UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO - UFMA

DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA – CCBS

CURSO DE FARMÁCIA

DOCENTE: ROSIMARY DE JESUS GOMES TURRI

DISCENTES: LUIS FERNANDO LIRA LIMA, MILLENA AUSTRÍACO ARAÚJO

DE OLIVEIRA E ISABELLE DOS SANTOS SOARES

EXTRAÇÃO DE DNA DE BACTÉRIAS DO SOLO

As técnicas de genética molecular, como isolamento e caracterização do

DNA total e amplificação deste através de PCR (Reação em Cadeia da
Polimerase) de genes funcionais, têm sido usadas em estudos de comunidades
microbianas, para superar as limitações encontradas para a avaliação da
microbiota ambiental, através do uso de técnicas convencionais de isolamento
e cultivo em laboratório.

É nesse contexto científico que surge uma nova área interdisciplinar

denominada Ecologia Molecular Microbiana. O isolamento de DNA microbiano
do ambiente natural encontra-se como um instrumento útil para o estudo da
diversidade presente nos ecossistemas, para a descoberta de espécies “não
cultiváveis”, na detecção de organismos geneticamente modificados e no
estudo das funções ecológicas de certos genes que codificam importantes
atividades metabólicas (TSAI e OLSON, 1991).

De acordo com Rosado et al. (1997), os principais fatores responsáveis

pelo surgimento desta área são os avanços nas técnicas de biologia aliados ao
surgimento da bioinformática, uma vez que o uso de técnicas baseadas nas
ferramentas moleculares permite estudar a microbiota. A quantidade de
microrganismos em um grama de solo é vasta, e cada um deles encerra em
seu genoma uma média de 2 milhões de pares de bases nucleotídicas. Não é
possível sequenciar todas as moléculas de DNA presentes na solução do solo
extraída para avaliação de toda a diversidade do solo. Por isso é utilizada uma
sequência do genoma extraído do solo, de tamanho relativamente pequeno,
conservado na maioria dos microrganismos, na qual é possível analisar e
caracterizar as espécies de forma filogenética, como a sequência 16S do DNA
ribossômico, no caso dos estudos de procariontes (COUTINHO, 1999).

Em geral, os métodos envolvem a análise das células microbianas

presentes nas amostras de solo para a liberação do material genético (DNA),
seguido de sua purificação, para uso em reações de PCR, sequenciamento,
hibridização, entre outros. O DNA “do solo” contém cromossomos de um
grande número de microrganismos presentes na amostra analisada. Quanto
maior a diversidade microbiana do solo, maior o número de sequencias
diferentes encontradas nos cromossomos recuperados do solo (COUTINHO,
1999).

Os métodos para extração de DNA de bactérias do solo podem ser

divididos em dois tipos: método indireto, no qual as células microbianas são
extraídas do solo por centrifugação e, a partir disso, sofrem análise e extração
dos ácidos nucléicos; e o método direto, que consiste na extração do DNA
diretamente das células, ainda na matriz do solo.

Heuer et al. (1997) utilizaram um grupo específico de primers para PCR

e aplicaram a técnica de DGGE (Eletroforese em Gel com Gradiente
Desnaturante) para analisar comunidades de actinomicetos em diferentes
solos. Curtis e Craine (1998) usaram DGGE para comparar a diversidade de
comunidades microbianas totais presentes em diferentes amostras de lodo. Na
técnica de DGGE, as moléculas com diferentes sequencias têm diferentes
comportamentos, assim param a migração em diferentes pontos do gel. Para a
análise por T-RFLP (Polimorfismos de Tamanho de Fragmentos de Restrição
Terminal), são utilizados primers marcados com fluorescência para a reação de
PCR, os fragmentos de DNA amplificados são cortados por enzimas de
restrição em sítios específicos, e o tamanho dos fragmentos produzidos é
constante em um indivíduo, mas varia entre as espécies devido às diferenças
nas sequências não codificantes do DNA.
 Além das técnicas citadas anteriormente, outras metodologias têm sido
utilizadas na análise microbiana do solo, como por exemplo, SSPC
(Conformação de Polimorfismoem Fita Simples), ARDRA (Análise de Restrição
de DNA Ribossomal Amplificado) (TORSVIK e OVREAS, 2002). Todas essas
técnicas envolvem a análise dos produtos de PCR com primers universais, e se
diferenciam pela forma com que os produtos são separados para a avaliação.
A técnica de SSPC separa os produtos de PCR pelas diferenças na mobilidade
eletroforética causada por diferenças conformacionais da fita simples da
sequência amplificada de DNA (STACH et al., 2001). Outras técnicas
moleculares utilizadas no estudo microbiológico do solo constam de reações de
hibridização e sequenciamento de fragmentos de DNA amplificados.

ATIVIDADE DE EXTRAÇÃO DE DNA

1) Para a extração de RNA/DNA, uma das etapas mais importante é a

eliminação das proteínas durante o processo de purificação. Para a
eliminação de proteínas na extração de RNA/DNA, assinale a
afirmativa inadequada.

A) Digestão das amostras com a enzima proteinase K.

B) Extrações com misturas de solventes orgânicos como fenol e
clorofórmio por repetidas vezes.
C) Solubilização em tampões de guanidina.
D) Precipitação salina.
E) Solubilização em tampões ácidos (pH menor que 3,5).

2) A tecnologia de sequenciamento da Illumina ® é considera uma das

principais formas de sequenciamento de última geração.
Sobre a tecnologia Illumina®, assinale a afirmativa incorreta.

A) Na preparação do DNA para o sequenciamento, é desnecessária a

ligação de adaptadores de DNA.

B) Na etapa inicial, as fitas simples de DNA se ligam randomicamente a

superfície.
C) Para a amplificação, a enzima incorpora nucleotídeos para produzir uma
dupla fita em ponte que realizada em um substrato sólido.

D) A etapa de desnaturação da dupla fita produzida deixa as fitas simples

ancoradas no substrato.

E) A etapa de amplificação termina quando são formados milhões de

agrupamentos de fita duplas de DNA com alta densidade no substrato
sólido.

3) Sobre as diferenças entre o método didesoxi e o método utilizado em

sequenciadores automáticos, assinale a alternativa incorreta.

A) O método didesoxi é usualmente dependente de radioatividade, enquanto o

dos sequenciadores automáticos utiliza corantes fluorescentes.
B) No método didesoxi são necessárias quatro reações distintas para uma
mesma sequência, enquanto que nos sequenciadores automáticos apenas
uma reação é utilizada.
C) A interpretação do resultado do método didesoxi depende da revelação de
um autoradiagrama, enquanto nos sequenciadores automáticos o resultado
é revelado em tempo real em um gráfico.
D) O método didesoxi depende da migração em gel de poliacrilamida, enquanto
que nos sequenciadores automáticos outras matrizes de migração podem
ser utilizadas.
E) O método didesoxi depende de uma reação de PCR para obtenção dos
resultados, enquanto nos sequenciadores automáticos o PCR não é
necessário

4) Sequenciamento de nova geração, conhecido também como NGS ou

sequenciamento profundo de ácidos nucleicos, é um termo geral utilizado
para descrever uma série de tecnologias modernas de sequenciamento.
Sobre esta tecnologia é correto afirmar que:

A) Illumina (Solexa), 454 (Roche) e Ion Torrent (Próton/PGM) são

sequenciadores de nova geração que realizam o sequenciamento direto
tanto de DNA quanto de RNA.
B) Uma das maiores vantagens das tecnologias de sequenciamento de nova
geração é o fato de que as sequências obtidas geralmente são longas,
contendo, ao menos, 1 kilobases.
C) Apesar dos inúmeros avanços gerados pelas técnicas de sequenciamento
de nova geração, ainda é tecnicamente impossível utilizá-las para analisar
os genes que estão sendo expressos em um determinado tecido ou
condição.
D) Uma das restrições ao uso do sequenciamento de nova geração é a
necessidade de serem utilizadas amostras grandes com alta concentração
de ácidos nucleicos.
E) As tecnologias recentes de sequenciamento de ácidos nucleicos permitem
sequenciar tanto DNA como RNA de forma mais rápida e barata do que
anteriormente era conseguido com o sequenciamento de Sanger e, por
conta disto, estão revolucionando os estudos de genomas e a biologia
molecular.

5) Com relação ao sequenciamento de DNA, assinale a alternativa correta.

A) Os métodos de sequenciamento têm base na produção de fragmentos de

DNA de comprimento crescente, que começam em um ponto comum e
possuem todos os quatro tipos de nucleotídeos nas respectivas
extremidades.

B) Após a etapa de desnaturação do DNA, é colocado um primer na

extremidade 5’ de uma das cadeias e, com a ajuda de uma DNA polimerase,
sintetiza-se a cadeia complementar.

C) Após o término da reação de sequenciamento, ela é submetida à

eletroforese capilar. Todos os fragmentos recém-sintetizados, cada um
terminado em um nucleotídeo diferente e cada um marcado com um
diferente fluoróforo, são separados pelas respectivas cores.
D) Os nucleotídeos empregados nessa técnica são quimicamente modificados
de forma que não apresentam um terminal hidroxila (3’-OH), impedindo a
inserção de um novo nucleotídeo pela DNA polimerase.
E) O método de Sanger revolucionou o sequenciamento de DNA pela não
utilização de substâncias radioativas marcando os ddNTPs, e ficou
conhecido como sequenciamento da segunda geração.

REFERÊNCIAS

ROSA, Márcia Maria. Avaliação de diferentes metodologias para extração

de dna de solo sob cultivo de cana-de-açúcar. 2006. 100 f. Dissertação
(Mestrado) - Curso de Ciências Biológicas, Universidade Estadual Paulista -
Unesp, Rio Claro, 2006.

MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e bioquímica do solo.

Lavras: UFLA, 2006.

MULLIS, K. B.; FALOONA, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a

polymerasecatalyzed chain reaction. Methods In Enzymology, p.335-350,
1987.