Cinética Enzimática

Prof. Rita de Cassia Siqueira Curto Valle Depto. Engenharia Química Universidade Regional de Blumenau

Cinética enzimática
• Estuda a velocidade com que ocorrem as transformações de reações catalisadas por enzimas. • Velocidade de transformação de substrato em produto • Leva à determinação de parâmetros cinéticos para deduzir a atividade enzimática, a afinidade da enzima pelo substrato e os mecanismos através dos quais leva a cabo a catálise.

Cinética enzimática - objetivos
• Medir as velocidades das transformações que se processam; • Estudar a influência de condições de trabalho naquelas velocidades:
▫ ▫ ▫ ▫ pH; Temperatura; Concentração de reagentes e das enzimas; Concentração de inibidores e de ativadores;

• Correlacionar as velocidades das transformações com algum dos fatores que as afetam; • Colaborar com a otimização do processo; • Estabelecer critérios para o controle de processo • Projetar um reator adequado

Atividade enzimática • É a velocidade na qual a enzima catalisa a reação • Unidades da atividade enzimática: U: quantidade de enzima que promove a formação de 1 μmol de produto por minuto • Deve sempre estar referenciado à uma quantidade específica de amostra • Exemplo: 20 U/g de mamão 1 g de mamão tem uma quantidade de enzima que transforma 20 μmol de substrato por minuto .

Atividade enzimática • Unidades da atividade enzimática: • Katal: quantidade de enzima que transforma 1 mol de substrato por segundo ou forma 1 mol de produto por segundo • Deve sempre estar referenciado à uma quantidade específica de amostra • Exemplo: 45 katal/mL de amostra 1 mL da amostra tem uma quantidade de enzima que transforma 45 moles de substrato por segundo .

até o ponto em que ↑T. ↑V da reação. vai V↓ T = temperatura V = velocidade .Fatores que influenciam a atividade enzimática • Temperatura à medida que ↑T.

Fatores que influenciam a atividade enzimática • Temperatura ▫ Estabilidade térmica .

Fatores que influenciam a atividade enzimática • Temperatura ▫ Tempo de meia vida (t1/2) – tempo no qual as enzimas perdem 50% da sua atividade numa determinada temperatura .

unir os substratos ou catalisar a reação.Fatores que influenciam a atividade enzimática O sítio ativo da enzima está • pH frequantemente composto de grupos ionizáveis que devem estar na forma iônica adequada para manter a conformação. A atividade da enzima deve ser medida no pH ótimo .

até o ponto em que ↑pH.Fatores que influenciam a atividade enzimática • pH à medida que ↑pH. ↑V da reação.: pHótimo para pepsina = 1. [S] e a temperatura.5 a 3 . • Ex. vai V↓ • Fixam-se [E].

Fatores que influenciam a atividade enzimática • pH ▫ Resistência ao pH .

Fatores que influenciam a atividade enzimática • Concentração de enzima .

Fatores que influenciam a atividade enzimática • Presença de inibidores ▫ compostos que diminuem a velocidade da reação ▫ Agem de diferentes formas  Inibição competitiva  Inibição não-competitiva ▫ Fármacos ▫ Preservativos de alimentos ▫ Compostos tóxicos .

Fatores que influenciam a atividade enzimática • Concentração de substrato Elevadas concentrações de substrato podem preservar a estabilidade da enzima sob efeito da temperatura e do pH .

V torna-se cte V=Vmax . T e pH = ctes à medida que ↑[S]. ↑V da reação. até o ponto em que ↑[S].Fatores que influenciam a atividade enzimática • Concentração de substrato [E].

Fatores que influenciam a atividade enzimática • Concentração de substrato ▫ Concentrações altas a velocidade será máxima. Vmax [S] . Até o ponto de saturação da vo enzima não afeta a velocidade.

Fatores que influenciam a atividade enzimática • Concentração de substrato ▫ Desvios da linearidade ocorrem:     Presença de inibidores na solução de enzima. Limitações impostas pelo método de análise. Presença de um ativador que dissocia a enzima. Presença de substâncias tóxicas. .

.Determinação da velocidade de reação • Complicador .a concentração do substrato varia ao longo da reação à medida que este vai se transformando em produto.

Velocidade de reação • Então como medir a velocidade de uma reação enzimática? .

Velocidade de reação • Limitar a velocidade em alta [S] devido à saturação dos sítios ativos da Enzima • Determinar a velocidade inicial da reação v0 (velocidade inicial) .

Velocidade de reação Variações da concentração de substrato são negligenciáveis [P] é baixa .

Cinética de Michaelis e Menten • Modelo cinético que melhor explica a influência das concentrações iniciais de enzima e substrato na velocidade inicial da reação enzimática (1913) Leonor Michaelis -Enzimologista Maud Menten .Pediatra .

Cinética de Michaelis e Menten • Hipóteses: ▫ O substrato e a enzima reagem reversivelmente entre si formando um composto intermediário denominado complexo enzima-substrato. regenerando a enzima e formando os produtos da reação. . ▫ O complexo formado ou se decompõe.

Cinética de Michaelis e Menten v K1 = cte de velocidade de formação do complexo K2 = cte de velocidade de dissociação do complexo K3 = cte de velocidade de decomposição do complexo. formando produto v = velocidade de formação do produto S = concentração inicial de substrato E = concentração inicial de enzima P = concentração de produto .

[S] • A velocidade de quebra de ES corresponde a (k2 + k3). ou velocidade inicial (v0) é igual ao produto da concentração de ES por k3 v0 = K3 [ES] • A velocidade de formação de ES corresponde a k1 [E]. [ES] A constante de Michaelis (KM) é definida como: Reescrevendo... .Cinética de Michaelis e Menten • velocidade de catálise.[S] = (k2 + k3). [ES] • A velocidade de formação de ES será: k1 [E].

a E está saturada com o [S] e a [ES] = [ET] Nestas circunstâncias. menos a concentração da enzima ligada [ES] Como: v0 = K3 [ES] Fazendo as devidas substituições Condição reacional necessária Como a [S] >>> [ET]. [S] é muito maior do que KM e [S] /([S] + KM) ~ 1 Nestas condições Velocidade máxima de formação de P = Vmax Então Equação de Michalis-Menten .Cinética de Michaelis e Menten • Considerando que a concentração da enzima livre [E] corresponde à concentração da enzima total [ET].

Cinética de Michaelis e Menten Vo = V max [S] Km + [S] Essa equação explica o comportamento da cinética de reações catalisadas por enzimas: 1) Se [S] é muito maior do que KM a velocidade da reação é máxima e independe da concentração do substrato 2) Se [S] é muito menor do que KM. . a velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração de substrato.

Cinética de Michaelis e Menten Vo = V max [S] Km + [S] Essa equação explica o comportamento da cinética de reações catalisadas por enzimas: v = Vmax [S] Km 2 3) Se [S] é igual a KM v v = Vmax 1 Vmax 2 3 Km [S] .

Determinação de Km e Vmáx • Método gráfico de Lineweaver-Burk 1 v = Km Vmax [S] + 1 Vmax 1 v Inclinação = Km Vmax Vmax -1 Km 1 [S] 1 .

Determinação de Km e Vmáx • Método gráfico de Eadie-Hofstee v v=V −K max m [S] Vmax Inclinação = -Km v Vmax Km v [S] .

Determinação de Km e Vmáx • Método gráfico de Hanes-Woolf K [S] 1 m + = [S] v V V max max [S] v Km Vmax Inclinação = 1 Vmax -Km [S] .

o n° de passos da reação. em que k2 seja muito maior do que k3. KM é igual à constante de dissociação de ES.Constante de afinidade KM = K2 + K3 K1 Imaginando um caso limitante. isto significa que a dissociação do complexo ES em E mais S é mais rápida do que a formação de E mais produto (P). quando k3 é muito menor do que k2. Em outras •Km alto – baixa afinidade •Km baixo – alta afinidade •Km depende: o aspectos específicos do mecanismo de reação. o velocidades relativas dos passos individuais . Portanto.

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