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Faculdade Ciências Farmacêuticas

FBC0513 Bioquímica Clínica

Determinação da atividade
plasmática das Transaminases

Fernando V. Mansano
Helio T. Jeng
Gabriela Molina
Joana D. Campeiro
As transaminases são enzimas intracelulares que permitem a transferência de
grupos amina de ácidos aminados para cetoácidos, em reações designadas por
reações de transaminação. A constante de equilíbrio para a maior parte das
transaminações é próxima da unidade, o que significa que estas reações são
reversíveis.
Cada transaminase é específica para um par de aminoácidos. A AST, aspartato
amino-transferase (ou transaminase glutâmico oxalacética) catalisa a seguinte reação:

AST
Ác. aspártico + Ác. α-cetoglutárico √ Ác. oxalacético + Ác. glutâmico

A ALT, alanina amino-transferase (ou transaminase glutâmico pirúvica) catalisa


a seguinte reação:
ALT
Alanina + ácido α-cetoglutárico √ ácido pirúvico + ácido glutâmico

As transaminases existem em quantidades mínimas no sangue de um indivíduo


normal, mas após destruição celular extensa elas aumentam significativamente. São
enzimas indicadoras de morte celular.
Existindo em quantidades importantes nas células hepáticas, cardíacas,
musculares e do pulmão, a lesão celular nestes órgãos leva ao aumento da atividade
sérica destas enzimas, como acontece, por exemplo, nos quadros de hepatite e de
enfarte de miocárdio.
As transaminases têm um papel importante nas reações reversíveis de
transferência de grupos amina entre pares de α-amino/ α-cetoácidos, na transferência
de grupos amina para produtos transportadores e na sua eliminação. No soro normal,
a AST existe em quantidade superior à ALT.

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Estas enzimas são intracelulares: a ALT é citoplasmática e a AST é
citoplasmática e mitocondrial.
Aumentos patológicos das transaminases:
1) Hepatite aguda (também nas hepatites crônicas): se a lesão é superficial e
difusa, ALT>>AST.
2) Hepatites tóxicas (hepatite alcoólica aguda).
3) Cirrose hepática (se a AST está muito aumentada, é sinal de lesão profunda
afetando as mitocôndrias).
4) Metástases hepáticas.
5) Enfarte do miocárdio: a partir das 6 primeiras horas durante 4 a 6 dias com
pico máximo às 36 horas.
6) Embolias ou tromboses: tromboembolia pulmonar (aumento da AST); se há
afecção hepática também aumenta a ALT.
7) Doenças musculares: poliomiosites, dermatomiosites, traumatismos
musculares extensos.
A determinação de Gama Glutamil Transferase (GGT) tem aplicação principal no
estudo das doenças hepatobiliares e está distribuída em quase todo o tecido humano.
O rim contém a mais elevada concentração, seguido pelo pâncreas e fígado. A GGT é
um sensível indicador de doenças inflamatórias e lesão hepática e está
significativamente elevada nas doenças obstrutivas das vias biliares. A GGT tem maior
especificidade que a fosfatase alcalina (ALP) e a transaminase oxalacética para avaliar
doença hepática. Ela não está elevada na doença óssea e durante a gravidez como a
fosfatase alcalina, nem nas doenças do músculo esquelético como a transaminase
oxalacética.
A GGT auxilia diferenciar colestases mecânica e viral das induzidas por drogas.
Nas duas primeiras, a GGT e ALP estão igualmente elevadas. Nas colestases
induzidas por drogas a GGT está muito mais elevada. Valores elevados de GGT em
pacientes anictéricos com câncer são um seguro indicador de metástases hepáticas.
Está demonstrado que no alcoolismo crônico os níveis séricos da GGT diminuem com
a retirada do álcool e se elevam com a exposição ao mesmo. Com base nesta
observação a determinação da GGT está sendo usada nos centros de tratamentos de

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alcoólatras para documentar o sucesso da terapia e identificar os pacientes que
retornam ao alcoolismo após a alta
Objetivo:

Determinar a atividade enzimática das transaminases (ALT, AST e GGT)

Princípio (Determinação da Aspartato Amino Transferase):


Como demonstrado nas fórmulas abaixo, a AST catalisa a transferência de
grupos amina do aspartato para o α-Cetoglutarato, levando à formação de Glutamato e
Oxalacetato. O Oxalacetato em presença do MDH reage com o NADH, reduzindo-se a
Malato e o NADH oxida-se a NAD+. A velocidade de oxidação é proporcional à
atividade da AST na amostra.

A redução da absorbância em 340nm, conseqüente à oxidação da coenzima


NADH, é monitorada fotometricamente, sendo diretamente proporcional à atividade da
AST na amostra.

Materiais e Métodos:
Reagente 1: Tampão Tris 105 mmol/L pH 7,8; L-aspartato 330 mmol/L; MDH ≥ 825
U/L; LDH ≥1200U/L e azida sódica 0,095%
Reagente 2: Tampão Tris 20 mmol/L NADH 1320 µ mol/L; alfacetoglutarato 66 mmol/L
e azida sódica 0,095%
-Amostras: Soro obtido livre de hemólise ou plasma colhido com heparina. A
enzima sérica é estável 3 dias entre 2 e 8 ºC.
Foram marcados 3 tubos de ensaio: B, A1 (Amostra 1), A2 (Amostra 2) Os
reagentes e amostras foram adicionados aos tubos de acordo com a tabela a seguir:
Amostra Amostra
B 1 2
Amostra -- 100 μL 100 μL
Reagente 1000 μL 1000 μL 1000 μL

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(1+2)

Cada tubo foi homogeneizado e incubado a 37 ºC por 1 minuto.


Para verificar a linearidade da reação foram realizadas 3 leituras da absorbância
das Amostras com intervalo de 1 minuto em comprimento de onda de 340 nm,
acertando o zero com água destilada.
Os valores obtidos para AST foram:

1min 2min 3min

B 0,624 0,624 0,623

Amost
ra1 0,526 0,523 0,519

Amost
ra2 0,545 0,544 0,543

Determinação de AST, ALT e GGT

Para determinar o perfil de transaminases de cada paciente, os níveis de ALT e


GGT medidos pelos outros grupos também foram incorporados a este resultado.

Dados do Laboratório de Bioquímica Clínica

1min 2min 3min


ALT AST ALT AST ALT AST
B 0,46 0,624 0,46 0,624 0,46 0,623
A1 0,419 0,526 0,405 0,523 0,392 0,519
A2 0,521 0,545 0,521 0,544 0,519 0,543

GGT
1min 2min
B 0,26 0,262
A1 0,366 0,375
A2 0,29 0,294

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AST:
AST (U/L) = ∆ A/min Amostra x Fator
∆ A/min = (Ax min – Ax+1 min)/2
Fator: VT = volume total do ensaio (1100 µL) VA = volume da amostra (100 µL)
1000 = conversão de U/mL para U/L d = espessura da solução (1 cm)
ε = Absortividade milimolar do NADH em 340nm = 6,3
Fator = (1100 x 1000) / (6,3 x 100 x 1) = 1746

Para o paciente 1 temos:


∆ A1/min = 0,003
∆ A2/min = 0,004
∆ A/min Amostra = 0,0035

AST (U/L) = 0,0035 x 1746 = 6,10

Para o paciente 2 temos:


∆ A1/min = 0,001
∆ A2/min = 0,001
∆ A/min Amostra = 0,001

AST (U/L) = 0,001 x 1746 = 1,75

ALT:
AST (U/L) = ∆ A/min Amostra x Fator
∆ A/min = (Ax min – Ax+1 min)/2
Fator: VT = volume total do ensaio (1100 µL) VA = volume da amostra (100 µL)
1000 = conversão de U/mL para U/L d = espessura da solução (1 cm)
ε = Absortividade milimolar do NADH em 340nm = 6,3
Fator = (1100 x 1000) / (6,3 x 100 x 1) = 1746

Para o paciente 1 temos:


∆ A1/min = 0,014
∆ A2/min = 0,013
∆ A/min Amostra = 0,0135

AST (U/L) = 0,0135 x 1746 = 23,57

Para o paciente 2 temos:


∆ A1/min = 0,000
∆ A2/min = 0,002
∆ A/min Amostra = 0,001

AST (U/L) = 0,001 x 1746 = 1,75

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GGT:

∆ A = (A2min – A1min)
GGT (U/L) = ∆ A/min Amostra x Fator
Fator: 1158

Para o paciente 1 temos:


A1min = 0,366
A2min = 0,375
∆ A = 0,009

GGT (U/L) = 0,009 x 1158 = 10,42

Para o paciente 2 temos:


A1min = 0,290
A2min = 0,294
∆ A = 0,004

GGT (U/L) = 0,004 x 1158 = 4,63

Conclusão:

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A relação AST/ALT (Índice DeRitis) tem sido empregada algumas vezes para auxiliar
no diagnóstico diferencial das hepatopatias. Na hepatite virótica aguda, a relação
AST/ALT é sempre menor que 1, enquanto que nas outras doenças hepatocelulares
(cirrose, hepatites crônicas, etc) é sempre > 1.

Paciente 1:
U/L
ALT 23,57 ↔
AST 6,1 ↓
GGT 10,42 ↔
AST/A
LT 0,26 <1

O paciente 1 apresenta valor normal de ALT e GGT e um valor de AST abaixo


do normal podendo estar associada a uremia, ou a má conservação da amostra. A
relação AST/ALT é inferior a 1, que poderia vir a indicar uma hepatopatia aguda.

Paciente 2:

U/L
ALT 1,75 ↓
AST 1,75 ↓
GGT 4,63 ↓
AST/A
LT 1 =1

O paciente 2 apresenta todos os valores de transaminase abaixo do normal,


provavelmente devido ao tempo da amostra coletada. A relação AST/ALT é igual a 1.

Observação: As amostras haviam sido coletadas ha 10 dias. O que pode explicar os


valores abaixo do normal de algumas medidas.