Práctica 5

Propiedades de las membranas y efecto osmótico

Objetivo: que el estudiante compruebe algunas propiedades de las

membranas biológicas como lo es la permeabilidad selectiva, conozca la
importancia del entorno para mantener la integridad de las mismas y evidencie
experimentalmente el efecto osmótico.

Fundamento
La vida como la conocemos hoy no existiría si no existieran las membranas.
Estas estructuras definen el límite entre lo que se considera una célula y su
entorno. En el caso de las células eucariotas, las membranas también definen
las organelas internas. Las membranas tienen una función más compleja que
ser simples barreras delimitantes, son estructuras sumamente activas donde
ocurren procesos metabólicos complejos como transporte de moléculas,
transducción de señales, respiración celular y generación de potenciales
eléctricos entre otros. Es por esto que las membranas están constituidas no
solo de lípidos sino también de proteínas y carbohidratos. La proporción de
cada una de estas macromoléculas dependerá de la función de cada
membrana en particular, la cual a su vez depende de la célula a la cual
pertenece. Por ejemplo, la membrana plasmática de un hepatocito de ratón
está constituida proporcionalmente de 45% de proteínas, 27 % de fosfolípidos,
25 % de colesterol y 3% de otras macromoléculas. La estructura de las
membranas biológicas aceptada hoy en día es aquella descrita en el modelo
del mosaico fluido. En este modelo se establece que los fosfolípidos forman una
bicapa en la cual las regiones no polares de cada capa se encuentran hacia
adentro de la misma y las regiones polares de cada capa se encuentran hacia
afuera, en interacción con el medio acuoso. Las proteínas se encuentran
embebidas en este “mar” de fosfolípidos con interacciones generalmente de
tipo no covalente.
Las membranas son impermeables a la mayoría de los solutos polares y
permeables a los solutos no polares. Para el intercambio de la mayoría de los
solutos polares existen mecanismos controlados que pueden implicar inversión
de energía. La existencia de este tipo de membranas permite evidenciar una
propiedad coligativa del solvente universal, el agua, que se conoce como
presión osmótica. Las moléculas de agua tienden a moverse desde una región
de alta concentración de agua hacia una de menor concentración. Cuando dos
soluciones acuosas están separadas por una membrana semipermeable que
permite el paso del agua pero no del soluto, el movimiento de las moléculas de
agua desde una región más concentrada de agua hacia una de menor
concentración de agua genera una presión conocida como presión osmótica.
Esta presión puede ser cuantificada como se demuestra en la figura 1.
Considérese un recipiente que contiene agua pura al cual se le introduce un
tubo en cuyo extremo sumergido tiene una membrana semipermeable. Dentro
del tubo se encuentra un soluto disuelto en agua pero que no es permeable a
través de la membrana (figura 1a). Como se demuestra en la figura 1b, el agua
del recipiente atravesará la membrana para pasar al tubo y así igualar su
concentración a ambos lados de la membrana. La presión osmótica es medida
como la fuerza que debe ser aplicada para que la solución en el tubo regrese al
mismo nivel de aquella que se encuentra en el recipiente y es proporcional a la
altura del nivel de líquido contenido en el tubo, llamada “h” en la figura 1b. En la
figura 1c esta fuerza es aquella aplicada por un pistón.

Tomado de: Nelson D. L y Cox M.M. 2005.

Lehinger Principles of Biochemistry. W.H Freeman
and Company. NY. Cuarta edición.

Figura 1. Medida de la presión osmótica. Recipiente con agua pura. Dentro

del mismo se encuentra un tubo con una membrana semipermeable. Dentro del
tubo hay una solución acuosa de un soluto no permeable a través de la
membrana (a). El agua se mueve desde una región más concentrada (el
recipiente) hacia una menos concentrada, ocasionando un desplazamiento
hacia arriba del nivel de líquido en el tubo (b). La fuerza que debe ser aplicada
para que el líquido dentro del tubo vuelva a su nivel inicial es la medida de la
presión osmótica (c).

La ósmosis, es decir, el movimiento de agua a través de una membrana

semipermeable debido a diferencias en presión osmótica, es un factor
importante para la sobrevivencia de una célula. Las membranas
citoplasmáticas son más permeables al agua que a la mayoría de otras
moléculas o iones. Esta permeabilidad es debida en parte a la difusión libre del
agua a través de la bicapa de lípidos y a la presencia de canales proteicos que
facilitan su paso. Aquellas soluciones que poseen la misma osmolaridad se
conocen como soluciones isotónicas (Figura 2). En estas condiciones, una
célula no intercambia agua con el medio que la rodea. En una solución
hipertónica (Figura 2b), es decir, aquella que posee mayor osmolaridad que la
célula, el agua del citoplasma tenderá a salir por lo que la célula literalmente se
deforma y encoge. Al contrario, en una solución hipotónica, aquella que posee
menor osmolaridad que la célula, el agua de la solución tiende a entrar
abruptamente a la célula hasta causar su lisis (Figura 2c).
 Tomado de: Nelson D. L y Cox M.M. 2005.
Lehinger Principles of Biochemistry. W.H Freeman
and Company. NY. Cuarta edición.

Figura 2. Efecto de diferentes condiciones osmóticas sobre una célula. Si la

célula se encuentra en una solución isotónica, puede sobrevivir (a). No así en
condiciones hipertónicas, donde prácticamente se deshidrata (b) o en
condiciones hipotónicas, donde la presión osmótica causa su lisis (c).

En uno de los experimentos a realizar hoy observaremos la lisis causada por

efecto osmótico. En otro experimento, observaremos la lisis causada por
diferentes agentes químicos que destruyen la membrana celular. Los glóbulos
rojos por ser células muy sensibles a la lisis y por contener en su interior una
proteína coloreada, la hemoglobina, permiten observar fácilmente el efecto
osmótico.

Hemólisis por efecto osmótico

Materiales y reactivos

- Cloruro de sodio al 2%: Pesar 2 gramos de cloruro de sodio y llevar a 100 ml

con agua destilada
-Solución isotónica de eritrocitos lavados.
-Agua destilada
-Pipetas de diferente volumen.
-Tubos de ensayo
-Microscopio

Procedimiento

Rotule cuatro tubos como 1, 2, 3 y 4 y añada las cantidades de agua y cloruro

de sodio según el siguiente cuadro:

Cuadro 1. Procedimiento para observar efecto osmótico en eritrocitos

Tubo No ml de Agua ml de cloruro Concentración

. de sodio al 2% final (%NaCI)
1 10 0 0
2 7.5 2.5 0.5
3 5.5 4.5 0.9
4 3.5 6.5 1.3

Agite bien cada tubo y a cada uno agregue dos gotas de glóbulos rojos
lavados. Agite de nuevo y deje la muestra sedimentar por una hora. Observe el
grado de hemólisis en los tubos, de acuerdo con la intensidad del color rojo del
líquido sobrenadante. Ver al microscopio.

Resultados

1) Anote los resultados obtenidos tanto a nivel macro como microscópico.

2) Qué puede concluir de los resultados obtenidos?

3) Describa con sus propias palabras qué es una solución hipotónica, qué es
una solución hipertónica y qué es una solución isotónica?

4) Averigüe qué condiciones osmóticas (isotónicas, hipertónicas o hipotónicas)

prevalecen en ambientes naturales o fisiológicos. Explique.

Hemólisis producida por diferentes agentes químicos

Fundamento de la prueba

La solubilización de los lípidos de la membrana celular, o la disminución de

la tensión superficial, pueden producir hemólisis.

Materiales y reactivos

-Cloruro de sodio 0.9%: Pesar 0.9 gramos de cloruro de sodio y llevar a 100 ml
con agua destilada.

-Solución isotónica de eritrocitos lavados

-Pipeta de 10 ml y pipeta Pasteur

Procedimiento

A 10 ml de cloruro de sodio al 0.9% colocados en cada uno de 5 tubos de

ensayo, añada 2 gotas de eritrocitos lavados. Conserve uno de los tubos
como control y a los otros 4 añádales respectivamente, 2 gotas de una
solución saturada de jabón, cloroformo y alcohol etílico. Agite
 repetidamente y deje la solución en reposo durante 15 minutos. Observe
los tubos y compárelos con el control. Observe también al microscopio

Resultados

1) Describa el efecto en los eritrocitos con cada una de las soluciones

saturadas usadas tanto a nivel macro como microscópico.

2) Investigue con base en qué mecanismo cada una de las soluciones

saturadas de jabón, cloroformo y alcohol etílico causan lisis de los eritrocitos.

Prueba de fragilidad osmótica completa

Reactivos:

-Solución madre NaCl 10%: Pesar 10 gramos de cloruro de sodio, ajustar el

pH a 7.4 y llevar a 100 ml con agua destilada.

-Soluciones de trabajo: Diluir la cantidad necesaria de la solución madre a

100 ml, con agua destilada de acuerdo con la siguiente tabla:

% NaCI ml de sol. Madre

0.10 1.0
0.20 2.0
 0.30 3.0
0.35 3.5
0.40 4.0
0.45 4.5
0.50 5.0
0.55 5.5
0.60 6.0
0.65 6.5
0.70 7.0
0.75 7.5
0.80 8.0
0.85 8.5

Procedimiento:

Colocar 5 ml de cada una de las concentraciones anteriores en tubos de

ensayo, adicionar 0.02 ml de sangre anticoagulada (EDTA, heparina,
desfibrinada) y mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente por 30 minu-
tos. Mezclar y centrifugar a 3000 gravedades por 10 minutos. Leer la
absorbancia de cada uno de los sobrenadantes a 540 nm, utilizando como
blanco el sobrenadante del tubo 0.85% NaCI.

Cálculos

% de hemólisis Ab sobrenadante de cada tubo X 100 Ab

sobrenadante del tubo 100% (0.10)

Patrón: Absorbancia tubo de 0.10 de NaCI (100% hemólisis)

Blanco: Absorbancia tubo de 0.85 de NaCI (0% hemólisis)

Valores de referencia:

% NaCI % Hemólisis
0.10 100
0.20 100
0.30 97-100
0.35 90-99
0.40 50-95
0.45 5-45
0.50 0-6
0.55 0
0.60 0
0.65 0
 0.70 0
0.75 0
0.80 0
0.85 0

Resultados

Elabore una curva de fragilidad osmótica completa con los valores de

referencia. En la misma elabore otra curva con los resultados obtenidos de la
muestra procesada en el laboratorio. Analice los resultados y compárelos.

Bibliografía

-Angulo Ugalde, Y. Bioquímica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa

Rica. 1999
- Nelson D.L y Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H.
Freeman and Company, NY. Cuarta edición, 2005.