CLÁUDIO FONTES SOUZA

EFEITO DE ANTIDEPRESSIVOS INIBIDORES DA RECAPTAÇÃO NEURONAL DE MONOAMINAS SOBRE A PLASTICIDADE ADRENÉRGICA NO DUCTO DEFERENTE DE RATO

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutor em Ciências

SÃO PAULO - SP 2007

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO - UNIFESP

CLÁUDIO FONTES SOUZA

EFEITO DE ANTIDEPRESSIVOS INIBIDORES DA RECAPTAÇÃO NEURONAL DE MONOAMINAS SOBRE A PLASTICIDADE ADRENÉRGICA NO DUCTO DEFERENTE DE RATO

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor. Orientador: Prof. Dr. Roberto Frussa Filho Co-orientadora: Profa. Dra. Lúcia Garcez do Carmo Área de concentração: Setor de Neurotransmissores

SÃO PAULO - SP 2007

CLÁUDIO FONTES SOUZA

EFEITO DE ANTIDEPRESSIVOS INIBIDORES DA RECAPTAÇÃO NEURONAL DE MONOAMINAS SOBRE A PLASTICIDADE ADRENÉRGICA NO DUCTO DEFERENTE DE RATO

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor. Orientador: Prof. Dr. Roberto Frussa Filho Co-orientadora: Profa. Dra. Lúcia Garcez do Carmo Área de concentração: Setor de Neurotransmissores

SÃO PAULO - SP 2007

Ficha catalográfica
SOUZA, Cláudio Fontes Efeito de antidepressivos inibidores da recaptação neuronal de monoaminas sobre a plasticidade adrenérgica no ducto deferente de rato. — São Paulo, 2007. 156p. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo / Escola Paulista de Medicina. 1. reinervação 2. desnervação 3. ducto deferente de rato 4. antidepressivos 5. neurotransmissão adrenérgica 6. sistema nervoso periférico

Dedicado a:

Este trabalho é dedicado aos meus pais Anselmo Fontes Souza e Maria Geolinda Neta Souza Ao meu irmão e amigo Márcio Fontes Souza

Também dedico este trabalho à:

Fábia Guerra do Val (in memoriam)

AGRADECIMENTOS

“Nenhum caminho é longo demais quando um amigo nos acompanha.” Autor desconhecido

Ao orientador Professor Livre Docente Dr. Roberto Frussa Filho, pela oportunidade e orientação para a realização desta pesquisa e pela confiança em mim depositada. Meus sinceros agradecimentos à orientadora e amiga, profa. Dra. Lúcia Garcez do Carmo, pela paciência, dedicação, estímulo e competente orientação não somente durante esta pesquisa, mas também ao longo da minha pós-graduação. E por ter possibilitado o desenvolvimento desta Tese e exercer uma orientação que transcendeu o plano científico. Aos professores, do Departamento de Farmacologia, Dr. Aron Jurkiewicz, Dra. Neide Hyppolito Jurkiewicz, Dra. Soraya S. Smaili, Dra. Simone Sette Lafayette, Dr. Afonso Caricati Neto, Dra. Catarina Segreti Porto, Dra. Rosely Godinho, Dra. Maria Teresa L. Landman, Dra. Maria Cristina W. Avellar, Dra. Maria de Fátima Lázari, Dr. Antonio José Lapa, Dra. Caden Souccar pelo apoio e pelo estimulante convívio durante o curso. E em especial para às professoras e amigas Dra. Rosana Ribeiro e Dra. Vanessa Abílio Costec, pelo companheirismo e apoio.

Ao professor Dr. Isaltino Marcelo Conceição e à Thalma Ariani Freitas, pelo relevante auxílio e contribuição nas dosagens de catecolaminas realizadas no Instituto Butantan. Agradeço o apoio, o incentivo e a oportunidade de crescimento profissional que são proporcionados aos profissionais que integram o corpo docente da UNIFESP. À amiga Teotila Reuter, pelo apoio técnico e auxílio nos procedimentos cirúrgicos e pelo incentivo nas horas difíceis. Ao amigo que compõe o corpo técnico do Setor dos Neurotransmissores, Cleomar Ferreira Souza Ao corpo de funcionários responsáveis pelos biotérios da Farmacologia: “Toninho”, “Carlão”, Custódio, Jorge e João. À secretaria da Pós-Graduação, Luciana Santos de Oliveira pelas facilidades proporcionadas. Aos colegas de pós-graduandos do Depto. De Farmacologia pelo companheirismo, pelas reflexões, críticas, sugestões e também pelos momentos de descontração por eles proporcionados. São tantos que eu não gostaria de cometer a indelicadeza de omitir alguém, dessa forma não citarei nenhum nome, mas saibam que tenho um carinho e respeito por todos. Vocês fizeram e fazem parte da minha vida.

Ao CNPq, pelo apoio financeiro À todos que colaboraram direta ou indiretamente para a minha formação e/ou na realização deste trabalho.

"Transportai um punhado de terra todos os dias e fareis uma montanha." Confúcio

RESUMO
SOUZA C.F. Efeito de antidepressivos inibidores da recaptação neuronal de monoaminas sobre a plasticidade adrenérgica no ducto deferente de rato. 2007. 156 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Departamento de Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2007. Introdução: O uso prolongado de antidepressivos em indivíduos com depressão leva ao incremento de neurotrofinas no SNC, com aumento da neurogênese, sinaptogênese, aumento da arborização nervosa e o restabelecimento da rede neural. Algumas dessas neurotrofinas são encontradas no sistema nervoso periférico, inclusive trato urogenital, tendo sido demonstrado aumento da inervação simpática do ducto deferente de rato (DD) após administração de neurotrofinas. Em vista desse fato nosso objetivo foi verificar se o tratamento com os antidepressivos, fluoxetina, desipramina e imipramina seria capaz de acelerar a reinervação que normalmente ocorre após desnervação cirúrgica do ducto deferente. Métodos: Ratos Wistar foram tratados cronicamente com fluoxetina, desipramina ou imipramina (10mg/Kg/dia, via intraperitoneal), ou com veículo (salina). No 11º de tratamento os animais foram anestesiados para a realização da cirurgia de desnervação ou falsa-operação (controle) de seus ductos deferentes. O tratamento foi continuado até a eutanásia dos animais (7a 28 dias após a cirurgia). Os ductos deferentes foram retirados e processados para a quantificação de catecolamina endógena por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) ou preparados para registro de contração muscular isométrica in vitro. Nos estudos de contração muscular a viabilidade neuronal foi avaliada pela resposta contrátil à estimulação elétrica (EE) em parâmetro que promovem unicamente neuroliberação, e por tiramina, droga que acarreta liberação de catecolaminas neuronais. A reatividade do componente muscular pós-sináptico foi avaliada por meio de curvas concentração-resposta do agonista α1-adrenérgico, fenilefrina e pela contração induzida por concentração única de ATP (10-2M) e de BaCl2 (10-2M). A reatividade de α2-adrenoceptores pré-sinápticos foi avaliada por curvas inibitórias de clonidina sobre a contração causada por EE. Resultados: Após 7 dias de desnervação a contração do tecido em resposta ao EE e à tiramina é mínima, havendo gradual recuperação da resposta aos 21 e 28 dias. O tratamento crônico com antidepressivos alterou esse padrão de resposta neurogênica. Em DD obtidos de animais tratados com fluoxetina e desnervados por 7 ou 21 dias, a resposta à tiramina foi cerca de 2 vezes maior do que a obtida em DD desnervados tratados com veículo. Em DD desnervados por 7 dias, provenientes de animais tratados com desipramina, foi observada uma contração por EE cerca 2.2 vezes mais acentuada do que aquela obtida no grupo controle desnervado tratado com veículo. Nos grupos falso-operados o tratamento com os antidepressivos não alterou o padrão de contração induzida por EE ou tiramina. Os efeitos observados pelo tratamento crônico com os antidepressivos não foram decorrentes de alterações na reatividade de receptores pós-sinápticos uma vez que a resposta contrátil ao agonista α1-adrenérgico, fenilefrina, ao ATP e ao BaCl2, não foi diferente quando comparada àquela do grupo veículo, tanto nos animais falso-operados como nos desnervados. O tratamento com fluoxetina não alterou a reatividade de α2adrenoceptores pré-sinápticos, uma vez que não foram observadas diferenças na resposta à clonidina. O tratamento com imipramina não modificou a resposta do DD nem nos grupos falso-operados nem desnervados. Estudos de dosagem de catecolaminas endógenas foram realizados em animais tratados com fluoxetina. Nesses animais ocorreu um aumento em cerca de 84%, 43% e 51% dos níveis de noradrenalina (NA), em DD desnervados por 7, 21, e 28 dias respectivamente. Conclusão: O tratamento crônico com fluoxetina aumentou os níveis de NA, assim como a resposta de contração para a tiramina nos DD desnervados, da mesma forma o tratamento crônico com desipramina aumentou a resposta de contração do DD desnervado induzido por EE. Esse efeito não parece ser decorrente de alterações nos adrenoceptores pré ou pós-sinápticos, indicando que esses antidepressivos estariam facilitando a regeneração neuronal no DDR. Palavras chave: Reinervação, desnervação, ducto deferente de rato, antidepressivos, neurotransmissão adrenérgica.

ABSTRACT
SOUZA C.F. Effect of neuronal monoamine uptake inhibitor antidepressants in the adrenergic plasticity of the rat vas deferens. 2007. 161 f. Doctor Thesis (Pharmacology) – Departamento de Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2007. Background: Chronic administration of antidepressants in patients with depression leads to an increase of neurotrophins in the SNC, with an increase in neurogenesis, sinaptogenesis, neuronal sprouting, and reestablishment of the neural network. Some of these neurotrophins are found in the peripheral nervous system and it was demonstrated that neurotrophin administration significantly improved the sympathetic peripheral innervation of tissues from the urogenital tract, as the rat vas deferens (VD). Our goal was to verify if the treatment with the antidepressants, fluoxetine, desipramine and imipramine could be able to accelerate the reinnervation that normally occurs after surgical denervation of the VD. Methods: Wistar Rats were chronically treated with fluoxetine, desipramine or imipramine (10 mg/kg/day, IP) or vehicle (saline). At the 11th day after the beginning of the treatment the rats were anesthetized and the VD were surgically denervated or sham-operated (control). The treatment was continued until the euthanasia of the animals (7 to 28 days after the surgery). The VD was took out and processed for catecholamine quantification in HPLC (High Performance Liquid Chromatography) or prepared for in vitro muscular contraction registration. In studies of smooth muscle contraction the neuronal viability was assessed by the contraction induced by electric stimulation (ES) or by the neuronal catecholamine release caused by tyramine. The postsynaptic reactivity was evaluated by means of concentration response curves for the α1-adrenergic agonist, fenilefrine and by contraction induced by single concentration of ATP (10-4 M) or BaCl2 (10-2 M). The reactivity of the pre-synaptic α2-adrenoceptor was assessed by inhibitory concentrationresponses curves of the agonist clonidine, on VD contraction induced by ES. Results: After 7 days of denervation the contractions induced by ES or tyramine were minimum. A gradual recovery of the response was observed after 21 and 28 days. The chronic treatment with antidepressants modified this profile of neurogenic response. In VD obtained from fluoxetine treated animals, it was observed an increased of about 2 times of the contraction induced by tyramine in the period of 7 and 21 days after denervation, whereas in VD obtained from desipramine treated animals, after 7 days of denervation, it was observed an increase around 2.2 times of the contraction induced by ES. The contractile responses induced by fenilefrine, ATP or BaCl2 , or the reactivity of pre-synaptic α2-adrenoceptors were not modified by the chronic treatment with the antidepressants. The treatment with imipramine did not modify the VD reactivity. In catecholamine dosage by liquid chromatography, in VD obtained from fluoxetine treated animals, it was observed an increase of the levels of noradrenaline at about 84%, 43% and 51% in denervated VD for 7, 21 and 28 days respectively. Conclusion: The chronic treatment with the antidepressants fluoxetine increased the noradrenaline levels and the contraction induced by tyramine in denervated VD. The chronic treatment with desipramine increased the contraction of denervated VD induced by ES. This effect does not seem to be caused by alterations in the α2-adrenoceptors or adrenergic and purinergic post-synaptic receptors, indicating that these antidepressants can improve the neuronal regeneration of the rat VD. Key words: denervation, rat vas deferens, antidepressant, reinnervation, adrenergic neurotransmission.

SUMÁRIO INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1 NEUROTRANSMISSÃO ........................................................................................... 2 PLASTICIDADE NEURONAL ................................................................................. 3 FATORES NEUROTRÓFICOS ................................................................................. 4 LESÃO E REGENERAÇÃO NEURONAL ............................................................... 5 DEPRESSÃO E ANTIDEPRESSIVOS ...................................................................... Fisiologia da depressão .............................................................................................. Drogas e terapias antidepressivas .............................................................................. 6 SISTEMA NERVOSO PERIFÉRICO – TRATO UROGENITAL ............................ 7 DUCTO DEFERENTE ............................................................................................... Neurotransmissão e receptores presentes na musculatura lisa .................................. Desnervação e reinervação do ducto deferente .......................................................... OBJETIVOS .................................................................................................................... OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... MATERIAS E MÉTODOS ............................................................................................ 1 NORMAS E LOCAIS DE EXPERIMENTAÇÃO ..................................................... 2 ANIMAIS .................................................................................................................... 3 TRATAMENTO DOS ANIMAIS .............................................................................. 3.1 Tratamento crônico .............................................................................................. 3.1 Tratamento agudo ................................................................................................ 4 DESNERVAÇÃO CIRURGICA ................................................................................ 5 GRUPOS EXPERIMENTAIS ................................................................................... 5.1 Caracterização do padrão de desnervação e reinervação .................................... 5.2 Animais tratados com antidepressivos ................................................................. 6 EXPERIMENTOS DE CONTRAÇÃO MUSCULAR IN VITRO ............................ 6.1 Isolamento dos ductos deferentes ....................................................................... 6.2 Solução nutritiva .................................................................................................. 6.3 Aparelho e montagem da preparação .................................................................. 6.4 Protocolos experimentais ..................................................................................... 6.4.1 Estudo da capacidade de liberação de neurotransmissores ............................ Contração isométrica por concentração única de tiramina ................................. Contração isométrica por estimulação elétrica ................................................... 6.4.2 Estudo da reatividade de receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos ............ Curvas concentração efeito inibitórias de clonidina ........................................... 6.4.3 Estudo da reatividade pós-sináptica ............................................................... Curvas concentração-efeito de fenilefrina ......................................................... Concentração única de ATP ............................................................................... 6.4.4 Estudo do efeito dos antidepressivos in vitro ................................................. 6.5 Parâmetros Farmacológicos ................................................................................. Efeito máximo (Emáx) .............................................................................................. Afinidade aparente do agonista (pD2) ..................................................................... Deslocamento (D) .................................................................................................... 7 QUANTIFICAÇÃO DOS NÍVEIS DE NORADRENALINA PRESENTES NO TECIDO POR MEIO DE CROMATROGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE (HPLC) ............................................................................................... 7.1 Processamento do ducto deferente ...................................................................... 7.2 Separação e quantificação das aminas ................................................................ 15 16 17 18 21 23 24 31 34 36 38 40 46 47 47 48 49 49 49 49 50 50 51 51 52 53 53 53 53 54 54 54 54 55 55 56 56 57 57 57 57 58 58 58 58 59

8 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................... 9 DROGAS E REAGENTES ......................................................................................... RESULTADOS ............................................................................................................... 1 DESNERVAÇÃO CIRÚRGICA ................................................................................ 1.1 Análise da neurotransmissão ................................................................................ Resposta à tiramina ................................................................................................. Resposta à estimulação elétrica ............................................................................... 2 ESTUDO COM ANTIDEPRESSIVOS ................................................................ 2.1 Efeito dos antidepressivos sobre o mecanismo de recaptação neuronal no ducto deferente in vitro ............................................................................................................... 3 FLUOXETINA ......................................................................................................... 3.1 Tratamento crônico com fluoxetina ..................................................................... 3.1.1 Estudos funcionais .......................................................................................... Análise da neurotransmissão ............................................................................. Resposta à tiramina ........................................................................................ Resposta à estimulação elétrica ..................................................................... Análise da reatividade de receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos ................. Análise da reatividade pós-sináptica .................................................................. Resposta à fenilefrina ..................................................................................... Resposta ao ATP ............................................................................................ Resposta ao BaCl2 .......................................................................................... 3.1.2 Estudos bioquímicos – quantificação de aminas bioativas ............................ Quantificação de noradrenalina .......................................................................... Quantificação de serotonina ............................................................................... 3.2 Tratamento agudo com fluoxetina ....................................................................... Análise da neurotransmissão .................................................................................. Resposta à tiramina ................................................................................................. 4 DESIPRAMINA .......................................................................................................... 4.1 Efeito do tratamento crônico com desipramina sobre o ducto deferente ............. 4.1.1 Estudos funcionais .......................................................................................... Análise da neurotransmissão ............................................................................. Resposta à tiramina ........................................................................................ Resposta à estimulação elétrica ..................................................................... Análise da reatividade dos receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos .............. Análise da reatividade pós-sináptica ................................................................. Resposta à fenilefrina ..................................................................................... Resposta ao ATP ............................................................................................ Resposta ao BaCl2 .......................................................................................... 5 IMIPRAMINA ............................................................................................................ 5.1 Efeito do tratamento crônico com desipramina sobre o ducto deferente ............. 5.1.1 Estudos funcionais .......................................................................................... Análise da neurotransmissão ............................................................................. Resposta à tiramina ........................................................................................ Resposta à estimulação elétrica ..................................................................... Análise da reatividade dos receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos .............. Análise da reatividade pós-sináptica .................................................................. Resposta à fenilefrina .................................................................................... Resposta ao ATP ............................................................................................ Resposta ao BaCl2 ..........................................................................................

60 60 62 63 63 63 65 68 68 70 70 70 70 70 72 76 78 78 81 81 84 84 86 88 88 88 90 90 90 90 90 92 96 97 97 100 100 103 103 103 103 103 105 109 110 110 113 113

DISCUSSÃO .................................................................................................................... Caracterização da desnervação cirúrgica no ducto deferente de rato ............................. Tratamento crônico com antidepressivos ....................................................................... Fatores que poderiam estar interferindo nos efeitos dos antidepressivos .................. Possíveis mecanismos envolvidos nos efeitos facilitatórios da neurotransmissão .... CONCLUSÃO ................................................................................................................. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................................

116 117 119 120 128 133 136

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-HT - serotonina AMPc - 3,5’-monofosfato de adenosina cíclico ATP - 5’-trifosfato de adenosina BDNF- fator neurotrófico derivado do cérebro Ca2+ - íon cálcio CaCMK - cinase dependentes de Ca2+ calmodulina CAM - molécula de adesão celular CAM-cinase - proteína-cinase dependente de Ca2+/calmodulina CaMKII - proteína cinase dependente de Ca2+/calmodulina do tipo II CNTF - fator neurotrófico ciliar CRE - elemento responsivo ao AMPc CREB - proteína de ligação ao elemento responsivo ao AMPc (CRE) DDR - ducto deferente de rato ERK - cinases reguladas por sinal extracelular GDNF - fator neurotrófico derivado da glia IL - interleucina iMAO - inibidor da monoaminaoxidase IP3 - inositol-1,4,5-trifosfato ISRN - inibidores da recaptação de noradrenalina ISRS - inibidores da recaptação de serotonina MAO - monoaminoxidase MAPK - proteina cinase ativada por mitógeno NA - noradrenalina Na+ - íon sódio NGF - fator de crescimento neuronal NPY - neuropeptídeo Y NT- neurotrofina p75NT- receptor de baixa afinidade para neurotrofinas PKA - proteína cinase dependente de cAMP PKC - proteína cinase dependente de Ca2+ e fosfolipídio PLC - fosfolipase C TNF - fator de necrose tumoral Trk - receptor cinase relacionado à tropomiosina

INTRODUÇÃO

Introdução 16

1. NEUROTRANSMISSÃO

A célula nervosa (neurônio) pode ser considerada a unidade básica do sistema nervoso. Sua tarefa fundamental é receber, conduzir e transmitir sinais para outros neurônios ou outros tipos celulares. O neurônio é dividido morfologicamente em três regiões: corpo celular (ou soma), local onde se encontram as principais organelas, como núcleo, sendo a região responsável por grande parte do metabolismo da célula nervosa; dendritos, que são prolongamentos que saem do corpo celular e cuja principal função é receber sinais que chegam de outras células nervosas; o axônio, que se estende para além do corpo celular, sendo o principal elemento da unidade condutora para a transmissão de sinais, geralmente elétricos na forma de potenciais de ação, até os terminais nervosos. A partir desses terminais nervosos, o sinal é transmitido à estrutura seguinte que pode ser outro neurônio ou outro tipo celular qualquer. O ponto de comunicação entre esses terminais nervosos e células efetoras é conhecido como sinapse. Quando um potencial de ação alcança o terminal do neurônio, é desencadeado o processo de exocitose, que culmina na liberação do transmissor químico, conhecido como neurotransmissor, o qual é sintetizado no próprio neurônio. Uma vez liberado, o neurotransmissor é difundido pela fenda sináptica alcançando e estimulando receptores de membrana em células pós-sinápticas ou auto-receptores situados no próprio terminal nervoso. Esse processo que ocorre na região sináptica é de extrema importância e caracteriza o processo de neurotransmissão (KANDEL et al., 2003). Neurotransmissores são, portanto, substâncias que têm como função básica a indução de respostas excitatórias ou inibitórias em vários tipos de células, tanto no sistema nervoso central como no periférico. Muitos dos neurotransmissores são aminas primárias derivadas de aminoácidos, conhecidas como aminas biogênicas, representadas pela histamina, serotonina, adrenalina, noradrenalina e dopamina, sendo as três últimas catecolaminas. Além destes, temos também outros neurotransmissores entre os quais podemos citar a acetilcolina, o glutamato, o GABA, entre outros (MOORE, 1993). Todos esses fatores em conjunto, quais sejam, a quantidade de neurotransmissor ou de receptores pré ou pós-sinápticos, o padrão de condução do potencial de ação, ou o número de sinapses numa determinada região vão determinar o grau de estímulo neuronal que um determinado tecido recebe. Entretanto, os mecanismos relacionados à neurotransmissão não são permanentes e imutáveis, e podem sofrer mudanças plásticas bastante importantes (FRUSSA–FILHO & PALERMO-NETO, 1988).

Introdução 17

2. PLASTICIDADE NEURONAL

A plasticidade é um fenômeno de adaptação biológica que visa promover modificações funcionais ou anatômicas compensatórias de uma célula ou de um tecido, frente a diferentes tipos de perturbações, quer de origem fisiológica, farmacológica, patológica ou mecânica (COWEN & GAVAZZI, 1998). O sistema nervoso é bastante versátil, sendo que a plasticidade neuronal pode ocorrer tanto no sistema nervoso central como no periférico. O processo plástico é um evento fundamental pelo qual o tecido nervoso, a partir das informações obtidas, faz adaptações apropriadas, alterando a intensidade do estímulo, para adequar seu funcionamento às novas necessidades impostas (FRUSSA-FILHO & PALERMO-NETO, 1988). Os processos celulares envolvidos nesses mecanismos plásticos são bastante complexos. As mudanças plásticas neuronais podem ser decorrentes de alterações funcionais na região de sinapses já existentes, envolvendo mudanças na eficiência da neurotransmissão com o fortalecimento ou enfraquecimento da transmissão sináptica. As sinapses geralmente apresentam uma capacidade notável para mudanças funcionais, sendo que, podem ocorrer alterações nos níveis de neurotransmissores liberados, na sensibilidade ou no número de receptores pré ou pós-sinápticos, alterações na cascata dos segundos mensageiros envolvidos no processo ou mudanças no perfil de expressão gênica, entre outras (BYLUND & MARTINEZ, 1980; GIRALT & GARCIA-SEVILLA, 1989). As modificações plásticas podem também ser iniciadas por mudanças anatômicas e morfológicas da estrutura e da arborização neuronal. Essas alterações anatômicas estariam relacionadas ao aumento ou à diminuição da densidade de dendritos e de ramificações axonais, levando à formação e crescimento de novas conexões ou à remoção de conexões neurais pré-existentes. Mudanças anatômicas de estruturas neurais geralmente ocorrem em um espaço de tempo mais longo do que as alterações funcionais moleculares em sinapses já existentes (SPATZ, 1996; KANDEL et al., 2003; CASTRÉN, 2004). Plasticidade envolve, portanto, sensibilização, dessensibilização, habituação ou aprendizagem, propriedades que são fundamentais ao sistema nervoso e que permitem a adaptação ante a uma variedade de circunstâncias e ambientes. O sistema nervoso apresenta uma intensa plasticidade neuronal durante seu desenvolvimento, e conserva sua plasticidade ao longo da vida, o que é pré-requisito não só para as adaptações fisiológicas, mas também,

Introdução 18

em certas circunstâncias, para recuperação da função após uma lesão ou processo patológico.

3. FATORES NEUROTRÓFICOS

Entre os vários mecanismos que controlam a plasticidade neuronal, temos aqueles relacionados aos fatores de crescimento neuronal, também conhecidos como fatores neurotróficos. Fatores neurotróficos são, portanto, substâncias que regulam o desenvolvimento e a viabilidade neuronal, a formação ou regressão da arborização dendrítica ou axonal e o padrão de atividade sináptica tanto no sistema nervoso central como periférico. Inicialmente, os fatores neurotróficos foram considerados substâncias que regulavam o crescimento e a diferenciação neuronal durante o desenvolvimento embrionário, mas hoje se sabe que esses fatores têm também uma função vital na plasticidade de neurônios adultos (REICHARDT, 2006). A existência desses fatores é conhecida há mais de 70 anos. Entre 1930 e 1940, pesquisadores como Viktor Hamburger, Rita Levi-Montalcini e Giusepe Levi, a partir de estudos em embriões de galinha, mostraram que manipulações em um tecido alvo afetavam os seus padrões de inervação (ver LUBA, 2001). Assim, foi mostrado que a retirada de um órgão alvo causava diminuição da inervação e o transplante de um órgão alvo adicional causava aumento da inervação ao tecido. Os pesquisadores concluíram que haveria alguma substância liberada pelo tecido alvo, que favoreceria a sobrevivência neuronal. Dessa forma, surgiu a hipótese neurotrófica, a qual postulava que durante o processo de desenvolvimento, a manutenção e a sobrevivência de um neurônio dependiam em grande parte de fatores liberados por células que se situavam ao seu redor, ou seja, das células alvo a serem inervadas. Portanto, esses fatores promoveriam um balanço entre o tamanho do órgão alvo e o número de neurônios que o inervaria. Posteriormente, Rita Levi-Montalcini e Stanley Cohen, conseguiram isolar uma proteína essencial à sobrevivência dos neurônios, tanto durante o desenvolvimento embrionário quanto no indivíduo adulto e que recebeu o nome de fator de crescimento neuronal (nerve growth factor - NGF) (HUANG & REICHARDT, 2001; LUBA, 2001). Os estudos avançaram e foi visto que o NGF não era o único fator trófico existente, tendo sido descoberto logo em seguida, o BDNF (“brain-derived neurotrophic factor”) cuja purificação e caracterização revelaram uma substância com alto grau de semelhança ao NGF (TATAGIBA et al., 1997; BIBEL & BARDE, 2000; NICHOLLS et al., 2001). Enquanto o

Introdução 19

NGF tinha uma importante ação no sistema nervoso periférico, o BDNF exercia suas principais funções no sistema nervoso central (BIBEL & BARDE, 2000). Hoje são conhecidos inúmeros fatores tróficos. Um grupo muito importante é composto pelas neurotrofinas, que são proteínas descendentes de um gene ancestral comum e que possuem estrutura bastante semelhante. As principais neurotrofinas são o NGF, o BDNF, as neurotrofinas NT3, NT4/5, NT6 e NT7. Com exceção das duas últimas que só são encontradas em peixes, todas as outras são encontradas em mamíferos. As neurotrofinas são secretadas constitutiva ou transientemente e geralmente de modo dependente da atividade neuronal (HUANG & REICHARDT, 2001; BOYD & GORDON, 2002; CARLSON et al., 2006). Subseqüentemente, estudos demonstraram haver outras fontes de fatores neurotróficos além de células alvo do neurônio. Após a lesão de nervos periféricos, macrófagos infiltrados no nervo em resposta a inflamação liberam citocinas que induzem a síntese de NGF em células de Schwann e em fibroblastos (KORSCHING, 1993). Também mastócitos podem sintetizar e liberar neurotrofinas. E hoje já está bem demonstrado que a própria célula neuronal também produz neurotrofinas (HUANG & REICHARDT, 2001). O mecanismo de ação das neurotrofinas está relacionado à ativação de duas classes distintas de receptores transmembranais: receptores Trk (tropomyosin-related kinase) que são receptores da família tirosina-cinases, e o receptor p75NT, o qual pertence à família de receptores para fatores de necrose tumoral (HUANG & REICHARDT, 2001). A grande maioria das células expressa tanto receptores Trk como os p75NT, sendo que a resposta final depende da presença ou não dos dois tipos de receptor. Quando estimulados em conjunto, as respostas favorecem a sobrevivência e a manutenção neuronal. Entretanto, paradoxalmente a ativação do receptor p75NT em células com deficiência ou ausência dos receptores Trk, desencadeia indução de morte celular por apoptose (HUANG & REICHARDT, 2003). Existem três tipos de receptores Tkrs: TrkA, TrkB e TrkC. As neurotrofinas ligam-se com diferentes afinidades a esses receptores, sendo que o NGF tem uma maior afinidade pelo receptor TrkA, o BDNF e a NT4/5 pelo TrkB e a NT3, pelo receptor TrkC. A localização e distribuição desses receptores são variadas. No sistema nervoso central os receptores mais encontrados são os do tipo TrkB, sendo que no sistema nervoso periférico predominam os receptores TrkA (BIBEL & BARDE, 2000). Muito do que se sabe sobre as neurotrofinas foi obtido em estudos com o sistema NGF/TrkA, provavelmente pelo fato de ser o sistema nervoso periférico de mais fácil acesso e estudo. Um aspecto interessante e importante da sinalização das neurotrofinas é seu transporte

Introdução 20

retrógrado, do terminal nervoso ao corpo celular. Esse processo envolve a internalização do complexo ligante-receptor, sendo que o transporte axonal até o corpo celular ocorre rapidamente e é dependente de energia e de microtúbulos, apesar de os mecanismos exatos envolvidos ainda não estarem claros (BIBEL & BARDE, 2000; KANDEL et al., 2003). As neurotrofinas têm como efeito final, a modulação da sobrevivência, proliferação celular e da força sináptica, o que é conseguido tanto por ações sinápticas como nucleares. Na região da sinapse as neurotrofinas interferem na disposição do citoesqueleto e na atividade de várias proteínas, canais iônicos e receptores. Estudos com NGF mostraram, no terminal nervoso, o controle do alongamento do cone axonal durante seu crescimento (HUANG & REICHARDT, 2003). As neurotrofinas também são capazes de modular mecanismos présinápticos como número de vesículas de armazenamento, síntese e liberação de transmissores. Estudos feitos com BDNF e seus receptores TrkB mostraram sua capacidade de aumentar a quantidade de neurotransmissor liberado (BIBEL & BARDE, 2000). Geralmente, os efeitos das neurotrofinas relacionados à sinapse ocorrem de maneira bastante rápida. No núcleo, as neurotrofinas podem controlar a transcrição gênica, a expressão de várias proteínas e a ativação ou repressão de genes responsáveis pelo desenvolvimento neural. Essas ações nucleares levam a efeitos cujo desenvolvimento é mais lento. Parte, mas não todos os efeitos relacionados ao núcleo, como modulação de transcrição gênica, são dependentes do transporte retrógrado de neurotrofinas (RICCIO et al., 1997). Existem muitas outras substâncias endógenas, além das neurotrofinas, que estão reconhecidamente relacionadas ao desenvolvimento, crescimento e sobrevivência neuronal, como o fator neurotrófico ciliar (CNTF), o fator neurotrófico derivado da glia (GDNF), citocinas neuropoiéticas entre outros (TATAGIBA et al., 1997; HUANG & REICHARDT, 2001). As neurotrofinas, entretanto, são os fatores de crescimento neuronais mais importantes e mais estudados. Além de terem um papel muito importante em situações fisiológicas como durante o desenvolvimento embrionário e na manutenção e viabilidade neuronal, assim como participar de processos plásticos na fase adulta, os fatores de crescimento neuronal, principalmente as neurotrofinas, também exercem um papel bastante importante em outras situações, como por exemplo, na regeneração neuronal após uma lesão traumática ou patológica.

Introdução 21

4. LESÃO E REGENERAÇÃO NEURONAL
Quando um neurônio é lesionado não ocorre necessariamente a morte celular. Lesões que danificam ou seccionam axônios causam uma série de resposta moleculares, estruturais e celulares que levam à possibilidade de que ocorra regeneração com um possível restabelecimento de função. As modificações que ocorrem no sistema nervoso central são, entretanto, diferentes daquelas que ocorrem no sistema nervoso periférico. No sistema nervoso central, o crescimento axonal geralmente se limita a poucos milímetros e a regeneração não acontece efetivamente, enquanto no sistema nervoso periférico, em determinadas situações o neurônio lesado é capaz de crescer novamente, relativamente por longas distâncias e restabelecer suas conexões com seus respectivos alvos (AGUAYO et al., 1981; NICHOLLS et al., 2001). Há décadas varias investigações experimentais têm tentado compreender melhor a baixa capacidade regenerativa do sistema nervoso central e suas diferenças em relação ao sistema nervoso periférico. Ramón Y Cajal, em 1928, atribuiu a falha da regeneração do sistema nervoso central a uma incapacidade inerente ao neurônio. Na década de 80, entretanto, Aguayo e colaboradores concluíram, por meio de uma série de estudos com transplantes de células entre o sistema nervoso central e periférico, que a regeneração neuronal tem maior relação com o meio que o cerca, do que com as características próprias da célula nervosa (AGUAYO et al., 1981). Dessa forma, hoje está relativamente comprovado que um dos principais fatores que leva à falta de regeneração central é a presença de um meio não permissivo, onde várias substâncias inibitórias liberadas por células da glia dificultam a regeneração (DOMENICONI & FILBIN, 2005). Em experimentos ao qual foi adicionado um meio adequado ao local de lesão de neurônios centrais foi observada a capacidade de o neurônio se regenerar. Adicionar ao sítio de lesão, células de Schwann e drogas que aumentem a produção de AMPc são exemplos de manobras que facilitam a regeneração (PEARSE et al., 2004; NIKULINA et al., 2004). No sistema nervoso periférico o conhecimento sobre os mecanismos relacionados ao processo de regeneração está mais avançado (HANZ & FAINZILBER, 2006; RAIVICH & MAKWANA, 2007; THURET, et al., 2006). A lesão neuronal induz a formação de fatores de crescimento, fatores de transcrição e outros mediadores os quais favorecem a reconstrução e o crescimento neuronal. A lesão axonal leva a divisão do axônio, formando a porção ou segmento proximal, que continua ligada ao corpo celular e é a porção que terá capacidade de

Introdução 22

regenerar, e a porção distal, que devido à falta da influência nuclear, tende a degenerar (RAIVICH & MAKWANA, 2007). Na porção distal, inicia-se logo após a lesão, um rápido processo de degeneração não só do axônio, mas também da capa de mielina. Começa também uma intensa reação inflamatória, além de importantes modificações nas células de Schwann, as quais começam a se diferenciar e proliferar. Todo esse processo recebe o nome de degeneração Walleriana (FAWCETT & KEYNES, 1990). O processo inflamatório causa o recrutamento de macrófagos e a produção e liberação de citocinas além de outras moléculas envolvidas no processo inflamatório tais como o fator de necrose tumoral (TNF-α) e interleucinas (IL). A IL-1 estimula células não neurais, como as células de Schwann e fibroblastos, a produzir NGF e outros fatores de crescimento (BOURDE et al., 1996; WAKABAYASHI et al., 2003; AHMED et al., 2005), o que dará suporte à regeneração da porção proximal do neurônio lesado. Com efeito, os fatores tróficos têm uma importante ação sobre o brotamento axonal durante a regeneração neuronal (RAIVICH & MAKWANA, 2007). As células de Schwann também são de extrema importância no processo de regeneração de neurônios periféricos. Além de fatores neurotróficos, elas fornecem moléculas de adesão e outras substâncias que ajudam não só no crescimento axonal, mas também no direcionamento do axônio em crescimento. Sua capacidade de produzir uma membrana de base, contendo matrix extracelular, leva a formação de um tubo endoneural em direção ao órgão alvo, o qual serve de suporte para o axônio que está se formando (SON & THOMPSON, 1995a; SON & THOMPSON, 1995b; PEARSE et al., 2004). Na porção proximal, ocorrem rápidas alterações não só na região da lesão, mas também no corpo celular. Na região lesada, a ruptura do axônio leva de imediato, a uma série de conseqüências físicas: a lesão interrompe o fluxo normal retrógrado de fatores neurotróficos; ocorre rápida entrada de íon Ca2+ e Na+ no terminal lesado, o que despolariza a membrana e desencadeia potenciais de ação; ocorre exposição do terminal a substâncias presentes no espaço extracelular ou produzidas por células vizinhas, como células de Schwann, outros neurônios e células do processo inflamatório. Diferentes cascatas de sinalização e enzimas intracelulares são ativadas e ocorre transporte retrógrado, em direção ao corpo celular de uma série de substâncias formadas no terminal proximal devido à lesão. Esses estímulos e sinais desencadeiam a ativação de fatores de transcrição nucleares, formação de fatores de crescimento, moléculas de adesão e outras substâncias, as quais regulam a viabilidade neuronal e favorecem o alongamento e regeneração axonal (CHANG et al., 2003; RAIVICH & MAKWANA, 2007). Há também um aumento na expressão de

Introdução 23

RNAm para neurotrofinas entre elas o NGF, que sabidamente têm um importante papel na plasticidade e no processo de regeneração do nervo lesado (AHMED et al., 2005). As mudanças no terminal proximal são acompanhadas de alterações na estrutura do corpo celular. O neurônio passa de estado de transmissor para o estado de crescimento (FU & GORDON, 1997; HANZ & FAINZILBER, 2006). Ocorre intenso aumento de metabolismo e de síntese protéica, o núcleo toma uma posição mais periférica e ocorre a chamada cromatólise, caracterizada por alterações na disposição e dispersão do retículo endoplasmático rugoso. Apesar do grande número de descobertas, a busca pela compreensão dos mecanismos envolvidos na plasticidade do sistema nervoso está longe de terminar. Grande número de pesquisas vem sendo desenvolvido no intuito de formular novas possibilidades terapêuticas para a recuperação de doenças, disfunções e lesões do sistema nervoso. Hoje se sabe que a neurogênese, a dendritogênese e regeneração neuronal podem ser moduladas por drogas. Importantes estudos sobre a depressão e antidepressivos têm mostrado que essas drogas possuem a capacidade de interferir no crescimento e na viabilidade neuronal (ITOH et al, 2004; NIKULINA et al, 2004) Uma ação desse tipo seria de grande importância e interesse terapêutico, considerando-se a regeneração neuronal. Para melhor entender esse processo será descrito a seguir alguns aspectos básicos sobre depressão e o mecanismo de ação dos antidepressivos.

5. DEPRESSÃO E ANTIDEPRESSIVOS

A depressão é um dos distúrbios do humor considerado mais comum entre a população mundial. Relatos dos seus sintomas foram descritos pela primeira vez por Hipócrates por volta do ano 400 a.C. (NESTLER et al., 2002; AKISKAL, 2000). A depressão pode apresentar-se nas formas uni ou bipolar. A forma bipolar, também chamada de síndrome maníaco-depressiva, ou ainda distúrbio afetivo bipolar, alterna estados de mania (euforia) com estados depressivos. A forma unipolar é caracterizada pelo constante estado deprimido e pode se manifestar, na maior parte dos casos, de modo mais brando, ou de modo mais severo que pode vir acompanhada por proeminentes anormalidades neurovegetativas, sendo esse o subtipo mais marcante e responsável pelo alto índice de pessoas que recorrem a tratamentos em razão da depressão. O quadro clínico de pacientes com depressão é composto por alterações que afetam o humor, a psicomotricidade, as funções cognitivas e as funções vegetativas. Os sintomas são

Introdução 24

variados podendo ocorrer intenso desânimo, falta de motivação, desinteresse por atividades prazerosas, pessimismo, angustia, insegurança, baixa auto-estima, culpa e outros sentimentos negativistas. Pode ocorrer ainda, falta de energia, cansaço, lentificação do pensamento, falta de memória e de concentração. Os sintomas vegetativos incluem alterações no apetite, na libido, e no sono, além de queixas físicas como cefaléia e dores difusas, que variam de intensidade e freqüência de acordo com as oscilações da depressão. Esse conjunto de sintomas ocorre de forma generalizada, por períodos prolongados, e levam ao comprometimento em diversas esferas da vida do indivíduo (AKISKAL, 2000; NESTLER et al., 2002). Estudos epidemiológicos mostram que em torno de 40% a 50% dos casos de depressão é de origem genética (SANDERS et al., 1999). Além da predisposição genética, vários fatores ambientais também podem favorecer o desenvolvimento da depressão. Entre eles incluem-se o estresse, o envelhecimento, traumas emocionais, o abuso de drogas, infecções virais, distúrbios endócrinos, doença de Parkinson, traumatismo craniano, doenças vasculares, câncer, asma, diabetes, hipo ou hipertiroidismo, hiper ou hipocorticolemia (AKISKAL, 2000; FAVA & KENDLER, 2000; NESTLER et al., 2002). Fisiopatologia da depressão. Apesar da importância da depressão, o conhecimento de sua etiologia e de sua fisiopatologia está longe de estar completo. A descoberta das diferentes classes de antidepressivos e de seus mecanismos de ação foi e tem sido de fundamental importância para a elucidação das causas da depressão. Hoje, as classes de drogas antidepressivas existentes são os inibidores seletivos ou não seletivos de recaptação de noradrenalina ou de serotonina (5HT), os inibidores da enzima monoaminoxidase (MAO) que é a principal enzima metabolizadora de monoaminas, além de outras terapias aparentemente não relacionadas aos sistemas noradrenérgico ou serotoninérgico, como lítio, terapia eletroconvulsiva, estimulação magnética transcraniana, ácido valpróico, carbamazepina e outras (NIBUYA et al., 1996; MOORE et al., 2000; DUMAN, 2002a; KITAMURA et al., 2002). As primeiras drogas eficazes para o tratamento da depressão surgiram por volta de 1950. Antes disso achava-se que a depressão era uma manifestação puramente psicológica, e havia pouquíssimos ou nenhum tratamento medicamentoso mais específico para a doença. Nessa época, o tratamento da depressão recebeu um grande impulso quando por acaso foi observado que agentes tricíclicos como a imipramina (que estavam sendo estudados por seus

Introdução 25

efeitos anti-histamínicos) e inibidores da enzima MAO, como a iproniazida (que vinha sendo usada para o tratamento de tuberculose) apresentavam acentuado efeito antidepressivo (NESTLER et al., 2002). Essa descoberta e a análise do mecanismo de ação dessas drogas permitiram o início de uma série de estudos mais concretos sobre os mecanismos fisiopatológicos da depressão. Os estudos se direcionaram para mediadores e para a transmissão monoaminérgica, já que tanto iproniazida (por inibição da MAO) como a imipramina (por bloquear a recaptação neuronal de monoaminas) são drogas que levam ao aumento de noradrenalina na fenda sináptica (SLATTERY et al., 2004). Surgiu, então, a proposta monoaminérgica da depressão, sugerida por Shildkraut (1965), a qual postulava que a depleção de noradrenalina na fenda sináptica seria a causa primária da depressão. Dessa forma, ao aumentar os níveis desse transmissor na sinapse, os antidepressivos reverteriam o quadro depressivo. Várias evidências reforçaram essa teoria. Por exemplo, foi demonstrado que pacientes com depressão apresentavam menor quantidade de noradrenalina e seus metabólitos na urina e a reserpina, droga que depleta os estoques de aminas biogênicas no terminal nervoso simpático, levava a sintomas depressivos (SHILDKRAUT, 1965). Além disso, é sabido que as vias monaminérgicas estão amplamente distribuídas em regiões cerebrais relacionadas ao comportamento e às manifestação viscerais presentes na depressão (NESTLER et al., 2002). Posteriormente a 5HT também foi implicada na gênese da depressão, pois tanto os compostos tricíclicos como os inibidores da MAO, alteram a transmissão serotoninérgica, pelos mesmos mecanismos observados na transmissão noradrenérgica. Dessa forma, ocorre aumento sináptico de 5HT. Confirmando esse fato, foi visto que o 5-hidroxitriptofano e o L-triptofano, precursores da 5HT, promoviam uma melhora do quadro depressivo (COPPEN & DOOGAN, 1988). Além disso, alguns estudos mostraram uma redução nos níveis do metabólito da 5HT, o 5-hidroxiindolacético, no líquor de pacientes deprimidos (MURPHY et al., 1978; JANOWSKY & OVERSTREET, 1995). Mas logo ficou claro que unicamente o aumento dessas monoaminas na fenda sináptica não deveria ser o mecanismo básico de ação dos antidepressivos. Tanto o bloqueio do transporte de 5HT ou noradrenalina, assim como a inibição da metabolização dessas aminas, são os efeitos farmacológicos imediatos da maioria dos antidepressivos e levam ao aumento da transmissão noradrenérgica ou serotonérgica de modo bastante rápido. Contudo, a melhora do humor em pacientes com depressão geralmente ocorre após semanas ou meses do início da terapia medicamentosa com antidepressivos. Portanto, o aumento nos níveis de aminas por si só, não seria o fator responsável pela melhora da depressão. Aventou-se então que esse aumento levaria a alterações sinápticas adaptativas de instalação mais lenta e essas

Introdução 26

alterações seriam a base para o efeito terapêutico dos antidepressivos. As atenções então se voltaram para um possível fenômeno plástico. Mas a procura se limitou a processos relacionados à sinapse (SCHLOSS & HENN, 2004). Por exemplo, postulou-se que na depressão haveria uma alteração na densidade de determinados receptores e no padrão da transmissão sináptica, sendo que o excesso de monoaminas causado pelos antidepressivos levaria a uma lenta dessensibilização de receptores pré ou pós-sináptico, ou outras alterações em estruturas sinápticas, que causariam o efeito antidepressivo. O primeiro achado mais consistente foi o de que a maioria dos antidepressivos causava uma dessensibilização e internalização de receptores pós-sinápticos β-adrenérgicos (BANERJEE et al., 1977; SULSER, 1984; HENN et al., 1993). Além de receptores pós-sinápticos, foi estudada também a possibilidade de ocorrência de alterações em receptores pré-sinápticos (SCHLOSS & HENN, 2004). Nesses estudos houve enfoque nos receptores α2-adrenérgicos (GARCIA-SEVILLA & ZUBIETA, 1986; SACCHETTI et al., 2001). Esses receptores, quando estimulados, exercem uma conhecida modulação negativa sobre o processo de exocitose (MILLER, 1998) e controle negativo sobre a enzima de síntese de noradrenalina, a tirosina hidroxilase (ESTEBAN et al., 1996). Efeitos semelhantes foram observados em relação ao sistema serotoninérgico no qual a atividade de receptores pré-sinápticos 5HT1A e 5HT1B exercem regulação negativa da exocitose e dos níveis da enzima de síntese de serotonina, a triptofano hidroxilase (BLIER & MONTIGNY, 1994). Dessa forma, com o uso crônico dos antidepressivos, ocorreria uma dessensibilização desses receptores com conseqüente aumento de síntese de noradrenalina ou serotonina e do processo de exocitose (BLIER & MONTIGNY, 1994; SACCHETTI et al., 2001; SCHLOSS & HENN, 2004). Também foram feitos vários estudos a respeito dos efeitos do tratamento crônico dos antidepressivos sobre os transportadores de noradrenalina ou serotonina, responsáveis pela recaptação das monoaminas (SCHLOSS & HENN, 2004). Algumas dessas pesquisas mostraram que ocorre uma diminuição da quantidade do recaptador para serotonina (LESCH et al., 1993; PINEYRO et al., 1994). Em relação aos recaptadores de noradrenalina, os resultados obtidos foram bastante contraditórios e de difícil interpretação (ZHU & ORDWAY, 1997; ZHU et al., 2002). Embora o assunto seja controverso e os resultados variáveis conforme a região cerebral considerada, a maioria dos estudos indicava, portanto, que o tratamento crônico com antidepressivos poderia modular a atividade de estruturas pós e pré-sinápticas. Principalmente as possíveis modulações de estruturas pré-sinápticas, com o aumento da síntese e liberação dos neurotransmissores, e diminuição da quantidade de transportadores, teriam como

Introdução 27

conseqüência final um aumento na transmissão sináptica. Entretanto, não se conseguia explicar com clareza qual seria a relação entre essas alterações adaptativas desencadeadas pelos antidepressivos na região sináptica e os efeitos terapêuticos observados. Por exemplo, durante o tratamento antidepressivo, a dessensibilização dos receptores pós-sinápticos βadrenérgicos, os quais estão acoplados à cascata de sinalização adenilil ciclase-AMPc, deveria levar a uma diminuição na formação de AMPc. Entretanto, o que se observava a longo prazo era um aumento na formação de AMPc (DONATI & RASENICK, 2003). E ainda, a dessensibilização e internalização de receptores demoram de 1 a 3 dias para ocorrer, o que ainda é um processo mais rápido do que as semanas necessárias para a instalação do efeito antidepressivo (DONATI & RASENICK, 2003). Nesse contexto, nessas últimas duas décadas as pesquisas tomaram outro rumo, procurando alterações plásticas não só na região sináptica, mas no neurônio como um todo e no padrão de suas conexões e sua arborização (NESTLER et al., 2002). Dessa forma, embora as alterações neuroquímicas, principalmente noradrenérgica e serotoninérgica, estejam provavelmente relacionadas à depressão, estudos mais recentes vêm mostrando que existe uma correlação entre o processo depressivo e alterações na plasticidade e sobrevivência neuronal com prejuízo de conexões da rede neuronal em determinadas regiões cerebrais (DUMAN et al., 1999; MANJI et al., 2001; CASTREN, 2004; CARLSON et al., 2006). O acúmulo de dados e evidências apontam para alterações em conexões em regiões como hipocampo, córtex pré-frontal, tálamo, amígdala, entre outras, as quais sabidamente estão relacionadas com processos afetivos e com a depressão (MANJI et al., 2001; CARLSON et al., 2006). Essas evidências vieram da correlação com os estudos sobre estresse, de estudos de imagem cerebral em animais e humanos e análise postmortem em humanos deprimidos. Uma das primeiras indicações de que alterações em redes neuronais estariam associadas à depressão foram obtidas com os estudos sobre o estresse. Embora nem todo caso depressivo tenha uma situação de estresse associada e nem toda situação de estresse leve à depressão, a depressão é freqüentemente descrita como uma desordem relacionada ao estresse. Estudos tanto em animais como em humanos, mostraram que durante o estresse crônico, a constância e o excesso de corticóides produzidos pela ativação do eixo hipotálamopituitária-adrenal, podem levar a danos cerebrais, principalmente no hipocampo (SAPOLSKY, 2000a; 2000b; McEWEN, 2000; CZEH et al., 2001). A natureza e os mecanismos que levam às lesões ainda não estão bem claros (SAPOLSKY, 2000b; MANJI et al., 2003), contudo, há intensa redução da árvore dendrítica e ocorre também, uma diminuição da gêneses de novos neurônios no giro dentado do hipocampo. E esse fato estaria relacionado

Introdução 28

de alguma forma com a depressão. Estudos em roedores mostraram que uso crônico de antidepressivos (DUMAN et al., 2001; 2002b) revertia ou evitava a diminuição na arborização e na neurogênese hipocampal que se observa nesses animais, após exposição ao estresse crônico (SAPOLSKY, 1996; DUMAN et al., 1999; McEWEN, 1999). Grande parte dos indivíduos que são diagnosticados deprimidos possui altos níveis sanguíneos de glicocorticóides ou exibem hiperatividade do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (SAPOLSKY, 2000a; DUMAN, 2002b). Portanto, o fato de que o estresse crônico pode levar a lesões em áreas cerebrais como o hipocampo, associada à estreita relação entre estresse e depressão foi uma forte evidência de que o desenvolvimento da depressão estaria intimamente ligado a processos degenerativos de conexões cerebrais. Estudos postmortem, ou a análise de imagem cerebral por meio de tomografia de emissão de positrons e ressonância magnética em pacientes deprimidos reforçaram essa suposição. Em autópsias de pacientes deprimidos, inúmeros estudos mostraram intensa redução de volume e redução das células gliais em determinadas áreas cerebrais (COYLE & SCHWARCZ, 2000; MANJI et al., 2001; MANJI et al., 2003; FOSSATI et al., 2004). No que diz respeito aos estudos de imagem cerebral, foram vistas alterações de fluxo sanguíneo e de metabolismo de glicose, além de alterações anatômicas como diminuição de volume em regiões do cérebro incluindo córtex, hipocampo, estriado e tálamo, tanto em pacientes humanos deprimidos (SHELINE et al., 1996; DREVETS, 2000; MANJI et al., 2001; SHELINE et al., 2003) como em animais, em modelos de depressão (CZEH et al., 2001; FOSSATI et al., 2004). Todas essas alterações foram revertidas parcialmente ou totalmente após terapia com antidepressivos (FOSSATI et al., 2004; MANJI et al., 2003). Nesse sentido, Nakamura (1993) mostrou que o tratamento crônico com o antidepressivo desipramina induzia a regeneração do axônio terminal em córtex frontal de rato. O tratamento crônico com imipramina promoveu a regeneração do axônio noradrenérgico do córtex cerebral de ratos submetidos a estresse prolongado (KITAYAMA et al., 1997). A fluoxetina, outro antidepressivo extensamente utilizado, diminuiu a morte celular, aumentou a neurogênese de células granulosas e aumentou a arborização de neurônios hipocampais (DUMAN et al., 1999; MANEV et al., 2001; DUMAN et al., 2000; 2001; SANTARELLI et al., 2003). Para reforçar a suposição de que alterações e o prejuízo de conexões neuronais estariam associados à depressão, existe o fato de que vários outros tipos de tratamentos antidepressivos (além dos que aumentam transmissão noradrenérgica e serotoninérgica), como eletrochoque (SCHLOSS & HENN, 2004) privação de sono (CARLSON et al., 2006), lítio, carbamazepina e ácido valpróico revertem processos lesivos induzidos pelo stresse, favorecem a neurogênese e a

Introdução 29

proliferação neuronal, promovendo aumento de crescimento dendrítico e axonal (MANJI et al., 2001; 2003; CARLSON et al., 2006). Esses dados levaram então à hipótese neurotrófica da depressão, a qual postula que alterações atróficas e degenerativas em determinadas áreas cerebrais seriam a causa da depressão, sendo essas alterações decorrentes de uma deficiência de neurotrofinas (NESTLER et al., 2002; CASTREN 2004; SCHLOSS & HENN, 2004). Essa hipótese, que associa as lesões neuronais à falta de neurotrofinas, foi fundamentada no fato de que a plasticidade neuronal, relacionada à sobrevivência e desenvolvimento neuronal, está diretamente associada às ações de neurotrofinas. Vários estudos vêm mostrando que a depressão e/ou o estresse crônico, levam a uma diminuição da expressão e dos níveis de BDNF ou de outras neurotrofinas em várias áreas cerebrais de ratos (NIBUYA et al., 1995; SMITH et al., 1995; NIBUYA et al., 1999). Os níveis das neurotrofinas NT3 e NT4/5 estão significantemente diminuídos no hipocampo de vítimas de suicídio, quando comparados com cérebros normais (DWIVEDI et al., 2005). E essa diminuição nos níveis de neurotrofinas é revertida pelo tratamento crônico com diferentes tipos de tratamentos antidepressivos. O tratamento crônico com desipramina, fluoxetina e outros antidepressivos, causou o aumento na expressão de BDNF e de seu receptor, TrkB no córtex frontal e no hipocampo de ratos (NIBUYA et al., 1995; 1996), havendo indicações também que o mesmo ocorra igualmente em humanos (CHEN et al., 2001). Em estudos in vitro usando células PC12 tratadas com fluoxetina ou desipramina por 48 horas foi mostrado um acréscimo da expressão de RNAm para NGF (LI et al., 2003). Outro estudo interessante mostrou que a infusão de BDNF no hipocampo de ratos, em modelos de depressão como natação forçada, levou a uma resposta antidepressiva (SHIRAYAMA et al., 2002). Dessa forma, na depressão haveria uma deficiência de neurotrofinas, o que levaria a degeneração neuronal, sendo que de alguma forma, os antidepressivos promoveriam aumento dos níveis de neurotrofinas, o que seria um importante fator para proteger e restaurar o neurônio prejudicado pelo processo depressivo. A síntese de neurotrofinas é controlada por um importante fator de transcrição gênica, o CREB (cAMP response element-binding protein - CREB). Fatores de transcrição são proteínas que regulam a expressão gênica, ligando-se em domínios específicos de regiões promotoras de vários genes, estimulando a transcrição do RNA mensageiro relacionado ao gene em questão (CHANG et al., 2006). O CREB controla a síntese não só de neurotrofinas, como o BDNF, mas também de outras substâncias relacionadas à manutenção neuronal, como por exemplo, a proteína anti-apoptótica Bcl-2 (NESTLER et al., 2002), exercendo dessa forma, um papel fundamental na regulação de genes essenciais para a diferenciação,

Introdução 30

prolongamento e manutenção neuronal. Vários dados sugerem que algo que leve à diminuição de CREB (o que teria como conseqüência a diminuição de síntese de neurotrofinas) poderia contribuir para a fisiopatologia da depressão e o aumento de sua transcrição e de sua atividade seria um ponto chave na ação dos diferentes tipos de terapia antidepressiva. Estudos sobre os níveis de CREB no estresse crônico, na depressão ou após tratamento com antidepressivos, mostraram resultados qualitativamente semelhantes aos obtido com BDNF, ou seja, no estresse e na depressão observa-se uma diminuição da expressão e da atividade de CREB e após o tratamento com a maioria das diferentes classes antidepressivo, ocorre um aumento nos seus níveis. Estudos postmortem mostraram uma diminuição dos níveis de CREB no córtex pré frontal de pacientes deprimidos (DOWLATSHAHI et al., 1998). O aumento da expressão de CREB em hipocampo de rato foi observado com a administração crônica de diferentes antidepressivos como fluoxetina, desipramina ou imipramina (NIBUYA et al., 1996; DUMAN et al., 2000). Em situações normais, a ativação de CREB ocorre a partir de sua fosforilação. Diversos estímulos mediados por neurotransmissores, por neurotrofinas ou por atividade neuronal, desencadeiam diferentes vias de sinalização intracelular que podem levar à fosforilação do CREB (figura 1).

Introdução 31

Figura 1 – Esquema representando as diversas vias transducionais que podem acarretar a ativação do fator de transcrição, CREB. Adaptado de D’Sa & Duman, 2002. A principal dessas vias é a cascata adenilil ciclase/AMPc/PKA, que pode ser ativada por receptores noradrenérgicos, como os β-adrenérgicos, ou receptores serotoninérgicos dos tipos 5HT4, 6 ou 7. Evidências sugerem que disfunções na cascata de sinalização do AMPcCREB diminuam a regulação de fatores tróficos em áreas cerebrais de pacientes com depressão (DUMAN et al., 1997). Reforçando essa importante suposição que indica uma diminuição de AMPc na fisiopatologia da depressão existem trabalhos mostrando que inibidores da fosfodiesterase, enzima que degrada o AMPc, além de promover aumento na expressão de CREB, BDNF e TrkB no hipocampo de ratos (NIBUYA et al., 1996), podem apresentar efeito antidepressivo (O’DONNELL & ZANG, 2004). Além dessa importante via de modulação pelo AMPc, a atividade do CREB pode ser controlada por vias transducionais relacionadas ao aumento de cálcio intracelular, com ativação da cinase dependentes de Ca2+-calmodulina (CaCMK). As vias relacionadas ao cálcio podem ser ativadas por receptores α-adrenérgicos ou 5HT2 ou por ativação de canais que influem na sinalização de cálcio. A ativação de CREB pode ainda ser conseguida por outras vias de sinalização, como vias relacionadas à MAPK (DUMAN et al., 1999). Estudos recentes mostraram que a ativação de vários receptores acoplados à proteína G, entre eles receptores α-adrenérgicos ou 5HT1A, levam à ativação da via MAPK (LUTTRELL et al., 1999; MENDEZ et al., 1999). Fica claro, portanto, que o aumento de neurotransmissão noradrenérgica ou serotoninérgica pode aumentar a fosforilação de CREB e síntese de BDNF por várias vias diferentes. Dessa forma, o CREB pode servir de integrador central a vários sinais extracelulares que influenciam a plasticidade neuronal, o que explicaria o fato de que outros tipos de condutas ou de drogas, além das que afetam diretamente as vias noradrenérgicas ou serotoninérgica, também podem apresentar efeito antidepressivo (NIBUYA et al., 1996). Drogas e terapias antidepressivas. Resumindo, portanto, as diferentes classes de antidepressivos teriam seus efeitos relacionados ao favorecimento de mecanismos que aumentam a viabilidade e a sobrevivência neuronal. O mecanismo comum, pelo menos em parte, seria a ativação de CREB, com conseqüente formação de neurotrofinas, as quais promoveriam a manutenção neuronal, podendo induzir a formação de novas sinapses e novas conexões neuronais (ALTAR, 1999).

Introdução 32

Como já mencionado anteriormente, as principais classes de drogas antidepressivas existentes são os inibidores seletivos de recaptação de noradrenalina ou serotonina, os inibidores da MAO, e outras drogas ou terapias aparentemente não relacionadas aos sistemas monoaminérgico, como lítio, terapia eletroconvulsiva, ácido valpróico, carbamazepina e outras. Lítio, um cátion monovalente bastante usado da depressão bipolar, aumenta a expressão de CREB, BDNF e de TrkB em neurônios corticais de rato (MANJI et al., 2000). Foi mostrado também, aumento nos níveis de Bcl-2, em várias áreas do sistema nervoso central, estímulo da neurogênese no hipocampo de ratos e aumento do volume de substância cinzenta em humanos (MANJI et al., 2001; CARLSON et al., 2006). Ácido valpróico e carbamazepina são drogas usadas como anticonvulsivantes e que também apresentam efeito antidepressivo. Foi observado que essas drogas promovem aumento de crescimento dendrítico e axonal e tem um efeito neuroprotetor. Entretanto, não estão claros quais os mecanismos envolvidos nessas ações (COYLE & DUMAN, 2003). A terapia eletroconvulsiva, que induz importante e rápido efeito antidepressivo, aumenta a atividade do CREB por causar despolarização neuronal, com conseqüente aumento de cálcio e ativação da CaCMK. Foi mostrado que terapia eletroconvulsiva aumenta níveis de BDNF e de seu RNAm em hipocampo de ratos (NIBUYA et al., 1995). E por fim, as principais e mais usadas drogas antidepressivas são aquelas que interferem com a transmissão noradrenérgica e serotoninérgica. As primeiras drogas desse grupo a serem usadas foram os inibidores da monoaminoxidase (IMAO) e os inibidores de recaptação neuronal de noradrenalina. Entre os inibidores da MAO temos a iproniazida, fenelzina e tranilcicloprominas, entre outras (MOLLER & VOLZ, 1996). Essas drogas não têm sido muito usadas devido a problemas de interação com determinados tipos de alimentos, entre outros fatores. A classe de inibidores de recaptação neuronal recebeu inicialmente o nome de antidepressivos tricíclicos devido a sua estrutura característica com núcleo formado por três anéis. Embora atualmente muitos dos inibidores de recaptação sejam tricíclicos, como por exemplo, a amitriptilina, clomipramina, e a imipramina, novas drogas com estruturas diferentes foram sendo introduzidas. Os inibidores da recaptação de monoaminas são classificadas conforme a sua seletividade pelos diferentes tipos de recaptadores (FEIGHNER, 1999). Assim, temos os inibidores seletivos da recaptação de noradrenalina (ISRN), inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRS) e inibidores não seletivos que bloqueiam tanto a recaptação de noradrenalina como a de serotonina. As principais drogas que inibem seletivamente a recaptação de noradrenalina são a desipramina, a nortriptilina, a mianserina e

Introdução 33

a reboxetina, entre outras. Pertencem à classe dos inibidores seletivos da serotonina, a paroxetina, a fluoxetina, a sertralina, entre outras (MASAND & GUPTA, 1999). E como inibidores não seletivos, temos a imipramina, amitriptilina ou clomipramina (KENT, 2000). Em síntese, esses antidepressivos, ao aumentarem a quantidade de transmissor na fenda sináptica, acarretam alterações sinápticas que facilitam a transmissão noradrenérgica e/ou serotoninérgica, desencadeando cascatas de sinalização, principalmente envolvendo aumento de AMPc, que induziriam ativação de CREB, e aumento da expressão gênica e de liberação de BDNF (ALTAR, 1999). Isso explicaria o longo tempo necessário para os antidepressivos exercerem seus efeitos. É preciso que haja tempo para a indução da expressão e atividade de CREB e como conseqüência, de BDNF e depois, tempo suficiente para o BDNF exercer seus efeitos neurotróficos e o aumento da arborização dendrítica seja suficiente para normalizar as conexões sinápticas. Entretanto, vem sendo mostrado, que as ações dessa classe de antidepressivos não são unicamente decorrentes do aumento de monoaminas na fenda sináptica. Existem evidências de que os antidepressivos exerçam, por algum mecanismo ainda não claro, ações diretas facilitatórias sobre a via de sinalização de AMPc/PKA, que ocorrem de maneira independente do transmissor. Estudos em membranas corticais de ratos tratados por 21 dias com amitriptilina ou desipramina mostraram uma maior capacidade da proteína G em ativar a adenilil ciclase, enzima responsável pela produção de AMPc (CHEN & RASENICK, 1995b). Essa facilitação de acoplamento estaria ocorrendo provavelmente por mecanismos relacionados à fluidez de membrana e ao citoesqueleto (CHEN & RASENICK, 1995b, DONATI & RASENICK, 2003; 2005). Resultados semelhantes, isto é, melhor acoplamento entre proteína Gs e adenilil ciclase, foram obtidos em relação aos receptores serotoninérgicos do subtipo 5HT1A (HENSLER, 2002; DONATI & RASENICK, 2003). Além disso, foi mostrado um aumento na quantidade de fosfoquinase A (PKA) em frações límbicas cerebrais de ratos tratados com antidepressivos (NESTLER et al., 1989; PEREZ et al., 1989). Uma ação direta dos antidepressivos na formação de AMPc é confirmada por vários trabalhos realizados in vitro, em células em cultura ou estudos em membranas isoladas, situações que permitem o controle do meio e garantem a ausência de transmissor. Foi mostrado um melhor acoplamento entre proteína G e adenilil ciclase em astrócitos isolados tratados por vários dias com amitriptilina (HERTZ & RICHARDSON, 1983), ou células glioma C6, tratadas com desipramina (FISHMAN & FINBERG, 1987; CHEN & RASENICK, 1995a). Em cultura de células PC12, lesadas devido a presença de corticosterona, o tratamento por 48 horas com diferentes antidepressivos causou um efeito

Introdução 34

citoprotetor, com aumento de mRNA para NGF (LI et al., 2003). Esses achados poderiam explicar o fato de que, mesmo com a já bem demonstrada dessensibilização de receptores β-adrenérgicos, causada pelos antidepressivos, observa-se paradoxalmente um aumento na formação de AMPc (OZAWA & RASENICK, 1989; CHEN & RASENICK, 1995a; 1995b). Apesar dessa dessensibilização, haveria ainda quantidade suficiente de receptores para que, frente ao aumento de monoaminas na sinapse e frente aos efeitos facilitatórios dos antidepressivos sobre a ativação da cascata AMPc/PKA, o efeito final fosse um aumento do acúmulo de AMPc (DUMAN et al., 1999). Embora a evidente participação dos antidepressivos na manutenção e sobrevivência neuronal no sistema nervoso central seja indiscutível, existem poucos trabalhos a esse respeito no sistema nervoso periférico. Ou seja, não é sabido se no sistema nervoso periférico os antidepressivos também teriam essa capacidade de favorecer a regeneração neuronal. Entretanto, vêm sendo mostrados estudos animadores relacionados à participação de AMPc na reinervação periférica. Tratamentos farmacológicos que aumentam os níveis de AMPc levaram a uma melhor evolução do crescimento do cone regenerativo de axônios no gânglio da retina de ratos adultos, em contraste com o pequeno potencial regenerativo visto em condições normais (CHIERZI et al., 2005). O uso de um análogo do AMPc, o dibutiril AMPc aumentou o alongamento de neurônios ganglionares em cultura da retina de ratos (MONSUL et al, 2004). Em estudo de imuno-histoquímica, também foi demonstrado que o aumento do AMPc combinado com o fator neurotrófico ciliar, pode aumentar a sobrevivência de nervos da retina axotomizados e promover a regeneração axonal do nervo periférico de ratos (HU et al., 2007). Como a ação dos antidepressivos está muito provavelmente relacionada ao aumento de AMPc, como descrito anteriormente, uma interessante associação entre os antidepressivos e um possível aumento dos níveis de AMPc e neurotrofinas poderia servir como uma terapia em potencial em casos, como por exemplo, de lesões neuronais periféricas.

6. SISTEMA NERVOSO PERIFÉRICO - TRATO UROGENITAL

Determinadas patologias do trato urogenital estão relacionadas a disfunções no sistema nervoso central, no sistema nervoso periférico, ou em ambos, causadas por infecções, inflamação, doenças degenerativas, má formação congênita, lesão na medula espinhal, trauma pélvico ou cirúrgico, entre outros (BIERS & BRANDING, 2003). Em algumas dessas disfunções, portanto, a causa primária é uma lesão neuronal.

Introdução 35

A regeneração do nervo periférico, como já dito anteriormente, é mais rápida e eficiente do que aquela que ocorre no sistema nervoso central (DEZAWA, 2000). Em relação ao sistema nervoso autônomo simpático, tem sido bem documentada a regeneração espontânea de seus nervos periféricos. No que diz respeito ao trato urogenital, existem relatos de pacientes que sofreram interrupção da via simpática abdominal ou pélvica que inerva o vaso deferente ou a próstata, e espontaneamente readquiriram funções como, por exemplo, a ejaculação (BORS & COMARR, 1960 apud KOBAYASHI et al., 2001; BAXTER & O’KAFO, 1984). Essa facilidade de regeneração também foi mostrada experimentalmente. Por exemplo, foi demonstrado em cães que sofreram secção do nervo hipogástrico, a recuperação da função ejaculatória após a reconexão do nervo (KIHARA et al., 1998; KOBAYASHI et al., 2003). Entretanto, apesar de relatos nesse sentido, a regeneração espontânea de neurônios simpáticos, não só no trato urogenital como em outros sistemas periféricos, não é um processo que ocorra sempre e em qualquer situação. Intervenções farmacológicas ou de qualquer outro tipo, vem sendo procuradas no sentido de facilitar esse processo regenerativo. Vários estudos demonstram que o tratamento farmacológico usando fatores de crescimento (NGF), pode ser capaz de acelerar a reinervação do nervo hipogástrico e acelerar o ressurgimento da arborização axonal em ratos (BURGERS et al., 1991). O trato urogenital é bastante rico em neurotrofinas, sendo o ducto deferente um dos órgãos com as mais altas concentrações de RNAm para NGF entre os tecidos periféricos (HEUMANN et al., 1984; GOEDERT et al., 1986). Pela técnica de imunoflorescência foi possível detectar grande quantidade de receptores TrkA e p75 para NGF, no axônio de neurônios que inervam ducto deferente de ratos (KEAST & KEEPER, 2001). Além da alta concentração de neurotrofinas, o trato urogenital também responde melhor a essas substâncias do que outros sistemas. Foi mostrado que o tratamento crônico com NGF em ratos aumentou a densidade da inervação simpática em órgãos do trato urogenital sendo que o mesmo tratamento não afetou a inervação no sistema vascular (MILNER et al., 1995). Dessa forma, o trato urogenital, particularmente o ducto deferente, seria um bom modelo para o estudo de mecanismos relacionados à inervação, desnervação e regeneração neuronal após uma lesão nervosa, principalmente no que diz respeito à inervação simpática.

Introdução 36

7. DUCTO DEFERENTE

O ducto deferente é um órgão par, de forma cilíndrica e alongada, pertencente à genitália acessória masculina. Ele está localizado entre a cauda do epidídimo e glândula prostática (figura 2A). Sua principal função é a condução dos espermatozóides dos túbulos seminíferos para a uretra, durante a ejaculação. Sua musculatura é constituída de fibras musculares lisas, compostas de uma camada interior e circular e outra exterior longitudinal. A irrigação arterial para os ductos deferentes e órgãos adjacentes provem fundamentalmente da artéria deferencial, que tem sua origem nas artérias hipogástricas, e a artéria espermática, que por sua vez, origina-se da artéria aorta. A drenagem venosa do ducto deferente é realizada principalmente pela veia deferencial que acompanha a artéria de mesmo nome.

A

B

FIGURA 2 – (A) – localização do ducto deferente em relação a outros órgãos do trato urogenital masculino. (B) – inervação do ducto deferente de rato. Adaptado a partir de
Kobayashi et al., 2001.

Introdução 37

A inervação autonômica que chega ao ducto deferente é tanto de origem simpática como parassimpática (CAMPOS, 1988; DIXON et al., 1998; KIHARA et al., 1998; KALECZYC, 1998). O controle motor se faz principalmente por fibras simpáticas, cujas fibras pré-ganglionares são provenientes, majoritariamente, dos segmentos lombares superiores L2 e L3 (DIXON et al., 1998; ANTON et al., 1977), e de L4-L6 (KIHARA et al., 1998). Ao deixar esses segmentos lombares, essas fibras pré-ganglionares passam, sem formar sinapses, pelo plexo mesentérico, sendo que em seguida formam os nervos hipogástricos, os quais, logo abaixo, se juntam aos nervos pélvicos para chegarem, então, aos plexos pélvicos (figura 2B). Os plexos pélvicos contêm numerosos gânglios onde ocorrem as sinapses entre as fibras pré e pós-ganglionares da inervação simpática (KIHARA et al., 1998). Como esses plexos pélvicos ficam muito próximos ao órgão, as fibras pósganglionares simpáticas que inervam o tecido são curtas, característica pouco usual do sistema nervoso simpático (DIXON et al., 1998; KALECZYC, 1998; KIHARA et al., 1998). O ducto deferente apresenta uma grande densidade de fibras simpáticas, fato que o torna um dos órgãos periféricos mais densamente inervados pelo sistema nervoso autônomo simpático (FALCK et al., 1965; BATRA et al., 1974). A maior parte dessa inervação simpática se dirige para as camadas de musculatura lisa (MAJCEN, 1984; WANIGASEKARA et al., 2003). A inervação parassimpática do ducto deferente é bem menos densa do que a inervação simpática. As fibras pré-ganglionares do parassimpático são provenientes dos segmentos sacrais S2-S4 da medula, que formam o nervo pélvico e, assim como as fibras préganglionares do simpático, se dirigem aos plexos pélvicos onde farão sinapse com suas fibras pós-ganglionares, as quais se dirigem ao ducto deferente (KEAST, 1995; DIXON et al., 1998). Dessa forma, os plexos pélvicos constituem uma situação singular no sistema nervoso autônomo, sendo um dos únicos locais onde fibras simpáticas e parassimpáticas localizam-se no mesmo gânglio (DAIL, 1996; KIHARA et al., 1998). Apesar de existir inervação colinérgica no ducto deferente, as fibras pós-ganglionares parassimpáticas se dirigem predominantemente para a região subepitelial, sendo escassas as fibras existentes nas camadas musculares (KIHARA et al., 1998), o que contrasta com neurônios adrenérgicos que estão presentes especialmente na camada muscular (KUJAT et al., 1993). Sendo assim, é aceito que, no ducto deferente, o sistema nervoso autônomo parassimpático possui principalmente papel de controle da função secretora epitelial, apesar de ter sido descrita também que neurônios parassimpáticos podem exercer uma ação modulatória da transmissão simpática (SJÖSTRAND & SWEDIN, 1970; TSUNOO et al., 1991; KIHARA et al., 1998).

Introdução 38

Axônios sensórios também estão presentes no ducto deferente, contendo peptídeo relacionado ao gene para calcitonina (CGRP) e substância P (REYNIER-REBUFFEL, 1994). Além de células neuronais, musculares e vasculares, também podem ser encontradas no tecido, outros tipos celulares tais como fibroblastos, células intersticiais e mastócitos. É conhecido que em células do trato urogenital os fibroblastos são bastante numerosos (GABELLA, 1994). Células de Schwann também estão distribuídas pela superfície dos axônios (GABELLA, 1994; LIN & BENNET, 2005). Apesar do preceito em que no sistema nervoso autônomo, as fibras nervosas pós-ganglionares são compostas preferencialmente por nervos desmielinizados, foi mostrado em ducto deferente de cobaia que uma pequena parte suas fibras nervosas seria composta por axônios mielinizados (MERRILLEES et al., 1963), sendo que no ducto deferente de rato, há relato de que a totalidade das fibras nervosas seriam mielinizadas, embora o assunto seja controverso (GABELLA, 1994). Neurotransmissão e receptores presentes na musculatura lisa. O principal neurotransmissor liberado pelas terminações simpáticas adrenérgicas do ducto deferente é a noradrenalina. Outra importante substância, a adenosina 5-trifosfato (ATP) também é liberada e essas duas substâncias, noradrenalina e ATP, atuam de modo sinérgico, caracterizando o processo de co-transmissão (BURNSTOCK, 1988; VIZI & BURNSTOCK, 1988). Já está bem demonstrado também que em grande parte dos neurônios adrenérgicos é encontrado o neuropeptídeo Y (MAJCEN et al., 1984; KEAST, et al., 2002; WANIGASEKARA et al., 2003). A noradrenalina liberada atua em receptores α1Aadrenérgicos, localizados na musculatura lisa (MINNEMAN & ABEL, 1984; DIAZTOLEDO & MARTI, 1988; PUPO, 1998) enquanto o ATP atua em receptores purinérgicos do tipo P2X (MINNEMAN & ESBENSHADE, 1994). Quando o ducto deferente é estimulado eletricamente, em parâmetros que só estimulem o tecido nervoso e não o muscular, ocorre a clássica resposta neurogênica bifásica, composta por uma resposta fásica inicial, rápida, de origem predominantemente purinérgica (que é bloqueada pelo antagonista purinérgico, suramin), seguida de uma resposta mais lenta, porém sustentada (resposta tônica) de origem principalmente noradrenérgica (inibida pelo antagonista α1-adrenérgico, prazosin). Vários mecanismos modulam a neuroliberação e um importante processo que ocorre no ducto deferente é a retro modulação negativa exercida por receptores α2-adrenérgicos pré-

Introdução 39

sinápticos (STARKE, 1987). A presença de receptores α2-adrenérgicos excitatórios póssinápticos não foi detectada no ducto deferente de rato (MINNEMAN et al., 1983). No ducto deferente também são encontrados receptores β-adrenérgicos, cuja localização e função não estão completamente esclarecidas. Vários trabalhos indicam que esses receptores seriam do subtipo β2-adrenérgico estando presentes tanto na pré como na pós-sinapse (MAY et al., 1985; DRIESSEN et al., 1996; GONÇALVES et al., 1996; TODOROV et al., 2001). Na localização pré-sináptica, a ativação desses receptores causa uma modulação complexa da neurotransmissão. Foi observado que a neuroliberação de noradrenalina é facilitada, sendo que, por outro lado, ocorre uma diminuição da liberação de ATP (TODOROV et al., 2001; DRIESSEN et al., 1996). Na pós-sinapse, a estimulação desses receptores leva a uma diminuição da capacidade contrátil muscular (HOVEVEI-SION et al., 1983; MAY et al., 1985; DIAZ-TOLEDO & JURKIEWICZ, 1991). Entretanto, existem indicações de que fisiologicamente esses receptores não teriam um papel muito importante (MAY et al., 1986). Outro assunto bastante controverso diz respeito ao sistema serotoninérgico. Já foi demonstrada, no ducto deferente, a presença de 5HT e de suas enzimas de síntese e degradação (FUENMAYOR et al., 1976). Sua presença foi confirmada em mastócitos e em outras estruturas não identificadas (CELUCH & SLOLEY, 1988; 1989). Evidências sugerem a presença de 5HT em tecido nervoso, uma vez que 4 dias após desnervação do tecido, foi observada uma diminuição do teor de 5HT no tecido (FREITAS et al., 2004). Entretanto, não está claro se essa 5HT neuronal estaria em uma inervação exclusivamente serotoninérgica ou se estaria em outros tipos neuronais. Foi mostrado que a 5HT pode ser captada pelos terminais nervosos simpáticos e promover liberação de noradrenalina por mecanismo semelhante ao observado para a tiramina (LUCCHELLI et al., 1984; JURKIEWICZ et al., 1999). Por outro lado, estudos realizados por Cohen e colaboradores (1988) mostraram que provavelmente a 5HT não estaria co-localizada junto com noradrenalina em neurônios adrenérgicos, já que sua distribuição ao longo do ducto deferente não é a mesma daquela observada para noradrenalina e dopamina. Além disso, algumas drogas que afetam especificamente o neurônio adrenérgico interferem com os níveis das monoaminas adrenérgicas sem afetar o teor de 5HT. Receptores serotoninérgicos foram mostrados no ducto deferente por estudos de biologia molecular e por meio de estudos funcionais. Pelas técnicas de PCR (Polimerase Chain Reaction) e eletroforese foi possível identificar e quantificar no ducto deferente de rato RNAm para receptores 5HT1A, 5-HT1B e 5-HT2C (KIM & PAICK 2004). Estudos funcionais indicaram a presença de receptores serotoninérgicos tanto na pré-sinapse, em neurônios noradrenérgicos, como na pós-

Introdução 40

sinapse, no tecido muscular. Foi mostrada uma modulação negativa da liberação de noradrenalina mediada por receptores pré-sinápticos do tipo 5HT1B (SEONG et al., 1990; SMITH & BENNETT, 1990) e modulação positiva, relacionada a receptores 5HT3 (SEONG et al., 1990). Pós-sinápticamente a 5HT promove contração provavelmente mediada por 5HT2 (MORITOKI et al., 1986; GARCEZ-DO-CARMO, 1995). Além desses receptores, também já foi demonstrada no ducto deferente a presença de receptores colinérgicos muscarínicos (MIRANDA et al., 1995; KASUYA & SUZUKI, 1979), receptores para histamina do tipo H1 (VASSILEV et al., 1991), para neuropeptídeo Y (KAHL et al., 1994; BITRAN et al., 1996), entre outros. Assim como qualquer terminação adrenérgica, no ducto deferente os terminais nervosos apresentam transportadores para recaptação de noradrenalina. (SCHROETER et al., 2000; SUNG et al., 2005). A participação desses transportadores no controle da quantidade de noradrenalina na biofase é bastante importante e são inúmeros os trabalhos que mostram a potencialização da resposta à noradrenalina e outras drogas adrenérgicas, quando ocorre o bloqueio desses transportadores (KENAKIN, 1980). Além de transportar drogas adrenérgicas, o neurônio adrenérgico também é capaz de captar serotonina (LUCCHELLI et al., 1984; GARCEZ-DO-CARMO, 1995; JURKIEWICZ et al., 1999), embora não se saiba se essa captação ocorra por transportadores de noradrenalina ou se existem transportadores específicos para serotonina no terminal adrenérgico. Desnervação e reinervação do ducto deferente. Considerando suas características anatômicas, que permitem sua fácil manipulação bem como suas características funcionais, como a rica inervação simpática, o ducto deferente serve como um modelo muito usado para o estudo de mecanismos adrenérgicos. Além de mecanismos envolvidos com a contração do músculo liso, também processos relacionados à inervação do tecido são bastante estudados no ducto deferente. Muito do que se sabe hoje sobre as conseqüências da desnervação sobre a funcionalidade do tecido muscular liso foi decorrente de estudos no ducto deferente. Intervenções imunológicas, químicas ou cirúrgicas (PICKLO, 1997), com o objetivo de danificar parcial ou totalmente o neurônio e conseqüentemente, investigar os eventos posteriores à sua lesão, são metodologias de desnervação úteis que auxiliam a entender melhor os processos fisiológicos da plasticidade neuronal. Como exemplo de desnervação imunológica temos a imuno-simpatectomia que pode ser conseguida pela administração de

Introdução 41

anticorpos contra a neurotrofina NGF (COHEN et al., 1960; LEVI-MONTALCINI & BOOKER, 1960, PICKLO, 1997). O NGF é um fator trófico bastante importante para neurônios simpáticos e sensoriais e a presença de anticorpos anti-NGF leva à apoptose e degeneração neuronal. Entretanto, esse tipo de desnervação ocorre de modo irregular e é dependente da idade (PICKLO, 1997). Além disso, alguns nervos simpáticos são resistentes à privação de NGF, em particular aqueles do ducto deferente (LEVI-MONTALCINI & ANGELETTI, 1966; GORIN & JOHNSON, 1980; ABERDEEN et al., 1991). A desnervação química pode ser conseguida com 6-hidroxidopamina e guanetidina. A 6-hidroxidopamina é captada especificamente pelo neurônio adrenérgico, onde, devido a sua metabolização, leva à formação de peróxidos e superóxidos, comprometendo e lesando a membrana plasmática e conseqüentemente o neurônio adrenérgico. Entretanto, essa ação ocorre em graus diferentes conforme o tecido e geralmente a recuperação é bastante rápida, ocorrendo em alguns dias (PICKLO, 1997). Já a guanetidina, também específica para o neurônio adrenérgico, causa desnervação por mecanismos não completamente esclarecidos, existindo evidências de que ocorra uma reação imunológica que leva à lesão neuronal praticamente irreversível (PICKLO, 1997). Essas drogas têm que ser administradas de forma sistêmica, levando ao comprometimento de todo sistema nervoso autônomo simpático, não sendo, portanto, considerado um método apropriado para estudos dos efeitos crônicos de uma simpatectomia específica (SAITO et al., 1982; PICKLO, 1997). A desnervação cirúrgica, por outro lado, é um dos métodos mais usados, pois permite a lesão seletiva de um nervo ou grupos de nervos, gerando portanto, uma desnervação tecido específica. Conforme a técnica empregada, a desnervação pode ser total, levando à completa ausência de neurotransmissores (PICKLO, 1997). Outro fato importante quanto à desnervação cirúrgica é a possibilidade de se realizar estudos de regeneração nervosa que envolvam longos períodos. Existem várias técnicas de desnervação do ducto deferente, relacionadas à altura em que é feita a secção do nervo, podendo ser pré-ganglionar (secção do nervo hipogástrico) ou pós-ganglionar. Nesse aspecto, as técnicas de desnervação mais usadas consistem na separação cuidadosa dos nervos que chegam ao ducto deferente provenientes dos plexos pélvicos, sendo portanto, uma desnervação pós-ganglionar. A separação é feita a partir da região prostática, sendo as técnicas mais usadas a de Birmingham (1970), que promove essa separação até a região final do ducto deferente, na porção epididimal e a técnica de Kasuya e colaboradores (1969), que realiza a separação apenas na porção prostática. Em ambas as técnicas de desnervação, análises bioquímicas indicaram uma drástica redução dos níveis de catecolaminas, principalmente no período entre o 4º e 16º dia após a cirurgia.

Introdução 42

A perda da inervação acarreta mudanças secundárias mais profundas na estrutura e no comportamento das células inervadas, que dão início a mecanismos adaptativos na tentativa de normalizar a função (BRADING, 1997; BIERS & BRADING, 2003). São inúmeros os trabalhos que mostram que a interrupção crônica da neurotransmissão simpática, por métodos cirúrgicos ou químicos, acarreta uma supersensibilidade do tecido desnervado (SAITO et al., 1982; FLEMING & WESTFALL, 1988). Esse fenômeno plástico foi descrito no sistema nervoso central (BERNARDI et al., 1986; FRUSSA-FILHO & PALERMO-NETO, 1988, 1990, 1991; BERGAMO et al., 1997; VITAL et al., 1998) e em órgãos do sistema nervoso periférico como o vaso deferente, íris de coelhos, diafragma e jejuno de ratos, coração de cães, entre outros (WESTFALL, 1970; WESTFALL et al., 1972; SANNOMIYA & DE MORAES, 1979, 1981a; MENKES et al., 1983; ABRAHAM & RICE, 1992; MATSUMOTO et al., 1992; HERSHMAN et al., 1993; OSINSKI & BASS, 1993; WARNER et al., 1993; ABDEL-LATIF et al., 1995). No ducto deferente esse fenômeno já foi bastante estudado, tendo sido observado um aumento relativamente inespecífico da resposta contrátil a vários agonistas, como noradrenalina, fenilefrina, acetilcolina, carbacol, Ca2+, 5-HT, BaCl2, KCl, ATP, entre outros (KASUYA et al., 1969; DE MORAIS, 1976; HATA et al., 1980; JURKIEWICZ et al., 1977; 1991; 1994; GARCEZ-DO-CARMO, 1995; CORDELLINI, & SANNOMIYA, 1999). A quase totalidade dos estudos a esse respeito mostra que a supersensibilidade inicia-se logo após a desnervação alcançando seu ápice em torno do 7º dia após a cirurgia (OZAWA et al., 1970; FLEMING et al., 1975). No que diz respeito aos agonistas adrenérgicos, a supersensibilidade observada é bastante acentuada, ocorrendo aumento tanto no que diz respeito ao efeito máximo como quanto à potência do agonista (LANGER, 1974; DE MORAIS 1976; HATA et al., 1981; GARCEZ-DO-CARMO, 1995). Os processos que levam à supersensibilidade adrenérgica estão relacionados a mecanismos pré e pós-sinápticos (KASUYA et al., 1969). A supersensibilidade pré-sináptica se deve basicamente à ausência do mecanismo de recaptação de catecolaminas pelo terminal nervoso, em decorrência da desnervação (TRENDELENBURG & WEINER, 1962). Dessa forma, em estudos funcionais, quando se realizam curvas concentração-efeito de agonistas adrenérgicos, uma maior concentração do agonista permanece na biofase, aumentando, portanto, sua potência aparente, o que se manifesta pelo deslocamento das curvas para a esquerda. A supersensibilidade pré-sináptica, relacionada à ausência de recaptação neuronal é de instalação rápida é proporcional à degeneração neuronal, sendo altamente específica para substâncias adrenérgicas. Essa mesma supersensibilidade é obtida na presença de inibidores da recaptação neuronal de aminas, em

Introdução 43

animais não desnervados, como a cocaína e antidepressivos tricíclicos (KASUYA & GOTO, 1968; VELASCO et al., 1996). A supersensibilidade pós-sináptica está relacionada a alterações no tecido muscular visando facilitar a sua ativação. Em estudos funcionais, esse tipo de supersensibilidade pode se manifestar tanto pelo aumento de efeito máximo como pelo aumento da potência (deslocamento das curvas concentração-efeito do agonista para a esquerda). Embora inicialmente pensou-se que a supersensibilidade adrenérgica pós-sináptica estivesse relacionada a um aumento no número de receptores α1-adrenérgicos, a maioria dos estudos mostrou não haver alterações na afinidade ou densidade desses receptores (ABEL, et al., 1985; CORDELLINI, & SANNOMIYA, 1999; CAMPOS et al., 2003). Esse achado, associado à constatação de que a supersensibilidade era relativamente inespecífica, ocorrendo aumento de resposta a vários agonistas além dos adrenérgicos, levou à procura por alterações em mecanismos de excitabilidade celular ou mudanças no mecanismo contrátil do músculo liso. Várias alterações foram relatadas que poderiam explicar a supersensibilidade. Por exemplo, foi verificado que a excitabilidade da membrana plasmática se apresentava aumentada, ou por diminuição do limiar de excitabilidade, como foi mostrado em ducto deferente de rato (GOTO et al., 1978) ou por aumento do potencial de repouso, resultado de uma parcial despolarização da célula efetora, o que ocorre em ducto deferente de cobaia (FLEMING et al., 1975). Estudos de “binding” mostraram uma diminuição da quantidade e da atividade da bomba Na+/K+ ATPase, o que poderia justificar essas alterações de excitabilidade da membrana, facilitando a despolarização celular (GERTHOFFER et al., 1979; HERSHMAN et al., 1993; QUINTAS et al., 2000). Alterações intracelulares em mecanismos relacionados à homeostase de cálcio que facilitariam a contração muscular também foram descritos. Foi mostrada, após a desnervação cirúrgica do ducto deferente, uma diminuição na recaptação do Ca2+ para o retículo endoplasmático (DE MORAIS, 1976; QUINTAS et al., 2005). Após a simpatectomia, foi detectado aumento nos níveis de proteína cinase C (PKC), segundo mensageiro bastante importante na mobilização do Ca2+ (ABRAHAM et al., 2003). Outras investigações mostraram que, após a desnervação pósganglionar do ducto deferente de ratos, o número de canais de comunicação entre células (gap junctions) são duas vezes maiores, sendo que o aumento do acoplamento célula à célula facilitaria o sincronismo da contração, aumentando o do efeito máximo de agonistas (WESTFALL et al., 1977). Como dito, a supersensibilidade que se observa no ducto deferente ocorre de forma inespecífica. O aumento de resposta foi visto por diferentes autores para vários agonistas.

Introdução 44

Entretanto, a maneira como a supersensibilidade se manifesta e para quais agonistas ela é observada, é assunto relativamente controverso, sendo que conforme o agonista em estudo enquanto alguns autores relatam aumento de resposta, outros não observam a supersensibilidade (CAMPOS et al., 2003; CORDELLINI & SANNOMIYA, 1999). Diferenças metodológicas poderiam estar relacionadas a essas discrepâncias, como, por exemplo, a composição da solução nutritiva contida no banho de imersão do órgão (SANNOMIYA & DE MORAIS, 1981b). O desenvolvimento da desnervação pode ser analisado por métodos bioquímicos, histológicos ou funcionais. Dosagens de catecolaminas e estudos histológicos são importantes parâmetros para caracterizar a desnervação (KASUYA, et al., 1969; BIRMINGHAM, 1970; WESTFALL et al., 1975). A análise funcional do tecido é outro método de caracterização bastante empregado. Nesse sentido, a ocorrência ou não da desnervação pode ser vista de modo indireto pela resposta do tecido a drogas e processos que estimulem a liberação de mediadores dos terminais nervosos, como a estimulação elétrica ou o uso do agonista adrenérgico indireto, a tiramina. A estimulação elétrica desencadeia o processo de exocitose, levando à liberação de noradrenalina e ATP, em proporções que vão depender da freqüência de estimulação e da fase de resposta considerada. Em altas freqüências, a resposta fásica inicial é mediada preferencialmente por ATP e a resposta tônica, por noradrenalina. A tiramina, ao sofrer o processo de captação neuronal pelo captador de catecolaminas, acarreta a liberação de noradrenalina, sendo portanto, um processo não exocitótico, com liberação unicamente de noradrenalina. A ausência de resposta a esses mecanismos liberadores de neurotransmissores é uma confirmação da ausência neuronal e portanto, de desnervação do tecido. Da mesma forma, a ocorrência de supersensibilidade a agonistas que atuem sobre a musculatura lisa também é indicativo de desnervação. A grande maioria dos estudos sobre desnervação cirúrgica do ducto deferente levou em consideração períodos de desnervação relativamente curtos. Nesses trabalhos, é indiscutível que por volta de 7 a 14 dias após a cirurgia, a desnervação atingia seu ponto máximo. Entretanto, são poucos os trabalhos mais detalhados sobre o decurso temporal da desnervação por longos períodos, nos quais seriam consideradas também a reinervação do tecido. Em metodologia de desnervação por transplante, em que o ducto deferente era implantado na parede do ceco, Jurkiewicz e colaboradores (1991) fizeram um estudo mais detalhado, acompanhando a reinervação do tecido por cerca de 130 dias. O estado de inervação do tecido foi analisado pelos níveis de noradrenalina no tecido, e por método funcional, sendo analisada a capacidade de liberação do transmissor pela tiramina, e as

Introdução 45

características da supersensibilidade do tecido. Foi observado que alguns parâmetros eram revertidos após 130 dias, como por exemplo, o deslocamento das curvas do agonista adrenérgico para esquerda (que indica presença de supersensibilidade), enquanto outros parâmetros, como os teores de noradrenalina no tecido ou a resposta à tiramina, eram somente parcialmente recuperados. Outro estudo mais prolongado sobre a recuperação da inervação do ducto deferente foi realizado por Freitas (2004), que analisaram os teores de noradrenalina no tecido, medidos por método cromatográfico, por 84 dias após desnervação cirúrgica. Os menores níveis de noradrenalina foram observados entre o 4º e 7º dia após a desnervação, sendo que no 28º dia havia recuperação dos níveis a valores semelhantes aos observados em ductos deferentes não desnervados. Apesar de ser um tecido rico em NGF, existem poucos estudos, no ducto deferente, sobre manipulações farmacológicas que pudessem interferir na reinervação do tecido. Em relação à capacidade de antidepressivos modificarem a reinervação do ducto deferente, ao nosso conhecimento não existe relatos na literatura a esse respeito. E um estudo nesse sentido poderia ser útil para formular novas possibilidades terapêuticas para a recuperação de doenças, disfunções e lesões do sistema nervoso periférico. Nesse contexto, uma última observação vem a ser de especial importância para a fundamentação da pergunta científica desta tese. O termo “reinervação do tecido”, utilizado no parágrafo anterior deverá ser considerado em uma dimensão mais abrangente, envolvendo tanto os aspectos pré-sinápticos, como alterações plásticas pós-sinápticas que em conjunto contribuem para a reabilitação da função. Com efeito, além das importantes alterações présinápticas, destacadas com ênfase nesta Introdução, as neurotrofinas ou drogas que potencializam seus efeitos (DUCHEMIN et al., 2002; RABIN et al., 2002) são capazes de modificar de forma dramática processos plásticos pós-sinápticos, incluindo a supersensibilidade pós-sináptica que ocorre como conseqüência da desnervação mecânica ou farmacológica (SCHRÖDER et al., 1994; VITAL et al., 1995; PERRY et al., 2004).

OBJETIVOS

Objetivos 47

OBJETIVOS
A evolução do conhecimento sobre o mecanismo de ação dos antidepressivos, mencionada no capítulo de Introdução desta tese, mostrou a capacidade de essas drogas favorecerem a sobrevivência e a regeneração neuronal no sistema nervoso central. Entretanto, muito pouca informação se tem a respeito de um possível efeito dos antidepressivos na reabilitação do nervo periférico. Nosso objetivo, portanto, foi verificar se o tratamento prolongado com diferentes drogas antidepressivas seria capaz de facilitar a reinervação tecidual que normalmente se observa após a desnervação cirúrgica do ducto deferente de rato.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Os objetivos específicos foram analisar o padrão de desnervação e reinervação de ductos deferentes de ratos tratados cronicamente com os antidepressivos fluoxetina, desipramina ou imipramina. O estado de inervação do tecido foi analisado por: - métodos funcionais: pela análise da resposta do tecido a agentes liberadores de neurotransmissores, como tiramina e estimulação elétrica e pela análise do grau de supersensibilidade do tecido em diferentes períodos após a desnervação cirúrgica. - métodos bioquímicos: pela quantificação de monoaminas pela técnica de detecção eletroquímica de noradrenalina e serotonina no tecido em diferentes períodos após a desnervação cirúrgica.

MATERIAIS E MÉTODOS

Material e Métodos 49

1 - NORMAS E LOCAIS DE EXPERIMENTAÇÃO Foram respeitadas as normas técnicas e bioéticas da UNIFESP/EPM (Universidade Federal de São Paulo – antiga Escola Paulista de Medicina). O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética da UNIFESP sob o nº. 1080/02. Os experimentos foram realizados no setor de Neurotransmissores do Departamento de Farmacologia da UNIFESP e no Laboratório de Farmacologia do Instituto Butantan. 2 - ANIMAIS Foram utilizados ratos Wistar machos da colônia 2BAW com em média 4 a 5 meses de idade e peso ao redor de 350g. Os ratos foram obtidos do Biotério do Departamento de Farmacologia da UNIFESP/EPM, mantidos em ambiente controlado (temperatura entre 23ºC a 25ºC, ciclo de 12/12 horas claro/escuro), recebendo água e alimento ad libitum. Os animais foram tratados ou não com diferentes antidepressivos e tiveram seus ductos deferentes desnervados cirurgicamente ou não. 3 - TRATAMENTO DOS ANIMAIS 3.1 - Tratamento crônico Os animais foram tratados com injeções diárias intraperitoneais (i.p.), de 10 mg/kg dos antidepressivos: fluoxetina (inibidor seletivo da recaptação de serotonina); desipramina (inibidor seletivo da recaptação de noradrenalina) e imipramina (inibidor não seletivo da recaptação de serotonina e noradrenalina). Foram também tratados ratos controles, para cada grupo de antidepressivo usado, os quais receberam o veículo salina (NaCl 9%), em volume correspondente ao do tratamento com o antidepressivo. Todos os tratamentos foram realizados no período da manhã entre as 09h00min e 11h00min. O tratamento foi iniciado 11 dias antes da cirurgia de desnervação ou falsa-operação perdurando até 24 horas antes da eutanásia dos animais.

Material e Métodos 50

3.2 - Tratamento agudo Para o estudo do efeito agudo do antidepressivo fluoxetina, os animais foram tratados de modo semelhante ao tratamento crônico, ou seja, injeções diárias com início 11 dias antes da cirurgia de desnervação ou falsa-operação até o dia da eutanásia dos animais. Entretanto, do início do tratamento até 48h antes da eutanásia, todos os animais receberam somente salina. Na 24a h antes da eutanásia os animais foram divididos em dois grupos, sendo que um deles recebeu novamente salina e o outro, uma dose única de 10 mg/kg de fluoxetina. 4 - DESNERVAÇÃO CIRÚRGICA A desnervação pós-ganglionar foi realizada de acordo com a técnica de Kasuya et al. (1969). A inervação do ducto deferente, assim como sua irrigação sanguínea, chega ao tecido pela região prostática (como descrito na introdução) e consiste de vários neurônios pósganglionares provenientes do plexo pélvico. Segundo essa técnica, a desnervação consiste em separar, na região prostática do tecido, a serosa que está ligada ao ducto deferente, uma vez que aí estão os terminais nervosos que chegam ao tecido. A técnica para a realização da desnervação está descrita resumidamente a seguir. Os animais foram anestesiados por inalação de éter etílico, aguardando-se a perda dos reflexos corneano para iniciar o ato operatório. Após a fixação do animal pelos quatros membros em decúbito dorsal e feita a assepsia da região abdominal com álcool iodado (iodo 2% diluído em álcool 70%), foi realizada uma incisão longitudinal de cerca de 3 cm seguindo a linha alba da cavidade supra púbica. Em seguida a vesícula seminal foi localizada e com a ajuda de uma pinça foi puxado o tecido adiposo anexo ao órgão, sendo então, retirados da bolsa escrotal parte dos órgãos sexuais, como o ducto deferente e o testículo. A parte prostática do ducto deferente foi localizada, e posicionada de maneira adequada para sofrer o processo de desnervação. A partir da extremidade prostática do ducto deferente foi introduzida cuidadosamente uma pinça cirúrgica entre a camada serosa e o tecido muscular (figura 3, flecha azul) e lentamente a camada serosa foi sendo separada do tecido ao longo de cerca de 1 cm, em direção à região epididimal. Durante esse processo, um rigoroso cuidado foi tomado para não lesar tanto a artéria quanto a musculatura do ducto deferente. Em seguida foi aplicada uma solução de fenol (1%) embebido em um chumaço de algodão em volta da terminação prostática.

Material e Métodos 51

Figura 3 – Ilustração da terminação prostática do ducto deferente. VD - vaso deferente; HN - nervo hipogástrico, PP - plexo pélvico; SV - vesícula seminal; VA – artéria; UB – bexiga; R – reto. A flecha azul indica a região onde é realizada a desnervação. Adaptado a partir de Kasuya et al.,
1969.

Por fim o testículo foi recolocado na bolsa escrotal e o vaso deferente na cavidade abdominal. O rato foi suturado e novamente submetido à assepsia com álcool iodado. O processo de desnervação foi realizado em ambos os ductos deferentes. Além do grupo desnervados, foi obtido o grupo falso-operado, no qual os procedimentos foram semelhantes aos empregados na desnervação, sendo que o ducto deferente foi apenas exposto, sem, entretanto, ser feita a desnervação do tecido. Após a cirurgia, os animais foram mantidos em condições ideais de alojamento até o dia da eutanásia. Esse período foi variável conforme os protocolos empregados. Em um grupo inicial de caracterização da desnervação e da reinervação do tecido, os animais foram sacrificados 2, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias após a cirurgia. Para os estudos com os antidepressivos, os períodos foram de 7, 21 e 28 dias.

5 - GRUPOS EXPERIMENTAIS 5.1 - Caracterização do padrão de desnervação e reinervação Para a caracterização inicial do padrão temporal de desnervação e reinervação do ducto deferente, os animais não obtiveram tratamento algum, mas tiveram seus deferentes desnervados ou falso operados, tendo sido os animais divididos em dois grupos:

Material e Métodos 52

- animais falso-operados - animais desnervados Ambos os grupos foram submetidos à eutanásia 2, 7, 14, 28, 35 e 42 dias após a cirurgia, para a retirada e estudo dos respectivos ductos deferentes. 5.2 - Animais tratados com antidepressivos Para o estudo dos efeitos do tratamento com antidepressivos sobre o padrão temporal de desnervação e reinervação dos ductos deferentes, foram selecionados três períodos de tempo após a cirurgia: 7, 21, e 28 dias. Após esses períodos, os animais foram eutanasiados para retirada e estudo dos ductos deferentes. Dessa forma, conforme o tipo de tratamento e conforme o tipo de cirurgia sofrida (desnervação ou falsa-operação) os seguintes grupos foram formados: - animais tratados com veículo e falso-operados - animais tratados com veículo e desnervados - animais tratados com antidepressivo e falso-operados - animais tratados com antidepressivos e desnervados

A figura 4 exemplifica o esquema empregado para os diferentes grupos.

Figura 4 – Esquema do protocolo de tratamento e cirurgia empregado para o estudo com os antidepressivos.

Material e Métodos 53

Para o estudo do efeito de tratamento agudo com fluoxetina, os mesmos grupos foram obtidos e os períodos de tempo escolhidos foram de 7 e 28 dias após cirurgia dos animais. 6 – EXPERIMENTOS DE CONTRAÇÃO MUSCULAR in vitro Após o período adequado de tratamento e desnervação (ou falsa operação), os animais foram eutanasiados para a retirada dos ductos deferentes e estudo da contração muscular in vitro. 6.1 - Isolamento dos ductos deferentes A eutanásia dos animais foi feita por superdosagem de éter, 24 horas após a última injeção de salina ou do antidepressivo em estudo (fluoxetina, desipramina ou imipramina). Foi realizada uma incisão abdominal que permitia a remoção dos ductos deferentes. Estes, uma vez retirados, tiveram seus tecidos adjacentes separados e a luz lavada com o líquido nutritivo com a ajuda de uma seringa e agulha. Os ductos deferentes foram usados em sua forma integral em todos os experimentos realizados. 6.2 - Solução nutritiva Foi utilizado o Líquido Nutritivo de Vesícula que consiste em um Tyrode modificado com a seguinte composição (mM) NaCl 138,0; KCl 5,7; CaCl2 1,8; NaHCO3 15,0; NaH2PO4 0,36; NaHCO3 15 e glicose 5,5 diluídos em água destilada e pH entre 7,2 e 7,6 ajustado com HCl 0,1N (PICARELLI et al., 1962). 6.3 - Aparelhagem e montagem da preparação Para o estudo da contração muscular, a aparelhagem utilizada foi uma cuba de vidro com dupla parede onde internamente localizava-se a câmara muscular com capacidade para 10mL e uma serpentina helicoidal que fornecia solução nutritiva à câmara muscular. Uma bomba de circulação impulsionava água aquecida à 30ºC pelo lado externo da câmara, aquecendo a serpentina e a câmara muscular. A solução nutritiva era aerada por meio de uma bomba de aeração ligada a uma haste de vidro. O ducto deferente era montado na câmara muscular, fixando-se, por meio de um fio de algodão, uma extremidade na terminação “S” da

Material e Métodos 54

haste da aeração sendo a outra extremidade ligada a uma alavanca de registro isotônico ou a um transdutor isométrico (UGO BASILE® MOD. 7080) sendo submetido a uma tensão de 1g. Para os estudos envolvendo estimulação elétrica, dois eletrodos de platina, acoplados a um estimulador Grass S88, foram adaptados à câmara muscular, paralelamente ao ducto deferente. As contrações isométricas do ducto deferente foram registradas com o auxílio de fisiógrafo UGO BASILE® (MOD. GEMINI 7070). 6.4. – Protocolos experimentais Uma vez ajustado à aparelhagem, o ducto deferente era deixado em repouso por cerca de 45 minutos, sendo lavado a cada 15 minutos para a estabilização da preparação. Em alguns protocolos, após o período de estabilização, era inicialmente adicionada ao banho, uma concentração única máxima de cloreto de bário (10-2 M) para servir de referência como efeito máximo da preparação (JURKIEWICZ et al., 1969). Em seguida, foram iniciados os diferentes protocolos experimentais. 6.4.1 – Estudo da capacidade de liberação de neurotransmissores Foi testada a capacidade do tecido de liberar neurotransmissores, o que indicaria o estado de inervação do tecido. O estudo da capacidade de neuroliberação de transmissores foi feito com o uso de tiramina, droga que acarreta liberação de noradrenalina dos terminais nervosos e pela estimulação elétrica do tecido. Contrações isométricas induzidas por concentração única de tiramina Após o período de estabilização da preparação, foi adicionada ao banho tiramina em concentração única de 10-4M. A contração foi registrada até ser atingido o efeito máximo, sendo a preparação lavada em seguida. A amplitude da contração induzida pela tiramina foi medida em gramas de tensão ou em porcentagem, tendo como valor de referência 100% a contração máxima induzida pelo cloreto de bário (10-2 M). Contrações isométricas induzidas por estimulação elétrica Os ductos deferentes foram estimulados eletricamente a uma voltagem supramáxima, de 50 V com 3 ms de duração, nas freqüências de 0,05, 1, 5, 10 e 20 Hz, parâmetros esses que estimulam somente o tecido neuronal. A contração causada por cada freqüência foi registrada

Material e Métodos 55

por 30 segundos, com 10 minutos de intervalo entre os estímulos. A figura 5 mostra um registro típico das contrações obtidas nessas freqüências. A contração obtida com a freqüência de 0,05 Hz se apresenta na forma de ‘twitches’ (contrações rápidas, fásicas). Com freqüências mais altas (1, 5, 10, 20 Hz) a contração se torna mais intensa e com característica bifásica, com um componente rápido inicial (contração fásica) seguido de um componente tônico de instalação mais lenta. A figura mostra também, com finalidade de comparação, a resposta por cloreto de bario (10-2 M). A amplitude da contração obtida para cada freqüência foi medida em gramas de tensão. Para as freqüências a partir de 1Hz foi considerado para análise dos resultados o componente fásico da contração.

FIGURA 5 – Registro típico da contração do ducto deferente de rato, induzida pela estimulação elétrica em freqüências crescentes (50V, 3ms).

6.4.2 – Estudo da reatividade de receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos Curva concentração-efeito cumulativa inibitória de clonidina A reatividade de receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos foi estudada pela análise da inibição promovida pela clonidina, agonista desse tipo de receptor, da contração induzida por estímulo elétrico. Para isso, foram induzidas contrações isométricas por estimulação elétrica de baixa freqüência (0,05 Hz, duração de 3 ms, 50V). Nesses parâmetros de estimulação ocorrem contrações fásicas conhecidas como “twitches”. Após a estabilização dos “twitches”

Material e Métodos 56

era iniciada curva concentração-efeito cumulativa inibitória de clonidina (figura 6). Somente uma curva era realizada por preparação. A clonidina foi usada na faixa de dose com seletividade α2-adrenérgica. Esses experimentos só foram realizados nos grupos falsooperados, pois nos desnervados, devido à falta de inervação, a resposta à estimulação elétrica nesses parâmetros, era inexistente ou muito irregular para permitir esse tipo de estudo. A medida da resposta da clonidina foi feita em gramas de tensão e passada para porcentagem tendo com valor 100% a amplitude dos “twiches” imediatamente anterior à adição da primeira concentração de clonidina.

FIGURA 6 – Registro típico de curva concentração-efeito cumulativa de clonidina obtida sobre contrações induzidas por estimulação elétrica (0,05 Hz, 50 V, 3 ms) em ducto deferente de rato.

6.4.3 – Estudo da reatividade pós-sinaptica Curva concentração-efeito cumulativa de fenilefrina Foram efetuadas curvas concentração-efeito cumulativas de fenilefrina (agonista seletivo para α1-adrenoceptores) segundo a técnica de van Rossum (1963). Após ser atingido o efeito máximo do agonista, a preparação era lavada com líquido nutritivo e deixada em repouso por 30 minutos quando então era iniciada uma nova curva. Em cada preparação foram realizadas no máximo 3 curvas concentração-efeito, sendo que a última curva foi considerada para análise dos resultados. A amplitude da contração induzida por cada concentração de fenilefrina foi medida em gramas de tensão.

Material e Métodos 57

Concentração única de ATP Após as curvas concentração-efeito cumulativas de fenilefrina, foi testada concentração única do agonista ATP (10-4 M). Para isso, a concentração escolhida era adicionada ao banho e deixada em contato com a preparação até ser atingido o efeito máximo. Em seguida a preparação era lavada e 30 minutos após, novo estímulo, com a mesma concentração era dado. Em cada preparação esse procedimento foi repetido de 2 a 3 vezes, sendo o último estímulo com ATP considerado para análise da resposta. A amplitude da contração foi medida em gramas de tensão. 6.4.4 – Estudo do efeito dos antidepressivos in vitro Foi analisada a capacidade de inibição da recaptação neuronal de noradrenalina, induzida in vitro, pelos antidepressivos em estudo (fluoxetina, desipramina e imipramina). Esse estudo foi realizado em ducto deferente de animais não tratados e não operados. Após a estabilização da preparação, foram realizadas duas a três curvas de noradrenalina, com 30 minutos de intervalo entre elas. Em seguida, após a realização da terceira curva de noradrenalina, foi adicionada ao banho, uma concentração única do antidepressivo em estudo, o qual permaneceu incubado por 30 minutos. Passado esse tempo e ainda na presença do antidepressivo foi realizada nova curva de noradrenalina. O mesmo procedimento foi repetido para mais uma concentração do antidepressivo. A amplitude de contração obtida com cada concentração do agonista foi medida em gramas de tensão e transformadas para porcentagem, tendo como valor 100% o efeito máximo da curva concentração-efeito considerada como controle (curva imediatamente anterior à primeira adição do antidepressivo). 6.5. - Parâmetros Farmacológicos Os diferentes parâmetros farmacológicos foram conseguidos diretamente a partir das medidas das contrações obtidas segundo os diferentes protocolos ou a partir de gráficos construídos com essas medidas. Os parâmetros considerados foram: Efeito máximo (Emax) O efeito máximo atingido por concentrações únicas ou pela curva concentração-efeito dos diferentes agonistas estudados foi conseguido diretamente a partir das medidas realizadas.

Material e Métodos 58

Afinidade aparente do agonista (pD2) O parâmetro pD2 por definição representa o valor negativo do logaritmo da concentração do agonista que produz 50% do efeito máximo (ED50) de curvas concentraçãoefeito cumulativas, segundo a fórmula (ARIËNS, 1954): pD2= -log de ED50 Quando o efeito do agonista era inibitório foi considerado o parâmetro farmacológico pIC50, que representa o logaritmo negativo da concentração molar do agonista que promove 50% da inibição máxima. Esses parâmetros foram obtidos a partir de curvas concentração-efeito cumulativas do agonista, pelo programa Graph Pad Prisma® 3.0. Deslocamento (D) Este parâmetro indica a diferença entre valores de pD2 obtidos entre curvas concentração-efeito cumulativas de agonista, após e antes um determinado tratamento. O D foi calculado, para cada experimento, de acordo com a seguinte fórmula: D = pD2 depois - pD2 antes

7 - QUANTIFICAÇÃO DOS NÍVEIS DE NORADRENALINA PRESENTES NO TECIDO POR MEIO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE (HPLC) 7.1 - Processamento do ducto deferente A quantificação de noradrenalina presente no ducto deferente foi realizada em grupos de animais desnervados e falso-operados, tratados cronicamente com fluoxetina ou salina. Os animais passaram por eutanásia 7, 21 e 28 dias após a cirurgia para a retirada e processamento dos órgãos conforme descrito abaixo. Após a eutanásia por superdosagem de éter, a parede abdominal foi aberta e os ductos deferentes foram expostos, retirados e colocados em um recipiente com solução nutritiva. Em seguida foi realizada a limpeza externa dos órgãos, sendo os tecidos conectivos, a gordura e

Material e Métodos 59

os vasos adjacentes retirados com o auxilio de uma pinça e uma tesoura. A limpeza interna do órgão foi realiza pela passagem de solução nutritiva pela sua luz. Feita a limpeza, os ductos deferentes foram colocados individualmente em tubos de ensaio contendo 10mL de solução nutritiva, sendo mantidos a 37ºC com aeração constante de carbogênio (mistura de 95% de O2 e 5% de CO2) por 60 minutos. Passados os 60 minutos, os ductos deferentes foram retirados dos tubos, pesados e colocados em tubos contendo 3,0 mL de ácido perclórico (0,1 M), 0,02% de metabissulfito de sódio e 0.02% de EDTA. A seguir, foram processados por 30 segundos em um homogeneizador de tecido do tipo turrex. Durante todo o procedimento as amostras foram mantidas no gelo para evitar a degradação das aminas. Após a homogeneização, as amostras foram submetidas à centrifugação por 45 minutos, a 14.000 rpm, (15.338 g) à temperatura de 4ºC em centrifuga (SORVAL®). O sobrenadante resultante da centrifugação foi filtrado em filtro de seringa (MILLIPORE®) de 0,22 μm e separado em duas alíquotas para a quantificação de aminas. As amostras foram guardadas em freezer –80ºC até serem injetadas em HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência). Todos os reagentes usados para análise em HPLC foram diluídos em água ultra pura (Mili-Q) 7.2 - Separação e quantificação das aminas e seus metabólitos As amostras foram separadas e quantificadas por meio de um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência, (HPLC, Shimadzu®), utilizando-se uma coluna Chromolith RP-18e (Merck®), sendo detectadas por um detector eletroquímico (1049 A, Hewlett Packard) com tensão de 0,650 voltz. O sistema de HPLC foi controlado por um computador acoplado ao sistema, com auxílio de um programa específico (Software Class VP®, versão 5.032) que realizou o registro e a análise dos dados. A fase móvel da cromatografia utilizada foi composta por Na2HPO4.H2O (13,4 g/l), EDTA (0,372 g/l), ácido 1-heptanossulfônico (0,320 g/l), ácido cítrico (10,5 g/l) g/l, metanol (100 ml) e pH 3,0. Diferentes concentrações conhecidas (5 ρM, 3 ρM e 1 ρM) de noradrenalina e serotonina (5-HT) serviram como padrão do perfil cromatográfico. Em seguida, as amostras foram submetidas à análise. A regressão linear da curva padrão foi utilizada para os cálculos das concentrações das aminas nas amostras em razão do peso em mg das amostras. Foram calculadas as médias das áreas dos picos de cada concentração utilizada, sendo construída uma curva da concentração dos padrões em função da área obtida em cada concentração.

Material e Métodos 60

8 - ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média. As diferenças de médias dos resultados obtidos foram comparadas pela análise de variância Kruskal Wallis, seguida pelo teste “U” de Mann-Whitney quando os dados se mostravam não paramétricos (teste de Levine). Quando os dados se revelaram paramétricos, utilizou-se a análise de variância (ANOVA), seguidado teste de Tukey, o teste “t” de Student para amostras paramétricas de amostras pareadas e não pareadas. A probabilidade de p≤0,05 foi considerada estatisticamente significante. 9 – DROGAS E REAGENTES ácido cítrico (C6H8O7 ⋅ 8H2O) – Merck®, Brasil ácido clorídrico (HCl) – Merck®, Brasil ácido heptano 1-sulfônico (C7H15NaO3S) – Mallinckrodt Baker®, USA ácido perclórico (HClO4) – Merck® adenosina 5, trifosfato (ATP - C10H16N5O13P3) – Sigma Chem. Co. ® USA bicarbonato de sódio (NaHCO3) – Merck®, Brasil clonidina (C9H9Cl2N3⋅HCl) - Sigma Chem. Co. ®USA cloreto de bário (BaCl2) – Merck®, Brasil cloreto de cálcio (CaCl2) – Merck, ® Brasil cloreto de potássio (KCl) – Merck®, Brasil cloreto de sódio (NaCl) – Merck®, Brasil desipramina (C18H22N2 ⋅ HCl) - Sigma Chem®. Co. USA etilanodinitrilo (EDTA- C10H14Na2O8 ⋅ 2H2O) – Merck®, Alemanha fenilefrina (C9H13NO2 ⋅ HCl)- RBI® fenol (C6H5OH) – Merck®, Brasil fluoxetina (C17H18F3NO ⋅ HCl) – Eurofarma® e Farmasa® fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4 ⋅ 2H2O) – Merck®, Brasil fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4 ⋅ H2O)– Merck®, Brasil glicose (C6H12O6) – Labsynth LTDA®, Brasil imipramina (C19H24N2 ⋅ CIH) - Sigma Chem. ® Co. USA

Material e Métodos 61

metabissulfito de sódio (Na2O5S2) – Merk®, USA. metanol (CH3OH)- Mallinckrodt Baker®, USA noradrenalina: -(+)-arterenol chloride (C8H11NO3 ⋅ HCl) - Sigma Chem®. Co. USA serotonina (5-hidroxtriptamina - N2OC10H12) – Aldrich Chem®. tiramina (C8H11NO ⋅ HCl) - Sigma Chem®. Co. USA

RESULTADOS

Resultados 63

1- DESNERVAÇÃO CIRÚRGICA

Foi realizada uma caracterização inicial do comportamento do ducto deferente desnervado cirurgicamente ou falso-operado em animais que não sofreram nenhum tipo de tratamento farmacológico. Com o intuito de analisar o grau de desnervação e de reinervação do tecido, foi estudada a capacidade de neuroliberação em diferentes períodos após a cirurgia.

1.1 - Análises da neurotransmissão O estudo da viabilidade ou não da neurotransmissão foi feito pela análise de capacidade de indução de liberação de neurotransmissores por tiramina ou por estimulação elétrica nervosa do ducto deferente de rato. Resposta à tiramina A tiramina é um agonista adrenérgico indireto que causa contração devido à liberação de noradrenalina dos terminais nervosos. Em ductos deferentes de ratos não desnervados, essa contração corresponde a um valor máximo de cerca de 60 % a 70 % da amplitude de contração máxima causada pelo cloreto de bário (BaCl2), que é um dos agentes que causa contração de maior amplitude nesse tecido (JURKIEWICZ et al., 1969). A figura 7 mostra a amplitude de contração causada por 10-4M de tiramina em ductos deferente obtidos de animais falso-operados ou desnervados após 2, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias das cirurgias. Nos grupos falso-operados a resposta à tiramina foi semelhante nos sete períodos de tempo estudados. Já nos grupos desnervados, em todos os períodos a resposta à tiramina, como esperado, foi estatisticamente menor quando comparada ao seu respectivo grupo falso-operado. Essa queda na amplitude de contração foi menos acentuada no 2º dia e mais evidente no 7º dia após a cirurgia, o que indicaria desnervação máxima por volta do 7º dia. Nos períodos de 14, 21, 28, 35 e 42 dias ocorreu gradual recuperação da resposta sendo, entretanto, esse aumento de resposta estatisticamente significante somente nos dias 35 e 42, quando comparado ao 7º dia. Os valores obtidos a partir desses experimentos estão mostrados na tabela 1.

Resultados 64

tiramina
contração em relação ao BaCl2 (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 dias
falso operado desnervado

#

*

#

#

*
7 dias

*

*

*

*

*

14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias

FIGURA 7 - Histograma representando o efeito máximo causado por concentração única de tiramina (10-4 M) em ductos deferentes desnervados por 2, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias e em seus respectivos grupos controles falso-operados. Cada barra representa a média ± epm de 10 a 15 experimentos. A amplitude de contração foi medida em porcentagem em relação ao efeito máximo obtido com concentração única de BaCl2 (10-2 M). * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05) (ANOVA seguida de teste de TUKEY)

TABELA 1 – Valores do efeito máximo obtido por concentração única de tiramina (10-4 M) em animais desnervados por 2, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias e seus respectivos controles falsooperados. A amplitude de contração foi calculada em porcentagem em relação à resposta de BaCl2 (10-2 M). Cada valor representa a média ± epm de 10 a 15 experimentos. *estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05) (ANOVA seguida de teste de TUKEY) Tiramina - 10-4 M (Emax - %) 2 dias falso-operado desnervado
67,57±6,99 38,94±3,80*
#

7 dias
61,26±4,97

14 dias
61,35±3,15

21 dias
68,69±5,27

28 dias
61,69±3,63

35 dias
68,55±3,78

42 dias
65,42±3,12 13,11±2,58*
#

1,71±0,48* 4,85±1,70* 5,91±1,06* 6,93±1,73* 11,87±2,92*#

Resultados 65

Resposta à estimulação elétrica

A estimulação elétrica do ducto deferente, nos parâmetros selecionados (50V, 3ms e freqüências de 0,05 a 20Hz), causa estimulação somente dos terminais nervosos com conseqüente liberação de neurotransmissores os quais levam à contração do tecido muscular. A contração obtida com a freqüência de 0,05 Hz se apresenta na forma de ‘twitches’ (contrações rápidas, fásicas). Com freqüência mais altas (1, 5, 10, 20 Hz) a contração se torna mais intensa e com característica bifásica (ver materiais e métodos). Ductos deferentes de ratos falso-operados ou desnervados por 7, 14, 21, 28 e 35 dias foram estimulados eletricamente nas freqüências de 0,05, 1, 5, 10 e 20 Hz. A partir desses experimentos, foram construídas curvas de freqüência, onde foram plotadas as amplitudes de contração do componente fásico obtidas nas diferentes freqüências nos diferentes períodos de tempo após a cirurgia (figura 8). A figura 8 mostra, para todos os grupos estudados, o esperado aumento da amplitude de contração muscular conforme o aumento da freqüência de estimulação elétrica. Considerando-se os grupos falso-operados, não foram observadas diferenças estatísticas, para cada freqüência, entre os cinco períodos de tempo estudados. Em todos os grupos desnervados, observou-se uma diminuição da amplitude da contração nas diferentes freqüências testadas, quando comparada aos respectivos grupos falso-operados. No grupo de animais estudados 7 dias após desnervação, a diminuição da contração foi bastante intensa, sendo que nos grupos 14, 21, 28 e 35 dias observou-se um gradual aumento da amplitude de contração para cada freqüências analisada, indicando tendência à recuperação da capacidade de neuroliberação do ducto deferente.

Resultados 66

Curva de freqüência (fásica)
6 5 contração (g) 4 3 2 1 0 0,05 1 5 10 freqüência (Hz) 20 F - 7 dias F - 14 dias F - 21 dias F - 28 dias F - 35 dias D - 7 dias D - 14 dias D - 21 dias D - 28 dias D - 35 dias

FIGURA 8 – Amplitude da contração fásica induzida por estimulação elétrica (50V, 3ms) em freqüências crescentes, em ducto deferente de animais falso-operados (F) ou desnervados (D) e testados após 7, 14, 21, 28 e 35 dias. Cada ponto representa média ± e.p.m. de 5 a 8 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g).

Em freqüências mais baixas, principalmente nos grupos desnervados por tempos mais curtos quando a desnervação está no seu ponto mais intenso, as respostas são mais irregulares e de difícil mensuração. Portanto, para uma melhor visualização das respostas, a figura 9 mostra, em uma representação na forma de histograma, os mesmos resultados apresentados na figura 8, considerando-se, entretanto, somente as freqüências mais altas de estimulação, de 10 Hz (A) e 20 Hz (B). A figura mostra que as contrações obtidas para todos os grupos desnervados foram estatisticamente diferentes das obtidas em seus respectivos controles falsooperados e que, quando comparados ao grupo 7 dias, a recuperação da resposta nos grupos desnervados passa a ser estatisticamente significante a partir do 21º dia.

Resultados 67

A
6 5 contração (g) 4 3 2 1

10 Hz
falso operado desnervado

# #

#

*

*

* * *

0 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias

B
6 5 contração (g) 4

20 Hz
falso operado desnervado

#

#

3
#

* * * *
7 dias 14 dias 21 dias 28 dias

*

2 1 0

35 dias

FIGURA 9 – Histograma representando a amplitude das contrações fásicas induzidas por estimulação elétrica (50V, 3ms) nas freqüências de 10 (A) e 20 (B) Hz em ductos deferentes de animais falso-operados ou desnervados usados nos experimentos após 7, 14, 21, 28 e 35 dias. Cada barra representa a média ± epm de 5 a 8 experimentos. * estatisticamente diferente do respectivo falso-operado, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05) (ANOVA seguida de teste de TUKEY)

Resultados 68

2 - ESTUDO COM ANTIDEPRESSIVOS A partir da caracterização inicial sobre a resposta do ducto deferente de rato após diferentes períodos de desnervação em animais não tratados, foram selecionados os períodos de 7, 21 e 28 dias para o estudo do tratamento crônico com diferentes drogas antidepressivas. As drogas escolhidas foram fluoxetina, desipramina e imipramina, as quais são classificadas como inibidoras da recaptação neuronal de monoaminas. 2.1 - Efeito dos antidepressivos sobre o mecanismo de recaptação neuronal no ducto deferente in vitro Antes da realização dos estudos de tratamento crônico com esses antidepressivos, foram realizados experimentos controle para verificar a capacidade dessas drogas de inibir a recaptação neuronal no ducto deferente de rato. Para isso, os antidepressivos foram adicionados, in vitro, à preparação de ducto deferente de ratos normais, não operados, 30 minutos antes da realização de curva concentração-efeito cumulativa do agonista αadrenérgico, a noradrenalina. A figura 10 mostra que as três drogas causaram deslocamento da curva de noradrenalina para esquerda, o que seria esperado de uma droga inibidora da recaptação neuronal dessa catecolamina. Observa-se também, que para deslocamentos semelhantes foram necessárias concentrações mais altas de fluoxetina em relação às usadas com imipramina e desipramina, o que é compatível com o fato de que a imipramina e desipramina são mais seletivas em inibir a recaptação de noradrenalina, do que a fluoxetina, a qual é mais seletiva pelo captador de serotonina. O deslocamento da curva, (obtido pela diferença de pD2 da curva na presença em relação à curva na ausência do inibidor) para a maior concentração de fluoxetina usada (10-5M), foi de 0,56 ± 0,09 unidades logarítmicas (pD2 antes 6,07±0,08 - pD2 após fluoxetina 6,66±0,13, p<0,05). Para desipramina, na concentração de 10-7M, o deslocamento foi de 0,87 ± 0,14 (pD2 antes 6,32±0,07 pD2 após desipramina 7,17±0,09, p<0,05) e para imipramina (10-7M) foi de 0,49 ± 0,07 (pD2 antes 5,85±0,07 pD2 após imipramina, 6,35±0,12, p<0,05).

Resultados 69

A
120 100

FLUOXETINA

% contração

80 60 40 20 0 8 . 7 . 6 . 5 . 4

0 10-6 M 10-5 M

- log [noradrenalina] M

B
120 100 % contração 80 60 40 20 0 8 . 7

DESIPRAMINA

0 10-8 M 10-7 M

.

6

.

5

.

4

- log [noradrenalina] M

C
120 100

IMIPRAMINA

% contração

0
80 60 40 20 0 8 . 7 . 6 . 5 . 4 - log [noradrenalina] M

10-8 M 10-7 M

FIGURA 10 - Curvas concentração-efeito cumulativas de noradrenalina obtidas na ausência ou na presença de fluoxetina (A), desipramina (B) ou imipramina (C). Cada ponto representa a média ± epm de 4 a 7 experimentos.

Resultados 70

3 – FLUOXETINA 3.1 - Tratamento crônico com fluoxetina Os animais foram tratados com fluoxetina (10 mg/kg) ou com o veículo salina por 11 dias antes da cirurgia de desnervação ou da falsa operação, sendo mantido o tratamento até 24 horas antes da eutanásia dos animais, que ocorreu 7, 21 ou 28 dias após a cirurgia. Foram realizados estudos funcionais e bioquímicos. Em relação aos estudos funcionais foram analisadas a capacidade de neuroliberação e a reatividade de receptores pré e pós-sinápticos. Para os estudos bioquímicos foram feitas dosagens do teor de monoaminas no tecido dos diferentes grupos estudados. 3.1.1. Estudos funcionais Análise da Neurotransmissão O estudo da viabilidade da neurotransmissão foi feito pela análise de capacidade de indução de liberação de neurotransmissores por tiramina ou por estimulação elétrica. Resposta à tiramina A figura 11 mostra a amplitude de contração causada pela tiramina (10-4M) nos diferentes grupos estudados, obtidos de animais tratados cronicamente com fluoxetina ou veículo. A tabela 2 mostra os valores obtidos a partir desses experimentos. Nos grupos falso-operados, não foram observadas diferenças estatísticas na resposta da tiramina entre os três períodos de tempo estudados (7, 21 e 28 dias), considerando tanto os grupos tratados com fluoxetina como os tratados com veículo. Todos os grupos desnervados, mostraram uma resposta à tiramina menor quando comparada a seu respectivo grupo falso-operado. Nos grupos desnervados por 28 dias, tratados ou não, houve uma pequena recuperação da resposta, já que a amplitude de contração foi estatisticamente diferente daquela obtida aos 7 ou 21 dias. Ao serem analisadas as conseqüências do tratamento com fluoxetina nos grupos desnervados, observamos que a amplitude de contração, nos grupos tratados com esse antidepressivo nos períodos de 7 e 21 dias, foi maior quando comparada ao seu respectivo grupo desnervado, tratado com veículo, indicando que o tratamento facilitou a contração do ducto deferente de rato.

Resultados 71

TIRAMINA
4

F - veículo F - fluoxetina D - veículo D - fluoxetina

3 contração (g)

2
# # *

1

* *
0
7 dias

*

* *
21 dias

*

*

28 dias

FIGURA 11 - Histograma representando a amplitude de contração, em gramas de tensão (g), causada por concentração única de tiramina (10-4 M) em ductos deferentes falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 e 28 dias obtidos de animais tratados cronicamente com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. Cada barra representa a média ± epm de 4 a 6 experimentos. * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 e 21 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY) TABELA 2 – Valores do efeito máximo (Emax) obtido por tiramina (10-4M) em animais desnervados ou falso-operados por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. Cada valor representa a média ± e.p.m. de 4 a 6 experimentos, expressos em gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 e 21dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY) Tiramina (10-4 M) Emáx (g) Falso-operado 7 dias veículo fluoxetina
2,43±0,18 2,82±0,21

Desnervado 28 dias
2,21±0,41 2,72±0,23

21dias
2,29±0,22 2,43±0,13

7 dias
0,30±0,14* 0,57±0,09**

21dias
0,31±0,05* 0,63±0,09**

28 dias
0,79±0,07*# 1,06±0,06*#

Resultados 72

Resposta à estimulação elétrica

Na figura 12 estão mostradas as amplitudes de contração fásicas induzidas por estimulação elétrica, nas freqüências de 0,05, 1, 5, 10 e 20 Hz nos grupos de animais desnervados e falso-operados tratados cronicamente com fluoxetina ou veículo e utilizados 7 (A), 21 (B) e 28 (C) dias após a cirurgia. A figura 13 mostra os mesmos resultados na forma de histograma, enfocando somente as freqüências mais altas de 10 e 20 Hz, o que permite uma melhor visualização das respostas. Os valores da amplitude de contração obtidos a partir da figura 13 estão mostrados na tabela 3. A análise dos resultados mostrados nas figuras indica que, considerando-se somente os grupos falso-operados, não foram observadas diferenças estatísticas, para cada período de tempo estudado, entre os grupos tratados ou não com fluoxetina, com exceção da resposta a 20 HZ no grupo 28 dias, onde foi observado um aumento da resposta em decorrência do tratamento. Nos grupos desnervados, observou-se que, como esperado, independentemente do tratamento considerado, quando comparada aos respectivos grupos falso-operados, a resposta foi bastante reduzida, sendo que nos grupos desnervados por 7 dias somente foi conseguida resposta, ainda que bem reduzida, em freqüências mais altas. Nos grupos desnervados por 28 dias ocorreu pequena recuperação da resposta, quando feita comparação em relação aos grupos 7 e 21 dias. Ainda em relação aos grupos desnervados, a análise das conseqüências do tratamento crônico com fluoxetina sobre a resposta à estimulação elétrica, mostrou que não houve diferenças estatísticas entre os grupos tratados e não tratados, nos três períodos de tempo estudados, embora nos grupos testados 7 e 21 dias após a desnervação, tenha havido uma tendência a aumento da amplitude de contração nos grupos desnervados tratados com fluoxetina quando comparados com os desnervados tratados com veículo.

Resultados 73

A

6 5 4 3

curva de freqüência 7 dias

contração (g)

F - veículo 2 1 0 0,05 1 5 10 20 freqüência (Hz) F - fluoxetina D - veículo D - fluoxetina

B

6 5 4 3

curva de freqüência 21 dias

contração (g)

F - veículo 2 1 0
0,05 1 5 freqüência (Hz) 10 20

F - fluoxetina D - veículo D - fluoxetina

C
6 5 contração (g) 4 3

curva de freqüência 28 dias

*

F - veículo 2 1 0 0,05 1 5
freqüência (Hz)

F - fluoxetina D - veículo D - fluoxetina

10

20

FIGURA 12 – Amplitude de contração fásica induzida por estimulação elétrica em freqüências crescentes, em ducto deferente de animais falso-operados (F) e desnervados (D) e testados após 7 (A), 21 (B) e 28 (C) dias, tratados cronicamente com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. Os pontos representam média ± e.p.m. de 4 a 6 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

Resultados 74

A
6,0 5,0 contração (g) 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0

10 Hz
F - veículo F - fluoxetina D - veículo D - fluoxetina

#

#

* *

*

*
7 dias

*

*

21 dias

28 dias

B
6,0 5,0 contração (g) 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 7 dias

20 Hz
F - veículo F - fluoxetina

*

D - veículo D - fluoxetina

* * * * *
21 dias

# # *

28 dias

FIGURA 13 – Histograma representando a amplitude das contrações fásicas induzidas por estimulação elétrica na freqüência de 10 (A) e 20 (B) Hz nos grupos de animais falsooperados (F) e desnervados (D) tratados cronicamente com fluoxetina ou veículo, usados em experimentos após 7, 21 e 28 dias. Cada barra representa a média ± epm de 4 a 6 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo veículo, (p<0,05), # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 e 21 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05) (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

Resultados 75

TABELA 3 – Valores da amplitude de contração fásica induzida pela estimulação elétrica nas freqüências de 10 e 20 Hz, em ductos deferentes falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, de animais tratados cronicamente ou não com fluoxetina (10 mg/kg). Cada valor representa a média ± e.p.m. de 4 a 6 experimentos, expressos em gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo veículo, (p<0,05), # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 e 21 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05) (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

Estimulação elétrica – contração fásica (g) 10 Hz Falso-operado 7 dias veículo fluoxetina
4,73±0,17 4,88±0,31

Desnervado 28 dias
4,73±0,23 5,31±0,14

21dias
4,69±0,55 3,84±0,42

7 dias
0,07±0,04* 0,16±0,16*

21dias
0,29±0,15* 0,69±0,25*

28 dias
1,75±0,42*# 1,89±0,44*#

20 Hz Falso-operado 7 dias veículo fluoxetina
5,09±0,30 5,09±0,30

Desnervado 28 dias
4,82±0,21 5,57±0,13*

21dias
5,17±0,62 4,15±0,43

7 dias
0,15±0,06* 0,45±0,16*

21dias
0,48±0,23* 1,06±0,35*

28 dias
2,17±0,49*# 2,27±0,58*#

Resultados 76

Análise da reatividade de receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos

Como a fluoxetina tem a capacidade de inibir a recaptação neuronal de monoaminas, durante o tratamento crônico o aumento de noradrenalina na biofase decorrente dessa inibição poderia levar à dessensibilização tanto de receptores pré como pós-sinápticos. Dessa forma, qualquer alteração na amplitude de contração observada nos grupos tratados com fluoxetina poderia ser devida não a alterações no padrão de inervação, mas sim a diferente responsividade do tecido. Por exemplo, uma dessensibilização de receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos, os quais medeiam retroalimentação negativa, poderia levar a uma maior resposta à estimulação elétrica. Foi realizada então, como controle, a análise da reatividade de receptores α2adrenérgicos pré-sinápticos. Essa análise foi feita pelo estudo do agonista α2-adrenérgico, clonidina. Ao estimular os receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos, a clonidina promove um efeito inibitório das contrações induzidas pelo estímulo elétrico. O tecido foi estimulado eletricamente em parâmetros (0,05 Hz, 3 ms, 50 V) que acarretam contrações fásicas, rápidas conhecidas como “twiches”, sendo então, realizada curva concentração-efeito de clonidina (ver materiais e métodos). A figura 14 mostra curvas concentração-efeito cumulativas inibitórias de clonidina, obtidas nos grupos falso-operados usados nos experimentos 7 (A), 21 (B), e 28 (C) dias após a cirurgia, tratados ou não com fluoxetina. Esses experimentos foram realizados somente em ductos deferente de animais falso-operados, uma vez que nos desnervados a resposta à estimulação elétrica era muito pequena para permitir esse tipo de estudo. Podemos observar que o protocolo de tratamento com fluoxetina empregado não foi suficiente para causar alterações nos receptores α2-adrenérgicos, uma vez que não alterou a resposta da clonidina em nenhum dos grupos estudados.

Resultados 77

A
120 contração estímulo elétrico (%) 100 80 60

CLONIDINA 7 dias

F - veículo
40 20 0 11 . 10 . 9 . 8 . 7 -log [clonidina] M

F - fluoxetina

B
120 contração estímulo elétrico (%) 100 80 60

CLONIDINA 21 dias

F - veículo
40 20 0 11 . 10 . 9 . 8 . 7 -log [clonidina] M

F - fluoxetina

C
120

CLONIDINA 28 dias

contração estímulo elétrico (%)

100 80 60

F - veículo
40 20 0 11 . 10 . 9 . 8 . 7

F - fluoxetina

-log [clonidina] M

FIGURA 14 – Curvas concentração-efeito inibitórias de clonidina sobre as contrações induzidas por estimulação elétrica (0,05 Hz, 3 ms, 50 V) no ducto deferente de animais falsooperados (F) por 7(A), 21(B) e 28(C) dias e tratados cronicamente com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. A amplitude de contração foi medida em porcentagem tendo como valor 100% a amplitude dos “twiches” obtida antes do início da adição de clonidina. Cada ponto representa a média ± e.p.m. de 4 a 6 experimentos.

Resultados 78

Análise da reatividade pós-sináptica

Uma vez que a desnervação sabidamente acarreta alterações plásticas no músculo liso do ducto deferente, como por exemplo, supersensibilidade, foram realizados experimentos para o estudo dessas alterações, não só com o intuito de caracterizar a desnervação e reinervação, mas também como controle para análise de possíveis alterações observadas nos experimentos de neuroliberação. O estudo da reatividade pós-sináptica foi feito através da análise da resposta do tecido ao agonista α1-adrenérgico fenilefrina, ao agonista purinérgico ATP e ao agente despolarizante, BaCl2. Resposta à fenilefrina A figura 15 mostra curvas concentração-efeito cumulativas de fenilefrina obtidas nos grupos falso-operado e desnervados por 7 (A), 21 (B) e 28 (C) dias, tratados cronicamente com fluoxetina ou veículo. Os valores de efeito máximo e de pD2 obtidos a partir dessas curvas estão mostrados respectivamente nas tabelas 4 e 5. Observar que, em todos os grupos de animais desnervados, houve deslocamento das curvas concentração-efeito para esquerda (figura 15), levando a um aumento estatisticamente significante dos valores de pD2 (tabela 5). Além disso, foi observado aumento de efeito máximo para os grupos 7 e 28 dias (Figura 15 e tabela 4). Tanto o deslocamento para esquerda como aumento de efeito máximo são respostas esperadas após a desnervação do tecido, as quais ocorrem pelo desenvolvimento de supersensibilidade. A análise das conseqüências do tratamento crônico com fluoxetina indicou que esse tratamento não alterou as respostas obtidas com fenilefrina tanto nos grupos desnervados como nos grupos falso-operados, quando comparado com seu respectivo grupo tratado com veículo.

Resultados 79

A
4,0 3,5 3,0 contração (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 9,0 8,0 7,0

7 dias

F - veículo F - fluoxetina D - veículo D - fluoxetina

6,0

5,0

4,0

-log [fenilefrina]M

B
4,0 3,5 3,0 contração (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 9,0 8,0 7,0

21 dias

F - veículo F - fluoxetina D - veículo D - fluoxetina

6,0

5,0

4,0

-log [fenilefrina]M

C
4,0 3,5 3,0 contração (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 9,0 8,0 7,0

28 dias

F - veículo F - fluoxetina D - veículo D - fluoxetina

6,0

5,0

4,0

-log [fenilefrina]M

FIGURA 15 – Curvas concentração-efeito cumulativas de fenilefrina obtidas em ductos deferentes de animais falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7 (A), 21 (B) e 28 (C) dias, tratados cronicamente com fluoxetina ou veículo. Os pontos representam a média ± e.p.m de 9 a 12 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g).

Resultados 80

TABELA 4 – Valores de Emáx obtidos a partir de curvas concentração-efeito de fenilefrina realizadas em ducto deferente de animais falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m. de 9 a 12 experimentos. A amplitude de contração foi medida gramas de tensão (g). *estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado (p<0,05) (teste “t” de Student).

Fenilefrina Emáx (g) falso-operado 7 dias veículo fluoxetina
1,8 ± 0,2 2,2 ± 0,2

desnervado 28 dias
1,8 ± 0,1 2,1 ± 0,2

21dias
2,2 ± 0,2 2,3 ± 0,3

7 dias
3,3 ± 0,4* 3,1 ± 0,2*

21dias
2,3 ± 0,3 2,6 ± 0,2

28 dias
2,5 ± 0,3* 2,7 ± 0,1*

TABELA 5 – Valores de pD2 obtidos a partir de curvas concentração-efeito de fenilefrina realizadas em ducto deferente de animais falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m. de 9 a 12 experimentos. *estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado (p<0,05) (teste “t” de Student). Fenilefrina pD2 falso-operado 7 dias veículo fluoxetina
6,78±0,08 6,73±0,09

desnervado 28 dias
6,56±0,05 6,66±0,07

21dias
6,55±0,14 6,65±0,12

7 dias
7,16±0,08* 7,09±0,08*

21dias
7,26±0,14* 7,14±0,08*

28 dias
7,20±0,16* 7,06±0,12*

Resultados 81

Resposta ao ATP A amplitude das contrações induzidas por concentrações únicas, supramáximas, de ATP (10-4 M) em ductos deferentes desnervados ou falso-operados, tratados cronicamente com fluoxetina ou veículo, estão mostradas na figura 16. Os valores da amplitude de contração estão mostrados na tabela 6. Após a desnervação observou-se uma tendência ao aumento do Emáx do ATP, sendo esse aumento estatisticamente significante nos grupos 7 e 28 dias tratados com veículo e 21 dias tratados com fluoxetina. Contudo, para cada período de tempo estudado, o tratamento crônico com fluoxetina não modificou a resposta ao ATP, quando comparado ao seu respectivo controle tratado com veículo.

Resposta ao BaCl2 A figura 17 mostra a amplitude de contração induzida por BaCl2, na concentração única de 10-2 M, em todos os grupos estudados. Os valores de contração máxima, obtidos a partir desses experimentos estão mostrados na tabela 7. Tanto a desnervação quanto o tratamento crônico com fluoxetina não alteraram a resposta ao BaCl2 de forma significante.

Resultados 82

ATP
3 F - veículo F - fluoxetina D - veículo D - fluoxetina

contração (g)

2

*

*

*

1

0 7 dias 21 dias 28 dias

FIGURA 16 – Histograma representando a amplitude das contrações promovidas por concentração única de ATP (10-4M) em ductos deferentes falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 e 28 dias obtidos de animais tratados cronicamente com fluoxetina ou veículo. As barras representam a média ± e.p.m de 6 a 12 experimentos. A amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado (p<0,05). (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

TABELA 6 – Valores de Emáx obtidos por concentração única de ATP (10-4M) em ducto deferente falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias obtidos de animais tratados cronicamente com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m. de 6 a 12 experimentos. A amplitude de contração está expressa gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado (p<0,05). (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY) ATP (10-4M) Emáx (g) falso-operado 7 dias veículo fluoxetina
1,08±0,08 1,35±0,23

desnervado 28 dias
0,90±0,11 1,23±0,13

21dias
1,30±0,21 1,08±0,09

7 dias
1,68±0,16* 1,82±0,18

21dias
1,77±0,26 1,64±0,13*

28 dias
1,6±0,26* 1,54±0,17

Resultados 83

BaCl2
6 5 contração (g) 4 3 2 1 0 7 dias 21 dias 28 dias

F - veículo F - fluoxetina D - veículo D - fluoxetina

FIGURA 17 – Histograma representando a amplitude das contrações promovidas por concentração única de BaCl2 (10-2M) em ductos deferentes falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 e 28 dias obtidos de animais tratados cronicamente com fluoxetina ou veículo. As barras representam a média ± e.p.m de 6 a 12 experimentos. A amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g).

TABELA 7 – Valores de Emáx obtidos a partir de concentração única de BaCl2 (10-2M) em ductos deferentes falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 e 28 dias obtidos de animais tratados cronicamente com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m. de 6 a 12 experimentos. A amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g).

BaCl2 (10-2M) Emáx (g) falso-operado 7 dias veículo fluoxetina
4,53±0,54 4,59±0,40

desnervado 28 dias
3,79±0,21 4,70±0,63

21dias
3,85±0,20 4,38±0,24

7 dias
5,06±0,42 4,87±0,21

21dias
4,26±0,47 4,85±0,27

28 dias
4,45±0,29 4,75±0,25

Resultados 84

3.1.2. Estudos de quantificação de aminas bioativas A quantificação de monoaminas foi realizada pelo método de cromatografia líquida, em ductos deferentes falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, obtidos de animais tratados cronicamente com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. Quantificação de noradrenalina A figura 18 mostra os teores de noradrenalina no tecido nos diferentes grupos estudados. Observar que nos grupos desnervados ocorreu, como esperado, uma intensa queda nos níveis de noradrenalina, queda essa que foi mais acentuada no período de 7 dias após a desnervação. Nos períodos de 21 e 28 dias, houve recuperação parcial dos teores de noradrenalina, uma vez que em ambos os períodos os valores obtidos, embora ainda menores que aqueles dos respectivos grupos falso-operados, foram estatisticamente maiores que aqueles obtidos no grupo 7 dias. Nos grupos falso-operados, tratados ou não com fluoxetina, foi observado que nos grupos 21 dias, a quantidade de noradrenalina dosada foi inferior àquela obtida aos 7 dias. A análise das conseqüências do tratamento crônico com fluoxetina sobre os teores de noradrenalina dosados mostrou que, nos grupos desnervados, para os três períodos de tempos estudados, os valores obtidos em ductos deferentes de animais tratados com fluoxetina foram estatisticamente maiores quando comparados aos respectivos grupos tratados com veículo. Nos grupos falso-operados independentemente do período de tempo estudado, o tratamento com fluoxetina não alterou a concentração de noradrenalina de forma significante. Os valores da quantidade de noradrenalina dosada nos diferentes grupos estão mostrados na tabela 8.

Resultados 85

Dosagem de Noradrenalina
350 300 NA (pmol/mg de tecido) 250 200 150
#

#

F - veículo F - fluoxetina D - veículo D - fluoxetina

*
100 50 0 7 dias 21 dias 28 dias
# * #

*
# # *

*

*

*

*

*

FIGURA 18- Histograma representando a concentração de noradrenalina (NA), em ρmol/mg de tecido, em de ductos deferentes de animais falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 ou 28 dias, obtidos de animais tratados com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. As barras representam a média ± e.p.m de 10 experimentos. * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY) TABELA 8– Valores dos teores de noradrenalina, em ρmol/mg de tecido, dosados em ductos deferentes falso-operados ou desnervados por 7, 21 ou 28 dias, obtidos de animais tratados com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. Os valores representam média±e.p.m de 10 experimentos. * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)
Noradrenalina (ρmol/mg de tecido) falso-operado 7 dias veículo fluoxetina
311,65±20,18 309,03±19,60

desnervado 28 dias
242,78±11,04 274,00±21,36

21dias
220,17±18,04# 249,46±4,37#

7 dias
19,86±5,16* 36,53±4,37**

21dias
50,02±6,09*# 71,45±8,06*#*

28 dias
54,17±8,99*# 81,91±7,43*#*

Resultados 86

Quantificação de serotonina Os teores de serotonina no tecido nos diferentes grupos estudados estão mostrados na figura 19 e tabela 9. Nos grupos falso-operados não foram observadas diferenças na quantidade de serotonina dosada, independentemente do tratamento ou do período de tempo estudado. Nos grupos desnervados por 7 dias tratados com veículo ocorreu uma queda estatisticamente significante nos valores de serotonina no tecido. No grupo 7 dias tratado com fluoxetina, apesar de uma tendência da diminuição de resposta em relação a seu respectivo grupo falso-operado, a análise estatística não mostrou diferenças nos valores. Nos grupos desnervados por 21 ou 28 dias, ocorreu, com exceção do grupo tratado com fluoxetina e desnervado por 21 dias, um aumento nos teores de serotonina, quando comparados aos respectivos grupos falso operados. Além disso, todos os animais desnervados por 21 e 28 dias independente do tratamento farmacológico, apresentaram teores de serotonina nos seus ductos deferentes estatisticamente maiores que os obtidos 7 dias após a desnervação. Nesses grupos desnervados, o tratamento com fluoxetina não alterou o padrão de resposta, nos diferentes períodos de tempo estudados, em relação aos grupos não tratados.

Resultados 87

Dosagem de 5-HT
F - veículo F - fluoxetina 1,0 0,9 5-HT (pmol/mg de tecido) 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 7 dias 21 dias 28 dias D - veículo

# # * * #

# *

D - fluoxetina

*

FIGURA 19 – Histograma representando os valores da concentração de serotonina (5-HT), em ρmol/mg de tecido, obtidos em ductos deferentes de animais falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 ou 28 dias, tratados com veículo ou fluoxetina (10 mg/kg). As barras representam a média ± e.p.m de 10 experimentos. # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY) TABELA 9– Valores dos teores de serotonina, em ρmol/mg de tecido, dosados em ductos deferentes falso-operados ou desnervados por 7, 21 ou 28 dias, obtidos de animais tratados com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)
Serotonina (ρmol/mg de tecido) falso-operado 7 dias veículo fluoxetina
0,41±0,03 0,46±0,10

desnervado 28 dias
0,359±0,05 0,47±0,06

21dias
0,34±0,04 0,35±0,07

7 dias
0,25±0,04* 0,35±0,06

21dias
0,62±0,08*# 0,55±0,07#

28 dias
0,71±0,10*# 0,70±0,09*#

Resultados 88

3.2. Tratamento agudo com fluoxetina Pelo protocolo de tratamento crônico com fluoxetina, a última injeção do antidepressivo era administrada 24h antes da eutanásia dos animais para o estudo funcional dos ductos deferentes. Foram feitos experimentos para verificar se as alterações observadas durante o tratamento crônico eram devidas ao tratamento em si ou eram decorrentes de uma possível presença de fluoxetina no animal mesmo passadas 24h após a última injeção. Para isso, foram realizados esquemas de tratamento semelhantes aos empregados para o estudo com o tratamento crônico, com a diferença de que durante todo período de tratamento os animais foram tratados com veículo, com exceção do último dia, quando metade dos animais recebeu nova injeção de veículo e a outra metade, fluoxetina (10 mg/kg). Após 24h, os animais foram sacrificados para a obtenção dos ductos deferentes. Para o estudo do tratamento agudo foi analisada a neuroliberação induzida pela tiramina. Os estudos foram feitos em animais falso-operados ou desnervados por 7 e 28 dias. Análise da Neurotransmissão

Resposta à tiramina A figura 20 mostra a amplitude de contração causada por concentrações únicas de tiramina (10-4M) nos diferentes grupos estudados. Os valores obtidos a partir desses experimentos estão mostrados na tabela 10. Nos grupos falso-operados a resposta à tiramina foi semelhante independentemente do tratamento empregado ou dos períodos de tempo estudados (7 e 28 dias). Nos grupos desnervados houve intensa queda na amplitude de contração em relação ao respectivo grupo falso-operado. Essa queda foi mais intensa no grupo desnervado por 7 dias, sendo que houve uma recuperação da resposta no grupo estudado 28 dias após a desnervação. O tratamento agudo com fluoxetina não modificou a resposta à tiramina.

Resultados 89

Tiramina
4

F - veículo F - fluoxetina D - veículo

3 contração (g)

D - fluoxetina

2

*
1

*

#

*

*

0 7 dias 28 dias

FIGURA 20 – Histograma representando a amplitude da contração induzida por concentração única de tiramina (10-4 M) em ducto deferente de animais falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7 e 28 dias. Todos os animais foram tratados com veículo, com exceção do último dia, 24h antes da eutanásia, quando um grupo recebeu veículo e outro, fluoxetina (10 mg/kg). As barras representam a média ± e.p.m. de 4 a 6 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g). # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY). TABELA 10 – Valores de Emáx obtidos por concentração única de tiramina (10-4 M) em ducto deferente de animais falso-operados ou desnervados por 7 e 28 dias. Todos os animais foram tratados com veículo, com exceção do último dia, 24h antes da eutanásia, quando um grupo recebeu veículo e outro, fluoxetina (10 mg/kg). Os valores representam a média ± e.p.m. de 4 a 6 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g). # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY).

Tiramina (10-4M) Emáx (g) falso-operado 7 dias veículo fluoxetina
2,37±0,14 2,65±0,14

desnervado 7 dias
0,68±0,25* 0,48±0,18*

28 dias
2,57±0,11 2,53± 0,1

28 dias
1,21± 0,12* 1,26±0,33*#

Resultados 90

4. DESIPRAMINA 4.1. Efeito do tratamento crônico com desipramina sobre o ducto deferente Os animais foram tratados com desipramina (10 mg/kg) ou com o veículo (salina), por 11 dias antes da cirurgia de desnervação ou da falsa operação, sendo mantido o tratamento até 24 horas antes da eutanásia dos animais, que ocorreu 7, 21 ou 28 dias após a cirurgia. Foram realizados estudos funcionais, com o intuito de analisar a capacidade de neuroliberação e a reatividade de receptores pré e pós-sinápticos.

4.1.1. Estudos funcionais

Análise da Neurotransmissão Resposta à tiramina A figura 21 mostra a amplitude de contração induzida por concentrações únicas de tiramina (10-4M) em ductos deferentes falso-operados ou desnervados por 7, 21 ou 28 dias, tratados cronicamente com desipramina ou veículo. Nos grupos falso-operados, não foram observadas diferenças estatísticas na resposta da tiramina entre os três períodos de tempo estudados (7, 21 e 28 dias), considerando tanto os grupos tratados com desipramina como os tratados com veículo. Nos grupos desnervados ocorreu diminuição da resposta à tiramina, independentemente do tratamento, para todos os períodos de tempo estudados. A análise das conseqüências do tratamento crônico com desipramina mostrou que o tratamento não afetou de modo estatisticamente significante, a resposta à tiramina nos períodos de 7 e 21 dias, apesar da tendência ao aumento da resposta no grupo 7 dias. Por outro lado foi observado que o tratamento com desipramina causou uma diminuição da contração causada pela tiramina no grupo desnervado por 28 dias. Os valores da amplitude de contração obtidos a partir desses experimentos estão mostrados na tabela 11.

Resultados 91

Tiramina 4
F - veículo F - desipramina D - veículo

3
contração (g)

D - desipramina

2

1

* *

* *

*

#

* *

0
7 dias 21 dias 28 dias

FIGURA 21 – Histograma representando a amplitude de contração induzida por concentração única de tiramina (10-4M) em ductos deferentes de animais falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com desipramina (10 mg/kg) ou com veículo. As barras representam a média ± e.p.m de 7 a 16 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY) TABELA 11 – Valores do Emax, em gramas de tensão, obtidos para tiramina (10-4M) nos grupos falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com desipramina (10 mg/kg) ou veículo. Cada valor representa a média ± e.p.m. de 7 a 16 experimentos. * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

Tiramina (10-4M) Emáx (g) Falso-operado 7 dias Veículo desipramina
1,86±0,17 2,03±0,22

Desnervado 28 dias
2,13±0,12 1,99±0,39

21dias
2,20±0,12 2,31±0,17

7 dias

21dias

28 dias
0,99±0,13*
#

0,28±0,07* 0,80±0,10* 0,62±0,18* 0,82±0,11*

0,61±0,12**

Resultados 92

Resposta à estimulação elétrica A figura 22 representa a amplitude do componente fásico da contração induzida pela estimulação elétrica nas freqüências de 0,05, 1, 5, 10 e 20 Hz em ductos deferentes falsooperados e desnervados por 7, 21 e 28 dias obtidos de animais que receberam tratamento crônico com desipramina ou com veículo. Na figura 23, estão mostradas na forma de histograma, somente as respostas obtidas com as freqüências mais altas, de 10 e 20 Hz, para melhor visualização dos resultados, estando os valores obtidos na tabela 12. Considerando-se os grupos falso-operados, não foram observadas diferenças significativas, para cada freqüência empregada, na resposta do tecido ao estímulo elétrico, independentemente do período estudado ou o tratamento empregado. A desnervação causou a esperada diminuição da resposta contrátil, observada para todas as freqüências estudadas. Essa diminuição foi mais acentuada no grupo estudado 7 dias após a desnervação, seguida de uma lenta recuperação da resposta, nos grupos 21 e 28 dias. O tratamento crônico com desipramina afetou a resposta nos grupos desnervados, tendo sido observado, na freqüência de 20 Hz, um aumento da amplitude de contração para o grupo 7 dias (22A e 23B) quando comparado ao respectivo grupo tratado com veículo.

Resultados 93

A
6,0 5,0 contração (g) 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0,05

Curva de freqüência 7 dias

F - veículo F - desipramina D - veículo D - desipramina

*

1

5 freqüência (Hz)

10

20

B
6,0 5,0 contração (g) 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0,05

Curva de freqüência 21 dias

F - veículo F - desipramina D - veículo D - desipramina

1

5 freqüência (Hz)

10

20

C
6,0 5,0 contração (g) 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0,05 1

Curva de freqüência 28 dias

F - veículo F - desipramina D - veículo D - desipramina

5 freqüência (Hz)

10

20

FIGURA 22 – Amplitude de contração fásica induzida por estimulação elétrica em freqüências crescentes, em ducto deferente de animais falso-operados (F) e desnervados (D) por 7 (A), 21 (B) e 28 (C) dias, tratados cronicamente com desipramina (10 mg/kg) ou veículo. Os pontos representam a média ± e.p.m. de 7 a 15 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g). *estatisticamente diferente do respectivo grupo veículo, (p<0,05) (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY).

Resultados 94

A
6 5 contração (g) 4 3 2 1

10 Hz
F - veículo F - desipramina D - veículo D - desipramina

* # * * *
7 dias 21 dias

#

* # *

#

0 28 dias

B
6 5 contração (g)

20 Hz
F - veículo F - desipramina D - veículo D - desipramina

**

4 3 2 1 0 7 dias 21 dias

#

* # * * *

#

*

*

#

*

28 dias

FIGURA 23 – Histograma representando a amplitude de contração fásica induzida por estimulação elétrica nas freqüências de 10 (A) e 20 Hz (B) em ductos deferentes falsooperados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com desipramina (10 mg/kg) ou veículo. As barras representam a média ± e.p.m de 7 a 15 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05) * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05) (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

Resultados 95

TABELA 12 – Valores do efeito máximo obtidos pela estimulação elétrica nas freqüências de 10 e 20 Hz, em animais falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com desipramina (10 mg/kg) ou veículo. Cada valor representa a média ± e.p.m. de 7 a 15 experimentos, expressos em gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05) * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05) (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

Estimulação elétrica – contração fásica (g) 10 Hz falso-operado 7 dias Veículo Desipramina
4,07±0,21 4,10±0,26

desnervado 28 dias
4,30±0,15 4,52±0,16

21dias
4,40±0,16 4,31±0,23

7 dias
0,15±0,10* 0,59±0,25*

21dias
1,73±0,30*# 1,51±0,21*#

28 dias
2,36±0,23*# 1,86±0,25*#

20 Hz falso-operado 7 dias Veículo Desipramina
4,29±0,23 4,53±0,28

desnervado 28 dias
4,60±0,13 4,77±0,18

21dias
4,61±0,16 4,60±0,23

7 dias
0,23±0,16* 0,83±0,22**

21dias
2,01±0,32*# 1,81±0,24*#

28 dias
2,75±0,25*# 2,02±0,27*#

Resultados 96

Análise da reatividade dos receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos Na figura 24 estão representadas as curvas concentração-efeito cumulativas inibitórias de clonidina, obtidas em ductos deferentes falso-operados, usados em experimentos 7 (A), 21 (B) e 28 (C) dias após a cirurgia, obtidos de animais tratados cronicamente com desipramina ou veículo. O tratamento crônico com desipramina causou uma diminuição nos valores de pIC50 estatisticamente significante no grupo 28 dias (pIC50 = 8,56 ± 0,10) em relação ao grupo veículo (pIC50 = 8,90 ± 0,06), o que caracteriza um deslocamento da curva inibitória de clonidina para a direita. A
7 dias 120 contração estímulo elétrico (%) 100 80 60 40 20 0 0 10 ° 9 ° 8 ° 7 -log [clonidina]M F - veículo F - desipramina

B
21 dias 120 contração estímulo elétrico (%) 100 80 60 40 20 0 0 10 ° 9 ° 8 ° 7 -log [clonidina]M contração estímulo elétrico (%) 120 100 80 60

C
28 dias

F - veículo 40 20 0 0 10 ° 9 ° 8 ° 7 -log [clonidina]M F - desipramina

F - veículo F - desipramina

FIGURA 24 – Curvas concentração-efeito inibitórias de clonidina sobre as contrações induzidas por estimulação elétrica (0,05 Hz, 3 ms, 50 V) no ducto deferente dos animais falso-operados (F) por 7(A), 21(B) e 28(C) dias e tratados cronicamente com desipramina (10 mg/kg) ou veículo. A amplitude de contração foi medida em porcentagem tendo como valor 100% a amplitude dos “twiches” obtida antes da adição de clonidina. Cada ponto representa a média ± e.p.m. de 5 a 15 experimentos.

Resultados 97

Análise da reatividade pós-sináptica

Resposta à fenilefrina A figura 25 mostra curvas concentração-efeito cumulativas de fenilefrina obtidas para os grupos falso-operados ou desnervados por 7 (A), 21 (B) e 28 (C) dias, submetidos ao tratamento crônico com desipramina ou veículo. Os valores de efeito máximo e de pD2 obtidos a partir desses experimentos estão mostrados na tabela 13 e 14 respectivamente. Como dito anteriormente, a desnervação pode causar, devido ao desenvolvimento de supersensibilidade, um aumento de efeito máximo e deslocamento das curvas para esquerda (caracterizado pelo aumento nos valores de pD2). Nos grupos tratados com veículo, o deslocamento das curvas de fenilefrina ocorreu em todos os grupos desnervados em relação às curvas dos grupos falso-operados. Nos tratados com desipramina, a desnervação causou deslocamento das curvas nos grupos 7 e 21 dias. Entretanto, esse deslocamento não foi estatisticamente significante no grupo 28 dias (tabela 14). O aumento de efeito máximo ocorreu, para os grupos tratados com desipramina, nos três períodos de tempo estudados, sendo que nos tratados com veículo, esse aumento só foi estatisticamente significante nos grupos 7 e 28 dias (figura 25 e tabela 13). A análise das conseqüências do tratamento com desipramina mostrou que no grupo desnervado por 21 dias, esse tratamento levou a um aumento do efeito máximo da fenilefrina, quando comparado a seu respectivo controle tratado com veículo. Nos demais grupos, a desipramina não alterou os parâmetros analisados, em comparação ao grupo veículo.

Resultados 98

A
4,0 3,5 3,0 contração (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 9,0 8,0 7,0

7 dias

F - veículo F - desipramina D - veículo D - desipramina 6,0 5,0 4,0

-log [fenilefrina] M

B
4,0 3,5 3,0 contração (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 9,0 8,0 7,0

21 dias

F - veículo F - desipramina D - veículo D - desipramina

6,0

5,0

4,0

-log [fenilefrina] M

C
4,0 3,5 3,0 contração (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 9,0 8,0 7,0

28 dias

F - veículo F - desipramina D - veículo D - desipramina

6,0

5,0

4,0

-log [fenilefrina] M

FIGURA 25 – Curvas concentração-efeito cumulativas de fenilefrina obtidas em ductos deferentes de animais falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7 (A), 21 (B) ou 28 (C) dias, tratados cronicamente com desipramina (10 mg/kg) ou veículo. Os pontos representam a média ± e.p.m de 6 a 16 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g).

Resultados 99

TABELA 13 – Valores de Emáx obtidos a partir de curvas concentração-efeito de fenilefrina obtidas no ducto deferente de animais falso-operados ou desnervados por 7, 21 ou 28 dias, tratados cronicamente com desipramina (10 mg/kg) ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m. de 6 a 16 experimentos. A amplitude de contração foi medida gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado (p<0,05). (teste “t” de Student). Fenilefrina Emáx (g) falso-operado 7 dias Veículo Desipramina
2,00±0,14 2,46±0,31

desnervado 28 dias
1,92±0,11 2,09±0,21

21 dias
2,05±0,14 2,45±0,19

7 dias
2,85±0,26* 3,16±0,25*

21 dias
2,19± 0,20 2,89±0,18**

28 dias
2,37±0,15* 2,55±0,20*

TABELA 14 - Valores de pD2 obtidos a partir de curvas concentração-efeito de fenilefrina realizados em ducto deferente de animais desnervados e no grupo falso-operados por 7, 21 e 28 dias, submetidos ao tratamento crônico com desipramina ou veículo. Cada valor representa a média ± e.p.m. de 6 a 16 experimentos. * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado (p<0,05) (teste “t” de Student).

Fenilefrina pD2 falso-operado 7 dias Veículo Desipramina
6,52±0,12 6,63±0,09

desnervado 28 dias
6,41±0,06 6,72±0,17

21 dias
6,29±0,12 6,36±0,10

7 dias
7,15±0,06* 7,17±0,15*

21 dias
7,25±0,09* 7,00±0,07*

28 dias
7,08±0,10* 7,03±0,06

Resultados 100

Resposta ao ATP A figura 26 mostra a amplitude de contração induzida por concentração única de ATP (10-4M) em ductos deferentes falso-operados ou desnervados, tratados ou não com desipramina. Nos grupos tratados com veículo, a desnervação cirúrgica foi capaz de levar a um aumento da sensibilidade ao ATP em relação aos respectivos grupos falso-operados, em todos os períodos de tempo de desnervação estudados. O tratamento com desipramina não alterou o padrão da resposta ao ATP, em nenhum dos períodos de tempo estudados, tanto nos grupos falso-operados como desnervados. Os valores de efeito máximo causado pelo ATP estão mostrados na tabela 15.

Resposta ao BaCl2 A amplitude de contração causada por concentração única de BaCl2 (10-2M) está mostrada na figura 27. Tanto a desnervação cirúrgica, como o tratamento crônico com desipramina, não alteraram significativamente as amplitudes de contração em todos os períodos de tempo estudados. Os valores do efeito causado pelo BaCl2 estão mostrados na tabela 16.

Resultados 101

ATP
2

*
contração (g)

*

*

*

F - veículo F - desipramina D - veículo D - desipramina

1

0 7 dias 21 dias 28 dias

FIGURA 26 – Histograma representando a amplitude de contração promovida por concentração única de ATP (10-4M) em ductos deferentes falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 e 28 dias, de animais tratados cronicamente com desipramina (10 mg/Kg) ou veículo. As barras representam a média ± e.p.m de 7 a 16 experimentos. A amplitude de contração foi medida gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05). (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

TABELA 15 – Valores de Emáx obtidos por concentração única de ATP (10-4M) em ductos deferentes de animais falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com desipramina ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m. de 7 a 16 experimentos. A amplitude de contração foi medida gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05). (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY) ATP (10-4M) Emáx (g)
falso-operado

Desnervado

7 dias Veículo
Desipramina
1,18±0,07 1,28±0,16

21dias
1,13±0,11 1,10±0,13

28 dias
1,12±0,11 1,04±0,16

7 dias
1,57±0,13* 1,44±0,11

21dias
1,66±0,13* 1,33±0,10

28 dias
1,51±0,15* 1,44±0,11*

Resultados 102

BaCl2
6 5 contração (g) 4 3 2 1 0 7 dias 21 dias 28 dias

F - veículo F - desipramina D - veículo D - desipramina

FIGURA 27 – Histograma representando a amplitude das contrações promovida por concentração única de BaCl2 (10-2 M) em ductos deferentes falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 e 28 dias obtidos de animais tratados cronicamente com desipramina ou veículo. As barras representam a média ± e.p.m de 7 a 16 experimentos. A amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g).

TABELA 16 – Valores de Emáx obtidos a partir de concentração única de BaCl2 (10-2M) em ductos deferentes de animais falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias tratados cronicamente com desipramina ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m. de 7 a 16 experimentos. A amplitude de contração foi medida gramas de tensão (g).

BaCl2 (10-2 M) Emáx (g) veículo 7 dias
falso-operado 4,42±0,31 4,08±0,50

fluoxetina 28 dias
4,12±0,20 4,7±0,33

21dias
3,77±0,14 4,10± 0,29

7 dias
4,56±0,25 4,52±0,28

21dias
4,26±0,30 4,86±0,21

28 dias
4,66±0,18 4,55±0,21

desnervado

Resultados 103

5. IMIPRAMINA

5.1. Efeito do tratamento crônico com imipramina sobre o ducto deferente Os animais foram tratados com imipramina (10 mg/kg) ou veículo por 11 dias antes da cirurgia de desnervação ou da falsa operação, sendo o tratamento mantido até 24 horas antes da eutanásia, a qual ocorreu 7, 21 ou 28 dias após a cirurgia. Assim como para os outros antidepressivos estudados, foram feitos estudos funcionais para análise da capacidade de neuroliberação e a reatividade de receptores pré e pós-sinápticos. 5.1.1. Estudos Funcionais

Análise da Neurotransmissão

Resposta a tiramina A figura 28 mostra a amplitude de contração causada por tiramina (10-4M) nos diferentes grupos estudados. Para todos os grupos desnervados, quando comparados aos grupos falso-operados, foi observada uma diminuição da contração causada pela tiramina. Os valores obtidos a partir desses experimentos estão mostrados na tabela 17. A análise dos efeitos do tratamento crônico com imipramina sobre a amplitude das contrações por tiramina mostrou que não foram observadas diferenças significantes entre os grupos tratados com o antidepressivo em relação aos respectivos grupos tratados com veículo, com exceção de grupo falso-operado por 28 dias, no qual um aumento da amplitude da contração foi verificado após o tratamento com imipramina.

Resultados 104
Tiramina
4 F - veículo

*
3 contração (g)

F - imipramina D - veículo D - imipramina

2

* *
1

*

*

* *

0 7 dias 21 dias 28 dias

FIGURA 28 – Histograma representando a amplitude de contração induzida por concentração única de tiramina (10-4M) em ductos deferentes falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com imipramina (10 mg/kg) ou veículo. As barras representam a média ± e.p.m. de 6 a 7 experimentos, expressos em gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

TABELA 17 – Valores de efeito máximo, em gramas de tensão (g), obtidos por concentração única de tiramina (10-4M) nos grupos de animais falso-operados e desnervados por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com veículo ou imipramina (10 mg/kg). Os valores representam a média ± e.p.m. de 6 a 7 experimentos. * estatisticamente diferente do respectivo grupo veículo (p<0,05). * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)
Tiramina (10-4 M) Emáx (g) falso-operado 7 dias veículo imipramina
2,34±0,14 2,56±0,17

desnervado 28 dias
2,34±0,11 2,97±0,14*

21dias
2,53±0,11 2,45± 0,36

7 dias
0,59±0,13* 0,60± 0,14*

21dias
1,05±0,15* 0,98±0,35*

28 dias
1,29±0,18* 0,98±0,17*

Resultados 105

Estimulação elétrica Na figura 29 estão representadas as amplitudes de contrações fásicas induzidas por estimulação elétrica nas freqüências de 0,05, 1, 5, 10 e 20 Hz em ductos deferentes falsooperados ou desnervados por 7 (A), 21 (B) e 28 (C) dias, tratados cronicamente com imipramina (10 mg/kg) ou veículo. As respostas obtidas com as freqüências mais altas, de 10 e 20 Hz, estão mostradas na figura 30, na forma de histograma e os valores obtidos estão mostrados na tabela 18. A análise das figuras mostra que nos grupos desnervados, tratados ou não com imipramina, a resposta foi bastante reduzida, particularmente nos grupos desnervados por 7 dias. Nos grupos 21 e 28, a resposta foi um pouco maior, estatisticamente diferente daquela obtida no grupo 7 dias, mas ainda diferente dos respectivos grupos falso-operados. A análise das conseqüências do tratamento crônico com imipramina sobre esse padrão de respostas mostrou que o tratamento levou a um aumento da amplitude de contração no grupo falso-operado por 7 dias nas freqüências de 0,05 e 5 Hz (29 A). No grupo de animais desnervado por 28 dias (29 C e 30), o tratamento crônico com imipramina fez com que as amplitudes de contração induzidas pelo estímulo elétrico nas freqüências mais altas (10 e 20 Hz) fossem menores, quando comparadas com os respectivos grupos tratados com veículo (tabela 18).

Resultados 106

A
6 5 contração (g)

Curva de freqüência 7 dias

*
4 3 2 1 0 0,05 1 5 freqüência (Hz) 10 20

*

F - veículo F - imipramina D - veículo D - imipramina

B
6 5 contração (g) 4 3 2

Curva de freqüência 21 dias

F - veículo F - imipramina D - veículo

1 0 0,05 1 5 freqüência (Hz) 10 20

D - imipramina

C
6 5 contração (g) 4 3 2 1 0 0,05 1

Curva de freqüência 28 dias

F - veículo

*

*

F - imipramina D - veículo D - imipramina

5 freqüência (Hz)

10

20

FIGURA 29 – Amplitude das contrações fásicas induzidas por estimulação elétrica em freqüência crescentes em ductos deferentes falso-operados (F) e desnervados (D) por 7 (A), 21(B) e 28(C) dias, tratados com veículo ou imipramina (10 mg/kg). Cada ponto representa a média ± e.p.m. de 4 a 7 experimentos e estão expressos em grama de tensão (g). *Valores estatisticamente diferente do respectivo grupo veículo (p<0,05)

Resultados 107

A
6 5 4 3 2 1 0 7 dias

10 Hz
F - veículo F - imipramina D - veículo

contração (g)

* # * * *
21 dias

#

* * *
#

#

D - imipramina

28 dias

B
6 5 4

20 Hz
F - veículo F - imipramina D - veículo

contração (g)

#
3 2 1 0 7 dias 21 dias

# #

D - imipramina

*

* *
#

*

*

* *
28 dias

FIGURA 30 – Histograma representando a amplitude das contrações fásicas induzidas por estimulação elétrica nas freqüências de 10 (A) e 20 (B) Hz nos grupos de animais falsooperados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias e tratados com veículo ou imipramina (10 mg/kg). Cada barra representa a média ± e.p.m. de 4 a 7 experimentos e estão expressos em grama de tensão. * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 e 21 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05) (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

Resultados 108

TABELA 18 – Valores de efeito máximo da contração fásica induzida por estimulação elétrica nas freqüências de 10 e 20 Hz, em ductos deferentes de animais falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente ou não com imipramina (10 mg/kg). Cada valor representa a média ± e.p.m. de 4 a 7 experimentos, expressos em gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) # estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05), * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)
Estimulação elétrica – contração fásica (g) 10 Hz falso-operado 7 dias veículo imipramina
3,98±0,14 4,46±0,26

desnervado 28 dias
4,40±0,22 4,24±0,21

21dias
4,80±0,08 4,19±0,31

7 dias
0,40±0,09* 0,31±0,11*

21dias
1,86±0,41*# 1,64±0,57*#

28 dias
2,66±0,23*# 1,84±0,22*#*

20 Hz falso-operado 7 dias veículo imipramina
4,13±0,15 4,62±0,25

desnervado 28 dias
4,68±0,22 4,58±0,24

21dias
4,99±0,11 4,52±0,27

7 dias
0,50±0,09* 0,40±0,13*

21dias
2,26±0,48*# 1,82±0,60*#

28 dias
3,00±0,27*# 2,15±0,27*#*

Resultados 109

Análise da Reatividade de Receptores α 2-Adrenérgicos Pré-Sinápticos A figura 31 mostra curvas concentração-efeito cumulativas inibitórias médias de clonidina, obtidas em ductos deferentes de animais falso-operados por 7 (A), 21 (B) e 28 (C), tratados ou não cronicamente com imipramina. No grupo 7 dias (31A), foi observada uma tendência a um deslocamento da curva inibitória de clonidina para a direita após o tratamento crônico com imipramina. Contudo, os valores de pIC50, que foram de 9,16 ± 0,47 para o veículo e de 8,28 ± 0,09 para o tratado com imipramina, não foram estatisticamente diferentes.

A
120

7 dias

contração estímulo elétrico (%)

100 80 60 40

F - veículo
20 0

F - imipramina

0

10

°

9

°

8

°

7

-log [clonidina]M

B
21 dias
120 contração estímulo elétrico (%) 100 80 60 40 20 0 0 10 ° 9 ° 8 ° 7 -log [clonidina]M contração estímulo elétrico (%) 120 100 80 60 40 20 0

C
28 dias

F - veículo F - imipramina

F - veículo F - imipramina

0

10

°

9

°

8

°

7

-log [clonidina]M

FIGURA 31 – Curvas concentração-efeito inibitórias de clonidina sobre as contrações induzidas por estimulação elétrica (0,05 Hz, 3 ms, 50 V) no ducto deferente dos animais falso-operados por 7 (A), 21 (B) e 28 (C) dias e tratados com imipramina (10 mg/kg) ou veículo. A amplitude de contração foi medida em porcentagem tendo como valor 100% a amplitude da contração obtida antes da adição de clonidina. Cada ponto representa a média ± e.p.m. de 4 a 7 experimentos.

Resultados 110

Análise da Reatividade Pós-sináptica Resposta à fenilefrina A figura 32 mostra curvas concentração-efeito cumulativas de fenilefrina obtidas nos grupos falso-operados ou nos grupos desnervados por 7 (A), 21(B) e 28(C) dias, submetidos ao tratamento crônico com imipramina ou veículo. Os valores de efeito máximo e de pD2 estão mostrados nas tabelas 19 e 20 respectivamente. Observar que em todos os grupos de animais desnervados, houve o deslocamento das curvas concentração-efeito para esquerda, com conseqüente aumento dos valores de pD2, em relação aos seus respectivos grupos falso-operados (tabela 20). O tratamento crônico com o antidepressivo imipramina somente alterou a resposta à fenilefrina, no grupo falso-operado por 28 dias, no qual o parâmetro Emáx da curva concentração-efeito foi maior no grupo tratado quando comparado com o grupo não tratado (tabela 19).

Resultados 111

A
4,0 3,5 3,0 contração (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 9,0 8,0 7,0

7 dias

F - veículo F - imipramina D - veículo D - imipramina

6,0

5,0

4,0

-log [fenilefrina]M

B
4,0 3,5 3,0 contração (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 9,0 8,0 7,0

21 dias

F - veículo F - imipramina D - veículo D - imipramina

6,0

5,0

4,0

-log [fenilefrina]M

C
4,0 3,5 3,0 contração (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 9,0 8,0 7,0

28 dias

F - veículo F - imipramina D - veículo D - imipramina

6,0

5,0

4,0

-log [fenilefrina]M

FIGURA 32 – Curvas concentração-efeito cumulativas de fenilefrina obtidas em ductos deferentes de animais falso-operados ou desnervados cirurgicamente por 7 (A), 21 (B) ou 28 (C) dias, tratados com imipramina (10 mg/kg) ou veículo. Os pontos representam a média ± e.p.m de 6 a 8 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g).

Resultados 112

TABELA 19 – Valores de Emáx obtidos a partir de curvas concentração-efeito de fenilefrina realizadas no ducto deferente de animais falso-operados ou desnervados por 7, 21 ou 28 dias, tratados com imipramina (10 mg/kg) ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m. de 6 a 8 experimentos. A amplitude de contração máxima foi medida gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05) (teste “t” de Student)
Fenilefrina Emáx (g) falso-operado 7 dias veículo imipramina
2,26±0,16 2,49±0,21

desnervado 28 dias
1,98±0,21

21dias
1,83±0,07 2,16±0,17

7 dias
2,37±0,04 2,35±0,19

21dias
1,98±0,24 2,18±0,23

28 dias
2,27±16 2,31±0,13

2,76±0,23*

TABELA 20 - Valores de pD2 obtidos a partir de curvas concentração-efeito de fenilefrina realizadas em ducto deferentes de animais desnervados ou falso-operados após 7, 21 ou 28 dias, submetidos ao tratamento crônico com imipramina ou veículo. Cada valor representa a média ± e.p.m. de 6 a 8 experimentos. * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado (p<0,01) (teste “t” de Student)
Fenilefrina pD2 falso-operado 7 dias veículo imipramina
6,15 ± 0,17 6,21 ± 0,09

desnervado 28 dias
6,24 ± 0,06 6,19 ± 0,09

21dias
5,99 ± 0,12 6,04 ± 0,10

7 dias
7,10±0,09* 6,99±0,12*

21dias
7,17±0,06* 7,15±0,08*

28 dias
6,92±0,08* 6,97±0,10*

Resultados 113

Resposta ao ATP As amplitudes das contrações induzidas por ATP, na concentração única de 10-4M, em ductos deferentes falso-operados ou desnervados, tratados ou não com imipramina estão mostradas na figura 33. Ocorreu aumento do efeito máximo do ATP no grupo 21 dias, desnervados e tratado com veículo, em relação ao seu respectivo grupo controle (falsooperado) Foi observado que o tratamento com imipramina não afetou as respostas ao ATP (tabela 22).

Resposta ao BaCl2 A amplitude de contração induzida pelo cloreto de bário, na concentração única de 10-2M, em todos os grupos estudados está mostrada na figura 34. A desnervação cirúrgica ou tratamento crônico com imipramina, não alteraram significativamente os valores de amplitudes das contrações induzidas pelo BaCl2 em todos os períodos estudados (tabela 23).

Resultados 114

3

ATP
F - veículo F - imipramina D - veículo D - imipramina

contração (g)

2

*

1

0 7 dias 21 dias 28 dias

FIGURA 33 – Contração promovida por concentração única de ATP (10-4 M) em ducto deferente de animais falso-operados ou desnervados por 7 (A), 21 (B) e 28 (C) dias, tratados com imipramina (10 mg/kg) ou veículo. As barras representam a média ± e.p.m. de 6 a 8 experimentos. A amplitude de contração foi medida gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

TABELA 22 – Valores de Emáx obtidos a partir de concentração única de ATP (10-4M) no ducto deferente de animais desnervados cirurgicamente e usados nos experimentos após 7, 21 e 28 dias em paralelo ao seu grupo controle (falso-operado) tratados com imipramina ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m. de 6 a 8 experimentos. A amplitude de contração foi medida gramas de tensão (g). * estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05), (Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)

ATP (10-4 M) Emáx (g) falso-operado 7 dias veículo imipramina
1,32±0,11 1,56±0,12

desnervado 28 dias
1,38±0,12 1,16±0,13

21dias
0,95±0,12 0,97±0,10

7 dias

21dias

28 dias
1,41±0,15 1,57±0,14

1,44±0,22 1,54±0,22* 1,51±0,16 1,38±0,26

Resultados 115

.
6 5 contração (g) 4 3 2 1 0 7 dias 21 dias

BaCl2
F - veículo F - imipramina D - veículo D - imipramina

28 dias

FIGURA 34 – Histograma representando a amplitude das contrações promovidas por concentração única de BaCl2 (10-2 M) em ductos deferente falso-operados (F) ou desnervados (D) por 7, 21 e 28 dias obtidos de animais tratados cronicamente com imipramina (10 mg/kg) ou veículo. As barras representam a média ± e.p.m de 6 a 8 experimentos. A amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g).

TABELA 23 – Valores de Emáx obtidos a partir de concentração única de BaCl2 (10-2 M) obtidos em ductos deferentes de animais falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, tratados com imipramina (10 mg/kg) ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m. de 6 a 8 experimentos. A amplitude de contração foi medida gramas de tensão.
BaCl2 (10-2 M) Emáx (g)
falso-operado

desnervado 28 dias
4,45±0,31 4,69±0,37

7 dias veículo imipramina
4,29±0,31 3,99±0,40

21dias
3,66±0,20 4,23±0,20

7 dias
4,17±0,16 3,97±0,21

21dias
4,27±0,16 4,33±0,54

28 dias
4,86±0,20 4,32±0,27

DISCUSSÃO

Discussão 117

Em vista do nosso objetivo de verificar se o tratamento crônico com diferentes antidepressivos poderia favorecer o processo de reinervação que normalmente ocorre após a desnervação do ducto deferente de rato, nossos resultados mostraram que houve indicações de que, em animais tratados cronicamente com pelo menos um dos antidepressivos estudados, haveria um maior teor de neurotransmissores, indicando alterações no padrão de inervação do tecido. Mais especificamente, a análise dos resultados mostrou que em ductos deferentes desnervados obtidos de animais tratados com fluoxetina, a contração induzida pelo agente liberador de noradrenalina, tiramina, foi de maior amplitude do que aquela observada em animais não tratados. Da mesma forma, os estudos de quantificação de catecolaminas mostraram que nos animais tratados com esse antidepressivo, os teores de noradrenalina no tecido foram maiores do que nos animais não tratados. Com o tratamento crônico com desipramina, foi observado que a estimulação elétrica em alta freqüência, causou contração de maior amplitude em ductos deferentes desnervados obtidos de animais tratados do que aquela observada em animais não tratados. Entretanto, embora os resultados só tenham sido estatisticamente significantes nessas situações citadas, em várias outras situações foi observada uma tendência ao aumento de contração por tiramina ou por estímulo elétrico nos ductos deferentes desnervados de animais tratados. Em relação à imipramina, não foi observado aumento das respostas à tiramina ou estimulação elétrica nos animais tratados com esse antidepressivo. Isso indica que em nossas condições experimentais, o tratamento crônico com fluoxetina ou desipramina apresentou uma capacidade de interferir na inervação do tecido, sendo, contudo, essa capacidade bastante limitada no caso do segundo antidepressivo. Para melhor análise dos resultados, inicialmente serão discutidos os efeitos da desnervação sobre o ducto deferente de rato, e em seguida, as conseqüências do tratamento crônico com os antidepressivos sobre o estado de inervação do tecido. Caracterização da desnervação cirúrgica do ducto deferente de rato. Considerando a hipótese de que os antidepressivos teriam a capacidade de facilitar a regeneração neuronal, o que já foi bem mostrado no sistema nervoso central, o esperado no presente trabalho seria que o tratamento crônico com antidepressivos também causasse esse tipo de facilitação em tecidos periféricos. Para tanto, foi analisada a capacidade dos

Discussão 118

antidepressivos em modificar o decurso temporal do processo de desnervação e reinervação do ducto deferente de rato. Para avaliar e caracterizar o estado de inervação do tecido, foram utilizados métodos experimentais indiretos e diretos. Pelo método indireto foram feitos estudos funcionais, nos quais foram analisadas as contrações musculares induzidas por manobras experimentais que levam à liberação de mediadores neuronais, como o uso de tiramina ou de estimulação elétrica do tecido. Pelo método direto, foram quantificados os teores de noradrenalina dos ductos deferentes por método de detecção eletroquímica. A metodologia funcional que analisa o comportamento neuronal indiretamente pela contração muscular induzida por mediadores liberados do terminal nervoso, apesar de indireta, é bastante empregada. Dessa forma, o uso de tiramina ou de estimulação elétrica do tecido, é de grande valia para avaliar a presença ou não de tecido neuronal. A tiramina, um agonista adrenérgico indireto, ao ser captada pelo transportador neuronal de noradrenalina, promove saída de noradrenalina por um mecanismo não exocitótico. Pela estimulação elétrica, em parâmetros que só afetam o tecido nervoso, ocorre despolarização do terminal nervoso e abertura de canais de cálcio dependentes de voltagem o que desencadeia o processo de exocitose. Dessa forma, a contração mediada pela tiramina é especificamente adrenérgica e aquela induzida pelo estímulo elétrico é mediada principalmente por noradrenalina e ATP, que é um cotransmissor do sistema adrenérgico (BURNSTOCK, 1988). A relação entre as quantidades de noradrenalina ou ATP liberado depende de vários fatores como freqüência de estimulação e da fase da resposta observada. Por exemplo, a resposta fásica inicial é mediada preferencialmente por ATP, sendo que na fase tônica o principal mediador liberado é a noradrenalina (LIANG et al., 2000; BOSELLI & GRANA, 2000). A comprovação de que tanto tiramina como a estimulação elétrica promovem contração estritamente por liberação de mediadores, foi confirmado no presente trabalho uma vez que a resposta em tecidos desnervados foi praticamente abolida. Na caracterização inicial do comportamento do ducto deferente desnervado, foi mostrado que as respostas à tiramina e à estimulação elétrica foram bastante reduzidas por volta do 7º dia após a desnervação (figuras 7, 8 e 9), caracterizando esse período como sendo o de desnervação máxima. Em relação à tiramina, na análise dos diferentes períodos estudados, observamos que no 2º dia após a desnervação, ainda ocorreu contração razoável, indicando liberação de noradrenalina e a presença de resposta neuronal. Provavelmente por volta do 2º dia, os neurônios estariam ainda em processo de degeneração, o que explicaria a presença de resposta à tiramina.

Discussão 119

No que concerne à análise da recuperação neural, nossos resultados mostraram uma melhora tempo-dependente da resposta neuronal do tecido. Após o período de desnervação máxima que ocorre, como exposto, por volta do 7º dia, as respostas da tiramina e da estimulação elétrica foram sendo gradualmente recuperadas, conforme o aumento do período de tempo entre a desnervação e o experimento. Aos 35 e 42 dias após a cirurgia, a contração por tiramina, apesar de ainda ser de pequena amplitude, foi estatisticamente maior do que a observada no grupo 7 dias (figura 7). Nos estudos de neuroliberação por estimulação elétrica, houve recuperação parcial das respostas contráteis a partir do 21º dia após a desnervação (figura 8 e 9). Os estudos de quantificação de catecolaminas no tecido mostraram equivalente padrão de alterações nos teores de noradrenalina no tecido, com valores menores aos 7 dias seguido de lenta recuperação aos 21 e 28 dias após a desnervação (figura 18). Decursos temporais semelhantes de desnervação do ducto deferente já foram amplamente demonstrados na literatura. A maioria dos trabalhos mostrou depleção máxima de noradrenalina entre o 7º e o 14º dia após a desnervação, seja por medidas funcionais indiretas ou medidas bioquímicas diretas (KASUYA et al., 1969; BIRMINGHAM, 1970; IVERSEN & JARROTT, 1970; FREITAS, 2004). Portanto a metodologia de desnervação empregada no presente trabalho, assim como os métodos indiretos e diretos utilizados para caracterizar o grau de inervação do tecido constituem-se conjuntamente em um modelo válido para estudo da ação de drogas sobre o padrão de perda e recuperação da atividade neuronal no ducto deferente. Tratamento Crônico com Antidepressivos. Nos estudos funcionais indiretos, os principais indicativos do estado de inervação do tecido foram as respostas à tiramina e ao estímulo elétrico. O conjunto dos resultados mostrou que, em ductos deferentes desnervados, o tratamento crônico com fluoxetina e desipramina causaram em algumas situações, mas não em todas, aumento da amplitude de contração, em relação aos desnervados não tratados, o que poderia indicar um maior teor de neurotransmissores, ou seja, alterações no estado de inervação do tecido. Para a fluoxetina, esse aumento foi obtido em relação à resposta da tiramina (figura 11), e para a desipramina, o aumento ocorreu na amplitude de contração causada por estimulação elétrica (figura 23B). Esses resultados inicialmente levam à sugestão de que haveria uma correlação entre o antidepressivo utilizado e o tipo de estímulo afetado: ou seja, a fluoxetina teria capacidade

Discussão 120

maior de afetar as ações da tiramina e a desipramina afetaria mais as respostas ao estímulo elétrico. Entretanto, a análise mais geral dos resultados obtidos sugere que não existiria esse tipo de diferenciação. Isso por que tal análise mais abrangente dos resultados mostrou uma tendência ao aumento em várias situações, ocorrendo, entretanto, significância estatística apenas em uma ou outra situação experimental, provavelmente pelo ao fato de que a capacidade desses antidepressivos de aumentar os teores de neurotransmissores, ter sido relativamente pequena nesse tecido. Por exemplo, considerando-se o tratamento com desipramina, foi verificado que apesar de que a significância estatística para considerar um aumento de contração só tenha sido obtida aos 7 dias pela estimulação elétrica em alta freqüência (figura 23B) houve uma tendência a esse aumento também em freqüências de 10 Hz (figura 23A) e pelo uso de tiramina (figura 21). O mesmo é válido para fluoxetina: embora a significância só tenha sido obtida em relação às respostas para tiramina (figura 11), uma tendência de aumento também foi observada nos experimentos de estimulação elétrica (figura 13). Dessa forma, seria prematuro, pelos resultados obtidos, tentar quantificar e comparar os efeitos da fluoxetina com os da desipramina, ou concluir que fluoxetina é especifica em afetar as respostas à tiramina e à desipramina, as respostas da estimulação elétrica. Fatores que poderiam estar interferindo nos efeitos dos antidepressivos. Um primeiro ponto a ser discutido é se esse aumento de resposta em ductos deferentes desnervados de animais tratados com antidepressivos, refletiria realmente um aumento de neurotransmissor liberado ou se seria decorrente de modificações adaptativas do tecido muscular, em vista da desnervação ou do tratamento com os antidepressivos. É sabido que apesar de bastante úteis, estudos funcionais que caracterizam a inervação de modo indireto pela contração do tecido, levam a possíveis erros de interpretação devido a esse fato. Ou seja, mesmo que não ocorra alteração na densidade de inervação ou no conteúdo de neurotransmissores, as respostas aos agentes neuroliberadores podem estar alteradas se houver modificações adaptativas principalmente no tecido muscular. Para descartar essa possibilidade, foram feitos experimentos controles com diferentes tipos de agonistas para avaliar a reatividade de receptores não só pós-sinápticos, da musculatura lisa, mas também de receptores pré-sinápticos, como por exemplo, receptores α2adrenérgicos que modulam negativamente a exocitose. A reatividade pós-sináptica foi analisada pela resposta do tecido ao agonista α1-adrenérgico, fenilefrina, ao ATP e ao cloreto

Discussão 121

de bário e a reatividade pré-sináptica foi avaliada pela resposta do agonista α2-adrenérgico, clonidina. Considerando as alterações decorrentes da desnervação, é bem conhecido o fato de que a falta de inervação do tecido leva ao desenvolvimento de supersensibilidade do tecido muscular, podendo ocorrer potencialização, portanto, da contração induzida por mediadores endógenos ou exógenos. Essa supersensibilidade foi verificada nos nossos experimentos para as respostas da fenilefrina, tendo sido caracterizada por um aumento de potência, ou seja, pelo deslocamento das curvas concentração-efeito para esquerda e, na maior parte dos casos por aumento de efeito máximo (figura 15, 25 e 32). A ocorrência de supersensibilidade α1adrenérgica no ducto deferente já foi amplamente descrita pela literatura (KASUYA et al., 1969; HATA et al., 1980; GARCEZ-DO-CARMO, 1995; CORDELLINI, & SANNOMIYA, 1999). Em relação ao ATP, observamos que a supersensibilidade, caracterizada pelo aumento da amplitude de contração, ocorreu de modo mais irregular tendo sido verificada em algumas, mas não em todas as situações (figura 16, 26 e 33). Para o cloreto de bário, nas nossas condições experimentais, não foi observada a ocorrência de supersensibilidade. A ocorrência de supersensibilidade ao ATP e ao cloreto de bário é descrita na literatura de modo relativamente contraditório, sendo que alguns autores relatam a ocorrência de supersensibilidade a esses agonistas, enquanto outros não conseguiram observar tal efeito (SANNOMIYA & DE MORAES, 1981b; QUINTAS et al., 2002). De qualquer forma, no presente trabalho as alterações causadas pela desnervação na contratilidade muscular não interferem na análise dos efeitos do tratamento crônico com os antidepressivos, uma vez que dentro de nosso objetivo de analisar as conseqüências do tratamento com antidepressivos sobre o padrão de reinervação, a comparação a ser feita é entre grupos na mesma situação de protocolo cirúrgico, ou seja, os resultados obtidos no grupo desnervado tratado com antidepressivo foram comparados aos efeitos obtidos no grupo também desnervado, mas não tratado, um grupo portanto, que passou pelas mesmas alterações decorrentes da desnervação que o grupo tratado. Assim, as conseqüências do tratamento crônico com os diferentes antidepressivos sobre a reatividade do tecido muscular devem ser consideradas. Não só o bloqueio crônico da recaptação neuronal de monoaminas, que é o mecanismo básico de ação desses antidepressivos, mas também alguma outra ação qualquer dessas drogas poderia estar afetando a reatividade do tecido e como conseqüência, alterando os efeitos de mediadores endógenos. Particularmente qualquer alteração que potencializasse os efeitos de agonistas adrenérgicos ou purinérgicos, ou que causasse uma potencialização inespecífica do tecido

Discussão 122

poderia estar sendo responsável pelos aumentos dos efeitos de tiramina ou de estimulação elétrica, que foram observados nos grupos desnervados e tratados pelos antidepressivos. O tratamento com fluoxetina, como visto, causou aumento nas respostas à tiramina no grupo desnervado. Como a contração por tiramina é mediada exclusivamente por noradrenalina, o controle pós-sináptico de suas ações seria feito pela análise dos efeitos de um agonista α1-adrenérgico, tendo sido usada, a fenilefrina. Os experimentos com esse agonista (figura 15 e tabelas 4 e 5) mostraram que em todos os outros grupos, desnervados ou falsooperados, o tratamento com fluoxetina não causou alterou as respostas da fenilefrina, nem no que diz respeito ao efeito máximo, nem em relação ao deslocamento das curvas para esquerda (aumento de pD2). Também as respostas ao cloreto de bário, o qual causa contração mais inespecífica do ducto deferente ou as respostas ao ATP, não foram alteradas pelo tratamento com fluoxetina (figura 16 e 17). Ou seja, o tratamento crônico com fluoxetina não alterou diretamente a reatividade do tecido muscular, sendo portanto, o aumento das respostas da tiramina, causado pelo tratamento com fluoxetina, muito provavelmente decorrente de alterações na quantidade de noradrenalina liberada. O mesmo tipo de análise foi feito em relação ao tratamento crônico com desipramina que acarretou, em ductos de deferentes desnervados, aumento das respostas induzidas por estimulação elétrica. Como a resposta obtida pela estimulação elétrica considerada nesse trabalho foi a resposta fásica, que tem como transmissor principal o ATP, foram analisadas as respostas ao ATP exógeno, para verificar a reatividade purinérgica do músculo liso. Os resultados mostraram que em todos os grupos estudados, o tratamento com esse antidepressivo não alterou a resposta ao ATP (figura 26). Apesar de que nas contrações fásicas a proporção de ATP é bem maior do que a de noradrenalina, haveria também liberação em menor quantidade desse transmissor. Dessa forma, a análise das conseqüências do tratamento com desipramina sobre os efeitos de fenilefrina também seria importante. Nesse sentido, não foram observadas diferenças nos efeitos de fenilefrina, tanto nos grupos falsooperados como nos desnervados, com exceção do grupo 21 dias, onde o tratamento causou aumento de efeito máximo desse agonista no grupo desnervado. Esse aumento no grupo 21 dias poderia indicar que o aumento nas respostas do estimulo elétrico no grupo desnervado tratado com desipramina poderia ser decorrente dessa ação sobre o tecido muscular. Entretanto, esse aumento só foi visto no grupo 21 dias, mas em nenhum outro grupo. Nesse aspecto, deve-se destacar que o efeito potencializador da desipramina sobre a resposta do ducto deferente à estimulação elétrica foi estatisticamente significante no 7º dia e não no 21º dia (figura 23B) após a desnervação. Além disso, como já abordado, não foram vistas

Discussão 123

alterações na resposta ao ATP exógeno, que seria o mediador principal para controle póssináptico de contrações fásicas por estimulação elétrica. Dessa forma, não existem indicações de que o aumento de respostas aos agentes neuroliberadores em ductos deferente desnervados, causado pelo tratamento com antidepressivos, possa ser resultados de alterações na reatividade muscular. Outra possibilidade a ser considerada seria as conseqüências do excesso crônico de noradrenalina causado pelo bloqueio de recaptação durante o tratamento com os antidepressivos. Os antidepressivos utilizados para esse estudo pertencem à classe dos inibidores de recaptação de monoaminas, tendo sido escolhidas a fluoxetina (seletiva para o recaptação de serotonina), a desipramina (seletiva para noradrenalina) e a imipramina (não seletiva, inibindo de maneira semelhante os dois tipos de recaptadores). O ducto deferente de rato é um tecido ricamente inervado pelo sistema adrenérgico. Dessa forma, desipramina e imipramina promovem o esperado bloqueio de recaptação de noradrenalina, já amplamente descrito na literatura (FEIGHNER, 1999; KENT, 2000). Apesar da presença de uma inervação serotoninérgica no ducto deferente ser bastante controversa e não ser de nosso conhecimento a descrição da presença de recaptador para serotonina nesse tecido, a fluoxetina também tem capacidade de atuar nesse tecido uma vez que ela é seletiva, mas não especifica para o recaptador de serotonina (MASAND & GUPTA, 1999). Ou seja, ela também produz, em uma faixa de concentração um pouco mais alta, a inibição da recaptação de noradrenalina. Isso pode ser evidenciado no presente trabalho, nos experimentos em que foi analisada a capacidade de essas drogas inibirem a recaptação de noradrenalina in vitro (figura 10). As três drogas inibiram a recaptação de noradrenalina o que foi caracterizado pelo deslocamento das curvas de noradrenalina para esquerda. Entretanto a inibição causada pela fluoxetina, como esperado, só foi conseguida em uma faixa de concentrações mais alta do que aquelas empregadas com desipramina e imipramina. A capacidade de a fluoxetina inibir, nessa faixa de concentração, a recaptação de noradrenalina no ducto deferente de rato já foi mostrada anteriormente (VELASCO, et al., 1997; BUSCH et al., 2000). Dessa forma, durante o tratamento crônico com antidepressivos, o excesso de noradrenalina na fenda sináptica em decorrência do bloqueio de recaptação, poderia levar à dessensibilização tanto de receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos ou receptores α1adrenérgicos pós-sinápticos. É importante ser analisada principalmente uma possível dessensibilização de receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos, os quais sabidamente modulam negativamente o processo de exocitose. Uma dessensibilização desses receptores levaria a uma maior

Discussão 124

facilidade de neuroliberação pelo estímulo elétrico. Nesse sentido, o aumento das respostas à estimulação elétrica, causado pelo tratamento crônico com os antidepressivos poderia ser devido a essas alterações e não necessariamente devido a uma reinervação mais eficiente. A capacidade de o tratamento crônico com desipramina levar à dessensibilização de receptores pré-sinápticos α2-adrenergicos já foi descrita em literatura (GARCIA-SEVILLA & ZUBIETA, 1986; SACCHETTI et al., 2001). Por esse motivo, no presente trabalho foram realizados experimentos controles para verificar o estado de reatividade de receptores α2adrenérgicos, sendo testada a capacidade de um agonista desse tipo de receptor, a clonidina, de inibir a contração por estimulação elétrica. Os resultados mostraram que o tratamento crônico com fluoxetina não foi capaz de alterar a reatividade desses receptores (figura 14). Por outro lado, o tratamento crônico com desipramina levou a uma dessensibilização dos receptores α2-adrenérgicos no grupo 28 dias, já que a curva de clonidina foi deslocada para direita (figura 24). Dessa forma, essa dessensibilização poderia tornar o processo exocitótico mais fácil, favorecendo portanto, a contração por estímulo elétrico. Entretanto, não ocorreu uma correlação temporal entre aumento das respostas ao estímulo elétrico e dessensibilização dos receptores α2-adrenérgicos, uma vez que a dessensibilização decorrente do tratamento com desipramina só ocorreu em períodos mais longos (28 dias) e o aumento de resposta ao estímulo elétrico causado pela desipramina foi visto somente aos 7 dias. Além do mais, se o aumento das respostas fosse devido à dessensibilização α2-adrenérgica, seria de se esperar que nos animais falso-operados e tratados com desipramina, houvesse também um aumento nas respostas à estimulação elétrica, o que não ocorreu (figuras 23). Portanto, apesar de as drogas bloqueadoras de recaptação neuronal terem a capacidade de dessensibilizar receptores α2-adrenérgicos, esse fato não parece ter influído na facilitação da recuperação da resposta do ducto deferente desnervado por elas promovida. Isso indica que apesar de bloquear a recaptação neuronal, nas nossas condições experimentais, pelo protocolo de tratamento empregado, o aumento de neurotransmissores na fenda sináptica causado pelos antidepressivos não foi suficiente para levar a uma dessensibilização significativa. Nosso protocolo de tratamento, tanto no que diz respeito à dose do antidepressivo como ao tempo de tratamento, foi baseado em dados de literatura. Em estudos no sistema nervoso central, vários autores empregaram a dose de 10 mg/Kg para tratamento crônico com fluoxetina, desipramina ou imipramina, tendo sido observado nessas condições, tanto aumento da neurogênese, como aumento dos níveis de BDNF em várias regiões cerebrais (MANEV et al., 2001; DE FOUBERT et al., 2004; MOLTENI et al.,

Discussão 125

2006). Nesses mesmos estudos, o período de tratamento foi de 10 a 20 dias. O tratamento com fluoxetina durante o período de 10 dias em experimentos in vitro e in vivo foi suficiente para promover o aumento da proliferação de células neurais em áreas do cérebro de ratos (MALBERG et al., 2000, MANEV et al., 2001). No sistema nervoso central o acesso de drogas até as áreas cerebrais é dificultado pela barreira hemato-encefálico sendo o acesso aos tecidos inervados pelo sistema nervoso periférico em geral mais fácil. Dessa forma, tudo indica que o tratamento com doses sugeridas pela literatura, aptas a proporcionarem alterações plásticas no sistema nervoso central, garantiria o acesso dos antidepressivos ao tecido periférico, possibilitando possíveis alterações na plasticidade neuronal. Assim, em nossos experimentos empregamos protocolos semelhantes e iniciamos o tratamento previamente à desnervação para que quando a desnervação fosse realizada as vias responsáveis pelo aumento da plasticidade neuronal já estivessem facilitadas. Outro fator que poderia estar interferindo nas respostas funcionais seria a presença residual do antidepressivo durante o experimento in vitro. Pelo protocolo de tratamento, a última injeção com o antidepressivo em estudo foi administrada 24 horas antes do sacrifício do animal, para permitir que durante o experimento propriamente dito, a presença da droga no tecido fosse mínima. Para verificar se esse espaço de 24 horas seria suficiente para evitar interferências desse tipo, foram feitos os experimentos de tratamento agudo, no caso com fluoxetina. Nesses experimentos, a fluoxetina foi administrada por meio de injeção única, 24 horas antes da morte do animal. Nessas condições, foi observado que esse tratamento agudo com a fluoxetina não interferiu nas ações da tiramina tanto nos ductos deferentes desnervados como falso-operados (figura, 20) demonstrando que caso ainda houvesse concentrações residuais do antidepressivo na biofase, elas não seriam suficientes para afetar as respostas promovidas pela tiramina. Dessa forma, eliminadas as possibilidades de que alterações pós-sinápticas decorrentes da desnervação ou do tratamento, ou mesmo que uma possível presença dos antidepressivos durante os experimentos fossem fatores que pudessem estar interferindo nos resultados obtidos, podemos considerar que os aumentos de resposta à tiramina ou ao estímulo elétrico observados em ductos deferentes desnervados de animais tratados com fluoxetina ou desipramina tenham sido resultantes de uma maior disponibilidade de neurotransmissores para a contração. Nesse sentido, os experimentos de quantificação de catecolaminas por detecção eletroquímica, fornecem o principal indicativo de que realmente ocorreu aumento nos níveis de noradrenalina no tecido. Essas dosagens mostraram que em ductos deferentes desnervados

Discussão 126

obtidos de animais tratados cronicamente com fluoxetina, os teores de noradrenalina foram maiores do que aqueles vistos em desnervados não tratados, nos três períodos de tempo estudados, ou seja, 7, 21 e 28 dias (figura 18). Medidas mais diretas da inervação, seja por dosagens bioquímicas, por detecção eletroquímica ou estudos histológicos, são bastante importantes, pois descartam a possibilidade de que possíveis alterações observadas pelas análises indiretas sejam conseqüentes não de um aumento de neurotransmissores ou de inervação, mas sim a alguma modificação no tecido muscular, como já discutido. Entretanto, os estudos funcionais indiretos também são de importância, pois esses estudos indicam se, paralelamente à recuperação da inervação e dos níveis de noradrenalina neuronal, estaria ocorrendo também uma recuperação da função neuronal, ou seja, se esses neurônios regenerados seriam viáveis. Mais um fato interessante observado foi que, considerando-se as situações experimentais em que foram obtidas diferenças após o tratamento com fluoxetina ou desipramina, verificou-se que essas alterações só foram estatisticamente significantes, nos grupos desnervados por 7 ou 21 dias, mas não por 28 dias. Inclusive, aos 28 dias com o uso de desipramina ou imipramina, foi observada nos deferentes desnervados, em várias situações, uma diminuição ou uma tendência à diminuição da resposta nos ductos deferentes de animais tratados, quando comparado aos não tratados (figuras 21, 23, 30). Entretanto, os estudos de quantificação por detecção eletroquímica (realizados em animais tratados com fluoxetina) mostraram um maior teor de noradrenalina mesmo aos 28 dias (figura 18). Isso seria sugestivo, portanto, de que a não ocorrência do aumento nas respostas de tiramina ou estimulação elétrica após 28 dias, seria devida a outras alterações no tecido que poderiam estar mascarando os efeitos do aumento de noradrenalina. Ou seja, além de inibir a recaptação neuronal, esses antidepressivos, principalmente a desipramina e a imipramina, poderiam ter algum tipo de ação que se manifestaria tardiamente e que levaria ao comprometimento da contração nos deferentes desnervados. Vários trabalhos mostram que drogas como a imipramina, desipramina ou mesmo a fluoxetina têm a capacidade de inibir canais de cálcio dependentes de voltagem (BUSCH et al., 2000; MEDINA et al., 2000), assim como os canais de potássio e de sódio, (NICHOLSON et al., 2002) e modular a Na+/K+ ATPase (VIOLA et al., 1994). Portanto, é concebível que os efeitos finais relacionados ao tratamento com antidepressivos sejam decorrentes de uma combinação de mecanismos envolvendo bloqueio de recaptação e efeitos em sistemas de canais iônicos ou outro tipo de efeito que poderiam ocorrer a curto ou a longo. Entretanto, além de não termos uma explicação exata sobre o mecanismo que estaria levando a essa inibição, também não podemos explicar o fato de que

Discussão 127

esse efeito só tenha se manifestado após longos períodos de tratamento e só em ductos deferentes desnervados e não nos falso-operados. Talvez essa seja uma explicação para o fato do tratamento com imipramina não ter sido capaz de causar nenhum aumento ou mesmo tendência a aumento das respostas à tiramina ou ao estímulo elétrico. Em estudos sobre regeneração neuronal no sistema nervoso central, foi mostrado que não só os antidepressivos fluoxetina e desipramina, mas também a imipramina promoveram um aumento na neurogênese e da viabilidade neuronal em diferentes estruturas cerebrais (MANEV et al., 2001, SANTARELLI et al., 2003). Foi mostrado também, no córtex pré-frontal de ratos, que assim como a desipramina e a fluoxetina, o tratamento crônico com imipramina foi capaz de causar aumento dos níveis de RNA mensageiros para proteínas diretamente ligadas aos fatores neurotróficos (NIBUYA et al., 1995). Dessa forma seria de se esperar que no ducto deferente, também a imipramina facilitasse a reinervação, o que não ocorreu. Caso a imipramina tenha uma maior capacidade de levar a esses possíveis efeitos inibitórios descritos acima, essa hipotética maior capacidade justificaria a ausência de efeito facilitatório sobre as ações de tiramina ou estímulo elétrico. Essa capacidade dos antidepressivos, principalmente desipramina e imipramina, de levar a uma diminuição da resposta à tiramina ou à estimulação elétrica nos grupos por 28 dias é bastante interessante, no sentido de que só foi observado em ductos deferentes desnervados. Esse fato dificulta a aceitação de que o efeito seja devido a uma ação inespecífica desses antidepressivos, uma vez que se esse fosse o caso, também nos animais falso-operados essa diminuição deveria ocorrer. Além disso, em experimentos controles, nos quais foram analisadas as ações pós-sinápticas de fenilefrina, ATP e cloreto de bário, o tratamento com os antidepressivos não causou em nenhuma situação, uma diminuição nas respostas desses agentes. Dessa forma, se o antidepressivo estivesse afetando canais iônicos de membrana, ou causando outro efeito inespecífico, seria de se esperar que as respostas a esses agonistas, seja nos animais desnervados ou nos falso-operados, estivessem também diminuídas, o que não ocorreu. As indicações são, portanto, de que a tendência dos antidepressivos de levar a uma diminuição da resposta de agentes neuroliberadores é um efeito que ocorre mais tardiamente e somente nos ductos deferentes desnervados.

Discussão 128

Possíveis mecanismos envolvidos nos efeitos facilitatórios da neurotransmissão, causados pelo tratamento crônico com os antidepressivos. E por fim, alguns comentários deveriam ser feitos sobre os possíveis mecanismos envolvidos nesta facilitação de neurotransmissão causada pelo tratamento crônico com antidepressivos. Apesar de que o assunto não esteja completamente esclarecido, os avanços nas pesquisas sobre o mecanismo de ação dos antidepressivos no sistema nervoso central, como exposto na introdução, mostram que existe uma relação entre um aumento da neurotransmissão promovido pela inibição da recaptação ou da metabolização de aminas biogênicas, e um aumento da cascata de sinalização mediada por componentes intracelulares como AMPc/PKA, CaCMK, entre outros. Esses mediadores levariam à ativação do fator de transcrição, CREB, o qual é responsável pelo controle de síntese de fatores neurotróficos tais como o BDNF e NGF (ALTAR, 1999; TAKEBAYASHI et al., 2002; HUANG & REICHARDT, 2003). Vários trabalhos vêm mostrando também a possibilidade de uma ação direta facilitatória dos antidepressivos sobre a cascata de sinalização da adenilil ciclase/AMPc, que ocorreria de modo independente do aumento de monoaminas na biofase (NESTLER et al., 1989; HENSLER, 2002; DONATI & RASENICK, 2003; LI et al., 2003). Nas nossas condições experimentais e pelos resultados apresentados, não podemos avaliar o papel de cada um desses fatores nos efeitos observados. Como o ducto deferente é um órgão basicamente de inervação adrenérgica, provavelmente a noradrenalina seja a amina de maior importância envolvida nos efeitos dos antidepressivos estudados. No que diz respeito à participação do bloqueio de recaptação como uma etapa importante no processo, em um primeiro momento poderia ser considerado que esse fator não seria relevante uma vez que não houve correlação entre a ordem de potência inibidora de recaptação (D≥I>F) como visto na figura 10 e a capacidade de potencializar a reinervação do ducto deferente (F=D>I). Entretanto deve ser lembrado que esses resultados foram obtidos por métodos funcionais indiretos e outros possíveis efeitos específicos dos antidepressivos poderiam estar interferindo na análise, como já discutido anteriormente em relação aos efeitos inibitórios observados em grupos desnervados por 28 dias. Para esclarecer esse ponto seria importante realizar a quantificação bioquímica de catecolaminas de modo direto, não só após o tratamento com fluoxetina, como mostrado nos resultados, mas também após o tratamento com desipramina e imipramina, o que não foi realizado nesse trabalho por limitações alheias a nossa vontade. Dessa forma poderia ser comparada a ordem de potência do aumento dos teores de noradrenalina com a ordem de potência inibidora da recaptação.

Discussão 129

No que diz respeito à serotonina, sua importância nos efeitos de antidepressivos no sistema nervoso central, já está bem mostrada. Ao ser bloqueada a recaptação neuronal dessa amina pelos antidepressivos, ocorre um aumento da transmissão serotoninérgica, facilitando a formação de fatores neurotróficos e a viabilidade neuronal (DUMAN et al., 1999; MASAND & GUPTA, 1999). Dessa forma, no presente trabalho em ducto deferente, a serotonina poderia estar tendo uma participação nos efeitos facilitatórios da neurotransmissão, observados com o tratamento crônico com fluoxetina ou desipramina. Entretanto, embora não possa ser descartada uma possível participação dessa amina nessa facilitação, nossos resultados não indicam seu envolvimento no processo. No ducto deferente de rato já foi descrita a presença de serotonina principalmente em mastócitos, que teriam as enzimas necessárias para síntese de serotonina e de outras substâncias como, por exemplo, a histamina (FUENMAYOR et al., 1976; CELUCH & SLOLEY, 1988; 1989). Foi mostrado também que essa amina pode ser encontrada em pequenas quantidades em terminais simpáticos, os quais podem captar e armazenar serotonina (LUCCHELLI et al., 1984; JURKIEWICZ et al., 1999). Uma inervação especificamente serotoninérgica nesse tecido não foi ainda demonstrada. A presença de serotonina no ducto deferente de rato foi por nós confirmada a partir dos experimentos de quantificação bioquímica. Os teores obtidos, entretanto, foram bastante inferiores (na faixa de 0,4 ρmol/mg de tecido, figura 19) do que aqueles obtidos para noradrenalina (faixa de 300 ρmol/mg de tecido, figura 18). Após a desnervação do tecido, foi observada no grupo 7 dias tratado com veículo uma queda estatisticamente significante nos teores de serotonina. Essa queda, de cerca de 40% foi bem menos acentuada do que a que ocorreu com noradrenalina (queda de cerca de 94%). Em estudos semelhantes, Freitas (2004) mostraram que a desnervação por 4 dias causou uma queda nos teores de serotonina no ducto deferente de rato, na mesma faixa observada no presente trabalho. Essa queda de pouca amplitude indica que a quantidade de serotonina neuronal no ducto deferente é pequena, o que estaria de acordo com os dados de literatura que mostram como já mencionado, que a maior parte de serotonina nesse tecido estaria em tecidos não neuronais, como mastócitos, por exemplo. Ao se analisar as conseqüências do tratamento crônico com fluoxetina sobre os níveis de serotonina, mostramos que em nenhuma situação o tratamento com esse antidepressivo alterou os teores de amina no tecido, quando comparado ao respectivo grupo tratado com veículo. Esse fato, além dos resultados que mostraram que a quantidade de serotonina é bastante reduzida no ducto deferente e sua presença em neurônios não é tão evidente como a presença de noradrenalina neuronal, sugerem, portanto, que provavelmente essa amina não

Discussão 130

teria uma participação mais evidente nos efeitos do tratamento crônico com fluoxetina ou desipramina sobre a inervação simpática. É importante frisar que a análise das respostas funcionais refere-se a resultados obtidos em ductos deferentes de animais submetidos à eutanásia 24 horas após a última injeção dos respectivos tratamentos. Com efeito, principalmente nos casos da fluoxetina e a imipramina, seria de se esperar um considerável aumento da disponibilidade sináptica de serotonina durante o tratamento farmacológico, uma vez que o bloqueio da captação da serotonina é um dos principais mecanismos de ação dessas drogas. Não obstante, a inefetividade da imipramina em facilitar a reinervação, em contraste com a efetividade da fluoxetina advogam, mais uma vez, que as alterações serotoninérgicas não foram cruciais para os resultados apresentados nesta tese. Ainda em relação à serotonina, um fato interessante, que também foi observado por Freitas (2004), foi que em períodos mais tardios de desnervação (21 e 28 dias), ocorreu um acentuado aumento nos níveis de serotonina no tecido, ultrapassando os valores obtidos nos grupos não desnervados. Resultado semelhante, mas considerando os níveis de histamina, foi observado por Campos (1988), que observou em ductos deferentes de rato desnervados, uma depleção de histamina após 7 dias de desnervação, seguida por um gradual acúmulo de histamina em mastócitos superando os níveis do grupo controle. Em outro tecido que não o ducto deferente também foi observado fato semelhante, tendo sido mostrado por Bergerot e colaboradores (2000), que 60 dias após a simpatectomina do gânglio cervical superior, ocorreu um aumento nos níveis de 5-HT quando comparado a grupos controles. Nesse mesmo estudo, os autores mostraram que a diminuição da atividade simpática após a desnervação, apesar de não alterar inicialmente a densidade e atividade de mastócitos, causa após um período mais prolongado de desnervação, mudanças complexas na atividade de síntese e no processo exocitótico de mastócitos (BERGEROT et al., 2000). Dessa forma, poderia haver um envolvimento de mastócitos nos aumentos de serotonina observado por nós após um período mais prolongado de desnervação. Os motivos que levam a essas alterações mastocitárias não estão claros, mas poderia haver uma participação colinérgica no processo. Reynier-Rebuffel e colaboradores (1992, 1994, 1997) demonstraram que agentes colinérgicos e peptidérgicos estimulam a ativação dos mastócitos, levando a um aumento da síntese e liberação de 5-HT em tecido vascular cerebral. O fato de que o aumento ocorre mais tardiamente pode ser explicado pelo conhecido fato de que a desnervação simpática pode induzir um aumento tardio da inervação parassimpática (HYATT-SACHS et al., 1996). Por técnicas de microscopia eletrônica Evans e colaboradores (1979) fizeram um estudo

Discussão 131

analisando por um período de um ano, o padrão de reinervação do ducto deferente após simpatectomia, tendo sido mostrado que após esse tempo o número dos axônios adrenérgicos era similar àquele dos controles, sendo essa reinervação acompanhada paralelamente por um grande aumento de axônios não adrenérgicos, provavelmente colinérgicos. Dessa forma, a desnervação poderia estar levando a um aumento tardio de inervação colinérgica, que promoveria o aumento de síntese de 5HT pelos mastócitos. Outra possível ação dos antidepressivos poderia estar relacionada à ação direta sobre a cascata de sinalização mediada por AMPc e PKA que ocorre de maneira independente do transmissor (CHEN & RASENICK, 1995b). Foi mostrada a capacidade de antidepressivos causarem aumento de AMPc por facilitação do acoplamento da proteína G com a adenilil ciclase, sem a necessidade de ativação de receptor (CHEN & RASENICK, 1995a; 1995b; LI et al., 2003; HENSLER, 2002). Também foi mostrado que a cinase ativada pelo AMPc, a PKA, tem seus níveis aumentados pelo tratamento com antidepressivos (NESTLER et al., 1989; PEREZ et al, 1989). Nesse sentido, vem sendo mostrado, no sistema nervoso periférico, que tratamentos farmacológicos que aumentam os níveis de AMPc, como o uso de rolipram (O´DONNELL & ZHANG, 2004; NIKULINA et al., 2004), ou que mimetizem sua ação, como o dibutiril AMPc (MONSUL et al., 2004) levam a uma melhor evolução do crescimento e regeneração neuronal (CHIERZI et al., 2005). No ducto deferente, apesar da pouca participação de receptores associados à via de sinalização por AMPc, já foi comprovada a presença de AMPc assim como sua enzima de síntese, a adenilil ciclase (BHOOLA & PAY, 1986; SAFRANY & SHEARS, 1998; QUEIROZ et al., 2004). Dessa forma, poderia haver uma participação desse segundo mensageiro nos efeitos observados pelo tratamento com fluoxetina e desipramina. É importante observar também, que independentemente do mecanismo envolvido, esse efeito favorecedor da neurotransmissão praticamente só ocorreu em tecido em fase de regeneração, ou seja, nos ductos deferentes desnervados. Como o aumento de liberação e dos teores de noradrenalina foi bastante pequeno, talvez esse efeito só tenha sido evidenciado nos ductos desnervados porque nessa situação outros estímulos intrínsecos ao processo regenerativo estariam aumentando também a quantidade de neurotrofinas ou de outra substância qualquer que favoreceria a regeneração. Dessa forma, a ação dos antidepressivos se somaria a esses estímulos regenerativos (os quais não ocorrem no tecido normal) favorecendo e evidenciando o processo. Chamou a atenção também o fato de que apesar de o tratamento com os antidepressivos ter facilitado de alguma forma a recuperação da inervação no ducto deferente

Discussão 132

desnervado, esse efeito apresentou uma magnitude limitada. Diferentemente do sistema nervoso central, o sistema nervoso periférico possui uma grande capacidade regenerativa. Esse evento é atribuído a um ambiente mais permissivo à regeneração no sistema nervoso periférico, não só pela presença de fatores tróficos presentes nos tecidos alvo (AGUAYO et al., 1981), mas também pela a ausência de fatores inibitórios, como por exemplo, a proteína NOGO, a qual restringe o crescimento neuronal no sistema nervoso central (DOMENICONI & FILBIN, 2005). O trato urogenital é rico em neurotrofinas, sendo o ducto deferente um dos órgãos com as concentrações mais altas de RNAm para NGF (HEUMANN et al., 1984; GOEDERT et al., 1986). Os níveis de RNAm para NGF estimados por hibridização apresentam-se mais abundantes no ducto deferente, seguido pelo epidídimo, vesícula seminal e testículos (MACGROGAN et al., 1991). Além disso, uma grande quantidade de receptores TrkA e p75NT foi detectado no ducto deferente (KEAST & KEPPER, 2001). Dessa forma, seria de se esperar uma ação mais significativa desses antidepressivos sobre a reinervação do tecido. Isso pode não ter acontecido por vários fatores. Em primeiro lugar, embora o protocolo de tratamento tenha sido baseado em dados de literatura, talvez nas nossas condições experimentais a quantidade de antidepressivos não tenha sido suficiente para causar um efeito maior. Outra possibilidade seria a de que outros efeitos dos antidepressivos estivessem mascarando os aumentos nos teores de noradrenalina, conforme discutido anteriormente. E a última possibilidade seria uma menor sensibilidade de tecidos periféricos (ou pelo menos do ducto deferente) aos efeitos facilitadores da plasticidade neuronal promovido pelos antidepressivos. São poucos os estudos dos efeitos de antidepressivos sobre a regeneração neuronal em tecidos periféricos. Nesse sentido, foi mostrado, por meio de estudos histológicos, que o tratamento crônico com fluoxetina levou a um maior crescimento e melhor reorganização axonal após a lesão da retina de ratos (BASTOS et al., 1999). Entretanto nesse estudo histológico a análise foi qualitativa, sendo difícil portanto, determinar se foi um efeito intenso ou não. Dessa forma, concluindo, o presente estudo mostrou que o tratamento com antidepressivos causou alterações neuroquímicas e funcionais indicativas de uma maior capacidade regenerativa da inervação periférica. Embora a magnitude dessa capacidade tenha sido limitada, os resultados encorajam estudos futuros no sentido de determinar situações que favoreçam a ocorrência desse efeito de modo mais significativo.

CONCLUSÕES

Conclusões 134

Antidepressivos inibidores de recaptação neuronal de monoaminas são capazes de facilitar regeneração neuronal no sistema nervoso central. Após a desnervação cirúrgica do ducto deferente de rato é iniciado um processo de reinervação do tecido. Nosso objetivo foi verificar se o tratamento crônico com os antidepressivos, fluoxetina, desipramina e imipramina alterariam o padrão dessa reinervação. Nesse sentido observamos que: - Após 7 dias de desnervação do ducto deferente de rato a contração do tecido muscular em resposta à estimulação elétrica, em parâmetro que promovem unicamente neuroliberação, ou à tiramina, droga que promove liberação de noradrenalina dos terminais nervosos, é mínima, havendo gradual recuperação da resposta aos 21, 28, 35 e 42 dias. Da mesma forma, em estudos de quantificação de catecolaminas endógenas por cromatografia líquida, foi observado que os níveis de noradrenalina estão mais baixos 7 dias após a desnervação aumentando gradualmente após 21 e 28 dias. - Em ductos deferentes desnervados por 7 ou 21 dias, obtidos de animais tratados cronicamente com fluoxetina, a resposta contrátil induzida pela tiramina foi maior do que aquela observada em ductos deferentes desnervados de animais tratados com veículo. - Em estudos de quantificação de catecolaminas endógenas, foi observado, em ductos deferente desnervados por 7, 21 e 28 dias obtidos de animais tratados cronicamente com fluoxetina, que os níveis de noradrenalina estavam aumentados quando comparados aos respectivos controles desnervados tratados com veículo. - Em ductos deferentes desnervados por 7 dias obtidos de animais tratados cronicamente com desipramina, a resposta contrátil induzida pela estimulação elétrica foi maior do que aquela observada em ductos deferentes desnervados obtidos de animais tratados com veículo. - Em ductos deferentes obtidos de animais falso-operados tratados com fluoxetina ou desipramina, de modo geral não foram observadas alterações no padrão de resposta à

Conclusões 135

estimulação elétrica ou à tiramina, assim como, no caso do tratamento com fluoxetina, nos teores de noradrenalina endógena, quando comparados a controles tratados com veículo. - Os resultados obtidos, ou seja, o aumento da resposta à tiramina, observado em deferentes desnervados tratados com fluoxetina, assim como o aumento da resposta por estimulação elétrica, obtido nos deferentes de animais tratados com desipramina, não foram decorrentes de alterações adaptativas pós-sinápticas do tecido muscular devido ao tratamento, uma vez que em todas as situações estudadas, em ductos deferentes provenientes de animais tratados com os antidepressivos, a resposta contrátil aos agonistas de ação pós-sinápticas, fenilefrina, ATP, BaCl2 não foram alteradas quando comparadas com àquelas obtidas nos controles não tratados. Também possíveis alterações em receptores α2-adrenérgicos, que modulam negativamente a exocitose de noradrenalina, não estariam levando ao aumento de resposta uma vez que não foram observadas diferenças em curvas concentração efeito inibitórias de clonidina, com exceção do tratamento mais prolongado com desipramina. - O tratamento crônico com imipramina, em todas as situações estudadas, não alterou a resposta contrátil do ducto deferente de rato. Esses resultados indicam que, embora de modo limitado, o tratamento com alguns antidepressivos estudados, (fluoxetina e desipramina) levou a uma maior capacidade regenerativa da inervação periférica no ducto deferente de rato. Essa conclusão foi tomada baseada em evidências indiretas, pela resposta do tecido a processos que levam a neuroliberação, e evidências diretas, pela dosagem de noradrenalina endógena. Em ambas as situações os resultados indicaram um maior teor de noradrenalina nos ductos deferentes desnervados obtidos de animais tratados com os antidepressivos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

137

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
ABDEL-LATIF, A.A.; AKHTAR, R.A.; ZHOU, C.J. Effects of surgical sympathetic denervation on G-protein levels, alpha and beta-adrenergic receptors, cAMP production and adenylate cyclase activity in the smooth muscles of rabbit iris. Curr Eye Res.;14(5):405-11, 1995. ABEL, P.W.; JOHNSON R.D.; MARTIN T.J.; MINNEMAN K.P. Sympathetic denervation does not alter the density or properties of alpha-1 adrenergic receptors in rat vas deferens. J Pharmacol Exp Ther.;233(3):570-7, 1985. ABERDEEN, J.; MOFFITT, D.; BURNSTOCK, G. Increases in NPY in non-sympathetic nerve fibres supplying rat mesenteric vessels after immunosympathectomy.; Regul Pept. 11; 34(1):43-54, 1991. ABRAHAM, S.T.; RICE, P.J. Absence of denervation supersensitivity to neurokinin A in the rat vas deferens. Gen Pharmacol.;23(3):471-4, 1992. ABRAHAM, S.T.; ROBINSON, M.; RICE, P.J. A role for protein kinase C in the supersensitivity of the rat vas deferens following chronic surgical denervation. Pharmacology.;67(1):32-40, 2003. AGUAYO, A.J.; DAVID, S.; BRAY, G.M. Influences of the glial environment on the elongation of axons after injury: transplantation studies in adult rodents. J Exp Biol.; 95:23140, 1981. AHMED, M.R.; BASHA S.H.; GOPINATH, D.; MUTHUSAMY, R.; JAYAKUMAR, R. Initial upregulation of growth factors and inflammatory mediators during nerve regeneration in the presence of cell adhesive peptide-incorporated collagen tubes. J Peripher Nerv Syst.;10(1):17-30, 2005. AKISKAL, H.S. Temperament and mood disorders. Harv Ment Health Lett.; 16(8):5-6, 2000. ALTAR, C.A. Neurotrophins and depression. Trends Pharmacol Sci.; 20(2):59-61, 1999. ARIËNS, E.J. Affinity and intrinsic activity in the theory of competitive inhibition. I: Problems and theory. Arch Int Pharmacodyn Ther.;99(1):32-49, 1954. ANTON, P.G.; DUNCAN, M.E.; MCGRATH, J.C. An analysis of the anatomical basis for the mechanical response to motor nerve stimulation of the rat vas deferens. J Physiol. 273(1):23-43, 1977. BANERJEE, S.P; KUNG, L.S.; RIGGI, S.J.; CHANDA, S.K. Development of betaadrenergic receptor subsensitivity by antidepressants. Nature. 4; 268(5619):455-6, 1977. BASTOS, E.F., MARCELINO, J.L., AMARAL, A.R., SERFATY, C.A. Fluoxetine-induced plasticity in the rodent visual system. Brain Res.;824(1):28-35, 1999.

138

BATRA, S.K. Sperm transport through vas deferens: review of hypotheses and suggestions for a quantitative model. Fertil Steril. 25(2):186-202, 1974 BAXTER, A.D.; O'KAFO B.A. Ejaculatory failure after chemical sympathectomy. Anesth Analg.;63(8):770-1, 1984. BERGAMO M.; ABÍLIO V.C.; QUEIROZ C.M.; BARBOSA-JÚNIOR H.N.; ABDANUR L.R.; FRUSSA-FILHO R. Effects of age on a new animal model of tardive dyskinesia. Neurobiol Aging.;18(6):623-9, 1997. BERGEROT, A.; REYNIER-REBUFFEL, A.M.; CALLEBERT, J.; AUBINEAU, P. Longterm superior cervical sympathectomy induces mast cell hyperplasia and increases histamine and serotonin content in the rat dura mater. Neuroscience.;96(1):205-13, 2000. BERNARDI, M.M.; SCAVONE C.; FRUSSA-FILHO R. Differential effects of single and long-term amphetamine and apomorphine administrations on locomotor activity of rats. Gen Pharmacol.;17(4):465-8, 1986. BHOOLA, K.D.; PAY, S. Opioid inhibition of adenylate cyclase in the striatum and vas deferens of the rat. Br. J. Pharmacol.;89(1):109-18, 1986. BIBEL, M.; BARDE, Y.A. Neurotrophins: key regulators of cell fate and cell shape in the vertebrate nervous system. Genes Dev. 1; 14(23):2919-37, 2000. BIERS, S.M.; BRADING, A.F. Nerve regeneration: might this be the only solution for functional problems of the urinary tract? Curr Opin Urol.;13(6):495-500, 2003. BIRMINGHAM, A.T. Sympathetic denervation of the smooth muscle of the vas deferens. J Physiol.; 206(3):645-61, 1970. BITRAN, M.; TORRES, G.; TAPIA, W.; HUIDOBRO-TORO, J.P. Neuropeptide Y inhibits 3[H]noradrenaline release in the rat vas deferens independently of cAMP levels. Neurochem Int.;28(3):309-17, 1996. BLIER, P.; de MONTIGNY, C. Current advances and trends in the treatment of depression. Trends Pharmacol Sci.;15(7):220-6, 1994. BOSELLI, C.; GRANA, E. Differential effects of drugs interacting with autonomic transmitters on responses of rat vas deferens to field stimulation. J Auton Pharmacol.;20(2):87-97, 2000. BOURDE, O.; KIEFER, R.; TOYKA, K.V.; HARTUNG, H.P. Quantification of interleukin-6 mRNA in wallerian degeneration by competitive reverse transcription polymerase chain reaction. J Neuroimmunol.; 69(1-2):135-40, 1996. BOYD, J. G.; GORDON, T. A dose-dependent facilitation and inhibition of peripheral nerve regeneration by brain-derived neurotrophic factor. European Journal of Neuroscience, v. 15, p. 613-626, 2002.

139

BRADING, A.F. Alterations in the physiological properties of urinary bladder smooth muscle caused by bladder emptying against an obstruction. Scand J Urol Nephrol Suppl.;184:51-8, 1997. BUSCH, L.; WALD, M.; STERIN-BORDA, L.; BORDA, E. Fluoxetine modulates norepinephrine contractile effect on rat vas deferens. Pharmacol. Res.;41(1):39-45, 2000. BURGERS, J.K.; NELSON, R.J.; QUINLAN, D.M.; WALSH, P.C. Nerve growth factor, nerve grafts and amniotic membrane grafts restore erectile function in rats. J Urol.;146(2):463-8, 1991. BURNSTOCK, G. Sympathetic purinergic transmission in small blood vessels. Trends Pharmacol Sci.;9(4):116-7, 1988. BYLUND, D.B.; MARTINEZ, J.R. alpha 2-Adrenergic receptors appear in rat salivary glands after reserpine treatment. Nature. 22; 285(5762):229-30, 1980. CAMPOS, H.A. A possible crossed histamine-containing pathway adjacent to the sympathetic system of the rat vas deferens. J Pharmacol Exp Ther.;244(3):1121-7, 1988. CAMPOS, M.; DE LUCENA MORAIS, P.; PUPO, A.S. Functional characterization of alpha(1)-adrenoceptors in denervated rat vas deferens. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.;368(1):72-8, 2003. CARLSON, P.J.; SINGH, J.B.; ZARATE, C.A.JR.; DREVETS, W.C.; MANJI, H.K. Neural circuitry and neuroplasticity in mood disorders: insights for novel therapeutic targets. NeuroRx.; 3(1):22-41, 2006. CASTRÉN, E. Neurotrophic effects of antidepressant drugs. Curr Opin Pharmacol.; 4(1):5864, 2004. CELUCH, S.M.; SLOLEY, B.D. Regional distribution of dopamine, 5-hydroxytryptamine, and noradrenaline in the rat vas deferens. Neurochem Res.;13(10):967-72, 1988. CELUCH, S.M.; SLOLEY, B.D. Release of 5-hydroxytryptamine, dopamine and noradrenaline in the rat vas deferens in the presence of compound 48/80, veratridine or K+. Br J Pharmacol.;96(1):77-82, 1989. CHANG, F.; STEELMAN, L.S.; LEE, J.T.; SHELTON, J.G.; NAVOLANIC, P.M.; BLALOCK, W.L.; FRANKLIN, R.A.; MCCUBREY, J.A. Signal transduction mediated by the Ras/Raf/MEK/ERK pathway from cytokine receptors to transcription factors: potential targeting for therapeutic intervention. Leukemia; 17, 1263–1293, 2003. CHANG, J.H.; VUPPALANCHI, D.; VAN NIEKERK, E.; TREPEL, J.B.; SCHANEN, N.C.; TWISS, J.L. PC12 cells regulate inducible cyclic AMP (cAMP) element repressor expression to differentially control cAMP response element-dependent transcription in response to nerve growth factor and cAMP. J Neurochem.; 99(6):1517-30, 2006.

140

CHEN, B.; DOWLATSHAHI, D.; MACQUEEN, G.M.; WANG, J.F.; YOUNG, L.T. Increased hippocampal BDNF immunoreactivity in subjects treated with antidepressant medication. Biol Psychiatry.; 50(4):260-5, 2001. CHEN, J.; RASENICK, M.M. Chronic treatment of C6 glioma cells with antidepressant drugs increases functional coupling between a G protein (Gs) and adenylyl cyclase. J Neurochem.;64(2):724-32, 1995a. CHEN, J.; RASENICK, M.M. Chronic antidepressant treatment facilitates G protein activation of adenylyl cyclase without altering G protein content. J Pharmacol Exp Ther. 275(1):509-17, 1995b. CHIERZI, S.; RATTO, G.M.; VERMA, P.; FAWCETT, J.W. The ability of axons to regenerate their growth cones depends on axonal type and age, and is regulated by calcium, cAMP and ERK. Eur J Neurosci. (8):2051-62 , 2005. COHEN, S. Purification of a nerve-growth factor promoting protein from the mouse salivary gland and its neuro-cytotoxic antiserum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 46_.302–311, 1960. COHEN, M.L.; SCHENCK, K.W.; KURZ, K.D. 5-HT2-receptor antagonists: alpha 1- vs. 5HT2-receptor blocking properties in blood vessels. J Cardiovasc Pharmacol.; Suppl 1:S25-9, 1988. COPPEN, A.J.; DOOGAN, D.P. Serotonin and its place in the pathogenesis of depression. J Clin Psychiatry.; 49 Suppl:4-11, 1988. CORDELLINI, S.; SANNOMIYA, P. Denervation supersensitivity to phenylephrine in guinea-pig vas deferens in vivo and in vitro: functional studies on alpha1-adrenoceptors. Gen Pharmacol.;32(3):393-400, 1999. COWEN, T.; GAVAZZI, I.; Plasticity in adult and ageing sympathetic neurons.; Prog Neurobiol.;54(3):249-88, 1998. COYLE, J.T.; DUMAN, R.S. Finding the intracellular signaling pathways affected by mood disorder treatments. Neuron.; 38(2):157-60, 2003. COYLE, J.T.; SCHWARCZ, R. Mind glue: implications of glial cell biology for psychiatry. Arch Gen Psychiatry.; 57(1):90-3, 2000. CZEH, B.; MICHAELIS, T.; WATANABE, T.; FRAHM, J.; DE BIURRUN, G.; VAN KAMPEN, M.;BARTOLOMUCCI, A.; FUCHS, E. Stress-induced changes in cerebral metabolites, hippocampal volume, and cell proliferation are prevented by antidepressant treatment with tianeptine. Proc Natl Acad Sci U S A. 23;98(22):12796-801, 2001. DAIL, W.G. The pelvic plexus: innervation of pelvic and extrapelvic visceral tissues. Microsc Res Tech.; 35(2):95-106, 1996.

141

DE FOUBERT, G.; CARNEY, S.L.; ROBINSON, C.S.; DESTEXHE, E.J.; TOMLINSON, R.; HICKS, C.A.; MURRAY, T.K.; GAILLARD, J.P.; DEVILLE, C.; XHENSEVAL, V.; THOMAS, C.E.; O'NEILL, M.J.; ZETTERSTRÖM, T.S. Fluoxetine-induced change in rat brain expression of brain-derived neurotrophic factor varies depending on length of treatment. Neuroscience.;128(3):597-604, 2004. DE MORAES, S. An analysis of the post junctional component of denervation supersensitivity in the isolated vas deferens of the guinea-pig. Arch Int Pharmacodyn Ther.;222(1):16-26, 1976. DEZAWA, M. The interaction and adhesive mechanisms between axon and Schwann cell during central and peripheral nerve regeneration. Kaibogaku Zasshi; 75(3):255-65, 2000. DIAZ-TOLEDO, A.; JURKIEWICZ, A. Different mechanisms of action of agents acting on beta-adrenoceptors in barium-stimulated and electrically-stimulated rat vas deferens. Br J Pharmacol.;104(1):277-83, 1991. DIAZ-TOLEDO, A.; MARTI, M.C. Relationship between alpha-adrenoceptor occupancy and contractile response in rat vas deferens: Experimental and theoretical analysis. Eur J Pharmacol.;156(3):315-24, 1988. DIXON, J.S.; JEN, P.Y.; GOSLING, J.A. Structure and autonomic innervation of the human vas deferens: a review. Microsc Res Tech.; 42(6):423-32, 1998. DOMENICONI, M.; FILBIN, M.T. Overcoming inhibitors in myelin to promote axonal regeneration. J Neurol Sci. Jun 15,; 233(1-2):43-7, 2005. DONATI, R.J.; RASENICK, M.M. G protein signaling and the molecular basis of antidepressant action. Life Sci;73(1):1-17, 2003. DONATI, R.J.; RASENICK, M.M. Chronic antidepressant treatment prevents accumulation of gs-alpha in cholesterol-rich, cytoskeletal-associated, plasma membrane domains (lipid rafts). Neuropsychopharmacology; 30(7):1238-45, 2005. DOWLATSHAHI, D.; MAcQUEEN, G.M.; WANG, J.F.; YOUNG, L.T.; Increased temporal cortex CREB concentrations and antidepressant treatment in major depression. Lancet. 28;352(9142):1754-5, 1998. DREVETS, W.C. Neuroimaging studies of mood disorders. Biol Psychiatry.; 48(8):813-29, 2000. DRIESSEN, B.; BULTMANN, R.; GONCALVES, J.; STARKE, K. Opposite modulation of noradrenaline and ATP release in guinea-pig vas deferens through prejunctional betaadrenoceptors: evidence for the beta 2 subtype. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.;353(5):564-71, 1996. D'SA, C.; DUMAN, R.S. Antidepressants and neuroplasticity. Bipolar Disord.;4(3):183-94, 2002.

142

DUCHEMIN, A.M.; REN, Q.; MO, L.; NEFF, N.H.; HADJICONSTANTINOU, M. GM1 ganglioside induces phosphorylation and activation of Trk and Erk in brain. J Neurochem.;81(4):696-707, 2002. DUMAN, R.S. Synaptic plasticity and mood disorders. Mol Psychiatry.;7 Suppl 1:S29-34, 2002a. DUMAN, R.S. Pathophysiology of depression: the concept of synaptic plasticity. Eur Psychiatry.;17 Suppl 3:306-10, 2002b. DUMAN, R.S; HENINGER, G.R.; NESTLER, E.J. A molecular and cellular theory of depression. Arch Gen Psychiatry.;54(7):597-606, 1997. DUMAN, R.S.; MALBERG, J.; NAKAGAWA, S.; D'SA, C. Neuronal plasticity and survival in mood disorders. Biol Psychiatry.;48(8):732-9, 2000. DUMAN, R.S.; MALBERG, J.; THOME, J. Neural plasticity to stress and antidepressant treatment. Biol Psychiatry. 1;46(9):1181-91, 1999. DUMAN, R.S.; NAKAGAWA, S.; MALBERG, J. Regulation of adult neurogenesis by antidepressant treatment. Neuropsychopharmacology.;25(6):836-44, 2001. DWIVEDI, Y.; MONDAL, A.C.; RIZAVI, H.S.; CONLEY, R.R. Suicide brain is associated with decreased expression of neurotrophins. Biol Psychiatry.; 58(4):315-24, 2005. ESTEBAN, S.; LLADO, J.; GARCIA-SEVILLA, J.A. Alpha 2-autoreceptors and alpha 2heteroreceptors modulating tyrosine and tryptophan hydroxylase activity in the rat brain in vivo: an investigation into the alpha 2-adrenoceptor subtypes. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.; 353(4):391-9, 1996. EVANS, B.K.; HEATH, J.W.; BURNSTOCK, G. Reinnervation following guanethidineinduced sympathectomy of adult rats. J Neurocytol.;8(3): 381-400, 1979. FALCK, B.; OWMAN, C.; SJÖSTRAND, N.O. Peripherally located adrenergic n eurons innervating the vas deferens and the seminal vesicle of the guinea-pig. Experientia.; 15;21:98100, 1965. FAVA, M.; KENDLER, K.S. Major depressive disorder. Neuron.; 28(2): 335-41, 2000. FAWCETT, J.W.; KEYNES, R.J. Peripheral nerve regeneration. Annu Rev Neurosci.;13:4360, 1990. FEIGHNER, J.P. Overview of antidepressants currently used to treat anxiety disorders. J Clin Psychiatry.; 60 Suppl. 22:18-22, 1999. FISHMAN, P.H.; FINBERG, J.P. Effect of the tricyclic antidepressant desipramine on betaadrenergic receptors in cultured rat glioma C6 cells. J Neurochem; 49(1):282-9, 1987.

143

FLEMING, W.W.; URQUILLA, P.R.; TAYLOR, D.A.; WESTFALL, D.P. Electrophysiological correlations with postjunctional supersensitivity. Fed Proc.;34(10):19814, 1975. FLEMING, W.W.; WESTFALL, D.P. Adaptive supersensitivity. In: Trendelenburg, U., Weiner, N. (Eds.), Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 90. Springer Verlag, Heidelberg, BW, pp. 509–559, 1988. FOSSATI, P.; RADTCHENKO A.; BOYER P. Neuroplasticity: from MRI to depressive symptoms. Eur Neuropsychopharmacol.; 14 Suppl 5:S503-10, 2004. FREITAS, T. A. Caracterização do curso temporal da desnervação e da reinervação simpática do ducto deferente de rato: Um estudo neuroquímico do conteúdo dos neurotransmissores e seus metabólitos. Universidade Metodista de São Paulo, 2004. TCC, Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Metodista, 2004 FRUSSA-FILHO R.; PALERMO-NETO J. Effects of single and long-term metoclopramide administration on open field and stereotyped behavior of rats. Eur J Pharmacol. 10;149(3):323-9, 1988. FRUSSA-FILHO R.; PALERMO-NETO J. Effects of single and long-term administration of sulpiride on open-field and stereotyped behavior of rats. Braz J Med Biol Res.;23(5):463-72, 1990. FRUSSA-FILHO R.; PALERMO-NETO J. Effects of single and long-term droperidol administration on open-field and stereotyped behavior of rats. Physiol Behav.;50(4):825-30, 1991. FU, S.Y.; GORDON, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol.; 14(1-2):67-116, 1997. FUENMAYOR, L.; GOMEZ, J.; CAMPOS, H.A.; ROMERO, E. Presence of serotonin in the rat vas deferens: its influence on contractile responses. Neuroscience.;1(3):197-203, 1976. GABELLA, G. Structure of smooth muscles in: Handbook of Experimental Pharmacology. L. Szekeres and J.Gy. Papp (eds) Springer Verlag, Berlin Heidelberg Vol. 111 (pp): 3−34, 1994. GARCEZ -DO-CARMO, L. Características da interação da serotonina com receptores serotoninérgicos e adrenérgicos em ducto deferente de rato. UNIFESP/EPM, São Paulo, 1995. Tese de Doutorado em Ciências, Universidade Federal de São Paulo/antiga Escola Paulista de Medicina, 1995. GARCIA-SEVILLA, J.A.; ZUBIETA, J.K. Activation and desensitization of presynaptic alpha 2-adrenoceptors after inhibition of neuronal uptake by antidepressant drugs in the rat vas deferens. Br J Pharmacol.;89(4):673-83, 1986. GERTHOFFER, W.T.; FEDAN, J.S.; WESTFALL, D.P.; GOTO, K.; FLEMING, W.W. Involvement of the sodium-potassium pump in the mechanism of postjunctional supersensitivity of the vas deferens of the guinea pig. J Pharmacol Exp Ther.;210(1):27-36, 1979.

144

GIRALT, M.T.; GARCIA-SEVILLA, J.A. Acute and long-term regulation of brain alpha 2adrenoceptors after manipulation of noradrenergic transmission in the rat. Eur. J. Pharmacol.; 30;164(3):455-66, 1989. GOEDERT, M.; FINE, A.; HUNT, S.P.; ULLRICH, A. Nerve growth factor mRNA in peripheral and central rat tissues and in the human central nervous system: lesion effects in the rat brain and levels in Alzheimer's disease. Brain Res.;387(1):85-92, 1986. GONÇALVES, J.; BULTMANN, R.; DRIESSEN, B. Opposite modulation of cotransmitter release in guinea-pig vas deferens: increase of noradrenaline and decrease of ATP release by activation of prejunctional beta-adrenoceptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.; 353(2):184-92, 1996. GORIN, P.D.; JOHNSON, E.M. JR. Effects of long-term nerve growth factor deprivation on the nervous system of the adult rat: an experimental autoimmune approach. Brain Res. 29; 198 (1):27-42, 1980. GOTO, K.; WESTFALL, D.P.; FLEMING, W.W. Denervation-induced changes in electrophysiologic parameters of the smooth muscle of the guinea-pig and rat was deferens. J Pharmacol Exp Ther.; 204 (2):325-33, 1978. HANZ, S.; FAINZILBER, M. Retrograde signaling in injured nerve - the axon reaction revisited. J Neurochem.; 99 (1):13-9, 2006. HATA, F.; TAKEYASU, K.; MORIKAWA, Y.; LAI, R.T.; ISHIDA, H.; YOSHIDA, H. Specific changes in the cholinergic system in guinea-pig vas deferens after denervation. J Pharmacol Exp Ther.; 215 (3):716-22, 1980. HATA, F.; TAKEYASU, K.; MORIKAWA, Y.; LAI, R.T.; ISHIDA, H.; YOSHIDA, H. Role of alpha-adrenergic receptors in denervation supersensitivity of rat vas deferens. Jpn J Pharmacol.; 31(3):383-90, 1981. HENN, F. A.; EDWARDS, E.; MUNEYYIRCI, J. Animal models of depression. Clin Neurosci.; 1, 152–156, 1993. HENSLER, J.G. Differential regulation of 5-HT1A receptor-G protein interactions in brain following chronic antidepressant administration. Neuropsychopharmacology.;26(5):565-73, 2002. HERSHMAN, K.M.; TAYLOR, D.A.; FLEMING, W.W. Adaptive supersensitivity in the guinea pig vas deferens is associated with a reduction in the abundance of the alpha 2 subunit isoform of Na+/K(+)-ATPase. Mol Pharmacol.;43(6):833-7, 1993. HERTZ, L.; RICHARDSON, J.S. Acute and chronic effects of antidepressant drugs on betaadrenergic function in astrocytes in primary cultures: an indication of glial involvement in affective disorders? J Neurosci Res.;9(2):173-82, 1983.

145

HEUMANN, R.; KORSCHING, S.; SCOTT, J.; THOENEN, H. Relationship between levels of nerve growth factor (NGF) and its messenger RNA; in sympathetic ganglia and peripheral target tissues. EMBO J. 20;3(13):3183-9, 1984. HOVEVEI-SION, D.; FINBERG, J.P.; BOMZON, A.; YOUDIM, M.B. Effects of forskolin in rat vas deferens: evidence for facilitatory beta-adrenoceptors. Eur J Pharmacol.; 25; 95(34):295-9, 1983. HU, Y.; CUI, Q.; HARVEY, A.R. Interactive effects of C3, cyclic AMP and ciliary neurotrophic factor on adult retinal ganglion cell survival and axonal regeneration. Mol Cell Neurosci.;34(1):88-98, 2007. HUANG, E.J.; REICHARDT, L.F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu Rev Neurosci.;24:677-736, 2001. HUANG, E.J.; REICHARDT, L.F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annu Rev Biochem.;72:609-42, 2003. HYATT-SACHS, H.; BACHOO, M.; SCHREIBER, R.; VACCARIELLO, S.A.; ZIGMOND, R.E. Chemical sympathectomy and postganglionic nerve transection produce similar increases in galanin and VIP mRNA but differ in their effects on peptide content. J. Neurobiol.;30(4):543-55, 1996. ITOH, T.; TOKUMURA, M.; ABE, K. Effects of rolipram, a phosphodiesterase 4 inhibitor, in combination with imipramine on depressive behavior, CRE-binding activity and BDNF level in learned helplessness rats. Eur J of Pharmacol.: 498: 135– 142, 2004. IVERSEN, L.L.; JARROTT, B. Modification of an enzyme radiochemical assay procedure for noradrenaline. Biochem Pharmacol.;19(5):1841-3, 1970. JANOWSKY, D.S.; OVERSTREET, D.H. The hole of acetylcholine mechanism in mood disorders. In: Bloom F.E; Kupfer D.J. (eds.); Parmacology: The fourth generation in progress. New York, Raven Press, pp. 945-56, 1995. JURKIEWICZ, A.; DO CARMO, LG.; YOMURA, M.H.; JURKIEWICZ, N.H. The serotonin paradox: drug-receptor interaction in rat vas deferens. Acta Physiol Pharmacol Ther Latinoam.;49(4):210-4, 1999. JURKIEWICZ, A.; JURKIEWICZ, N.H.; BARROS, G.G.; VALLE, J.R. Relative responsiveness (rho) of pharmacological receptor systems in the rat vas deferens. Pharmacology.;2(2):89-99, 1969. JURKIEWICZ, N.H.; JURKIEWICZ, A.; GARCIA, A.G. Reinnervation of the transplanted vas deferens: differential recovery of various biochemical and pharmacological parameters. J Neural Transm Gen Sect.;85(2):83-94, 1991. JURKIEWICZ, N.H.; JURKIEWICZ, A.; GOMES, C.B.; AUCELIO, J.G. Pharmacodynamic analysis of the rat isolated vas deferens after transplantation to intestinal wall. J Pharmacol Exp Ther.;203(1):112-9, 1977.

146

JURKIEWICZ, A.; LAFAYETTE, S.S.; NUNES, S.H.; MARTINI, L.C.; DO CARMO, L.G.; WANDERLEY, A.G.; JURKIEWICZ, N.H. Decreased density of binding sites for the Ca2+ channel antagonist[3H]isradipine after denervation of rat vas deferens. Eur J Pharmacol.; 256(3):329-33, 1994. KAHL, U.; LANGEL, U.; BARTFAI T.; GRUNDEMAR, L. Functional effects and ligand binding of chimeric galanin-neuropeptide Y (NPY) peptides on NPY and galanin receptor types. Br J Pharmacol.;111(4):1129-34, 1994. KALECZYC, J. Origin and neurochemical characteristics of nerve fibres supplying the mammalian vas deferens. Microsc Res Tech.; 42(6):409-22, 1998. KANDEL, E. R.; SCHWARTZ, J. H.; JESSEL, T. M. (Ed.). Princípios da neurociência. Tadução de Ana Carolina Guedes Pereira et al. 4ª ed. São Paulo: Manole, 2003; p.173; p.34; p. 1109 . KASUYA, Y.; GOTO, K. The mechanism of supersensitivity to norepinephrine induced by cocaine in rat isolated vas deferens. Eur J Pharmacol.;4(4):355-62, 1968. KASUYA, Y.; GOTO, K.; HASHIMOTO, H.; WATANABE, H.; MUNAKATA, H.; WATANABE, M. Nonspecific denervation supersensitivity in the rat vas deferens "in vitro". Eur J Pharmacol.; 8(2):177-84, 1969. KASUYA, Y.; SUZUKI, N. Regional differences in the distribution of cholinergic receptors in the rat vas deferens. Jpn J Pharmacol.;29(2):313-5, 1979. KEAST, J.R. Visualization and immunohistochemical characterization of sympathetic and parasympathetic neurons in the male rat major pelvic ganglion. Neuroscience.;66(3):655-62, 1995. KEAST, J.R.; GLEESON, R.J.; SHULKES, A.; MORRIS, M.J. Maturational and maintenance effects of testosterone on terminal axon density and neuropeptídeo expression in the rat vas deferens. Neuroscience.;112(2):391-8, 2002. KEAST, J.R.; KEPPER, M.E. Differential regulation of trkA and p75 in noradrenergic pelvic autonomic ganglion cells after deafferentation of their cholinergic neighbours. Eur J Neurosci.; 13(2):211-20, 2001. KENAKIN, T.P. One the importance of agonist concentration-gradients within isolated tissues. Increased maximal responses of rat vasa deferentia to (--)-noradrenaline after blockade of neuronal uptake. J Pharm Pharmacol.;32(12):833-8, 1980. KENT, J.M. SNaRIs, NaSSAs, and NaRIs: new agents for the treatment of depression. Lancet.;355(9207):911-8, Mar 11, 2000. Erratum in: Lancet; 355(9219):2000. Comment in: Lancet.;355(9214):1554, 2000. KIHARA, K.; SATO, K.; ISHIZAKA, K.; OSHIMA, H. Preservation of ejaculatory function by reconstruction of the canine hypogastric nerve. J Neurosurg.; 88(4):726-33, 1998. KIM, S.W.; PAICK, J.S. Peripheral effects of serotonin on the contractile responses of rat seminal vesicles and vasa deferentia. J Androl.;25(6):893-9, 2004.

147

KITAYAMA, I.; YAGA, T.; KAYAHARA, T.; NAKANO, K.; MURASE, S.; OTANI, M.; NOMURA, J. Long-term stress degenerates, but imipramine regenerates, noradrenergic axons in the rat cerebral cortex. Biol Psychiatry.; 42(8):687-96, 1997. KITAMURA, Y.; ARAKI, H.; GOMITA, Y. Influence of ACTH on the effects of imipramine, desipramine and lithium on duration of immobility of rats in the forced swim test.; Pharmacol Biochem Behav.; 71:63–69, 2002. KOBAYASHI, T.; KIHARA, K.; HYOCHI, N.; MASUDA, H.; SATO, K. Spontaneous regeneration of the seriously injured sympathetic pathway projecting to the prostate over a long period in the dog. BJU Int.; 91(9):868-72, 2003. KOBAYASHI, T.; KIHARA, K.; KAGEYAMA, Y.; YAMADA, T.; LIU, S.; SATO, K. Spontaneous reconstruction of the canine hypogastric nerve over a long period after removing half of its length. Auton Neurosci.;86(3):151-62, 2001. KORSCHING, S. The neurotrophic factor concept: a reexamination. J Neurosci.; 13(7):273948, 1993. KUJAT, R.; ROSE, C.; WROBEL, K.H. The innervation of the bovine ductus deferens: comparison of a modified acetylcholinesterase-reaction with immunoreactivities of cholinacetyltransferase and panneuronal markers. Histochemistry. 99(3):231-9, 1993. LANGER, S.Z. Increase in the maximal responses to the agonists during the development of the postsynaptic component of denervation supersensitivity. Acta Physiol Lat Am.;24(2):1667, 1974. LESCH, K. P.; AULAKH, C. S.; WOLOZIN, B. L.; TOLLIVER, T. J.; HILL, J. L.; MURPHY, D. L. Regional brain expression of serotonin transporter mRNA and its regulation by reuptake inhibiting antidepressants. Mol Brain Res.; 17, 31– 35, 1993. LEVI-MONTALCINI, R.; ANGELETTI, P.U. Modification of sympathetic function. Immunosympathectomy. In: Second symposium on catecholamines. Pharmacol Rev.;18(1):619-28, 1966. LEVI-MONTALCINI, R.; BOOKER, B. Destruction of the sympathetic ganglia in mammals by an antiserum to a nerve-growth protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 46_.384–391, 1960. LI, Y.F.; LIU, Y.Q.; HUANG, W.C.; LUO, Z.P. Cytoprotective effect is one of common action pathways for antidepressants. Acta Pharmacol Sin.; 24(10):996-1000, 2003. LIANG, S.X.; D'ARBE, M.; PHILLIPS, W.D.; LAVIDIS, N.A. Development of fast purinergic transmission in the mouse vas deferens. Synapse.;37(4):283-91, 2000. LIN, Y.Q.; BENNETT, M.R. Varicosity-Schwann cell interactions mediated by ATP in the mouse vas deferens. J Neurophysiol. May, 2005;93(5):2787-96. Epub Jan 12, 2005.

148

LUBA, Vikhanski. In: Search of the Lost Cord: Solving the Mystery of Spinal Cord Regeneration.; Joseph Henry Press. p. 153-61; Washington, D.C.; 2001. Disponível em:<http://www.nap.edu/catalog/10124.html>. Acesso em: 10 de julho de 2005. LUCCHELLI, A.; SANTAGOSTINO-BARBONE, M.G.; MODESTO, F.; GRANA, E. Direct and indirect actions of 5-hydroxytryptamine on the rat isolated vas deferens. Arch Int Pharmacodyn Ther.;269(2):236-51, Jun, 1984. LUTTRELL, L.M.; FERGUSON, S.S.; DAAKA, Y.; MILLER, W.E.; MAUDSLEY, S.; DELLA ROCCA, G.J.; LIN, F.; KAWAKATSU, H.; OWADA, K.; LUTTRELL, D.K.; CARON, M.G.; LEFKOWITZ, R.J. Beta-arrestin-dependent formation of beta2 adrenergic receptor-Src protein kinase complexes. Science.;283(5402):655-61, Jan 29, 1999. MacGROGAN, D.; DESPRES, G.; ROMAND, R.; DICOU, E. Expression of the beta-nerve growth factor gene in male sex organs of the mouse, rat, and guinea pig. J Neurosci Res.;28(4):567-73, 1991. MAJCEN, Z. Cholinesterases and choline acetyltransferase in the ductus deferens of the guinea-pig. Histochemistry.;81(2):195-9, 1984. MALBERG, J.E.; EISCH, A.J.; NESTLER, E.J.; DUMAN, R.S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci.;20(24):9104-10, 2000. MANEV, H.; UZ, T.; SMALHEISER, NR.; MANEV, R. Antidepressants alter cell proliferation in the adult brain in vivo and in neural cultures in vitro. Eur J Pharmacol.; 411(1-2):67-70, 2001. MANJI, H.K.; DREVETS, W.C.; CHARNEY, D.S. The cellular neurobiology of depression. Nat Med.; 7(5):541-7, 2001. MANJI, H.K.; MOORE, G.J.; RAJKOWSKA, G.; CHEN, G. Neuroplasticity and cellular resilience in mood disorders. Mol Psychiatry.;5(6):578-93, 2000. MANJI, H.K.; QUIROZ, J.A.; SPORN, J.; PAYNE, J.L.; DENICOFF, K.A.; GRAY, N.; ZARATE, C.A.JR.; CHARNEY, D.S. Enhancing neuronal plasticity and cellular resilience to develop novel, improved therapeutics for difficult-to-treat depression. Biol Psychiatry.; 53(8):707-42, 2003. MASAND, P.S.; GUPTA, S. Selective serotonin-reuptake inhibitors: an update. Harv Rev Psychiatry; 7(2):69-84, 1999. MATSUMOTO, N.; WANG, X.B.; UCHIDA, S. Different natures of supersensitivity of adenylate cyclase stimulated by calcitonin gene-related peptide and isoproterenol in rat diaphragm after denervation and reserpine treatment. J Neurochem.; 58(1):357-61, 1992. MAY, J.M.; ABEL, P.W.; MINNEMAN, K.P. Binding of agonists and antagonists to betaadrenoceptors in rat vas deferens: relationship to functional response. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.;331(4):324-33, 1985.

149

MAY, J.M.; ABEL, P.W.; MINNEMAN, K.P. Regulation of beta-adrenoceptor density and function in rat vas deferens. Eur J Pharmacol.;122(2):221-9, 1986. McEWEN, B.S. Stress and hippocampal plasticity. Annu Rev Neurosci.;22:105-22, 1999. McEWEN, B.S. Effects of adverse experiences for brain structure and function. Biol Psychiatry.; 48(8):721-31, 2000. MEDINA, P.; SEGARRA, G.; BALLESTER, R.; CHUAN, P.; DOMENECH, C.; VILA, J.M.; LLUCH, S. Effects of antidepressants in adrenergic neurotransmission of human vas deferens. Urology.;55(4):592-7, 2000. MENDEZ, J.; KADIA, T.M.; SOMAYAZULA, R.K.; EL-BADAWI, K.I.; COWEN, D.S. Differential coupling of serotonin 5-HT1A and 5-HT1B receptors to activation of ERK2 and inhibition of adenylyl cyclase in transfected CHO cells. J Neurochem.;73(1):162-8, 1999. MENKES, D.B.; GALLAGER, D.W.; REINHARD, J.F; AGHAJANIAN, G.K. Alpha 1adrenoceptor denervation supersensitivity in brain: physiological and receptor binding studies. Brain Res.; 272(1):1-12, 1983. MERRILLEES, N.C.; BURNSTOCK, G.; HOLMAN, M.E. Correlation of fine structure and physiology of the innervation of smooth muscle in the guinea pig vas deferens. J Cell Biol.; 19: 529-50, 1963. MILLER, R.J. Presynaptic receptors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.; 38, 201–207, 1998. MILNER, P.; CROWE, R.; FERNYHOUGH, P.; DIEMEL, L.T.; TOMLINSON, D.R.; BURNSTOCK, G. Nerve growth factor treatment of adult rats selectively enhances innervation of urinogenital tract rather than vascular smooth muscle. Int J Dev Neurosci.; 13(5):393-401, 1995. MINNEMAN, K.P.; ABEL, P.W. "Spare" alpha 1-adrenergic receptors and the potency of agonists in rat vas deferens. Mol Pharmacol.;25(1):56-63, 1984. MINNEMAN, K.P.; ESBENSHADE, T.A. Alpha1-adrenergic receptor subtypes. Annu. Rev Pharmacol Toxicol.;34:117-33, 1994. MINNEMAN, K.P.; FOX, A.W.; ABEL, P.W. Occupancy of alpha 1-adrenergic receptors and contraction of rat vas deferens. Mol Pharmacol.;23(2):359-68, 1983. MIRANDA, H.F.; DURAN, E.; FERNANDEZ, E.; PINARDI, G. Muscarinic receptor subtypes in the bisected vas deferens of the rat. Gen Pharmacol.;26(2):387-91, 1995. MOLLER, H.J.; VOLZ, H.P. Drug treatment of depression in the 1990s: An overview of achievements and future possibilities. Drugs.;52(5):625-38, 1996. MOLTENI, R.; CALABRESE, F.; BEDOGNI, F.; TONGIORGI, E.; FUMAGALLI, F.; RACAGNI, G.; RIVA, M.A. Chronic treatment with fluoxetine up-regulates cellular BDNF mRNA expression in rat dopaminergic regions. Int J Neuropsychopharmacol.;9(3):307-17, 2006.

150

MONSUL, N.T.; GEISENDORFER, A.R.; HAN, P.J.; BANIK, R.; PEASE, M.E.; SKOLASKY, R.J.R.; HOFFMAN, P.N. Intraocular injection of dibutyryl cyclic AMP promotes axon regeneration in rat optic nerve. Exp Neurol.; 186(2):124-3, 2004. MOORE, G.J.; BEBCHUK, J.M.; HASANAT, K.; CHEN, G.; SERAJI-BOZORGZAD, N.; WILDS, I.B.; FAULK, M.W.; KOCH, S.; GLITZ, D.A.; JOLKOVSKY, L.; MANJI, H.K. Lithium increases N-acetyl-aspartate in the human brain: in vivo evidence in support of bcl2's neurotrophic effects? Biol Psychiatry.; 48(1):1-8, 2000. MOORE, R.Y. Principles of synaptic transmission. Ann N Y Acad Sci.; 24;695:1-9, 1993. MORITOKI, H.; IWAMOTO, T.; KANAYA, J.; ISHIDA, Y.; FUKUDA, H. Age-related change in serotonin-mediated prejunctional inhibition of rat vas deferens. Eur J Pharmacol. 2;132(1):39-46, 1986. MURPHY, D.L.; CAMPBELL, I.; COSTA, J.L. Current status of the indeolamine hypothesis of the affective disorders. In: Lipton M.A; diMascio A.; Killiam KF (eds). Psycopharmacology: a generation of progress. New York, Raven Press, pp. 1235-47, 1978. NAKAMURA, S. Involvement of phospholipase A2 in axonal regeneration of brain noradrenergic neurones. Neuroreport.; 4(4):371-4, 1993. NESTLER, E.J.; BARROT, M.; DILEONE, R.J.; EISCH, A.J.; GOLD, S.J.; MONTEGGIA, L.M. Neurobiology of depression. Neuron. 28;34(1):13-25, 2002. NESTLER, E.J.; TERWILLIGER, R.Z.; DUMAN, R.S. Chronic antidepressant administration alters the subcellular distribution of cyclic AMP-dependent protein kinase in rat frontal cortex. J Neurochem.;53(5):1644-7, 1989. NIBUYA, M.; MORINOBU, S.; DUMAN, R.S. Regulation of BDNF and trkB mRNA in rat brain by chronic electroconvulsive seizure and antidepressant drug treatments. J Neurosci.;15(11):7539-47, 1995. NIBUYA, M.; NESTLER, E.J.; DUMAN, R.S. Chronic antidepressant administration increases the expression of cAMP response element binding protein (CREB) in rat hippocampus. J. Neurosci. 1;16(7):2365-72, 1996. NIBUYA, M.; TAKAHASHI, M.; RUSSELL, D.S.; DUMAN, R.S. Repeated stress increases catalytic TrkB mRNA in rat hippocampus. Neurosci Lett.;267(2):81-4, 1999. NICHOLLS, J. G.; MARTIN, A. R.; WALLACE, B. G.; FUCHS, P.A. From neuron to brain. Fourth edition, Sunderland, Sinauer associates, Inc, 2001. NICHOLSON, G.M.; BLANCHE, T.; MANSFIELD, K.; TRAN. Y. Differential blockade of neuronal voltage-gated Na(+) and K(+) channels by antidepressant drugs. Eur. J. Pharmacol.;452(1):35-48, 2002.

151

NIKULINA, E.; TIDWELL, J.L.; DAI, H.N.; BREGMAN, B.S.; FILBIN, M.T. The phosphodiesterase inhibitor rolipram delivered after a spinal cord lesion promotes axonal regeneration and functional recovery. Proc Natl Acad Sci U S A.; 101(23):8786-90, 2004 O'DONNELL, J.M.; ZHANG, H.T. Antidepressant effects of inhibitors of cAMP phosphodiesterase (PDE4). Trends Pharmacol Sci.; 25(3):158-63, 2004. OSINSKI, M.A.; BASS, P. Chronic denervation of rat jejunum results in cholinergic supersensitivity due to reduction of cholinesterase activity. J Pharmacol Exp Ther.;266(3):1684-90, 1993. OZAWA, H.; RASENICK, M.M. Coupling of the stimulatory GTP-binding protein Gs to rat synaptic membrane adenylate cyclase is enhanced subsequent to chronic antidepressant treatment. Mol Pharmacol.;36(5):803-8, 1989. OZAWA, H, SUGAWARA, K. Sensitivity of the isolated vas deferens of the guinea-pig to norepinephrine and acetylcholine after denervation, decentralization and treatments by various agents. Eur J Pharmacol.;11(1):56-66, 1970. PEARSE, D.D.; PEREIRA, F.C.; MARCILLO, A.E.; BATES, M.L.; BERROCAL, Y.A.; FILBIN, M.T.; BUNGE, M.B. cAMP and Schwann cells promote axonal growth and functional recovery after spinal cord injury. Nat Med.; 10(6):610-6, 2004. PEREZ, J.; TINELLI, D.; BRUNELLO, N.; RACAGNI, G. cAMP-dependent phosphorylation of soluble and crude microtubule fractions of rat cerebral cortex after prolonged desmethylimipramine treatment. Eur J Pharmacol. 15;172(3):305-16, 1989. PERRY, J.C.; VITAL, M.A.; FRUSSA-FILHO, R.; TUFIK, S.; PALERMO-NETO, J. Monosialoganglioside (GM1) attenuates the behavioural effects of long-term haloperidol administration in supersensitive rats. Eur Neuropsychopharmacol.;14(2):127-33, 2004. PICARELLI, Z. P.; HYPPOLITO, N.; VALLE, J. R. Synergistic effect of 5HT on the response of rat seminal vesicle to adrenaline and noradrenaline. Arch. Int. Pharmacodyn.,138: 354-65, 1962. PICKLO, M.J. Methods of sympathetic degeneration and alteration. J Auton Nerv Syst.;62(3):111-25, 1997. PINEYRO, G.; BLIER, P.; DENNIS, T.; DE MONTIGNY, C. Desensitization of the neuronal 5-HT carrier following its long-term blockade. J Neurosci.; 14(5 Pt 2):3036-47, 1994. PUPO, A.S. Functional effects of castration on alpha1-adrenoceptors in rat vas deferens. Eur J Pharmacol. 19;351(2):217-23, 1998. QUEIROZ, G.; QUINTAS, C.; TALAIA, C.; GONÇALVES, J. Coupling to protein kinases A and C of adenosine A2B receptors involved in the facilitation of noradrenaline release in the prostatic portion of rat vas deferens.Neuropharmacology.;47(2):216-24, 2004.

152

QUINTAS, L.E.; CARICATI-NETO, A.; LAFAYETTE, S.S.; JURKIEWICZ, A.; NOEL, F. Down-regulation of Na(+)/K(+)-ATPase alpha(2) isoform in denervated rat vas deferens. Biochem Pharmacol.;60(6):741-7, 2000. QUINTAS, L.E.; CUNHA, V.M.; SCARAMELLO, C.B.; DA SILVA, C.L.; CARICATINETO, A.; LAFAYETTE, S.S.; JURKIEWICZ, A.; NOEL F. Adaptive expression pattern of different proteins involved in cellular calcium homeostasis in denervated rat vas deferens. Eur J Pharmacol.;525(1-3):54-9, 2005. QUINTAS, L.E.; LAFAYETTE, S.S.; CARICATI-NETO, A.; JURKIEWICZ, A.; NOËL, F. Role of noradrenaline on the expression of the Na+/K+-ATPase alpha2 isoform and the contractility of cultured rat vas deferens. Biochem. Pharmacol. 15;64(10):1431-7, 2002. RABIN, S.J.; BACHIS A.; MOCCHETTI, I. Gangliosides activate Trk receptors by inducing the release of neurotrophins. J Biol Chem.;277(51):49466-72, 2002. RAIVICH, G.; MAKWANA, M. The making of successful axonal regeneration: Genes, molecules and signal transduction pathways.; Brain Res Brain Res Rev.;53(2):287-311, 2007 RAMÓN Y CAJAL, S. Degeneration and Regeneration of the Nervous System. London: Oxford University Press, 1928. REICHARDT, L.F. Neurotrophin-regulated signalling pathways. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.; 29;361(1473):1545-64, 2006. REYNIER-REBUFFEL, A.M.; CALLEBERT, J.; DIMITRIADOU, V.; MATHIAU, P.; LAUNAY, J.M.; SEYLAZ, J.; AUBINEAU, P. Carbachol induces granular cell exocytosis and serotonin release in rabbit cerebral arteries. Am J Physiol.;262(1 Pt 2):R105-11, 1992. REYNIER-REBUFFEL, A.M.; CALLEBERT, J.; LAUNAY, J.M.; SEYLAZ, J.; AUBINEAU, P. NE inhibits cerebrovascular mast cell exocytosis induced by cholinergic and peptidergic agonists. Am J Physiol.;273(3 Pt 2):R845-50, 1997. REYNIER-REBUFFEL, A.M.; MATHIAU, P.; CALLEBERT, J.; DIMITRIADOU, V.; FARJAUDON, N.; KACEM, K.; LAUNA,Y J.M.; SEYLAZ, J.; ABINEAU, P. Substance P, calcitonin gene-related peptide, and capsaicin release serotonin from cerebrovascular mast cells. Am J Physiol.;267(5 Pt 2):R1421-9, 1994. RICCIO, A.; PIERCHALA, B.A.; CIARALLO, C.L.; GINTY, D.D.; An NGF-TrkAmediated retrograde signal to transcription factor CREB in sympathetic neurons. Science. 22;277(5329):1037, 1997. SACCHETTI G.; BERNINI M.; GOBBI M.; PARINI S.; PIRONA L.; MENNINI T.; SAMANIN R. Chronic treatment with desipramine facilitates its effect on extracellular noradrenaline in the rat hippocampus: studies on the role of presynaptic alpha2-adrenoceptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.; 363(1):66-72, 2001.

153

SAFRANY, S.T.; SHEARS, S.B. Turnover of bis-diphosphoinositol tetrakisphosphate in a smooth muscle cell line is regulated by β2-adrenergic receptors through a cAMP-mediated, Akinase-independent mechanism. EMBO J.;17(6):1710-6, 1998. SAITO, A.; KASUYA, Y.; GOTO, K. A comparative study of changes in innervation and development of supersensitivity in the rat vas deferens after various procedures. Jpn J Pharmacol.;32(1):169-79, 1982. SANDERS, A.R.; DETERA-WADLEIGH, S.D.; AND GERSHON, E.S. Molecular genetics of mood disorders. In: Neurobiology of Mental Ilness, D.S. Charney, E.J. Nestler, and B.S. Bunney, eds. New York: Oxford, pp. 299–316, 1999. SANNOMIYA, P.; DE MORAES, S. Denervation supersensitivity to noradrenaline in the guinea-pig vas deferens in vivo: absence of the postjunctional component. Eur J Pharmacol.;54(1-2):167-71, 1979. SANNOMIYA, P.; DE MORAES, S. Effects of denervation, decentralization and cocaine on the responses of the guinea-pig vas deferens to phenylephrine in vivo and in vitro. J Pharm Pharmacol.;33(6):388-9, 1981a. SANNOMIYA, P.; DE MORAES, S. Denervation supersensitivity to norepinephrine in the guinea-pig vas deferens in vivo and in vitro: influence of the bathing solution. Arch Int Pharmacodyn Ther.;252(1):53-66, 1981b. SANTARELLI, L.; SAXE M.; GROSS, C.; SURGET, A.; BATTAGLIA, F.; DULAWA, S.; WEISSTAUB, N.; LEE, J.; DUMAN, R.; ARANCIO, O.; BELZUNG, C.; HEN, R. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science.;301(5634):805-9, 2003. SAPOLSKY, R.M. Stress, Glucocorticoids, and Damage to the Nervous System: The Current State of Confusion. Stress.;1(1):1-19, 1996. SAPOLSKY, R.M. Glucocorticoids and hippocampal atrophy in neuropsychiatric disorders. Arch Gen Psychiatry.;57(10):925-35, 2000a. SAPOLSKY, R.M. The possibility of neurotoxicity in the hippocampus in major depression: a primer on neuron death. Biol Psychiatry.; 48(8):755-65, 2000b. SCHILDKRAUT, J.J. The catecholamine hypothesis of affective disorders: a review of supporting evidence. J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 1995 Fall; 7(4):524-33; discussion 523-4, 1965. SCHLOSS, P.; HENN, F.A. New insights into the mechanisms of antidepressant therapy. Pharmacol Ther.; 102(1):47-60, 2004. SCHRÖDER, U.; SCHRÖDER, H.; AUGUSTIN, W.; SABEL, B.A. Haloperidol-induced behavioral supersensitivity is increased by monosialoganglioside treatment in rats without affecting spiroperidol-binding. J. Pharmacol Exp Ther.;271(3):1193-6, 1994.

154

SCHROETER, S.; APPARSUNDARAM, S.; WILEY, R.G.; MINER, L.H.; SESACK, S.R; BLAKELY, R.D. Immunolocalization of the cocaine- and antidepressant-sensitive lnorepinephrine transporter. J Comp Neurol.;420(2):211-32, May 1, 2000. SEONG, Y.H.; BABA, A.; MATSUDA, T.; IWATA, H. 5-Hydroxytryptamine modulation of electrically induced twitch responses of mouse vas deferens: involvement of multiple 5hydroxytryptamine receptors. J Pharmacol Exp Ther.; 254(3):1012-6, 1990. SHELINE, Y.; GADO, M.; KRAEMER, H.C. Untreated depression and hippocampal volume loss. Am. J. Psychiatry.; 160, 1 - 3, 2003. SHELINE, Y.I.; WANY, P.; GADO, M.H.; CSERNANSKY, J.G.; VANNIER, M.W. Hippocampal atrophy in recurrent major depression. Proc Natl Acad Sci USA. 93:3908 –3913, 1996. SHIRAYAMA, Y.; CHEN, A.C.; NAKAGAWA, S.; RUSSELL, D.S.; DUMAN, R.S.; Brainderived neurotrophic factor produces antidepressant effects in behavioral models of depression. J Neurosci.;22(8):3251-61, 2002 SJÖSTRAND, N.O.; SWEDIN, G. Potentiation by various smooth muscle stimulants of an isolated sympathetic nerve-seminal vesicle preparation from the guinea-pig. Acta Physiol Scand.;80(2):172-7, 1970. SLATTERY, D.A.; HUDSON, A.L.; NUTT, D.J.; Invited review: the evolution of antidepressant mechanisms. Fundam Clin Pharmacol.;18(1):1-21, 2004. SMITH, C.F.; BENNETT, R.T. Characterization of the inhibitory 5-HT receptor in the rat vas deferens. Arch Int Pharmacodyn Ther.;308:76-85, 1990. SMITH, M.A.; MAKINO, S.; KVETNANSKY, R.; POST, R.M. Stress and glucocorticoids affect the expression of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 mrnas in the hippocampus. J. neurosci.; 15(3 pt 1):1768-77, 1995. SON, Y.J.; THOMPSON, W.J. Nerve sprouting in muscle is induced and guided by processes extended by Schwann cells. Neuron.; 14(1):133-41, 1995a. SON, Y.J; THOMPSON, W.J. Schwann cell processes guide regeneration of peripheral axons. Neuron.; 14(1):125-32, 1995b. SPATZ, H. C. Hebb´s concept of synaptic plasticity and neuronal cell assemblies. Behavioral Brain Research, vol 78, p. 3-7, 1996. STARKE, K. Presynaptic alpha-autoreceptors. Rev Physiol Biochem Pharmacol.; 107:73146, 1987. SULSER, F. Antidepressant treatments and regulation of norepinephrine-receptor-coupled adenylate cyclase systems in brain. Advances in Biochemical Psychopharmacology.; 39, 249– 261, 1984.

155

SUNG ,U.; JENNINGS, J.L.; LINK, A.J.; BLAKELY, R.D. Proteomic analysis of human norepinephrine transporter complexes reveals associations with protein phosphatase 2A anchoring subunit and 14-3-3 proteins. . Biochem Biophys Res Commun.;333(3):671-8, 2005. TAKEBAYASHI, M.; HAYASHI, T.; SU, T.P. Nerve growth factor-induced neurite sprouting in PC12 cells involves sigma-1 receptors: implications for antidepressants. J Pharmacol Exp Ther.;303(3):1227-37, 2002. TATAGIBA, M.; BRÖSAMLE, C.; SCHWAB, M. E. Regeneration of injured axons in the adult mammalian central nervous system. Neurosurgery, v. 40, n. 3, p. 541- 547, 1997. THURET, S.; MOON, L.D.; GAGE, F.H;. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci.; 7(8):628-43, Aug 2006. Erratum in: Nat Rev Neurosci.; 7(11):902, 2006. TODOROV, L.D.; CLERKIN, R.; MIHAYLOVA-TODOROVA, S.T.; KHOYI, M.A.; WESTFALL, D.P. Beta2-adrenoceptor-mediated prejunctional facilitation and postjunctional inhibition of sympathetic neuroeffector transmission in the guinea pig vas deferens. J Pharmacol Exp Ther.;298(2):623-33, 2001. TRENDELENBURG, U.; WEINER, N. Sensitivity of the nictitating membrane after various procedures and agents. J Pharmacol Exp Ther.;136:152-61, 1962. TSUNOO, A.; KUROKAWA, M.; TAKAHASHI, K. Neurally evoked potentiation of tonic contractions in the guinea-pig vas deferens involves adenosine receptors. J Physiol.; 433:16381, 1991. VASSILEV, P.; STANEVA-STOYTCHEVA, D.; MUTAFOVA-YAMBOLIEVA, V. Do H3-receptors participate in the effects of histamine on electrically-evoked contractions of rat vas deferens? Gen Pharmacol.;22(4):643-5, 1991. VAN ROSSUM, J.M. Cumulative dose-response curves. II. Technique for the making of dose-response curves in isolated organs and the evaluation of drug parameters. Arch Int Pharmacodyn Ther.;143:299-330, 1963. VELASCO, A.; ALAMO, C.; HERVÁS, J.; CARVAJAL, A. Effects of fluoxetina hydrochloride and fluvoxamine maleate on different preparations of isolated guinea pig and rat organ tissues. Gen. Pharmacol.;28(4):509-12, 1997. VELASCO, A.; HERVAS, J.; CARVAJAL, A.; ALVAREZ, F.J.; ALAMO, C. Effect of several antidepressant drugs on isolated rat vas deferens in vitro. Methods Find Exp Clin Pharmacol.;18(8):507-11, 1996. VIOLA, M.S.; RODRÍGUEZ DE LORES ARNAIZ, G.; ENERO, M.A. Na+,K(+)-ATPase activity in CNS and noradrenergic neurotransmission: time course of differential desipramine (DMI) effects. Neurochem. Int.;24(1):91-7, 1994. VITAL, M.A.; FLÓRIO, J.C.; FRUSSA-FILHO, R.; DE LUCIA, R.; TUFIK, S.; PALERMO-NETO, J. Effects of haloperidol and GM1 ganglioside treatment on striatal D2 receptor binding and dopamine turnover. Life Sci.;62(13):1161-9, 1998.

156

VITAL, M.A.; FRUSSA-FILHO, R.; PALERMO-NETO, J. Effects of monosialoganglioside on dopaminergic supersensitivity. Life Sci.;56(26):2299-307, 1995. VIZI, E.S.; BURNSTOCK, G. Origin of ATP release in the rat vas deferens: concomitant measurement of [3H]noradrenaline and [14C]ATP. Eur J Pharmacol.;158(1-2):69-77, 1988. WAKABAYASHI, H.; TAKAKURA, N.; TERAGUCHI, S.; TAMURA, Y. Lactoferrin feeding augments peritoneal macrophage activities in mice intraperitoneally injected with inactivated. Candida albicans. Microbiol Immunol.;47(1):37-43, 2003. WANIGASEKARA, Y.; KEPPER, M.E.; KEAST, J.R. Immunohistochemical characterisation of pelvic autonomic ganglia in male mice. Cell Tissue Res.;311(2):175-85, 2003. WARNER, M.R.; WISLER, P.L.; HODGES, T.D.; WATANABE, A.M.; ZIPES, D.P. Mechanisms of denervation supersensitivity in regionally denervated canine hearts. Am J Physiol.;264: 815-20, 1993. WESTFALL, D.P. Nonspecific supersensitivity of the guinea-pig vas deferens produced by decentralization and reserpine treatment. Br J Pharmacol.;39(1):110- 20, 1970. WESTFALL, D.P.; FEDAN,J.S.The effect of pretreatment with 6-hydroxydopamine on the norepinephrine concentration and sensitivity of the rat vas deferens. Eur J Pharmacol.;33(2):413-7, 1975. WESTFALL, D.P; McCLURE, D.C.; FLEMING, W.W. The effects of denervation, decentralization and cocaine on the response of the smooth muscle of the guinea-pig vas deferens to various drugs. J Pharmacol Exp Ther.;181(2):328-38, 1972. WESTFALL, D.P.; MILLECCHIA, L.L.; LEE, T.J.; COREY, S.P.; SMITH, D.J.; FLEMING, W.W. Effects of denervation and reserpine on nexuses in the rat vas deferens. Eur J Pharmacol.;41(2):239-42, 1977. ZHU, M.Y.; ORDWAY, G.A. Down-regulation of norepinephrine transporters on PC12 cells by transporter inhibitors. J Neurochem.; 68(1):134-41, 1997. ZHU, M.Y.; KIM C.H.; HWANG, D.Y.; BALDESSARINI, R.J.; KIM, K.S. Effects of desipramine treatment on norepinephrine transporter gene expression in the cultured SK-NBE(2)M17 cells and rat brain tissue. J Neurochem.;82(1):146-53, 2002.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful