c
 

La fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas, hasta donde sea posible, en
el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un método histológico
destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfológica y
química de las células y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los
procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento
de su constitución íntima.

Fijación de la muestra.

Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos que se utilizan para
tal fin.

Cualidades que debe tener un fijador:

1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los
fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis, desintegración, etc.).
2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas
profundas de la pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación
ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.).
5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de
ella.
6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.
7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

Manera de actuar de los fijadores

Varía con la composición o naturaleza de los mismos: coagulando las proteínas sin
combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor), formando combinaciones
químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose en
contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (ácido
ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración
ulterior de los tejidos (recuérdese que éstos, en su mayoría, son reductores que muchos
colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molécula de
hidrógeno con su cromóforo).

Fijadores químicos

Son los más utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia
química, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias
intervienen en su constitución.

ß
 ß   
 

c 

Deshidratación

Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas en
agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar,
debemos deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua.
Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja proceder
escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etílico de graduación creciente.

Se dispone una lámina en un cassette de deshidratación.

 Deshidratación en alcoholes sucesivos.

 

Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloración.

Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a otros
cuerpos.

Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia

colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la
solución colorante.

Clasificación de los colorantes:

Según su O
 se clasifican en:

COLORANTES NATURALES:

- Ênimales (carmín)
- Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)

COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA):

- Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de

sodio). Son colorantes citoplasmáticos.
- Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o
clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
- Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo
de un color y el citoplasma de otro.
- Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder
disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución colorante
(Sudán lll, rojo escarlata).

Por otro lado, las ÷OO ÷
O pueden ser:

- Ërtocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solución colorante
empleada.
- Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe con un color diferente
al del colorante empleado.

Métodos de coloración:

- Coloración directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto.

- Coloración indirecta: requiere la intervención de intermediarios o mordientes para que
la coloración tenga lugar.
- Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto óptimo.
- Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el
resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina
diferenciación.
- Coloración simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado (núcleo,
fibras elásticas, etc.).
- Coloración combinada: se tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos
recurriéndose, generalmente, al empleo sucesivo de colores básicos y ácidos que
contrastan por sus colores.
- Coloración panóptica: es una coloración combinada realizada sucesivamente por
colorantes neutros (May-Grünwald-Giemsa).
- Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos los colorantes neutros
que se necesiten.

Colorantes más utilizados en histología humana:

HEMATOXILINA:

- Es un colorante vegetal.
- Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el
aire (varios meses de exposición) u oxidantes artificiales (óxido de mercurio,
permanganato de potasio, dicromato potásico, etc.)
- Es un colorante directo, pero en la práctica se lo utiliza en forma de lacas
hematoxilínicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar
la solución colorante), comportándose en este caso como un colorante indirecto.

EOSINA:

- Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos halogenados con tres

grupos arilo).
- Presenta autofluorescencia espontánea.
- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas.

Para colorear se emplea generalmente una batería de coloración.

 Batería de Coloración H&E.

V

Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje

definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser
observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro.

La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes.

La aclaración se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el

corte con un disolvente del Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo le confiere un
índice de refracción semejante al del vidrio.

Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo
una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto.

Se deja secar unas horas antes de su observación al microscopio.

  

A continuación se presenta el protocolo de trabajo utilizado por nuestra cátedra para la

técnica de Hematoxilina - Eosína para preparados de uso didáctico:

I. Fijación

En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante
6 hs.

II. Corte

Se le da el tamaño deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa, con el fin de

enjuagarla en agua corriente durante, por lo menos, 15'.

III. Deshidratación
1) Alcohol 70º, 1h30'.
2) Alcohol 96º, 1h30'.
3) Alcohol 100º (l), 1h30'.
4) Alcohol 100º (ll), 1h30'.
5) Toluol, entre 1h30' y 3hs.

IV. Inclusión

1) Secado de la muestra con gasa.

2) Parafina 56º (l), 1h30'.
3) Parafina 56º (ll), 1h30'.
4) Formación de la barra.
5) 30' de frezzer.
6) Fractura del taco

V. Corte

VI. Coloración

1) Secado de los cortes en estufa a 58ºC, 15'.

2) Xilol o toluol (I), 15' en estufa.
3) Xilol o toluol (II), 2'.
4) Alcohol 100º, 30".
5) Alcohol 96º, 30".
6) Alcohol 70º, 30".
7) Alcohol 50º, 30".
8) Agua destilada, 30".
9) Hematoxilina, 1´30".
10) Agua corriente, 2´.
11) Alcohol 50º, 15".
12) Eosina, 30".
13) Alcohol 96º, 10".
14) Alcohol 100º, 10".
15) Xilol, 1´ por lo menos.
16) Montaje con Bálsamo de Canadá sintético.

 V ß 
  

¢ Las técnicas histológicas pertenecen al tipo denominado "técnicas contrarreloj". Si

Ud. está apurado no las empiece, déjelas para cuando su trabajo le permita dedicarse
solo a esa actividad.
¢ Mantenga su laboratorio en orden, con todos los elementos de vidrio que va a utilizar
perfectamente limpios.
¢ Rotule todos los frascos inmediatamente luego de preparar cualquier solución.
¢ Guarde siempre las soluciones en frascos de color caramelo.
¢ Mantenga los recipientes que contienen xilol, toluol y alcohol 100º siempre tapados.
¢ Nunca coloque xilol o toluol en recipientes plásticos porque resultan atacados por
estas sustancias.
¢ Si debe trabajar con ácidos hágalo bajo campana. Si se derraman o salpican la piel,
lave inmediatamente con abundante agua con bicarbonato de sodio.
¢ Cuando coloree prepare primero todas las soluciones, solo después comience con los
pasajes del material.
¢ Si debe realizar simultáneamente varios procesos de inclusión, confeccione planillas
de tiempos para cada uno de los materiales. Esto evitará confusiones.
¢ Controle cuidadosamente los tiempos establecidos para cada técnica. Es muy
importante respetarlos para obtener resultados satisfactorios.
¢ Êntes de iniciar cualquier técnica, primero léala atentamente. Prepare el material de
vidrio necesario, reúna los reactivos y colorantes, haga las diluciones, determine los
tiempos, y después comience el proceso.
¢ Tenga mucha paciencia y voluntad. Sea perseverante, si durante las primeras
experiencias sus resultados no son lo que Ud. esperaba, verifique cada paso y repita
tantas veces como sea necesario.

Los métodos para la obtención de preparaciones histológicas ocupadas en los estudios

de microscopia óptica, se engloban en la Técnica Histológica. La Técnica Histológica
abarca varios procedimientos a los que se somete un tejido para proporcionar los cortes
como se conocen, montados bajo un cubre objeto con imágenes de estructuras
contrastadas, para su estudio bajo microscopia óptica o electrónica.
Los procedimientos de la Técnica Histológica se resumen en las etapas siguientes:
Para empezar con la técnica histológica se debe obtener una V
ß 

ßa estudiar y existen 2 formas:

? Necropsia: Examen u obtención de tejido de un organismo muerto.

? Biopsia:(del griego bios = vida y oasis = visión) Examen u obtención de tejido de un

organismo vivo. Puede ser inscisional, excisional, por sacabocado, por punción y
absorción, por raspado, por trepanación.

c
 
Este proceso se refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas que tienen
varias finalidades:
1.? Conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado
in vivo.
2.? Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de
éste.
3.? Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos.
4.? Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la muerte de la célula.

Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que de otra manera iniciarían la
O

y llevarían a la DEGENERACIÓN POST MORTEM.
La fijación mantiene las estructuras al estimular la formación de enlaces cruzados entre
las proteínas.
Los agentes más usados para Microscopia de Luz son:
cO  
 OcO OOcO 

O÷
 cO  
 O
 ÷


? Puede usarse con amortiguadores o con otros fijadores.

? Reacciona con los grupos aminos de las proteínas, formando enlaces transversales y
conservando las estructuras de la célula.

?  OcO O

  
 O 
O 
O
O c
 O  O


? Funcionan formando enlaces transversales en las proteínas y manteniendo las

estructuras de la célula.

? El fijador de Bouin es una solución que contiene 75 ml de solución acuosa saturada

de ácido pícrico, 25 ml de formol y 5 ml de ácido acético glacial.

? El líquido de Helly es una solución con 2.5 g de bicromato de potasio, 5 g de cloruro

de mercurio, 100 ml de agua y 5 ml de formol.

O  O V ÷
O÷
O

÷
÷O

? Precipitan las proteínas.

Para Microscopia Electrónica se usan:

  
 O
 O  
 O 
O 
O
 O

O
O

? Permiten conservar detalles estructurales finos, ya que otros fijadores como el

formaldehído, son muy enérgicos en su acción con las proteínas.

? Actúan como colorantes electrodensos, permitiendo observar al tejido con el haz de

electrones.

? Una solución de Glutaraldehído al 2.5% en un tampón a pH 7.4, evita la violenta

desnaturalización de las proteínas guardando detalles finos de la célula. 
 OV
÷ O÷O
 ÷ 
÷

  O  c
÷


? La mejor fijación es cuando a pasado el menor tiempo entre la muerte del tejido y la
fijación.

? Tamaño de la Muestra

? El tamaño de la muestra debe de ser de 2-3 cm. variando el estudio para lo cual de va
a utilizar.

ß
 ß 
Después que la muestra ha sido fijada se elimina el fijador y se deshidrata.
Debido a que una gran parte del tejido está constituida por agua, se aplica una 

   O÷
O acuosas de menor a mayor de agente deshidratante, por ejemplo,
÷O
O 
÷Oo Acetona. Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una solución de
60%, 70%, 80%, 90%, 96% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 % para
eliminar el agua. Esto se hace por que si se colocara el tejido en una solución al 100%
de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se O  
V ß c  
Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es miscible
tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los
casos se utiliza como medio de inclusión Parafina líquida). La sustancia comúnmente
utilizada es el 
OO
ODe la misma manera se coloca la muestra de tejido en un
recipiente de Xilol, el Xilol solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento
ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su
índice de refracción. También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como
medios de aclaramiento.
 ÷O
O
O
O
O ÷  O O÷
  
  O
O ÷ 

 V
  
A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al
microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de
consistencia firme. Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y  

El objeto de la inclusión es:

? Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la matriz extracelular.

? Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.

La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en

estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido.
Por lo general se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina
fundida a 60º C, colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas
manteniendo la temperatura a 60º C.
Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente ocupados
por ellos son ahora ocupados por la parafina. Después se coloca la pieza y un poco de
parafina fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar
a temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido
incluido, a este bloque se le denomina ÷O
Los medios de inclusión para Microscopia Electrónica comúnmente utilizados son
resinas polimerizadas o epoxi como:

? Epon

? Mikropal

? Araldit

  
El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para
permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopia óptica
tienen un grosor entre 
÷  OPara estos cortes se utiliza un aparato
llamado V V
Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos que se extraen en el proceso de aclaramiento
o enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusión, nos auxiliamos
con la  ÷
÷ O÷
 
O. Un tejido congelado, es los suficientemente
duro para ser cortado.
Se sumerge la muestra de tejido en 
 O
O para tener una congelación
rápida. Luego se corta con un aparato especial denominado V Vß 
  , existe un aparato más elaborado y eficiente para los cortes de
congelación llamado  
La ventaja de esta técnica es que los cortes que se
obtienen son muy rápidos, se puede utilizar en el diagnostico de material patológico,
tomado en intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de una
operación.
Para Microscopia Electrónica se requieren cortes más delgados (denominados ultra
finos) de aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5 mm. de lado medio. Para
esto se utiliza un V V
ß  ß ß V . Una vez
preparados, se montan sobre rejillas de cobre con un diámetro de 3mm.
V
  
Los cortes todavía no son aptos para su examen con el microscopio, puesto que los
tejidos se hallan infiltrados en parafina y carecen de color.
Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha agregado una pequeña
cantidad de 
, la cual actúa como adhesivo.
La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo se incluyen en Xilol, y la
muestra se rehidrata haciéndola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de
alcohol etílico hasta llegar a una solución 100% de agua.
Ya rehidratado se   
ß. Los colorantes más utilizados son la
 V  Y la 
 Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal
manera que pueda fijarse de modo permanente el CUBREOBJETOS con un medio
adecuado para el V
(por ejemplo una gota de Bálsamo de Canadá o similar).
Los medios de montaje pueden ser miscibles o no miscibles en agua, si son miscibles en
agua ya no es necesaria la deshidratación después del teñido, se puede montarlo
directamente. El cubreobjetos no solo protege el tejido, sino que se requiere para
observar el corte con un microscopio.
Los colorantes pueden agruparse en 3 clases:

? Colorantes que diferencian los componentes ácidos y básicos de la célula.

? Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriza

extracelular.

? Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales con
ellos.


!ß  



O
÷Superficie plana y delgada en donde se encuentra montada una
preparación de tejido permanente. Se compone de tres partes:

? PORTAOBJETOS

? CORTE O TEJIDO

? CUBREOBJETOS

! 
 

V 


 
! 
 
V 

   
 c ßV 
" #V 
ß  
La 
 es un colorante ácido y sus propiedades tintoriales pueden ser explicadas
sobre la base de lo que se sabe acerca de la acción de las 

÷
. La
 V   O÷OO 
÷O O O
  



÷.

Un colorante básico es una molécula de anilina que tiene una o más cargas positivas en
su porción coloreadas y su fórmula general se representa:
  $
Los 


reaccionan con los 

  
de los
componentes texturales, que son los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (ADN y
RNA), los grupos
c de los glucosaminoglucanos y los 


  de las proteínas. La reacción de estos grupos varía según el pH.
Como ya se menciono, la Hematoxilina no es un colorante básico en sentido estricto. Se
la utiliza con un VO
 (Intermediario), entre el componente textural y la anilina, y
es debido a este que la coloración con hematoxilina se asemeja a la tinción que produce
un colorante básico. La unión en el complejo TEJIDO ± MORDIENTE ±
HEMATOXILINA, no consiste en un simple enlace, y cuando la Hematoxilina se
coloca en agua no se disocia del tejido, sino que permanece firmemente adherida. A
causa de esto, la Hematoxilina se presta para aquellos procedimientos tintoriales en los
que a ella le sigue la Eosina u otros colorantes ácidos.
Los colorantes básicos verdaderos no suelen usarse en secuencia en donde el colorante
básico es seguido por uno ácido, por que la anilina básica tiende a disociarse del tejido
durante los lavados posteriores en soluciones acuosas.
Un   ßlleva una carga negativa en la porción coloreada de la
molécula y su fórmula general se representa:
$  
Los colorantes ácidos se unen primariamente a los componentes texturales por medio de
enlaces electrostáticos de manera similar pero opuesta a la de los colorantes básicos. Las
anilinas ácidas reaccionan con grupos catiónicos, como los 

V 
 ß
de las proteínas.
Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico (o con
Hematoxilina) se dice que es 
c  y que presenta 
c   Estos
componentes son:

? La Heterocromatina y los Nucleolos del Núcleo por los   OcOO
O
 O

? Ergatoplasma (parte del citoplasma) por   OcOO
O
 O

? Matriz del Cartílago por   O
O
O
 O

Los componentes texturales que se tiñen de colorantes ácidos se dice que son
 ßc 
y que presentan  ßc   Son acidofilos:

? La mayor parte del citoplasma no especializado.

? Filamentos Citoplasmáticos.

? Fibras extracelulares.

Todos estos debidos a   O
O
O
 O

V V

O O ÷÷OO  O  O O

O

O
÷
 ÷OO   ÷÷
O ÷O÷O O 
Esto se debe a que en tejidos con altas concentraciones de
  
, la
molécula del colorante se polimeriza entre si y sus propiedades de absorción son
diferentes de las propiedades de las moléculas individuales. Se interpreta que la
metacromasia refleja gran cantidad de cargas aniónicas muy cercanas unas a otras en el
tejido, una situación prevalerte en la sustancia fundamental del cartílago y en los
gránulos de los mastocitos, el  O

 tiñe a estos de color púrpura.
Los componentes titulares que pueden colorearse metacromáticamente, denominados
 OO O O son principalmente los glucosaminoglucanos sulfatados y las
nucleoproteínas.
V!ß

ß
   ß 
 cc



ß #ß
El ÷
O 
÷

 es la leucofucsina o bisulfato de fucsina. Es incoloro, pero puede
formar un color rojo estable producto de adición con grupos aldehído. Este compuesto
se utiliza en combinación con otros productos químicos como:
El V O O ÷
O  
÷O
÷



 se emplea para determinar la presencia
de moléculas como el ÷O÷O O÷O
O÷O
Lo que hace es romper la unión de los anillos de las hexosas formando grupos aldehído
o rompen los enlaces de las hexoaminas de los glucosaminoglucanos, también formando
grupos aldehído y haciéndolos reaccionar a estos grupos con el reactivo de Schiff.
También sirve para identificar membranas basales y fibras reticulares.
El V O O c este es un método especifico para la determinación histoquímica
del DNA, donde la hidrólisis ácido débil con cloruro de hidrógeno (HCl) se separan los
grupos púricos del DNA. De este modo se abre el anillo de desoxirribosa, y se forma un
grupo aldehído que reacciona con el reactivo de Schiff. Se obtiene un color magenta o
rojo. O

ß  V  
" V ß 
ß

Luego de la fijación con formalina se realizan cortes por congelación, por lo que se
evita extraer los lípidos con los solventes orgánicos.
Para la determinación histoquímica se emplean muy a menudo los denominados


ß Estos son casi insolubles en agua. El colorante Sudán se
emplea disuelto en un solvente orgánico en el cual los lípidos sean relativamente
insolubles, y en el que también el colorante sea sólo parcialmente soluble. Además, el
colorante debe ser más soluble en lípidos que en el solvente, puesto que la coloración
tiene lugar porque O ÷ ÷OO 

 O
O
O ÷
÷OO

 O Para evitar la extracción del
colorante y los lípidos, luego de la coloración se montan los cortes en medio acuoso.
Los colorantes Sudán tiñen fuertemente los   ! ß
, como por ejemplo:

? 
ß 
ß
ß   ß ! 


ß




?  ß 
ß
ß 
 V

   
ß 
 
V # 
ß 
c 
  


V





 #


Finalmente hay métodos que utilizan varios colorantes y que colorean diferentes
estructuras tisulares y que desconociendo las bases químicas en como se unen
con los componentes se denominan Métodos no específicos, como el

÷ 
÷O VO 
También puede emplearse una modificación de la reacción de PAS ±
ocasionalmente denominada V O O
  para la microscopia electrónica.
Luego de la oxidación con ácido peryódico se emplea por lo general como
reactivo la 
 . El producto final de reacción será electrodenso.