Extração de DNA genómico (método Cenis modificado)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC312363/?page=1)

1. Macerar as células a extrair

2. Transferir as células para um tubo cónico de 1,5 ml

3. Pipetar 500 μl de Tampão Cenis para o tubo contendo as células maceradas.

4. Agitar no “vortex” e incubar durante 3 minutos num banho de água fervente, em

seguida colocar em gelo durante 10 minutos
5. Adicionar 150 μl de acetato de sódio 3M (pH5.2) e misturar (“up-side-down”).
6. Incubar durante pelo menos 20 min. em banho de gelo.

7. Centrifugar durante 10 min. a 4ºC / 12 000 rpm.

8. Transferir o sobrenadante para um tubo novo.

9. Adicionar 1 volume isopropanol gelado (encher o tubo) e agitar cuidadosamente.

10. Incubar durante for 30 minutos em gelo.

11. Centrifugar durante 10 min. at 12 000 rpm at 4 ºC.

12. Desprezar o sobrenadante

13. Lavar o “pellet” com etanol 70% (gelado) (centrifugar durante 10 minutos,
descartar o sobrenandante).

14. Deixar o pellet secar ao ar e ressuspender em ±50 μl de tampão TE-

Soluções
Cenis buffer
20 ml 1M Tris pH8
8,2 ml NaCl 3M Acetato de sódio 3M pH 5,2
5 ml 0.5M EDTA pH8 Pesar 40.8g acetato sódio trihidratado
1g SDS (CH3COONa 3H2O)
Completar o volume até 100ml com H2O ou
24.6g acetato sódio anidro (CH3COONa)
TE Buffer Dissolver em 80 ml H2O, acertar o pH
Tris HCl pH 8 1 M 1 ml com ácido acético glacial, completar o
EDTA (0.5 M, pH 8.0) 200 μL volume para 100 ml.
H2O ajustar para 100 ml

Todas as soluções devem ser em seguida autoclavadas