PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS

SUMÁRIO
1. Introdução ..................................................................... 3
2. Microscopia .................................................................. 3
Referências Bibliográficas..........................................16
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS 3

1. INTRODUÇÃO maioria das bactérias, e para a identi-

ficação definitiva de fungos e parasi-
Em 1676, Anton van Leeuhennhoek
tas. No entanto, pode ser usado para
observou bactérias na água utilizando
detectar também inclusões virais pre-
um dos seus primeiros microscópios.
sentes em células infectadas. Há cin-
No século XIX, Louis Pasteur conse-
co métodos gerais de microscopia:
guiu cultivar bactérias em laboratório
usando um meio de cultura feito com
extrato de levedura, açúcar e sais de Microscopia de Campo Claro
amônio. Ainda no século XIX, com uso
É utilizada uma fonte de luz, que
do ágar de cozinha, Hesse logrou so-
ilumina o material analisado; um
lidificar um meio de cultura que per-
condensador, que concentra a lu-
mitiu o crescimento de colônias bac-
minosidade sobre o material; e um
terianas macroscópicas. Esses foram
conjunto de lentes – lente objetiva
alguns dos acontecimentos que mar-
e lente ocular – que amplia a ima-
caram a evolução das técnicas diag-
gem das estruturas.
nóstivcas. Desde então, a capacidade
e a evolução dos métodos de identifi- A luz atravessa o condensador até o
cação de patógenos se intensificou e material, e a amostra é visualizada. A
nos permitiu obter todas as técnicas imagem é, então, ampliada, primeira-
que temos hoje. mente com lentes objetivas e, em se-
guida, pelas lentes oculares. As lentes
Doenças infecto-contagiosas ainda
objetivas podem ser de baixo poder
são de alta prevalência global. Logo,
(amplia em 10 vezes), podendo ser
técnicas de isolamento de patóge-
usada para triagem do material ana-
nos são de grande utilidade para o
lisado; de alto poder seca (amplia em
diagnóstico de infecções e para a sua
40x), localizando microorganismos
identificação etiológica, permitindo
maiores, como parasitas e alguns
condutas específicas e eficazes para
fungos; e a lente de imersão em óleo
obter controle ou cura.
(amplia em 100 vezes), que obser-
va bactérias, leveduras e os detalhes
2. MICROSCOPIA da morfologia de microorganismos
maiores. O óleo aprimora a resolu-
A microscopia tem duas funções bá-
ção por reduzir a dispersão da luz. As
sicas na microbiologia: detectar e
lentes oculares, finalmente, ampliam
identificar preliminar ou definitiva-
mais ainda a imagem, em cerca de 10
mente microorganismos. Caracterís-
a 15 vezes.
ticas morfológicas são muito utiliza-
das para a identificação preliminar da A microscopia de campo claro tem
como limitação a resolução da
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS
imagem (capacidade de diferenciar
entre dois objetos diferentes). Além
disso, os melhores microscópios de
campo claro não permite a visualiza-
ção dos vírus.
Por fim, os índices de refração dos mi-
crorganismos e do fundo são seme-
lhantes, tornando imperativo que os
microrganismos sejam corados para
que sejam visualizados.
• Microscopia de Campo Escuro: A
diferença desta para a microscopia
de campo claro é que, na micros-
copia de campo escuro, o conden-
sador impede que a luz ilumine
diretamente o local. Apenas umas
luz oblíqua e dispersa atinge o ma-
terial a ser visualizado, passando
pelo sistema de lentes, fazendo
com que o material fique iluminado
contra um fundo preto. Sua vanta-
gem é o poder de resolução subs-
tancialmente aumentado em rela-
ção à microscopiade camplo claro,
possibilitando visualizar bactérias
delgadas. Sua desvantagem é a
má visualização das estruturas in-
ternas do microrganismo, já que a
luz ilumina mais o seu entorno.
Microscopia de Contraste de Fase
Permite uma melhor visualização
das estruturas internas do microrga-
nismo, na medida em que os feixes
paralelos de luz são desviados ao
passsar através de objetos com dife-
rentes densidades. Anéis anulares no
condensador e nas lentes amplificam
4
os desvios e criam uma imagem tri-
dimensional do microrganismo ou da
amostra.
• Microscopia de Fluorescência:
Alguns compostos denomina-
dos “fluoróforos” são capazes de
absorver luminosidade de baixo
comprimento de onda, e então
emitir energia em um comprimen-
to de onda superior visível. Esse
processo envolve uso de corantes
fluorescentes nos mcirorganismos
e posterior visualização destes em
um microscópio fluorescente es-
pecialmente projetado. O micros-
cópio usa lâmpada de mercúrio de
alta pressão, lampada de halogê-
nio ou de vapor de xenônio, que
emitem luz de comprimento de
onda mais curto do que as emiti-
das por microscópios tradicionais.
A luz emitida pelo fluoróforo é am-
pliada por lentes objetivas e ocu-
lares tradicionais. Os microrganis-
mos e amostras com fluoróforos
aparecem brilhantes, em contras-
te com o fundo, e esse contraste é
suficiente para que a amostra seja
localizada rapidamente em menor
aumento e, então, examinada em
menor aumento.
• Microscopia Eletrônica: São uti-
lizadas espirais magnéticas no lu-
gar de lentes. A ampliação e reso-
lução são drasticamente melhores
na microscopia eletrônica, chegan-
do a visualizar inclusive partículas
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS
virais – sendo a única microscopia
capaz de visualizar esses patóge-
nos. As amostras são geralmente
coradas ou revestidas com íons
metálicos para criar contraste.
Há dois tipos de microscópios eletrô-
nicos. Os microscópios eletrônicos de
transmissão, os elétrons passam di-
retamente através da amostra; e os
de varredura, nos quais os elétrons
cobrem a superfície do material em
determinado ângulo, gerando uma
imagem tridimensional.
As amostras ou suspensões podem
ser colocada sobre uma lâmina de
vidro e examinadas ao microscópio
diretamente (exemplo: exame direto
a fresco). Entanto, embora microrga-
nismos maiores possam ser visuali-
zados por esse método, mas a visu-
alização de estruturas detalhadas e
internas fica mais dificultada. Alter-
nativamente, a amostra ou o organis-
mo podem ser ainda corados por uma
variedade de métodos para facilitar a
visualização.
• Exame direto: são os métodos
mais simples de separação de
amostras para visualização mi-
croscópica. A amostra pode ser
suspensa em água ou soro fisio-
lógico (exame a fresco), mistura-
da a uma substância alcalina para
claficação do material (método do
hidróxido de potássio – KOH), ou
misturada a uma substância alca-
lina e um corante de contraste (ex.
5
Iodo). Os corantes coram o mate-
rial celular inespecificamente, au-
mentando o contraste de fundo e
facilitando a visualização.
• Colorações diferenciais: uma va-
riedade de colorações diferenciais
são utilizadas para corar organis-
mos específicos ou componentes
de material celular. A mais conhe-
cida de todas é a coloração de
Gram, que serve de base para a
classificação das bactérias. Outros
exemplos são as colorações de he-
matofilina férrica e tricromo.
• Colorações acidorresistentes:
essas colorações exploram o fato
de alguns microrganismos reterem
sua coloração primária mesmo ao
serem expostos a fortes agentes
descolorantes, como álcoois e áci-
dos. Alguns patógenos são ainda
“parcialmente acidorresistentes”,
mantendo sua coloração só quan-
do corados com ácido fraco. A co-
loração de Ziehl-Neelsen é o mais
antigo desses métodos, mas re-
quer aquecimento da amostra du-
rante o processo. Já existem mé-
todos empregados de coloração a
frio, como o método de Kinyoun, ou
por coloração fluorescente, como o
método da auramina-rodamina. O
método fluorescente é a coloração
de escolha, pois grande parte do
material pode ser analisada rapi-
damente contra um fundo preto.
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS
• Colorações fluorescentes: den-
tre os exemplos principais, temos
a coloração laranja de acridina,
coloração com cálcofluor branco
e coloração direta com anticorpo
fluorescente.
Cultura in vitro
O sucesso dos métodos de cultura
depende de algumas variáveis:
• Biologia do organismo;
• Local de infecção;
• Resposta imune do paciente à
infecção;
• Qualidade do meio de cultura.
Os meios de cultura podem ser divi-
didos em: meios enriquecidos não
seletivos, meios seletivos, meios
diferenciais e meios especializados
(estes são melhor vistos ao estudar
os métodos diagnósticos de mi-
crorganismos específicos).
Meios enriquecidos não seletivos
Projetados para permitir o crescimen-
to da maioria dos microrganismos
que não precisam de nutrição adicio-
nal para crescer. Dentre eles, temos:
• Ágar-sangue: os meios contêm
dois componentes primários – um
meio básico e o sangue. Outros su-
plementos podem ser adicionados
6
para aumentar a gama de micror-
ganismos capazes de crescer.
• Ágar-chocolate: consiste em uma
forma modificada do meio anterior.
A hemoglobina ou sangue, quando
adicionado ao meio básico aque-
cido, torna o meio amarronzado.
Esse meio permite o crescimento
da maioria das bactérias, incluindo
espécies que são capazes de cres-
cer no meio ágar-sangue.
• Ágar-Miller-Hinton: esse meio é
usado para os testes de sensibili-
dade bacterianos.
• Caldo tioglicolato: várias formu-
lações são utilizadas, e a suple-
mentação com hemina e vitamina
K melhora a recuperação de bac-
térias anaeróbicas.
• Ágar-Sabouraud dextrose: este
é um meio que consiste em caseí-
na digerida e tecido animal suple-
mentado com glicose, que é usado
para o isolamento de fungos. Fa-
z-se redução do pH e utilizam-se
antibióticos para inibir o cresci-
mento bacteriano e permitir o cres-
cimento isolado de fungos.
Meios Seletivos e Diferenciais
Os meios seletivos são usados para
isolar organismos específicos, que
podem estar acompanhados de ou-
tros organismos no meio. Os meios
são suplementados com substâncias
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS 7

que inibem o crescimento de micror- hidrogênio permite a diferenciação

ganismos indesejados. Esses meios entre esta e a Shigella.
podem ser diferenciais, pela adição
• Meio de Lowenstein-Jensen (LJ):
de substâncias que permitem a dife-
é usado para o isolamento de mi-
renciação entre microrganismos mui-
cobactérias. Há adição de verde-
to parecidos entre si.
-malaquita para inibir as bactérias
• Ágar-MacConkey: é um ágar se- gram-positivas.
letivo para bactérias gram-nega-
• Ágar-Middlebrook: também usa-
tivas, e também diferencial por
do para isolar micobactérias, sen-
permitir a diferenciação entre fer-
do muito semelhante ao meio de
mentadores e não-fermentado-
LJ. Ao contrário deste, no entanto,
res de lactose. Os sais biliares e o
é solidifcado com ágar.
cristal violeta presentes no meio
inibem as bactérias gram-negati- • Candida CHROMagar: é seletivo e
vas, já as bactérias fermentadoras diferencial, permitindo o isolamen-
de lactose produzem ácido e este to de diversas espécies de Candi-
precipita sais biliares, gerando uma da, bem como diferenciação entre
coloração vermelha. elas. Utiliza-se cloranfenicol para
inibir bactérias. A interação de en-
• Ágar-manitol: utilizado para isolar
zimas com subtratos gera colônias
estafilococos. Estas bactérias cres-
de diferentes cores para diferentes
cem na presença de elevadas con-
espécies de Candida: Candida al-
centrações de sal, e o S. aureus é
bicans produz colônias verdes; C.
capaz de fermentar o manitol, ge-
tropicalis, colônias roxas; e Candi-
rando colônias amareladas.
da krusei, colônias rosas.
• Ágar xilose-lisina desoxicolato
• Ágar inibidor de fungos filamen-
(XLD): usado para detecção de
tosos: formulação enriquecida e
Salmonella e Shigella em culturas
seletiva, é usada no isolamneto
entéricas. O crescimento da maio-
de fungos patogênicos não-der-
ria das bactérias não-patogênicas
matófitos. Também há adição de
é inibido. Aquelas que crescem e
cloranfenicol.
fermentam carboidratos produ-
zem colônia amarelada. A Shigella
não fermenta carboidratos e forma Diagnóstico molecular
colônias vermelhas. Já a colora-
O DNA, RNA ou proteínas de um
ção preta gerada pela Salmonella
agente infeccioso podem ser usados
devido à produção de sulfeto de
para identificar o agente.
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS
Detecção do material genético
microbiano
Cepas específicas de microrganismos
podem ser diferenciadas conforme o
DNA ou RNA ou ainda fragmentos de
DNA produzidos após clivagem des-
te com enzimas de restrição (endonu-
cleases). Os fragmentos de DNA ou
RNA com tamanhos e estruturas di-
ferentes podem ser distinguidos com
base na sua mobilidade na eletrofo-
rese em um gel de agarose ou polia-
crilamida. Formas diferentes da mes-
ma sequência de DNA ou fragmentos
com tamanhos diferentes se movem
em velocidades distintas, permitindo
sua separação.
Além da eletroforese, podemos fa-
zer amplificação e sequenciamento
de ácidos nucleicos. Sondas de DNA
podem ser usadas para detectar, lo-
calizar e quantificar sequências es-
pecíficas de ácido nucleico. Espécies
ou cepas individuais de um agente
8
infeccioso podem ser detectadas,
mesmo que não estejam crescendo
ou se replicando.
As sondas de DNA podem ainda de-
tectar sequências genéticas especí-
ficas em amostras de biópsia de te-
cidos fixados e permeabilizados, por
meio da técnica hibridização in situ.
A reação em cadeia de polimera-
se (PCR) amplifica poucas cópias de
DNA viral um milhões de vezes e é
uma das técnicas mais recentes de
análise genética. Nessa técnica, uma
amostra é incubada com primers,
uma DNA polimerase termoestável,
nucleotídeos e tampões. Esses oli-
gômeros atuam sintetizando novos
DNA a partir das sequências de DNA
da amostra inicial, e cada cópia de
DNA sintetizada e novamente servi-
da como molde. Esse processo é re-
petido muitas vezes (20 a 40 vezes)
para amplificar a sequência de DNA
original exponencialmente.
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS 9

Figura 1. Ciclos de PCR. Fonte: Microbiologia – Murray, 7ª ed.

PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS
A técnica de RT-PCR (reação em ca-
deia da polimerase com transcrição
reversa) é uma variação da PCR, en-
volvendo o uso da enzima transcrip-
tase reversa para converter RNA viral
ou RNA mensageiro em DNA.
A técnica de PCR em tempo real
pode ser usada na quantificação de
amostras. Quanto mais DNA estiver
presente, mais rápido novos DNA’s
serão sequenciados na PCR. Já a téc-
nica de DNA de cadeia ramificada é
uma técnica de hibridização usada
para detectar pequenas quantidades
de sequências específicas de DNA ou
RNA. O ensaio de captura híbrida de-
tecta e quantifica híbridos de DNA-R-
NA usando anticorpo específico para
o complexo.
SE LIGA! O sequenciamento de DNA
tem se tornado um método suficiente-
mente rápido e barato para permitir a
determinação laboratorial de sequên-
cias microbianas para identificação de
microrganismos.
Detecção de proteínas
Em alguns casos, vírus e outros mi-
crorganismos podem ser detectados
com base em proteínas específicas
ou enzimas características desses
microrganismos. A exemplo, a detec-
ção da enzima transcriptase reversa
no soro ou cultura de células indica
presença de um retrovírus.
10
Diagnóstico Sorológico
Métodos de Detecção
Os complexos antígeno-anticorpo po-
dem ser detectados diretamente, por
técnicas de precipitação ou marcação
do anticorpo com sonda radioativa,
fluorescenteou enzimática; ou indire-
tamente, pela quantificação de uma
reação provocada pelo anticorpo, a
exemplo da fixação do complemento.
Técnicas de precipitação e imunodi-
fusão: complexos antígeno-anticorpo
específicos e reatividade cruzada po-
dem ser diferenciados por técnicas de
precipitação. Em um intervalo limitado
de concentração do antígeno e do an-
ticorpo, chamado “zona de equivalên-
cia”, os anticorpos formam uma rede
com os antígenos, e essa rede é tão
grande que não fica solúvel e precipita.
Os complexos antígeno-anticorpo são
solúveis em concentrações fora dessa
concentração de equivalência.
Várias técnicas de imunodifusão usam
o conceito de zona de equivalência
para identificar um antígeno ou detec-
tar presença de um anticorpo. A imuno-
difusão radial simples é usada para de-
tectar e quantificar um antígeno. Nela,
o antígeno é colocado em um orifício
e se difunde pelo ágar contendo anti-
corpos. Quanto maior a concentração
desse antígeno, mais ele terá que se
“diluir” e se estender para atingir a zona
de equivalência, na qual irá precipitar
formando um anel ao redor do orifício.
Logo, a área do anel será proporcional
à concentração inicial de antígeno.
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS
Figura 2. Ilustração da imunodifusão radial simples. Fonte: Microbiologia – Murray, 7ª ed.
Já a imunodifusão dupla de Ouch-
terlony determina a identidade imu-
nológica de diferentes antígenos.
Nela, soluções separadas de antíge-
nos e anticorpos são colocados em
orifícios separados, cortados no ágar,
e os antígenos e anticorpos se difun-
dem, um em direção ao outro. Uma
linha visível de precipitação aparece
na região de equivalência entre antí-
geno e anticorpo.
Em outras técnicas, o antígeno é se-
parado por eletroforese em ágar e
exposto ao anticorpo (imunoeletro-
forese). Pode também ser submetido
à eletroforese em ágar que contém
anticorpo (eletroforese em “foguete”);
ou ainda o antígeno e o anticorpo po-
dem ser colocados em orifícios dife-
rentes para que se movimentem um
11
em direção ao outro na eletroforese
(contraeletroforese).
Imunoensaios para antígenos
associados a células
(Imunohistologia)
Antígenos na superfície celular ou
dentro das células podem ser detec-
tados por imunofluorescência ou en-
zimaimunoensaio (EIA).
Na imunofluorescência direta, uma
molécula fluorescente é ligada ao
anticorpo. Na imunofluorescência in-
direta, um segundo anticorpo fluo-
rescente, específico para o primeiro
anticorpo, é usado para detectar o
anticorpo primário e assim localizar o
antígeno.
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS 12

Figura 3. Ilustração da imunofluorescência. Adaptado de Microbiologia – Murray, 7ª ed.

Já no EIA, uma enzima é conjugada identificar e quantificar linfócitos. Essa

ao anticorpo, convertendo o substra-
to em um cromóforo que sinaliza o
antígeno.
O citômetro de fluxo é usado para
analisar a imunofluorescência de cé-
lulas em suspensão, sendo útil para
técnica lança mão de um laser para
excitar o anticorpo fluorescente liga-
do na superfícia da célula, bem como
para determinar o tamanho da célula
por medidas de dispersão da luz.
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS
Figura 4. Localização por imunofluorescência do vírus herpes simples (HSV) em células nervosas de um paciente com encefalite
herpética. Fonte: Murray – 7ª ed. De Emond RT, Rowland HAK: A color atlas of infectious diseases, 2nd ed. London, 1987, Wolfe.
Imunoensaios para anticorpos e
antígenos solúveis
O ensaio imunoabsorvemte ligado à
enzima (ELISA) usa um antígeno mo-
bilizado em superfície para capturar e
separar o anticorpo específico de ou-
tros anticorpos no soro do indivíduo.
Um anticorpo anti-anticorpo humano
ligado a uma enzima covalentemen-
te detecta o anticorpo do paciente
que se ligou ao antígeno. Essa rea-
ção é quantificada no espectrofotô-
mero conforme a intensidade da cor
produzida.
Esse ensaio também pode ser usado
para identificar antígeno solúvel no
13
soro do paciente. O antígeno solúvel e
capturado e concentrado por um an-
ticorpo imobilizado e detectado com
um anticorpo diferente marcado com
uma enzima. Um exemplo é o exame
rápido de gravidez para pesquisa do
beta-HCG.
A análise por western blot é uma va-
riação do ELISA. Proteínas virais se-
paradas por eletroforese de acordo
com seus pesos moleculares ou car-
gas elétricas são transferidas para
um papel de filtro. Ao serem expostas
ao soro do paciente, essas proteínas
capturam anticorpos virais especí-
ficos, e a reação é visualizada com
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS 14

anticorpo anti-imunoglobulina huma- (inibiçaõ da hemaglutinação) para

na conjudado a enzima. Essa técnica
evidencia as proteínas reconhecidas
pela amostra de soro do paciente.
Geralmente, essa técnica é utilizada
para confirmar infecções pelo HIV
em pacientes cujo teste ELISA deu
positivo.
Já no radioimunoensaio (RIA), um
anticorpo ou antígeno radiomarcado
(com iodo-125, por exemplo) é usa-
do para quantificar complexos enzi-
ma-anticorpo. Pode ser realizado por
ensaio de captura, conforme já foi
descrito no ELISA, ou ensaio de com-
petição. Neste, o anticorpo no soro do
paciente reage com antígeno produ-
zido em laboratório e complemento
extra. Complexos antígeno-anticorpo
ligam, ativam e fixam o complemen-
to, e o complemento residual é então
dosado pela hemólise de hemácias
cobertas com anticorpo.
Os ensaios de inibição de anticorpos
usam a especificidade do anticorpo
em neutralizar e prevenir uma infec-
ção (neutralização) ou outra atividade
identificar a cepa do agente infectan-
te ou quantificar a resposta do anti-
corpo a uma cepa específica. A agluti-
nação pelo látex é uma técnica rápida
e simples de detecção de anticorpos
ou antígeno solúvel: anticorpos virais
aglutinam partículas de látex cober-
tas por antígenos virais. Ou partículas
de látex cobertas com anticorpos são
usadas para detectar antígeno viral
solúvel. Na hemaglutinação passiva,
em vez de látex, eritrócitos cobertos
de antígenos são utilizados.
Sorologia
A sorologia é utilizada para identificar
o agente infeccioso e a cronologia da
infecção, bem como determinar sua
natureza- se é uma infecção primá-
ria ou reinfecção, e se é uma infecção
aguda ou crônica. São usados para
identificar vírus e outros agentes de
difícil controle e crescimento em la-
boratório, ou que causam doenças de
progressão lenta.

SAIBA MAIS!
A concentração relativa do anticorpo é denominada título. A concentração de IgM, IgG, IgA
ou IgE que reage com o antígeno pode ser avaliada usando-se um segundo anticorpo anti-
-imunoglobulina específico para o isotipo do anticorpo.
Soroconversão ou reinfecção são indicadas pelo aumento de pelo menos 4 vezes no título de
anticorpo obtido no soro durante a fase aguda e aquele obtido pelo menos 2 a 3 semanas
mais tarde, na fase convalescente.
Também é usada para determinar o estágio de uma infecção lenta ou crônica. Os primeiros
anticorpos a serem detectados são aqueles contra antígenos mais expostos ao sistema imu-
ne, como os de superfície celular. Posteriormente, são detectados anticorpos contra proteínas
intracelulares e enzimas.
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS 15

MAPA MENTAL – PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS EM MICROBIOLOGIA

Para isolar organismos

Permite o crescimento da
específicos e fazer
maioria dos microrganismos
diferenciação entre eles

Meios enriquecidos Meios Seletivos e

Cultura in vitro PCR
não seletivos Diferenciais

Detecção do material
genético microbiano
Microscopia
PRINCÍPIOS Diagnóstico
DIAGNÓSTICOS molecular
Detecção de proteínas
Má visualização das Microscopia de
estruturas internas Fluorescência
Diagnóstico
Microscopia de Sorológico
Contraste de Fase

Má visualização das Microscopia de Sorologia

estruturas internas Campo Escuro ELISA
Imunoensaios para anticorpos
Resolução da Microscopia de e antígenos solúveis
imagem baixa Campo Claro Western Blot
Imunoensaios para antígenos
associados a células (Imunohistologia)
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS 16

REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
Microbiologia médica / Patrick R. Murray, Ken S. Rosenthal, Michael A. Pfaller; [tradução An-
dreza Martins]. - 7. ed. - Rio de Janeiro : Elsevier, 2014.
Microbiologia / Trabulsi-Altherthum; 6ª ed : Atheneu, 2015.
PRINCÍPIOS DIAGNÓSTICOS 17