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As doenças que cursam com sintomatologia nervosa sempre foram de grande prevalência
em rebanhos de bovinos de corte criados, tanto intensiva como extensivamente . Durante
décadas, quando ocorriam surtos de tais doenças, a principal preocupação era a de serealizar
um diagnóstico da raiva, tendo em vista a implementação imediata de medidas de controle
baseadas, principalmente em vacinação preventiva do rebanho, complementada com o
controle de vetores. Posteriormente a poliencefalomalácia, as meningoencefalites bacterianas
causadas por microrganismos do gênero Î  , as encefalites inespecíficas, a
encefalite por Herpesvírus Bovino tipo 5 e o botulismo também adquiram importância como
fontes de prejuízo para pecuária bovina, não só para o Mato Grosso do Sul, como também
para todo Centro-Oeste e o restante do País.

A obrigatoriedade imposta pelos órgãos oficiais de defesa sanitária animal em se realizar o


exame para diagnostico da raiva em bovinos mortos apresentando sintomatologia nervosa e,
no caso de resultado negativo para esta enfermidade, a diferenciação de outras encefalopatias,
fez com que os médicos veterinários de campo desenvolvessem uma metodologia própria para
obtenção de amostras de Sistema Nervos Central (SNC). Esta metodologia foi tradicionalmente
baseada na colheita da metade do encéfalo acondicionada em gelo e metade reservada para
obtenção de fragmentos a serem fixados em formol a 10% e destinados à histopatologia.

Recentemente, com o reconhecimento das autoridades sanitárias do Governo Britânico de


que o consumo de carne de bovinos infectados com Encefalopatia Espongiforme Bovina
(BSE=
        ), também denominada ³Doença da Vaca Louca´ é
capaz de causar uma variante da doença de Creutzfeld-Jakob (vCDJ), um processo
neurodegenerativo progressivo a fatal, foi criada uma situação de pânico entre os
consumidores de carne bovina. Isto fez com que os mercados importadores, principalmente os
Países membros da Uniao Européia, impusessem rigorosas barreiras sanitárias para BSE,
motivando a intervenção do Ministério da Agricultura a estabelecer uma rigorosa vigilância
sanitária desta enfermidade.

As medidas a serem tomadas foram determinadas através de instrumento legal


determinando a obrigatoriedade de exame histopatológico no SNC de animais mortos com
sintomatologia nervosa e que tenha sido negativos para raiva. Tal obrigatoriedade visa a
implementação da vigilância sanitária possibilitando a manutenção do País no nível 1(um) de

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risco para BSE, conforme estabeleceu a própria União Européia, correspondendo a um risco
desprezível de contaminação do rebanho bovino brasileiro. Para isso foi criada a Instrução
Normativa (IN) nº18 da Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA) de 15/02/2002, a qual
determina que amostra do O         , sejam submetidos à
histopatologia, como parte de busca passiva para Encefalopatias Transmissíveis (EET¶s), entre
as quais situa-se a BSE.

Define-se como animais de risco referenciados na Instrução Normativa aqueles


representados por:
 Ruminantes com sinais clínicos de distúrbios nervosos ou comportamentais de
evolução sub aguda, acima de 15 dias e negativos para raiva.
 Animais importados de paises que tiveram casos autóctones EET.
 Bovinos com idade superior a 30 meses e ovinos/caprinos com mais de 12 meses,
oriundos de exploração leiteira ou de sistemas intensivos ou semi-intensivos, com
possibilidade de terem sido alimentados com rações contendo subprodutos de
origem animal (Farinhas de ossos ou carne de ruminantes e cama de frango).
 Animais em decúbito sem causa determinada.
 Animais com doenças depauperantes.

O SNC dos animais com todas, ou algumas das características anteriores, que tenham
morrido ou sidos sacrificados em estado terminal, deve ser submetido a exame específico para
diagnostico de raiva. Os casos negativos devem ser encaminhados a histopatologia para
diagnostico diferencial de Encefalopatia Espongiforme Bovina.
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A Encefalopatia Espongiforme Bovina (BSE), também denominada ³Doença da Vaca


Louca´, é uma enfermidade neurodegenerativa progressiva que afeta bovinos domésticos.
Pertence ao grupo das Encefalopatias Espongiforme Transmissíveis (EET), ou doenças do
³prion´, diagnosticada pela primeira vez no Reino Unido, em 1986.

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O    é uma proteína designada PrP produzida pela célula nervosa central, que
pode se converter em uma forma normal, denominada       (PrPSc), que pode se
converter em uma forma anormal encontrada em neurônios de ovinos cometidos de Scrapie. A
conversão da proteína normal em anormal se da devido a alteração conformacional na
molécula protéica, diminuindo a quantidade das Į-hélices com aumento do pregueamentos ȕ,
fazendo com que ela se dobre de forma anormal. Isto a transforma em uma proteína de 23-30
kD com propriedades químicas e físicas consideravelmente modificadas. Um exemplo destas
modificações é a acentuada diminuição da susceptibilidade da PrPSc à ação das proteases,
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quando comparada à PrP .

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O PrP , ao ser ingerido pelo animal, ou o homem, é absorvido no tubo digestivo, passa
para a corrente circulatória e, uma vez no SNC, penetra nas células nervosas tornando-se
molde para novas PrP¶s que estão sendo sintetizadas, transferindo-lhes o padrão de
dobramento anárquico. Isto cria um mecanismo de auto-replicação utilizando-se a maquinaria
genética normal da célula. Esse patógeno é o único conhecido até o momento, que não possui
ácido nucléico (DNA ou RNA) e acumula na célula nervosa afetando o seu funcionamento,
desencadeando uma vacuolização e morte celular.

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Entre as enfermidades causadas pela presença de PrP , destacam-se, a Doença de
Creutzfeldt-Jakob (CJD), tanto a forma esporádica quanto a familiar, que afetam os seres
humanos; o Scrapie ou paraplegia enzoótica das ovelhas, que afeta ovinos e caprinos e a
Encefalite Espongiforme Bovina (BSE), também denominada ³Doença da Vaca Louca´, que
afeta bovinos domésticos.

O Prion responsável por esta ultima doença pode ser transmitido aos seres humanos,
desencadeando um processo neurodegenerativo, considerado uma variante da Doença de

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Creutzfeldt-Jakob (vCJD). A epidemiologia, as manifestações clínicas e o perfil patológico vCJD
diferem do normalmente observado nas formas esporádica e familiar da CJD.

Os estudos epidemiológicos revelaram que aparecimento da BSE não teve relação


com importação de animais, com predisposição genética, com o sexo e com a raça dos
animais afetados. Concluíram que a sua origem foi relacionada com a suplementação de
bovinos com a farinha de carne e osso provenientes de ovinos e/ou bovinos. Concluíram ainda
que as farinhas suspeitas haviam sido produzidas, por motivos de economia, sem a adição de
solventes hidrocarbonados para extração da gordura. Também receberem tratamento térmico
com temperatura inferior à utilizada convencionalmente. Este novo protocolo de processamento
de subprodutos de origem animal se mostrou insuficiente para inativação do Prion anormal
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permitindo, com isso, o consumo, pelos bovinos, de alimentos com presença de PrP
proveniente tanto de ovinos afetados de Scrapie, como de bovinos portadores assintomáticos
de BSE. Os estudos revelaram que a idade média dos bovinos que apareceram com a doença
foi de cinco anos, com alguns casos esporádicos de animais com dois anos de idade.
Observou-se que o período de incubação foi, em média, de 4 a 5 anos, podendo variar entre 2
a 15 anos.

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Os bovinos afetados de BSE apresentam alterações do comportamento, da locomoção


e da sensibilidade. As mudanças do comportamento são manifestadas na forma de
desconfiança e medo, tanto de entrar em estábulos, como de passar por porteiras ou sobre
canaletas. As alterações locomotoras aparecem aparecem subitamente, afetando,
principalmente os membros posteriores. Os distúrbios da sensibilidade manifestam-se na forma
de hiperestesia a estímulos sonoros ou ao tato e os animais geralmente reagem com coices ao
simples contato com pessoas ou com outros animais.
Além desses sinais clássicos, vários animais afetados apresentam também outros
distúrbios do comportamento caracterizados por loucura ou manifestação intensa de alegria.
Um número menor rangem os dentes, franzem os lábios, lambem freqüentemente o focinho e o
flanco, esfregam a cabeça e as orelhas. Alguns apresentam tremores musculare s, paresia,
andar em círculo, caem e mantém-se decúbito lateral, até a morte, que geralmente sobrevém
entre 7 e 14 dias do início dos sintomas. Na maioria das vezes os animais afetados são
submetidos à eutanásia, devido à mudança extrema de comportamento, a lesões traumáticas
resultantes de quedas repetidas ou ao decúbito prolongado.

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O diagnóstico da BSE é feito principalmente através de histopatologia do Sistema


Nervoso Central (SNC), onde são desenvolvidas alterações exclusivamente microscópicas. O
local para se observar as alterações características é o tronco encefálico, mais propriamente a
medula oblonga. Para isso deve ser colhido, neste local, um fragmento transversal, de no
máximo 8mm de espessura , caudalmente mas adjacente ao obex. Os fragmentos, deverão ser
fixados em formol a 10%, neutro e tamponada por 2 a 4 dias, antes de serem processados.

Considerando a necessidade de estabelecer diagnóstico diferencial entre diversas


encefalopatias, a recomendação oficial é a colheita do SNC de maneira ampla, o suficiente
para atender aos diversos protocolos laboratoriais.

Como metodologia de colheita são necessários os seguintes procedimentos:

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Depois de desarticulada a cabeça do animal, retirar a pele e músculos das regiões
frontal e occipitais. Traçar uma linha imaginária imediatamente superior às apófises
supraorbitárias dos ossos frontais unindo o extremo caudal de um olho ao outro. Seccionar o
osso frontal, os temporais e os occipitais unindo as extremidades de secção anterior ao forame
Mágno. Retirar a calota craniana. Pinçar , abrir e rebater a dura mater , seccionando
completamente a foice do cérebro e o tentório do cerebelo. Inserir os dedos indicador e médio
frontalmente bulbo olfatório, tracionar delicadamente ambas as áreas corticais em direção
caudal, seccionando as raízes dos nervos com a ponta de uma tesoura. Retirar o cérebro o
mais intacto possível.

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Dispor o cérebro posição dorsal sobre uma tábua de corte.

Utilizando-se uma tesoura, realizar dois cortes profundos oblíquos, no extremo rostral
do tronco encefálico até atingir os ventrículos laterais,separando o tronco, dos dois hemisférios
cerebrais.

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Cortar os pedúnculos cerebelares,de ambos os lados até atingir o IV ventrículo e liberar


o cerebelo dos seus pontos de fixação no tronco encefálico.

Depois desses procedimentos, o encéfalo estará dividido em dois hemisférios


telencefálicos, o tronco encefálico incluindo parte da medula cervical e o cerebelo.

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Tomar um dos hemisférios telencefálicos e realizar cortes transversais obtendo os
seguintes fragmentos:
Um fragmento do córtex frontal;
Um fragmento do córtex lateral incluindo o hipocampo
Tomar o cerebelo e cortá-lo para obter:
Um fragmento da região central do cerebelo.

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Localizar na face dorsal e realizar cortes transversais no tronco encefálico obtendo os
seguintes fragmentos:
Um fragmento do mesencéfalo no nível do colículo rostral
Um fragmento do mesencéfalo no nível do colículo caudal
Um fragmento do bulbo, no nível dos pedúnculos cerebelares
Um fragmento do bulbo, na região do obex*
Um fragmento da medula cervical.
* É imprescindível a colheita desse
fragmento,uma vez que, em aproximadamente 100%
de 684 casos de doenças priônicas diagnosticadas pela
histopatologia, foram observadas alterações
espongiformes no núcleo do trato solitário e no trato
espinhal do nervo trigêmio indicando que esse é o corte
de cérebro mais importante para diagnóstico de BSE.
Obs.: Todos os fragmentos acima relacionados (itens a e d) deverão ser obtidos
através de cortes perfeitamente paralelos e naão poderão ter mais que 8mm de espessura.

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Localizar o par de gânglios do nervo trigêmeo** (5º par de nervos cranianos ), no
assoalho da cavidade craniana, de cada lado da glândula hipófise.

Promover a sua retirada, de preferência junto com a hipófise e a rede admirável


carotídea.
**O exame desse par de gânglios é importante
para diagnóstico e doença a vírus, especialmente a
raiva e a doença de Aukeszky ou pseudo-raiva que se
manifesta como ganglioneurite. Por outro lado o exame
da rede admirável carotídia é importante nos casos de
encefalite da febre catarral maligna, uma vez que,
nesse caso são freqüentes os processos inflamatórios
vasculares.
Obs.: Todo o material acima relacionado (itens a ± e) devera ser acondicionado em frasco de
boca larga contendo formol a 10% na quantidade de, pelo menos, 10 vezes maior que o
volume de amostras a serem fixadas. Identificar o frasco escrevendo os dados em fita adesiva.

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Todas as sobras do córtex telencefálico, do cerebelo e do troncoencefálico, juntamente
com um fragmento de medula espinhal, deverão ser acondicionadas em saco plástico com
boca cuidadosamente amarrada. Depositar o pacote em outro saco plástico, tendo o cuidado
de acrescentar uma etiqueta de papel com identificação escrita a lápis. Amarrar novamente e
manter sob refrigeração.

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As amostras destinadas à histopatologia deverão ser remetidos frascos de boca larga
contendo formol a 10%, em temperatura ambiente.

As amostras destinadas ao exame de raiva deverão ser remetidas em caixa térmica


com gelo, em quantidade suficiente para mantê-las refrigeradas até serem processadas no
laboratório.

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IMPORTANTE: Remeter as amostras acompanhadas de relatório conforme ficha


epidemiológica.

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As alterações histopatológicas encontradas no Sistema Nervoso Central de animais com


manifestações clínicas de BSE são análogas às observadas nos casos naturais de Scrapie. As
lesões são características e consideradas patognomônicas, apresentando-se como vacúolos
na substância cinzenta, no neurópilo e no processo neuronais. São distribuídas de forma
bilateral simétrica, ocorrendo com mais intensidade no tronco encefálico. Não são evidenciadas
reações inflamatórias, como também não há incitamento de resposta imune.

Deve-se ter cuidado ao se realizar exames histopatológicos no SNC de animais recém-


infectados, que estejam em período de incubação da doença ou com sintomas incipientes os
quais podem não revelar alterações, dando margem a diagnósticos falsos negativos.

Por esse motivo, tem sido constante a busca de testes laboratoriais de maior precisão.
Atualmente pode-se confirmar presença de PrPSc através de imunodiagnósticos utilizando-se
anticorpo monoclonal, em fragmento de tecido nervoso previamente processados para
histopatologia. Isto é possível porque esta técnica é capaz de separar o   normal do
anormal.

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A Microscopia Eletrônica de material preparado de tecido cerebral homogeneizado,
proveniente de bovinos afetados de BSE, revelou a presença de fibrilas semelhantes às
Fibrilas Associadas ao Scrapie (SAF) encontradas no SNC de ovinos e caprinos com Scrapie e
de humanos com CDJ.

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Inicialmente as provas imunodiagnóticas para detecção de PrP em tecido nervoso,
proveniente de animais afetados de doença priônicas e incluído em parafina, apresentavam
limitações. Isto porque a fixação pela formalina, produz ligações cruzadas entre a substância
química e as proteínas teciduais , entre as quais estão os antígenos. Tais ligações modificam
as estruturas protéicas terciárias e quaternárias, com preservação das primárias e secundárias.
A preservação destas últimas estruturas garante a capacidade antigênica, mas o
reconhecimento dos antígenos pelos anticorpos é impedido, devido às modificações das
estruturas protéicas terciárias e quaternárias. Com a descoberta de que, submetendo-se os
tecidos fixados à digestão enzimática pela proteinase K, ao tratamento com ácido fórmico ou
com diferentes fontes de calor úmido, a exemplo da autoclave, tal problema foi contornado,
uma vez que o epítopo, isto é, o determinante antigênico, poderia ser desmascarado e exposto
às reações, aumentando imunorreatividade. Com isso a imunohistoquímica tornou-se uma
importante ferramenta na elucidação de diagnósticos histopatológicos inconclusivos.

Atualmente existem provas imunohistoquímicas disponíveis, mas que são incapazes de


distinguir o Prion normal do anormal. Para isso, os tecidos a serem avaliados, devem ser
submetidos a tratamentos que promovam destruição seletiva entre as duas proteínas. Um
exemplo é seu tratamento com temperatura de 122ºC por 30 minutos em autoclave úmida. Tal
procedimento destrói o PrPc, mas não afeta o PrPSc e a positividade dos tecidos frente aos
anticorpos ligados a substâncias cromogênicas que, por sua vez, se ligam ao Prion permite o
diagnóstico positivo de Scrapie e BSE.

Por outro lado , a habilidade deste teste em detectar baixas concentrações de PrPSc, o
torna eficiente na validação de exames histopatológicos com lesões incipientes e abre
perspectiva de diagnóstico precoce, antes mesmo que os animais afetados devolvam sinais
clínicos. Além disso, a imunohistoquímica pode ser aplicada em tecidos autolizados ou com
artefatos de processamento, dando ainda resultados satisfatórios na avaliação da presença de
PrPSc.

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 Os Materiais que representam risco da Encefalopatia Espongiforme Bovina, são:
Cérebro, Olhos; Medula Espinhal e Dura Mater; Amidalas, parte distal do ileo.

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Todos os funcionários são treinados para realizar as operações de remoção e


segregação do Material De Risco Específico (MRE). Todo Material de Risco Específico (MRE)
dentro da indústria é identificado para que esse material não entre em contato com outros
materiais contaminando assim o produto.
As bandejas de acondicionamento, bem como sacos plásticos que recebem o Material
de Risco Especifico (MRE) são identificados com etiqueta ³Material de Risco Específico´.

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Para remoção do Material de Risco Específico (MRE), são utilizadas facas de cabo
branco/azul com uma faixa vermelha, garantindo assim que estes materiais serão utilizados
somente neste procedimento, para que não ocorra contaminação cruzada.

Todos os instrumentos, recipientes e equipamentos que entram em contato com o


Material de Risco Específico (MRE) é devidamente higienizado. As facas de cabo branco/azul
com faixa vermelha utilizadas somente para remoção do Material de Risco Específico (MRE)
são submetidas à lavagem e esterilização por 20 segundos no mínimo a temperatura mínima
de 82,5ºC a cada operação.

Os funcionários que tem contato e/ou manipulam o Material de Risco Específico (MRE)
tomam cuidados de higiene pessoal. Esses funcionários são proibidos de manipular outros
materiais.

Todos os instrumentos, recipientes e equipamentos utilizados em contato com o


Material De Risco Específico (MRE) são guardados em armário específico e identificados com
etiqueta ³Material de Risco de BSE´ na sala de guarda de materiais.

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Todo Material de Risco Específico (MRE) é recebido em uma bandeja verde identificada
com ´MRE´ localizada ao lado de cada operador que manipula esses materiais, facilitando
assim a segregação do mesmo.

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O Material de Risco Específico (MRE) é recolhido cuidadosamente em saco plástico
transparente identificado com a etiqueta ³Material de Risco de BSE´ durantes as atividades do
setor.
Todo Material de Risco Específico (MRE) é destinado ao local reservado à cremação.


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As amídalas são removidas pelo SIF, e, do mesmo modo, são identificadas e segregadas até
a cremação de todo material.As amídalas são retiradas por um colaborador com auxilio de um
gancho e faca sendo depositada em bandejas verdes devidamente identificadas para devido
fins. No momento que antecipa cada procedimento de retirada das amídalas as facas, aço e o
gancho são lavados e esterilizados. Este material é enviado para pesagem e incineração.

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O cérebro e os olhos são retirados cuidadosamente pelos funcionários, que são treinados
pelo Chefe do Departamento a realizar a operação. Na remoção do cérebro, também é retirado
o Gânglio Trigêmeo, que faz parte do Sistema Nervoso, sendo assim um Material de Risco
Específico (MRE).

Os procedimentos são monitorados diariamente pelo Inspetor de Controle de Qualidade.

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O funcionário responsável pela remoção da medula espinhal e dura mater é treinado pelo
Chefe do departamento para realização da operação.

A remoção da medula espinhal é realizada de forma cuidadosa fazendo com que todo o
Material de risco Específico (MRE) seja removido, conforme o Procedimento Operacional
Retirar Medula Espinhal e Dura Mater.
A operação é monitorada pelo Inspetor de Controle de Qualidade freqüentemente.
No caso em que se faz o aproveitamento da medula espinhal, faz -se a retirada e envio
para o setor de miúdos através de chutes para processamento e estocagem.

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A remoção da porção distal do íleo é realizada por um colaborador devidamente
treinado na área suja da triparia. O colaborados tem como base o gabarito de 70cm
para sua orienta ção durante a retirada da mesma. Depois de retirado o conteúdo fecal
a porção é depositada em badejas devidamente identificadas para tal fim. Este
material é enviado para pesagem e incineração.
Nos casos em que se faz o uso deste material para envoltórios naturais este material é
depositadas em caixas brancas e destinadas para o processamento. Ao termino da
abate todos os resíduos de MRE retidas nos ralos são recolhidos e destinados a
incineração.
Os procedimentos são monitorados pelo chefe de matança que promove ações
corretivas imediatas quando necessário. Todo material que por ventura cair no chão é
imediatamente recolhido e depositado em bandejas devidamente identificados para tal
fim, sendo enviadas a pesagem e incineração.

PESAGEM DO MATERIAL

O Peso do material recolhido é registrado em planilha diaria mente de forma ordenada


para elaboração do Controle Mensal de MRE incinerada.
(planilha em anexo).

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