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UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO


MARCOS JOSÉ DA SILVA

SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE UMA BIOMEMBRANA RICA EM


COLÁGENO COM POTENCIAL PARA USO CLÍNICO CIRÚRGICO

SÃO PAULO
2015
2

MARCOS JOSÉ DA SILVA

SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE UMA BIOMEMBRANA RICA EM


COLÁGENO COM POTENCIAL PARA USO CLÍNICO CIRÚRGICO

Dissertação apresentada à Faculdade


de Odontologia da Universidade
Anhanguera de São Paulo para
obtenção do título de MESTRE em
Biomateriais, Área de concentração:
Biomateriais em Odontologia.

Orientador: Prof. Dr. Fábio Dupart Nascimento

SÃO PAULO
2015
3

Ficha Catalográfica

A663
Silva, Marcos José da.
Síntese e caracterização de uma biomembrana rica em colágeno
com potencial para uso clínico cirúrgico/ Marcos José da Silva
-- São Paulo, 2015.
87 f.; 30 cm.

Dissertação (Mestrado) - Curso de Odontologia da Universidade


Anhanguera de São Paulo. Diretoria de Pós-Graduação e
Pesquisa. Área de concentração: Biomateriais em Odontologia,
2015.
Orientação: Prof. Dr. Fábio Dupart Nascimento

1. Matriz Extracelular. 2. Regeneração Óssea Guiada. 3. Submucosa


Intestinal suína.

CDD 637.23

Catalogação na fonte: Elisabete Feitosa dos Santos CRB8/8048


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FOLHA DE APROVAÇÃO

Silva, MJ. SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE UMA BIOMEMBRANA RICA EM


COLÁGENO COM POTENCIAL PARA USO CLÍNICO CIRÚRGICO Dissertação
apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Anhanguera de São Paulo
para obtenção do título de Mestre em Biomateriais em Odontologia.

Aprovado em:

Banca Examinadora
Prof. Dr. _________________________Instituição: _____________________

Julgamento: ____________ Assinatura: ______________________________

Prof. Dr. _________________________Instituição: _____________________

Julgamento: ____________ Assinatura: ______________________________

Prof. Dr. _________________________Instituição: _____________________

Julgamento: ____________ Assinatura: ______________________________


5

RESUMO

Existe no cenário atual da medicina regenerativa um grande interesse na


pesquisa e desenvolvimento de biomateriais que possuam a capacidade de
proporcionar um reparo mais rápido e eficiente em lesões ósseas. A utilização de
arcabouços tridimensionais que possuam ou mimetizem os elementos da matriz
extracelular (MEC) vem crescendo porque além da sua bioatividade, também podem
sofrer alterações nas suas propriedades através de modificações químicas. Desta
maneira inúmeros materiais veem sendo desenvolvidos, dentro deste universo,
materiais obtidos a partir da submucosa intestinal suína, ou bovina estão sendo
estudados e os resultados são promissores na área de traumatologia, principalmente
quando essas membranas são capazes de mimetizar a função da MEC. O objetivo
deste estudo foi desenvolver e caracterizar uma nova biomembrana rica em colágeno,
bem como compará-la a algumas já existentes no mercado nacional, para ser utilizada
em regeneração óssea guiada (ROG). Foi extraída a matriz extracelular a partir da
submucosa intestinal suína (SIS), mantendo as características moleculares desta
matriz, isto é, a capacidade de servir como nicho para a migração e diferenciação
celular no sítio onde está implantada. Foram realizados testes mecânicos de tração e
deformação, os quais demonstraram que a biomembrana desenvolvida neste estudo
possui as propriedades mecânicas, resistência a tração e deformação, compatíveis
com as amostras comercializadas, apresentando o melhor compromisso tensão x
deformação, com uma tensão média de 6,2 MPa, a 2ª melhor, e a maior deformação,
em torno de 50%.Também foram realizados os ensaios de microscopia eletrônica de
varredura (MEV), energia dispersiva espectroscópica (EDS), Quantificação dos
Glicosaminoglicanos, Avaliação do padrão estrutural do colágeno por microscopia de
varredura confocal SHG e Ensaio de biocompatibilidade em modelo animal. Todos os
resultados atestaram que o material desenvolvido na UNIAN possui todas as
características necessárias para desempenhar o papel de barreira biorreabsorvida
nas áreas médica e odontológica, além do que a MEC desenvolvida na UNIAN
demonstrou um caráter inovador quando comparamos os resultados obtidos com as
outras membranas utilizadas neste estudo.
6

Palavras chaves: matriz extracelular, submucosa intestinal suína, regeneração


óssea guiada.
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ABSTRACT

The current scenario of regenerative medicine shows a keen interest in research and
development of biomaterials that have the ability to provide faster and efficient repair
in bone lesions. The use of three-dimensional scaffolds that mimic the extracellular
matrix (ECM) has increased during the past year. Thus numerous materials being
developed within this universe, material obtained from swine intestinal submucosa, or
bovine are being studied and the results are promising in the trauma area, especially
when these membranes are capable to combine the function of the ECM. The objective
of this study was to develop and characterize a new biomembrane rich in collagen and
compare it to some already on the national market, to be used in guided bone
regeneration (GBR). Extracellular matrix from porcine intestinal submucosa (SIS),
keeping the molecular features of this matrix, that is, the ability to serve as a niche for
cell migration and differentiation at the site where it is implanted has been extracted.
Mechanical tests have been carried out and tensile deformation, which demonstrated
that the biomembrane has developed in this study the mechanical properties, tensile
strength and deformation compatible with the marketed samples showing the best
compromise tension-deformation with an average tension of 6, 2 MPa, the 2nd best,
and most deformation, around 50%. Also were performed the scanning electron
microscopy assays (SEM), energy dispersive spectroscopy (EDS), quantification of
glycosaminoglycans, evaluation of structural collagen by scanning confocal
microscopy SHG and biocompatibility testing on animal model. All results attested that
the material developed in UNIAN has all the features needed to play the role of
biological barrier in medical and dental areas, in addition to MEC developed in UNIAN
demonstrated an innovative character when we compare the results obtained with
other membranes evaluated in this study.

Keywords: extracellular matrix, porcine intestinal submucosa, guided bone


regeneration.
8
9

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a DEUS, que nos galhos secos


de uma árvore qualquer, onde ninguém jamais pudesse
imaginar, fez uma flor brotar e transformou minha
vida.
10

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Ao Prof. Dr. Fabio Dupart Nascimento, que me


orientou em todas as etapas deste trabalho. Meus
sinceros agradecimentos.

Aos Professores Doutores Paulo Henrique Perlatti


D’Alpino e Vinícius Di Hipólito que sempre me
incentivaram e acreditaram no meu potencial.
Obrigado pela amizade.
11

AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha esposa Rosana e aos meus filhos Gabriel, Lívia e


Isabella, por terem me apoiado em todos os momentos difíceis.

Aos meus pais, Geraldo José da Silva e Maria Madalena da Silva por
toda a dedicação.

Agradeço a Instituição Universidade Anhanguera de São Paulo –


UNIAN-SP, por minha formação profissional.

À banca de defesa composta pelas Professoras Dras. Alejandra


Hortencia Miranda González, Roberta Caroline Bruschi Alonso e
pelo Professor Dr. Ivarne Luis dos Santos Tersariol

Agradeço aos colegas do Mestrado pela amizade, convívio e troca de


experiências no decorrer do curso.

A todos os Professores do Programa de Biomateriais em Odontologia,


que participaram e contribuíram diretamente no processo da minha
formação. Profa. Dra. Alejandra Hortência M. González, Prof. Dr.
Fabio Dupart Nascimento, Prof. Dr. Paulo Henrique Perlatti
D’Alpino e Prof. Dr. Vinícius Di Hipólito. Meus sinceros
agradecimentos.
12

A todos que indiretamente contribuíram para a realização deste


trabalho.

Meus sinceros agradecimentos


LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Família do colágeno..........................................................................9

Tabela 2 – Isoformas de lamininas....................................................................19

Tabela 3 – Características importantes das proteoglicanas mais conhecidas..29

Tabela 4 – Amostras utilizadas neste trabalho..................................................40

Tabela 5 – Equipamentos utilizados para o ensaio de tração das amostras... 49

Tabela 6 – Dimensão dos corpos de prova.......................................................49

Tabela 7 – Determinação da composição química das membranas por EDS ..56

Tabela 8 - Resultados de resistência à tração e porcentagem de deformação

das amostras......................................................................................................60

Tabela 9 - Alterações histopatológicas apresentadas pelos animais que


receberam implante MEC UNIAN e da Lumina Coat, com coleta em 3
dias.........................................................................63

Tabela 10 - alterações histopatológicas apresentadas pelos animais que


receberam implante MEC UNIAN e da Lumina Coat, com coleta em 7
dias.........................................................................63

Tabela 11 - alterações histopatológicas apresentadas pelos animais que

receberam implante MEC UNIAN e da Lumina Coat, com coleta em 28

dias.......................................................................64

Tabela 12 - Alterações histopatológicas apresentadas pelos animais que


receberam implante MEC UNIAN e da Lumina Coat, com coleta em 42
dias.......................................................................64
14

Tabela 13 - alterações histopatológicas apresentadas pelos animais que


receberam implante MEC UNIAN e da Lumina Coat, com coleta em 84
dias.......................................................................65
15

LISTA DE ABREVIATURAS

MEC – Matriz Extracelular


RTG – Regeneração Tecidual Guiada
ROG – Regeneração Óssea Guiada
SIS – Submucosa Intestinal Suína
CMB – Complexo da membrana basal
MEV– Microscopia eletrônica de Varredura
GF – Fator de Crescimento
IGF – Fator de crescimento semelhante à insulina
TGF – Fator de crescimento de transformação
FGF – Fator de crescimento de fibroblasto
PDGF – Fator de crescimento derivado de plaqueta
RGD – Growth factor receptor complex (complexo do domínio de receptor de
fator de crescimento)
EGFR1 – Epidermal growth factor receptor (Receptor do fator de crescimento
epidermal)
TNC – Tenascina
FN – Fibronectina
TSPs – Trombospondinas
GAGs – Glicosaminoglicanos
IL-1 – Interleucina 1
TNFa – Fator A de necrose tumoral
WFI – Água ultrapura
BMP – Proteína Óssea morfogenética
16

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Ilustração de uma Matriz Extracelular................................................4

Figura 2 - Desenho esquemático da organização supramolecular do


colágeno..............................................................................................................8

Figura 3 - Desenho esquemático da organização supramolecular do


colágeno............................................................................................................10

Figura 4 - Representação esquemática da fibronectina e alguns de seus sítios


de ligação ..........................................................................................................12

Figura 5 - Desenho esquemático da ligação de FN e colágeno .......................13

Figura 6 - Representação esquemática de cinco repetições consecutivas de


módulos de FN do Tipo III e o mecanismo de elasticidade molecular .............. 14

Figura 7 - Representação esquemática de uma molécula de Laminina ...........15

Figura 8 - Estrutura do fibrinogênio, composto por duas cadeias alfa, duas betas
e duas gamas, unidas por pontes dissulfeto ..................................................... 17

Figura 9 - Principais etapas da formação das microfibrilas e fibras elásticas em


três exemplos de tecidos ...................................................................................20

Figura 10 - Desenho esquemático da molécula de Proteoglicano de cartilagem


(Agrecan) .......................................................................................................... 23

Figura 11 - Esquema da estrutura de um proteoglicano de membrana ............26

Figura 12- Ilustração da utilização de membrana na técnica de regeneração


tecidual guiada (RTG) ........................................................................................31

Figura 13 - Ilustração da utilização de membrana associada a enxerto ósseo em


ROG...................................................................................................................32

Figura 14 - Fluxograma do processo de descelularização.................................37

Figura 15 - Remoção grosseira de resíduos, realizada por meio de raspagem do


material ............................................................................................................. 38

Figura 16 - SIS em agitação e imersa em solução enzimática..........................38

Figura 17 - SIS esticada sobre Teflon e colocada no processo de secagem …39

Figura 18 - Curva tensão x deformação para enxerto derivado de pele de


cadáver humano ................................................................................................43
17

Figura 19 - Corpo de prova posicionado no equipamento de tração e dispositivo


de garras ...........................................................................................................44

Figura 20 – Amostras utilizadas nos ensaios de tração/deformação ................44

Figura 21 - Apresentação dos materiais implantados .......................................46

Figura 22 - Implante subcutâneo de MEC UNIAN .............................................47

Figura 23 -. Retirada da região do implante e tecido adjacente ..........................47

Figura 24 - Avaliação por MEV da membrana Lumina-Coat ................................48

Figura 25 - Avaliação por MEV da membrana Surgidry Dental..........................49


Figura 26 - Avaliação por MEV da membrana Gen Derm .................................49
Figura 27 - Avaliação por MEV da membrana surgi time PTFE ........................50
Figura 28 - Avaliação por MEV da membrana MEC UNIAN .............................51
Figura 29 - Análise de EDS nas membranas ....................................................52
Figura 30 - Perfil eletroforético em gel de PDA de Glicosaminoglicanos
Sulfatados extraídos das membranas ...............................................................53
Figura 31 - Fluorescência intrínseca do colágeno observada por microscopia
confocal a laser ..................................................................................................54
Figura 32 - Secção histológica ilustrando fibroplasia e um marcante infiltrado
inflamatório neutrofílico delineando o material experimental (MEC UNIAN)
acidofílica (seta vermelha). Material retirado 3 dias após implante................... 61
Figura 33 – Secção histológica ilustrando um moderado a marcante componente
inflamatório neutrofílico e fibrose delineando membrana eosinofílica estreita em
região de implante de material controle (Lumina Coat), (seta vermelha). Material
retirado 3 dias após implante - Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x.............62
Figura 34 - Secção histológica ilustrando discreto depósito de colágeno maduro
corado em azul, e componente inflamatório delineando o material experimental
(MEC UNIAN) estreita avermelhada com trechos corados em azul (seta verde).
Material retirado 3 dias após implante – Tricrômio de Masson /objetiva de 40x..62
Figura 35 - Secção histológica ilustrando discreto depósito de colágeno maduro
corado em azul e membrana controle (seta verde). Material retirado 3 dias após
implante – Tricrômio de Masson /objetiva de 40x ..............................................63
18

Figura 36 - Secção histológica ilustrando abundante componente inflamatório


neutrofílico, delineando a MEC UNIAN (MEC) eosinofílica estreita. Material
retirado 7 dias após o implante - Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x............63
Figura 37 - Secção histológica ilustrando discreta fibrose e infiltrado inflamatório
misto delineando membrana controle (Lumina Coat) levemente basofílica (seta
verde). Material retirado 7 dias após o implante - Hematoxilina e eosina /objetiva
de 40x................................................................................................................64
Figura 38 - Secção histológica ilustrando depósito de colágeno maduro corado
em azul (seta) e componente inflamatório delineando membrana estreita
basofílica (MEC UNIAN). Material retirado 7 dias após o implante – Tricrômio de
Masson /objetiva de 40x.....................................................................................64
Figura 39 - Secção histológica ilustrando discreta a moderado depósito de
colágeno maduro corado em azul e estrutura membrana controle (Lumina Coat)
grosseira basofílica (seta verde). Material retirado 7 dias após o implante –
Tricrômio de Masson /objetiva de 40x................................................................65
Figura 40 - Secção histológica ilustrando fibrose e poucos vasos neoformados.
Região de implante da MEC UNIAN retirada após 28 dias - Hematoxilina e eosina
/objetiva de 40x..................................................................................................65
Figura 41 - Secção histológica ilustrando fibrose e poucos vasos neoformados.
Região de implante de material controle (Lumina Coat) retirado após 28 dias -
Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x.............................................................. 66
Figura 42 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno
maduro em bandas corado em azul. Região de implante da MEC UNIAN retirada
em 28 dias – Tricrômio de Masson /objetiva de 40x ...........................................66
Figura 43 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno
maduro em bandas corado em azul. Região de implante de material controle
(Lumina Coat) com retirada após 28 dias – Tricrômio de Masson /objetiva de
40x.....................................................................................................................67
Figura 44 - Secção histológica ilustrando tecido conjuntivo denso modelado e
discreta quantidade de pequenos vasos sanguíneos. Região de implante do
material experimental (MEC UNIAN) retirada em 42 dias - Hematoxilina e eosina
/objetiva de 40x..................................................................................................67
19

Figura 45 - Secção histológica ilustrando tecido conjuntivo denso modelado e


poucos vasos sanguíneos. Região de implante de material controle (Lumina
Coat) com retirada em 42 dias - Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x........... 68
Figura 46 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno
maduro em bandas corado em azul. Região de implante do material experimental
(MEC UNIAN) com retirada em 42 dias – Tricrômio de Masson /objetiva de
40x.....................................................................................................................68
Figura 47 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno
maduro em bandas corado em azul e vermelho. Região de implante de
membrana controle (Lumina Coat) com retirada em 42 dias – Tricrômio de
Masson /objetiva de 40x.....................................................................................69
Figura 48 - Secção histológica ilustrando tecido conjuntivo denso modelado, e
discreta quantidade de pequenos vasos sanguíneos. Região de implante da
MEC UNIAN com retirada em 84 dias - Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x..69
Figura 49 - Secção histológica ilustrando tecido conjuntivo denso modelado, e
poucos vasos sanguíneos. Região de implante de membrana controle (Lumina
Coat) com retirada em 84 dias - Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x...........70
Figura 50 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno
maduro em bandas corado em azul e vermelho. Região de implante da MEC
UNIAN com retirada em 84 dias – Tricrômio de Masson /objetiva de 40x..........70
Figura 51 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno
maduro em bandas corado em azul e vermelho. Região de implante de
membrana controle com retirada em 84 dias – Tricrômio de Masson /objetiva de
40x.....................................................................................................................71
20

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO................................................................................................1
1.2- MATRIZ EXTRACELULAR (MEC) ..............................................................4
1.2.1- ESTRUTURA DA MEC .............................................................................6
1.2.2- COLÁGENO..............................................................................................7
1.2.3-FIBRONECTINAS....................................................................................12
1.2.4- LAMININAS.............................................................................................14
1.2.5- FIBRINOGÊNIO......................................................................................16
1.2.6- ELASTINA...............................................................................................18
1.2.7- FIBRILINA...............................................................................................18
1.2.8- FIBULINA................................................................................................20
1.2.9- TENASCINAS.........................................................................................21
1.3- TROMBOSPONDINAS..............................................................................22
1.3.1- PROTEGLICANOS.................................................................................23
2 – BIOMEMBRANAS......................................................................................27
3 - ESTADO ATUAL.........................................................................................33
4 – OBJETIVOS................................................................................................35
5- MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................36
5.1- SÍNTESE DE BIOMEMBRANAS...............................................................36
5.2- CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS E ESTUDO COMPARATIVO.... 39
5.2.1- ENSAIO DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) E
ENERGIA DISPERSIVA ESPECTROSCÓPICA (EDS) .................................. 39
5.2.2- EXTRAÇÃO DOS GLICOSAMINOGLICANOS .................................... 40
5.2.3- ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE............................................41
5.2.4- AVALIAÇÃO DO PADRÃO ESTRUTURAL DO COLÁGENO POR
MICROSCOPIA DE VARREDURA CONFOCAL SHG (GERAÇÃO DE
FLUORESCÊNCIA POR SEGUNDA HARMÔNICA) .......................................42
5.2.5- ESTUDO DAS PROPRIEDADES MECÂNICAS DAS BIOMEMBRANAS
...........................................................................................................................42
5.2.5.1- EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NO ENSAIO MECÂNICO ................45
5.2.5.2- PARÂMETROS DO ENSAIO MECÂNICO ..........................................45
5.3- ENSAIO DE BIOCOMPATIBILIDADE EM MODELO ANIMAL ..................46
21

6- RESULTADOS.............................................................................................48
6.1- MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA....................................48
6.2- ESPECTROSCOPIA DE ENERGIA DISPERSIVA (EDS) .........................51
6.3- QUANTIFICAÇÃO DOS GLICOSAMINOGLICANOS ...............................53
6.4- AVALIAÇÃO ESTRUTURAL DO COLÁGENO POR MICROSCOPIA
CONFOCAL DE FLUORESCÊNCIA INTRÍNSECA ..........................................53
6.5- RESISTÊNCIA MECÂNICA .......................................................................55
6.6- AVALIAÇÃO DA BIOCOMPATIBILIDADE DA MEC UNIAN EM MODELO
ANIMAL .............................................................................................................58
7- DISCUSSÃO .................................................................................................71
8 – CONCLUSÃO ..............................................................................................74
9 – Referências.................................................................................................75
1

1- INTRODUÇÃO

A Engenharia de Tecidos baseia-se no estudo da manipulação e


desenvolvimento das interações de moléculas, células, tecidos e/ou órgãos
como o objetivo de substituir ou dar suporte às funções anormais no organismo
humano (KAKAZU et al., 2014). Trata-se de uma nova ciência de âmbito
multidisciplinar, na qual especialistas de diversas áreas interagem entre si
trocando conhecimentos e experiências no intuito de proporcionar soluções para
os vários desafios da medicina regenerativa.
A população mundial de idosos vem crescendo progressivamente, e estes
indivíduos desejam manter níveis de atividade mais elevados, fato este que não
ocorria nas últimas décadas, todavia com o envelhecimento surgem também
algumas patologias, as quais trazem perdas das propriedades e funções dos
tecidos advindas de doenças crônico degenerativas. Somando-se a esta
problemática estão os traumas provocados por acidentes ou da retirada de tecido
comprometido por patologia ou inviável, onde a cura total prevê a reinserção do
paciente reimplantado na sociedade. Este cenário se mostra extremamente
vantajoso em incentivar o desenvolvimento de novas tecnologias para sanar os
novos desafios da área da saúde (LANGER et al.,1993).
É necessário um conjunto de requisitos para se definir o termo biomaterial,
como por exemplo: não provocar modificação física no tecido hospedeiro, não
ser carcinogênico, não causar reação alérgica ou de corpo estranho, ter
capacidade de resistência a forças mecânicas e ser esterilizável. Os efeitos do
ambiente orgânico no material e do material no organismo, também devem ser
avaliados com extremo cuidado, esta relação é a chamada biocompatibilidade
(WILLIANS D.F.,2008).
Mais de um milhão de procedimentos envolvendo a técnica de
regeneração óssea, são realizados anualmente nos Estados Unidos da América,
por médicos e cirurgiões dentistas, com o objetivo de restaurar o tecido perdido
ou danificado (FIERZ et al., 2008). O enxerto autógeno ainda permanece como
primeira escolha dos cirurgiões no tratamento regenerador do tecido ósseo,
principalmente, devido a suas propriedades de osteocondução, osteoindução e
osteogênese (HANDA et al., 2012).
2

Entende-se por regeneração a reposição dos componentes perdidos do


organismo, fenômeno que ocorre distintamente entre os diversos órgãos do
organismo, alguns deles possuem alto poder regenerativo, como o fígado,
enquanto outros apenas sofrem preferencialmente um processo cicatricial
(KAKAZU et al., 2014).
As duas principais áreas da engenharia tecidual na odontologia são a
Regeneração Tecidual Guiada (RTG) e a Regeneração Óssea Guiada (ROG),
amplamente descritas na literatura. Estas técnicas trazem grandes vantagens
tanto no tratamento periodontal, tentando obter uma restituição da integridade
da região afetada pela lesão, como no tratamento implantológico, permitindo a
recuperação e o melhoramento de casos que de outra maneira não alcançariam
êxito. Embora não exista consenso na literatura sobre a escolha do material ideal
a ser utilizado, a tomada de decisão é uma questão essencialmente do
profissional e de suas preferências pessoais (BISEGNA, 2013).
A ROG e RTG são considerados procedimentos com grande margem de
sucesso, desde que corretamente realizados e planejados. O sucesso destes
procedimentos também depende de outros fatores, como tamanho e tipo do
defeito, idade e fatores genéticos dos pacientes (INANÇ et al, 2009). Somado a
estes fatores, os biomateriais utilizados nestes processos devem apresentar
algumas características desejáveis, como biocompatibilidade, capacidade para
impedir que células do tecido conjuntivo invadam o sítio de neoformação óssea,
permeabilidade de nutrientes, integração com os tecidos do hospedeiro,
capacidade de induzir a proliferação e diferenciação celular e apresentar fácil
manipulação clínica (THANGAKUMARAN et al., 2009).
Em uma revisão da literatura realizada por El Helow e colaboradores em
2008, que versa sobre o uso de membranas em técnicas regenerativas na
instalação de implantes imediatos, deiscências, fenestrações e perda do osso
alveolar são comuns na prática clínica. Nesse estudo foram comparadas
membranas não absorvíveis, absorvíveis, e associação de outros biomateriais
para ajudar na regeneração. O estudo mostrou que a degradação desses
materiais pode liberar fragmentos e ocasionar uma resposta local do tecido,
podendo prejudicar a regeneração. E embora alguns tenham a mesma
composição, apresentam diferentes formas de processamento, estrutura,
propriedades mecânicas, potencial antigênico e tempo de degradação. Como
3

resultado, o autor define que as membranas favorecem a regeneração tecidual,


principalmente quando associado a outros tipos de biomateriais.
Muitas pesquisas foram realizadas com materiais de origem sintética ou
natural, verificando interação celular, biorreabsorção biocompatibilidade e
propriedades mecânicas. Arcabouços com várias estruturas que carreiam
células, promovendo um suporte inicial e facilitando a nutrição e o metabolismo
tecidual, veem sendo exaustivamente estudados (INANÇ, 2009 et al.; CHO et
al.,2009; PARK et al.,2009; SANTANA et al.,2010). Em estudos in vitro onde
foram utilizadas células do ligamento periodontal, e membranas de ácido
polilático-glicólico, foram realizados testes mecânicos com o intuito de verificar a
deformação da membrana. Foram avaliadas também a viabilidade após 24 horas
da sedimentação celular e a capacidade de adesão celular destas células em
contato com membrana, após 7,14 e 21 dias do início do experimento (PARK et
al.,2009). Outro estudo mostrou que as células do ligamento periodontal têm
capacidade de formar estruturas teciduais e de se diferenciarem sobre a
biomembrana utilizada (SANTANA et al.,2010).
Retzepi e Donos, 2010, mostraram que a regeneração de defeitos ósseos
é possível pela capacidade das membranas em promover a exclusão mecânica
de células indesejáveis, não osteogênicas. Todavia, o sucesso é dependente do
tempo de degradação e das reações teciduais que as membranas provocam
durante o processo de biorreabsorção e este processo é dividido em quatro
estágios: hidratação, perda de resistência, perda da integridade estrutural, e
fagocitose.
O tempo de biorreabsorção é dependente do material e do seu
processamento. A regeneração é dependente da capacidade da manutenção do
espaço pela membrana, não podendo ocorrer o colapso. Sua aplicação é
importante após remoções cirúrgicas do elemento dental pois reduz a perda de
osso alveolar.
Um biomaterial que é utilizado em RTG necessita de algumas
propriedades adequadas para a finalidade que está sendo utilizado, dentre estas
propriedades estão: ter uma resistência mecânica suficiente para suportar as
forças cíclicas aplicadas a ele, participação ativa no processo de regeneração
da área onde foi implantado e ser capaz de tornar-se um nicho de crescimento
e diferenciação celular (HUTMACHER, 2000).
4

Diante deste contexto, a síntese de um material que mimetize a estrutura


da matriz extracelular, não apenas em suas características moleculares, mas
também com qualidades mecânicas que viabilizem o seu uso durante, e pós,
procedimento cirúrgico seria, sem sombra de dúvidas, uma inovação na área de
desenvolvimento de novos biomateriais.

1.2 - MATRIZ EXTRACELULAR (MEC)

A constituição dos inúmeros tecidos orgânicos é conferida, basicamente,


pelo agrupamento de distintos tipos celulares, entremeados pela matriz
extracelular (MEC). Apesar da complexidade inerente aos organismos, podemos
destacar, de maneira simplificada, quatro tipos teciduais: epitelial, nervoso,
muscular e conjuntivo. O tecido ósseo encontra-se no grupo dos tecidos
conjuntivos demonstrando um padrão de organização celular condizente com a
classe: presença de células bastante espaçadas entre si, permeadas por grande
quantidade de matriz (DAHLIN et al., 1998).
A MEC é composta por produtos de secreção de células residentes em
todos os tecidos e órgãos, as moléculas da MEC são representadas por uma
mistura diversificada de proteínas funcionais e estruturais, glicoproteínas e
glicosaminoglicanos, entre outras moléculas, organizadas em uma ultraestrutura
que é única para cada localização anatômica (Figura 1).

Figura 1 - (Ilustração de uma Matriz Extracelular, adaptado de fonte: www.lookfordiagnosis.com)


5

A MEC existe em um estado de reciprocidade dinâmica com as células


residentes, isto é, a composição da matriz e organização mudam de acordo com
a função das adaptações metabólicas das células em resposta a mudanças nas
propriedades mecânicas, pH, concentração de oxigênio e outras variáveis no
microambiente. Este dinamismo da relação estrutura-função, por conseguinte,
representa o microambiente ideal para a população de células residentes.
A MEC é constituída por moléculas que influenciam todo o microambiente
onde está inserida, modulando a função celular em diversos aspectos
fundamentais da biologia celular (HYNES, 2009).
A complexidade e sofisticação da MEC, de seus componentes e seus
respectivos receptores na superfície celular, estão entre as características mais
salientes durante a evolução do Reino Animal (HAR-EL e TANZER 1993;
HUTTER et al., 2000; WHITTAKER et al., 2006; ENGLER et al., 2009; HUXLEY-
JONES et al., 2009; OZBEK et al., 2010). A MEC é extremamente versátil e
realiza muitas outras funções além do seu papel estrutural. Isso a torna um
componente importante no microambiente do tecido. Cabe a ela, também,
participar da maioria dos comportamentos celulares básicos como: proliferação,
adesão, migração, diferenciação e apoptose celulares (BADYLAK et al.,2009).
Este aspecto da função pleiotrópica da MEC é resultado de sua estrutura
altamente dinâmica e constante processo de remodelação participando
ativamente da regulação do comportamento celular, transmitindo “pistas”
mecânicas, fornecendo sinais por meio de ligação celular direta para
componentes da MEC e através do sequestro e da regulação do acesso a fatores
de crescimento solúveis e citocinas (HYNES, 2009).
Este conceito é particularmente importante quando consideramos os
processos e comportamentos celulares, que necessitam estar em atividade, já
que as interações célula-célula e célula-matriz estão em constante mutação
(DALEY et al., 2008). Este dinamismo da MEC é característico de tecidos que
passam por estados de remodelação radical, tal como durante a metamorfose
dos insetos e anfíbios ou remodelação do osso adulto, glândula mamária, em
processos de desenvolvimento incluindo migração da crista neural,
angiogênese, dentogênese, desenvolvimento do esqueleto, ramificação
6

morfogênese e maturação das sinapses e do sistema nervoso (BERARDI et


al.,2004; FUKUMOTO, 2005; MCCAW et al., 2007; ZIMMERMANN, 2008).
As interações adesivas entre MEC e tecido, podem ocorrer com notável
precisão temporal e espacial. Como ilustrado na Figura 2, não apenas
participando das ligações em tecidos e órgãos funcionais, mas também estas
interações podem transmitir para as células aderentes informações precisas
sobre seu posicionamento no ambiente celular e extracelular. Além disso as
respostas da adesão atuam ativamente no remodelamento e reestruturação da
MEC, através da interação bidimensional entre as células e sua matriz.
O dinamismo da MEC pode ser resultante de alterações na sua
composição, por exemplo síntese, alteração ou degradação de um ou mais de
seus componentes, ou em sua arquitetura devido a alterações em sua
organização. A montagem individual de cada um de seus componentes tem
evidenciado que a rede reticulada estabelecida por ligações covalentes e não
covalentes, podem influenciar aspectos fundamentais do comportamento celular
(LOPEZ et al., 2008; ENGLER et al., 2009; EGEBLAD et al., 2010b). Este
elevado nível de organização da MEC é também dinâmico e sujeito a processos
de remodelação mediado por interações recíprocas entre MEC e as células
residentes (DALEY et al., 2008).
A dinâmica da MEC é rigidamente regulada para assegurar o
desenvolvimento e fisiologia normais dos órgãos, e isto é conseguido através de
mecanismos redundantes, os quais modulam a expressão e função enzimática
em vários níveis.

1.2.1 – ESTRUTURA DA MATRIZ EXTRACELULAR

A rede estrutural complexa da MEC é composta por quatro grandes


classes de macromoléculas: colágenos, proteoglicanos, glicosaminoglicanos e
glicoproteínas adesivas, as quais proporcionam um arcabouço físico para a
sustentação da estrutura tecidual, determinando a hidratação e,
consequentemente, o volume do tecido, criando espaços para o transporte de
moléculas, organização dinâmica e a resistência às forças compressivas.
7

As células residentes secretam no meio extracelular componentes como


colágeno, fibronectina, laminina, trombospondina, hemonectina, proteoglicanos
sulfatados e ácido hialurônico, produzidos principalmente pelos fibroblastos e
distribuídos em uma rede organizada em íntima associação com a superfície da
célula que a produziu (TENÓRIO et al., 2003).
A matriz extracelular apresenta em sua estrutura:
• componentes fibrilares (colágenos fibrilares, laminina, fibronectina, elastina);
• componentes não-fibrilares (proteoglicanos e glicoproteínas não colagênicas);
• microfibrilas (colágenos não-fibrilares e microfibrilas associadas à elastina);
• enzimas de reciclagem de matriz (metaloproteinases, catepsinas, heparanase).

1.2.2 - COLÁGENO

A palavra colágeno é utilizada para denominar uma família de 28


isoformas de proteínas encontradas nos tecidos conjuntivos do corpo. Em
termos de quantidade, é o composto mais importante do tecido conjuntivo e um
elemento estrutural importante em organismos multicelulares (RICARD-BLUM et
al., 2005).
É uma proteína encontrada em todo Reino Animal e fornece resistência
estrutural para todas as formas de matrizes extracelulares, incluindo as fibras
tendinosa, matrizes orgânicas de ossos e cartilagens, lâminas da membrana
basal, matriz viscosa do humor vítreo e MECs intersticiais da derme e de
cápsulas em torno dos órgãos. Essas cadeias são organizadas de forma paralela
a um eixo, formando as fibras de colágeno, que proporcionam resistência e
elasticidade à estrutura presente. As proteínas colagênicas formam agregados
supramoleculares (fibrilas, filamentos ou redes), sozinhas ou em conjunto com
outras matrizes extracelulares (Figura 2). Sua principal função é contribuir com
a integridade estrutural da matriz extracelular ou ajudar a fixar as células na
matriz.
8

Figura 2 – Desenho esquemático da organização supramolecular do colágeno adaptado de


HOLMES,2001.

A superfamília de colágeno compreende 28 membros numerados com


algarismos romanos em vertebrados (I-XXVIII) (Tabela 1).

Tabela 1 – Famílias do colágeno.

Tipo de Colágeno Cadeias α Espécies moleculares


Colágeno I α1(I), α2(I) [α1(I)]2, α2(I)
[α1(I)]3
Colágeno II α1(II) [α1(II)]3
Colágeno III α1(III) [α1(III)]3
Colágeno IV α1(IV), α2(IV), α3(IV), α4(IV), [α1(IV)]2, α2(IV)
α5(IV), α6(IV) α3(IV), α4(IV), α5(IV)
[α5(IV)]2, α6(IV)
Colágeno V α1(V), α2(V), α3(V), α4(V)a [α1(V)]2, α2(V)
[α1(V)]3
[α1(V)]2α4(V)
α1(XI)α1(V)α3(XI)
Colágeno VI α1(VI), α2(VI), α3(VI), α4(VI)b, α5(VI)c, α6(V)
Colágeno VII α1(VII) [α1(VII)]3
9

Colágeno VIII α1(VIII) [α1(VIII)]2, α2(VIII)


α1(VIII), [α2(VIII)]2
[α1(VIII)]3
[α2(VIII)]3
Colágeno IXe α1(IX), α2(IX), α3(IX) [α1(IX), α2(IX), α3(IX)]
Colágeno X α1(X) [α1(X)]3
Colágeno XI α1(XI), α2(XI), α3(XI)d α1(XI)α2(XI)α3(XI)
α1(XI)α1(V)α3(XI)
Colágeno XIIe α1(XII) [α1(XII)]3
Colágeno XIII α1(XIII) [α1(XIII)]3
Colágeno XIVe α1(XIV) [α1(XIV)]3
Colágeno XV α1(XV) [α1(XV)]3
Colágeno XVI e
α1(XVI) [α1(XVI)]3
Colágeno XVII α1(XVII) [α1(XVII)]3
Colágeno XVIII α1(XVIII) [α1(XVIII)]3
Colágeno XIXe α1(XIX) [α1(XIX)]3
Colágeno XX e
α1(XX) [α1(XX)]3
Colágeno XXIe α1(XXI) [α1(XXI)]3
Colágeno XXIIe α1(XXII) [α1(XXII)]3
Colágeno XXIII α1(XXIII) [α1(XXIII)]3
Colágeno XXIV α1(XXIV) [α1(XXIV)]3
Colágeno XXV α1(XXV) [α1(XXV)]3
Colágeno XXVI α1(XXVI) [α1(XXVI)]3
Colágeno XXVII α1(XXVII) [α1(XXVII)]3
Colágeno XXVIII α1(XXVIII) [α1(XXVIII)]3

Tabela 1- Família do colágeno, adaptado de The Collagen Family Sylvie Ricard-Blum

Um estudo recente encontrou um novo membro na epiderme chamado


de colágeno XXIX (SODERHALL et al., 2007), mas o gene COL29A1 localizado,
mostrou ser idêntico ao gene COL6A5, e (XXIX) da cadeia corresponde à
cadeia 5 (VI) (GARA et al., 2008). A característica estrutural comum das
proteínas colagênicas é a presença da uma tripla hélice que pode variar desde
mais de 96% de colágeno tipo I a menos de 10% de colágeno tipo XXII. 
O mecanismo da biossíntese do colágeno tem sido extensivamente
estudado, os fibroblastos secretam na forma solúvel o procolágeno, o qual é
circundado por duas estruturas globulares de peptídeos contendo nitrogênio (N-
10

) e carbono (C-) terminais. Em seguida o procolágeno é secretado dentro das


vesículas, formado no interior do aparelho de Golgi e secretado para a matriz
extracelular. Na matriz extracelular, ocorre a ação das C- e N-peptidases, para
clivar as duas estruturas globulares ligadas às extremidades do procolágeno,
iniciando o processo de fibrilogênese, pois essas estruturas globulares ligadas
ao procolágeno ocupam um grande espaço ao redor da molécula (NIMA SAEIDI,
2009). Deste modo, é necessário que ocorra o processo de clivagem para
formação do tropocolágeno (Figura 3 A), que começa a se unir com outras
moléculas de tropocolágeno, formando as fibrilas (Figura 3 B). As moléculas de
tropocolágeno unem-se na forma de conformação torsa por meio de associações
lado a lado, estabilizadas primeiramente pelas interações hidrofóbicas e
eletrostáticas (Figura 3).

Figura 3 - Biossíntese, organização e estrutura de colágeno (adaptado de SAEIDI, 2009).


11

Ligações peptídicas estão presentes nas formações das ligações


cruzadas covalentes intermoleculares entre as cadeias, resultado da interação
entre os grupos aldeídos e grupos aminos livres. Essas ligações cruzadas
fornecem a estabilidade e a força tensora necessária à estrutura supramolecular
(Figura 3 C). Existem quatro resíduos-chave envolvidos no início das ligações
das cadeias do tropocolágeno: dois resíduos de lisina ou hidroxilisina de
peptídeos, contendo o N-terminal; e dois resíduos de lisina ou hidroxilisina de
peptídeos, contendo o C-terminal.
O arranjo cabeça- cauda das moléculas de tropocolágeno permite a
interação entre os peptídeos contendo o N-terminal com os peptídeos adjacentes
contendo o C-terminal. O percurso helicoidal dessa superestrutura é dextrógiro,
sentido oposto ao enrolamento das hélices polipeptídicas individuais, que é
levógira. Essas duas conformações permitem um enrolamento mais apertado
possível das múltiplas cadeias polipeptídicas. O enrolamento da tripla hélice
fornece uma grande resistência às forças de tensão, sem nenhuma capacidade
para o estriamento (AVERY e BAILEY, 2006).
Assim, o colágeno apresenta uma resistência mecânica que é aumentada
pelo enrolamento helicoidal de múltiplos seguimentos em uma tripla-hélice, de
uma forma muito parecida a cordões enrolados entre si e sobre si mesmo, para
formar uma corda mais resistente.
Os aminoácidos hidroxilisina e hidroxiprolina, presentes na estrutura do
colágeno, não são sintetizados, mas são formados por hidroxilação da prolina e
lisina, respectivamente, que se inicia nos ribossomos durante a tradução do
RNAm do colágeno. Assim, o processo de hidroxilação é concluído após a
formação da estrutura linear (PERSIKOV et al ,2005).
As fibrilas de colágeno são compostas de agregados de moléculas de
colágeno ao longo de um eixo paralelo, mas cujas extremidades são igualmente
sobrepostas para produzir bandas de 70 nm. O conjunto de fibrilas forma as
fibras de colágeno, que se organizam em feixes (Figura 3).
A estrutura molecular do colágeno o torna insolúvel em água, em virtude
da grande concentração de aminoácidos hidrofóbicos, quer no interior da
proteína, quer na superfície. O colágeno representa uma exceção à regra de que
12

os grupos hidrofóbicos precisam estar escondidos no interior da molécula


proteica. O núcleo hidrofóbico, portanto, contribui menos para a estabilidade
estrutural da molécula, enquanto as ligações covalentes assumem um papel
especialmente importante.

1.2.3- FIBRONECTINAS

A fibronectina (FN) é uma glicoproteína amplamente distribuída na MEC,


possui massa molecular que varia entre 230 e 270 kDa, e pode, além da sua
presença na MEC, também ser detectada em concentrações substanciais no
plasma. A estrutura das fibronectinas são divididas em três subunidades
chamadas; tipos I, II e III (FNI, FNII e FNIII). Duas ligações intermoleculares de
dissulfeto são formadas dentro dos módulos tipo I e tipo II para estabilizar a
estrutura dobrada. Módulos tipo III são formados por sete cadeias com estruturas
de barril β e não possuem pontes de dissulfeto.
O dímero é encontrado em todos os vertebrados sob duas formas
fundamentais: solúvel (plasma sanguíneo e outros fluidos) e insolúvel na MEC
de diversos tecidos. Possui peso molecular entre 440 e 500 kD e dobras que
levam à remodelação estrutural e diversas conformações de acordo com o meio
(Figura 4) (MENEZES, 2003; ANTIA et al., 2008).

Figura 4 – Representação esquemática da fibronectina e alguns de seus sítios de ligação


modificada de GRAVINA,2010.
13

A codificação das isoformas de FN é realizada por um único gene com


caráter modular. Seus aproximadamente 50 éxons codificam três tipos de
subunidades homólogas repetitivas, denominadas Tipo I, II e III. Estes módulos
são classificados pelo tipo e numerados em ordem crescente da porção amino-
terminal para a porção carboxiterminal. Os monômeros são compostos por doze
repetições do Tipo I (segmento de aproximadamente 45 aminoácidos), duas do
Tipo II (segmentos de aproximadamente 60 aminoácidos) e quinze a dezessete
do Tipo III (segmentos de aproximadamente 90 aminoácidos). O domínio Tipo III
é um dos mais presentes dentre os domínios proteicos, com homólogos em
aproximadamente 2% das sequências animais (ANTIA et al., 2008).
Dentre as funções da FN, destacam-se a adesão, a migração, a
sobrevivência, a proliferação e a diferenciação celulares, bem como a
organização tecidual. A molécula de FN pode interagir com diversas
biomoléculas, tais como colágenos, proteoglicanas, heparina, ácido hialurônico,
fibrina/fibrinogênio, plasmina, gangliosídeos, componentes do complemento,
com ela mesma, e também com proteínas integrais da membrana plasmática
das células – integrinas, (Figura 5), (MIYAMOTO et al., 1998).

Figura 5 – Desenho esquemático da ligação de FN e colágeno, adaptado de GRAVINA,2010.

Sabemos que o arranjo das fibrilas de FN está diretamente relacionado


ao arranjo dos filamentos de actina das células, e vice e versa, e que as células
14

parecem gerar tensões sobre a matriz, presume-se que as mesmas possuem


alguma característica elástica. O modelo mais aceito para explicar a elasticidade
das fibrilas de FN se baseia em características intrínsecas dos módulos
consecutivos do Tipo III (ERICKSON, 1994). Três fases de elasticidade
compõem este modelo: a) conformação estendida da molécula em “zig-zag”
quando não há tensão sobre a mesma, b) conformação alinhada com pequena
extensão da molécula, adquirida com a aplicação de pequenas forças, e c)
conformação hiper-estendida da molécula, em que há o desdobramento dos
módulos individuais e o consequente aumento do comprimento modular em até
seis vezes, adquirida com a aplicação de forças maiores (Figura 6) (ERICKSON,
1994).

Figura 6 - Representação esquemática de cinco repetições consecutivas de módulos de FN do


Tipo III e o mecanismo de elasticidade molecular. A: conformação estendida, não tensionada,
disposta em “zig-zag”. B: três estágios de elasticidade molecular. B1: molécula relaxada em “zig-
zag”; B2: alinhamento dos domínios sob baixa tensão; e B3 e B4: desdobramento completo do
módulo central sob alta tensão (Adaptado de ERICKSON, 1994).

1.2.4- LAMININAS

As Lamininas são uma família de glicoproteínas heterotriméricas de


grande multi-domínio, com peso molecular de 500-800 kDa. Dezesseis
isoformas triméricas foram descritas em tecido humano, e estas isoformas
variam na sua especificidade celular e tecidual (Figura 7).
15

Figura 7 - Representação esquemática de uma molécula de Laminina. Adaptado de MATSUI


et al,1995.

Em geral, cada uma das isoformas de laminina é composta por três


cadeias, α, β e γ, e cada isoforma existe em cinco, quatro e três formas
geneticamente distintas, respectivamente (DOMOGATSKAYA, 2012). Estas
cadeias podem apresentar pequenas variações dando origem às cadeias α1, α2,
α3, α4, α5, β1, β2, β3, γ1 e γ2 que podem agrupar-se dando origem a várias
isoformas de laminina (Tabela 02) (TIMPL e BROWN, 1996).
Tabela 2 - Isoformas de lamininas

Isoformas Localização Cadeias


Laminina 1 EHS tumor α1β1γ1
Laminina 2 Músculo esquelético, cardíaco α2β1γ1
e nervos
Laminina 3 Junções neuromusculares e α1β2γ1
glomérulos renais
Laminina 4 Células de Shwann e músculo α2β2γ1
esquelético
Laminina 5 Junções epidermo-dermais α3β3γ2
Laminina 6 Junções epidermo-dermais α3β1γ1
Laminina 7 Âmnion humano α3β2γ1
Laminina 8 Córion humano α4β1γ1
Laminina 9 Córion humano α4β2γ1
Laminina 10 Âmnion humano e cultura de α5β1γ1
queratinócitos

Tabela 2 – Isoformas de lamininas. Adaptado de LUCKENBILL-EDDS, 1997.


16

As Lamininas contribuem para a estrutura da MEC e influenciam células


associadas em relação à adesão, diferenciação, migração, a estabilidade do
fenótipo, e resistência a apoptose, moléculas laminina não só interagem com o
colágeno tipo IV e integrinas, mas também com outros componentes da MEC e
da membrana basal, e assim contribuem para a estrutura global.
A rede insolúvel formada por laminina e colágeno tipo IV desempenha um
papel estrutural e funcional na membrana basal, bem como em células a ela
associadas.

1.2.5- FIBRINOGÊNIO

O fibrinogênio é uma das principais glicoproteínas solúveis do plasma,


onde atua como potencial precursor do produto final da coagulação sanguínea,
a fibrina. Neste sentido, o fibrinogênio é a única proteína coagulável presente no
plasma sanguíneo dos vertebrados (e alguns artrópodes). Estruturalmente, o
fibrinogênio é uma molécula longa e assimétrica (relação axial de 5:1, com
cerca de 97,5nm de comprimento e 350 kD de peso molecular, constituída
por três pares de cadeias polipeptídicas diferentes (2A-, 2B-, 2.
Cada molécula possui o dímero de duas subunidades simétricas, cada
uma contendo três cadeias diferentes (A alfa= 66,5kD; B beta= 52kD; gama=
46,5kd), unidas entre si por pontes dissulfeto. O dímero é estabilizado na região
central por estas pontes dissulfeto entre resíduos de cisteína das extremidades
aminadas dos três tipos de cadeias polipeptídicas de cada subunidade estrutural
(Figura 8).
17

Figura 8 - Estrutura do fibrinogênio, composto por duas cadeias alfa, duas betas e duas gamas,
unidas por pontes dissulfeto. A ação da trombina sobre os fibrinopeptídeos A e B permite a sua
liberação e a formação da fibrina. Adaptado de MOSESSON, 2005.

A fração glicídica (2%) do fibrinogênio é representada por


oligossacarídeos complexos, fixados a resíduos de asparagina das cadeias
polipeptídicas B/3 e –y. Estudos de microscopia eletrônica (MOSESSON, 2005)
e calorimetria vieram corroborar com as observações físico-químicas iniciais,
possibilitando a definição de um modelo estrutural para o fibrinogênio:
configuração alongada e sigmoidal em que se individualizam três grandes zonas
globulares, uma menor central e duas, mais volumosas, periféricas unidas entre
si por segmentos predominantemente helicoidais (FISH et al, 2012).
Fibrinogênio e fibrina participam de vários eventos celulares, tais como:
coagulação do sangue, interações entre MEC e células residentes, resposta
inflamatória, cicatrização de feridas e neoplasia (MOSESSON, 2005). Estas
funções são reguladas por sítios interativos durante a formação da fibrina, ou
interações entre fibrinogênio-superfície celular (MOSESSON, 2005).
A sequência primária do fibrinogênio humano, inicialmente definida por
análise sequencial de aminoácidos e depois confirmada por DNA recombinante,
está perfeitamente estabelecida. Existem grandes semelhanças entre os três
tipos de cadeias polipeptídicas do fibrinogênio humano e as cadeias homólogas
de todos os vertebrados.
18

Novos estudos de ocorrência natural sobre a fibrinogenemia e moléculas


variantes estão aumentando nossa compreensão das funções de fibrinogênio. O
fibrinogênio liga-se a integrina ativada na αIIbβ3 plaquetária de superfície,
ocorrendo a formação de pontes de plaquetas competentes para a agregação
na hemostasia, ele também tem importantes funções adesivas e inflamatórias
através interações específicas com outras células (ARMSTRONG e
PETER,2012).

1.2.6- ELASTINA

A tropoelastina elastina é a precursora do polímero insolúvel monomérico


Elastina, esta por sua vez é a principal componente de fibras elásticas no tecido
da MEC, e como tal, é o principal contribuinte para a elasticidade dessas fibras
(MUIZNIEKS et al., 2010). A tropoelastina é codificada por um único gene
humano, onde após traduzida é secretada com aproximadamente 60 kDa, na
forma não glicosilada, por uma variedade de células, incluindo fibroblastos,
células endoteliais e células musculares lisas, condrócitos e queratinócitos.
O splicing do transcrito primário da tropoelastina é tecido-específico e,
assim, permite ajuste conformacional e funcional para cada local (KIELTY et al.,
2006). O arranjo primário da tropoelastina possui domínios hidrofóbicos, ricos
em valina e prolina, proporcionando elasticidade ao produto final, a molécula
madura de elastina.
Estes domínios hidrofóbicos se alternam com domínios hidrofílicos que
contêm resíduos de lisina, cujo papel é o de estabilizar as microfibrilas de
elastina por reticulação (KIM et al., 2011).

1.2.7- FIBRILINA

A fibrilina-1, uma glicoproteína ligante do cálcio rica em cisteína, é o


principal componente das microfibrilas extracelulares. Ela é organizada em fibras
multiméricas compostas de dezenas ou talvez centenas de monômeros.
19

Alterações no gene da fibrilina-1 levam à Síndrome de Marfan (HANDFORD et


al, 2000).
Seu peso molecular é de 350kDa, sendo que ela contém
aproximadamente 14% de cisteínas e, consequentemente, pontes de dissulfeto
intra e inter-cadeias, fato que dificulta a obtenção de preparações puras dessa
proteína. Os monômeros de fibrilina são sintetizados por várias células da matriz
extracelular, incluindo fibroblastos, osteoblastos, células de músculo liso e
pericondrócitos. A proteína inicial tem uma sequência que serve como molde e
um propeptídio que são clivados antes que ocorra a montagem das microfibrilas
fora da célula.
A principal diferença estrutural entre as fibrilinas-1 e -2 é que a primeira
apresenta um domínio rico em prolina no éxon 10, enquanto a segunda é rica
em glicina. Além disso, ambas apresentam em seu éxon 37 um sítio de ligação
de integrina, RGD; na fibrilina-2, porém, há um sítio adicional no éxon 24
(WERNECK et al, 2004). Embora diferentes estas isoformas apresentam
distribuições distintas, mas que, algumas vezes, coincidem em determinados
momentos nos tecidos durante o desenvolvimento e na fase adulta, sendo a
isoforma mais encontrada em humanos adultos a fibrilina-1 (KIELTY et al, 2005).

A fibrilina-1 foi isolada de culturas de fibroblastos humanos,


caracterizada e batizada por Sakai e colaboradores, em 1986. Através da
utilização de anticorpos monoclonais específicos para fibrilina, Sakai demonstrou
a vasta distribuição no tecido conjuntivo da pele, pulmões, rins, vasculatura,
cartilagem, tendões, músculos, córnea e zônula ciliar (SAKAI et al., 1986).

As fibras elásticas e as microfibrilas são organizadas em tecidos


específicos e estão dispostas de acordo com as exigências mecânicas do
sistema de órgãos individuais. Na pele, as microfibrilas estão dispostas desde a
membrana basal da derme até a derme reticular, a qual permanece
paralelamente com as fibras elásticas e confere elasticidade à pele. Na aorta, as
microfibrilas se associam com a elastina na camada média para formar as
lâminas concêntricas que separam a camada muscular lisa. Nos olhos, as
microfibrilas formam feixes paralelos com a lente (Figura 9), (RAMIREZ e
RIFKIN, 2009).
20

Figura 9 - Principais etapas da formação das microfibrilas e fibras elásticas em três exemplos
de tecidos adaptado de Ramirez e Rifkin,2009).

1.2.8- FIBULINA

Fibulinas são um grupo de sete glicoproteínas que são expressas e


secretadas por vários tipos de células e tecidos, e são firmemente ligados a
membrana basal, fibras elásticas e outros componentes da MEC. Os membros
da família da fibulina são divididos em classes I e II, baseados nas suas
estruturas de domínio e comprimento (YANAGISAWA et al, 2010). A Classe II
consiste de fibulinas curtas 3,4,5 e 7, as Fibulinas 3 a 5 participam na formação
de fibras elásticas e são expressadas durante o desenvolvimento embrionário,
especialmente nos tecidos esquelético e cardiovascular, isto é facilitado pelos
íons de Ca2+.
Fibulina-3 é predominantemente encontrada no mesenquima, onde se
desenvolve em cartilagem e osso, Fibulina-4 é marcadamente expressa no
21

músculo cardíaco, Fibulina-5 é muito encontrada no sistema vascular e Fibulina-


7 é muito expressada nos dentes, placenta, folículos capilares e cartilagem
(WACHI et al, 2008).
As Fibulinas não atuam somente como componentes estrutural da MEC,
mas também como mediadoras de muitos processos celulares, tais como,
crescimento, diferenciação, angiogênese e crescimento tumoral. Com isso
atuando como moduladora do comportamento e função celular.

1.2.9 - TENASCINAS

As tenascinas (TNC), são glicoproteínas poliméricas com seis cadeias


longas, que possuem vários seguimentos em comum com a fibronectina.
Possuem ampla distribuição tecidual e são variáveis nos diversos tecidos e
estágios de maturação (CHIQUET-EHRISMANN, 1989). A família das
tesnacinas é constituída por três tipos específicos de proteínas: TNC-R,
constituinte do sistema nervoso central e periférico; TNC-X constituinte dos
músculos esquelético e cardíaco e TNC-C, constituinte de vários tecidos em
desenvolvimento, inclusive do SNC, mas ausente nos músculos estriados
esqueléticos e cardíacos. A função desta proteína é estrutural no mesênquima e
serve de moduladora para a função celular, devido ao fato de se ligar a
receptores específicos da família das integrinas (CHIQUET-EHRISHMANN,
1995).
A TNC está presente no mesênquima de tecidos embrionários, sendo
relacionada à indução executada por tecidos epiteliais em desenvolvimento,
principalmente em condensações como as glândulas mamárias, vibrissas e
dentes. Provavelmente, a tenascina é uma molécula com funções de adesão e
distribuição restrita nos tecidos (CHIQUET-EHRISMANN, 1989). O RNAm da
tenascina já foi demonstrado em células endoteliais, o que indica que estas
células são produtoras da molécula, bem como a sua associação a tecidos
neoplásicos já foi relatada. Natali e colaboradores (1991), demonstrou que
estágios iniciais da carcinogênese eram representados por um aumento na
deposição da tenascina (NATALI et al, 1991; LEE et al, 1995).
22

Em culturas celulares, foi observada a inibição do contato célula-célula,


promoção de adesão e não espraiamento destas células cultivadas. Também foi
observada a ação anti-adesiva, que se associando à atividade adesiva e de
espraiamento permite a movimentação celular com a manutenção da integridade
do seu citoesqueleto, durante a migração da fronte de invasão. (CHIQUET-
EHRISMANN, 1989). A TNC tem a sua expressão aumentada no estroma de
neoplasias malignas, principalmente devido ao fato de haver uma necessidade
de movimentação do tecido neoplásico durante o processo de invasão. A
alteração da permeabilidade, facilitando a migração das células epiteliais
complexas por sobre a matriz, justificariam o aumento da expressão desta
proteína.

1.2.10- TROMBOSPONDINAS

As trombospondinas (TSPs), compreendem uma família de glicoproteínas


extracelulares ligadoras de cálcio. O protótipo do grupo é a Trombospondina-1
(TSP-1), que tem funções na agregação plaquetária, resposta inflamatória e
regulação da angiogênese durante a cicatrização tecidual e crescimento tumoral.
Muitas dessas propriedades são compartilhadas com a TSP-2. Outra TSP que
tem sido estudada é Proteína Oligomérica da Matriz da Cartilagem (COMP ou
TSP-5), principalmente expressa nas cartilagens e outros tecidos conjuntivos.
Pouco se sabe sobre a biologia da TSP 3 e TSP 4 (ADAMS e LAWLER, 2004).
As TSPs podem ser divididas em dois subgrupos de acordo com sua
organização molecular: membros do subgrupo A (TSPs 1 e 2) são trímeros e
contêm uma região de sequência similar ao pró-colágeno, enquanto os do
subgrupo B (TSPs 3, 4 e 5) são pentâmeros e não possuem este domínio. Os
níveis de TSPs nos fluidos corporais e sua distribuição no tecido mudam nos
vários estados patológicos. Estão ligadas ao crescimento de tumores primários
e a metástases, ao desenvolvimento da placa aterosclerótica, à malária e outras
enfermidades (LAHAV, 1993).
Cada TSP tem um padrão de expressão no desenvolvimento tecidual
durante a vida, e dependendo do tipo celular e da TSP podemos evidenciar
atividades adicionais, tais como: indução da organização do citoesqueleto,
23

migração celular, modulação da proliferação celular e efeitos indiretos na função


celular através da regulação de proteases extracelulares, ativação ou inibição de
citocinas e fatores de crescimento (LAHAV, 1993).
Outra TSP que tem sido estudada é Proteína Oligomérica da Matriz da
Cartilagem (COMP ou TSP-5), principalmente expressa nas cartilagens e outros
tecidos conectivos. Pouco se sabe sobre a biologia da TSP 3 e TSP 4 (LAHAV,
1993).
A COMP/TSP-5 é uma proteína não colágena existente na matriz
cartilaginosa das articulações, mas também pode ser detectada em tendões,
meniscos, membranas sinoviais, humor vítreo e células musculares lisas
vasculares, porém em quantidades significativamente menores (RECKLIES et
al., 1998).

1.2.11 - PROTEOGLICANOS

Os proteoglicanos são moléculas formadas por um eixo proteico, ao qual


se ligam covalentemente cadeias laterais de glicosaminoglicanos (GAGs).
Encontram-se presentes em grânulos citoplasmáticos, na membrana celular e
na matriz extracelular (Figura 10).

Ácido Hialurônico
Proteoglicano
Condroitim
Sulfato (GAG)

Keratan
Sulfato
(GAG)

Proteína de
ligação

Esqueleto Proteico

Figura 10 – Desenho esquemático da molécula de Proteoglicano de cartilagem (Agrecan)


adaptado de themedicalbiochemistrypage.org.
24

A grande variedade estrutural ocorre devido a vários fatores, como por


exemplo: a expressão diferencial de genes que codificam o esqueleto proteico
de cada proteoglicano, as variações no tamanho, no número e nos tipos de
cadeias de GAGs, A Tabela 3 resume algumas características importantes das
proteoglicanas mais conhecidas (THEOCHARIS et al., 2010).

Tabela 3 – Características importantes das proteoglicanas mais conhecidas


adaptado de, SOUZA e PINHAL, 2011).

Proteoglicana GAGs componentes Localização Função


Suporte mecânico.
Condroitim Sulfato Cartilagem
Agrecan Forma grande
+
Queratam Sulfato Agregados com
hialuronas.

Condroitim Sulfato Superfície Liga-se ao fator de


Betaglican +
Dermatam Sulfato celular e matriz crescimento TGF-β

Distribuída em Liga-se a fibras de


Condroitim Sulfato
Decorin + colágeno do tipo 1 e
Dermatam Sulfato tecidos conjuntivos
TGF-β

Condroitim Sulfato Função estrutural e


Perlecan Lâmina basal
+ de filtração na
Heparam Sulfato lâmina basal.

Adesão celular. Liga-se a


Sindecan Heparam Sulfato Epitélios
fatores de crescimento.

A grande variedade de ligantes, que inclui fatores de crescimento,


moléculas de adesão, componentes da matriz, enzimas e inibidores enzimáticos,
é uma característica importante dos proteoglicanos (WU et al., 2005). Esta
especificidade de ligação é dependente tanto da interação com o esqueleto
proteico, como também das cadeias laterais de glicosaminoglicanos.
No interior da célula, o esqueleto proteico dos proteoglicanos é sintetizado
nos ribossomos e transferido para o retículo endoplasmático rugoso. A ligação
25

com cadeias de glicosaminoglicanos é efetuada no aparelho de Golgi em etapas


que envolvem a atividade de várias enzimas específicas (SOUZA e PINHAL,
2011).
Após a síntese, o proteoglicano é transportado por vesículas secretoras e
endereçado para grânulos intracelulares, superfície celular ou matriz
extracelular. Os glicosaminoglicanos são polissacarídeos lineares, não-
ramificados, constituídos de unidades dissacarídicas que se repetem, nas quais
um dos resíduos de açúcar é um ácido urônico (idurônico ou glucurônico) e o
outro é uma N-acetil-glucosamina ou N-acetil-galactosamina.
Os GAGs são classificados de acordo com os seguintes aspectos:
composição monomérica, tipo de ligações glicosídicas intra e interdissacarídicas,
e grau e da posição da sulfatação. Dentre os mais estudados estão: condroitim
sulfato, dermatam sulfato, heparam sulfato e queratam sulfato, além da heparina
e do ácido hialurônico (TAYLOR e GALLO, 2006).
O ácido hialurônico é o único GAG isento de sulfatação e que não se
encontra na forma de proteoglicano. A ligação do GAG ao núcleo proteico
envolve um tetrassacarídeo xilose-galactose-galactose-ácido glucurônico (GAG-
Xil-Gal-Gal-O-CH2-proteína). Estes resíduos sacarídicos são acoplados ao
esqueleto proteico por meio de uma ligação O-glicosídica de um resíduo de
serina. Algumas formas estão ligadas ao esqueleto proteico por meio de uma
ligação N-asparaginil (Figura 11).
26

Figura 11 - Esquema da estrutura de um proteoglicano de membrana, este esquema representa


um proteoglicano ancorado à membrana citoplasmática pela região hidrofóbica do esqueleto
proteico deste. As cadeias de heparam sulfato, dermatam sulfato e condroitim sulfato são ligadas
à proteína por resíduos de serina. A região de ligação tetrassacarídica também se encontra
representada pelos resíduos de xilose-galactose-galactose e ácido glucurônico. O ácido
hialurônico não se encontra ligado a um esqueleto proteico (Imagem adaptada de GANDHI e
MANCERA, 2008).

Os proteoglicanos interagem com as proteínas fibrosas da MEC, a


interação com o colágeno, por exemplo, possibilita a organização das fibras de
colágeno na matriz extracelular. Os GAGs também estão envolvidos na ligação
de cátions (como sódio, potássio e cálcio) e na retenção de água nos tecidos,
possuindo papel fundamental na hidratação da matriz extracelular e na
regulação de movimentos moleculares. Alguns proteoglicanos, presentes na
membrana celular, podem estabelecer ligações com fatores de crescimento e
hormônios, apresentando papel fundamental no controle do crescimento celular
e servindo como sinal para as células sofrerem divisão, podendo controlar, deste
modo, processos importantes como o desenvolvimento de tumores e a
embriogênese (CHEM et al., 1999). Estudos têm demonstrado que a importância
dos proteoglicanos ultrapassa muito seu papel estrutural, portanto, o estudo de
tais macromoléculas vem elucidando vários mecanismos moleculares
essenciais.
27

2 - BIOMEMBRANAS

A alta incidência de lesões provocadas por traumas causados por


diferentes fatores, envolvem de forma majoritária o sistema musculoesquelético.
Diante disso, a pesquisa e aperfeiçoamento de biomateriais que possam ser
utilizados na substituição do tecido ósseo, e mais ainda, que atuem como
indutores do processo de reparação óssea, vem ganhando cada vez mais
espaço na área de desenvolvimento de biomateriais. Dentre essas novas
tecnologias, a engenharia de tecidos tem obtido destaque.
A utilização de biomembranas obtidas de tecidos colagenosos tem sido
estudada com a finalidade de constatar sua eficiência no reparo de defeitos
ósseos. Membranas de colágeno possuem a capacidade de inibir o crescimento
e a migração dos tecidos epitelial e conjuntivo para áreas indesejadas,
permitindo a formação e/ou regeneração de um novo tecido sadio em uma região
que tenha sido previamente exposta.
Essas membranas mantêm a estabilidade do coágulo durante o processo
de reparo e promovem a migração celular seletiva. Dados da literatura
demonstram que tal material age como barreira na prevenção do crescimento de
tecido conjuntivo junto ao defeito, permitindo somente a neoformação óssea.
Sua capacidade de osteocondutividade caracteriza assim um método alternativo,
quando comparado ao uso de membranas não biorreabsorvíveis, e promissor na
área clínica de implantologia e na engenharia de tecidos. (PITARU et al., 1988;
BUNYARATAVEJ e WANG, 2001; WANG e SHAMMARI, 2002)
A utilização de biomembranas também vem sendo investigada para o uso
médico no tratamento de lesões de pele tais como queimaduras e ulcerações de
origem diabética e vascular como barreira contra microrganismos e perda de
eletrólitos (FRANCO e GONÇALVES, 2003).
Biomembranas para uso médico e odontológico podem ser preparadas
usando polímeros bioabsorvíveis ou não. Polímeros naturais como colágeno,
proteoglicanos, glicosamionoglicanos e elastina além de biocompatíveis,
participam no controle da estrutura do tecido e na regulação do fenótipo celular
28

(LEE et al, 2010). Assim, o colágeno, principal composto orgânico do tecido


ósseo, vem sendo amplamente usado como material na fabricação de
biomateriais, em especial, biomembranas.
A partir da túnica submucosa intestinal suína (SIS) é possível obter uma
biomembrana colagênica, acelular que é capaz de induzir a remodelação local
em diversos tecidos (FRY et al., 1986; DEJARDIN et al., 2001).
Depois de submetida a processos mecânicos e enzimáticos de
descelularização, a biomembrana apresenta apenas componentes da matriz
extracelular (MEC). Dentre esses componentes podemos citar os diferentes tipos
de colágenos (mais abundante o tipo I), glicosaminoglicanos (condroitim sulfato,
heparina, heparan sulfato e ácido hialurônico), fatores de crescimento,
proteoglicanos e glicoproteínas não-colagênicas (HODDE et al., 1996;
MCPHERSON e BADYLAK, 1998; SCHIMDT e BAIER, 2000).
O colágeno é considerado um dos mais proveitosos biomateriais (CHEN
et al., 2000). Devido às suas propriedades físico-químicas, presença ou adição
de ligações cruzadas ou reticulação variável que controla o grau de embebição
e reabsorção, físico-mecânicas (entrelaçamento ou orientação das fibras) e
biocompatibilidade, o colágeno é largamente utilizado como material para
implante, tanto na forma pura como na forma de gel (FRIESS, 2001) ou ainda
associado a outras moléculas, como polissacarídeos (DE PAULA, 2002).
Os proteoglicanos são constituídos basicamente por uma proteína central
na qual estão ligados covalentemente uma ou mais cadeias de
glicosaminoglicanos. As diferenças observadas tanto na proteína central quanto
nas classes de glicosaminoglicanos ligados permitem que os proteoglicanos
desempenhem importantes funções no organismo, como participação na
fibrilogênese do colágeno (SCOTT et al., 1981; SCOTT, 1992; YOON e
HALPER, 2005).
As biomembranas ricas em colágeno possuem boa mobilidade,
permitindo sua fixação nos tecidos lesionados, são receptivas às células
hospedeiras, não são carcinogênicas, são esterilizadas facilmente e possuem
ainda resistência a diferentes forças mecânicas (FRY et al., 1986; DEJARDIN et
al., 2001; Badylak et al., 2002). O processo regenerativo no local de implantação
gera um tecido estrutural e funcionalmente similar ao tecido original, sendo mais
organizado do que um tecido cicatricial (DERWIN et al., 2006).
29

Podemos extrair tecido rico em componentes da MEC de uma grande


variedade de tecidos, incluindo válvulas cardíacas (BADER et al., 1998;
SCHENKE-LAYLAND et al., 2003; RIEDER et al., 2004; GRAUSS et al., 2005),
vasos sanguíneos (SCHMIDT e BAIER, 2000; CONKLIN et al., 2002;
UCHIMURA et al., 2003), nervos (HUDSON et al., 2004), tendões (CARTMELL
e DUNN, 2000), tecido uretral (CHEN et al., 1999; FREYTES et al., 2004); e
fígado (LIN et al., 2004), sendo todos estes alvos da engenharia tecidual e da
medicina regenerativa.
Outro ponto positivo é o fato dos componentes da MEC se manterem
constantes entre diferentes espécies animais sendo, portanto, bem tolerados
mesmo em destinatários xenógenos (GILBERT et al., 2006). Esse fato abre
caminho para que estudos utilizem tais fontes teciduais na produção de
arcabouços descelularizados, submetendo-as a variados processos de remoção
celular.
Com respeito às reações imunes, as biomembranas de colágeno não
promoveram reações de rejeição quando implantadas em ratos, mas foi descrita
a existência de uma resposta imune, ativando células T-helper-2, bem como
citocinas, fator de necrose tumoral IL I e IL VI (HODDE et al., 2007a). Hodde e
colaboradores (1996) atribuem ainda esta capacidade à presença dos
glicosaminoglicanos, que podem ativar citocinas e os inúmeros fatores do
crescimento que participam em processos cicatriciais e de revascularização.
Outra importante característica das biomembranas provenientes da
submucosa intestinal é a capacidade de ser degradada rapidamente e
completamente após implantação (BADYLAK et al., 2001). Estudos quantitativos
com biomembranas contendo C14 utilizadas em reconstrução de tendão
calcâneo mostraram que 50% da biomembrana implantada é degradada e
reabsorvida até o 28º dia após a cirurgia e, até o 60º dia, toda a biomembrana
foi substituída por um novo tecido. Mais ainda, 95% da biomembrana implantada
foi excretada pela urina e há indícios da não reutilização dos componentes
biológicos por outros tecidos (BADYLAK et al., 2001; RITCHEY e RIBBECK,
2003).
Estudos experimentais têm demonstrado que depois de implantada, a
biomembrana torna-se um arcabouço biológico (“bioscaffold”) promovendo uma
resposta angiogênica e aumento na migração celular.
30

O processo regenerativo gera um tecido estruturalmente e funcionalmente


similar ao tecido original, sendo mais organizado do que um tecido cicatricial
(DERWIN et al., 2006). A comercialização de produto a partir da SIS é autorizada
pelo FDA- Food And Drug Admnistration (Surgisis® Cook Medical, USA).
Historicamente na odontologia, os procedimentos utilizados para tratar os
tecidos doentes incluem raspagem e alisamento radicular, curetagem gengival e
cirurgia com retalhos, com ou sem a utilização de enxertos. Esses tratamentos
normalmente induzem ao reparo, caracterizados pela formação de epitélio
juncional longo adjacente a raiz dentária. No entanto, a regeneração de cemento,
ligamento periodontal e do osso alveolar nem sempre é alcançada com esses
tratamentos (GREENSTEIN e CATION, 2000), isto porque, a formação de novo
tecido ósseo após a intervenção cirúrgica é frequentemente prejudicada pela
infiltração de células do tecido conjuntivo de crescimento mais rápido, tais como
fibroblastos do tecido gengival. (SCHELEGEL et al., 1997).
Originalmente, a Regeneração Tecidual Guiada (RTG) foi descrita na
literatura como o emprego de barreiras físicas, ou veículo, com a finalidade de
regenerar o tecido ósseo (IAMAGUTI et al, 2008). Atualmente ocorre a
extrapolação desta técnica para vários tecidos, como tecido nervoso,
cartilaginoso e conjuntivo. É importante salientar que, além do papel de barreiras
físicas, as biomembranas devem promover uma resposta celular seletiva sem
produzir reação inflamatória e, além disso, sua aplicabilidade apresenta certo
grau de especificidade ao tipo de tecido onde será implantada (SENISE et al
1999).
As membranas ou barreiras mecânicas para RTG têm como função
impedir a migração de células do epitélio e do tecido conjuntivo, promovendo
espaço adequado para a formação de um arcabouço natural de fibrina, precursor
do tecido ósseo. Com isso torna-se biologicamente viável a migração de células
progenitoras dos remanescentes do ligamento periodontal e do osso alveolar
para o interior do defeito ou para a superfície de uma raiz raspada a fim de que
as mesmas façam sua diferenciação em osteoblastos e osteoclastos, cumprindo
então seu papel regenerador.
Inicialmente a técnica de RTG foi desenvolvida com a aplicação de
barreiras não reabsorvíveis. Entretanto, a utilização desse tipo de material exige
um segundo procedimento cirúrgico para remoção da membrana. As barreiras
31

biorreabsorvíveis (Figura 12) despertam grande interesse, pois não exigem um


segundo ato cirúrgico para sua remoção, eliminando o trauma cirúrgico no tecido
periodontal novo e imaturo que foi regenerado (WANG e MCNEIL, 1998).

Figura 12 – Ilustração da utilização de membrana na técnica de regeneração tecidual guiada


(RTG). Seta negra indicando o defeito no tecido e a seta azul indica a membrana adaptado de
GOTTLOW ,1993.

Os princípios da utilização de membranas como barreiras biológicas,


também foram usados na recuperação de defeitos ósseos extensos, chamados
de defeitos ósseos perenes, recebendo o nome de Regeneração Óssea Guiada
(ROG), (Figura 13), cujo objetivo é promover aumento do volume ósseo,
utilizando-se uma membrana como barreira.
A técnica de ROG vem sendo aplicada na clínica odontológica em
diferentes casos, incluindo a terapia com implante dentário, nos casos em que o
volume ósseo no local do implante seja insuficiente. Dessa forma, as membranas
podem ser associadas a enxertos ósseos também no tratamento de defeitos
intra-ósseos periodontais, lesão de furca e deiscências (WANG e MACNEIL,
1998; BUNYARATAVEJ e WANG, 2001; PAOLANTONIO, 2002). Tem sido
utilizada ainda em cirurgias paraendodonticas, onde a proliferação de tecido
conjuntivo para o interior do sítio cirúrgico poderia dificultar a regeneração dos
tecidos (MARÍN-BOTERO et al., 2006).
Grande parte das membranas de colágeno disponíveis comercialmente é
proveniente do colágeno tipo I, mas existem membranas formadas por colágeno
32

tipo I e tipo III (BUNYARATAVEJ e WANG, 2001). O colágeno extraído pode ser
proveniente de diferentes espécies (bovina, suína e ratos) e sítios anatômicos
(pericárdio, dura mater, fáscia do temporal, derme, tendão, dentre outros)
(PITARU et al., 1988; BUNYARATAVEJ e WANG, 2001).

Figura 13 – Ilustração da utilização de membrana associada a enxerto ósseo em ROG. Seta


negra indicando a região do enxerto ósseo e seta azul indicando a membrana, adaptado de
GOTTLOW ,1993.

No tratamento de queimaduras e ulcerações da pele, as biomembranas


exercem as seguintes funções: restauram a barreira de vapor e previnem a
desidratação da ferida; diminuem a evaporação por perda de calor; previnem a
contaminação bacteriana protegendo a ferida e o paciente da septicemia;
permitem trocas menos dolorosas de curativos; facilitam o debridamento da
ferida além de melhorar a qualidade da cicatrização (WINTER et al., 2000).
A utilização das biomembranas obtidas a partir da SIS tem sido também
aplicada com sucesso em cirurgias de reconstrução ligamentar (BIGLIANI et al.,
1992; AIKEN et al., 1994; DERWIN et al., 2006) e tendinosa (BADYLAK et al.,
1995), de estética facial (DEJARDIN et al., 1999), de reconstrução do trato
gênito-urinário (KROPP, 1998) e das meninges (COBB et al., 1996).
33

3 – ESTADO ATUAL

Uma das formas da utilização do colágeno na cirurgia médica e


odontológica consiste na obtenção de biomembranas para atuar como barreira
mecânica biodegradável e biocompatível. Além de um método de obtenção
relativamente barato, os tecidos de origem animal são abundantes e as técnicas
de processamento, bem como sua eficiência pós-implante estão documentadas
em vasta literatura (PITARU et al., 1988; BUNYARATAVEJ e WANG, 2001;
WANG e SHAMMARI, 2002).
Em especial na odontologia, a utilização das biomembranas é usualmente
destinada na reconstrução buco-maxilo-facial atuando como barreira mecânica
para impedir a migração de tecido mole circundante que tem uma velocidade de
crescimento maior em relação àquela do tecido ósseo (GOTTLOW J,1993).
Os biomateriais aplicados na odontologia são uma importante área ainda
não coberta pelo SUS, porém em estado de pleno crescimento mercadológico
em nível mundial. Este fato é atribuído ao avanço tecnológico no
desenvolvimento de novas técnicas possibilitando a massificação do
procedimento cirúrgico regenerativo. O mapeamento da atuação das empresas
em nível mundial demonstra a importância da inovação tecnológica, em especial
do mercado nacional onde empresas atuantes no segmento, pouco tem gerado
de inovações (marketsandmarkets.com Publishing Date: May 2011 Report Code:
BT 1607).
Nas aplicações na medicina, a utilização das biomembranas está
direcionada ao tratamento de lesões de pele tais como queimaduras e
ulcerações da pele de natureza diabética ou vascular, propiciando recuperação
mais rápida e menos dolorosa ao paciente, além de reduzir substancialmente as
cicatrizes provocadas por esses tipos de ferimentos (GINDL et al., 2006; NEEL
et al., 2012; SARGEANT et al., 2012).
O desenvolvimento das biomembranas ora proposto, justifica-se pelo fato
de que além de ser um material clinicamente eficiente, fato este demonstrado
em várias publicações científicas que contam neste trabalho, existe um mercado
no segmento médico e odontológico, nacional e internacional, em plena
ascensão e pouco explorado pela indústria brasileira. Por isso, a necessidade de
um produto com características inovadoras, tais como presença de
34

macromoléculas que atuem melhorando o processo de regeneração tecidual,


desenvolvido e comercializado dentro do país cresce a cada dia.
Este trabalho pretende estabelecer uma relação estrutura-função das
biomembranas, correlacionando a morfologia e distribuição das fibras colágenas
e macromoléculas da MEC, com suas propriedades biomecânicas e
bioquímicas. Ainda, destaca-se o fato de que o projeto ora proposto se mostra
relevante para o desenvolvimento nacional da área biomédica, e irá utilizar
tecnologia e matéria-prima nacionais, tendo como premissa a oferta ao mercado
de um produto com custo inferior, com qualidade, eficiência e eficácia,
propiciando retorno imediato à população, sendo, portanto, de grande valia
social e econômica para o país.
35

4 – OBJETIVOS

Este trabalho teve como objetivo desenvolver e caracterizar uma nova


biomembrana rica em colágeno, bem como compará-la a algumas já existentes
no mercado nacional.
36

5- MATERIAIS E MÉTODOS

Para o desenvolvimento deste estudo foram avaliadas, além da MEC


UNIAN, outras quatro biomembranas largamente utilizadas no mercado
nacional, e por sua vez, provenientes de diferentes processos de síntese. A
Tabela 4 mostra as características de cada membrana incluída neste estudo.

Tabela 4 – Características gerais das membranas avaliadas

NOME DO PRODUTO FABRICANTE COMPOSIÇÃO TIPO DO TECIDO BIORREABSORVIDA


Membrana de cortical Tecido ósseo Sim
GEN DERM BAUMER
óssea bonina bovino
Membrana de Tecido ósseo Sim
LUMINA-COAT CRITÉRIA colágeno tipo I bovino
desmineralizado
Politetrafluoroetileno Origem sintética Não
SURGITIME PTFE BIONNOVATION

Matriz orgânica de Tecido bovino Sim


SURGIDRY DENTAL F TECHNODRY colágeno tipo I polimerizado e
purificado
Colágeno tipo I, Submucosa Sim
MEC UNIAN
glicosaminoglicanos intestinal suína

5.1 – SÍNTESE DE BIOMEMBRANAS

As biomembranas (MEC UNIAN), desenvolvidas neste trabalho foram


sintetizadas a partir da submucosa intestinal suína (SIS) desidratadas. Para
tanto, os intestinos suínos foram adquiridos de frigoríficos qualificados e
certificados pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária)
O processo de obtenção das biomembranas produzidas neste estudo,
está descrito no documento de patente nº PI0805153-4 A2, disponível para
consulta no site do INPI. Abaixo, a figura 14 mostra o fluxograma da síntese
destas biomembranas.
37

Figura 14 - Fluxograma do processo de descelularização.

Em linhas gerais o material depois de recebido do frigorífico, foi limpo e


cortado em seguimentos de 15 cm de comprimento, as peças obtidas foram
lavadas exaustivamente com água ultrapura (WFI), obtida por osmose reversa
e, posteriormente lavadas em solução de hipoclorito de sódio (0,1%) por 30 min
sob agitação branda. O próximo passo consistiu em outra lavagem em água
corrente e limpeza mecânica para remoção de resíduos grosseiros, conforme
mostrado na figura 15.
38

Figura 15 – Remoção grosseira de resíduos, realizada por meio de raspagem do material.

Na etapa seguinte o material passou por um tratamento termoquímico,


onde foi imerso em solução enzimática a base de Lauril Sulfato de Sódio e as
proteases Lipomax NA e Protemax N600 (PROZYN) por 12 hs sob agitação
(Agitador Q261-22, Quimis). Posteriormente, o material foi lavado com água
ultrapura (WFI) e submetido por outras 12 horas ao segundo tratamento com
solução enzimática, desta vez a base de Lauril Sulfato de Sódio e lipase. Após
esse novo período de incubação foi realizada outra lavagem com água ultrapura
(WFI), conforme mostrado na figura 16.

Figura 16 – SIS em agitação e imersa em solução enzimática.


39

Na etapa seguinte as membranas foram colocadas esticadas sobre


superfície regular de Teflon (Figura 17), e resfriadas a 3,5 °C por 12 horas. As
amostras foram então posteriormente colocadas em estufa a 40°C por 12 horas
e a 65°C por mais 12 horas com ventilação forçada.

Figura 17 – SIS esticada sobre Teflon e colocada no processo de secagem.

Finalmente, o material foi submetido ao tratamento químico, onde o foi


imerso em uma solução de HCl a 1 M, sob agitação por 24 horas. Ao final da
incubação, as amostras foram novamente lavadas em água ultrapura WFI e
posteriormente liofilizadas (Liotop L101 – Liobrás- Brasil).

5.2 – CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS E ESTUDO COMPARATIVO

5.2.1 – Ensaio de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Energia


Dispersiva Espectroscópica (EDS)

Para a análise em MEV as membranas foram cortadas em fragmentos


com cerca 9 mm de largura e fixadas em suporte de alumínio com o auxílio de
fita adesiva. Em seguida, as membranas foram submetidas ao processo de
metalização em câmara à vácuo (Denton Vacuum Desk V, Denton Vacuum,
Moorestown, USA), sendo cobertas com micropartículas de ouro.
Posteriormente, as amostras foram avaliadas em microscópio eletrônico de
40

varredura (MEV) (Zeiss, modelo EVO LS15). Este equipamento possui


capacidade de aumento de 700.000x e resolução de 3nm, aceleração de
voltagem de 15kV, utiliza sensores de elétrons secundários (SE), que captam
imagens de relevo da amostra, ou utiliza o sensor de elétrons backscatering
(BSE), que gera uma imagem com diferenças de contraste onde elementos
químicos de maior número atômico aparecem mais contrastados (claros) em
relação aos menos contrastados (escuros). As imagens digitais foram obtidas
através da detecção de sinais secundários de elétrons emitidos pelas amostras
quando as mesmas foram expostas ao feixe de elétrons.
Para analisar a composição atômica das membranas, foi utilizado um
espectrômetro de dispersão de energia de raios-X (EDS) (Oxford, modelo X-act)
integrado ao MEV, onde foi feita a análise química por energia dispersiva de
raios-X para todos os elementos da tabela periódica salvo (H, He, Li e Be), com
resolução de 0,5μm possibilitando gerar gráficos de composição ou
mapeamentos por elementos na imagem. A interação entre um feixe de elétrons
e uma amostra produz uma variedade de emissões, dentre elas raios-X. O
detector de energia dispersiva do aparelho absorve e separa os raios-X
característicos de cada elemento. Através de software, obtêm-se análise semi-
quantitativa da percentagem de cada átomo dentro do material analisado, sendo
os resultados expressos em histogramas.

5.2.2 – Extração dos Glicosaminoglicanos

As membranas dos diferentes fabricantes, bem como a MEC UNIAN,


foram picotadas à temperatura ambiente e colocadas em solução de acetona
100% para remoção dos lipídeos.
Os fragmentos foram, posteriormente, retirados da acetona, sendo então
submetidos a secagem em estufa a 50°C, para a obtenção do pó cetônico, que
foi pesado individualmente em balança analítica. O pó seco foi submetido à
proteólise por maxatase 4mg/mL em tampão Tris-HCl 0,05M pH 8,0 com NACl
1M na proporção de 1g de pó cetônico para cada 20 mL de tampão, sob agitação.
A solução foi mantida sob agitação por 12 h a 60°C. Posteriormente, ácido
tricloroacético 90% foi acrescentado a solução até atingir a concentração de 10%
do volume final para precipitação dos ácidos nucléicos e peptídeos. A solução
41

foi deixada sem agitação por 20 minutos a 4°C. A seguir, o material foi
centrifugado a 5000rpm por 20 minutos a temperatura ambiente e o precipitado
descartado. Em seguida, foram adicionados 2 volumes de metanol ao
sobrenadante para a precipitação dos glicosaminoglicanos, que foi realizada a -
20°C (freezer) por 24 horas. Foi realizada nova centrifugação a 5000rpm por
mais 20 min em temperatura ambiente e o sobrenadante foi novamente
descartado. O material precipitado contendo os GAGs foi seco em estufa e
ressuspenso em água destilada na proporção de 5 mg pó cetônico para 10 μL
de água destilada.

5.2.3 – Eletroforese em Gel de Agarose

Os compostos provenientes da extração foram identificados por


eletroforese em gel de agarose e quantificados por densitometria (JACQUES et
al, 1968; DIETRICH, DIETRICH, 1976; NADER et al., 1984), da seguinte
maneira:
Foi retirada uma alíquota de 5μL para aplicação em lâmina de gel de
agarose 0,6%, com espessura de 0,2cm em tampão 1,3 diaminopropano acetato
(PDA) 0,05M pH 9,0. A corrida eletroforética foi realizada em caixa refrigerada a
4°C, com diferença de potencial elétrico de 100V, durante cerca de uma hora e
trinta minutos, ou até que se obtivesse a migração desejada, indicada pelo
corante vermelho de cresol. A origem da eletroforese corresponde ao pólo
negativo, uma vez que os glicosaminoglicanos apresentam carga aniônica e,
portanto, migram para o pólo positivo.
Neste tipo de eletroforese em gel de agarose tampão PDA, os
glicosaminoglicanos são separados pela capacidade de interação com a diamina
do tampão. Sendo assim, os compostos que menos interagem com o
diaminopropano, tem maior migração eletroforética. Portanto, o tampão PDA
discrimina por ordem decrescente de mobilidade eletroforética, respectivamente,
o condroitim sulfato (CS), o dermatam sulfato (DS) e o heparam sulfato (HS).
Após a corrida eletroforética, os glicosaminoglicanos foram precipitados
no gel com CTV-cetavlon (brometo de cetiltrimetilamônia) 0,1% por um período
mínimo de duas horas.
42

A seguir, a lâmina de gel de agarose foi submetida a secagem sob calor


e ventilação e o gel foi corado com solução de azul de toluidina 0,1% em ácido
acético 1% e etanol 50%. O excesso de corante foi removido por solução de
ácido acético 1% e etanol 50%. Finalmente o gel foi seco a temperatura
ambiente.

5.2.4 – Avaliação do padrão estrutural do colágeno por microscopia de varredura


confocal SHG (Geração de fluorescência por Segunda Harmônica)

A Geração de Segunda Harmônica ocorre quando o campo elétrico da luz


que excita uma determinada molécula é suficientemente forte para deformá-la.
Caso a molécula alvo seja estruturalmente assimétrica, a anisotropia resultante
cria um campo oscilante com duas vezes a frequência inicial (GAUDERON et
al,2001). Isso significa que a capacidade de gerar segundas harmônicas é
peculiar para moléculas que não são centrossimétricas, como é o caso do
colágeno.
Baseado neste conhecimento, os padrões estruturais e de distribuição do
colágeno foram avaliados em todas as biomembranas estudadas. Para tanto,
fragmentos de 1 cm2 foram levados, sem nenhum tipo de tratamento, para o
microscópio confocal de varredura e laser ( , Alemanha), previamente
configurado com o seguinte padrão de excitação: Laser de Titânio-Safira (Ti-S)
em pulsos que variaram de 100 a 200 fs em um comprimento de onda de 1600
nm e incidência multifóton.
As imagens foram adquiridas em planos variantes do eixo-Z, em secções
de 12 µm até que a imagem em 3D pudesse ser formada e o padrão de
visualização do colágeno fosse avaliado.

5.2.5 - Estudo das propriedades mecânicas das Biomembranas


O ensaio de tração permite avaliar o comportamento do material sob carga
de tração elástica ou lentamente aplicada. O alongamento e a força aplicada
43

podem ser medidos e obtém-se então uma curva de força em função do


alongamento, esta curva é dependente das dimensões da amostra. Todavia,
calculando-se a tensão e deformação de engenharia ou nominal
correspondentes, obtemos uma curva de tensão-deformação para um
determinado material, independentemente de suas dimensões, e isso representa
o comportamento do material sob tração, figura 18 (ORÉFICE, 2006).

Figura 18 - Curva tensão x deformação para enxerto derivado de pele de cadáver humano
(Adaptado de KLEINER, 2005).

As análises de todas as amostras foram realizadas em triplicata utilizando


um equipamento de tração Filizola, modelo BME-20kN, com célula de carga de
50N (5 kgf), resolução de 0,003N e velocidade de separação das garras de 20
mm/min (Figuras 19 e 20).
44

Vel.= 20 mm/min

Corpo de prova Garras auto-


travantes superior
e inferior

Figura 19 - Corpo de prova posicionado no equipamento de tração e dispositivo de garras.

Figura 20 – Amostras utilizadas nos ensaios de tração/deformação.


45

5.2.5.1 - Equipamentos utilizados no ensaio mecânico

Tabela 5 – Equipamentos utilizados para o ensaio de tração das amostras

Máquina, modelo Característica Calibração Validade

Máquina de tração, Filizola, Célula de carga de 50N (5 Nº: R10383/13 Elus 29/11/2015
modelo BME-20kN kgf), resolução de 0,003N Instrumentação

Paquímetro, Digimess 150mm, resolução 0,01 mm Nº 4199/13 28/10/2015


Balança Eletrônica, Resolução 0,0001g = 0,1 mg Nº 13.516.722-0 Dez/2015
Shimadzu, AUY 220

5.2.5.2 - Parâmetros do ensaio mecânico

 Velocidade de separação das garras: 20 mm/min


 Dimensão dos corpos de prova (CP): Tabela 6
 Distância entre garras (L0):

Tabela 6 – Parâmetros do ensaio de mecânico

Item Material Comprimento Distância entre


do CP (mm) garras (mm)
1 Lumina Coat 30 15
2 Technodry 30 15
3 Amostras MEC UNIAN 30 15
4 Gen Derm 30 15
5 Bionnovation 30 15
46

5.3 - ENSAIO DE BIOCOMPATIBILIDADE EM MODELO ANIMAL

Para avaliar a biocompatibilidade tecidual da nova membrana foram


utilizados ratos Wistar machos, provenientes do setor de criação da Tecam
Tecnologia Ambiental, divididos em cinco grupos contendo 5 animais cada
grupo, que receberam implantes subcutâneos de MEC UNIAN e Lunina-Coat
(Critéria – São Paulo - SP) como controle. A metodologia utilizada segue os
procedimentos descritos no “Pratical Guide to ISO 10993-6: Implant Effects” (ISO
10993, 2000).
Todos os animais foram pesados e anestesiados com associação de
quetamina 80 mg/kg pc (peso corpóreo) + xilazina 10 mg/kg pc, por via
intraperitoneal. Após a perda de sensação dolorosa, os animais foram
tricotomizados em toda região dorsal, e receberam do lado esquerdo a MEC
UNIAN e do lado oposto, a membrana da Lumina-Coat que serviu como material
controle. O tamanho de membrana a ser utilizado foi padronizado em 1,0 cm2
(Figuras 21 e 22).

A B

Figura 21 – Apresentação dos materiais implantados: A) MEC UNIAN e B) Lumina-Coat

Em seguida, foram feitas incisões na pele dos animais (em formato de “L”)
de aproximadamente 1,5 cm; a pele foi divulsionada e o material implantado na
região subcutânea, entre a pele e a musculatura dos animais (Figura 25). Por fim
a pele foi suturada com fio cirúrgico de nylon. Após 7 dias, foi feita a retirada dos
pontos cirúrgicos da pele dos animais, nos animais que ainda estavam em
experimento. O material foi coletado nos diferentes grupos experimentais em
47

períodos de 3, 7, 28, 42 e 84 dias, sendo que 5 animais foram eutanasiados em


cada bloco temporal

.
Figura 22 – Implante subcutâneo de MEC UNIAN

Posteriormente, a região de implante foi retirada com 2 mm de área


adjacente (Figura 23). O material foi fixado em formol 10% e encaminhado para
exame histopatológico, no qual foram feitas as colorações de Hematoxilina-
Eosina (HE), Von Kossa e Tricrômio de Masson, para observação de calcificação
e inflamação, em cada amostra retirada.

Figura 23 – Retirada da região do implante e tecido adjacente


48

6 - RESULTADOS

6.1 – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

Por meio da microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram avaliadas


as superfícies das membranas oriundas dos diferentes fabricantes. Foram
selecionados os aumentos de 1000 e 3000X, uma vez que mostram diferentes
perspectivas dos produtos analisados. Os resultados apresentados a seguir
mostram que a morfologia das superfícies variou consideravelmente entre as
membranas estudadas. Nas figuras 24 A e B (aumentos de 1000 e 3000X
respectivamente) é possível notar uma distribuição heterogenia das fibras de
colágeno, resultando em uma superfície com elevada porosidade na membrana
LUMINA-COAT, e também uma alta variabilidade no diâmetro dos poros.

Figura 24 A e B – Avaliação por MEV da membrana Lumina-Coat. (Aumentos de 1000 e 3000X


respectivamente). As fibras de colágeno mostram uma trama heterogenia e com elevada
porosidade.

As figuras 25 A e B, mostram a superfície da membrana SURGIDRY


DENTAL, onde se pode notar um padrão diferente do apresentado anteriormente
na distribuição das fibras de colágeno. Nesta membrana as fibras possuem uma
menor espessura e se distribuem pela membrana mais desorganizadamente.
Por outro lado, devido a essas características, a trama molecular acaba sendo
mais coesa e, consequentemente, menos porosa.
49

Figura 25 A e B – Avaliação por MEV da membrana Surgidry Dental. (Aumentos de 1000 e


3000X respectivamente). As fibras de colágeno mostram uma trama mais filamentosa, com
espessura variável das fibras colágenas e menor porosidade.

As figuras 26 A e B mostram a morfologia da membrana GEN DERM. Por


se tratar de uma membrana preparada a partir de cortical óssea bovina ela difere
estruturalmente das outras apresentadas anteriormente. É possível visualizar
nas imagens a seguir características típicas de um tecido parcialmente
mineralizado e organização histológica coerentes ao tecido de origem. Nota-se
a presença de poros de grande diâmetro, possivelmente remanescentes dos
canais haversianos.

Figura 26 A e B – Avaliação por MEV da membrana Gen Derm. (Aumentos de 1000 e 3000X
respectivamente). Formada por uma estrutura mais organizada, características de tecido ósseo,
essa membrana não permite a visualização clara das fibras colágenas, uma vez que o material
é parcialmente mineralizado. A abertura, claramente mostrada no painel A, indica a presença de
sistemas haversianos na membrana.
50

Única representante das membranas totalmente sintéticas, as


características morfológicas da membrana SURGITIME PTFE são apresentadas
nas Figuras 27 A e B. Por se tratar de um material polimérico a base de
Politetrafluoroetileno essa membrana apresenta camadas superpostas de
polímeros, que se assemelham a escamas. Nitidamente menos porosa, a
membrana SURGITIME PTFE, provavelmente, apresenta menor permeabilidade
quando comparada as demais avaliadas neste estudo.

Figura 27 A e B – Avaliação por MEV da membrana surgi time PTFE. (Aumentos de 1000 e
3000X respectivamente). Padrão escamóide da membrana sintética, mostrando estrutura
polimérica típica e poucos poros.

As figuras 28 A e B, mostram o perfil microscópico da membrana MEC


UNIAN. É possível notar que, diferentemente das demais, essa membrana
apresenta, além das fibras colágenas mais calibrosas, uma quantidade,
nitidamente, superior de MEC. Comparativamente, a porosidade é inferior à das
outras membranas de origem animal, característica que pode ser positiva em um
biomaterial que necessita de uma certa impermeabilidade para evitar o
encharcamento e posterior perda das características físicas.
51

Figura 28 A e B – Avaliação por MEV da membrana MEC UNIAN. (Aumentos de 1000 e 3000X
respectivamente). Fibras colágenas mais calibrosas e MEC mais estruturada. É possível notar a
presença de poros, no entanto eles apresentam-se em menor quantidade e menos calibrosos do
que os observados nas demais membranas avaliadas.

6.2 – ESPECTROSCOPIA DE ENERGIA DISPERSIVA (EDS)

A avaliação por EDS tornou possível identificar parte da composição


química de cada uma das membranas. Os dados são expressos como
percentagem em relação ao peso, não sendo considerados os átomos de
carbono e nitrogênio, os quais, devido ao baixo número atômico, não são
quantificados de forma precisa. A Tabela 8 mostra as médias dos resultados
obtidos das análises de cada uma das membranas estudadas.
A Figura 29, mostra ilustrações representativas das áreas avaliadas de
cada membrana, no entanto, o estudo calculou os valores baseado na aferição
de três áreas para cada grupo. Os resultados mostram diferenças pouco
significativas na composição química das membranas, com destaque apenas
para a elevada concentração de Flúor, na forma de íon fluoreto (F-), na
membrana SURGI TIME.
52

Figura 29 – Análise de EDS nas membranas, (A) MEC UNIAN, (B) LUMINA COAT, (C)
GENDERM, (D) SURGI TIME e (E) SURGIDRY.

Tabela 7 – Determinação da composição química das membranas por EDS

AMOSTRA C N O K+ Cl- Mg2+ Na+ F- Ca+

MEC UNIAN 48,01 21,10 27,53 0,55 0,24 0,65


LUMINA
44,77 25,36 27,48 2,37
COAT
GEN DERM 50,77 23,60 25,62

SURGI TIME 26,90 73,09

SURGIDRY 47,57 23,66 24,66 2,27 0,88 0,95


* Valores obtidos da média da análise de três pontos de cada amostra, e expressos em
porcentagem em relação ao peso total, excluindo-se os átomos de carbono e nitrogênio.

6.3 – QUANTIFICAÇÃO DOS GLICOSAMINOGLICANOS

A Figura 30, mostra os resultados referentes a presença de


glicosaminoglicanos sulfatados na composição das membranas avaliadas. É
possível notar que apenas a MEC UNIAN possui 0,4 mg/mg de amostra de
Dermatam Sulfato, enquanto as outras membranas, talvez pela diferença
estrutural apresentada em suas MECs, não apresentaram glicosaminoglicanos,
em níveis detectáveis, na sua composição.
53

Figura 30 – Perfil eletroforético em gel de PDA de Glicosaminoglicanos Sulfatados extraídos das


membranas: P) Padrão, 1) SurgiDry, 2) MEC UNIAN, 3) Gen Derm, 4) Lumina Coat e 5) Surgi
Time; HS) Heparam Sulfato, DS) Dermatam Sulfato e CS) Condroitim Sulfato.

6.4 – AVALIAÇÃO ESTRUTURAL DO COLÁGENO POR MICROSCOPIA CONFOCAL DE

FLUORESCÊNCIA INTRÍNSECA.

Como descrito anteriormente em métodos, a molécula de colágeno,


quando estruturada (em sua forma nativa), é capaz de emitir fluorescência sem
qualquer tipo de marcação indireta. A Figura 31, mostra em 3D como o colágeno
se distribui nas membranas estudas. Cabe ressaltar que a membrana Surgi
Time, que é a única de origem sintética e, portanto, não possui colágeno em sua
estrutura, não pode ser avaliada. Corroborando com os dados obtidos pela
Microscopia Eletrônica de Varredura, a membrana Gen Derm, feita a partir de
cortical óssea bovina (Painel A), apresenta um padrão diferenciado de
distribuição de colágeno, mostrando claramente regiões, onde provavelmente
estão localizados os grandes poros, onde as fibras estão ausentes. Já a
membrana Lumina Coat (Painel B), por possuir filamentos de maior diâmetro
preenche o campo avaliado irregularmente. Ainda, é possível reconhecer as
regiões onde se encontram os grandes poros. O Painel C mostra o padrão
estrutural do colágeno da MEC UNIAN, que, mais uma vez, como mostrado pelos
MEVs mostra um perfil de distribuição denso do colágeno, com poucos poros
detectáveis. Já o Painel D, mostra a membrana Surgidry, que por possuir
54

filamentos de colágeno mais delgados que as demais, apresenta uma superfície


com menos irregularidades, o que resulta em picos mais baixos de fluorescência
quando analisadas tridimensionalmente. Ainda, é possível notar que as regiões
de poros são equivalentes às observadas na MEC UNIAN.

Figura 31 – Fluorescência intrínseca do colágeno observada por microscopia confocal a laser:


Fragmentos de membrana, sem nenhum tipo de tratamento, foram observadas quanto ao perfil
estrutural do colágeno por autofluorescência. A) Gen Derm, B) Lumina Coat, C) MEC UNIAN e
D) Surgidry.
55

6.5 - RESISTÊNCIA MECÂNICA

São necessárias algumas características básicas, para que uma


membrana possa ser utilizada em RTG ou ROG, entre elas: biocompatibilidade,
capacidade de oclusão celular, adaptação ao espaço cirúrgico (maleabilidade),
facilidade de manuseio pelo cirurgião e resistência mecânica
(SCANTLEBURY,1993).
O ensaio de resistência a tração é a maneira rápida e simples de se avaliar
as propriedades mecânicas dos materiais, sendo realizado por meio do
tracionamento de um corpo de prova até a sua ruptura (ALMEIDA, 2009).
A força de tração é produzida no material quando duas forças em sentidos
opostos são aplicadas na mesma linha de aplicação com o objetivo de alongar o
material, e a resistência à tração provém das forças moleculares atrativas que
tendem a dificultar a separação do material (HOLANDA, 1999).
Neste trabalho avaliamos a resistência máxima à tração que as
membranas suportaram até que ocorresse a sua ruptura, ou seja, a capacidade
das membranas em absorver as cargas fisiológicas e externas impostas no sítio
de implante, esta informação é essencial, uma vez que o local é sujeito a uma
grande variedade de cargas impostas diariamente (BOERCKEL et al., 2011).
A Tabela 9 e os Gráficos 1 e 2, mostram os resultados de resistência à
tração e a porcentagem de deformação das membranas estudadas neste
trabalho.
56

Tabela 8 – Resultados de resistência à tração e porcentagem de deformação das


amostras.

D1 D2 D3
Material Amostra Peso Sessão Força Tensão Deformação Força/Larg
mm mm mm
n° L C E (g) (mm²) (N) (MPa) (%) (N/mm)
Lumina-Coat 1-A 10,47 30 0,40 0,0086 4,188 1,532 0,366 22,8 0,146
1-B 10,00 30 0,28 0,0076 2,800 1,368 0,489 25,0 0,137
1-C 10,80 30 0,37 0,0095 3,996 1,442 0,361 26,2 0,134
Média 0,405 24,7 0,139
SurgiDry 2-A 10,94 30 1,27 0,0476 13,894 1,264 0,091 17,2 0,116
2-B 10,58 30 1,23 0,0488 13,013 1,368 0,105 12,2 0,129
2-C 10,70 30 1,20 0,0470 12,840 1,830 0,143 24,0 0,171
Média 0,113 17,8 0,139
MEC-UNIAN CP01 10,07 30 0,64 0,0297 6,445 39,928 6,195 54,7 3,965
CP02 10,50 30 0,64 0,0274 6,720 41,566 6,185 46,9 3,959
CP03 10,50 30 0,64 0,0288 6,720 41,400 6,161 51,2 3,943

Média 6,181 50,9 3,956

Gen Derm 4-A 9,94 30 0,20 0,0287 1,988 20,950 10,538 11,3 2,108
4-B 10,50 30 0,20 0,0278 2,100 43,320 20,629 11,2 4,126
4-C 10,26 30 0,16 0,0270 1,642 42,054 25,618 8,7 4,099
Média 18,928 10,4 3,444
Surgi Time 5-A 10,10 30 0,11 0,0420 1,111 3,962 3,566 43,8 0,392
5-B 9,96 30 0,11 0,0447 1,096 2,866 2,616 34,9 0,288
5-C 5,70 30 0,11 0,0209 0,627 1,698 2,708 31,3 0,298
Média 2,963 36,7 0,326

*D1, D2 e D3 correspondem às dimensões em mm / L- largura; C- comprimento; E- espessura


57

Gráfico 1 – Resultados comparativos das tensões suportadas antes da ruptura.

Gráfico 2 – Resultados comparativos da deformação da deformação de cada


amostra antes da ruptura.

Lumina
Coat
Gen
Derm Surgitime
PTFE
58

6.6 – AVALIAÇÃO DA BIOCOMPATIBILIDADE DA MEC UNIAN EM MODELO ANIMAL

Após a avaliação in vivo do comportamento da MEC UNIAN quando


implantadas em modelo animal, foi possível notar que todos os animais
apresentaram aumento de peso durante o período de observação. Ainda, no
terceiro e no sétimo dia, nos quais foram coletadas as zonas de implantes, foi
possível detectar a presença do material controle (Lumina Coat) e do material
experimental (MEC UNIAN) em todos os animais.

As alterações histopatológicas encontradas nos animais avaliados nos


períodos de 3,7, 28, 42 e 84 dias estão descritas nas tabelas 9, 10, 11, 12 e 13.
Acantose e Hiperqueratose discreta à intensa foram observadas em 4 animais
do grupo controle e em 5 animais do grupo MEC UNIAN no período experimental
de 3 dias, porém, por tratar-se de sinal de inflamação com distribuição
semelhante entre os dois grupos, não foram considerados significantes.
Inflamação crônica moderada à intensa foi observada em ambos os grupos
controle e MEC UNIAN. Fibroplasia leve à intensa foi descrita em regiões
controle e MEC UNIAN. A presença de fibrose leve à intensa e a ausência de
calcificação foram observadas em ambas as regiões de implante, tanto controle
quanto na MEC UNIAN.

No período experimental de 7 dias, acantose e hiperqueratose discreta


à moderada foram descritas em 5 animais do grupo controle e em 4 animais do
grupo MEC UNIAN. Inflamação crônica leve à intensa foi observada em ambos
os grupos, controle e experimental, com distribuições semelhantes. Fibroplasia
leve à intensa e ausência de calcificação foram observadas em ambas as regiões
de implante nos dois grupos.

Não foram observadas acantose ou hiperqueratose no tempo


experimental de 28 dias em nenhuma região de implante de nenhum dos grupos.
Foi observado com a mesma frequência inflamação crônica e fibroplasia leves e
fibrose leve à moderada em ambos grupos, com a mesma frequência.

Também foi observada no tempo experimental de 42 dias no grupo MEC


UNIAN inflamação crônica leve na região do implante em apenas um animal.
59

Ainda, foi possível observar fibroplasia leve à moderada nas duas regiões de
implantes, controle Lumina Coat e MEC UNIAN.

No tempo experimental de 84 dias, houve descrição de inflamação


crônica leve e fibroplasia leve em região de implante de material experimental
(MEC UNIAN) em um e dois animais. Fibrose leve foi observada para as duas
membranas do estudo.

Tabela 9 – Alterações histopatológicas apresentadas pelos animais que


receberam as duas membranas (coleta em 3 dias).

1: Discreto; 2: Moderado; 3: Intenso; X: Ausência; M: Macho

Tabela 10 – Alterações histopatológicas apresentadas pelos animais que


receberam as duas membranas (coleta em 7 dias).

1: Discreto; 2: Moderado; 3: Intenso; X: Ausência; M: Macho


60

Tabela 11 – Alterações histopatológicas apresentadas pelos animais que


receberam as duas membranas (coleta em 28 dias).

1: Discreto; 2: Moderado; 3: Intenso; X: Ausência; M: Macho

Tabela 12 – Alterações histopatológicas apresentadas pelos animais que


receberam as duas membranas (coleta em 42 dias).

1: Discreto; 2: Moderado; 3: Intenso; X: Ausência; M: Macho


61

Tabela 13 – Alterações histopatológicas apresentadas pelos animais que


receberam as duas membranas (coleta em 84 dias).

1: Discreto; 2: Moderado; X: Ausência; M (macho) NL; não lida (animal foi à óbito no 47º dia de
experimento)

As Figuras 32 a 35 mostram os achados histopatológicos referentes ao


tecido retirado 3 dias após a implantação das membranas avaliadas.

Figura 32 - Secção histológica ilustrando fibroplasia e um marcante infiltrado inflamatório


neutrofílico delineando o material experimental (MEC UNIAN) acidofílica (seta vermelha).
Material retirado 3 dias após implante – Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x
62

Figura 33 – Secção histológica ilustrando um moderado a marcante componente inflamatório


neutrofílico e fibrose delineando membrana eosinofílica estreita em região de implante de
material controle (Lumina Coat), (seta vermelha). Material retirado 3 dias após implante -
Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x.

Figura 34 - Secção histológica ilustrando discreto depósito de colágeno maduro corado em azul,
e componente inflamatório delineando o material experimental (MEC UNIAN) estreita
avermelhada com trechos corados em azul (seta verde). Material retirado 3 dias após implante –
Tricrômio de Masson /objetiva de 40x.
63

Figura 35 - Secção histológica ilustrando discreto depósito de colágeno maduro corado em azul
e membrana controle (seta verde). Material retirado 3 dias após implante – Tricrômio de Masson
/objetiva de 40x.

As Figuras 36 a 39 apresentam os achados histopatológicos referentes


ao material retirados 7 dias após a implantação das membranas avaliadas.

Figura 36 - Secção histológica ilustrando abundante componente inflamatório neutrofílico,


delineando a MEC UNIAN (MEC) eosinofílica estreita. Material retirado 7 dias após o implante -
Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x.
64

Figura 37 - Secção histológica ilustrando discreta fibrose e infiltrado inflamatório misto


delineando membrana controle (Lumina Coat) levemente basofílica (seta verde). Material retirado
7 dias após o implante - Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x.

Figura 38 - Secção histológica ilustrando depósito de colágeno maduro corado em azul (seta) e
componente inflamatório delineando membrana estreita basofílica (MEC UNIAN). Material
retirado 7 dias após o implante – Tricrômio de Masson /objetiva de 40x.
65

Figura 39 - Secção histológica ilustrando discreta a moderado depósito de colágeno maduro


corado em azul e estrutura membrana controle (Lumina Coat) grosseira basofílica (seta verde).
Material retirado 7 dias após o implante – Tricrômio de Masson /objetiva de 40x.

As Figuras 40 a 43 apresentam os achados histopatológicos referentes


ao material retirados 28 dias após a implantação das membranas avaliadas.

Figura 40 - Secção histológica ilustrando fibrose e poucos vasos neoformados. Região de


implante da MEC UNIAN retirada após 28 dias - Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x.
66

Figura 41 - Secção histológica ilustrando fibrose e poucos vasos neoformados. Região de


implante de material controle (Lumina Coat) retirado após 28 dias - Hematoxilina e eosina
/objetiva de 40x.

Figura 42 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno maduro em bandas


corado em azul. Região de implante da MEC UNIAN retirada em 28 dias – Tricrômio de Masson
/objetiva de 40x.
67

Figura 43 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno maduro em bandas


corado em azul. Região de implante de material controle (Lumina Coat) com retirada após 28
dias – Tricrômio de Masson /objetiva de 40x.

As Figuras 44 a 47 apresentam os achados histopatológicos referentes ao


material retirados 42 dias após a implantação das membranas avaliadas.

Figura 44 - Secção histológica ilustrando tecido conjuntivo denso modelado e discreta


quantidade de pequenos vasos sanguíneos. Região de implante do material experimental (MEC
UNIAN) retirada em 42 dias - Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x.
68

Figura 45 - Secção histológica ilustrando tecido conjuntivo denso modelado e poucos vasos
sanguíneos. Região de implante de material controle (Lumina Coat) com retirada em 42 dias -
Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x.

Figura 46 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno maduro em bandas


corado em azul. Região de implante do material experimental (MEC UNIAN) com retirada em 42
dias – Tricrômio de Masson /objetiva de 40x.
69

Figura 47 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno maduro em bandas


corado em azul e vermelho. Região de implante de membrana controle (Lumina Coat) com
retirada em 42 dias – Tricrômio de Masson /objetiva de 40x.

As Figuras 48 a 51 apresentam os achados histopatológicos referentes


aos materiais retirados 84 dias após a implantação das membranas avaliadas.

Figura 48 - Secção histológica ilustrando tecido conjuntivo denso modelado, e discreta


quantidade de pequenos vasos sanguíneos. Região de implante da MEC UNIAN com retirada
em 84 dias - Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x.
70

Figura 49 - Secção histológica ilustrando tecido conjuntivo denso modelado, e poucos vasos
sanguíneos. Região de implante de membrana controle (Lumina Coat) com retirada em 84 dias
- Hematoxilina e eosina /objetiva de 40x.

Figura 50 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno maduro em bandas


corado em azul e vermelho. Região de implante da MEC UNIAN com retirada em 84 dias –
Tricrômio de Masson /objetiva de 40x.
71

Figura 51 - Secção histológica ilustrando marcante depósito de colágeno maduro em bandas


corado em azul e vermelho. Região de implante de membrana controle com retirada em 84 dias
– Tricrômio de Masson /objetiva de 40x.

7 – DISCUSSÃO

Os conceitos biológicos da RTG e ROG são baseados no estabelecimento


de uma barreira protetora para o coágulo sanguíneo e células residentes, através
da interposição de uma barreira física entre retalho gengival e o defeito ósseo,
ou migração de epitélio sobre a raiz dentária (GOTTLOW, 1993).
Através do uso de membranas, espera-se que células mesenquimais
indiferenciadas repovoem os sítios de reparo dando origem ao ligamento
periodontal e ao tecido ósseo (BUNYARATAVEJ ,2001).
Inúmeros estudos suportam o conhecimento de que o colágeno favorece
a adesão de vários tipos celulares, permitindo sua permanência, in vitro, por
longos períodos, e estimula a proliferação celular (ZELLIN et al., 1995). A
estrutura e composição da membrana determinam o tempo de degradação, sua
conformação espacial e as reações teciduais. Se a membrana tem tendência ao
colapso no defeito ósseo, isso limita o espaço para a regeneração óssea (KASAJ
et al., 2008). Na fase inicial, a resistência ao colapso de uma membrana é
determinada principalmente pela rigidez do material. Do ponto de vista prático,
também deve ser capaz de se adaptar aos contornos ósseos adjacentes
(ZELLIN, 1995).
72

O presente trabalho, que inicialmente intencionava apenas comparar a


biomembrana sintetizada em nosso laboratório com algumas outras já
disponíveis no mercado nacional, acabou por ganhar muito mais profundidade
durante o desenvolvimento do projeto. Os resultados apresentados nas
microscopias eletrônicas de varredura mostram, contundentemente, que todas
as membranas estudadas, apesar de se prestarem a mesma função possuem
microestruturas totalmente diferentes. Foram encontradas membranas com alta
porosidade (Figura 24), enquanto na outra extremidade do estudo foram
encontradas membranas totalmente impermeáveis (Figura 27). A mesma
diversidade morfológica diz respeito às características apresentadas pelas fibras
colágenas, presentes em todas as membranas de origem orgânica, que
acabaram por variar em calibre, direção e quantidade, muito provavelmente
pelas diferenças dos tecidos de onde elas foram extraídas. Outro ponto que
merece destaque é a quantidade de MEC presente em cada uma das
membranas que, seguindo os outros parâmetros também variou
consideravelmente, não apenas em quantidade, como também em conteúdo
molecular, uma vez que apenas a MEC UNIAN apresentou glicosaminoglicanos
em seu conteúdo (Figura 30). A membrana Gen Derm, que possui a cortical
óssea bovina como tecido de origem, apresenta características nítidas de tecido
mineralizado, mostrando como fator positivo a total similaridade com o tecido ao
qual ele será implantado no caso da ROG. Por outro lado, apesar de não
apresentar Ca+2 em sua estrutura (Tabela 7), por sua origem de cortical óssea
ofereceu a maior resistência à tensão de todas as membranas avaliadas,19 MPa.
No entanto, muito provavelmente por apresentar a maior rigidez, essa membrana
possui baixos níveis de deformação,10%, quando comparada às demais
membranas, 20% me média (Tabela 8), fator altamente desejável em cirurgias
de regiões não planas. Essas características acabam por tornar o material mais
quebradiço, que de acordo com o fabricante, necessita de ao menos 5 minutos
de hidratação antes do manuseio para ganhar flexibilidade e se tornar segura
para o cirurgião. A membrana Surgitime apresentou deformação de 36,7%, e
apresentou a 3ª melhor resistência mecânica, com 3MPa de resistência à tração,
embora se trate de uma membrana não absorvível, ela é amplamente utilizada
na prática cirúrgica.
73

No entanto, apesar das diferenças apresentadas anteriormente, a MEC


UNIAN, apresentou o melhor compromisso tensão x deformação, com uma
tensão média de 6,2 MPa, a 2ª melhor, e a maior deformação, em torno de 50%,
enquanto as membranas Lumina Coat e Surgidry apresentaram pouca tensão
de ruptura, 0,4 MPa e 0,1 MPa e deformação na casa dos 20%.
A análise de tensão/deformação, mostra informações relativas à
elasticidade, plasticidade, rigidez, ruptura e energia que um tecido é capaz de
absorver antes da sua ruptura (AQUINO; VIANA; FONSECA, 2005). A região
linear da curva corresponde à fase elástica, onde a deformação aumenta
linearmente com a força aplicada, e o material deformará somente enquanto a
carga está sendo aplicada a ele, retornando ao seu tamanho original quando a
carga é removida (HOLANDA, 1999). A região não linear corresponde à fase
plástica das membranas, sendo o final correspondente à ruptura das
membranas, ou seja, o tecido torna-se permanentemente deformado e não é
capaz de recuperar o seu comprimento inicial após a remoção da força externa,
havendo a falha tecidual (AQUINO; VIANA; FONSECA, 2005).
Na região elástica, a membrana desenvolvida na UNIAN, é a que deforma
mais e que apresenta maior resistência à tração no limite da elasticidade. Já na
região plástica, a membrana supracitada tem o segundo maior valor de
resistência à tração, tornando em tese um material com características
mecânicas compatíveis com as das amostras analisadas, mas com melhor
média tensão/deformação. Com base nestes parâmetros foi possível concluir
que a MEC UNIAN possui as características mecânicas mais desejáveis dentre
todas as membranas avaliadas, pois mostra resistência suficiente para suportar
suturas e a flexibilidade necessária para se encaixar em qualquer defeito ou loja
óssea.
Baseado nos resultados de MEV, EDS e microscopia de fluorescência
confocal foi possível concluir que a MEC UNIAN possui o melhor conjunto de
características favoráveis de todas a membranas avaliadas. Apresenta fibras
colágenas dispostas paralelamente e bem distribuídas por toda a superfície,
poros com tamanho uniforme e dispostos regularmente, que proporcionam o
embebimento regular, sem perda de resistência.
No que diz respeito ao estudo em modelo animal, a MEC UNIAN, mostrou
ser biologicamente tão compatível aos tecidos biológicos quanto a membrana
74

Lumina Coat, utilizada como controle positivo no experimento. As análises


histomorfológicas mostram que, como esperado, após o ato cirúrgico é possível
notar em ambas membranas a presença contundente de células inflamatórias,
que tendem a desaparecer com o passar dos dias. Ainda, nenhuma das duas
membranas provocaram fibrose ou calcificações a cima dos níveis toleráveis
para um tecido que sofreu grave agressão e tenta se reestruturar. A presença de
fibras colágenas maduras e neovascularização fazem parte dos sinais
desejáveis em processos de reparo.
Sendo assim, os resultados indicam fortemente que a biomembrana
produzida em nosso laboratório satisfaz de maneira sólida e comprovada os
requisitos necessários, não apenas para ser colocada no mercado, mas também
para cumprir eficientemente a função a que se propõe. A MEC UNIAN ainda
pode receber em sua superfície compostos químicos ou moléculas bioativas que,
por sua vez, aumentem sua capacidade de participar efetivamente, de forma
positiva, dos processos de remodelação tecidual.

8 – CONCLUSÃO

Com base nos resultados obtidos no presente estudos nos limites da


metodologia empregada, é lícito concluir que:
1 – A MEC UNIAN possui características físico-químicas e moleculares
semelhantes às amostras utilizadas para comparação neste estudo.
2 - A MEC UNIAN apresenta qualidades compatíveis para uso como barreira
para a Regeneração Óssea Guiada, todavia não apenas como barreira física,
mas também, por se tratar de uma Matriz Extracelular e possuir na sua
composição macromoléculas tais como GAGs, as quais de acordo com a
literatura utilizada como base deste trabalho, participa ativamente do processo
de neoformação óssea atuando como nicho para crescimento, proliferação e
diferenciação celular.

3 – A MEC UNIAN mostrou ser biocompatível, não provocando resposta


imunológica grave ou sinais de rejeição à tecido estranho.
75

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EDITION, Daniel Buser, DDS, PROF DR MED DENT Professor and Chairman
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