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1 INTRODUÇÃO
Devido aos avanços em análise e manipulação genética, durante os últimos tempos, o
impacto das inovações no sequenciamento de DNA de alto rendimento e na edição de
genoma, tem sido amplamente significativo no campo de pesquisa cientifico.

Basicamente, estudos genéticos se baseiam em descobrir e analisar mutações

espontâneas. Em meados do século XX, Muller(“ARTIFICIAL TRANSMUTATION OF
THE GENE | Science”, [s.d.]) e Auerbach(AUERBACH; ROBSON; CARR, 1947),
demonstraram que a taxa de mutagênese poderia ser aumentada com radiação ou tratamento
químico.

Depois de um tempo, surgiram métodos que dependiam de inserções de transposon

que poderiam ser induzidas em alguns organismos, mas esses procedimentos, como a radiação
e a mutagênese química, produziram mudanças em locais aleatórios no genoma. Nas décadas
de 1970 a 1980, as primeiras mudanças genômicas direcionadas, foram produzidas em
leveduras e em camundongos (CARROLL, 2017).

Esse direcionamento para um gene se deu através do processo de recombinação

homóloga, que foi muito preciso, mas ineficiente em células de camundongo. O
direcionamento de genes não foi facilmente adaptado a outras espécies devido à baixa
frequência e à ausencia de células-tronco embrionárias cultiváveis em outros mamíferos que
não fossem ratos. As tecnologias atuais de edição de genoma resolveram esse problema,
possibilitando manipulações genéticas direcionadas para praticamente todos os tipos de
células e organismos.

Com isso, terapia gênica surgiu como a capacidade do melhoramento genético por
meio da correção de genes alterados (mutados) ou modificações sítio-específicas, que tenham
como alvo o tratamento terapêutico. Um dos principais focos desta técnica é a otimização dos
veículos de entrega (vetores) que, em sua maioria, são plasmídeos, nanoestruturados ou vírus
− sendo estes últimos os mais estudados, devido à sua excelência em invadir as células e
inserir seu material genético.

No entanto, existe grande preocupação referente às respostas imunes exacerbadas e à

manipulação do genoma, principalmente em linhagens germinativas. Entretanto, avanços
biotecnológicos têm sido empregados para o aprimoramento da terapia gênica e a
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manipulação genética é um deles. Durante a revisão, serão abordadas as ferramentas que

possibilitam as manipulações genéticas e os seus principais desafios.

2 FERRAMENTAS DA EDIÇÃO GENÉTICA

Devido ao longo tempo gasto para realizar a técnica de recombinação homóloga em
células tronco embrionárias de camundongos e o desafio de realizar esse mesmo
procedimento em células humanas, abordagens com alternativas diferentes para regular a
expressão gênica tornaram-se padrão.

No entanto, o fato dessas abordagens apenas reduzir transitoriamente a expressão, o

efeito ser geralmente incompleto e a possiblidade de afetar genes fora do alvo, possibilitaram
a demanda por métodos mais eficazes para a realização de modificação genética.

As novas tecnologias de edição genética (Fig.1) surgiram para suprir essa demanda e
dar aos pesquisadores a capacidade de introduzir de forma precisa e eficaz, uma variedade de
alterações genéticas em células de mamíferos, através da edição de apenas um nucleotídeo ou
até mesmo regiões cromossômicas.

Figura 1. Edição de genoma mediada por nucleases específicas do local (SSNs)

que mediam a edição direcionada de genoma em espécies eucarióticas. As SSNs
induzem quebras de fita dupla (DSBs) que podem ser reparadas pela imprecisão
na junção não homóloga (NHEJ) ou por vias precisas de reparo de DNA de
recombinação homóloga. NHEJ reúne as extremidades quebradas do DNA com
inserções aleatórias ou deleções de nucleotídeos de DNA (indels). O reparo
homólogo (HR), na presença de uma sequência de DNA doador, pode ser
aproveitado para editar ou substituir a sequência de qualquer gene, resultando
na correção ou adição de genes.
 3

2.1 Zinc finger nucleases

Zinc finger nucleases (ZFNs) são proteínas de fusão que consistem em uma matriz
com domínios de ligação a DNAs específicos de um local - adaptados de fatores de
transcrição - ligados ao domínio endonuclease da enzima de restrição FokI
bacteriana(GUPTA; MUSUNURU, 2014). Cada domínio proteico de dedo de zinco
reconhece uma sequência de DNA de 3 a 4 pares de bases (pb) e os domínios em tandem
(repetição) podem potencialmente se ligar a uma sequência de nucleotídeos estendida dentro
de um genoma da célula.

Para ocorrer a clivagem em um sítio específico, ocorre uma interação proteína-DNA

pelo domínio ZF. Após a ligação dos ZFNs em ambos os lados do local, o par de domínios
FokI dimeriza e cliva o DNA naquele local, gerando uma quebra de cadeia dupla (DSB) com
extremidade 5 ' livre. As células reparam a DSBs utilizando junção não homóloga (NHEJ),
que pode ocorrer durante qualquer fase do ciclo celular, mas ocasionalmente resulta em
reparo incorreto, ou reparo dirigido por homologia (HDR), que normalmente ocorre durante
Fase S ou na fase G2 quando uma cromátide irmã está disponível para servir como um molde
de reparo.

A inclinação a erros da junção não homóloga pode ser explorada para introduzir
substâncias que causam a adição ou supressão na sequência codificadora de um gene,
potencialmente nocauteando o gene. Apesar das vantagens dessa técnica, existem várias
desvantagens potenciais. O uso provou não ser fácil montar os domínios de dedos de zinco
para ligar um trecho extenso de nucleotídeos com alta afinidade. Isso tornou difícil para os
não-especialistas projetarem rotineiramente ZFNs.

Outra desvantagem potencial é que nem todas as sequências podem ser alvo de
ZFN(“Functional genetics for all: engineered nucleases, CRISPR and the gene editing
revolution | EvoDevo | Full Text”, [s.d.]). Apesar dessa desvantagem não ser um problema
caso um investigador tente desligar um gene, uma vez que um mutagênico por deslocação do
quadro de leitura for introduzido em qualquer lugar na sequência codificadora inicial do gene,
ele pode produzir o resultado desejado ou apresentar desafios caso for preciso a utilização de
um local específico. Finalmente, uma preocupação significativa sobre o uso de proteínas
projetadas para introduzir DSBs no genoma é que elas o farão não apenas no local desejado,
mas também em locais fora do alvo.
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Portanto, os investigadores devem estar cientes de que há possibilidade dos ZFNs

projetados para uma finalidade específica poderem se desdobrar em eventosn adversos
indesejados. Uma estratégia para reduzir eventos fora do alvo é utilizar um par de ZFNs que
possuam domínios FokI distintos que são heterodímeros obrigatórios(GUPTA; MUSUNURU,
2014). Isso impede que um único ZFN seja vinculado a dois locais adjacentes fora do alvo,
gerando um DSB; em vez disso, a única maneira de ocorrer um evento fora do alvo é se
ambos os ZFNs de um par se ligarem de maneira adjacente e assim permitir que o dímero
FokI se forme. Outra estratégia que tem demonstrado reduzir eventos fora do alvo é a
introdução de proteínas ZFN purificadas nas células(GUPTA; MUSUNURU, 2014).

2.2 Transcription activator-like effector nucleases

A recente descoberta de uma classe de proteínas chamadas de efetoras do tipo ativador
de transcrição (TALEs), exclusivas de um grupo de patógenos de plantas, levou à
caracterização de um novo domínio DNA-binding , denominado repetição TALE. As
repetições TALE, que ocorrem naturalmente, incluem matrizes que repetem sequências de
DNA (tandem) com 10 a 30 repetições que se ligam e reconhecem sequencias de DNA
extendidas(SUN; ZHAO, [s.d.]). Cada repetição tem 33 a 35 aminoácidos de comprimento,
com dois aminoácidos adjacentes (di-resíduo de variável repetida [RVD]) dando
especificidade para um dos quatro pares de bases do DNA. Assim, existe uma
correspondência de um para um entre as repetições e os pares de bases nas sequências de
DNA alvo.

A elucidação do código RVD possibilitou a criação de um novo tipo de nuclease

específica do local manipulado, que funde um domínio de TALE com repetições no domínio
da endonuclease FokI, denominado nucleases efetoras TAL (TALENs). Os TALENs são
semelhantes aos ZFNs, pois podem gerar DSBs em um local de destino desejado no genoma
e, portanto, podem ser usados para eliminar genes ou provocar mutações da mesma maneira.
Em comparação com os ZFNs, os TALENs se mostraram muito mais fáceis de projetar. O
código RVD tem sido empregado para projetar muitas matrizes de repetição TALE que se
ligam com alta afinidade às seqüências de DNA genômico desejadas; As matrizes projetadas
de novo de repetição TALE se ligam às sequências de DNA desejadas, com alta afinidade.

Os TALENs podem ser projetados e construídos em um curto espaço de tempo de dois

dias e em um número tão grande quanto centenas de cada vez. Uma vantagem potencial sobre
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os ZFNs é que o conjunto de repetições TALE pode ser facilmente estendido para qualquer
tamanho desejado. Enquanto os ZFNs modificados geralmente se ligam a seqüências de 9 a
18 pb, os TALENs são frequentemente construídos para se ligar a seqüências de 18 pb ou até
mais, embora evidências recentes sugiram que o uso de TALENs maiores possa resultar em
menor especificidade.

Outra vantagem dos TALENs sobre os ZFNs é que parece haver menos restrições na
seleção de locais; Em teoria, existem vários pares possíveis de TALEN disponíveis para cada
pb de uma sequência aleatória de DNA. Tal como acontece com ZFNs, os efeitos fora do alvo
são uma preocupação significativa com os TALENs. Um estudo no qual os TALENs foram
usados para edição de genoma em células-tronco pluripotentes humanas encontrou baixas,
porém mensuráveis, taxas de mutagênese em alguns dos 19 possíveis locais fora do alvo
baseados na similaridade de sequência com os locais no alvo(GUPTA; MUSUNURU, 2014).

Embora os dados comparativos sejam escassos, um estudo descobriu que para

TALENs e ZFNs visando o mesmo local no gene CCR5, os TALENs produziram menos
mutações de alvo-alvo do que os ZFNs em um local altamente semelhante no gene
CCR2(GUPTA; MUSUNURU, 2014). Assim como com ZFNs, os TALENs com domínios
FokI heterodiméricos obrigatórios são usados rotineiramente para minimizar a possibilidade
de eventos fora do alvo.

Recentemente, estudos de sequenciamento completo do genoma de clones de células-

tronco pluripotentes humanos editados com TALENs, mostraram que a taxa geral de eventos
fora do alvo é muito baixa. Uma desvantagem dos TALENs é que o seu tamanho é
significativamente maior em comparação com os ZFNs(GUPTA; MUSUNURU, 2014). A
princípio, isso dificulta a entrega e expressão de um par de TALENs nas células em
comparação com ZFNs, e o tamanho dos TALENs torna-os menos atraentes para aplicações
terapêuticas nas quais eles devem ser entregues em vetores virais com tamanho de carga
limitado ou como moléculas de RNA. Além disso, a natureza altamente repetitiva dos
TALENs pode prejudicar sua capacidade de ser empacotada e entregue por alguns vetores
virais, mas isso pode ser aparentemente superado pela diversificação das sequências de
codificação das repetições de TALE (GUPTA; MUSUNURU, 2014).
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2.3 CRISPR / Cas9

Durante a década de 1980, no genoma de Escherichia coli, uma região foi identificada
com um padrão incomum, no qual uma sequência altamente variável foi intercalada por uma
seqüência repetida com função desconhecida. Em 2005, foi assumido que as sequências
variáveis eram de origem extra-cromossômica, atuando como uma memória imune contra
fagos e plasmídeos, o que deu início ao então desconhecido sistema CRISPR (repetições
palindrômicas curtas agrupadas em intervalos regulares) e Cas (proteínas associadas), que tem
tomado espaço na comunidade científica desde 2012, como uma das principais ferramentas
biotecnológicas para a edição de genes.

Originado no sistema imuno-adaptativo de procariontes, a função deste mecanismo é

reconhecer o mateiral genético invasor, dividí-lo em pequenos fragmentos e integrá-lo em seu
próprio DNA. Após uma segunda infecção pelo mesmo agente, ocorre a seguinte sequência:
transcrição do locus CRISPR, processamento de RNAm e criação de pequenos fragmentos de
RNA (crRNAs) que formam complexos com as proteínas Cas, e estes reconhecem os ácidos
nucléicos exógenos e finalmente os destrói(GONÇALVES et al., 2017).

Com base nesse mecanismo natural, a técnica CRIPSR foi desenvolvida possibilitando
a edição das sequências específicas de DNA do genoma de qualquer organismo por meio de
basicamente três moléculas: nuclease (Cas9), responsável pela clivagem do DNA de fita
dupla; um guia de RNA, que orienta o complexo para o alvo; e o DNA alvo.

Devido à sua simplicidade e precisão quando comparado a outras técnicas (Zuc-Finger

Nucleases, TALENs e Gene Targeting) (Tab.1), o sistema CRISPR pode ser utilizado tanto
para reparar mutações (restaurando a função gênica) quanto para introduzir mutações novas
(causando o "nocaute" gênico)(AREND et al., 2017). O RNA guide se hibridiza com o DNA
alvo e depois a Cas-9 reconhece este complexo e media a clivagem da cadeia dupla de DNA e
a reparação na presença de um DNA doador (homólogo). O resultado deste processo é a
integração de uma sequência exógena no genoma (knock-in) ou substituição de alelo.

O rápido avanço desta nova tecnologia permitiu a realização de ensaios translacionais

em células somáticas humanas, utilizando edição genética por CRISPR. As primeiras
aplicações com foco terapêutico já se destacaram em descrever até mesmo as etapas de
otimização dos sistemas de entrega e especificidade para a segurança e eficácia do
sistema(GONÇALVES et al., 2017). Pesquisadores da Universidade da Califórnia e de Utah
recentemente tiveram sucesso em corrigir a mutação do gene da hemoglobina, que origina
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anemia falciforme. Células CD34+ de pacientes portadores de anemia falciforme foram

isoladas, editadas por CRISPR-Cas9, e após 16 semanas, os resultados mostraram uma
redução nos níveis de expressão do gene mutado e uma expressão gênica aumentada do tipo
selvagem.

Além disso, uma pesquisa mostrou que a citidina desaminase guiada por CRISPR
pode modular eficientemente várias formas de processamento de mRNA, convertendo
guaninas invariantes em adeninas em locais de emenda de 5 ′ ou 3’ (YUAN et al., 2018), o
que promove um grande avanço nessa área de pesquisa.

Em contraste com ZFNs e TALENs, que exigem a recodificação de proteínas

utilizando grandes segmentos de DNA (500-1500 pb) para cada novo local alvo, a CRISPR-
Cas9 pode ser facilmente adaptada para direcionar qualquer sequência genômica e além disso
o componente da proteína Cas9 permanece inalterado. Outro potencial de vantagem do
CRISPR-Cas9 é a capacidade de multiplexar, isto é, utilizar múltiplos RNAs guide em
paralelo para atingir múltiplos locais simultaneamente na mesma célula(GUPTA;
MUSUNURU, 2014). Isso torna simples a mutação de múltiplos genes de uma só vez ou a
elaboração de deleções precisas em uma região genômica.

Tabela 1. Principais diferenças entre TALENs, ZFNs e CRISPR-Cas. Adaptado de (GenScript, n.d.)

ZFNs TALENs CRISPR-Cas9

Domínio Alvo

Proteína : DNA Proteína : DNA gRNA-Cas9 : DNA

Os motivos de ligação de Proteínas que possuam O crRNA de 20 nt é
DNA zinc finger em domínios de ligação de fundido com um tracrRNA
determinada configuração DNA reconhecem e uma endonuclease Cas9
Desvantagem
reconhecem segmentos de sequências específicas de Vantagens
que reconhece sequências
Sistema funciona apenas
Precisam de uma proteína para cada sequência de genes
com um vector gRNA-Cas9
Permite a edição de vários
Menor eficiência de entrega
genes

Uma desvantagem da CRISPR-Cas9 é o tamanho da proteína Cas9. O cDNA que

codifica a S. pyogenes Cas9 tem aproximadamente 4,2 kb de tamanho, tornando-o um pouco
maior que um monômero TALEN e muito maior do que um monômero ZFN (embora tanto os
TALEN como os ZFN requeiram dimerização, o que torna seus tamanhos mais eficazes
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maiores). Este tamanho dificulta fornecer a Cas9 via vetores virais (o que adicionalmente
exigiria um promotor e uma sequência de poliadenilação) ou como uma molécula de RNA
(GUPTA; MUSUNURU, 2014).

3 ÉTICA

Com as novas ferramentas de edição genética, diversas doenças possuem agora uma
possibilidade de tratamento. A fertilização in vitro, gravidez pós-menopausa, determinação de
sexo e de doenças genéticas e implante de óvulos de fetos abortados são assuntos que têm
gerado discussões científicas e éticas sobre os limites e consequências da interferência da
medicina na, até então, natural reprodução humana..

Existem diversas doenças em que a maioria da população concordaria com o

tratamento por meio de edição gênica em células somáticas,
onde a correção do gene alvo de células que produzem proteínas estruturais ou secretórias
aliviaria ou anularia efeitos devastadores da doença. O impedimento do potencial sofrimento
humano, despesas sociais, ganho na vida humana e produtividade seriam possíveis
justificações para a utilização de terapia de edição de genes.

Entretanto, para permitir um amplo acesso a esta técnica, o preço precisaria ser
reduzido através de um aumento no número de financiamentos para a optimização da
produção de vetores, já que o processo é muito caro, e também pela procura de novas
estratégias para diminuir o verdadeiro custo da terapia gênica.

Agora que o sequenciamento completo do genoma é amplamente disponível e a um

custo cada vez menor, deve-se considerar a utilização de testes genéticos preditivos de
doenças para fins médicos e com o aconselhamento genético adequado(LOCH; DE, 2014). 

Entretanto, corrigir genomas em gametas está fora dos limites devido às incertezas da
mutagênese isercional. Apesar do aumento de precisão desse procedimento, objeções a
respeito na edição genética em células germinativas têm como principal foco os possíveis
efeitos fora do alvo e preocupações em criar mutações genômicas adversas.

De acordo com o editorial(FONG; HACKETT, 2017) publicado por Yuman Fong e

Perry B. Hackett , as mulheres agora estão sendo descartadas como participantes de testes
visando mtDNA, porque tal manipulação genética pode resultar em alteração nas
mitocôndrias de células germinativas e, portanto, pode ser passado para a prole.
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Entretanto, o debate e o diálogo sobre a edição de células germinativas devem

continuar. A atual proibição da edição genética de células germinativas (GCGE) é justificada
e compreensível, dada as preocupações com consequências intencionais e não intencionais.
No entanto, ter um mecanismo bem definido para a habilitação e o estudo de tal GCGE é
importante. Como a metodologia para edição de genes se torna mais precisa e o mapeamento
e compreensão de áreas silenciosas do genoma humano melhora, é provável que a edição
altamente específica de codificação de genes defeituosos responsáveis pelo sofrimento
humano e mortalidade será possível. Somente se todos forem ouvidos, pode-se chegar a
orientações e decisões racionais quanto ao formato de estudo e aprovação dessas novas
terapias. Somente então, a ciência poderá encontrar as necessidades do sofrimento humano.
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4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AREND, M. C. et al. The CRISPR/Cas9 System and the Possibility of Genomic Edition for
Cardiology. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v. 108, n. 1, p. 81–83, jan. 2017.

ARTIFICIAL TRANSMUTATION OF THE GENE | Science. Disponível em:

<http://science.sciencemag.org/content/66/1699/84.long>. Acesso em: 20 nov. 2018.

AUERBACH, C.; ROBSON, J. M.; CARR, J. G. The Chemical Production of Mutations.

Science, New Series, v. 105, n. 2723, p. 243–247, 1947.

CARROLL, D. Genome Editing: Past, Present, and Future. The Yale Journal of Biology and
Medicine, v. 90, n. 4, p. 653–659, 19 dez. 2017.

FONG, Y.; HACKETT, P. B. Acceptance and Access to Gene Editing: Science and Our
Obligations to Mankind. Molecular Therapy, v. 25, n. 1, p. 1–2, 4 jan. 2017.

Functional genetics for all: engineered nucleases, CRISPR and the gene editing
revolution | EvoDevo | Full Text. Disponível em:
<https://evodevojournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/2041-9139-5-43>. Acesso em:
22 out. 2018.

GONÇALVES, G. A. R. et al. Gene therapy: advances, challenges and perspectives. Einstein

(São Paulo), v. 15, n. 3, p. 369–375, set. 2017.

GUPTA, R. M.; MUSUNURU, K. Expanding the genetic editing tool kit: ZFNs, TALENs,
and CRISPR-Cas9. The Journal of Clinical Investigation, v. 124, n. 10, p. 4154–4161, 1
out. 2014.

LOCH, A.; DE, F. Testes genéticos preditivos: uma reflexão bioético jurídica. Revista de
Bioética y Derecho, n. 30, p. 92–108, 2014.

SUN, N.; ZHAO, H. REVIEW Transcription Activator-Like Effect (TALENs): A Highly

Efficient and V Genome. [s.l: s.n.].

YUAN, J. et al. Genetic Modulation of RNA Splicing with a CRISPR-Guided Cytidine

Deaminase. Molecular Cell, v. 72, n. 2, p. 380- 394.e7, 18 out. 2018.
 11

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

CURSO BIOTECNOLOGIA

NICOLE FERNANDES SILVA

Revisão Bibliográfica:

Ferramentas da Edição Genética: ZFNs, TALENs e CRISPR/Cas9

Uberlândia – MG

2018
 12

NICOLE FERNANDES SILVA

Revisão Bibliográfica:

Ferramentas da Edição Genética: ZFNs, TALENs e CRISPR/Cas9

Revisão Bibliográfica apresentada na

aula Metodologia Científica do Curso
de Biotecnologia, da Universidade
Federal de Uberlândia.

Orientador: Prof. Dr. Rafael Nascimento

Uberlândia – MG

2018
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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................01

2. FERRAMENTAS DE EDIÇÃO
GENÉTICA.................................................................02
2.1. Zinc finger nucleases........................................................................................................03
2.2. Transcription activator-like effector
nucleases..............................................................04
2.3. CRISPR /
Cas9..................................................................................................................05

3. ÉTICA................................................................................................................................08

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................10
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RESUMO

O descobrimento de novas técnicas de manipulação genética tem aberto diversas

oportunidades para pesquisas científicas e gerado um grande avanço, particulamente na
área da saúde. Com as novas ferramentas da edição genética, a capacidade de introduzir
de forma eficiente, uma variedade de alterações genéticas em células, através da edição de
apenas um nucleotídeo ou até mesmo regiões cromossômicas, tem ganhado visibilidade
no campo de tratamento de doenças. Esses novos métodos que podem revolucionar a
natureza humana têm gerado um amplo debate, não só na comunidade científica, mas
também no mundo todo, especialmente quando se trata de ensaios em células somáticas
humanas. Com isso, problemas sociais, jurídicos e éticos, têm surgido com essa nova onda
tecnológica. O objetivo deste trabalho é fazer uma revisão bilbiográfica da edição genética
apresentando três de suas ferramentas principais (ZFNs, TALENs e CRISPR/Cas9), suas
vantagens e desvantages e também suas principais diferenças e desafios para o futuro.

Palavras-chaves: Bioética. Edição. Ferramentas.

 15

ABSTRACT

The discovery of new techniques of genetic manipulation has opened several opportunities
for scientific research and generated a great advance, particularly in the medical area.
With genetic editing’s new tools, the ability to efficiently introduce a variety of genetic
changes into cells by editing only one nucleotide or even chromosome regions has gained
visibility in the field of disease treatment. These new methods that can revolutionize
human nature, have generated a wide-ranging debate not only in the scientific community,
but also around the world, especially when it comes to human somatic cell assays. With
this, social, legal and ethical problems have arisen with this new technological wave. The
objective of this work is to do a bi-biographical revision of the genetic edition presenting
three of its main tools (ZFNs, TALENs and CRISPR / Cas9), their advantages and
disadvantages and also their main differences and challenges for the future.

Keywords: Bioethics; Editing; Tools.