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Relatório

Coloração de Gram; Coloração de


Ziehl-Neelsen; Microscopia

Estagiário: Stela Manson Grassmann


Data: 10/11/2021
Biomedicina

Coloração de Gram

A técnica de coloração de Gram foi descoberta pelo físico dinamarquês Christian GRAM, em
1884. A Coloração de Gram é muito utilizada na bacteriologia permitindo a distinção entre
bactérias Gram positivas (púrpura) e Gram negativas (rosa). A diferença entre os dois tipos de
células relaciona-se com a estrutura da parede celular das bactérias. Assim a parede celular
das bactérias Gram positivas é formada por uma camada espessa de peptideoglicano,
enquanto que a parede celular das Gram negativas é formada por uma camada fina de
peptideoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacarídeo e proteínas.
Diferenças na permeabilidade dessas membranas aos reagentes químicos, levam a diferenças
de coloração. Embora a grande maioria das bactérias possa ser corada por tal método,
algumas não o fazem

satisfatoriamente, exigindo técnicas especiais de coloração. Elas são as micobactérias,


nocardias, espiroquetas, micoplasma, riquétsias e clamídias.

OBJETIVOS

• Corar uma lâmina pelo método de Gram;

• Reconhecer bactérias Gram positivas e Gram negativas ao microscópio;

• Compreender a importância dessa coloração para microbiologia clínica;

• Compreender cada etapa do processo de coloração, bem como a função de cada substância
utilizada.

MATERIAL

• Placa de Petri contendo crescimento bacteriano

• Lâminas para preparação do esfregaço


• Solução salina

• Alça de platina

• Bico de Bunsen

• Bateria de corantes para o Gram

PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO

• Limpar uma lâmina de vidro (passar algodão embebido em álcool)

• Quando se tratar de uma cultura em meio líquido, com uma alça de inoculação, tomar uma
pequena porção da cultura, observando as precauções de assepsia, e colocá-la sobre a lâmina
espalhando-a para formar um esfregaço fino e uniforme.

• Quando a cultura for em meio sólido, colocar uma gota de água destilada sobre a lâmina e
com uma alça de inoculação, colher uma pequena quantidade de crescimento bacteriano da
superfície do ágar e suspendê-la na gota de água destilada, espalhando suficientemente para
obter um esfregaço fino.

• Deixar a lâmina secar à temperatura ambiente;

• Fixar na chama do Bico de Bunsen, cortando a chama por 3x.

TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM

• Cobrir o esfregaço bacteriano com cristal violeta, deixar um minuto e verter o corante na
cuba.

• Remover o excesso da solução de cristal violeta da lâmina, lavando-a levemente com água
corrente (opcional).

• Cobrir o esfregaço com solução de lugol, deixar por um minuto e retirar a seguir, lavando
com um filete de água.

• Descorar o esfregaço usando uma solução de álcool acetona, rapidamente (10 a 15


segundos).

• Lavar com água corrente, imediatamente.

• Cobrir o esfregaço com a Fucsina, deixar por 30 segundos e retirar

• Lavar com água corrente

• Secar com papel absorvente

* observar a lâmina: colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço corado e
observar a lâmina no microscópio, com objetiva de 100x
Coloração de Ziehl-Neelsen

Coloração de escolha para a observação de bactérias do gênero Mycobacterium, como, por


exemplo, as espécies Mycobacterium tuberculosis e Mycobacteríum lepra e, bem como para
cepas patogênicas de bactérias do gênero Nocardia. A parede das micobactérias possui uma
espessa camada de Lipídeos (ácidos micólicos) que evita a penetração de diversos corantes.
Por outro lado, quando o corante penetra alcançando o citoplasma da célula, ele não pode
ser removido com facilidade, mesmo com o uso de álcool

ácido. Por isso essas bactérias são chamadas de BAAR (bacilos álcool ácido resistentes). Os
bacilos da tuberculose são vistos como bacilos finos, retos, ligeiramente encurvados e
geralmente, isolados; já os bacilos da lepra, agrupam-se em feixes denominados globias. O
resultado da baciloscopia do escarro é dado em cruzes e depende da quantidade de bacilos
encontrados em 100 campos microscópicos observados. Assim teremos:

• (menos de 1 bacilo por campo)

• ++ (1 a 1O bacilos por campo)

• +++ (mais de 10 bacilos por campo)

OBJETIVOS:

• Executar a técnica de Ziehl Neelsen.

• Classificar as bactérias de acordo com a coloração de Ziehl Neelsen.

• Compreender a importância da solicitação de uma baciloscopia de Ziehl a partir de um


material biológico, e saber interpretar o resultado da baciloscopia conforme o número de
cruzes.

MATERIAL

• Lâminas para preparação do esfregaço

• Solução salina

• Alça de platina

• Bico de Bunsen

• Bateria de corantes para Ziehl Neelsen


TÉCNICA

• Cobrir o esfregaço com fucsina de Ziehl e aquecê-la até emissão de vapores, mantendo o
aquecimento por 5 minutos (tendo o cuidado para não deixar o corante ferver, nem secar). O
bacilo da tuberculose e o da lepra só se cora após aquecimento.

• Lavar com água corrente.

• Descorar rapidamente com álcool-clorídrico a 3% até que não se desprenda mais corante.

• Lavar com água corrente; corar com azul de metileno- 1 minuto

• Lavar com água corrente, secar com papel de filtro

Microscopia

 Para obtenção do melhor rendimento do microscópio, é necessário que sejam


seguidos alguns procedimentos durante o processo de focalização da imagem:

1. Verificar se o condensador está na posição mais elevada;


2. Verificar se o diafragma está totalmente aberto;

3. Movimentando o controle do macrométrico, focalize a amostra, primeiro olhando apenas


pela ocular sem ajuste de dioptria. No caso de tubos binoculares com dois ajustes de dioptria,
ou ainda oculares com ajuste próprio de dioptria, é importante observar a posição em que
estão esses ajustes antes de iniciar a focalização, pois isto pode atrapalhar o processo.

4. Ajuste a distância Inter pupilar que melhor se adapta à sua, até obter uma única imagem;
5. Ajuste a dioptria para o outro olho possibilitando a focalização completa;

6. Para observar a amostra em um aumento maior, utilize o revólver para mudar a posição
das objetivas. E então utilizar o controle do micrométrico para ajustar o foco;

7. Com ajuda do movimento do diafragma de íris, controle a quantidade de luz para melhorar
a definição da imagem.

8. Para utilizar a objetiva de 100X oil, após a focalização correta nas objetivas menores, deve-
se pingar uma gota de óleo de imersão sobre a lâmina e mudar para a objetiva de 100X,
utilizando apenas o micrométrico para melhorar a focalização.

 Focalização ao microscópio de luz

Iniciar sempre com a objetiva de menor aumento

1. Objeto no centro da mesa

2. Ajustar a iluminação (maior quantidade de luz através do objeto)

3. Elevar a mesa até a altura máxima utilizando o macrométrico

4. Iniciar o processo de focalização, com a menor objetiva (10x) abaixando vagarosamente a


mesa com o macrométrico

5. Fazer a focalização fina – micrométrico

6. Mudar a objetiva (para 40x e 100x) e utilizar apenas o micrométrico para focalização final
(100x somente para bactérias, sem o uso de lamínula)

7. Acertar a quantidade de luz

8. Condensador deve permanecer sempre em posição elevada.


 Montagem de lâmina para observação de fungos

1. Colocar duas gotas de água na lâmina


2. Pegar parte do micélio com alça de repicagem
3. Colocar o micélio sobre a lâmina
4. Colocar a lamínula
5. Observar
-Aumento de 100x
-Aumento de 400x

 Focalização ao microscópio de luz

Efeito do óleo de imersão


 Montagem de lâmina para observação de bactérias

Coloração Direta Simples

1. Esfregaço

2. Fixação

3. Coloração

4. Lavagem

5. Secagem

6. Observação

*Quando for passar para a objetiva de 100x pingar uma gota de óleo sobre o material.
REFERÊNCIAS:

DINIZ, Claudio. ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS. In: DINIZ, Claudio. ROTEIRO DE


AULAS PRÁTICAS. 2018. Roteiro aula prática (Farmácia) - Departamento de
Parasitologia, Microbiologia e Imunologia – Setor de Microbiologia., [S. l.], 2018.

https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/742170/mod_resource/content/0/Pratica
%201%20-%20Microscopia%20de%20luz%202016.pdf

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