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Bioquímica I
2010/ 2011

Preparação e Propriedades de
Soluções Tampão

Alunas:
Andreia Sousa
n.º 40261
Alexandra Salvado
n.º 40267

01 de Março de 2011
1.º Ano - 2.º Semestre
 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 2

1. Apresentação, Tratamento e Discussão de

Resultados

1.1.Estudo da influência do pH na capacidade de uma solução

tampão

Quadro 1. Estudo do efeito do pH na capacidade de uma solução tampão de fosfatos

0.1M.

Fracção Fracção Volume Volume

pH molar molar KH2PO4 K2HPO4 pHic pHiexp pHfc pHfexp ∆pHc ∆pHexp
H2PO4- HPO4- 0,1 M 0,1 M
(mL) (mL)
5.9 0.910 0.091 9.10 0.91 5.89 5.76 5.52 5.59 -0.37 -0.17
6.3 0.794 0.206 7.94 2.06 6.31 6.15 6.16 6.04 -0.15 -0.11
6.7 0.606 0.394 6.06 3.94 6.70 6.52 6.61 6.42 -0.09 -0.10
6.9 0.495 0.505 4.95 5.05 6.90 6.73 6.81 6.65 -0.09 -0.08
7.1 0.382 0.619 3.82 6.19 7.10 6.88 7.01 6.79 -0.09 -0.09
7.5 0.197 0.800 1.97 8.03 7.49 7.28 7.37 7.13 -0.12 -0.15
7.9 0.089 0.911 0.89 9.11 7.90 7.62 7.68 7.43 -0.22 -0.19

Cálculos:
[ ]
[ ] [ ] [ ]
[ ]

[ ] [ ]

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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 3

pH = 5.9
 Concentrações
[ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]
{ [ ] {
[ ] [ ] [ ]

 Fracção Molar

 Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4

 pH inicial (pHic)

H2PO4- HPO42- + H+
Ci
cf

[ ] [ ]
[ ]

01 de Março de 2011
 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 4

 pH final (pHfc)

H2PO4- HPO42- + H+
Ci
cf

[ ]
( )
[ ]

 pHc

pH = 6,3

 Concentrações
[ ]
[ ]

 Fracção Molar

 Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4

 pH inicial (pHic)  pH final (pHfc)

pHic = 6,31 pHfc =6,16

 pH

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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 5

pH = 6,7

 Concentrações
[ ]
[ ]
 Fracção Molar

 Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4

 pH inicial (pHic)  pH final (pHfc)

pHic = 6,7 pHfc =6,61
 pH

pH = 6,9

 Concentrações
[ ]
[ ]
 Fracção Molar

 Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4

 pH inicial (pHic)  pH final (pHfc)

pHic = 6,9 pHfc =6,81
 pH


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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 6

pH = 7,1

 Concentrações
[ ]
[ ]
 Fracção Molar

 Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4

 pH inicial (pHic)  pH final (pHfc)

pHic = 7,10 pHfc =7,01
 pH

pH = 7,5

 Concentrações
[ ]
[ ]
 Fracção Molar

 Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4

 pH inicial (pHic)  pH final (pHfc)

pHic = 7,49 pHfc =7,37
 pH

01 de Março de 2011
 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 7

pH = 7,9

 Concentrações
[ ]
[ ]
 Fracção Molar

 Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4

 pH inicial (pHic)  pH final (pHfc)

pHic = 7,90 pHfc =7,68
 pH

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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 8

pHic e pHiexp versus fracção molar de HPO42-

7,9
7,8
7,7
7,6
7,5
7,4
7,3
7,2
7,1
7
6,9
6,8
pH

6,7
6,6 pH inicial calculado
6,5 pH inicial experimental
6,4
6,3
6,2
6,1
6
5,9
5,8
5,7
5,6
5,5
5,76 6,15 6,52 6,73 6,88 7,28 7,62
Fracção molar de HPO42-

Gráfico 1. Gráfico que representa pHic versus fracção molar de HPO2-4 (pontos unidos por uma
linha a cheio) e pHiexp versus fracção molar de HPO2-4 (pontos individuais). Ambos os conjuntos
de pontos são para o intervalo de valores de pH entre 5.9 e 7.9.

Os valores de pH experimentais foram em todos os casos mais baixos que o pH

calculado. Pode-se então concluir que ocorreram erros na medição dos volumes –
foram medidos volumes menores do que o devido. Tendo em conta que o erro ocorrido
manteve-se “constante” em todas as medições - a diferença entre o pH experimental e
o pH calculado é idêntica em todas – é possível considerar que a escolha do material
para a medição pode não ter sido a mais apropriada (devido ao erro associado ao
material - dever-se-ia ter optado por um material cujo erro associado fosse o menor).

01 de Março de 2011
 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 9

Após a adição de 0,1 mL de HCl registaram-se os valores Quadro2 Quadro

com os valores de pH
finais do pH. Através do Quadro 2 é possível observar que houve finais, calculados e
alguma discrepância entre os valores de pH calculados e experimentais.
experimentais. No entanto, como foi referido anteriormente, os pHfc pHfexp
erros na medição mantiveram-se e por isso, no final, a variação 5.52 5.59
6.16 6.04
de pH experimental, na maioria dos casos, foi aproximadamente 6.61 6.42
igual à calculada, como se pode comprovar no gráfico abaixo 6.81 6.65
7.01 6.79
(Gráfico 2).
7.37 7.13
7.68 7.43

ΔpH experimental e ΔpH calculado versus

pHci
0,39
0,36
0,33
0,3
0,27
0,24
|ΔpH|

0,21
0,18 Δ pH final calculado
0,15 Δ pH final experimental
0,12
0,09
0,06
0,03
0
5,89 6,31 6,7 6,9 7,1 7,49 7,9
pHic

Gráfico 2 Gráfico que representa pH final calculado e pH final experimental versus

pH inicial calculado.

Numa solução tampão o ácido e a sua base conjugada encontram-se em

equilíbrio. Quando se adiciona pequenas quantidades de ácido ou base a variação de
pH é quase insignificante.
O valor de pH para o qual se considera efectivo um sistema tampão é o valor
que tiver menos variação de pH, ou seja, é o valor para o qual o ácido e a sua base

01 de Março de 2011
 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 10

conjugada têm a mesma concentração, já que é quando reagem e neutralizam de igual

modo tanto as bases como os ácidos adicionados, respectivamente. Através da
equação de Henderson-Hasselbalch concluímos então que a capacidade tamponante é
máxima quando o pH é igual ao pKa.
[ ]
[ ]
[ ] [ ]

Pode-se comprovar o que foi dito anteriormente no gráfico, pois quando o pH é

mais perto de 6.89 (que é o valor de pKa) a variação que ocorreu por se adicionar HCl
foi muito mais pequena do que para os outros valores de pH, tanto para a esquerda
como para a direita do gráfico – quanto mais longe o valor de pH estiver do de pKa
mais efeito tem o HCl, pois mais variação ocorre. Logo, existe uma menor capacidade
tampão do sistema.

1.2.Preparação de uma solução tampão de fosfatos por diferentes

métodos

Quando se preparam soluções tampão o pH nem sempre é o que se esperava.

A razão para tal é que o pH é medido em relação à actividade do par ácido-base e não
pela concentração do ácido ou da base conjugada. Assim, quando queremos preparar
uma solução com um pH exacto muitas das vezes é necessário acertá-lo gota a gota.
No caso dos cálculos do grupo 4, que foi o que os operadores realizaram, o volume de
NaOH igual a 13,42 mL não resultou no valor de pH esperado (7,2), visto que
ultrapassou esse valor (7,4). Não se pôde adicionar HCl para fazer descer o pH porque
iria reagir com o NaOH o que, numa solução tampão não é permitido, visto que não é
suposto os reagentes reagirem. Então a solução é repetir o procedimento e adicionar
menos quantidade volúmica de NaOH. Experimentou-se, então, realizar esta parte do
procedimento com um volume de 12 mL e pH também ainda não era o esperado, mas
como não o ultrapassava foi-se adicionando, gota-gota, NaOH até perfazer o pH de
7,2. Para agitar melhor a solução e para se observar o efeito do aumento do pH mais
rapidamente utilizou-se uma barra magnética.

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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 11

Grupo 1
 Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.

[ ]
[ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]
A relação entre a concentração do ácido e da base é igual para todos.
[ ] [ ] [ ]
{ [ ] {
[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ]

pH tampão fosfatos 0,05 M

[ ]

[ ]

 Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada

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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 12

[ ]
{
[ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ]

pH tampão fosfatos 0,05 M

[ ]

[ ]

Grupo 2
 Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.

[ ]
{
[ ] [ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ]

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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 13

pH tampão fosfatos 0,10 M

[ ]
[ ]

Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada

[ ]
{
[ ] [ ]
[ ] [ ]

[ ] [ ]

pH tampão fosfatos 0,05 M

[ ]
[ ]

Grupo 3
 Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.

[ ]
{
[ ] [ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ]

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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 14

pH tampão fosfatos 0,15 M

[ ]
[ ]

Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada

[ ]
{
[ ] [ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ]

pH tampão fosfatos 0,15 M

[ ]
[ ]

Grupo 4
 Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.

[ ]
{
[ ] [ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ]

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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 15

pH tampão fosfatos 0,20 M

[ ]
[ ]

Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada

[ ]
{
[ ] [ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ]

pH tampão fosfatos 0,20 M

[ ]
[ ]

1.3. Estudo da influência da molaridade na capacidade de uma

solução tampão

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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 16

Quadro 3 Estudo do efeito da molaridade na capacidade de uma solução tampão de fosfatos

(pH7,2) – registo dos resultados calculados e experimentais.

Solução pHic pHiexp pH f*c pHf*exp pHc pHexp

Tampão de Fosfatos
7,2 7,19 7,01 6,87 -0,19 -0,32
(pH = 7,2) 0,05M
Tampão de Fosfatos
7,2 7,26 7,18 7,05 -0,02 -0,21
(pH = 7,2) 0,10 M
Tampão de Fosfatos
7,2 7,27 7,2 7,13 0 -0,14
(pH = 7,2) 0,15M
Tampão de Fosfatos
7,2 7,21 7,20 7,15 0 -0,06
(pH = 7,2) 0,20M

Na apresentação desta tabela é de salientar que não se mediu o pH da água

destilada devido à falta de tempo com que nos deparámos. No entanto, teoricamente
sabemos que o pH da água destilada deveria ser 7, mas experimentalmente o pH
deveria ser um pouco mais baixo devido ao seu contacto com o ar (que contem CO2),
pois ocorre a reacção: H2O + CO2 H2CO4. Ao adicionar HCl o pH deveria descer

ΔpH experimental e ΔpH calculado versus

molaridade da solução tampão
0,34
0,32
0,3
0,28
0,26
0,24
|Variação de pH|

0,22
0,2
0,18
0,16 Δ pHc
0,14
Δ pHexp
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0,05 0,1 0,15 0,2
Molaridade da Solução tampão

ainda mais, o que causaria uma variação de pH negativa (sendo a maior variação de
todos os casos, já que não é uma solução tampão) tanto teórica como
experimentalmente.

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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 17

Gráfico 3 Gráfico que representa pH final calculado e pH final experimental versus

molaridade da solução tampão.

Nos restantes casos, soluções tampão, a variação de pH variou com diferentes

concentrações de fosfatos. Ao adicionar HCl, foram adicionados iões H + à solução que
contribuíram para o gasto da base conjugada e para a formação de ácido, fazendo o
pH descer ligeiramente.
Através da análise do quadro e do gráfico acima representados ( Quadro 3,Gráfico
3, respectivamente) pode-se concluir que quanto maior a concentração de fosfatos,
mais pequena é a variação de pH. Assim, podemos dizer que a molaridade tem
consequências na capacidade tampão: quanto maior a molaridade da solução, maior a
capacidade tampão. Isto deve-se ao facto de quando a molaridade é maior o número
de moles em solução também é maior – haverá maior o número de iões que
neutralizam o ácido e consequentemente haverá menor variação de pH.

1.4. Estudo da influência da temperatura no valor de pH de uma

solução tampão
Quadro 4 Estudo do efeito da temperatura no valor de pH de uma solução tampão – registo de
resultados.
Solução Condições Temperatura pHexp
Tampão Usadas (ºC)
1 – Gelo 2 7,29
Tampão de
Fosfatos 2- Temperatura 20 7,19
(pH 7,2) Ambiente
0,1 M 3 – Banho 37 7,17
Termostatizado

Como é visível no quadro acima apresentado ( Quadro 4Quadro 4 Estudo do efeito da

temperatura no valor de pH de uma solução tampão – registo de resultados.) o valor de pH
aumenta com a diminuição de temperatura. Como referido anteriormente, o pH é
medido em relação à actividade do par ácido-base por isso, com o aumento da
temperatura, a actividade dos iões H+ aumenta e consequentemente o pH (
) diminui. Quando a temperatura diminui a actividade dos iões H+ diminui e
portanto o pH aumenta. Nesta actividade laboratorial, por falta de tempo, as soluções 1
e 3 só estiveram colocadas no gelo e em banho de água, respectivamente, durante
cerca de 15 minutos e não os 30 minutos devidos.

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 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 18

2. Bibliografia

 Simões, José A. Martinho, Guia do laboratório de Química e Bioquímica, 2ª

edição, Lidel, Lisboa, 2008;
 Voet, D. e Voet, J.G. (1995) Biochemistry, 2ª ed., John Wiley & Sons: New York,
pp. 56-62 & 105-119.

3. Questionário
3.1. Quais são os critérios gerais mais importantes a considerar na escolha de uma solução
tampão a ser usada em experiencias bioquímicas? Justifique sucintamente.
A escolha de uma solução tampão deve ser feita em relação aos seguintes
critérios: o intervalo de pH que se vai estudar; deve ser impermeável relativamente às
membranas celulares (muito solúvel em água e pouco solúvel noutros solventes); não
deve interferir nos processos biológicos; não deve absorver radiação visível ou UV; não
deve formar compostos insolúveis (precipitação); de ter uma contribuição mínima para
a composição iónica (força iónica do meio influencia processos biológicos); a influência
da temperatura na alteração do pH deve ser limitada e o pKa deve distar pouco do pH.

3.2 Muitos protocolos de purificação de proteínas requerem que todos os procedimentos

sejam realizados a 4ºC para se minimizar a inactivação das proteínas. No caso de se
trabalhar com uma proteína muito sensível ao valor de pH do meio, a preparação das
soluções tampão e o acerto final do seu valor de pH são realizadas numa câmara frigorífica.
Justifique o procedimento anterior.

01 de Março de 2011
 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão 19

Como foi provado nesta actividade laboratorial, a temperatura afecta o valor de

pH logo, se se está a trabalhar com uma enzima que é muito sensível ao pH, deve-se
preparar a solução tampão nas condições em que a proteína está activa, para quando
a solução estiver em contacto com ela não sofrer (ou sofrer poucas) alterações e a
proteína não ser desactivada/desnaturada.
Assim, como a proteína está activa aos 4ºC prepara-se a solução tampão num
frigorífico à mesma temperatura para evitar mudanças no valor de pH e a inactivação
da mesma.

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