Acta Scientiae Veterinariae 34 Suplement

Binelli M., Ibiapina B.T. & Bisinotto R.S. 2006.
Bases fisiológicas, farmacológicas e endócrinas dos tratamentos de

sincronização do crescimento Acta Scientiae
folicular Veterinariae
e da ovulação. 34(Suplemento
Acta Scientiae 1): 2006
Veterinariae. 34 (Supl 1): 1-7.
BASES FISIOLÓGICAS, FARMACOLÓGICAS E ENDÓCRINAS DOS

TRATAMENTOS DE SINCRONIZAÇÃO DO CRESCIMENTO FOLICULAR E DA
OVULAÇÃO
Mario Binelli; Bruna Trentinaro Ibiapina; Rafael Siscôneto Bisinotto
Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,

Universidade de São Paulo
Resumo
Os modernos protocolos utilizados para a inseminação artificial e transferência de embriões em

tempo fixo foram desenvolvidos com base no conhecimento profundo do controle endócrino do
ciclo estral bovino. Com tal conhecimento tornou-se possível o controle das fases do
desenvolvimento folicular, recrutamento, seleção e ovulação, pela utilização estratégica de
fármacos específicos. O controle farmacológico do ciclo estral facilita o manejo reprodutivo e
aumenta a eficiência de operações pecuárias de produção de leite e carne. O objetivo do presente
trabalho é prover o embasamento teórico necessário sobre o controle endócrino do funcionamento
ovariano para que sua manipulação farmacológica possa ser efetuada de forma racional.
Palavras-chave: Folículos, Esteróides, Gonadotrofinas, Ciclo estral, Bovinos, Revisão.
Introdução
A característica mais marcante do processo reprodutivo é que este é cíclico. Tal característica
pode ser exemplificada em vacas, que apresentam comportamento estral que se repete em média
a cada 21 dias, sendo o período compreendido entre dois estros consecutivos denominado ciclo
estral. A justificativa evolutiva da atividade cíclica é prover à fêmea oportunidades sucessivas
de se tornar gestante e com isso perpetuar a espécie. A atividade cíclica depende de um complexo
mecanismo, orquestrado pelo sistema nervoso central que, em instância final, controla o
funcionamento do sistema reprodutivo. Tal controle é exercido pelas ações tecido-específicas
de hormônios protéicos e esteróides, fatores de crescimento, citocinas e prostanóides. A biologia
do ciclo estral bovino foi descrita exaustivamente em uma série de artigos científicos e livros
texto específicos (Roche et al., 1998; Wiltbank et al., 2002; Senger, 2003; Martinez et al., 2004;
Moore & Thatcher, 2006). O objetivo do presente trabalho é prover o embasamento teórico
necessário sobre o controle endócrino do funcionamento ovariano para que sua manipulação
farmacológica possa ser efetuada de forma racional.
O controle endócrino do ciclo estral bovino
Durante um ciclo estral, ocorrem normalmente duas ou três ondas de crescimento folicular
consecutivas, sendo apenas a última onda ovulatória. O folículo ovulado passa por mudanças
funcionais e estruturais para dar origem ao corpo lúteo (CL). O CL desenvolve-se rapidamente,
secretando quantidades crescentes de progesterona (P4). Por volta do dia 18, o processo de
luteólise causa a regressão do CL e a conseqüente queda das concentrações plasmáticas de P4.
Cada onda de crescimento folicular é caracterizada pelas fases de recrutamento, seleção e
dominância. O folículo dominante (FD) de uma onda tem dois destinos possíveis. Na presença
de P4 o FD entra em regressão ou atresia. Após a luteólise, o FD escapa à atresia e ovula. Se não
houver fertilização do ovócito ovulado, o ciclo se repetirá.
s1
Acta Scientiae Veterinariae 34(Suplemento 1): 2006
Em uma determinada onda, cada fase de crescimento folicular é controlada por mecanismos
específicos. O início de uma onda de crescimento folicular depende do término da onda que a
precedeu. Com a atresia ou ovulação do FD anterior, diminuem as concentrações plasmáticas de
inibina e estradiol-17β (E2). Tais hormônios são inibitórios e sua diminuição resulta na liberação
de um pico de FSH pela hipófise anterior e no recrutamento de uma nova onda (Adams et al.,
1992b). O recrutamento consiste do crescimento concomitante de um grupo de folículos em
resposta ao FSH. Conforme os folículos vão crescendo, aumenta sua capacidade de produção de
E2 e inibina, que suprimem paulatinamente a liberação de FSH (Gibbons et al., 1997). As
concentrações decrescentes de FSH limitam o crescimento folicular e a maioria dos folículos
recrutados entra em atresia. A seleção folicular é o ajuste do número de folículos recrutados para
o número de folículos ovulados normalmente, em um ciclo estral, por uma determinada espécie,
ou seja, um no caso dos bovinos. Assim, dentre os folículos recrutados em cada onda, apenas
um é selecionado por conseguir continuar a crescer sob concentrações limitantes de FSH.
Ultrasonograficamente, pode-se definir a seleção pelo momento do “desvio” folicular, que é o
momento no qual o folículo selecionado passa a ter uma taxa de crescimento (i.e., aumento
diário de diâmetro) maior que os outros folículos recrutados na mesma onda (Ginther et al.,
2001). Os mecanismos de seleção são controversos, mas provavelmente o folículo selecionado
apresenta mais precocemente a capacidade de responder ao estímulo provido por uma outra
gonadotrofina hipofisária, o LH (Driancourt, 2001; Sartori et al., 2001). Em resposta ao LH o
folículo selecionado continua a crescer e sua capacidade de produzir E2 e inibina aumenta. Tal
fato leva as concentrações de FSH ao nadir e o folículo selecionado se torna dominante (Ginther,
et al., 1999). A dominância é definida como a capacidade de um folículo inibir o crescimento
dos demais. A taxa de crescimento do FD é maior quanto maior for a freqüência de pulsos de
LH, sendo esta controlada diretamente pelo neurohormônio hipotalâmico GnRH (Karsh et al.,
1997). Ocorre que a freqüência de pulsos de GnRH e, conseqüentemente, de LH é inversamente
proporcional às concentrações de P4 circulante (Adams et al., 1992a). Durante a fase luteínica
do ciclo estral a freqüência de pulsos de LH é insuficiente para estimular a diferenciação final e
ovulação do FD. Ao entrar em atresia o FD perde a dominância e ocorre recrutamento de uma
nova onda, como mencionado acima. Alternativamente, na fase folicular do ciclo, com a ausência
de P4 ocorre aumento na freqüência de pulsos de LH que estimula a liberação de quantidades
crescentes de E2 pelo FD. O E2 induz mudanças de comportamento associadas ao estro e induz
a liberação de um pico pré-ovulatório de GnRH, seguido por um pico de liberação de LH que
causa a ovulação do FD.
Manipulações do ciclo estral bovino
O entendimento da fisiologia do ciclo estral bovino possibilitou que o mesmo fosse

manipulado de forma a aumentar-se a eficiência reprodutiva em operações pecuárias. Entende-
se por manipulação do ciclo estral a interferência humana visando alterar sua duração. Tal alteração
se dá pela interferência na seqüência cronológica natural das ondas dentro de um ciclo e das
fases dentro de cada onda de crescimento folicular. Exemplos de finalidades práticas das
manipulações são: sincronização de ovulações para inseminação artificial em tempo fixo (Baruselli
et al., 2004a) ou transferência de embriões em tempo fixo (Bó et al., 2002), superovulação de
doadoras (Bó et al., 2006), controle da progesteronemia (Marques et al., 2002) e controle da
luteólise (Binelli et al., 2001; Machado et al., 2006; Bisinotto et al., 2006; Ibiapina et al., 2006).
Para as manipulações do ciclo estral bovino são comumente utilizadas estratégias farmacológicas.
Tais estratégias consistem em protocolos de tratamentos hormonais, aplicados em uma seqüência
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pré-definida, visando um ou mais efeitos específicos, como por exemplo, controlar o recrutamento,
a seleção, a ovulação ou a atresia folicular.
Controle do recrutamento folicular
O recrutamento de uma nova onda depende do término da onda anterior, ou seja, da

eliminação dos efeitos supressivos causados por folículos em estádios mais adiantados de
crescimento folicular. A eliminação de tais folículos pode ser alcançada de diferentes maneiras,
e sua eficiência depende da fase da onda de crescimento folicular (Twagiramungu et al., 1995;
Martinez et al., 1999). Em qualquer onda de crescimento folicular, após a seleção os FD ganham
capacidade de responder ao LH e ovular. Após a ovulação, segue a liberação de um pulso de
FSH que leva ao recrutamento de uma nova onda um dia após (Adams et al., 1992b). Dessa
forma, tratamentos com GnRH (Twagiramungu et al., 1995), LH (Martinez et al., 1999; Goissis
et al., 2004) ou hCG (Diaz et al., 1998) causam a ovulação e o recrutamento de novos folículos.
A eficiência ovulatória de tratamentos com GnRH e LH variou, dependendo se a aplicação foi
realizada dia 3, 6 ou 9 do ciclo estral (Martinez et al., 1999). Na ausência de ovulação, o
recrutamento da nova onda ocorreu espontaneamente conforme esperado.
Em contraste ao GnRH ou LH, o efeito dos estrógenos é independente do estádio do ciclo
estral ou da onda de desenvolvimento folicular (revisado por Bó et al., 1995). A aplicação de
estrógenos causa, inicialmente, uma supressão na secreção tanto de FSH quanto de LH (Martinez
et al., 2003), levando à atresia dos folículos. Segue a liberação de um pico de FSH e,
conseqüentemente, o recrutamento de uma nova onda. O intervalo entre a aplicação do estrógeno
e o recrutamento da nova onda depende da dose administrada e da natureza do estrógeno, sendo
maior para doses maiores e para valerato de estradiol, benzoato de estradiol e E2, nessa ordem
(Martinez et al., 2005).
O controle do recrutamento folicular é utilizado em um grande número de protocolos visando
IATF (Baruselli et al., 2004; Vasconcelos et al., 2004; Moore & Thatcher, 2006), TETF (Bó et
al., 2002; 2006) e o retardamento da luteólise (Binelli et al., 2001; 2005; Machado et al., 2006).
Controle da seleção folicular
Objetiva-se com o controle da seleção folicular aumentar o número de folículos a continuar

o crescimento e, potencialmente, a ovular em uma mesma onda. Para tanto, é necessário que se
supra ao animal algum composto com atividade folículo-estimulante, uma vez que as
concentrações endógenas de FSH tornam-se limitantes entre o recrutamento e a seleção de folículos
em uma determinada onda (Adams et al., 1993; Adams, 1994). Dessa forma, protocolos
comumente utilizados para interferir com o mecanismo de seleção folicular e levar ao
desenvolvimento múltiplo de folículos contém aplicações estratégicas de eCG e FSH (Boland et
al., 1978; Donaldson, 1989; Wilson et al., 1993; Barros & Nogueira, 2001; Seneda et al., 2005).
O interesse prático no controle da seleção é, principalmente, na superestimulação ovariana visando
a obtenção de múltiplas ovulações de doadoras de embriões. Mais recentemente, aumentou o
interesse em também superestimular o desenvolvimento folicular em receptoras, objetivando a
produção de múltiplos CLs e conseqüente aumento na progesteronemia (Binelli et al., 2001).
Concentrações mais elevadas de P4 estão associadas a maiores taxas de concepção em receptoras
de embrião (Mann et al., 1999; Marques et al., 2002). Para a efetiva superestimulação, é necessário
que a atividade folículo-estimulante seja provida em fase adequada da onda de crescimento
folicular, idealmente a partir do seu recrutamento (Bó et al., 2003). Assim, os protocolos de
superestimulação mais modernos incluem tratamentos visando controlar o recrutamento folicular,
s3
utilizando estratégias similares às descritas acima (Nogueira & Barros, 2003; Baruselli et al.,
2006).
Controle da ovulação de folículos
Para que ocorra a ovulação é necessário que um FD (i.e., pós-seleção e pré-atresia) seja
exposto a um pico de LH. Pode-se programar a presença de um FD com capacidade ovulatória
programando-se anteriormente o recrutamento da onda de crescimento folicular pelos métodos
descritos acima. Na ausência de P4 a ovulação ocorrerá espontaneamente. Assim, formas de se
programar a ovulação incluem a indução farmacológica da luteólise utilizando-se prostaglandina-
F2α ou seus análogos sintéticos (PGF) ou a remoção de um dispositivo contendo P4 ou
progestágenos, como o norgestomet, em animais previamente tratados com PGF. Para se controlar
mais precisamente o momento da ovulação, é comum utilizar-se em protocolos de IATF e TETF
algum agente indutor da ovulação. Para esse fim, comumente utilizam-se estrógenos (Lammoglia
et al., 1998), GnRH (Pursley et al., 1995) ou LH (Brogliatti et al., 1998). Binelli e colaboradores
(2001) propuseram uma série de estratégias visando diminuir a mortalidade embrionária associada
às falhas no processo de reconhecimento materno da gestação em bovinos. Tais estratégias
incluem o aumento da progesteronemia em animais previamente inseminados. Um aumento nas
concentrações plasmáticas de P4 pode ser alcançado pela ovulação do FD da primeira onda de
crescimento folicular e conseqüente formação de um CL acessório (Schmitt et al., 1996). De
fato, maiores taxas de prenhez foram reportadas em animais com CL assessório induzido por
GnRH, LH ou hCG (Santos et al., 2001; 2004; Marques et al., 2002).
Considerações finais
O conhecimento dos fundamentos do controle endócrino do ciclo estral bovino permitiu

que estratégias racionais fossem elaboradas para que fins específicos, como a IATF e a TETF,
fossem alcançados. Com a utilização estratégica de fármacos é possível controlar precisamente,
individualmente e em conjunto, as fases da onda de crescimento folicular. Tal controle facilita o
manejo reprodutivo e aumenta a eficiência de operações pecuárias de produção de leite e carne.
Agradecimentos
FAPESP e CNPq pelo apoio financeiro, Prefeitura do Campus Administrativo de

Pirassununga pela concessão de animais experimentais, pos-docs, estudantes, estagiários e
pesquisadores colaboradores do Laboratório de Fisiologia e Endocrinologia Molecular da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo pelas contribuições
técnicas e intelectuais, Centro Paulista de Desenvolvimento Farmacotécnico, Bellman e
INTERVET pela concessão de fármacos e materiais experimentais.
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Scientiae Veterinariae. 34 (Supl 1): 9-16.
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO (IATF) EM BOVINOS
José Luiz Moraes Vasconcelos; Mauro Meneghetti; Ricarda Maria dos Santos
DPA – FMVZ – UNESP, Botucatu, SP; vasconcelos@fca.unesp.br
Em todo o mundo existem relatos que indicam baixa taxa de serviço em bovinos,
principalmente devido comprometimento na eficiência da detecção de estro. Visando otimizar o
manejo, o uso de mão-de-obra e minimizar a observação de cio, foram desenvolvidos protocolos
de sincronização da ovulação, que além de auxiliarem na indução da ciclicidade, permitem a IA,
de todos os animais, em horário pré-determinado (IATF), contornando os desafios da observação
de cio. Um protocolo de sincronização de ovulação deve ser de fácil aplicabilidade, ter alta
probabilidade de sucesso, ser viável economicamente (relação custo/benefício) e ser administrado
num curto período de tempo.
O objetivo desta revisão é apresentar resultados de trabalhos desenvolvidos no Brasil
utilizando IATF, em bovinos de corte e leite.
BOVINOS DE CORTE
Época de parição de novilhas no escore de condição corporal e na resposta a protocolo
de inseminação artificial em tempo fixo
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da época de parição no escore de condição
corporal (ECC) no início de estação de monta (EM) e na resposta a protocolo de IATF em vacas
primíparas. No experimento 1 foi avaliado o efeito da época do parto na alteração do ECC pré e
pós-parto em 87 novilhas Nelore e em 68 ½ Red Angus x ½ Nelore, que foram inseminadas em
datas diferentes para parir de forma distribuída nos meses de setembro a dezembro. O ECC foi
avaliado mensalmente no pré e pós-parto, de junho a fevereiro. No experimento 2, foram utilizadas
538 primíparas de duas fazendas (60 Nelore e 123 ½ Red Angus x ½ Nelore na fazenda 1 e 355
Nelore na fazenda 2), com 33 a 104 DPP e parto entre setembro e dezembro. As vacas foram
sincronizadas com o protocolo: inserção do dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®, Pfizer, novo
ou pré-utilizado por 9 ou 18 dias), e aplicação de estrógeno (2,0 mg de Benzoato de Estradiol,
Estrogin®, Farmavet, i.m.), após sete dias foi aplicado PGF2α (12,5 mg de Dinoprost, Lutalyse®,
Pfizer, i.m.). No dia 9 foi retirado o CIDR®, aplicado 0,5 mg de Cipionato de Estradiol (E.C.P.®,
Pfizer, i.m) e os bezerros foram removidos. Todos os animais foram inseminados 46 a 52 horas
após a retirada do CIDR®. Após a inseminação, os bezerros retornaram com suas mães. Apenas
nos animais da fazenda 2 foi avaliada a taxa de sincronização, por dois exames de ultra-som
(Aloka SSD-500, 5,0 MHz) e determinada de acordo com a presença e ausência de folículo
dominante no momento da IATF e 48 horas após. O diagnóstico de gestação foi feito por ultra-
som 28 dias após a IATF. A análise estatística do experimento 1 foi feita no PROC MIXED e do
experimento 2 no PROC LOGISTIC do SAS. No experimento 1 o mês de parição teve efeito
(p<0,001) na dinâmica do ECC ao longo dos nove meses do período experimental, os animais
com parto nos meses de setembro e outubro apresentaram redução mais acentuada no ECC do
que aqueles com parto em novembro e dezembro. No experimento 2 houve tendência de efeito
do ECC (p=0,07) na sincronização ao protocolo, os animais com melhor ECC tiveram maior
taxa de sincronização. O ECC teve efeito linear (p<0,0001) sobre a taxa de concepção, mostrando
melhora na taxa de concepção proporcional ao aumento no ECC. Não foi observado efeito de
raça ou de fazenda na taxa de concepção. A taxa de concepção das vacas efetivamente sincronizadas
s9
foi de 58,9% (99/168) e não foi verificado efeito de qualquer variável. Estes dados mostram a
importância dos animais apresentarem bom ECC no momento da IATF e para se conseguir isto
não se deve antecipar a parição das novilhas de corte.
Efeito de diferentes estratégias de manejo reprodutivo em vacas de corte paridas
Após o parto, vacas de corte apresentam quadro de balanço energético negativo. Algumas
estratégias de manejo podem ser aplicadas nestas situações, visando à indução de ciclicidade, a
redução da ocorrência de ciclos curtos e o aumento da eficiência reprodutiva. Estas estratégias
também permitem melhor controle da estação de monta, possibilitando as vacas emprenhar em
período mais adequado, permitindo desta maneira, a concentração das parições e melhor
desenvolvimento dos bezerros. O objetivo deste experimento foi comparar diferentes estratégias
de manejo reprodutivo, na porcentagem de vacas gestantes ao final da EM, porcentagem de
vacas gestantes por IA, número de dias para o nascimento dos bezerros e intervalo entre partos.
Foram utilizadas 724 vacas cruzadas (Brangus x Nelore), divididas aleatoriamente em 5
grupos:
G1 (n=143) controle: monta natural (1:25) por 107 dias;
G2 (n=143) observação de cio e inseminação artificial nos primeiros 57 dias, seguida por
repasse de touros (1:25) por mais 50 dias;
G3 (n=145) dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®) por 6 dias, remoção de bezerros por 60
horas, observação de cio e inseminação artificial por 57 dias, seguida por repasse de touros
(1:25) por mais 50 dias;
G4 (n=144) remoção de bezerros por 48 horas, seguido de aplicação de GnRH (Fertagyl®,
100mcg, i.m.), e inserção do dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®), sendo que após 6,5 dias,
retirou-se o dispositivo e foi aplicado PGF2α (Lutalyse®, 25mg, i.m.), realizando-se nova remoção
de bezerros por 48 horas, seguida por aplicação de GnRH e IATF. Após 7 dias os animais foram
colocados em repasse com touros por 107 dias.
G5 (n=149) recebeu o mesmo protocolo do G4, sendo que após a IATF os animais ficaram
apartados para re-observação de cio e inseminação, entre os dias 17 a 25, entrando em repasse
com touros, por mais 82 dias.
Foi realizado diagnóstico de gestação por exame de ultra-sonografia, utilizando-se o aparelho
modelo Aloka SSD – 500, com transdutor linear de 7,5 MHz, via retal, 30 dias após o início da
estação de monta (G3, G4 e G5) e 30 dias após o final da estação de monta, em todos os grupos.
As variáveis binomiais (porcentagem de vacas gestantes e porcentagem de vacas gestantes por
inseminação artificial) foram analisadas por regressão logística. As variáveis contínuas (dias
médios para nascimento dos bezerros e intervalo entre partos) foram analisadas por análise de
variância.
As estratégias de manejo reprodutivo não influenciaram a porcentagem de vacas gestantes
ao final da estação de monta, G1 = 92,3; G2 = 89,5; G3 = 82,8; G4 = 96,5 e G5 = 91,3%. As taxas
de concepção na IATF nos grupos 4 e 5 foram 47,2 e 51,7%, respectivamente. A porcentagem de
vacas gestantes por IA foi diferente (P<0,01) entre os tratamentos, G1 = 0,0; G2 = 69,5; G3 =
67,5; G4 = 48,9 e G5 = 75,0%. Houve efeito de grupo (P<0,01) no número de dias para o
nascimento dos bezerros (G1 = 38, G2 = 44; G3 = 39; G4 = 30 e G5 = 24 dias) e no intervalo
entre partos (G1 = 400; G2 = 402; G3 = 401; G4 = 382 e G5 = 375 dias). Os resultados mostram
que a IATF permite antecipar nascimento e emprenhar as vacas no início da estação de monta, o
que consequentemente reduz o número de dias para o nascimento dos bezerros e o intervalo
s10
entre partos. A associação da IATF e observação do cio de retorno (17 a 25 dias) permite ter mais
bezerros nascidos de IA.
Uso de protocolo de IATF associado a diagnostico precoce de gestação e re-sincronização
como estratégia para maximizar o número de vacas gestantes por IA em estação de monta
reduzida.
O objetivo deste trabalho foi avaliar se a estratégia reprodutiva (IATF no inicio da EM
associado com observação de cio no retorno, diagnóstico precoce de gestação e re-sincronização)
permite maximizar o número de animais gestantes por IA em estação de monta (EM) reduzida
(37 dias) em vacas de corte pós-parto.
Foram utilizadas 316 vacas da raça Nelore e aneloradas com 64 ± 17 dias pós-parto (de 40
a 110 dias) no momento da IATF. Os animais foram mantidos em regime de pastejo extensivo de
Brachiaria decumbens e suplementação mineral. O ECC foi avaliado no momento da IATF,
sendo de 3,06 ± 0,45 (de 2,25 a 3,75), usando a escala de 1 (muito magra) a 5 (muito gorda)
proposta por Edmonson, et al. (1989). Todas as vacas foram sincronizadas e inseminadas em
tempo fixo com o mesmo protocolo, no início da EM (dia 0): no dia -11 foi realizada a inserção
de dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®, Pfizer Saúde Animal) previamente utilizado por nove
ou dezoito dias juntamente com a aplicação de 2,0mg de Benzoato de Estradiol (2,0mL de
Estrogin®, Farmavet). No dia -4 foi aplicado 12,5mg de dinoprost trometamina, (2,5mL de
Lutalyse®, Pfizer Saúde Animal), dose reduzida testada por Losi et al. (2005), apenas nos animais
que tinham a presença de corpo lúteo. No dia -2, pela manhã, foi removido o dispositivo CIDR®,
aplicado 0,5mg de cipionato de estradiol (0,25mL de ECP®, Pfizer Saúde Animal) e os bezerros
foram separados de suas mães. No dia 0, 48 a 54 horas após a retirada do CIDR®, todos os
animais foram inseminados. Após a inseminação de todos os animais, os bezerros retornaram
com suas mães. Na IATF foi utilizado descongelador eletrônico de sêmen (Fertilize®) para facilitar
o processo sem comprometer o padrão de descongelamento. Os exames de ultra-som foram
realizados com aparelho Aloka SSD- 500 com transdutor linear de 5,0 MHz. A taxa de ciclicidade
foi avaliada por dois exames de ultra-som, nos dias -11 e -4 (US 1 e 2), sendo considerados em
anestro as vacas que não apresentaram corpo lúteo (CL) nas duas avaliações. A taxa de
sincronização foi avaliada pelos exames ultra-som no momento da IATF e 48 horas após esta
(US 3 e 4), considerando sincronizados os animais com presença e ausência de folículo dominante
nos dois exames, respectivamente. A taxa de concepção na IATF foi avaliada por ultra-som (US
5) 28 dias após a IATF. As taxas concepção no retorno em cio e na re-sincronização foram
avaliadas por ultra-som (US 6) 28 dias após o final da EM. Foi realizada detecção de cio apenas
entre os dias 18 e 24 após a IATF, pois devido a sincronização, os animais tendem a retornar em
cio sincronizado, sendo que os animais detectados em cio foram inseminados 12horas após a
detecção. Em todos os animais, exceto os que foram inseminados entre os dias 18 e 24, foi feito
diagnóstico precoce de gestação (US 5) e as vacas vazias foram re-sincronizadas. Todas as vacas
receberam dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®) e foram classificadas de acordo com a presença
ou ausência de CL ao exame de ultra-som. Passados seis dias foi retirado o dispositivo e aplicado
2,5mL de Lutalyse® nas vacas com presença de CL ou 200UI de eCG (Folligon®, Intervet) naquelas
que não apresentaram CL. Neste dia os bezerros dessas vacas foram removidos por 72 horas e as
vacas inseminadas 12 horas após detecção de estro. As variáveis, taxa de ovulação e de concepção,
foram analisadas por regressão logística (SAS), sendo incluídas nos modelos as variáveis
ciclicidade, condição corporal, manifestação de estro e pré-utilização do CIDR. Touro e
inseminador foram incluídos no modelo para avaliar taxa de concepção.
s11
BE Lutalyse E.C.P.
(dia -11) (dia -4) (dia -2) dia 18 dia 24 dia 28 dia 34 dia 37 dia 65
IATF
(dia 0)
Cio
CIDR Obs. CIDR +
RB Cio IA
7 dias 2 d. 2 d. 2 d. 24 dias 6 dias. 3 d. 28 dias
US 1 US 2 US 3 US 4 US 5 Final EM US 6
US = ultra-som
RB = remoção de bezerro
No início da EM, 83,2% (263/316) dos animais estavam em anestro. O protocolo de IATF
utilizado sincronizou 89,0% (234/263) dos animais em anestro e 90,6% (48/53) dos que estavam
ciclando. A taxa de concepção foi maior (P<0,05) nas vacas ciclando (66,0%, 35/53) do que nas
vacas que estavam em anestro (47,5%, 125/263).
A taxa de sincronização ao protocolo não foi influenciada pelo ECC, sendo 88,3% (113/
128) nos animais com menor ECC (d”2,75), 87,4% (83/95) nas vacas com ECC intermediário
(3,00 e 3,25) e 90,3% (84/93) naquelas com maior ECC (e”3,50). Foi observado efeito (P<0,05)
do escore condição corporal na taxa de concepção, sendo 42,1% (53/126) para menor ECC,
55,3% (52/94) nas vacas com ECC intermediário e 59,1% (55/93) para vacas com maior ECC.
Não foi observado efeito do período de pré-utilização do CIDR nas respostas ao protocolo.
As taxas de sincronização foram 88,8% (159/179) e 88,3% (121/137) e as taxas de concepção
foram 50,8% (91/179) e 50,4% (69/137) nos animais que receberam CIDR pré-utilizado por
nove e dezoito dias, respectivamente.
Foi observada alta taxa de manifestação de estro (77,2%) nas 48 horas entre o momento da
retirada do CIDR e a IATF, os animais que mostraram estro tiveram maior (P<0,01) taxa de
sincronização (93,4%; 228/244) do que as que não mostraram estro (72,2%; 52/72). A taxa de
concepção não foi diferente entre os animais que mostraram ou não estro (52,1%; 127/244 vs.
45,8%; 33/72, respectivamente).
Os resultados de sincronização e de concepção ao protocolo de IATF foram de 89,2% e
50,6%, respectivamente. No retorno sincronizado do cio, 18 a 24 dias após a IATF, a taxa de
detecção de estro foi de apenas 36,7% (33/90), e considerou-se apenas as vacas com presença de
CL ao diagnóstico de gestação aos 28 dias, sendo que a taxa de concepção desses animais foi
69,7% (23/33). Na re-sincronização foram inseminados 58,2% (71/122) dos animais tratados e a
taxa de concepção nesses animais foi 63,4% (45/71). Nos animais com presença de CL e que
receberam meia dose de Lutalyse® (2,5ml) a taxa de serviço foi 56,1% (32/57) e a de concepção
foi 71,9% (23/32). Nos animais em anestro, que receberam eCG (200UI Folligon®) a taxa de
serviço foi de 60,0% (39/65) e a de concepção foi 56,4% (22/39). Dessa forma, a taxa de prenhez
cumulativa por IA foi de 69,3%. Verificou-se que o ECC no início da EM foi determinante na
velocidade com que as vacas ficaram gestantes ao longo da estação de monta (Figura 1). A
estratégia utilizada IATF no inicio da EM, observação de cio por 7 dias (entre os dias 18 e 24),
diagnóstico precoce de gestação aos 28 dias e re-sincronização foi eficiente, pois permitiu
emprenhar 69,3% da vacas por IA em EM de 37 dias. Melhores resultados podem ser alcançados
se os animais apresentarem ECC adequado no início da EM.
s12
90
Taxa de Gestação (%)

79.6
80
68.8 76.6
70
59.1
60 60.6 65.9
ECC =2,75
50 55.3
50.0 ECC 3,00 e 3,25
40 42.1 ECC =3,50
30
IATF (dia 0) Observação de Cio Ressincronização
(18 a 24 dias) (37 dias)
Dias de Estação de Monta
Figura 1: Efeito do ECC na taxa de gestação ao longo da estação de monta
Validação de um protocolo de sincronização da ovulação em vacas de corte
Em 2005 foi desenvolvido um protocolo para sincronização de ovulação de vacas de corte

(Meneghetti et al. 2005a). Esse protocolo proporcionou taxa de concepção de 50,6% na IATF e
consistia em: D0 – inserção de um dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®, Pfizer) associado à
aplicação de 2 mg de benzoato de estradiol (2 mL, IM, Estrogin®, Farmavet). No D7 administração
de 12,5 mg de dinoprost trometamina (2,5 mL, IM, Lutalyse®, Pfizer). No D9, retirada do CIDR®,
aplicação de 0,5 mg de cipionato de estradiol (0,25 mL, IM, ECP®, Pfizer) e separação dos
bezerros até o término da IATF, que foi realizada 48 horas após a retirada do CIDR®. Esse estudo
teve como objetivo validar o protocolo supracitado. Os dados de 7527 vacas de corte, sincronizadas
com esse protocolo durante a estação de monta 2005/2006, foram analisados por regressão
logística. A taxa de concepção na IATF foi de 48,9% (3681/7527) e foi influenciada (P<0,001)
pelas variáveis: categoria, raça e ECC. A taxa de concepção diferiu entre vacas secas, primíparas
e multíparas, sendo de 39,4% (137/348), 46,3% (937/2022) e 50,5% (2607/5157), respectivamente.
Vacas cruzadas (½ Bos taurus taurus / ½ Bos taurus indicus) apresentaram maior taxa de
concepção quando comparado a vacas Bos taurus taurus e vacas Nelore [62,3% (964/1547),
53,0% (150/283) e 45,1% (2567/5697)]. Vacas com menor ECC mostraram menor taxa de
concepção na IATF [ECC 2,5: 41,9% (687/1638); ECC 2,75: 50,3% (831/1653); ECC 3,0: 49,4%
(1006/2035); ECC 3,25: 49,2% (386/785); ECC 3,5: 54,5% (771/1416)]. O número de vezes
que o dispositivo CIDR® havia sido utilizado anteriormente (0 vs. 1 vs. 2) não afetou a taxa de
concepção na IATF. Esses resultados validam o protocolo para sincronização de ovulação em
vacas de corte e fatores como categoria, raça e ECC devem ser levados em consideração antes de
se implementar um programa de IATF em vacas de corte.
Adição de eCG ou remoção de bezerro no final de protocolo de IATF
A suplementação de LH ao final de protocolos de IATF melhora o desenvolvimento folicular

resultando em incremento nas taxas de sincronização e concepção. Este efeito pode ser obtido
através da aplicação de eCG (Baruselli et al., 2002; Perez et al., 2004) ou com a remoção temporária
dos bezerros (RB) (Meneghetti et al., 2001), porém a adição do eCG não teve efeito aditivo à
remoção de bezerros quando utilizadas em protocolo de IATF a base de estrógeno e dispositivo
intravaginal de P4 (Meneghetti et al., 2005b). O objetivo deste experimento foi comparar o
s13
efeito da aplicação de eCG ou RB ao final de protocolo de IATF à base de P4 e estradiol. Vacas

paridas da raça Nelore (n=559) com escore de condição corporal 3,40 + 0,31 e entre 40 e 90 dias
pós-parto, mantidas em regime de pasto com suplementação mineral, foram sincronizadas com
o mesmo protocolo base: no dia 0 os animais receberam um dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®,
1,9 g de P4, Pfizer) novo ou pré-utilizado por 9 ou 18 dias e cipionato de estradiol (1,0 mg, i.m.,
E.C.P. ®, Pfizer). O dispositivo permaneceu nos animais por nove dias e dois dias antes da retirada
(dia 7) foi aplicado PGF2á (12,5 mg de dinoprost trometamina, i.m., Lutalyse®, Pfizer), na retirada
do CIDR® (dia 9) foi feita nova aplicação de cipionato de estradiol (0,5 mg, i.m., E.C.P. ®, Pfizer).
A IATF foi realizada 48 a 54 horas após a retirada do dispositivo. Os animais foram divididos
aleatoriamente em quatro grupos, sendo: Controle; RB: remoção de bezerros entre a retirada do
CIDR® e a IATF; 300 eCG ou 400 eCG: receberam aplicação de 300 ou 400 UI de eCG (i.m.,
Folligon®, Intervet) no momento da retirada do CIDR®, respectivamente. No momento da IATF
e 48 horas após foi realizado exame de ultra-som (Aloka SSD-500, 5,0 MHz) para determinar a
taxa de ovulação. O diagnóstico de gestação foi feito por ultra-som 28 dias após a IATF. A
análise estatística foi feita por regressão logística. Não foi verificado diferença na taxa de
sincronização entre os grupos, sendo 82,3% (107/130) no grupo controle, 86,5% (135/156) no
grupo RB, 80,8% (105/130) no grupo 300 eCG e 83,9% (120/143) no grupo 400 eCG. Foi
verificado efeito de grupo (p=0,10) na taxa de concepção que foi 41,5% (54/130), 51,3% (80/
156), 46,9% (61/130) e 54,5% (78/143) para os grupos controle, RB, 300 eCG e 400 eCG,
respectivamente. Os grupos remoção e 400 eCG foram superiores ao grupo controle enquanto o
grupo 300 eCG foi semelhante aos demais. Estes dados sugerem que no protocolo testado, remoção
de bezerros ou aplicação de eCG devem ser utilizadas pois resultaram em maior taxa de concepção
em vacas paridas da raça Nelore.
BOVINOS DE LEITE
Vacas Mestiças
Efeito da inclusão de eCG em protocolos de IATF na concepção de vacas de leite mestiças
Diferentes tratamentos hormonais visando IATF têm sido utilizados em vacas mestiças
mantidas a pasto. Nas primíparas tem sido indicado o Ovsynch com CIDR e nas multíparas o
HeatSynch com CIDR (Garcia, 2003). O objetivo deste estudo foi determinar se a inclusão de
eCG aos protocolos propostos por Garcia (2003), poderia melhorar a concepção em vacas de
leite mestiças, mantidas em regime de pastejo rotacionado.
Foram utilizadas 121 vacas de leite mestiças, sendo estas primíparas (n = 41), multíparas
sem presença de CL no dia do inicio do protocolo (n = 26) e multíparas com presença de CL (n
= 54), com ECC entre 2,5 e 4,0, em escala de 1 a 5. Todas as primíparas mais as multíparas sem
presença de CL receberam o seguinte protocolo: GnRH (Fertagyl®, 100ìg) mais dispositivo
intravaginal de P4 (CIDR®), após seis dias foi feita a remoção do dispositivo junto com a aplicação
de PGF2á (Lutalyse, 25mg). Após quarenta e oito horas foi realizada nova aplicação de GnRH
(Fertagyl®, 100ìg ), e IATF realizada doze horas após a segunda aplicação de GnRH. As multíparas
ciclando foram submetidas ao protocolo: GnRH (Fertagyl®,100 ìg) e dispositivo intravaginal de
P4 (CIDR®) , seis dias depois remoção do CIDR® junto com a aplicação de PGF2á (Lutalyse®,
25mg). Vinte e quatro horas depois os animais foram tratados com ECP® (1 mg, cipionato de
estradiol, via IM) e 48 horas após aplicação de ECP® as vacas que não apresentaram cio foram
submetidas à IATF. As vacas que apresentaram cio foram inseminadas 12h após a detecção do
cio. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos experimentais: G1 (n = 62) 2,0
ml de solução salina ou G2 (n=59) 200 UI de eCG (Folligon®) no momento da retirada do
s14
CIDR®. A presença de CL no início do protocolo e o diagnóstico de gestação aos 30 dias após a

IATF foram determinados por ultra-sonografia. A variável taxa de concepção foi avaliada por
regressão logística, sendo incluído no modelo as variáveis eCG, categoria dias pós-parto (<100
dias, entre 100 e 150 dias e com > 150 dias), escore de condição corporal (≤ 2,75, entre 3, 0 a
3,25, ≥ 3,5), protocolo utilizado, touro e inseminador. Das variáveis analisadas apenas tratamento
com eCG e ECC influenciaram a concepção. Nas vacas que receberam eCG (200UI) a taxa de
concepção foi de 40,7% e nas que não receberam eCG foi de 27,4% (P<0,10). Vacas com ECC ≤
2,75 apresentaram concepção de 21,8%, enquanto nas de 3,0 a 3, 25, foi de 37,8% e nas com
ECC ≥ 3, 5, a concepção foi de 40,0% (P=0,102). Estes dados mostram que inclusão de eCG aos
protocolos de IATF pode aumentar a taxa de prenhez. Mais estudos são necessários para determinar
o mecanismo pelo qual a inclusão de eCG aumenta a concepção.
Efeitos da utilização de protocolo de sincronização da ovulação na reprodução de vacas
leiteiras de alta produção
A produção de leite por dia de intervalo entre partos é um importante parâmetro para
avaliar a eficiência de sistemas de produção de leite. O objetivo deste experimento foi avaliar se
o protocolo de sincronização de ovulação HeatSynch associado a dispositivo intravaginal de P4
antecipa a concepção em vacas de leite de alta produção.
Foram utilizadas 208 vacas Holandesas de alta produção (média 37,3 ± 7,0kg/dia) com
117,5 ± 27,9 dias pós-parto e ECC de 2,9 ± 0,3 de 5 fazendas da região de Castro, PR no período
de agosto a outubro de 2004. As vacas foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos: G1 -
não recebeu nenhum tratamento e G2 – foi tratado com o seguinte protocolo: CIDR® + GnRH
(Fertagyl®, 100mcg) - 7d – retira o CIDR® + PGF2α (Lutalyse®, 25mg) - 24h - ECP (ECP®, 1mg)
– 48h – IATF. Vacas que apresentaram cio foram inseminadas 12 horas depois. O período de
avaliação foi de 50 dias. A variável dias para a concepção foi analisada pelo GLM e taxa de
concepção por Regressão Logística. Foram incluídas no modelo as variáveis: fazenda, tratamento,
produção de leite, ECC, ordem, dias pós-parto no início do protocolo e interações. Vacas
submetidas ao protocolo de sincronização ficaram gestantes mais rapidamente (P<0,01),
independente da fazenda (3,2 ± 7,7 vs. 17,7 ± 12,4 dias). Vacas submetidas ao protocolo de
sincronização também apresentaram maior concepção (44,0 vs. 33,3%), porém houve interação
com fazenda (faz 01: 57,1 vs. 50,0; faz 02: 45,0 vs. 19,1; faz 03: 44,0 vs. 21,9; faz 04: 44,4 vs.
22,2; e faz 05: 37,5 vs. 50,0%), respectivamente. Estes dados mostram que os protocolos de
sincronização devem ser utilizados para emprenhar as vacas mais rapidamente, porém em algumas
fazendas pode ocorrer redução da concepção, apesar de na média ter ocorrido aumento da
concepção.
Conclusões
A técnica de IATF esta bem consolidada e existem protocolos que permitem aumentar a
porcentagem de vacas gestantes de IA no inicio da estação de monta ou após o período voluntário
de espera, sem a necessidade de observação de cio. Fatores como ECC, qualidade do sêmen e do
inseminador devem ser levados em consideração antes de se implementar um programa de IATF.
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1
Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC), 2 Universidad Católica de Córdoba,
3
Universdad Nacional de Córdoba, 4Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP,
Brazil, gabrielbo@iracbiogen.com.ar
Resumo
Apesar da tecnologia de transferência de embriões vir sendo usada comercialmente há muitos

anos, a ineficiência na detecção de cios, especialmente em gado derivado de Bos indicus, tem
limitado a sua ampla aplicação. Provavelmente a alternativa mais útil para aumentar de modo
significativo o número de animais envolvidos em programas de TE é a aplicação de protocolos
que permitem a TE sem a necessidade de detecção de cio, geralmente chamados de protocolos de
TE em tempo fixo (TETF). A maioria dos protocolos de TETF usados atualmente são baseados
em dispositivos liberadores de progestágenos/ progesterona combinados com estradiol ou GnRH,
que controlam a dinâmica das ondas foliculares e a ovulação. Têm sido relatadas taxas de
concepção paea TETF semelhantes ou maiores do que aquelas observadas após a detecção de
cios espontâneos, mas as taxas de gestação têm melhorado porque esses tratamentos têm
aumentado o número de receptoras que receberam embriões entre aquelas tratadas. Modificações
recentes incorporadas ao tratamento, como a administração de eCG e as mudanças no momento
em que a PGF é aplicada, também têm melhorado as taxas de gestação e oferecem novas idéias
para tornar a execução desses tratamentos mais fácil para os funcionários das fazendas. Finalmente,
outros fatores também devem ser levados em consideração em programas de TE de larga escala
para se alcançar as melhores taxas de gestação possíveis.
Palavras-chave: transferência de embriões em tempo fixo, receptoras, progesterona, estradiol,
eCG
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC),
Argentina e Estancia “El Mangrullo S.A.”. Nós também agradecemos a Syntex S.A., Argentina
pelos hormônios usados nos estudos. Agradecimentos especiais para nossos colegas do IRAC e
da Universidade de São Paulo pela assistência técnica. e-mail: gabrielbo@iracbiogen.com.ar
Introdução
O principal objetivo da implementação de tecnologias de transferência de embriões (ET)

em gado de corte é produzir progresso genético no rebanho. Entre os principais fatores que
afetam o uso amplo dessas tecnologias estão aqueles relacionados à nutrição, manejo e detecção
de cio ineficiente. Provavelmente a alternativa mais útil para aumentar de modo significativo o
número de animais envolvidos em programas de TE é a aplicação de protocolos que permitem a
TE sem a necessidade de detecção de cio, geralmente chamados de protocolos de TE em tempo
fixo (TETF).
s17
Sincronização de cio e ovulação em receptoras
Um dos tratamentos utilizados para a sincronização de receptoras constitui na administração

de Prostaglandina F2á (PGF) com intervalos de 11 a 14 dias (revisado por Bó et al., 2004a).
Quando todas as receptoras estão ciclando, em torno de 80% deveriam manifestar sinais de cio
até 5 dias após o tratamento. Entretanto, devida à baixa precisão da detecção de cios, em torno de
50% das receptoras tratadas tinham um CL e receberam um embrião 7 dias após o cio (Bó et al.,
2004a). Essa situação foi até pior quando as receptoras usadas forma Bos indicus ou cruzamentos
de Bos indicus sob condições de pastejo, nas quais a taxa de gestação total foi tão baixa quanto
13% e foi causada em grande parte devido ao baixo número de receptoras detectadas em cio
(863/1554; 55,5%) e/ou com CL no momento da transferência dos embriões (449/1554; 28,9%;
Bó et al., 2004a). Essa ineficiência tem grande impacto na viabilidade desses programas em
gado mantido a pasto.
Protocolos Ovsynch
Os protocolos Ovsynch também têm sido usados na sincronização de receptoras que

receberam embriões (revisado por Bó et al., 2002). Em dois estudos utilizando novilhas mestiças
Bos indicus x Bos taurus (Baruselli et al., 2000; Zanenga et al., 2000), a taxa de gestação total foi
maior em receptoras tratadas com o protocolo Ovsynch do que em receptoras tratadas com PGF,
porque mais receptoras receberam embriões com o protocolo Ovsynch. A inclusão de um
dispositivo liberador de progesterona no protocolo Ovsynch também resultou em taxas de gestação
aceitáveis em receptoras. Em um experimento de campo envolvendo 1637 receptoras tratadas
com o protocolo Ovsynch mais um implante SMB na orelha ou um dispositivo CIDR-B e
inovuladas sem detecção de cio, a taxa de gestação total foi de 59,9% (Beal & Hinshaw, 2001).
Dispositivos liberadores de progestágeno/ progesterona e estradiol
Estudos realizados para avaliar diferentes protocolos a base de progestágenos/ progesterona

(P4) têm demonstrado que tratamentos que foram suficientemente longos para permitir a regressão
normal do CL (i.e., ≥14 d), poderiam sincronizar o cio. Entretanto, esses tratamentos foram
associados ao desenvolvimento de folículos dominantes de grande tamanho (persistentes) e à
baixa fertilidade após a IA (revisto por Bó et al., 2004b). Baseados nos resultados de um estudo
anterior, acreditava-se que folículos persistentes não afetavam a qualidade do CL a as taxas de
gestação após a TE (Wehrman et al., 1997). Contudo, as taxas de gestação desse estudo foram
baixas (em torno de 30% em todos os tratamentos) e os resultados de um estudo recente
demonstraram que CLs grandes originados de folículos persistentes resultaram em taxas de
gestação mais baixas do que em receptoras controle ovulando normalmente (Mantovani et al.,
2004).
Tratamentos com estradiol e P4 foram muito utilizados nos últimos anos para TETF (Bó et
al., 2002; Bó et al., 2004b). Em geral, os tratamentos são muito parecidos com aqueles usados
para a IATF, exceto pelo fato de que a PGF é aplicada mais cedo. Dessa forma, as receptoras
recebem um dispositivo liberador de P4 e uma injeção IM de 2 mg de BE no dia 0; a PGF é
aplicada no dia 5 (1 dia após a emergência da onda folicular); os dispositivos de P4 são removidos
s18
no dia 8 e 1 mg de BE é aplicado IM no dia 9. O dia 10 é considerado o dia do cio, portanto, os

embriões são transferidos no dia 17 para todas as receptoras com CL. A antecipação da aplicação
de PGF foi devida aos resultados de dois experimentos nos quais a aplicação de PGF mais cedo
aumentou: o diâmetro do folículo dominante (13,2±0,2 mm vs. 11,5±0,2 mm; P<0,05), a
concentração de P4 no plasma no momento da TETF (6,9±0,8 ng/ml vs 5,2±0,6 ng/ml; P=0,08),
a proporção de receptoras selecionadas para a transferência (70,5% vs. 52,7%; P<0,02) e as
taxas totais de gestação (41,1% vs. 21,5%; P<0,004; Moreno, 2006).
Um trabalho subsequente foi idealizado para avaliar se a aplicação de 400 UI de eCG no

dia 5 do protocolo de TETF poderia melhorar as taxas de gestação. Este tratamento foi utilizado
principalmente com receptoras mestiças Bos taurus x Bos indicus (n=312). Apesar da aplicação
de eCG não ter resultado em mais receptoras selecionadas para transferência, ela resultou em um
aumento do diâmetro dos CLs (eCG: 18,5±0,4 mm vs Controle 17,7±0,4 mm; P<0,05) e nas
taxas de concepção (eCG: 76/132; 57,6% vs Controle 53/127; 41,7%; P<0,05). Além disso, a
concentração plasmática de P4 nas receptoras tratadas com eCG que tinham 2 ou 3 CLs (30,2±8,2
ng/mL; n=8) ou somente 1 CL no momento da transferência do embrião (7,5±0,7 ng/mL; n=18)
foi significativamente maior (P<0,01) todo que nas receptoras que não foram tratadas com eCG
(5,7±0,4 ng/mL; n=29; Moreno, 2006).
Apesar dos estudos anteriores terem demonstrado a eficiência desse protocolo, é necessário
que os animais sejam manejados pelo menos 4 vezes durante o tratamento. Por essa razão, estudos
recentes foram idealizados para simplificar o protocolo de tratamentos, reduzindo o número de
injeções ou o número de dias necessários. O primeiro objetivo foi comparar as taxas de gestação
em receptoras tratadas com dispositivos DIB (Syntex SA, Argentina) e 400 UI de eCG (Novormon,
Syntex SA) mais PGF aplicada no dia 5 ou dia 8 (Nasser et al., 2004). Apesar da proporção de
receptoras selecionadas para a transferência (P=0,15) e as taxas de concepção (P=0,23) não
terem diferido, a taxa de gestação total tendeu (P=0,1) a ser maior nas novilhas tratadas com
eCG no dia 5 (71/151, 47,0%) do que naquelas tratadas com eCG no dia 8 (61/150, 40,7%).
Esses resultados foram confirmados em um estudo subsequente no qual o tratamento com eCG
mais PGF no dia 5 resultou em taxas de gestação significativamente maiores do que o tratamento
com eCG mais PGF no dia 8 (eCG dia 5: 132/299; 44,1% vs eCG dia 8: 108/295; 36,6%; P<0,05;
Bó et al., 2004b).
Após o resultado desses experimentos, nós continuamos a explorar a idéia de simplificar

os procedimentos e o próximo trabalho teve como objetivo avaliar se o segundo BE poderia ser
aplicado no momento da remoção do DIB, ao invés de 24 horas depois. Vacas mestiças Zebu,
secas e ciclando (n=478) foram tratadas com um dispositivo DIB e 2 mg de BE IM no dia 0 e 400
UI de eCG IM mais PGF no dia 5. Os dispositivos DIB foram removidos no dia 8 e as vacas
foram divididas de modo aleatório para receber 1 mg de BE IM no momento da remoção do DIB
(BE dia 8) ou 24 horas depois (BE dia 9). As receptoras foram observadas para detecção de cio
do dia 8 ao 11. Todas as receptoras com >1 CL, ou um único CL com uma área >256mm2 (16 mm
de diâmetro), medida por ultrasonografia, receberam embriões a fresco ou descongelados por
TETF no dia 16 (BE dia 8) ou dia 17 (BE dia 9). As variáveis embrião fresco ou congelado,
técnico, estágio embrionário e área de CL não afetaram as taxas de gestação (P>0.1). Todavia, a
qualidade do embrião teve uma tendência (P=0.06) a influenciar as taxas de gestação (Grau 1:
152/253, 60,1%, Grau 2: 32/65, 49,2%, Grau 3: 11/33, 33,3%). O intervalo entre a remoção do
DIB e o cio foi mais curto (P<0.01) nas receptoras do grupo BE dia 8 (26,5±0,6h) do que nas do
grupo BE dia 9 (39,8±0,8h). Apesar disso, as taxas de gestação não foram diferentes (P>0.6)
s19
entre receptoras observadas em cio ou não (Tabela 1). A quantidade de receptoras selecionadas
para a transferência não foi diferente (P>0.5) entre os grupos. Por outro lado, as taxas totais de
gestação foram maiores (P<0.05) no grupo BE dia 8 do que no grupo BE dia 9, respectivamente
(Tabela 2). Concluiu-se que o uso do BE no momento da remoção do dispositivo poderia reduzir
o manejo das receptoras necessário ao tratamento.
Tabela 1. Taxas de gestação em relação a observação de cio em receptoras tratadas com

dispositivos DIB por 8 dias e BE no dia 0, 400 UI de eCG no dia 5 e com
ovulação induzida com BE no dia 8 ou no dia 9.
BE dia 8 BE dia 9
Em cio (%) 137/241 (56,8%) 117/237 (49,3%)
Gestantes/ observadas em cio (%) 83/137 (60,6%) 60/117 (51,3%)
Gestantes/ não observadas em cio (%) 27/43 (62,8%) 25/54 (46,3%)
Gestantes/ inovuladas (%) 110/180 (61,1%) a 85/171 (49,7%) b
As taxas de gestação diferem significativamente (ab P<0.05)
Em um experimento mais recente nós quisemos confirmar os resultados do trabalho anterior

com relação ao momento do tratamento com BE e também avaliar outras alternativas para
simplificar o protocolo de TETF, antecipando o momento da aplicação de PGF para o dia 0 ao
invés do dia 5 e retardando a aplicação de eCG do dia 5 para o dia 8 (remoção do dispositivo
liberador de progesterona). Isso foi baseado em estudos preliminares nos quais a administração
de PGF no dia 0 aumentou a taxa de crescimento do folículo dominante; por essa razão, as vacas
ovularam um folículo maior comparado com aquelas nas quais a PGF foi aplicada no momento
da remoção do dispositivo de progesterona (Bo et al., 2004c, Cutaia et al., 2004). Esse é um
experimento em andamento no qual nós coletamos dados de 3 repetições (n=712). Todas as
vacas foram tratadas com um dispositivo DIB e 2 mg de BE IM no dia 0 e foram divididas de
forma aleatória em 1 de 6 grupos de tratamento em um esquema fatorial 3 por 2. Os fatores
avaliados foram o momento da administração de PGF e eCG e o momento da administração do
segundo BE (dia 8 ou dia 9, como no experimento anterior). As vacas dos Grupos 1 e 4 receberam
150ìg D(+)cloprostenol (Ciclase, Syntex SA) mais 400 UI de eCG no dia 5. As vacas nos Grupos
2 e 5 receberam 75 ìg D(+)cloprostenol nos dias 0 e 8 mais eCG no dia 5. As vacas nos Grupos
3 e 6 também receberam 75 ìg D(+)cloprostenol nos dias 0 e 8, mas o eCG foi dado no dia 8. Os
dispositivos DIB foram removidos no dia 8 e as receptoras foram novamente subdivididas para
receber 1 mg de BE IM no momento da remoção do DIB (Grupos 1, 2 e 3) ou 24 h depois (dia 9;
Grupos 4, 5 e 6). As receptoras foram observadas para detecção de cio dos dias 8 ao 11. Todas as
receptoras com >1 CL, ou com um único CL com uma área >196mm2 (14 mm de diâmetro)
receberam embriões descongelados por transferência direta no dia 16 (Grupos 1, 2 e 3) ou dia 17
(Grupos 4, 5 e 6). Como no experimento anterior, o intervalo entre a remoção do DIB e o cio foi
mais curto (P<0,05) para as receptoras tratadas com BE no dia 8 (Grupos 1, 2 e 3; 28,1±0,6h) do
que para aquelas tratadas com BE 24 h depois (Grupos 4, 5 e 6; 43,5±0,8h). Novamente, as taxas
de gestação não foram diferentes (P=0.6) entre as receptoras que foram vistas (205/375, 54,7%)
e as que não foram vistas em cio (77/137, 56,2%). Mas ao contrário do experimento anterior, o
número de receptoras selecionadas e de receptoras gestantes foi maior (P<0,05) em vacas tratadas
com BE no dia 8 (Grupos 1, 2 e 3) do que naquelas tratadas com BE 24 h depois (Grupos 4, 5 e
s20
6; Figura 1). Além disso, o diâmetro do CL também foi maior em vacas tratadas com BE no dia
9 (296,1 mm2, n=300) do que naquelas tratadas com BE no dia 8 (265,5 mm2, n=270, P<0,05).
Figure 1. Taxas de gestação em receptoras tratadas com dispooditivos DIB, BE e eCG e que
tiveram ovulação induzida com BE no dia 8 ou no dia 9. Os embriões foram
transferidos no dia 16 (BE dia 8) ou dia 17 (BE dia 9). ab P<0,05.
A análise de outros fatores como o momento da aplicação de PGF e eCG revelaram até
agora resultados interessantes, nos quais as taxas de gestação totais não foram diferentes entre
vacas tratadas com PGF mais eCG no dia 5 (Controle, 93/244, 38%), PGF nos dias 0 e 8 mais
eCG no dia 5 (89/234, 38,0%) e aquelas que também receberam PGF nos dias 0 e 8, mas o eCG
foi aplicado no dia 8 (100/240; 41,67%).
Fatores que afetam a taxa de gestação com embriões descongelados em programas de

TETF
Nós fizemos recentemente uma análise de regressão logística para avaliar diferentes fatores
(que não o próprio tratamento) que afetam as taxas de gestação em um programa de TETF com
embriões inovulados por transferência direta. Todos os embriões transferidos (n=506) foram
congelados em etileno glicol 1,5 M pelo mesmo veterinário e foram descongelados em água a
30ºC por 30 segundos. As taxas de gestação foram determinadas por ultrasonografia 35 dias
após a TETF. As variáveis analisadas foram estágio embrionário, escore de condição corporal da
receptora, histórico reprodutivo da receptora (receptora vazia após uma TETF anterior ou utilizada
pela primeira vez, sem histórico reprodutivo), área do CL (A: d” 201,06 mm2, B: > 201,06 and
<254,5 mm2 and C: e”254,5 mm2), observação ou não do cio antes da TETF (dias 8 a 11 do
tratamento de sincronização), técnico que executou a TE, local de deposição do embrião (proximal
ao ovário, na curvatura ou na bifurcação do corno uterino) e avaliação subjetiva da técnica (boa,
média ou ruim). As variáveis escore corporal, observação ou não do cio, local de deposição do
embrião, avaliação da técnica e área de CL não afetaram as taxas de gestação. Entretanto, houveram
três variáveis significativas (P<0,05): técnico (A: 133/219, 60,7% vs. B: 148/287, 51,6%); histórico
reprodutivo (vazia numa TETF anterior: 24/66, 36,3% vs. sem histórico: 254/440, 57,7%) e
estágio embrionário (mórula: 93/142, 65,5% vs. blastocisto inicial 115/207, 55,5% vs. blastocisto:
71/157, 45,2%). O efeito do técnico nas taxas de gestação era esperado e confirmou dados
s21
anteriores do nosso e de outros laboratórios, mostrando que a habilidade do técnico é crucial

para se alcançar altas taxas de gestação (Bó et al., 2004a). Contudo, a diferença nas taxas de
concepção obtidas em receptoras que ficaram vazias numa TETF anterior e receptoras que não
tinham sido usadas anteriormente levanta questões interessantes quanto à seleção de receptoras.
Apesar de haverem na literatura relatos indicando menores taxas de gestação em receptoras
usadas anteriormente, a redução relatada é em torno de 10% (Looney et al., 2006). Provavelmente
a diferença entre os resultados relatados por outros autores e os nossos é que nós usamos vacas
e não novilhas, como na maioria dos outros trabalhos, e as vacas foram compradas como vacas
vazias de vários fornecedores diferentes; dessa forma, muitas delas podem ter sido vacas sub-
férteis de descarte. Quando as receptoras mais férteis ficaram gestantes após a primeira TETF, a
proporção de vacas sub-férteis pode ter aumentado entre as vacas vazias, o que afetou bastante
as taxas de gestação quando essas receptoras foram reutilizadas. Se esses resultados forem
confirmados por outros autores, as recomendações sobre a reutilização de receptoras (até três
vezes) podem mudar quando forem utilizadas vacas com fertilidade desconhecida ao invés de
vacas com fertilidade conhecida ou novilhas.
Em outro estudo, nós avaliamos o efeito do tempo (segundos) entre o descongelamento e

a deposição do embrião dentro do corno uterino sobre as taxas de gestação. Todos os embriões
(n=800) foram descongelados em água a 30ºC por 30 segundos e transferidos de forma direta. As
transferências foram classificadas em três grupos: Grupo 1: <180 segundos, Grupo 2: entre 181
to 360 segundos e Grupo 3: >361 segundos (entre 361 a 960 segundos). A gestação foi determinada
por ultrasonografia de 28 a 35 dias após a TETF. Nós não conseguimos encontrar diferenças
significativas entre os grupos (Grupo 1: 147/267, 55,0%; Grupo 2: 269/469, 57,0%, Grupo 3:
33/64 51,5%). Esses resultados podem ser interpretados como sugestivos de que não há efeito
significativo do tempo entre o descongelamento e a transferência do embrião (até 16 minutos) na
transferência direta.
Resumo e conclusões
Apesar da tecnologia de transferência de embriões vir sendo usada comercialmente há

muitos anos, a ineficiência na detecção de cios, especialmente em gado derivado de Bos indicus,
tem limitado a sua ampla aplicação e aumentou muito o custo das operações comerciais. A
incorporação de técnicas desenvolvidas para controlar a dinâmica das ondas foliculares e da
ovulação reduz o problema da detecção de cio e propicia a possibilidade de aplicação de programas
de TETF. Têm sido relatadas taxas de concepção para TETF semelhantes ou maiores do que
aquelas observadas após a detecção de cios espontâneos, mas as taxas de gestação têm melhorado,
porque esses tratamentos têm aumentado o número de receptoras que receberam um embrião
entre as tratadas. As modificações mais recentes incorporadas, como o tratamento com eCG e as
mudanças no momento em que a PGF é aplicada também têm aumentado as taxas de gestação e
oferecido idéias interessantes para tornar esses protocolos mais fáceis de ser executados pelos
funcionários das fazendas. Finalmente, outros fatores devem ser levados em consideração em
programas de transferência de embriões de larga escala para se alcançar as melhores taxas de
gestação possíveis.
s22
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ASPECTOS PRÁTICOS E PERSPECTIVAS FUTURAS DO MODELO P-36 DE

SUPEROVULAÇÃO EM DOADORAS DA RAÇA NELORE
Marcelo F.G. Nogueira1; Ciro M. Barros2
1
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências e Letras, UNESP, Av. Dom
Antonio, 2100, CEP 19806-900, Assis, SP, Brasil. marcelo@assis.unesp.br; 2Departamento de
Farmacologia, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP, Brasil
Resumo
Nesta breve retrospectiva, serão descritas as mudanças implementadas durante a transição de um

programa de múltipla ovulação e transferência de embrião (MOTE) baseado em observação de
cio – previamente a IA – para um modelo de MOTE baseado na administração de pLH, como
indutor da ovulação, associado à inseminação artificial em tempo fixo (IATF). De forma adicional,
serão discutidas algumas interações entre o protocolo P-36 e doadora, dose de pLH, fonte de
progesterona e momento da IATF. Finalmente, as perspectivas futuras para a utilização do
protocolo P-36 – na MOTE de doadoras da raça Nelore – serão inferidas baseadas no modelo da
experiência de um rebanho em particular.
Palavras-chave: Superovulação; Transferência de embrião; IA em tempo fixo; Bos indicus; LH;
espécie bovina
Introdução
A múltipla ovulação e transferência de embrião (MOTE) na espécie bovina, recebeu

melhorias e evoluiu em diversos aspectos nas últimas 3 décadas (revisto por Barros & Nogueira,
2001). Nos trabalhos publicados recentemente, um dos aspectos mais pesquisados é a capacidade
do protocolo de superestimulação suportar a inseminação artificial em tempo-fixo (IATF) de
uma maneira similar ao protocolo convencional de produção embrionária (isto é, protocolo
superestimulatório associado à observação de estro previamente à IA; Nogueira et al., 2002;
Barros & Nogueira, 2005; Baruselli et al., 2006; Bó et al., 2006).
Um ponto crítico, para a capacidade do protocolo superestimulatório em suportar a IATF,
é que as ovulações ocorram de forma sincronizada, ou seja, em um curto período de tempo (no
qual ocorreria a maioria das ovulações). Desse modo, diferentes indutores da ovulação (GnRH,
pLH ou hCG) poderiam apresentar variações em sua ação, devido à dose administrada e cinética
do fármaco (Barros & Nogueira, 2005; Baruselli et al., 2006).
De forma adicional e com o intuito de otimizar a fertilização, o momento programado para
a realização da IATF é um ponto crucial para a obtenção da máxima viabilidade de ambos os
gametas (D’Occhio et al., 1997; Nogueira et al., 2002).
A concentração do sêmen utilizado para a IATF, de uma doadora superovulada, deveria ser
cuidadosamente controlado, a fim de evitar doses sub-ótimas e o decréscimo da produção
embrionária. Este aspecto é notório devido às tendências para a diminuição da concentração de
espermatozóides na palheta de sêmen – reflexo do mercado, para a genética de touros Nelore em
evidência – e para a utilização de uma única dose de sêmen na IATF (Baruselli et al., 2006).
Além dos fatores citados acima (tipo e dose do indutor da ovulação, momento da IATF
pós-indução da ovulação e concentração do sêmen na IATF), dois outros fatores deveriam ser
essenciais para a otimização da produção embrionária em um programa de MOTE, isto é, a
s25
equipe de funcionários que trabalha diretamente com as doadoras e receptoras, e a doadora por si
só (Stroud & Hasler, 2006; Nogueira et al., 2002, respectivamente).
Nesta sucinta revisão, a experiência de uma propriedade em particular – realizando MOTE
em animais Nelore desde 1999 – poderia servir como modelo quando houver a necessidade de
mudanças e de ajustes dos fatores citados acima. Ao menos, poderia ser um modelo alternativo
para outras propriedades que estejam iniciando a MOTE. Neste sentido, o sucesso obtido nesta
propriedade-modelo poderia ser um guia adicional dentre as possibilidades de realizar a MOTE
em bovinos.
Mudança do Protocolo de Inseminação
Em uma determinada propriedade (Fazenda Nova América), foi iniciado um programa de

MOTE baseado na IA após observação (12 e 24 h após a primeira aceitação de monta). Neste
sentido, foi frustrante a baixa taxa de viabilidade observada (49,9%), embora uma aceitável
média (±EPM) de estruturas totais colhidas tenha sido obtida (11,1±1,36). Com isso, foi inferido
que deveríamos estar obtendo uma boa taxa de ovulação porém, uma comprometida fertilização
poderia ser a causa da baixa taxa de viabilidade.
Foi demonstrado que, para a raça Nelore, o comportamento estral é de curta duração e de
ocorrência preferencialmente noturna (Pinheiro et al., 1998). Particularmente, isso implica em
um esforço adicional – pela equipe de trabalho da propriedade – para a eficiente realização da
observação do cio e IA em doadoras Nelore.
Nesse caso, foi implementada a mudança do protocolo de IA baseado na observação do cio
para um outro baseado na IATF (protocolo P-36; Barros & Nogueira, 2001), com o intuito de
melhorar a taxa de viabilidade. Essa decisão foi tomada uma vez que a ovulação induzida por
pLH e a realização da IATF (12 e 24 h após a administração do pLH; protocolo P-36) não foi
prejudicial para a produção embrionária, quando comparada à IA baseada na observação do cio
(Nogueira et al., 2002).
Na mesma propriedade e utilizando o mesmo rebanho base, a mudança da colheita de
embriões baseada na IA convencional (n=40) para a IATF associada ao protocolo P-36 (n=136),
não alterou a média de estruturas totais colhidas (relacionada, principalmente, com a doadora em
si e com a dose administrada de FSH), porém houve uma melhora na média de embriões viáveis
(5,5±0,95a e 9,4±0,63b, respectivamente). Não foi possível confirmar se a causa da baixa taxa de
viabilidade era devido à observação do cio e à programação da IA, ambas de forma sub-ótima,
porém os resultados foram sugestivos. Além disso, a única mudança realizada foi a introdução
da IATF associada ao protocolo P-36 (pLH como indutor da ovulação), uma vez que as partidas
de sêmen utilizadas para a IA ou a IATF, os técnicos responsáveis pela inseminação e administração
de hormônios e o responsável pelas colheitas de embriões, foram os (as) mesmos (as).
Indução da Ovulação
A ovulação – das doadoras Nelore superestimuladas – foi induzida mediante a administração

(i.m.) de 25 mg (Nogueira et al., 2002), 12,5 mg (Nogueira & Barros, 2003) e, recentemente, 6,2
mg (dados não publicados) de pLH (Lutropin, Bioniche, Ontario, Canada). O momento da
administração do pLH foi realizado, rotineiramente, às 46 h após a primeira aplicação de PGF2α
(isto é, 12 h após a remoção da fonte de progesterona).
Aparentemente, a redução da dose de pLH (25 mg, 12,5 mg e 6,2 mg) não foi prejudicial
para a taxa de viabilidade (73,7%, 69,5% e 66,8%, respectivamente), bem como para a média de
embriões viáveis (9,8±1,09, 9,2±0,77 e 8,8±0,82, respectivamente). Atualmente, os autores estão
s26
trabalhando para confirmar os resultados que foram obtidos utilizando 6,2 mg de pLH, como
indutor da ovulação. Caso os resultados sejam ratificados, esta dose seria incorporada
definitivamente ao protocolo P-36 padrão, utilizado nas doadoras Nelore.
Fonte de Progesterona
Não foram observadas quaisquer diferenças, de produção embrionária, com relação à fonte
de progesterona utilizada no protocolo P-36 (CIDR ou DIB; Barros & Nogueira, 2005; Baruselli
et al., 2006). Padronizamos a utilização de um dispositivo novo (CIDR, DIB ou Cronipress) para
as doadoras e, subseqüentemente, de dispositivos reutilizados para a sincronização da ovulação
em receptoras.
Quantidade de Inseminações (IATF)
Embora o esquema mais utilizado, para inseminar doadoras superestimuladas, sejam duas
IATF às 12 e 24 h após a indução da ovulação (Nogueira et al., 2002; Bó et al., 2006), há uma
tendência para a redução do custo relacionado ao sêmen utilizado para a IATF. Neste sentido,
uma idéia proposta anteriormente - a utilização de uma única palheta de sêmen, para a IATF de
doadoras superestimuladas (D’Occhio et al., 1998) – está novamente em pauta (Baruselli et al.,
2006).
A redução da quantidade de duas palhetas de sêmen (IATF às 12 e 24 h pós-pLH) para uma
única palheta, não reduziu a taxa de viabilidade quando a IATF foi realizada às 16 h após o LH
(58,3% e 52,4%, respectivamente; Baruselli et al., 2006) ou às 24 h após o LH (66,2% e 57,7%,
respectivamente; dados não publicados).
Não causaria surpresa a ocorrência de diferenças, com a IATF utilizando uma única palheta
de sêmen, devido à variabilidade nas partidas de sêmen (qualidade e concentração de sêmen;
Dumont, 2002). Estas diferenças poderiam ser cruciais, na eficácia da utilização de uma única
palheta para a IATF de doadoras superestimuladas (que irão conter vários oócitos a serem
fertilizados), uma vez que a qualidade do sêmen, a qualidade do embrião e as taxas de fertilização
são positivamente correlacionadas (Hawk & Tanabe, 1986; DeJarnette et al., 1992).
Em nossa experiência, a taxa de viabilidade pode atingir >80% com a IATF de doadoras
superestimuladas (≥2 palhetas de sêmen), no entanto, um cuidadoso controle da concentração e
da qualidade espermática deveria ser realizado, previamente à IATF com uma única palheta.
Variação Individual Inerente à Doadora
Como relatado anteriormente (Gradela et al., 1996; Nogueira et al., 2002) a própria doadora
pode ser a maior fonte de variação em um programa de MOTE, a despeito do protocolo
superestimulatório, do indutor da ovulação, da dose de FSH e da IA (convencional ou em tempo-
fixo) realizada nas doadoras. Em nossa experiência, a manutenção no programa de MOTE das
melhores produtoras de embrião – e de suas filhas e netas – pode ter melhorado a quantidade de
embriões viáveis em até 40%, em uma base anual média e durante um período de 5 anos.
Equipe de Trabalho
Indubitavelmente, a equipe de trabalho (funcionários da propriedade) tem um impacto

direto na produção embrionária das doadoras. O modo como a equipe maneja os animais, cuida
do bem-estar deles, manipula as drogas e os hormônios utilizados no protocolo de
s27
superestimulação, insemina as doadoras superestimuladas e estabelece padrões de higiene, é um

aspecto único em cada rebanho - onde a MOTE é utilizada - que não deveria ser subestimado
(Stroud & Hasler, 2006).
Somente deveriam ser mantidas na equipe as pessoas; capazes de melhorar as próprias
habilidades e os detalhes pertinentes à cada etapa da MOTE, comprometidas com metas e
honestamente interessadas no sucesso do programa. Uma bonificação – quando uma determinada
meta for atingida – é uma outra boa prática de motivação da equipe.
Certamente, algumas discrepâncias observadas quanto à produção embrionária, entre
propriedades que utilizam o protocolo P-36 em seus programas de MOTE, deveriam ser
relacionadas ao mérito da tríade “equipe”, “doadora” e “sêmen”, uma vez que os hormônios e o
material descartável podem ser facilmente adquiridos – e de empresas idôneas – pelo veterinário
responsável pelo programa.
Considerações Finais
A utilização do protocolo P-36 – em nossa experiência com doadoras Nelore – aparentou

ser útil no caso da observação do cio (com o intuito de realizar a IA) estar sub-ótima. Após a
implementação do protocolo P-36, um período de mudanças e ajustes foi realizado para determinar
a melhor opção de protocolo para o rebanho (menor custo & maior eficácia). Nós acreditamos
que os resultados obtidos - com o programa de MOTE durante os últimos 5 anos – são decorrentes,
principalmente, da equipe de trabalho da fazenda, da seleção e da manutenção das doadoras no
programa e dos cuidados com a qualidade do sêmen, mais do que a utilização do protocolo P-36
em si.
Como perspectiva futura, pretendemos consolidar o protocolo P-36 para utilizar; a menor
dose de LH eficaz para a sincronização das ovulações (6,2 mg, i.m. ?) e uma única palheta de
sêmen na IATF (24 h após a aplicação do LH), com o intuito de facilitar o manejo e de reduzir
custos do programa de MOTE. No entanto, quando a escolha vier a ser uma única IATF, os
requerimentos mínimos pertinentes ao sêmen a ser utilizado (concentração e qualidade), deveriam
ser futuramente padronizados a fim de permitir a otimização da fertilização.
Agradecimentos
Os autores desejam agradecer à Fazenda Nova América (Renato E. de Rezende Barbosa),

em especial à equipe de funcionários (Edinho, Baguá, Bruce, Bigode e Paulo Rangel) pela
constante cooperação e zelo no programa de MOTE, bem como ao Paulo S. Fragnito (gerente)
pela sua valiosa compreensão durante as decisões, quando mudanças se fizeram necessárias.
Parte dos experimentos tiveram o suporte financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP), oriundo dos processos 98/16355-0 e 01/08743-5.
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PROTOCOLOS DE SUPEROVULAÇÃO COM INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM

TEMPO FIXO EM Bos indicus
Pietro S. Baruselli1; Claudiney M. Martins1; Manoel F. de Sá Filho1; Lindsay U. Gimenes1;

Alexandre H. de Souza1; Henderson Ayres1; José R. S. Torres-Júnior1; Gabriel A. Bó2
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP, Rua Professor Orlando Marques de
Paiva, 87, CEP 05508-000, São Paulo-SP, Brasil. (barusell@usp.br)
2
Instituto de Reproducción Animal Córdoba, J.L. de Cabrera 106, X5000GVD Córdoba e
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Católica de Córdoba, Argentina
Introdução
A transferência de embriões em bovinos (TE) é a técnica mais utilizada em todo o mundo

para multiplicar animais de alto valor genético (BÓ et al., 2004). Segundo o último relatório da
Sociedade Internacional de Transferência de embriões (THIBIER, 2003) houve aumento de 20%
no número de embriões bovinos produzidos por múltipla ovulação. Porém os programas
tradicionais de superovulação apresentam algumas limitações como: 1) manejo para detecção de
cio; 2) necessidade de iniciar o tratamento superestimulatório em momento específico do ciclo
estral; 3) necessidade de detecção do cio para inseminação das fêmeas superestimuladas; 4)
baixa consistência na produção de embriões viáveis por doadora; 5) cerca de 20 a 30% das
doadoras não produzem embrião.
O objetivo desta revisão é discutir os aspectos relevantes aos tratamentos de
superestimulação em fêmeas Bos indicus, especificamente da raça de Nelore: 1) fatores que
influenciam resposta de superestimulação, 2) controle da dinâmica folicular durante os tratamentos
de superestimulação, 3) IA em tempo fixo em doadoras superstimuladas; 4) determinação do
tempo apropriado para indução da ovulação visando a IA em tempo fixo e 5) uso de diferentes
doses de FSH e de eCG para superestimulação.
1) Fatores que afetam a resposta superovulatória em bovinos
A variabilidade na resposta das doadoras ao tratamento superestimulatório com

gonadotrofinas continua sendo um dos maiores problemas nos programas comerciais de TE
(BARROS & NOGUEIRA, 2004; NOGUEIRA et al., 2002, MAPLETOFT et al., 2002). Esta
variação individual ao tratamento superovulatório foi relatada tanto em vacas Nelore (Bos indicus;
BARUSELLI et al. 2003), quanto em vacas Holandesas de alta produção (Bos taurus; MARTINS
et al., 2005).
No protocolo tradicional de superovulação (SOV), o tratamento com gonadotrofinas é
iniciado na metade do ciclo estral (8-12 dias após ovulação). Esta metodologia apresenta algumas
dificuldades por requerer a detecção do “cio base” para o início do tratamento superestimulatório
(MAPLETOFT et al., 2002).
A ausência do folículo dominante no início do tratamento com gonadotrofinas, aumenta a
eficiência dos programas de SOV (MAPLETOFT et al., 2002; ADAMS et al., 1994). Nasser et
al. (1993) obtiveram maior número de folículos recrutados e maior taxa de ovulação quando o
tratamento superestimulatório foi realizado um dia antes ou no dia de início da emergência da
onda de crescimento folicular que os tratamentos realizados um ou dois dias após o início da
onda.
s31
Sendo assim, alternativas para o controle da emergência da onda de crescimento folicular

em momentos aleatórios do ciclo estral, sem a necessidade de detecção do estro para o
estabelecimento do “cio base” podem facilitar o manejo de doadoras Bos indicus, bem como
possivelmente aumentar a eficiência dos programas de transferência de embriões em rebanhos
zebuínos.
2) Controle da dinâmica folicular para a superovulação em bovinos
O tratamento eletivo para a indução da emergência da nova onda de crescimento folicular

é a associação de estradiol (E2) e progesterona (P4). A eficiência desta associação tem sido
descrita em diversos trabalhos em fêmeas Bos taurus (Bó et al. 1993; Bó et al., 1994, Bó et al.,
1995; Bó et al., 1991; Martinez et al., 2000; Colazo et al., 2003 e 2005). Nosso grupo de pesquisa
tem estudado o efeito do tratamento com estradiol e progesterona na emergência da onda folicular
em novilhas Bos indicus, Bos taurus x Bos indicus e Bos taurus mantidas nas mesmas condições
de manejo (CARVALHO, 2004). Não foi observada diferença no intervalo entre o tratamento
com benzoato de estradiol e a emergência folicular entre Bos indicus, Bos taurus indicus e Bos
taurus. Entretanto, novilhas Bos indicus apresentaram maior número de folículos recrutados no
início da onda de crescimento folicular que novilhas Bos taurus, sugerindo maior resposta
superestimulatória ao tratamento com gonadotrofinas em fêmeas Bos indicus.
Todos ésteres de estradiol são capazes de induzir a regressão de folículos antrais quando
administrados na presença de elevadas concentrações de progesterona (BO et al., 1995). O valerato
de estradiol (VE) e o cipionato de estradiol (CE) apresentam meia vida longa, resultando na
indução de uma nova onda folicular mais tardia e menos sincronizada (BO et al., 1995; COLAZO
et at., 2003; 2005) que o 17β estradiol (BO et al., 1995) ou o Benzoato de estradiol (BE) (BO et
al., 2002).
Estudos conduzidos pelo nosso grupo de pesquisa avaliaram a necessidade do uso da
progesterona injetável no início do tratamento com dispositivo intravaginal de progesterona (P4;
DIB) em vacas Nelore (Bos indicus). Martins et al., (2005) observaram maior sincronização na
emergência e atraso no dia de início da onda de crescimento folicular quando se utilizou a
associação progesterona injetável mais BE (4,2±0,1a.y) que em animais que receberam somente
BE no início do tratamento com dispositivos intravaginais novos (3,1±0,2b.x) ou reutilizados
(2,8±0,2b.x; usados uma vez). Este estudo concorda com o descrito para Bos taurus (MORENO
et al., 2001). Em outro estudo Sá Filho et al., (2005a) testaram o efeito de diferentes doses (2 ou
3 mg) e/ou momentos (Dia 0 ou Dia 1) da aplicação de BE ou a associação de BE mais progesterona
injetável no início do tratamento com dispositivo intravaginal de P4 (Dia 0) em vacas Nelore. O
tratamento com BE+P4, no Dia 0, apresentou melhor sincronização da emergência da onda de
crescimento folicular (4,0±0,0ab,y) que os tratamentos com apenas BE (2mg no D0= 3,6±0,2b,x;
2mg no D1= 4,3±0,2a,x; 3mg no D0= 4,0±0,2ab,x e 3mg no D1 4,2±0,3a,x). Portanto, pode-se
concluir que o tratamento com benzoato de estradiol associado a progesterona injetável no início
do tratamento promove menor dispersão do momento do início da emergência da nova onda
folicular.
No entanto, apesar de alguns trabalhos indicarem aumento na resposta superovulatória
quando o tratamento coincide com a emergência da onda de crescimento folicular (Nasser et al.
1993), recentes trabalhos realizados pelo nosso grupo de pesquisa não verificaram efeito do
tratamento com BE+P4 (i.m.) administrados no momento da inserção do dispositivo de P4 (Martins
et al., 2005). Nesse estudo avaliou-se o efeito da associação ou não de 50mg progesterona injetável
(Synthex, Argentina) a 2mg de BE em programas de superovulação com inseminação artificial
em tempo fixo em vacas Nelore. O objetivo deste estudo foi aumentar a resposta superovulatória
s32
pela melhor taxa de sincronização da nova onda de crescimento folicular utilizando a progesterona
injetável associada ao BE. Não foram observadas diferenças na resposta superovulatória, bem
como no número de estruturas ou qualidade dos embriões viáveis nos animais que receberam ou
não progesterona injetável no início do protocolo de superovulação. Os dados são indicativos de
que a sincronização da emergência da onda folicular com BE associado ao dispositivo de P4 é
adequada para promover satisfatória resposta superovulatória em doadoras Bos indicus.
3) Inseminação artificial em tempo fixo em programas de superovulação
A manifestação do estro em Bos indicus apresenta grande variabilidade devido

principalmente a peculiaridades como: curto período de aceitação de monta e alta incidência de
cios noturnos (BO et al., 2003), o que aumenta a possibilidade de erros na detecção e dificulta a
programação prévia da data da colheita dos embriões. Sendo assim, diversos estudos têm procurado
avaliar a possibilidade do controle farmacológico da ovulação, com o objetivo de viabilizar a
inseminação artificial em tempo fixo de fêmeas Bos indicus superestimuladas (NOGUEIRA et
al., 2002; ZANENGA et al., 2003; BARUSELLI et al., 2003 e MARTINS et al., 2005).
Nosso grupo de pesquisa delineou um experimento para avaliar a retirada antecipada do
dispositivo de P4 em vacas Nelore superovuladas e inseminadas em tempo fixo (IATF). Para
isso, foram utilizadas dez vacas Nelore mantidas a pasto em Campo Grande, Mato Grosso do
Sul, divididas ao acaso em dois tratamentos. As doadoras foram superovuladas utilizando
delineamento “cross-over”, com intervalo entre colheitas de 35 dias. No primeiro grupo (P24) o
CIDR foi retirado 24 horas após a aplicação da PGF2α, administrada juntamente com a sexta
dose de FSH. Administrou-se 25 mg de LHp (Lutropin, Vetrepharm, Canada) 48 horas após a
PGF2α. O segundo grupo (P36) recebeu protocolo semelhante ao do primeiro, exceto a retirada
do CIDR, que foi realizada 36 horas após a administração de PGF2α. Todas as doadoras foram
inseminadas 12 e 24 horas após o LH. Sete dias após o tratamento com LH foram realizadas a
colheita e a classificação dos embriões (ZANENGA et al., 2003).
Os resultados são sugestivos de que a retirada do dispositivo de progesterona 24 ou 36
horas após a administração de PGF2α, seguido da indução da ovulação com LH (48h após a
PGF2α) com a IATF 12 e 24 horas após o LH é um protocolo viável para programas de
superovulação e transferência de embriões em Bos indicus, eliminando a necessidade de detecção
de estro e possibilitando a programação precisa das atividades de sincronização, de colheita e
transferência dos embriões.
4) Determinação do tempo apropriado para indução da ovulação visando a IA em

tempo fixo.
Atualmente, nosso grupo de pesquisa tem investigado a adequação do momento mais

apropriado para induzir as ovulações para inseminação artificial em tempo fixo em vacas Nelore
(Bos indicus) e em vacas Holandesas (Bos taurus) superovuladas (Martins, 2005). Dentre as
particularidades fisiológicas que diferenciam vacas Bos indicus de Bos taurus podemos citar o
diâmetro folicular na divergência e o diâmetro no qual o folículo atinge capacidade ovulatória.
Verificou-se que fêmeas Bos indicus atingem a divergência folicular com diâmetro inferior que
fêmeas Bos taurus (6,3mm; GIMENES et al., 2005 para Bos indicus e 8,5mm; GINTHER et al.,
1996 para Bos taurus).
Em um recente estudo, avaliou-se o efeito do atraso de 12 horas na indução das ovulações
em doadoras Nelore (12 ou 24h após a última injeção de FSH; Baruselli et al., 2005; Martins et
al., 2006). O objetivo deste estudo foi melhorar as taxas de ovulação pelo aumento do diâmetro
s33
folicular e da capacidade ovulatória no momento da administração de LHp . Um total de 20

doadoras Nelore (Bos indicus) foram superestimuladas utilizando modelo experimental “cross-
over”. Todas as fêmeas receberam um dispositivo intravaginal de P4 (DIB, Syntex, Argentina) e
2,5 mg de BE associado a 50mg de P4 injetável no início do tratamento (Dia 0). No Dia 4, os
animais receberam o tratamento superestimulatório com 100mg de FSH (Folltropin-V subdividido
em 8 doses decrescentes a cada 12 horas). Na manhã do Dia 6, os animais receberam PGF2α e na
tarde do Dia 7 os dispositivos intravaginais foram removidos (P-24). As fêmeas foram subdivididas
para receber 25mg de LHp 12 ou 24h após a última aplicação de Foltropin-V (Dia 8 manhã e
tarde), sendo posteriormente submetidas a inseminação artificial em tempo fixo 12 e 24 h após o
LH, utilizando a mesma partida de sêmen. O momento das ovulações foi determinado por ultra-
sonografia transretal realizada duas vezes ao dia. No Dia 15, foi realizada a colheita dos embriões,
sendo estes classificados de acordo com os critérios da IETS. O atraso da aplicação de LH de 12
para 24h após a última administração de Foltropin-V aumentou (p<0,01) o número de embriões
degenerados e diminuiu (p<0,005) o número de embriões transferíveis e congeláveis. A diminuição
da qualidade embrionária promovida pelo atraso da indução das ovulações pode ser explicada
pelo aumento (p<0,05) do intervalo entre a primeira e a última ovulação e pela tendência (p=0,08)
de aumento da dispersão das ovulações quando do atraso da administração de LH. Estes dados
são sugestivos de que a administração de LHp 12 horas após o último Foltropin-V seja apropriada
para induzir a ovulação em vacas Nelore (Bos indicus) submetidas ao protocolo de superovulação
com inseminação artificial em tempo fixo.
Os resultados obtidos em doadoras Nelore diferem aos observados em vacas Holandesas
de alta produção, no qual o tratamento com LHp 24h após o último Foltropin-V resulta em
aumento na resposta superovulatória e maior número de embriões transferíveis (RODRIGUES
et al., 2005; MARTINS et al., 2005, BARUSELLI et al., 2005). Rodrigues et al., (2005) observaram
redução no número de folículos não ovulatórios (>10mm) no momento da colheita dos embriões
e aumento numérico no número de embriões transferíveis quando o GnRH foi administrado 24h
após a última aplicação de FSH, comparado com a administração de GnRH 12h após o último
tratamento como FSH. Martins et al., (2005b) utilizando o modelo experimental “cross-over” e
a mesma partida de sêmen, também observou aumento no número de embriões transferíveis
quando o LHp foi administrado 24h após o último FSH, comparado com o LHp administrado
12h após o último FSH. Baseado nestes resultados, é possível concluir que o intervalo de 24h
após o último FSH (60h após o tratamento como PGF2α) é adequado para administração de LHp
como indutor de ovulação em vacas de leite de alta produção superovuladas, possibilitando a
inseminação artificial em tempo fixo, diferentemente do intervalo de 12h observado para fêmeas
Bos indicus.
Em outro trabalho recente do nosso grupo de pesquisa foi verificado que é possível obter a
mesma eficiência quando se utiliza LH ou GnRH como indutor de ovulação no protocolo de
superovulação com IATF em Bos indicus (Nelore; Martins et al., 2005). Nesse estudo, obteve-se
5,5±0,3 e 5,2±0,3 (P > 0,05) embriões transferíveis para doadoras tratadas com LH e GnRH,
respectivamente.
Conforme os resultados anteriores obtidos em vacas Nelore, nosso grupo de pesquisa
realizou um experimento para testar a hipótese de que é possível utilizar uma única inseminação
artificial em tempo fixo em fêmeas Bos indicus, sem comprometer a taxa de fertilização e a
qualidade dos embriões. Um total de 10 vacas Nelore (Bos indicus) foi subdividido em dois
grupos experimentais utilizando modelo fatorial “cross-over”. O tratamento superovulatório foi
semelhante ao do estudo anterior, no entanto, o dispositivo intravaginal de P4 (DIB) foi removido
na tarde do Dia 7 (protocolo P-36). Todas as fêmeas receberam 25mg de LHp 12h após a última
aplicação de Folltropin-V (Dia 8 pela manhã; 12h após a remoção do DIB ou 48h após a
s34
administração da PGF2α) e foram inseminadas em tempo fixo utilizando a mesma partida de

sêmen 12 e 24h após a administração do LHp (Grupo 2 IATF) ou somente uma inseminação 16h
após o LHp (Grupo 1 IATF). Não foram observadas diferenças na resposta superovulatória, no
número de estruturas ou qualidade dos embriões colhidos nos animais que receberam uma ou
duas inseminações. Os resultados são sugestivos de que é possível realizar somente uma única
inseminação artificial em tempo fixo 16h após a administração de LHp em vacas Nelore (Bos
indicus) superovuladas, sem comprometer os resultados.
5) Uso de diferentes doses de FSH e de eCG para superestimulação
Dentre as diferenças fisiológicas e comportamentais entre Bos indicus e Bos taurus destaca-
se a reduzida capacidade para secreção de LH e maior sensibilidade de vacas Bos indicus a
gonadotrofinas exógenas (Randel, 1984).
Em um experimento (Baruselli et al., 2003) objetivou-se avaliar a resposta superovulatória
de vacas Nelore a diferentes doses de FSH (Folltropin-V, Bioniche, Canada). Utilizou-se 23
doadoras tratadas com 3 diferentes doses (100, 133, ou 200mg) durante o protocolo de
superovulação com inseminação artificial em tempo fixo (P24). Empregou-se o delineamento
experimental “cross-over” para se evitar o efeito individual na resposta aos tratamentos. A produção
de embriões transferíveis foi semelhante para os grupos 100, 133 e 200 mg, indicando que não
existem diferenças na resposta superovulatória, no número de embriões transferíveis e congeláveis
após o emprego de reduzidas doses de FSH em doadoras Nelore superovuladas. Um experimento
semelhante foi realizado com o objetivo de avaliar diferentes doses de FSH ovino (FSH; Ovagen®,
ICPbio, New Zeland; Martins et al., 2006). A adotou-se o delineamento experimental cross-over
e as doadoras foram divididas em três grupos: 4,5 mg; 6,0 mg e 9,0 mg de FSH. De acordo com
os resultados, a dose de 4,5 mg de FSH ovino proporcionou menor resposta superovulatória e
produção de embriões transferíveis. Apesar dos tratamentos com 6 mg e 9 mg não apresentarem
diferenças estatisticamente significativas quanto à produção embrionária, verificou-se menor
resposta superovulatória no grupo tratado com 6 mg. Não foi confirmada a hipótese inicial de
redução da dose de FSH durante o tratamento superovulatório em doadoras Nelore quando se
empregou o Ovagen®.
Em outro experimento, foi testada a hipótese de que é possível obter resultados satisfatórios
quando do emprego de eCG para superovulação, associado ao protocolo de sincronização da
onda de crescimento folicular e da ovulação em doadoras Nelore (Martins et al., 2006). Um total
de 12 vacas da raça Nelore (Bos indicus) foi dividido em três grupos de acordo com o tratamento
superestimulatório: eCG-2500UI; eCG-2000UI e FSH-100mg (cross-over). Os animais receberam
um dispositivo intravaginal de P4 (1 g P4; DIB®, Syntex, Argentina) associado a 2 mg de Benzoato
de estradiol (BE; RIC BE®, Syntex, Argentina) no Dia 0. Nos tratamentos com eCG, a
superestimulação foi realizada com a administração de 2500 ou 2000 UI de Novormon®, (Syntex,
Argentina) em dose única no Dia 4. No tratamento com FSH, administrou-se 100mg de Folltropin-
V® (Bioniche, Canadá) em 8 doses decrescentes de 12/12 horas, a partir do Dia 4. No Dia 6,
administrou-se 150 µg de PGF2α (D-cloprostenol; PROLISE® Syntex, Argentina). Os dispositivos
de P4 foram retirados 36 horas após a administração de PGF2α, e o LH (25mg de LH, Lutropin-
V®, Bioniche, Canadá) aplicado 48 horas após a PGF2α Foi realizada uma única inseminação 16
horas após o tratamento com LH utilizando mesma partida de um único touro para cada vaca/
réplica. A colheita dos embriões foi realizada no Dia 15. Não foram observadas interações, sendo
os efeitos dos tratamentos eCG-2500UI; eCG-2000UI e FSH-100mg, respectivamente:, taxa de
ovulação (33,1%)b; (58,4%)a e (65.9%)a, estruturas totais (5.9±1.0; 7.6±1.0 e 5.7±1.4), embrião
Grau 1 (3.4±0.7; 5.8±0.9 e 3.5±0.7) e embriões transferíveis (4.4±0.7; 6.9±1.0 e 4.6±0.9). O
s35
tratamento com 2000UI de eCG produziu número semelhante de embriões transferíveis comparado
ao grupo tratado com FSH, mostrando ser uma alternativa viável para programas de TE com
inseminação artificial em tempo fixo em zebuínos, com vantagens significativas quanto ao custo
do tratamento e ao manejo das doadoras.
Conclusão
Os resultados são indicativos de que é possível sincronizar a emergência da onda folicular

e iniciar o tratamento superestimulatório em doadoras Bos indicus sem a necessidade de se
conhecer a fase do ciclo estral. Além disso, o tratamento com LHp 12h após a última administração
de FSH sincroniza as ovulações, possibilitando o emprego da inseminação artificial em tempo
fixo em fêmeas Bos indicus superestimuladas, sem a necessidade de detecção do cio. Ainda, é
possível realizar somente uma única IATF (16h após o tratamento com LHp), sem comprometer
os resultados. Finalmente, embora exista a necessidade de mais estudos sobre a administração
da eCG para superestimulação ovariana, seu uso possibilita racionalização de manejo sem
comprometer as taxas de produção de embriões em protocolos de superovulação com inseminação
artificial em tempo fixo em doadoras Nelore (Bos indicus).
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FATORES CRÍTICOS EM PROGRAMAS DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES

EM EQUINOS NO BRASIL E ARGENTINA
Losinno,L.1; Alvarenga, M.A.2
1
Facultad de Agronomía y Veterinaria. Universidad Nacional de Rio Cuarto, Rio Cuarto,
Argentina; 2Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – FMVZ/
UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil. llosinno@ ayv.unrc.edu.ar
malvarenga@fmvz.unesp.br
É notório o crescimento nos últimos anos do interesse pelo uso da Transferência de Embriões
(TE) pela indústria do cavalo. Hoje quase a totalidade das associações de criadores de cavalo
reconhecem os benefícios da técnica, permitindo o uso da TE.
Na Argentina o maior interesse pela TE esta relacionado a cavalos de Pólo, sabidamente a
Argentina possui as melhores matrizes e reprodutores de pólo, sendo um grande exportador de
cavalos desta raça. Interessante para a aplicação da TE é a observação de que éguas são melhores
jogadoras de Pólo do que cavalos, além do fato destas competirem até idades avançadas.
Atualmente operam na Argentina mais que 24 Centros os quais realizam anualmente um número
estimado 3.500 prenhezes pela TE. Destes oitenta por cento são embriões de cavalos de Polo
onde 90% dos programas são desenvolvidos com o uso do sêmen fresco, estando os Garanhões
alojados também na Central.
No Brasil o sistema difere do Argentino pela variedade de raças que utilizam a técnica, as
que mais utilizam atualmente são as raças, Mangalarga Marchador, Campolina, Quarto de Milha
e Mangalarga Paulista.. Sendo estimada uma média de 6.000 prenhezes por ano de TE. Existindo
no Brasil cerca de 30 Centros de TE em eqüinos sendo parte deles prestador de Serviços para
terceiros e outra parte para uso exclusivo em animais de um único proprietário. Nas raças Quarto
de Milha e de Hipismo as TEs são realizadas em Centrais em outras raças como Mangalarga as
TEs são realizadas em sua maioria em estruturas montadas no próprio Haras do criador.
Argentina e Brasil iniciaram a utilização da TE comercial em eqüinos em 1986 e juntos
respondem por cerca de 50% dos embriões transferidos no mundo atualmente. A recente liberação
do número de embriões pela raça Quarto de Milha certamente provocará um aumento significativo
destes números no Brasil.
Este artigo tem por objetivo unir a experiência Brasileira e Argentina, apontando os principais
fatores que interferem na eficiência dos programas de TE.
1. Fatores que interferem na eficiência reprodutiva de programas de TE em Eqüinos
Dificuldade em superovular doadoras
A indução de múltiplas ovulações em éguas tem como principal objetivo aumentar a chances
de recuperação embrionária em um ciclo e, conseqüentemente, melhorar a eficiência e diminuir
os custos envolvidos em programas de Transferência de Embriões (TE). Hoje em função da
dificuldade em superovular éguas a eficiência de programas de TE nesta espécie é muito baixa,
sendo necessário 2 a 3 ciclos para se obter uma gestação, conseqüentemente os custos para a
produção de um potro proveniente de TE são bastante elevados. È altamente desejável a adequação
s39
de um protocolo superovulatório que permita pelo menos garantir uma prenhez por ciclo de
cada égua doadora.
Uma grande dificuldade em se superovular éguas está relacionada a refratariedade da égua
aos preparados hormonais á base de FSH Suíno disponíveis comercialmente. Sendo necessário o
uso de FSH homólogo para que tenhamos resposta ovariana ao tratamento. Desta forma o Extrato
de Pituitária Eqüina (EPE) e mais recentemente o FSH eqüino purificado são os preparados
indicados para induzir-se superovulação na fêmea eqüina.
A resposta de éguas cíclicas ao eFSH e ao EPE parece depender da população ovariana de
folículos no início do tratamento, sendo que o momento ideal para se iniciar um programa
superovulatório é no início da onda folicular, antes do aparecimento de um folículo dominante.
Um outro fator que afeta a resposta superovulatória é a freqüência de aplicação.Os protocolos
superovulatórios tem se mostrado eficientes em induzir múltiplas ovulações, contudo a
recuperação embrionária tem se mostrado baixa, com uma média de 30 a 40% embriões /ovulação.
Procurando entender os motivos da baixa recuperação de embriões Carmo et al. (2005)
avaliaram ovidutos quanto à presença e qualidade de ovócitos obtidos em éguas superovuladas
com EPE, 25mg, duas vezes ao dia, a partir do dia 7 pós- ovulação e um grupo controle.
Constataram superioridade no número de ovulações das éguas superovuladas (4,41±2,90) quando
comparado ao grupo controle (1,16 ±0.40), e obtiveram uma taxa de recuperação de ovócito/
ovulação próximo de 60% no grupo superovulado contra 90% de recuperação no grupo controle.
Demonstrando que durante a ovulação ocorre algum distúrbio na captação dos ovócitos para o
oviduto em éguas superovuladas. Interessante foi a observação de que no Grupo de éguas
superovuladas, que responderam com um número menor de 3 ovulações a taxa de recuperação
de ovócito no oviduto foi similar á obtida no grupo controle.
Em função destes achados estamos estudando em experimentos mais recentes a eficiência
de baixas doses de EPE bem como FSH eqüino purificado, em induzirem duplas e triplas
ovulações. Desta forma poderemos ter um protocolo de baixo custo que possa ser utilizado em
todos ciclos do ano, por ser menos agressivo e induza a um menor número de ovulações com
conseqüente melhoria na recuperação de embriões. Seguindo esta filosofia, Farinasso (2004)
comparou três doses de EPE: 2, 4 e 6 mg. As doses de 4 e 6 mg elevaram a taxa de ovulação em
relação ao grupo controle e promoveram significativo aumento de ovulações duplas e triplas em
76,9% dos ciclos tratados. Para o tratamento com 6 mg foi obtida média de 1,84 ± 0,58 ovulações/
ciclo e de 1,31 ± 0,75 embriões/ciclo. Desta forma o protocolo permitiu garantir um embrião/
lavado. Vale ressaltar que neste experimento as éguas foram selecionadas tendo como base a
população de folículos no início do tratamento. Em nossa experiência em não havendo seleção
prévia das éguas, baseada na população de folículos, o protocolo apresenta uma eficiência próxima
de 60%.
2. Fatores que interferem com a recuperação embrionária
Éguas Doadoras
As éguas doadoras são o coração de qualquer programa de TE. Um dos problemas diz
respeito ao elevado percentual de éguas idosas em programas de TE, pois sabidamente éguas
idosas têm uma eficiência reprodutiva mais baixa do que éguas jovens. As falhas reprodutivas
observadas em éguas idosas estão normalmente associadas com distúrbios da ovulação e maturação
oocitária e /ou endometrite crônica.
s40
Carnevale et al., (1993), descreveram uma taxa de fertilização significativamente maior

em éguas jovens versus velhas no dia 1,5 pós-ovulação (88% versus 45% respectivamente).
Estes dados se correlacionam com as menores taxas de recuperação embrionária em éguas doadoras
jovens versus velhas. Contudo os embriões produzidos são normais e adequados para sem
transferidos. Alonso et al 2005, observaram que embriões provenientes de éguas idosas (>18
anos) tem a mesma chance que os de éguas mais jovens de permanecerem viáveis após
transferência, onde o índice de prenhez ao 15 e 50 dias foi similar entre os grupos.
Carnevale e Ginther, 1995 utilizando modelos in vivo, demonstraram pela primeira vez na
égua a relação entre idade cronológica e danos a ovócitos e embriões em estágios iniciais de
desenvolvimento. Desta forma é importante ressaltar que na maioria das vezes o fator implicado
na baixa recuperação embrionária de éguas idosas é a qualidade do ovócito.
Tabela 1. Efeito da idade da égua doadora nas taxas de recuperação embrionária *

Idade Taxa de recuperação Taxa de prenhez Eficiência
4-7 (n=30) 81,5 64,3 52,4
8-14 (n=113) 101,6 65,4 66,4
15-19 (n=59) 70,4 59,1 41,6
? 20 (n=10) 46,2 54,2 25,0
* Adaptado de Hunt at al.2005
Tabela 2. Efeito da idade da égua doadora nas taxas de recuperação embrionária*

Idade Taxa de Recuperação
<3 (n=7) 85,0
3-18 (n=34) 64,4
>18 (n=15) 24,1
* Adaptado de Fleury at al.1989
Tabela 3. Recuperação de embriões por ciclo em éguas férteis e sub-férteis *

éguas férteis éguas sub-férteis TOTAL
(%) (%)
TOTAL 75,0 26,9 47,8
* Adaptado de Alonso at al.2006
O que podemos fazer para aumentar a recuperação embrionária de éguas velhas e/ou
subférteis?
• Aumentar o número de lavados por estação

• Aumentar o número de ovulações por ciclo
• Encurtar a fase follicular e melhorar maturação follicular e/ou oocitária ( GnRH, EPE)
• Inseminar com Baixa dose na extremidade do ùtero
• Estabelecer tratamentos periovulatórios com Antibiótico sistêmicos
• Verificar possibilidade de endometrite fungica
• Lavagens uterinas pré e pós coberturas
• Realizar lavados mais tardiamente (Dias 8,5-9,5-10)
• Uso de progesterona pós ovulação
• Equilibrar a dieta
s41
• Minimizar o stress social

• Proteger contra o stress calórico ambiental (sombreamento)
Garanhão
É o primeiro dos fatores chave. Nenhum programa pode sustentar-se comercialmente se

não houver um completo e objetivo diagnóstico andrológico e uma estimativa da capacidade
reprodutiva dos reprodutores.
No Brasil por suas características geográficas e a tendência de pertencerem os garanhões a
diferentes proprietários (condomínios) o uso do sêmen refrigerado e transportado é crescente e
necessário.
O uso indevido da técnica de transporte de sêmen é em nossa opinião um dos mais
importantes fatores que interferem na eficiência de programas de TE no Brasil. Muitas das vezes
falhas relacionadas a manipulação do sêmen levam queda nos índices de fertilidade que não são
percebidas pelo técnico. Dados publicados no Brasil demonstram haver uma grande variação
nos índices de recuperação embrionária entre diferentes garanhões. Quando comparados de 5
Garanhões na Central de Reprodução Fleury as taxas de Recuperação Embrionária variaram
ente 25% e 85 % .
Tabela 4. Diferenças entre Garanhões na Taxa de recuperação embrionária estação de monta

95/96-Central Fleury-Brasil*
Garanhão Taxa de Recuperação
1 (n=35) 28%
2 (n=40) 65%
3 (n=54) 62 %
4 (n=15) 66%
5 (n=19) 84%
* Adaptado de Fleury et al,2001
Podemos apontar como sendo os seguintes os principais erros cometidos com o uso de
sêmen refrigerado no Brasil:
• Não respeito ás regras básicas para processamento (Dose, Relação Diluente: Sêmen)
• Utilização de sistemas de transporte inadequados (Temperatura inadequada, não
segurança contra stress calórico ambiental)
• Não respeito a limitações do próprio garanhão (Qualidade do Sêmen, Resistência so
transporte, Regime de coletas)
• Momento e freqüência das IA inadequados
Diferentes experimentos foram realizados ao longo do últimos 10 anos e muito pouco se

evoluiu quanto a possibilidade de preservar a fertilidade das células espermáticas de eqüinos por
um período de tempo superior a 24 hs de refrigeração. Certamente alguns reprodutores, apresentam
sua fertilidade preservada por até 48 hs de armazenamento, pois similar ao sêmen congelado
existem garanhões mais e menos resistentes ao processo de refrigeração. È importante enfatizar
que as inseminações devem ser realizadas em um período de tempo máximo de 24 hs antes das
ovulações.
Trabalhos demonstram que para garanhões com baixa resistência a refrigeração a
centrifugação do sêmen, visando a retirada do plasma seminal é sempre benéfica, contudo para
cavalos que refrigeram bem a centrifugação não traz nenhum benefício.
s42
È importante também enfatizar que para a obtenção de bons índices de fertilidade o sêmen
depois de processado deve ser acondicionado em recipientes especialmente desenvolvidos para
este fim. Recipientes estes que obedeçam as curvas de refrigeração já determinadas como
adequadas. A temperatura de refrigeração ideal é a de 5 graus Celsius, contudo para determinados
garanhões temperaturas próximas de 15 graus Celsius melhor preservam a motilidade espermática
e fertilidade.
Perante o exposto indicamos como estratégias para melhorar a eficiência da IA com sêmen
resfriado para garanhões sensíveis ao processo de refrigeração:
• Determinar melhor regime de coleta semanal para cada garanhão

• Determinar o melhor diluente
• Determinar a temperatura ideal de transporte (5 x 15 Célcius)
• Determinar o tempo máximo para transporte
• Utilizar sistemas de transportes que mantenham temperaturas estáveis mesmo com
aumento da temperatura ambiente
• Inseminar o mais próximo possível das ovulações.
• Remoção do plasma seminal através da centrifugação.
Na Argentina o fator transporte de sêmen tem menor importância pois a maioria (85%) dos
programas utiliza a inseminação artificial com sêmen fresco, com os reprodutores residindo
(temporariamente) nos centros. Isto permite um maior controle de cada ejaculado e reflete nas
altas médias de recuperação embrionária (superiores a 70-75%). O uso de sêmen refrigerado
corresponde a 10% dos programas (90% cavalos de salto) e os problemas mais freqüentes são a
logística dos envios e a diferença de formação entre o veterinário que envia e o que recebe, que
se traduzem em diferenças no tratamento do sêmen.
Os programas que utilizam sêmen congelado são uma minoria (5%), e em geral
correspondem a cavalos de salto e árabes. Estes programas representam, em geral, maior trabalho,
maior expectativa por parte dos clientes, são operacionalmente mais caros e se obtém menores
resultados. Estes resultados são dependentes da qualidade e quantidade de sêmen descongelado,
número de doses disponíveis, técnica de inseminação utilizada, categoria da égua doadora e
habilidade do técnico.
Em alguns casos particulares se utilizam reprodutores que estão em trabalho (polo, salto,
árabes, etc.) e isto muitas vezes dificulta a disponibilidade de tempo para a obtenção de sêmen,
o que leva, a coletar quando haja disponibilidade e refrigerar o sêmen por 24-48h para que a
inseminação seja realizada no momento mais adequado.
3. Fatores que interferem na taxa de prenhez após a transferência
Receptoras
Representam o gargalo de quase todos os programas e trata-se de um dos itens mais caros
do planejamento econômico. É cada vez mais, um bem escasso pelo aumento exponencial da
demanda, o que aumenta cada vez mais seu preço. Considerada, durante anos como uma égua de
“segunda”, com atenção e condições de espaço sanidade e alimentação limitada e sub-ótimas,
especialmente em relação às doadoras, hoje ocupa uma posição importante dentro das decisões
de um plantel comercial de TE.
Na Argentina, atualmente, quase todos os centros têm a política de que a receptora é
propriedade do centro e que se aluga temporariamente, até o desmame do potro, o proprietário
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do embrião deve devolvê-la no tempo e nas condições adequadas, acertadas previamente. De

qualquer forma trata-se de uma receptora que não será utilizada na estação em que pariu, e sim
na temporada seguinte, portanto o stock de cada centro deve contemplar um número total de
receptoras para duas estações reprodutivas completas. Este aspecto tende a ser minimizado na
atualidade com o uso do desmame precoce (4-5 meses), aonde ao menos uma quantidade
importante das receptoras podem ser utilizadas na estação seguinte. Qual é a melhor receptora?
Ou Qual é a receptora ideal? Freqüentemente enfrentamos estas perguntas. Existem pontos básicos
e irredutíveis no processo de seleção de uma receptora.
Tipo e tamanho: Em princípio, o mais parecido com a doadora. Nunca de menor

tamanho e tão pouco, éguas de raças pesadas para cavalos leves e medianos. Muitas vezes
utilizamos éguas da mesma raça e de menor valor genético, o que pode ser uma boa opção,
visto que em geral são do mesmo criador, ou seja, já adaptadas, os funcionários já a conheçam
etc. Desde os primeiros experimentos realizando cruzamentos entre Pôneis e Cavalos de
tração até os que compararam o peso ao nascimento com a área dos microcotiledones
placentários, em cruzamentos deste tipo, tem determinado que o tamanho e categoria
(primípara), são os fatores que mais influenciam no peso ao nascimento dos produtos
(Allen et al,2004).
Idade: A principio, a faixa de idade varia entre 4 e 14 anos, sendo o ideal entre 5 e 9
anos. No nosso caso, utilizamos uma tabela de projeção teórica máxima para recomendar
as idades de compra, considerando que na melhor das hipóteses, uma receptora emprenhe
no meio da temporada. Utilizando a faixa mencionada, desde 4 a 14 anos: 6 prenhezes; 5 e
6 anos: 5 prenhezes; 7 a 8 anos: 4 prenhezes; 9 e 10 anos: 3 prenhezes; 11 e 12 anos: 2
prenhezes; 13 e 14 anos: 1 prenhez. Assim, quando maior a idade da receptora, menos
estações poderá estar em nosso sistema, tratando-se de uma égua fértil, e menos produtiva,
e assim menos amortizável. Nota: a determinação da idade deveria ser feita por alguém
treinado e experiente.
Categoria: Há alguns anos atrás se preconizava que as potrancas (2-4 anos) virgens
como as de “maior fertilidade” e assim eleitas como primeira opção. Nos últimos anos,
coincidindo com observações empíricas de criadores e veterinários, foram realizados
interessantes experimentos (Allen et al, 2004) demonstrando que as placentas de potrancas
virgens e seus potros tinham menor peso quando comparados aos controles de éguas
multíparas e de maior idade. Associado a esta evidência as potrancas apresentam ciclo
estrais erráticos mais freqüentemente que as adultas, e muitas vezes indocilidade para o
manejo intensivo de exames retais, sendo assim, em geral, nos centros comerciais se evita
o uso de potrancas virgens como receptoras na primeira instância.
Sanidade reprodutiva: Durante os primeiros anos de abundancia, os requerimentos

para a compra, em geral, somente avaliavam a idade, tamanho, estado corporal e um exame
retal para avaliação da capacidade reprodutiva. Analisando os dados de campo, a taxa de
perda de gestação de éguas receptoras prenhes por TE variou entre 8-20%, durante as
temporadas anteriores. Realizamos um estudo de classificação endometrial de receptoras
de embriões relacionando-as com a idade, em éguas entre 2-10 anos de idade foram
detectadas 27% como categoria IIb e 5% com categoria III, de acordo com a classificação
histopatológica de Kenney , o que indica que na população estudada 32% das éguas com ≤
10 anos estavam seriamente comprometidas para levar uma gestação a termo e haviam
s44
sido classificadas clinicamente como aptas e compradas como receptoras (Alonso, 2005).
A minúcia do exame reprodutivo depende mais das circunstâncias particulares da compra
deste (preço, disponibilidade para amostras, autorização do proprietário, habilidade do
médico veterinário, etc), do que indicação médica. Quanto maior for a profundidade do
exame, menor erro e conseqüentemente maior preço, mas, de acordo com os nosso dados,
está absolutamente justificado considerando a alta proporção de éguas que são aceitas e
não aptas reprodutivamente. Resumindo, o ideal seria que uma égua candidata a ser
incorporada como receptora, tivesse o exame de biopsia endometrial somado ao exame
ultrassonográfico, e integridade dos genitais externos e um exame de competência cervical.
No Brasil os Veterinários usam quase que exclusivamente a Ultra-sonografia para compra
ou descarte de receptoras, é importante salientar que nem sempre uma égua sem fluido
uterino não tem um processo inflamatório instalado no útero. Em função disto aconselhamos
que pelo menos o exame citológico seja incluído na seleção de receptoras.
Tabela 5. Classificação de biópsia endometrial e idade de receptoras de embriões eqüino.

Idade(anos) Categoria (%)
I IIa IIb III
< 14 anos (n=59) 33,9 33,9 27,1 5,1
≥ 14 anos (n=16) 6,5 18,5 50 25
Adaptado de Losinno et al,2005
As tabelas seguintes demonstram os dados de MEP de um centro comercial da TE na

Argentina nas estações reprodutivas de 2004/2005 e 2005/2006 classificadas pela idade das
doadoras (> 15 anos: velhas; < 15 anos jovens) (Losinno, 2006-dados não publicados, vide
tabelas abaixo).
Na estação reprodutiva 2005/2006, todas (100%) as receptoras passaram por uma prova de
aptidão reprodutiva, incluindo biopsia endometrial, além de trocas no manejo geral das receptoras
após a transferência, o que determinou uma substancial diminuição nos índices de MEP que de
maneira “standard” ou aceitável oscilou ao redor de 10%.
Estação 2004/2005 Éguas MEP
Èguas Velhas 93 9%
Èguas Jovens 183 10%
Total 276 10%
Estação 2005/2006 Éguas MEP

Èguas Velhas 86 5%
Èguas Jovens 309 4%
Total 395 4%
• Docilidade: É outra característica básica, visto que um programa de TE não é um programa

de doma e não pode funcionar simultaneamente. Uma receptora deve na melhor das hipóteses
passar ao menos por 10 controles ultrassonograficos, gestar e criar um potro, pois uma
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égua indócil não só comprometera o manejo, colocando em perigo a integridade das pessoas
(e a ela), se não complicando o manejo do potro.
• Habilidade materna: Esta é uma característica de difícil realização quando se compra

uma receptora que está vazia e não se conhece o histórico reprodutivo, certamente deveria
ser um fator de descarte inicial e avaliada independentemente da fertilidade da receptora.
• Sanidade: É aconselhável que aos controles sorológicos obrigatórios (de Anemia

Infecciosa Eqüina, se incluam Babesiose e Leptospirose. Adenite Eqüina (garrotilho) é a
enfermidade infecciosa mais associada aos erros de manejo de receptoras. Quase não há
programas que eu não tenha visto casos de Adenite com maior ou menor freqüência, ainda
que utilizando imunização controlada, recomendo o uso de isolamento em qualquer
programa de TE que inclua receptoras e a quarentena para as éguas que ingressam no
programa. O principal problema de uma epidemia desta enfermidade em um centro é afetar
não só as receptoras como também as doadoras e reprodutores e se não há um programa
epidemiológico básico de controle frente ao problema, a probabilidade é alta e os problemas
maiores (Morte embrionária etc).
• Tolerância no sistema: Quantas ultrassonografias negativas pós transferência na mesma

receptora podemos tolerar na mesma temporada? Se assumirmos um sistema consistente e
padronizado e que possamos descartar fatores de manejo e integridade do embrião, a
principio nossa posição é não mais do que duas transferências negativas.
• Número ideal de receptoras (Quantas? Como calcular?): É difícil fazer uma

estimativa, visto que o número é muito dependente de cada programa, seus objetivos,
disponibilidade de espaço, alimento, dinheiro, etc., mas como regra base para programas
padronizados , mais do que a relação doadora x receptora, prefiro considerar um número
de 50% a mais do que o total de prenhezes desejadas. A este número devem ser descontados
os descartes por biopsia (10-20%) e mortes (1-2,5%).
• Receptoras com potro ao pé: É mais difícil o manejo de éguas com potro ao pé, exceto
em programas com pouca quantidade de éguas. Ainda mais, se tratando de receptoras que
ficaram prenhes na temporada anterior e as crias são produtos de TE. Devemos pensar em
seu valor econômico e no perigo de levar os potros aos currais todos os dias, entrar em
mangueiras, éguas nervosas, etc. Outro fator importante a ser considerado é a alimentação
destas éguas, tendo em conta que os requerimentos para éguas lactantes até o terceiro mês
são muito altos. De qualquer forma, as éguas pós-parto são um excelente recurso, passando
pelo exame de avaliação reprodutiva, podem ser utilizadas com êxito apartir do segundo
ciclo pós-parto.
• Alimentação: No geral, consideramos que as receptoras, independente do estado em que

se encontram se alimentem ad libitum a pasto, que é na Argentina um consorciado de
gramíneas e leguminosas. É necessário que as éguas estejam em um bom estado corporal,
não estando em balanço energético negativo. As receptoras prenhes passam a uma categoria
prioritária, ao menos durante o primeiro terço de gestação, dado que este é o período critico
na relação materno-embrionária, muito subestimado nas recomendações de livros de
nutrição. A soja como forragem é um excelente recurso, mas, de acordo com o reportado
para outras espécies (não para eqüinos) e até que não haja evidência objetiva, não deveria
s46
ser utilizada antes do dia 100-200 de gestação. As sementes contem fitoestrógenos

(isoflavonas), que poderiam atuar se unindo aos receptores de estrógenos, podendo inibir a
função progestágena do CL pela inibição da estimulação do LH e aumentando a síntese de
PGF2alfa pelo endométrio. No Brasil, onde diferente da situação Argentina, nem sempre
temos disponíveis pastos de boa qualidade e muito menos consorciados com leguminosas,
a suplementação com ração é sempre necessária, e na maioria das vezes aquém do ideal. È
importante ter-se em mente que uma receptora não alimentada adequadamente vai ter maior
dificuldade em ciclar bem como vai gerar um produto de pior qualidade, com o agravante
de também ter sua lactação futura comprometida.
• Sincronia doadora/receptora: È aconselhável o uso de receptoras que estejam entre o

quarto (D4) e oitavo (D8) dia após ovulação.Contudo resultados de trabalho recente
demonstraram que as receptoras quando tratadas com progesterona exógena podem ser
utilizadas em um momento mais preoce do ciclo. Neste trabalho os autores (Caiado et al
,2005) verificaram que o tratamento diário com progesterona iniciado no dia da ovulação
da receptora permitiu o uso destas já no segundo dia do ciclo (D2 pós ovulação). Obtendo
uma taxa de prenhez próximas de 70% quando da TE dois dias após ovulação da receptora
para receptoras tratadas com Progesterona contra 30% das éguas não tratadas. Fleury et al
(SBTE, 2006) observaram ser possível a utilização de receptoras no D3,ou seja 3 dias após
ovulação desde que estas apresentem bom tônus uterino na avaliação ginecológica
O uso da Progesterona em éguas receptoras de embriões em anestro ou transicionais no
início e final da estação de monta tem se tornado freqüente no Brasil. Este protocolo é
importante, pois sabidamente as éguas doadoras começam a ciclar mais precocemente do
que as receptoras no início da estação de monta bem como deixam de ciclar mais tardiamente
no final da estação. Nos últimos anos, o ingresso no mercado de novos veículos
biodegradáveis de liberação lenta controlada, associados a progesterona, que mantêm os
níveis plasmáticos por 6 a 8 dias, com uma única aplicação injetável, permite um melhor
manejo deste recurso.
Rocha Filho et al (2004) e Testa et al (2005) avaliaram no Brasil em dois programas de
Transferência de embriões os índices de prenhez e a perda embrionária precoce em éguas
receptoras não ciclantes (anestro ou transicionais) tratadas uma vez por semana com
progesterona de longa ação (P4 LA), em programas de transferência de embriões. Não
observando diferenças significativas entre o grupo não ciclante e ciclante demonstrando
que este tratamento é seguro na manutenção de gestação, permitindo a obtenção de altos
índices de taxa de prenhez após transferência de embriões. Neste protocolo as éguas em
anestro são tratadas inicialmente por 3 dias consecutivos com estrógeno sendo iniciado o
tratamento com Progesterona de longa duração um dia após a última aplicação de Estrógeno.
O tratamento com progesterona é continuado semanalmente até os 120 dias de gestação da
receptora. Deve-se estabelecer o dia da Progesterona no programa (exemplo quarta feira),
para que o Veterinário supervisione os tratamentos, a falha em uma aplicação certamente
levará a perda da gestação.
• Manejo diferencial das receptoras que receberam embriões: As receptoras transferidas

devem passar a uma categoria especial dentro do sistema, na medida que o programa e as
instalações permitam, deveriam permanecer tranqüilas sem mudanças até a data do primeiro
controle pós transferência, com a melhor alimentação disponível, sombra, visto que
geralmente coincide com o verão, período de temperaturas máximas fator que pode interferir
na manutenção da gestação inicial. Nós tentamos realizar controles em datas fixas (por
s47
exemplo, na segunda-feira), para evitar movimentos desnecessários de grupos de éguas

para o controle de uma minoria. O primeiro controle ultrassonográfico (US 1) acontece
aos 15 dias PO para umas e 20 dias para outras e o segundo controle (US 2) aproximadamente
aos 30 dias PO. È importante realizar mudanças entre grupos de receptoras sempre em
número de pelo menos 3 animais já socialmente adaptados.
4. Outros fatores e considerações finais:
Não podemos deixar de citar que além dos fatores anteriormente citados, o fator Profissional
é e grande relevância. Existem grandes variações nos programas de acordo com o profissional
envolvido, variações estas que não estão relacionadas somente aos aspectos técnicos da habilidade
na coleta, manipulação e transferência de embriões como também por cuidados com: a
esterilização adequada dos equipamentos, o ambiente de trabalho, acondicionamento de meios,
uso de equipamentos adequados para manipular embriões, respeito as regras para refrigeração de
embriões entre outros.
Devemos ter em mente que em muitas situações o risco maior quando se trata do fator
contaminação não vai interferir nos resultados de prenhez pós TE, pois os embriões mesmo que
sejam contaminados durante a coleta, se lavados adequadamente anteriormente a transferência,
estarão livres de contaminação. Contudo a doadora corre alto risco de contaminação, com
conseqüente comprometimento futuro da fertilidade que comprometerá a sua capacidade de
produzir embriões.
Devemos procurar trabalhar dentro de condições que nos permitam obter o resultado final
esperado que é o de se produzir potros através da técnica de TE. Certamente muitos dos fatores
que interferem negativamente dependem do apoio do(s) proprietário (s), cabendo ao Médico
Veterinário conscientizá-los dos riscos do mal uso da técnica.
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s49
s50
Menchaca A. & Rubianes E. 2006. Dois novos protocolos para controlar a atividade ovariana em caprinos: protocolo de curta
duração para inseminação artificial emScientiae
Acta tempo fixo Veterinariae
e protocolo para transferência de1):
34(Suplemento embriões
2006 iniciado no dia 0. Acta Scientiae
DOIS NOVOS PROTOCOLOS PARA CONTROLAR A ATIVIDADE OVARIANA EM

CAPRINOS: PROTOCOLO DE CURTA DURAÇÃO PARA INSEMINAÇÃO
ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO E PROTOCOLO PARA TRANSFERÊNCIA DE
EMBRIÕES INICIADO NO DIA 0
Menchaca,A.1; Rubianes, E.2
1
Laboratorio de FisRep-PEDECIBA, Dpto de Fisiología, Facultad de Veterinaria, UdelaR;
2
Dpto de Producción Animal y Pasturas, Facultad de Agronomía, UdelaR, Uruguay.
alejomen@adinet.com.uy
Resumo
Esta revisão resume a informação sobre o uso de dois novos protocolos para o controle da atividade
ovariana em caprinos, desenvolvidos por nosso grupo. Para a sincronização do estro, os chamados
protocolos de tempo curto, usando um dispositivo intravaginal impregnado com progesterona,
mantido por 5-7 dias e associado ao uso de Prostaglandina F2á e Gonadotrofina Coriônica Eqüina
permite uma alta taxa de prenhez (i.e. > 60%) com uma única inseminação em tempo fixo às 54
horas após a retirada do dispositivo. Para a superovulação, o chamado protocolo do dia 0, iniciando
o tratamento com FSH no dia da emergência da primeira onda folicular (i.e. na ausência do
folículo dominante), permite uma resposta ovulatória maior e uma maior produção de embriões
que os tratamentos tradicionais. Ambas as estratégias tem aumentado a eficiência dos programas
de inseminação artificial e transferência de embriões em caprinos.
Palavras-chave: Caprinos, Folículo, FSH, progesterona, sincronização, superovulação.
Introdução
O conhecimento sobre a fisiologia ovariana em caprinos tem passado por um avanço

significativo nos últimos anos, principalmente após as informações geradas pela técnica de ultra-
sonografia transretal. Avanços similares foram relatados previamente em bovinos, levando ao
desenvolvimento de novos tratamentos para o controle da atividade ovariana nesta espécie.
Contudo, os novos conceitos sobre a fisiologia ovariana não vem sendo incorporados aos
protocolos tradicionais de sincronização do estro e superestimulação em caprinos. Neste estudo
nós revisamos a informação publicada sobre estes novos avanços no controle da atividade ovariana,
desenvolvidos no Uruguai: Protocolo de curta duração para sincronização do estro e Protocolo
do dia 0 para superovulação.
Dinâmica folicular em caprinos
O crescimento folicular em caprinos ocorre em um padrão de ondas (Ginther & Kot 1994;
de Castro et al. 1998; Gonzalez de Bulnes et al. 1999). Uma onda folicular é definida como a
emergência de um grupo de pequenos folículos antrais, com normalmente um ou dois folículos
atingindo um diâmetro de 5 ou mais milímetros. De acordo com diferentes autores, o numero de
ondas foliculares por ciclo varia entre duas e cinco ondas. O padrão mais frequentemente
encontrado em caprinos é o de quatro ondas foliculares durante um ciclo inter-ovulatório normal
(19-22 dias) (Ginther & Kot 1994; de Castro et al. 1999; Schwarz & Wierzchos 2000; Menchaca
& Rubianes 2002). O intervalo entre ondas é o período entre a emergência do maior folículo de
duas ondas consecutivas, com duração de quatro a sete dias. O dia da emergência de cada onda
s51
folicular é variável e depende do número de ondas em cada ciclo. A predição do dia da emergência
de cada onda folicular é, portanto, muito difícil, com exceção da primeira onda do ciclo estral.
Os estudos concordam que a emergência da primeira onda de crescimento folicular ocorre em
torno do dia da ovulação (dia 0), do ciclo anterior. As características das ondas foliculares foram
recentemente revistas (Rubianes & Menchaca 2003) e outros aspectos são descritos na revisão
sobre controle da atividade ovariana em ovinos, publicados neste encontro (ver Rubianes &
Menchaca). Na Figura 1 são apresentados os padrões de ondas foliculares encontrados em cabras
cíclicas e gestantes.
9 # 28 9 # 21
8 8
7 7
6 6
5 5
4 4
3 3
diameter (mm)
2 2
-1 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 -1 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19
9 # 26
8
7
6
5
4
3
2
-1 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
Day from ovulation
Figura 1. Representação das ondas foliculares em caprinos. Durante o ciclo inter-ovulatório,

os animais # 28 e # 21 desenvolveram 3 e 4 ondas foliculares, respectivamente. A
cabra gestante número # 26 teve 6 ondas foliculares durante o início da gestação
(primeiros 30 dias). Somente folículos que cresceram acima de 3 mm foram
considerados (adaptado de Rubianes & Menchaca, 2003).
Protocolo de curta duração para sincronização do estro
De acordo com estas novas informações sobre dinâmica folicular em caprinos, nosso grupo
vem desenvolvendo tratamentos curtos com base na utilização de agentes progestágenos por 5-
7 dias em pequenos ruminantes, o chamado Protocolo “Curto”. O uso de protocolo de curta
duração, associado à aplicação de 200-300 UI da eCG no momento da retirada do dispositivo,
tem sido rotineiramente utilizados em fazendas de caprinos leiteiros localizadas no Uruguai,
durante os últimos 5 anos. Na estação de acasalamento, para garantir o controle luteal, este
tratamento é associado à aplicação de uma dose de PGF-2á no dia da inserção do dispositivo. No
entanto, durante a estação de anestro, faz-se necessário associar o tratamento curto com eCG. A
taxa de prenhez em protocolos que utilizam 200 ou 400 UI de eCG, administradas no momento
s52
da retirada do dispositivo intravaginal não difere (200 IU= 58%; 400 IU eCG= 64%), mas foi
superior à taxa de prenhez de protocolos progestágeno sem eCG (22%; A. Menchaca & A. Guarino,
dados não publicados). Outros estudos comparando o uso de protocolo de curta duração por
quatro, cinco, seis, sete ou oito dias, sugerem uma maior taxa de prenhez quando o implante de
progesterona foi mantido durante cinco dias (Tabela 1). O uso deste protocolo promoveu a
manifestação do estro em mais de 90 % dos animais e um intervalo médio do final do tratamento
ao inicio do estro foi em torno de 30 horas. A taxa de prenhez para a monta natural foi de 80 %
e, quando se utilizou a inseminação artificial com sêmen fresco, 12 horas após o início do estro,
foi maior que 70 %. Outros detalhes sobre a resposta a este tratamento foram revisados por
Rubianes & Menchaca (2003). Quando o momento de uma única inseminação em tempo fixo foi
avaliado, o tempo ótimo observado foi 54 horas após a retirada do implante, com uma taxa de
prenhez média maior que 60 % (Tabela 2).
A resposta ovariana ao tratamento com progesterona por 5 dias tem sido avaliado em
caprinos (Rubianes et al. 1998; Menchaca & Rubianes 2001, 2002). Recentemente, foi conduzido
um estudo ultra-sonográfico em cabras leiteiras cíclicas para avaliar, especificamente, o efeito
do tratamento curto sobre a dinâmica folicular (Menchaca 2006). O tratamento iniciou, não
considerando o dia do ciclo, utilizando-se um dispositivo com progesterona (CIDR-G) durante
cinco dias. Uma dose de PGF-2á foi aplicada no início do tratamento. Em 84 % dos animais
tratados, o protocolo de curta duração resultou no crescimento de um folículo jovem (~ 5 dias)
ao final do tratamento. A manifestação do estro ocorreu cerca de 30 horas após a retirada do
CIDR e a aplicação de 250 UI de eCG, o pico de LH e a ovulação do folículo dominante ocorreram
40 e 60 horas após o mesmo, respectivamente. A representação esquemática da resposta ao
tratamento encontra-se Figura 2.
Tabela 1. Taxa de Prenhez obtida utilizando diferentes períodos de tratamento com
progestágenos, em protocolos de curta duração. Uma única inseminação
artificial via transcervical foi realizada 54 horas após o término do tratamento.
(dados fornecidos por Red Capra, Faculty of Veterinary, Uruguay; Menchaca &
Rubianes 2004).
Duração do tratamento com progestágeno
4 dias 5 dias 6 dias 7 dias 8 dias
31/89 a
140/216 c
23/38 bc
74/122 bc 30/59ab
Prenhez/total de cabras (%)
(34,8) (64,8) (60,5) (60,7) (50,8)
Para diferentes superescritos P< 0,05.
Tabela 2. Taxa de prenhez obtida com a inseminação artificial em tempo fixo (IATF)
realizada 48 ou 54 horas apos o término do protocolo de curta duração, associado
com 250 IU da Ecg. Os dados de porcentagem de animais em estro na IATF,
segundo Menchaca & Rubianes 2006.
IATF 48 h IATF 54 h
Estro/total de cabras (%) 138/156a (88,5) 154/168a (91,7)
Prenhez/total de cabras (%) 77/156a (49,4) 107/168b (63,7)
Para diferentes superescritos, na mesma linha P <0,5.
s53
Figura 2. Representação esquemática do Protocolo de curta duração na indução/sincronização

do estro. A inserção do dispositivo contendo progesterona promoveu a regressão do
maior folículo (5–10 mm) e a emergência de uma nova onda folicular. Entretanto, na
retirada do implante observa-se a presença de um folículo dominante jovem (∼ 5 dias
de idade) que ovulará ∼60 h após a retirada do implante (adaptado de Menchaca &
Rubianes, 2004).
Protocolo de Superovulação Iniciado no Dia 0
O status folicular ao início do tratamento superestimulatório tem sido associado a

variabilidade na resposta a superovulação. Este fato foi primeiramente observado em vacas
(Guilbaut et al. 1991). O início do tratamento superovulatório no momento da emergência da
onda folicular (i.e. na ausência de um folículo dominante) apresenta vantagens. Consequentemente,
diferentes protocolos comerciais têm sido desenvolvidos para sincronizar a emergência da onda
antes da estimulação do recrutamento e crescimento dos folículos ovarianos em bovinos (Bó et
al., 2006). Em caprinos, efeitos deletérios similares são observados sobre o recrutamento e a
taxa de ovulação, devido à presença de um folículo dominante no início do tratamento com FSH
(Menchaca et al. 2002). O número total de pequenos folículos recrutados e a taxa de ovulação
diminuem com a presença e desenvolvimento do maior folículo da onda. Todavia, até o momento,
a maioria dos protocolos tradicionais de superovulação em cabras utilizaram períodos longos de
progestágeno (12- 18 dias) e administração da gonadotrofina (FSH ou eCG) antes ou no momento
da retirada do dispositivo. Estes protocolos não levam em consideração a informação atual sobre
s54
a dinâmica folicular ovariana caprina. Protocolos específicos para sincronizar a emergência da

onda, melhorando a resposta aos programas superovulatórios, semelhantes aos desenvolvidos
para bovinos, ainda não estão disponíveis para caprinos.
A maior eficiência na sincronização da emergência da onda folicular em pequenos
ruminantes é encontrada utilizando-se o “protocolo do dia 0” (Rubianes & Menchaca, 2003),
cuja representação esquemática esta apresentada na Figura 3. O dia 0 do período inter-ovulatório
é definido como sendo o dia da ovulação. No dia 0, todos animais possuem um “pool” de folículos
em crescimento e não há presença de uma folículo dominante. A utilização de protocolo de curta
duração para induzir a ovulação, previamente ao inicio do tratamento superovulatório, sugere o
início da superestimulação com FSH 84 horas após o término do tratamento de sincronização,
desde que a ovulação ocorra 72 horas após a retirada do dispositivo. Desta maneira, o protocolo
de curta duração é usado para sincronizar o dia 0 e, um análogo do GnRH (i.e. 8 μg acetato de
buserelina) pode ser aplicado 36 horas após a retirada do dispositivo para assegurar que a ovulação
ocorra em todos os animais (Pierson et al. 2003). A dose total de FSH é dividida em seis aplicações
e, juntamente com a 5a e 6a doses, duas meia doses de PGF-2á (i.e. 37.5 μg D-cloprostenol por
cada injeção) são administradas para garantir a luteólise. O análogo do GnRH é aplicado 24
horas após a primeira dose de PGF2á, induzindo o pico de LH 4 horas após (Menchaca et al.,
2001). O período ovulatório deste tratamento varia de 18 a 28 horas (~10 horas) após a aplicação
do GnRH (i.e. ∼ 42 horas após a primeira PGF2á). A inseminação artificial em tempo fixo é
realizada 38 horas após a primeira aplicação de PGF2á. A comparação entre a resposta aos
protocolos do dia 0 e tradicional esta representada na Tabela 3. O protocolo de superovulação do
dia 0 comparado ao tradicional, utilizando pFSH (200 mg NIH-FSH-P1, Folltropin, Bioniche,
Canadá) (Menchaca et al. 2005) ou oFSH (8.8 mg NIADDK oFSH-17, Ovagen, ICPbio, Auckland,
NZ) (Menchaca et al. 2006) tem sido reportado com sucesso (Tabela 4). O protocolo do dia 0 é
atualmente utilizado comercialmente em programas de superovulação e transferência de embriões
em pequenos ruminantes, permitindo um aumento de 10 a 20 % no número de embriões
transferíveis por doadora, quando comparado ao método tradicional.
Tabela 3. “Status” folicular no início do tratamento superovulatório com FSH em caprinos,

utilizando-se o tratamento tradicional ou o protocolo iniciado no dia 0 do ciclo
estral.
Maior Folículo n de grandes folículos n de pequenos folículos
(mm) (>5mm) (<4mm)
Tradicional (n=18) 6,6±0,4 2,4±0,4 7,2±0,7
Dia 0 (n=20) 4,3±0,3 0,4±0,2 11,8±1,1
P <0,001 <0,001 <0,001
Tabela 4. Resposta ovulatória e produção de embriões em cabras tratadas com FSH

(Ovagen, ICPbio, Auckland, NZ), nos protocolos tradicional ou do dia 0 do ciclo
estral (Menchaca et al., 2006).
CLs por Total de estruturas Embriões Transferíveis/Estruturas
doadora coletadas transferiréis Coletas (%)
Tradicional (n=18) 6,3±0,8 4,8±0,6 2,6±0,5 23/43 (54%)
Dia 0 (n=20) 9,6±0,6 6,7±0,8 4,9±0,7 84/114 (74%)
P <0,01 >0,1 <0,1 <0,05
s55
Figura 3. Esquema do “Protocolo do dia 0” para programas de TE em caprinos. A ovulação foi

sincronizada utilizando um Protocolo de curta duração, iniciando o tratamento com
seis doses de FSH logo após a ovulação (Dia 0) (i.e. na ausência do folículo dominante).
Duas meia doses de PGF2á foram aplicadas juntamente com a 5a e 6a doses de FSH e
uma dose de GnRH foi fornecida 24 horas após a primeira dose PGF2á.
Conclusão
Dois novos tratamentos foram revisados neste artigo: Protocolos de curta duração para
sincronização de estro e o Protocolo do dia 0 para superovulação em caprinos. Estes protocolos
incorporam as informações geradas nos últimos anos sobre a fisiologia ovariana de ruminantes.
O Protocolo de curta duração consiste no tratamento com progesterona por 5-7 dias associado
com uma aplicação de PGF2á e da Ecg, no momento da inserção e da retirada dispositivo,
respectivamente. Uma única inseminação em tempo fixo, realizada 54 horas após a retirada do
dispositivo, permite uma taxa de prenhez superior a 60 %. O protocolo do dia 0 consiste no
tratamento superestimulatório com FSH iniciado na ausência do folículo dominante (i.e. logo
após a ovulação: Dia 0). Este protocolo permite uma maior resposta ovulatória e, uma produção
de embriões transferíveis 10 – 20 % superior aos tratamentos tradicionais. Estes dois protocolos
aumentam a eficiência dos programas de inseminação artificial, permitindo a adoção destas
tecnologias por nossos países.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos co-autores V. Miller, V. Salveraglio, A. Pinczak, e M. Vilariño;

ao M. Pintos pelos cuidados animais. Um agradecimento especial aos produtores da Red Capra
por sua cooperação. Agradecimentos se estendem a D. Hughes e E. Dixon (ICPbio, New Zealand)
s56
pelo Ovagen e pelo meio Emcare; a E. Campos e S. Kmaid (Universal Lab, Uruguay) pelo
CIDR-G e o análogo da PGF2α (delprostenate, Glandinex); a I. Videla-Dorna (Syntex, Argentina)
pelas esponjas impregnadas com MAP. Suporte financeiro foi fornecido por PEDECIBA e CSIC
(Universidad de la República). AM e ER são pesquisadores do FNI (Fondo Nacional de
Investigadores).
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da ultra-sonografia. 1): 2006
Acta Scientiae Veterinariae. 34 (Supl 1): 59-64.
DIAGNÓSTICO PRECOCE DO SEXO FETAL NAS ESPÉCIES CAPRINA E OVINA

ATRAVÉS DA ULTRA-SONOGRAFIA
Santos, M.H.B.; Chiamenti, A.; Moraes, E.P.B.X.; Moura, R.T.D.; Lima, P.F.; Oliveira, M.A.L.
Laboratório de Biotecnologia da Área de Reprodução do Departamento de Medicina

Veterinária/Universidade Federal Rural de Pernambuco
Introdução
A nova realidade da craprino-ovinocultura no Brasil tem exigido maior controle da eficiência

reprodutiva dos rebanhos. O exame ultra-sonográfico, por ser um método não invasivo e de alta
precisão diagnóstica, é adequado para essa finalidade, porque sendo diagnosticados a gestação e
o sexo dos conceptos é possível racionalizar as ações de manejo.
Estabelecer um plano de nutrição diferenciado para fêmeas vazias e fêmeas com gestação
simples e múltipla, bem como definir um plano de comercialização de animais, descartando
apenas fêmeas não gestantes e gestantes com fetos de sexo indesejado, são medidas passíveis de
adoção, respaldadas no exame ultra-sonográfico (Reichenbach et al., 2004; Santos et al., 2004).
O exame ultra-sonográfico deve ser uma prática de rotina no controle reprodutivo dos
rebanhos, pelo menos das propriedades tecnificadas, porque qualifica e agrega valor ao comércio
de animais, principalmente quando o diagnóstico de gestação é associado à sexagem fetal.
Sexagem Fetal
Nos últimos anos foram desenvolvidas diversas possibilidades para identificação precoce
do sexo fetal e os métodos mais pesquisados são os não invasivos, por não provocar danos à
gestante e ao concepto. Em humanos existe a possibilidade de se identificar o sexo do feto pela
análise do sangue materno, em função da placenta do tipo hemocorial permitir a passagem de um
pequeno número de células da circulação do feto para a da mãe (Rijnders et al., 2001). Entretanto,
nos ruminantes a placenta do tipo epitéliocorial não é vulnerável à passagem de células ou
anticorpos, tornando esse tipo de diagnóstico improvável nas referidas espécies (Rüsse & Grunert,
1993).
A ultra-sonografia foi inicialmente introduzida na Medicina Humana para diagnosticar a
gestação e o sexo fetal, sendo posteriormente utilizada na Medicina Veterinária no mesmo sentido.
Nos eqüinos, estabeleceu-se que o período ideal de sexar os fetos é do 55º ao 75º dia de gestação
(Merkt & Moura, 2000) e nos bovinos do 50º ao 60º dia (Curran, 1992). Em ovinos, a identificação
do sexo foi efetuada entre o 60º e o 69º dias da gestação (Coughbrough & Castell, 1998) e entre
o 65º e o 100º dias (Nan et al., 2001), mas foi posteriormente recomendada em dois períodos,
sendo o primeiro entre o 50º e o 56º dias e o segundo do 66º ao 70º dia de gestação (Bürstell,
2000).
Para definir o período mais viável de diagnosticar o sexo fetal nos caprinos e ovinos,
pesquisas têm sido desenvolvidas na tentativa de estabelecer o período de migração do tubérculo
genital (TG) de raças nativas e exóticas, visando aumentar a acurácia do diagnóstico do sexo
fetal (Santos et al., 2005b; Moraes, 2006; Santos, 2006; Santos et al., 2006ab).
A sexagem fetal, com base unicamente no posicionamento do TG, requer habilidade e
experiência do operador, além de equipamento ultra-sonográfico apropriado, que permita qualidade
s59
de imagem para distinguir as estruturas anatômicas responsáveis pela identificação do sexo

(Reichenbach et al., 2004). Essa recomendação é particularmente importante quando se trata de
feto fêmea, pois a distância a ser percorrida pelo TG, do seu posicionamento inicial até o final, é
bem menor do que no feto macho. Se essa diferença de posicionamento é difícil de ser visualizada
até em fetos obtidos em matadouro, num feto com menos de 60 dias de vida é uma tarefa ainda
mais difícil de ser corretamente concretizada utilizando apenas imagens ultra-sonográficas (Santos,
2006). Por essa razão, ocorrem falsos diagnósticos, cuja freqüência pode ser diminuída através
do exame num período de gestação mais tardio, que permita visualizar o TG definitivamente
posicionado ou já sendo possível identificar as estruturas da genitália externa, que resultam da
sua diferenciação (Santos, 2006).
Os exames ultra-sonográficos devem ser conduzidos dedicando-se especial atenção à região
umbilical e àquela localizada entre os membros posteriores do feto. São considerados machos,
os fetos que apresentem o TG posicionado caudalmente ao cordão umbilical e fêmeas, aqueles
em que o TG encontra-se situado próximo à cauda. O TG é visualizado, no plano horizontal ao
eixo longitudinal do feto, como sendo uma estrutura bilobular e hiperecóica. Nas gestações mais
tardias, após a diferenciação do TG nas estruturas da genitália externa, podem ser observados
prepúcio, pênis e bolsa escrotal no feto macho, bem como vulva, clitóris e tetas no feto fêmea
(Figura 1).
Figura da pagina 60
M
A
Figura 1. Fetos do sexo masculino (A, B, C) evidenciando imagem hiperecóica do TG (tg) situado
caudalmente ao cordão umbilical (cu), do prepúcio (p) e da bolsa escrotal (be). Fetos do sexo
feminino (D, E, F) mostrando imagem hiperecóica do TG (tg) situado próximo à cauda (cd),
da vulva (v) e das tetas (t). Fonte: Santos et al. (2005a)
A migração do TG ocorre entre os dias 37º e 46º (41,4±2,1), 38º e 48º (46,1±4,7), 38º
e 51º (42,2±2,0) e entre o 38º e o 48º (39,5±2,9) de gestação, respectivamente, nos fetos das
raças Santa Inês, Dorper, Damara e Morada Nova (Santos, 2006; Santos et al., 2006b);
sendo recomendado que a sexagem de fetos ovinos originados de monta natural seja realizada
a partir do 50º dia de gestação. Por outro lado, nos fetos provenientes da transferência de
embriões congelados a migração do TG ocorre mais tardiamente, sendo do 36º ao 58º
(46,1±4,7) dia na raça Dorper e do 42º ao 52º (48,5±3,3) dia na Morada Nova, devendo o
diagnóstico do sexo fetal ser efetuado pelo menos a partir do 55º dia de gestação (Santos,
2006). Em princípio pode parecer equivocado recomendar a sexagem dos fetos da raça
s60
Damara, provenientes de monta natural, a partir do 50º dia e os da raça Morada Nova, oriundos
de transferência de embriões, a partir do 55º dia de gestação. Todavia, é necessário esclarecer
que este período é sugerido levando-se em consideração os valores médios e o fato de que a
migração tardia do TG ocorreu somente em um feto de cada raça.
Nos fetos da espécie caprina, o período de migração do TG varia do 44º ao 49º (46,2±1,3)
dia na raça Anglo-nubiana (Santos et al., 2005). Entre 43º e 54º (47,4±2,5) dias na raça Boer
(Santos, 2006), do 45º ao 55º (48,9±1,8) e do 41º ao 51º (46,4±2,1) dias, respectivamente, nas
raças Saanen e Alpina Americana (Santos, 2006), além de 48º a 53º (50,4±2,3) dias nos fetos
sem raça definida (Santos et al., 2006a). Como anteriormente justificado para fetos ovinos, a
decisão de recomendar a sexagem dos fetos caprinos a partir 55º dia de gestação foi em função
dos valores médios e do irrelevante número de fetos em que o TG migrou mais tardiamente.
Mesmo assim, é importante alertar que nada impede que o TG de algum feto, de ambas as
espécies, migre após o dia sugerido para os exames. Outra observação que deve ser ressaltada é
no que concerne à migração do TG de fetos do mesmo sexo nas gestações múltiplas, que pode
ocorrer com diferença de 96 horas, pelo menos, e induzir o operador a cometer equívocos,
diagnosticando fetos machos como sendo fêmeas (Santos, 2006).
Outro importante desafio da sexagem fetal é com relação à acurácia do exame ultra-
sonográfico, uma vez que nos pequenos ruminantes a influência de fatores que podem dificultar
o exame é maior do que nas espécies de grande porte. Na dependência do período e do tipo de
gestação, nem sempre é possível quantificar todos os fetos de forma precisa, como por exemplo,
nas gestações múltiplas e, muito menos, identificar o sexo de todos num mesmo exame. As
maiores dificuldades na sexagem ocorrem nas gestações múltiplas (White et al., 1984; Gearhart
et al., 1988; Haibel, 1990) e, em algumas delas, apesar de serem executados mais de um exame,
é muito pouco provável que se diagnostique todos os fetos (Santos, 2006).
Nas gestações simples, independentemente do número de exames, a acurácia do diagnóstico
por via transretal, segundo Santos (2006), é próxima de 100% quando os exames são realizados
no período adequado, entre o 50º e o 70º dia de gestação, o que não é verdadeiro para as gestações
múltiplas (Tabela 1). É oportuno comentar que, na quase totalidade dos casos, a diminuição da
precisão diagnóstica foi reduzida pela impossibilidade de quantificar todos os conceptos de uma
mesma fêmea gestante e não em decorrência de diagnósticos equivocados.
Tabela 1. Acurácia da identificação do sexo de fetos caprinos e ovinos pela ultra-sonografia transretal
de fêmeas entre o 50º e o 70º dia de gestação.
Gestação Simples Gestação Dupla Gestação tríplice
Exame Exame Exame Exame Exame Exame
Único Repetido Único Repetido Único Repetido
Espécie n/n n/n n/n n/n n/n n/n
Ovinos 16/16 44/45 24/28 63/70 - 35/49
(100%) (97,8%) (85,7%) (90,0%) (71,4%)
Caprinos 95/100 50/50 86/108 111/124 22/23 39/48
(95,0%) (100%) (79,6%) (89,5%) (95,6%) (81,2%)
Total 106/116 94/95 110/136 174/194 22/23 506/564
(91,3%) (98,9%) (80,9%) (89,7%) (95,6%) (89,7%)
Fonte: Santos (2006)
Nas gestações a partir do 100º dia, os exames, quando realizados, devem ser por via
transabdominal, em decorrência da localização dos fetos dificultar a utilização do transdutor por
via transretal (Santos et al., 2006a). Nesse período, a acurácia é inferior ao do anteriormente
abordado, tanto nas gestações simples quanto nas múltiplas (Tabela 2). Essa ocorrência é atribuída
ao maior crescimento dos fetos, nos últimos dois meses de gestação, reduzir o espaço uterino e
s61
favorecer que os placentomas, em conjunto com os demais anexos fetais e partes do próprio feto,
sejam incorretamente interpretados como estruturas hiperecóicas relacionadas com a diferenciação
sexual. Adicionalmente, a sexagem nesta fase é mais difícil de ser efetuada do que nos dois
meses iniciais de gestação, em virtude da impossibilidade de mapear e até mesmo quantificar os
fetos localizados no abdome. Neste período, o exame ultra-sonográfico, além de requerer uma
extensa área do ventre do animal para realização da tricotomia, como recomendado por Aiumlamai
et al. (1992) e Chavez Moreno et al. (1996), necessita de um maior número de pessoal para
manejar e conter adequadamente os animais.
Table 2. Acurácia da identificação do sexo de fetos caprinos após exame ultra-sonográfico

único por via transabdominal em fêmeas entre o 100º e o 120º dia de gestação.
Fetos Sexados Fetos Sexados Fetos Não Fetos Acurácia do
Corretamente Incorretamente Sexados Nascidos Diagnóstico
Gestação n n n n n/n
Simples 9 5 14 9/14
(64,3%)
Dupla 21 8 9 38 21/38
(55,3%)
Total 30 13 9 52 30/52
(57,7%)
Fonte: Santos et al. (2006a)
Nas gestações em que já ocorreu a diferenciação do TG nas estruturas da genitália externa,

a identificação do sexo fetal torna-se mais fácil, porque é respaldada num maior número de
componentes para serem observados. Por isso, ela é tida como mais acurada no feto macho, em
função do maior número de estruturas anatômicas utilizadas para essa finalidade (Davey, 1986;
Kähn et al., 1993; Kaulfuss et al., 1996). É interessante reportar que apesar da cauda e do cordão
umbilical, em alguns casos, posicionarem-se entre os membros posteriores e impedirem a
visualização da vulva e das tetas, no feto fêmea, e da bolsa escrotal no feto macho, neste existirão
ainda o TG e o prepúcio para serem adequadamente visualizados. Esse comentário é oportuno
por ser, segundo Bürstel (2002), um fato comum na rotina da sexagem fetal, especialmente nos
ovinos que possuem uma cauda suficientemente comprida para provocar esses transtornos.
Contudo, de acordo com Santos (2006), essa possível dificuldade não significa que a acurácia do
diagnóstico nos fetos machos seja maior do que nos fetos fêmeas, tanto nos ovinos quanto nos
caprinos (Tabelas 3 e 4).
Tabela 3– Identificação do sexo de fetos ovinos pela ultra-sonografia em fêmeas com

gestação entre o 55º e o 75º dia.
Fetos Sexados Fetos não Fetos Nascidos Acurácia do
Sexo n Sexados n Diagnóstico
n n/n
Masculino 20 2 22 20/22
(90,9%)
Feminino 20 2 22 20/22
(90,9%)
Total 40 4 44 40/44
(90,9%)
Fonte: Santos et al. (2006c)
s62
Tabela 4– Identificação do sexo de fetos caprinos pela ultra-sonografia em fêmeas com

gestação entre o 60º e o 70º dia.
Fetos Fetos Sexados Fetos não Fetos Acurácia do
Sexo Sexados Incorretamente Sexados Nascidos Diagnóstico
n n n n n
Masculino 84 2 15 101 84/101
(83,2%)
Feminino 86 - 13 99 86/99
(86,9%)
Total 170 2 28 200 170/200
(85,0%)
Fonte: Chiamenti, A. Sexagem fetal e estimativa da idade gestacional e do peso ao nascer de caprinos e ovinos pela ultra-
sonografia. Dados parciais do projeto de Tese. Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária da Universidade Federal Rural de
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Conclusões
A ultra-sonografia é um método eficiente para sexar fetos das espécies caprina e ovina,
desde que os exames sejam realizados em período de gestação adequado. A identificação do
sexo fetal, considerando-se somente a localização do TG, é uma possibilidade concreta que
determina precocidade ao exame, mas necessita ser efetuada sob rigoroso controle da idade do
feto.
Exames repetidos nem sempre contribuem para aumentar a acurácia do diagnóstico do
sexo fetal e devem ser evitados, porque oneram o custo/benefício da sexagem e limitam a adoção
dessa prática na rotina de exame.
As gestações múltiplas, principalmente aquelas com mais de dois fetos, comprometem a
acurácia da sexagem fetal, mas o sexo do feto não interfere na acurácia do diagnóstico.
O equipamento de ultra-som é uma peça fundamental para o sucesso da identificação do
sexo fetal, e a utilização de um transdutor linear com dupla freqüência é uma ferramenta que
pode auxiliar o operador a definir o diagnóstico.
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ActadaScientiae
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Veterinariae em caprinos. Acta
34(Suplemento 1):Scientiae
2006 Veterinariae. 34 (Supl 1): 65-70.
ALGUNS ASPECTOS DA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM CAPRINOS
Jeferson Ferreira da Fonseca
Embrapa Caprinos, CP D10, Cep. 62.011-970, Sobral, Ceará, Brasil,

jeferson@cnpc.embrapa.br
Introdução
O rebanho caprino mundial aumentou 55% de 1980 a 1999. Durante este período, a produção
de leite de cabra cresceu 58% (FAO, 2001). O Brasil tem a expectativa de seguir este cenário
mundial e projeta um rebanho da ordem de 50 milhões de cabeças nas próximas duas décadas.
Atualmente e para suportar este crescimento serão necessários programas acessórios para
identificar e/ou multiplicar com alto mérito genético.Assim, biotecnologias da reprodução tendem
a aumentar em número de animais assistidos, serem mais adaptadas às condições de campo bem
como simplificadas para darem suporte adequado à rápida multiplicação demandada por estes
animais. O estudo de biotecnologias do sêmen é importante para a preservação e multiplicação
de machos. Todavia, a multiplicação de fêmeas é igualmente demanda em alta escala. Neste
contexto, a superovulação e transferência de embriões podem ser muito vantajosas.
A primeira transferência de embriões caprinos com sucesso foi reportada no início dos
anos 1930 (Warwick et al., 1934). Entretanto, estudos sobre a biotecnologia de embriões caprinos
foram intensificados apenas a partir de 1970 (Gordon, 1997). Hoje, a transferência de embriões
caprinos é uma realidade mundial e o comércio de embriões aumenta anualmente. Thibier (2005)
reportou um movimento inferior a 3.000 embriões em 2004 (fresco e congelado). Certamente, o
aumento no número de comunicações oficiais contribuirá para elevar o número de transferências
de embriões no mundo, uma vez que dados estatísticos do setor são imprecisos.
No Brasil, os primeiros animais (raça Toggenburg) produzidos por transferência de embriões
foram reportados por Jaume & Bruschi (1985). Nos últimos dez anos, o número de embriões
transferidos aumentou de forma significativa, principalmente em função da importação de animais
e embriões de caprinos de corte. Isto popularizou a transferência de embriões, tornando-a acessível
ao setor produtivo. A simplificação desta tecnologia, bem como, o aumento no número de técnicos
capacitados podem potencializar ainda mais este expansão.
O objetivo deste artigo foi descrever de forma sucinta as etapas envolvidas na transferência
de embriões em caprinos.
A técnica
A técnica de transferência de embriões caprinos, compreendendo a superovulação,

acasalamento, colheita, manipulação, congelação/descongelação e inovulação embrionária,
apresenta grandes variações. O conhecimento das peculiaridades comportamentais, reprodutivas
e anatômicas é imprescindível para obtenção de sucesso na atividade.
O ciclo estral
A cabra é poliéstrica estacional de dia curto. Sua ciclicidade reprodutiva é dividida em

estações de anestro, de transição e de acasalamento. A atividade reprodutiva inicia-se em meados
do verão, atinge o esplendor no outono e cessa em meados no inverno. À medida que se aproxima
da Linha do Equador, esta sazonalidade é diminuída ou findada. No Nordeste brasileiro, por
s65
exemplo, desde que haja aporte nutricional em quantidade e qualidade suficientes, a cabra ciclará
durante todo o ano. O ciclo estral caprino tem uma duração média de 21 dias. Apresenta uma
fase luteínica (17 dias) e uma fase folicular (4 dias). Durante este período, duas a quatro ondas
foliculares podem estar presentes. A dominância folicular parece ocorrer apenas na primeira e
última ondas foliculares (Ginther & Kot, 1994). A ovulação pode ser única ou múltipla e ocorre
predominantemente no final do estro ou logo após o seu final (Fonseca, 2002). Há relativamente
poucos estudos envolvendo a dinâmica folicular ovariana na cabra. O aumento do conhecimento
neste campo tem implicado em elevação na qualidade e quantidade das estruturas recuperadas
(Menchaca et al., 2005).
Regressão pré-matura de corpo lúteo
A regressão luteal precoce é um fenômeno comum em cabras, manifestando-se na forma

de ciclos estrais curtos, geralmente no início da estação de acasalamento. Este fenômeno é
exacerbado em cabras superovuladas e parece estar associado a elevadas concentrações plasmáticas
de estrógenos durante a fase luteal inicial. Como conseqüência, nota-se um decréscimo na resposta
superovulatória. A regressão luteal precoce é evidenciada por laparoscopia cerca de quatro dias
após o estro, mas as concentrações plasmáticas de progesterona incompatíveis com atividade
luteal normal já são detectadas aos três dias após o estro em animais acometidos (Saharrea et al.,
1998). A administração de progesterona exógena (Gusmão, 2005), agentes anti-luteolíticos
(antiinflamatório) ou luteotróficos (hCG, GnRH, LH) pode prevenir ou reduzir os efeitos deletérios
da regressão luteal precoce (Saharrea et al., 1998; Fonseca, 2005).
Superovulação
A superovulação em caprinos segue os mesmo princípios básicos aplicados em ovinos e

bovinos. Várias preparações hormonais com variações no número de aplicações e na dose dos
hormônios utilizados têm reportado sucesso. Os hormônios utilizados são FSH, eCG e hMG. A
administração de preparações com múltiplas aplicações de FSH (6 a 8 aplicações) é a mais
comum (Fonseca, 2005). De fato, a superovulação é uma área que demanda estudos mais
aprofundados para determinação de protocolos mais simples, eficientes, menos estressantes e
menos onerosos. A superovulação pode ser feita com base na observação de estro e sem uso de
progestágenos durante a estação reprodutiva. Todavia, a sincronização de estro facilita e otimiza
os eventos envolvidos na superovulação e colheita de embriões. Normalmente, utilizam-se
progesterona ou progestágenos impregnados em dispositivos vaginais ou auriculares com um
tempo de exposição superior a 10 dias (Gordon, 1997; Gusmão, 2005). A diminuição deste
período de exposição (3-6 dias) pode agilizar e encurtar o processo e já tem sido aplicado com
sucesso (Fonseca et al., 2005a; Fonseca et al., 2006). A administração de prostaglandina para
assegurar a luteólise e estro durante o processo superovulatório é também necessária, a exemplo
de outras espécies. Todavia, variações no momento da aplicação relativo ao momento da inserção
do dispositivo devem ser consideradas. O conhecimento dos efeitos da progesterona exógena
sobre o turnover folicular ovariano associado ao efeito luteolítico da prostaglandina em caprinos
(Menchaca & Rubianes, 2002; Maffili, 2004) podem juntos proverem a melhora da resposta
superovulatória.
Uma das possibilidades é o início da administração de FSH o mais próximo possível da
emergência da onda folicular ovariana no início do ciclo estral (primeira e segunda ondas
foliculares), evitando, desta forma, os efeitos deletérios da presença de folículos grandes neste
momento (Gonzalez-Bulnes et al., 2002; Menchaca et al., 2002). Menchaca & Rubianes (2002)
s66
reportaram a emergência da primeira e segunda ondas foliculares no dia 0 (dia da ovulação e

inserção do dispositivo) e dia 4 respectivamente cabras tratadas com progesterona. A superovulação
utilizando este conceito (i.e. início da administração de FSH próximo à emergência folicular)
apresentou resultados satisfatórios em caprinos. Numa primeira tentativa, cabras Saanen receberam
dispositivos intravaginais contendo progesterona (CIDR®, Pfizer do Brasil), inseridos (dia 0) e
removidos seis dias depois (dia 6), e 22,5 μg cloprostenol (Prolise®, Tecnopec Ltda, São Paulo,
Brasil) administradas pela via intra-vulvosubmucosal (dia 0). No dia 4, dia esperado da emergência
da primeira onda folicular em cabras tratadas com progesterona (Maffili, 2004), as cabras
começaram a receber seis doses decrescentes (25, 25, 15, 15, 10 e 10%) de FSH (250 a 400 UI)
intervaladas de 12 horas. O acasalamento foi feito por monta natural a cada 12 horas. Três doses
de 50 mg flunixin meglumine foram administradas nos dias 9, 10 e 11. Colheitas realizadas no
dia 14 (6 a 7 dias após o início do estro) resultaram em cerca de 10 embriões viáveis por lavado
(Fonseca et al., 2005a). Em um segundo ensaio, as cabras receberam 37,5 g d-cloprostenol (dia
0 manhã), CIDR por três dias (dias 2 a 5), FSH (dias 2 a 4), 37,5 μg d-cloprostenol (dia 5 manhã)
e 500 UI hCG (dia 7 tarde). Neste caso, o dia esperado para emergência da primeira onda folicular
em cabras tratadas com progesterona é o dia da inserção do CIDR (Menchaca & Rubianes,
2002). Colheitas realizadas no dia 14 (6 a 7 dias após o início do estro) resultaram em cerca de 8
embriões viáveis por lavado (Fonseca et al., 2006). Em ambos os estudos, o acompanhamento
ultra-sonográfico revelou a ausência de folículos com diâmetro superior a 4 mm no momento da
primeira administração de FSH, confirmando a viabilidade de se superovular cabras com base na
primeira onda folicular do ciclo estral.
Colheita de embriões
A colheita de embriões em caprinos pode ser efetuada por laparotomia, laparoscopia e pela
via transcervical (Andrioli et al., 1999). A laparotomia, apesar de ser uma técnica segura e precisa,
apresenta todos os riscos e seqüelas inerentes aos processos cirúrgicos que envolvem exploração
de órgãos abdominais, principalmente aderências. A laparoscopia é uma técnica precisa e segura,
com menor índice de seqüelas que a anterior, mas envolve a necessidade de procedimentos mais
laboriosos (i.e. uso de laparoscópio). No início da década passada, o procedimento de colheita
não-cirúrgica trans-cervical foi desenvolvido (Pereira et al., 1991), sendo atualmente o mais
utilizado no Brasil. A técnica trans-cervical combina fácil execução, baixo índice de aderências
e boa taxa de recuperação (Andrioli et al., 1999). O procedimento pode ser executado com o
animal em estação. Para tanto, há necessidade de administração de prostaglandina 12 horas antes
da colheita ou de oxitocina no momento na colheita. Este procedimento tem o objetivo de promover
a dilatação do canal cervical, o que facilita a passagem do cateter (Pereira et al., 1998).
Anestesia epidural e local (cérvix), bem como leve sedação, minimizam o desconforto
animal, facilitando o processo (Fonseca et al., 2005a). A colheita deve ser efetuada seis a sete
dias após o início do estro. Em média, cinco embriões viáveis são recuperados por colheita. A
avaliação embrionária segue os princípios utilizados para bovinos (IETS, 1998; Strinfellow &
Seidel, 1999).
Receptoras
O padrão de seleção de receptoras caprinas também acompanha o de outras espécies. As

cabras devem apresentar perfeita condição clínico-patológica. Recomendam-se receptoras
negativas para CAEV (Artrite-encefalite viral caprina), com vacinas atualizadas para as diferentes
enfermidades. Antiparasitários não são recomendados antes dos 53 dias após a inovulação
s67
embrionária. Deve-se atentar para um plano nutricional adequado e contínuo, incluindo

mineralização e fornecimento de água em boa qualidade. As receptoras deverão receber o implante
de forma que a previsão de manifestação de estro coincida com o estro da doadora correspondente.
Estros naturais também podem ser utilizados, desde que atendam à sincronia com a doadora.
Inovulação
A inovulação embrionária em cabras e ovelhas pode ser feita pelo método cirúrgico,
laparoscópico, semilaparoscópico ou transcervical, sendo a última pouco relatada. Normalmente,
observam-se taxas de gestação que variam de 40 a 80 %. Os mesmos fatores que interferem na
taxa de gestação em bovinos também atuam em caprinos e ovinos. Todavia, métodos que
possibilitam a observação e caracterização precisa do corpo lúteo (localização e aparência
macroscópica) têm expectativas de taxas de gestação superiores, uma vez que receptoras com
regressão luteal ou corpos lúteos de baixa qualidade morfológica podem ser eliminadas. Os
embriões são transferidos ipsilaterais ao (s) corpo (s) lúteo (s), normalmente aos pares. A
transferência de um embrião para cada corno uterino também é reportada com sucesso. A
inovulação transcervical não-cirúrgica, executada de forma semelhante à colheita é talvez uma
tendência futura, a exemplo do que ocorreu em bovinos. Neste caso, o corpo lúteo deve ser
localizado por ultra-sonografia para determinação de qual corno receberá o embrião. Todavia, o
diâmetro do inovulador, a idade e a ordem de parição poderão conferir maior ou menor facilidade
à técnica (Fonseca, 20051), o que permanece como objeto de estudo.
Criopreservação
A criopreservação de embriões pode ser realizada de várias formas e utilizando vários

crioprotetores intra e extracelulares, com apenas um crioprotetor ou com associação de
crioprotetores (Fonseca et al., 2002). Em caprinos, os primeiros relatos de sucesso utilizaram
glicerol como crioprotetor (Bilton & Moore, 1976) e taxa de resfriamento lenta (Whittingham et
al., 1972). Todavia, estudos comparativos apontam o etileno-glicol como crioprotetor mais
eficiente que o glicerol (Gal et al., 1993). As taxas de gestação médias em cabras e ovelhas
inovuladas com embriões congelados/descongelados variam de 30 a 70 % em função da qualidade
embrionária (Gordon, 1997). Reporta-se sucesso tanto com a congelação lenta (Fonseca et al.,
2005b) quanto com a vitrificação (Gordon, 1997; Sales et al., 2002). A possibilidade de congelação/
descongelação em único passo torna o uso do etileno-glicol ainda mais atraente. Em nossa rotina,
os embriões são submetidos a uma solução etileno-glicol 1,5 molar por 10 minutos. Durantes
este período, os embriões são envasados em palhetas de 0,25 ml ( coluna centrl com embrião e
colunas adjascentes com PBS 20% soro fetal bovino) e colocados em cilindro de congelação
(Freeze Control CL 5000®) a 20ºC. A taxa de resfriamento é de 2ºC/min até –6ºC onde permanecem
por 15 mim. A indução da cristalização é feita após os 5mim iniciais da estabilização. Em seguida,
a taxa de resfriamento é de 0,6ºC/min até –30ºC, quando as palhetas são imersas em nitrogênio
líquido e estocadas. A descongelação é feita em água (35ºC/segundos) e os embriões diretamente
transferidos (laparoscopia ou laparotomia), com taxa de gestação de 60%.
1
Dados não-publicados
s68
Conclusões e perspectivas
A transferência de embriões caprinos reportou evolução nos conhecimentos básicos e

aplicados nas últimas duas décadas. Entretanto, embora tenha havido um número crescente de
técnicos envolvidos no setor, esta evolução não foi acompanhada por elevação no número
comunicações oficiais. Estes aspectos, associados à simplificação e aumento da eficiência da
técnica como um todo, projetam avanços ainda superiores. Estudos sobre o detalhamento das
peculiaridades reprodutivas caprinas são necessários. Neste cenário, o conhecimento ultra-
sonográfico da dinâmica folicular ovariana, bem como o perfil endócrino do ciclo estral natural
e induzido serão importantes ferramentas. Finalmente, estima-se que o crescimento do rebanho
caprino brasileiro aproxime-se de cinco vezes o atual, alcançando 50 milhões de animais nos
próximos 20 anos. Isto refletirá não somente no aumento da atividade de transferência de embriões,
mas também, em sua consolidação como tecnologia acessível e aplicada na rotina de manejo
reprodutivo em sistemas de produção de caprinos.
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71-84.
ESTADO ATUAL DA BIOTÉCNICA DE MANIPULAÇÃO DE OÓCITOS INCLUSOS

EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS
José Ricardo de Figueiredo; Ana Paula Ribeiro Rodrigues; Regiane Rodrigues dos Santos;
Cláudio Lopes; José Roberto Viana Silva
UECE-FAVET-PPGCV-LAMOFOPA - jrfig@webcabo.com.br
Introdução
A utilização e o desenvolvimento de biotécnicas da reprodução animal são condições

indispensáveis para o aumento da eficiência produtiva dos rebanhos. Neste sentido, especialmente
no tocante a ruminantes domésticos, biotécnicas como a inseminação artificial, a fecundação in
vitro (FIV) e a transferência de embriões vêm sendo utilizadas com sucesso. Outras biotécnicas
terão sua aplicabilidade prática em larga escala no futuro. Nesse grupo, pode-se incluir a clonagem
e manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA).
No intuito de facilitar a compreensão da importância da biotécnica de MOIFOPA, bem
como, demonstrar como ela se inserirá no futuro, no contexto da reprodução animal, este artigo
fará uma breve abordagem sobre os folículos ovarianos pré-atrais (FOPA), enfatizando a sua
formação, classificação e destino no interior dos ovários. Em seguida, será discutida a importância
do estudo da população de FOPA isolados do tecido ovariano, as principais técnicas de isolamento,
conservação e cultivo in vitro de FOPA, o estado atual da MOIFOPA e, finalmente, serão discutidas
as perspectivas de utilização da biotécnica de MOIFOPA na reprodução de animais domésticos,
silvestres e em perigo de extinção.
Folículos Ovarianos: definição, tipos e destino
O folículo é a unidade morfofuncional do ovário, sendo constituído por um oócito circundado

por células somáticas (células da granulosa e tecais). De acordo com o grau de evolução, os
folículos podem ser divididos em: a) FOPA ou não cavitários e b) folículos antrais ou cavitários.
Os FOPA representam cerca de 90 a 95% de toda população folicular e, desta forma, armazenam
a grande maioria dos oócitos presentes em ovários mamíferos. Na categoria de FOPA, são incluídos
os folículos primordiais, intermediários, primários e secundários.
O ovário mamífero contém milhares de oócitos inclusos em FOPA. Entretanto, a grande
maioria destes folículos (99,9%) não chega até à ovulação, mas ao contrário, é eliminada por
meio de um processo conhecido por atresia folicular.
Manipulação de Oócitos Inclusos em FOPA (MOIFOPA)
Conceito
A MOIFOPA é uma biotécnica que consiste 1) no isolamento ou resgate de FOPA a partir

de ovários, 2) na conservação visando a estocagem por um curto (resfriamento) ou longo
(criopreservação) período e 3) no cultivo folicular que tem como finalidade promover o
crescimento, a maturação e a fecundação in vitro dos oócitos previamente inclusos em FOPA. A
seguir, será descrita a importância da MOIFOPA, bem como, os principais avanços alcançados
nas suas diferentes etapas.
s71
Importância
Apesar do desenvolvimento de folículos antrais ter sido amplamente descrito, principalmente

em bovinos, informações concernentes à fisiologia dos FOPA são escassas. É sabido de estudos
histológicos, que os folículos primordiais são ativados e transformam-se, sucessivamente, em
folículos intermediários, primários e secundários. Entretanto, não são conhecidos com exatidão
os fatores que promovem ou inibem a ativação dos folículos primordiais, bem como aqueles
implicados no controle do crescimento de folículos primários e secundários. Em resumo,
comparada à fase antral, a fase pré-antral compreende um período obscuro e pouco conhecido da
foliculogênese sendo, portanto, um vasto campo para investigações científicas.
Tendo em vista que as biotécnicas ligadas à reprodução têm como finalidade geral o aumento
da eficiência reprodutiva dos rebanhos, será considerada agora a eficácia do ovário como uma
“máquina” produtora e liberadora de óvulos. O ovário mamífero contém milhares de oócitos,
inclusos em sua maioria (cerca de 90%) nos FOPA. Apesar deste enorme capital oocitário, uma
ínfima proporção destes oócitos (cerca de 0,1%) será ovulada e, conseqüentemente, poderá ter
alguma possibilidade de ser fecundada. Conforme o exposto acima, considerando-se o fato de
que a quase totalidade dos oócitos será eliminada pelo processo de atresia, caso eles permaneçam
no interior dos ovários, a biotécnica de MOIFOPA se fundamenta em dois objetivos principais,
a saber: 1) resgatar ou isolar os FOPA a partir dos ovários antes que eles se tornem atrésicos e 2)
cultivar in vitro os FOPA e, conseqüentemente, os oócitos imaturos neles inclusos, até o estádio
de maturação, prevenindo-os da atresia.
A biotécnica de MOIFOPA é de grande importância tanto para a pesquisa fundamental ou
básica, quanto para a reprodução animal. No tocante à pesquisa fundamental, esta biotécnica
poderá contribuir para elucidação dos mecanismos implicados na foliculogênese na fase pré-
antral. Nesse caso, os FOPA isolados do ambiente ovariano, bem como da influência endócrina,
nutricional e sanitária comuns no organismo animal, poderão ser cultivados in vitro em presença
de diferentes substâncias conhecidas (matriz extracelular, hormônios, fatores de crescimento,
carboidratos, aminoácidos, etc.), cujo efeito individual ou associado poderá ser avaliado e
controlado em diversos experimentos. Os resultados oriundos desses experimentos permitirão a
elucidação dos mecanismos envolvidos tanto na ativação dos folículos primordiais, quanto no
crescimento de folículos primários e secundários.
Referente à reprodução animal, no futuro, o isolamento de milhares de FOPA a partir de
um único ovário e o posterior cultivo in vitro dos oócitos neles inclusos até o estádio de maturação,
poderá contribuir para a multiplicação de animais de alto valor zootécnico ou em via de extinção.
Este objetivo será alcançado através do fornecimento de um grande número de oócitos oriundos
de um mesmo animal, que seriam crescidos e maturados in vitro, e utilizados posteriormente nas
biotécnicas de FIV e clonagem. O fornecimento de uma população homogênea de oócitos oriundos
de um mesmo animal proporcionado pela biotécnica de MOIFOPA contribuirá também para a
padronização de técnicas, como a clonagem, a FIV e a transgênese, uma vez que será utilizada
uma população de oócitos em um mesmo estádio de desenvolvimento e de mesma origem. Uma
outra conseqüência imediata desta nova biotécnica é a criopreservação de FOPA isolados ou in
situ (no interior de tecido ovariano) a qual poderia ter uma grande importância na constituição de
bancos de germoplasma animal, visando a conservação de oócitos de animais de alto valor
zootécnico e/ou em perigo de extinção.
s72
Conservação de ovários durante o transporte até o laboratório
A conservação (resfriamento) de FOPA de mamíferos é de grande importância para preservar

estes folículos durante o transporte dos ovários do local de coleta até o laboratório, garantindo,
portanto, o fornecimento de FOPA de boa qualidade para criopreservação e/ou cultivo folicular.
Estudos realizados por nossa equipe demonstraram que FOPA caprinos e ovinos podem ser
conservados in situ, eficientemente, a 4°C nas soluções salina (SS), à base de água de coco
(SBAC), Braun-Collins (SBC), TCM 199 ou PBS por até 24 h; bem como a 20°C por 4 h nestas
mesmas soluções. Nestas condições, a percentagem de folículos morfologicamente normais variou
de 78,1% (SS - 4ºC por 24 h) a 91,0% (SBAC – 4ºC por 4 h) para caprinos e de 70 % (SBC-20ºC
por 4 h) a 95% (TCM 199-4ºC por 4 h) para ovinos, não sendo observadas diferenças significativas
em comparação ao ovário no momento da coleta (média de 88,4% para caprinos e 93,6% para
ovinos). Por outro lado, após conservação a 20°C por 12 ou 24 h e a 39°C por 4, 12 ou 24 horas,
em todos os meios testados, observou-se uma redução significativa da percentagem de FOPA
morfologicamente normais (Carvalho et al., 2001; Ferreira et al., 2001; Andrade et al., 2002;
Santos et al., 2002). Utilizando a temperatura de 39°C, a conservação de ovários ovinos é viável
por apenas 2 horas, mantendo a percentagem de FOPA normais similar àquela observada no
momento da coleta dos ovários (Matos et al. , 2004).
Isolamento de FOPA
No laboratório, a utilização de FOPA para criopreservação e/ou cultivo in vitro no âmbito

das pesquisas fundamental e aplicada (futuro) é precedida do emprego de métodos eficazes que
permitam o isolamento de um grande número de FOPA a partir dos ovários. Para o isolamento de
FOPA, podem ser utilizados métodos mecânicos e/ou enzimáticos. Na literatura, os primeiros
registros de estudos de FOPA isolados em animais de laboratório (Grob, 1964 - camundongos) e
domésticos (Figueiredo et al., 1992 - bovinos) ocorreram nas décadas de 60 e 90 utilizando-se
procedimentos enzimáticos e mecânicos, respectivamente. O princípio dos métodos de isolamento
folicular consiste na dissociação ou separação dos FOPA dos demais componentes do estroma
ovariano (fibroblastos, fibras colágenas e elásticas, fibronectina, etc.) utilizando-se para isto,
instrumentos mecânicos associados ou não aos químicos ou enzimáticos. Nos procedimentos
mecânicos, os equipamentos mais comumente utilizados são o tissue chopper, míxer, tesouras
cirúrgicas, pequenos fórceps e agulhas dissecantes. Referente aos procedimentos enzimáticos,
as enzimas proteolíticas mais utilizadas são a colagenase, tripsina e pronase, sendo a primeira
empregada na maioria dos trabalhos.
Métodos enzimáticos de isolamento de FOPA foram descritos não apenas em animais de
laboratório (camundongo, rato, hamster, coelho), mas também em suínos, gatos, fetos bovinos,
ovinos e humanos. Em contraste aos procedimentos enzimáticos, métodos mecânicos têm sido
mais comumente usados para o isolamento de FOPA de ovários bovinos, caprinos, ovinos e
felinos. Os resultados obtidos de diferentes trabalhos demonstram que independente do tipo de
procedimento (mecânico ou enzimático), milhares de FOPA podem ser isolados por ovário
(revisado por Figueiredo et al., 2002). Diante do exposto, conclui-se que, devido à grande eficiência
dos métodos disponíveis, a obtenção de oócitos inclusos em FOPA isolados não constitui um
empecilho para o desenvolvimento da biotécnica de MOIFOPA.
Cultivo in vitro de FOPA
s73
O objetivo principal do cultivo in vitro de FOPA é o de permitir o desenvolvimento folicular

assegurando o crescimento e a maturação dos oócitos, bem como a multiplicação e posterior
diferenciação das células da granulosa presentes nesses folículos. In vivo, vários componentes
produzidos endócrina e localmente podem estimular a neovascularização ou inervação dos
pequenos folículos através da produção de nutrientes, citocinas, hormônios e substâncias
neuropeptidérgicas. Esses fatores parecem ser necessários para a sobrevivência e início do
crescimento folicular (van den Hurk et al., 1997). Entretanto, os fatores que regulam o crescimento
de FOPA de ruminantes ainda são pouco compreendidos. Estudos realizados in vitro têm
demonstrado que o crescimento dos FOPA é afetado por muitos fatores, os quais raramente
atuam independentemente (Williams, 1990).
Wandji et al. (1996b) demonstraram pela primeira vez que folículos primordiais, presentes
em fragmentos de córtex ovariano de fetos bovinos, sobrevivem e iniciam o crescimento in vitro
em altas taxas (94%) em meio de cultivo sem soro. Além disso, relataram que a expressão do
PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) pelas células da granulosa e oócito está
intimamente associada com o início do crescimento do folículo primordial. Recentemente, foi
demonstrado que folículos primordiais caprinos também são ativados com sucesso in vitro (Silva
et al., 2004). No entanto, utilizando este modelo de cultivo, não foi possível detectar efeitos
positivos do Hormônio Folículo Estimulante (FSH), Fator de Crescimento Epidermal (EGF),
Fator de Crescimento Fibroblástico-2 (FGF-2, Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-1
(IGF-1), Fator de Crescimento Transformante-α (TGFα) e TGFβ sobre a ativação de folículos
primordiais de bovinos (Derrar et al., 2000) e caprinos (Silva et al., 2004). Por outro lado, em
animais de laboratório, diversos fatores influenciam positivamente a ativação de folículos
primordiais in vitro, como por exemplo: Kit ligand, FGF-2, BMP-2, -7, GDF-9, LIF e insulina
(Nilsson et al., 2002; Fortune, 2003). Ao contrário, outras substâncias como o hormônio anti-
Mülleriano reduz os níveis de ativação de folículos primordiais de camundongos in vitro (Durlinger
et al., 2002).
No tocante aos folículos primários e secundários, FSH, ativina, EGF, TGFs e Peptídeo
Intestinal Vasoativo (VIP) parecem ser importantes para a sobrevivência e crescimento in vitro
destes folículos. Os principais resultados concernentes ao desenvolvimento de FOPA in vitro na
presença ou ausência de soro, hormônios, peptídios e fatores de crescimento serão mostrados a
seguir.
O crescimento e a sobrevivência de FOPA de vacas, isolados mecanicamente, e cultivados
por 7 dias sobre uma monocamada de fibroblastos de embriões de camundongos irradiados,
utilizando-se um meio suplementado com 10% de soro de bezerro recém-nascido, foi descrito
por Nuttinck et al. (1993). Esses autores observaram que 73% dos folículos sobreviveram,
apresentando um aumento do diâmetro folicular de 5 a 30 μm e um aumento no conteúdo de
DNA de 1% a 72%. Vários autores mostraram que o FSH promove um aumento no diâmetro
folicular e na proliferação das células da granulosa em diferentes espécies (bovina: Hulshof et
al., 1995; Saha et al., 2000; caprina: Silva et al., 2004; ovina: Cecconi et al., 1999; humana: Roy
& Treacy, 1993; Wright et al., 1999).A presença de 17β-estradiol é capaz de induzir o aumento
no tamanho folicular após 7 dias de cultivo em meio sem soro. Quando folículos bovinos são
estimulados com a associação de FSH e estradiol, observa-se a combinação de seus efeitos,
aumentando o diâmetro folicular (Hulshof et al., 1995).
Wandji et al. (1996a) demonstraram que a proliferação das células da granulosa de FOPA
bovinos isolados enzimaticamente pode ser estimulada pelo bFGF, oFSH (FSH ovino) e EGF,
enquanto o TGFβ inibe o crescimento folicular. O FGF bovino e o TGFβ antagonizam o efeito
positivo do FSH na produção de esteróide pelas células da granulosa cultivadas de FOPA bovinos.
s74
Além disso, vários estudos mostraram que o FSH estimula a formação de antro, a esteroidogênese
e a produção de lactato (suínos: Wu et al., 2001; ovinos: Kreeger et al., 2005).Gutierrez et al.
(2000) mostraram que 19% de folículos bovinos cultivados em um sistema desenvolvido para
células da granulosa, sem FSH ou fatores de crescimento, atingiram o estádio antral. Por outro
lado, a adição de EGF ou FSH aumentou para 55% a taxa de desenvolvimento até o antro (Gutierrez
et al., 2000). Outro experimento revelou que o FSH sozinho e o EGF adicionado de FSH podem
ser recomendados para o cultivo in vitro de folículos bovinos com diâmetro entre 40 e 80 μm –
Saha et al., 2000).
Os efeitos do VIP (pepitídeo intestinal vasoativo) e ativina A na presença ou ausência de
hFSH (Hulshof et al., 1995) sobre o desenvolvimento de FOPA bovinos isolados mecanicamente
também foram investigados. Os resultados desses estudos revelaram que o VIP estimula o
desenvolvimento de FOPA bovinos. O papel da ativina no desenvolvimento de FOPA é confirmado
pelo seu efeito estimulatório no crescimento folicular e proliferação das células da granulosa,
efeito dependente de sua concentração. A ativina também tem uma ação sinérgica com o FSH no
desenvolvimento folicular. Recentemente, em ovinos, também foi demonstrado que a ativina
promove o crescimento de FOPA até a formação de antro (Thomas et al., 2003).
Durante os últimos anos a função do fator de diferenciação do crescimento-9 (GDF-9)
sobre o desenvolvimento folicular tem sido parcialmente elucidada. O GDF-9 é uma substância
pertencente à família de fatores de crescimento transformantes e é secretado pelo oócito (Chang
et al., 2002). Este fator atua promovendo o crescimento de folículos primários e a proliferação
de células da teca de ratas (Nilson & Skinner, 2002), estimulando a manutenção da viabilidade
folicular e a proliferação de células da granulosa de humanos (Hreisson et al., 2002). Além
disso, exerce efeito sinérgico com o FSH sobre o crescimento e diferenciação de folículos pré-
antrais murinos (Hayashi et al., 1999). Dong et al. (1996) mostraram que na ausência do GDF-
9, não ocorre a formação de folículos secundários, levando conseqüentemente à degeneração
dos oócitos inclusos em folículos primários.
No tocante à viabilidade folicular, Katska & Rynska (1998) relataram que FOPA bovinos
cultivados em TCM 199 suplementado com FSH, 17β-estradiol, insulina, trasferrina e selênio,
piruvato de sódio, glutamina e hipoxantina apresentaram viabilidade e crescimento folicular
superior quando comparado ao meio sem suplementação. Contrariamente aos efeitos benéficos
do FSH sobre o desenvolvimento in vitro de FOPA bovinos descritos anteriormente, Nuttinck et
al. (1996) mostraram que o pFSH (FSH-porcino) induz a degeneração em pequenos FOPA bovinos
e que essa degeneração parece ser atenuada pelo FGF-2. Esse trabalho também demonstrou que
o FGF-2 leva ao aumento da síntese de DNA folicular, a qual não é observada na presença do
pFSH. A discordância entre os resultados obtidos por Nuttinck et al. (1996) e o dos autores
mencionados acima, no tocante ao efeito do FSH sobre o desenvolvimento de FOPA bovino in
vitro é, provavelmente, devido às diferenças nos procedimentos de isolamento folicular, bem
como, aos diferentes sistemas de cultivos empregados.
Em animais de laboratórios, diversos fatores influenciam positivamente o crescimento de
FOPA, como por exemplo: FSH, Fator de Diferenciação do Crescimento-9 (GDF-9), EGF, TGFβ,
ativina, Fator de Crescimento de Keratinócitos (KGF), Hormônio Luteinizante (LH) e Hormônio
do Crescimento (GH). Outras substâncias, como hormônio anti-Mülleriano inibem o
desenvolvimento de FOPA de camundongos (Fortune, 2003). Provavelmente, a interação de
vários fatores inibidores e estimuladores é responsável pelo controle do desenvolvimento de
FOPA.
A influência de diferentes hormônios, fatores de crescimento e outros peptídeos sobre a
ativação e crescimento in vitro de FOPA é ilustrado na Tabela 1.
s75
Criopreservação de Oócitos Imaturos Oriundos de FOPA
A criopreservação de oócitos é uma alternativa para conservar o material genético de espécies

ou raças de animais domésticos que são utilizados comercialmente, bem como de mamíferos
silvestres. Essa técnica também é importante na medicina humana para estocar oócitos de mulheres
com problemas reprodutivos ou submetidas a tratamento radio e/ou quimioterápico (no caso de
cânceres), reduzindo assim os problemas éticos, legais e morais que geralmente estão associados
com a estocagem de embriões (Shaw et al., 2000). Os oócitos utilizados para a criopreservação
podem ser imaturos (originários de FOPA ou terciários) e maturos (oriundos de punção de folículos
pré-ovulatórios ou obtidos após maturação in vitro. A despeito de considerável pesquisa realizada
durante os últimos 15 anos, o progresso obtido na criopreservação de oócitos maturos tem sido
muito limitado (Parks & Ruffings, 1992). Os oócitos maturos têm sido criopreservados utilizando-
s76
se os protocolos de congelação lenta e rápida, bem como de vitrificação. Entretanto, as taxas de

fecundação e desenvolvimento in vitro são muito inferiores as de oócitos não criopreservados.
Apesar dos oócitos maturos serem particularmente sensíveis aos procedimentos de
criopreservação, alguns progressos têm sido obtidos inicialmente com a adaptação de protocolos
empregados em embriões (Parks & Ruffings, 1992).
Características citológicas especiais dos oócitos maturos, tais como fuso meiótico, grânulos
corticais e citoesqueleto têm se mostrado susceptíveis a danos durante o resfriamento e a exposição
aos crioprotetores (Rall, 1992). Essa exposição e a posterior criopreservação estão implicadas
no aumento da incidência de anormalidades no fuso meiótico, no início da ativação partenogenética
e no estímulo da liberação dos grânulos corticais. A criopreservação pode também aumentar a
incidência de perda cromossômica no fuso meiótico e, nesses casos, não se pode obter resultados
favoráveis na fecundação (Wood et al., 1997). Em experimentos de fecundação in vitro, o
citoesqueleto de oócitos maturos de camundongas sofreram ruptura da rede de filamentos e
desorganização do fuso, levando à dispersão dos cromossomos (Eroglu et al., 1996).
Mais recentemente, a criopreservação de FOPA vem sendo considerada como uma excelente
alternativa para a estocagem de um grande número de oócitos imaturos obtidos a partir de um
único animal. Os oócitos inclusos em FOPA possuem várias características que os tornam menos
suscetíveis à crioinjúria do que os oócitos maturos (Gosden et al., 1994; Shaw et al., 2000).
Dentre elas, as mais importantes são: o menor tamanho do oócito, sua baixa taxa metabólica,
estádio do ciclo celular (núcleo no estado de prófase da primeira divisão meiótica), número
restrito de células da granulosa, ausência de zona pelúcida e de grânulos corticais periféricos e a
pequena quantidade de lipídios intracitoplasmáticos sensíveis às baixas temperaturas. Todas essas
características são potencialmente benéficas para a criopreservação. Uma vez que a grande maioria
dos oócitos encontra-se inclusa em FOPA e que esses oócitos não possuem um fuso meiótico, os
riscos citogenéticos são menores nas divisões subseqüentes (Oktay et al., 1998). Portanto, eles
são pouco suscetíveis às aberrações cromossômicas (Candy et al., 1994) e, conseqüentemente,
mais resistentes aos procedimentos de congelação. Além disso, diferentemente dos oócitos
maturos, os oócitos imaturos oriundos de folículos primordiais possuem tempo para reparar
danos subletais nas organelas e em outras estruturas durante a sua prolongada fase de crescimento,
que ocorreria durante o cultivo in vitro. Entretanto, ainda não há um número suficiente de
experimentos nesta área para comprovar essa suposição (Oktay et al., 1998).
Os oócitos inclusos em FOPA podem ser congelados in situ, isto é, no interior do próprio
tecido ovariano (Cox et. al., 1996) ou após isolamento (Jewgenow et al., 1998). Atualmente, a
criopreservação do córtex ovariano, para a medicina humana, tem sido uma alternativa promissora
para a preservação da fertilidade (Oktay et al., 1998, Newton, 1998). Além da perda natural
(atresia) de FOPA que ocorre in vivo, em humanos, depara-se com os problemas de infertilidade
prematura como resultado do tratamento de certos cânceres, incluindo altas doses quimioterápicas
e irradiação abdominal (Nugent et al., 1997). Portanto, a criopreservação de oócitos poderá ser
uma técnica extremamente necessária para o sucesso da reprodução assistida tanto de humanos
como de animais domésticos ou não. Na medicina humana (Newton, 1998; Newton et al., 1998)
e em animais de laboratório (Cox et al., 1996; Gunasena et al., 1997a,b), os pesquisadores têm
concentrado seus esforços para a criopreservação de FOPA in situ. Esses estudos têm demonstrado
por análise histológica, que FOPA presentes no tecido ovariano após a congelação e descongelação
apresentam-se morfologicamente normais (Hovatta et al., 1996). Dessa forma, o tecido ovariano
congelado, contendo os FOPA, pode ser utilizado posteriormente para transplantes. Camundongas
ovariectomizadas e auto-transplantadas com tecido ovariano fresco ou congelado e descongelado,
apresentaram ciclos estrais regulares pós-transplante em 75 e 80% dos animais, respectivamente
(Harp et al., 1994). Tecido ovariano de sagüis criopreservado também tem sido transplantado
s77
sob a cápsula renal de camundongas imunodeficientes. Nos enxertos recuperados 21 a 32 dias

depois, observaram-se folículos em todos os estádios da foliculogênese, incluindo folículos antrais
de 1 a 2mm de diâmetro (Candy et al., 1995). Resultados similares também foram obtidos por
Hovatta et al. (1996) em humanos, utilizando-se o Dimetilsulfóxido (DMSO) e o Propanodiol
(PROH) como crioprotetores. Cox et al. (1996) demonstraram que ovários fetais congelados e
descongelados quando transplantados recuperaram a fertilidade em camundongas, obtendo de
73 a 86% dos animais gestantes. O transplante para um ambiente diferente do naturalmente
encontrado in vivo pode ser uma alternativa para a constituição de bancos de tecido ovariano
congelado (Newton, 1998). Fragmentos de ovários ovinos (Gosden et al., 1994) e de primatas
não humanos (Candy et al., 1995) enxertados sob a cápsula renal de camundongos
imunodeficientes foram revascularizados, obtendo crescimento folicular. Ademais, folículos
presentes no tecido ovariano humano cresceram até o estádio antral (mais de 5 mm de diâmetro)
após seis semanas de estimulação exógena com FSH (Oktay et al., 1998). Embora, até o momento,
não tenha sido demonstrado que o tecido ovariano criopreservado possa restaurar a fertilidade
em humanos, o nascimento de animais viáveis foi obtido a partir de enxerto de tecido ovariano
congelado e descongelado em camundongos (Gunasena et al., 1997a,b). Em animais domésticos
como os ovinos, a viabilidade folicular também já foi demonstrada através da análise histológica
de tecido ovariano congelado e descongelado (Salle et al., 1998). Baird et al. (1999) realizaram
auto-transplante de tecido ovariano em ovelhas após descongelação e observaram aumento nos
níveis de progesterona quatro semanas após o enxerto. Porém, nessa espécie, os resultados mais
encorajadores foram reportados por Gosden et al. (1994), os quais relataram nascimento após o
transplante de tecido ovariano congelado e descongelado. Recentemente, em humanos, foi relatado
nascimento a partir de tecido ovariano congelado e transplantado (Donnez et al. 2004)
Embora resultados satisfatórios referentes à congelação de tecido ovariano já tenham sido
obtidos em alguns animais como camundongas (Guanasena et al., 1997a,b), coelhas (Daniel et
al., 1983), ovelhas (Gosden et al., 1994) e até mesmo em mulheres (Newton et al., 1998), a
formação de gelo intracelular ainda pode representar em alguns casos, um entrave para o sucesso
da criotecnologia. Em tecido, a formação de gelo intracelular tem mostrado ser muito mais
prevalente e pode ocorrer a uma taxa significativamente maior do que pode ser atingida nas
células em suspensão (Acker & McGann, 1998). A criopreservação de tecido é substancialmente
diferente da criopreservação de células em suspensão, como os FOPA isolados, por exemplo.
Em um tecido organizado, a difusão de água e crioprotetores não é facilitada. Vários tipos celulares
em um tecido desempenham uma contribuição para a função do mesmo. Portanto, a sobrevivência
de cada tipo celular pós-descongelação é extremamente importante (Harp et al., 1994). O tecido
do estroma ovariano é muito rico em células, as quais estão juntamente posicionadas. Portanto,
a formação de gelo no espaço intercelular pode danificar facilmente as células e quebrar a
comunicação intercelular necessária para a integridade do tecido (Sugimoto et al., 1996).
Uma possível alternativa para reduzir as injúrias causadas pela formação de gelo intracelular
seria a congelação de FOPA isolados. No entanto, esse procedimento tem sido estudado apenas
em camundongos e felinos. Utilizando folículos primordiais de camundongos isolados
enzimaticamente, que foram congelados lentamente com DMSO, Carroll et al. (1990) conseguiram
o nascimento de um animal vivo após a fecundação do oócito cultivado in vitro. Em um outro
trabalho, Carroll et al. (1991b) relataram que a criopreservação não afeta o crescimento e o
desenvolvimento do folículo, bem como a habilidade do oócito de retomar a meiose, demonstrando
assim, que é possível estocar um grande número de folículos para o seu subseqüente
desenvolvimento in vitro. Em uma primeira tentativa de congelar FOPA de gatas, Jewgenow et
al. (1998), utilizando um procedimento de congelação lenta, empregando o DMSO, relatou que
apenas cerca de 12% dos folículos que foram congelados, encontravam-se intactos após a
s78
descongelação. Posteriormente, Jewgenow et al. (1998) testaram diferentes crioprotetores (DMSO,

PROH, EG e glicerol) também para a congelação lenta de FOPA felinos e observaram que somente
quando o glicerol foi empregado, houve uma diminuição no número de folículos normais quando
comparado com folículos não congelados (controle). A percentagem de folículos viáveis utilizando
os demais crioprotetores foi similar ao controle. Amorim et al. (2003) realizaram pela primeira
vez a criopreservação de FOPA isolados a partir do tecido ovariano de ovelhas. Esses autores
demonstraram que a viabilidade de folículos primordiais congelados em DMSO ou EG nas
concentrações de 1 e 1,5 M foi similar àquela observada para folículos frescos ou não
criopreservados. FOPA isolados do tecido ovariano caprino também foram criopreservados e
posteriormente cultivados in vitro por 24 h (Rodrigues et al., 2005) ou 5 dias (dados não
publicados) e, mantiveram sua viabilidade compatível com aquela observada em folículos não
criopreservados. Após congelação e descongelação de FOPA isolados, 73 e 70% de folículos
ovinos e caprinos apresentavam-se viáveis, respectivamente. No caso da criopreservação de tecido
ovariano, em ovinos e caprinos, obteve-se respectivamente 47 e 68% de folículos
morfologicamente normais após descongelação.
Estado Atual da Biotécnica de Manipulação in vitro de FOPA
Superada a etapa de desenvolvimento de métodos eficazes para o resgate de FOPA a partir

dos ovários, o grande desafio dos pesquisadores consiste no desenvolvimento de sistemas de
cultivo especiais que proporcionem condições adequadas para o desenvolvimento ótimo de FOPA
in vitro. Em felinos, Jewgenow et al. (1998) relataram o desenvolvimento de FOPA oriundos de
ovários de felídeos domésticos (gata) e silvestres (leoa e tigresa). Em marsupiais, Butcher &
Ullman (1996) mostraram que o FSH teve efeito positivo sobre o crescimento in vitro de FOPA
de gambás sul-americanos. Nas espécies humana (Roy & Treacy, 1993), ovina (Cecconi et al.,
1999), caprina (Huanmin & Yong, 2000) e bovina (McCaffery et al., 2000), FOPA isolados se
desenvolveram in vitro até o estádio antral. Em suínos, folículos secundários crescidos in vitro
chegaram até a ovulação e tiveram seus oócitos fecundados in vitro (HIRAO et al., 1994), com
desenvolvimento até o estágio de blastocisto (WU et al., 2001). Entretanto, a maioria dos trabalhos
referentes ao cultivo de FOPA in vitro foi realizada em animais de laboratório. Em ratos, relatou-
se a produção in vitro de embriões, a partir da fecundação de oócitos oriundos de FOPA cultivados
in vitro (Daniel et al., 1989). Em camundongos, o desenvolvimento in vitro de FOPA foi descrito
por vários autores (Qvist et al., 1990; Carroll et al., 1991a,b). Resultados excelentes foram relatados
por Eppig & Schroeder (1989), que obtiveram o nascimento de camundongos a partir de FOPA
que cresceram, maturaram e foram fecundados in vitro. No ano seguinte, Carroll et al. (1990)
publicaram um artigo que representou um grande marco na biotécnica de MOIFOPA. Esses
autores obtiveram produtos viáveis a partir do desenvolvimento in vitro de FOPA de camundongos
que foram submetidos previamente a procedimentos de congelação e descongelação.
Considerações Finais e Perspectivas
Conforme mostrado anteriormente, a biotécnica de MOIFOPA apresentou um avanço

significativo nos últimos 10 anos. Folículos pré-antrais oriundos de ovários de seres humanos,
animais domésticos, silvestres e de laboratório podem ser isolados e cultivados in vitro em meios
especiais que têm permitido um aumento da taxa de desenvolvimento folicular in vitro. Além
disso, a viabilidade de FOPA oriundos de animais de laboratório (camundongo), felinos, caprinos,
ovinos e bovinos pôde ser preservada após procedimentos de congelação e descongelação.
s79
Atualmente, a biotécnica de MOIFOPA vem sendo utilizada somente em pesquisa

fundamental, não podendo ser utilizada ainda para multiplicação de animais. Entretanto, o rápido
avanço da ciência, associado às facilidades crescentes de trocas de informações entre laboratórios
do mundo inteiro, poderão resultar, no futuro, no desenvolvimento de sistema de cultivo que
permitam um excelente crescimento folicular com a preservação da viabilidade destes folículos.
Isso possibilitará, posteriormente, a utilização de oócitos oriundos da numerosa população de
FOPA isolados e crescidos in vitro, em programas de fecundação in vitro, clonagem e transferência
de embriões, contribuindo a longo prazo para a multiplicação de animais de alto valor zootécnico
e mesmo aqueles em via de extinção. A curto prazo, paralelamente ao estudo de crescimento
folicular in vitro, uma alternativa seria de desenvolver procedimentos de isolamento e congelação
de FOPA in vitro visando-se à utilização futura em sistemas de cultivo que apresentarem condições
ótimas para o completo desenvolvimento folicular in vitro. Futuramente, com a utilização, na
prática, da biotécnica de MOIFOPA, será factível o restabelecimento de populações de animais
ameaçados de extinção a partir de pequenos números de fêmeas.
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NOVO PAPEL DA ANGIOTENSINA II NO MECANISMO DE MATURAÇÃO DE

OÓCITOS, DESENVOLVIMENTO FOLICULAR E OVULAÇÃO EM BOVINOS
Paulo Bayard Dias Gonçalves; Rogério Ferreira; Valério Valdetar Marques Portela;
Bernardo Garziera Gasperin
Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal, Universidade Federal de Santa Maria,

Santa Maria, RS, Brazil. bayard@biorep.ufsm.br
Introdução e considerações básicas
A angiotensina II (Ang II) tem uma importante função na regulação da pressão sangüínea
sistêmica e homeostase dos fluidos. Além dessa conhecida função, há evidências da presença do
sistema renina-angiotensina (RAS) ovariano, incluindo a presença de componentes do RAS no
ovário e mRNA de angiotensinogênio e pró-renina [1;2]. O precursor do RAS angiotensinogênio
é clivado pela renina na ligação leucina-leucina para formar o decapeptídeo angiotensina I (Ang
I) [3]. A enzima conversora de angiotensina (ECA) cliva a Ang I formando a Ang II. A Ang II, um
octapepitideo ativo do RAS, está presente em altas concentrações nos ovários de mamíferos [4-
7], o que sugere uma função ovariana.
A ativação da renina necessita da clivagem de um segmento da pró-renina [8] e parece
ocorrer somente nos rins, uma vez que não é detectada em animais nefrectomizados bilateralmente
[9]. A pró-renina é produzida e secretada principalmente pelos rins, entretanto, há outras fontes
de pró-renina, pois é detectada em machos e fêmeas que sofreram nefrectomia bilateral [9]. As
concentrações de pró-renina no fluido folicular são 100 vezes maiores que as concentrações
plasmáticas [10;11], e estão relacionadas com o número de folículos pré-ovulatórios [12]. Em
mulheres, a concentração plasmática de pró-renina aumenta durante os três dias de aumento de
LH, permanecendo elevada durante a fase luteal e diminuindo concomitante à redução dos níveis
de progesterona [13]. A secreção ovariana de pró-renina é regulada por gonadotrofinas, ocorrendo
um pico nas concentrações de pró-renina 8 horas após o pico ovulatório de LH [14].
Há divergências consideráveis entre estudos no que diz respeito à produção ovariana de
renina. Níveis plasmáticos de renina não aumentam após o pico de LH, nem após administração
de hCG, momento em que as concentrações de pró-renina atingem os níveis mais altos [12]. Em
um estudo com mulher nefrectomizada bilateralmente, a renina não foi detectada no plasma;
entretanto, níveis de pró-renina aumentaram antes do aumento de progesterona, concomitante ao
aumento de LH e estradiol [15]. A renina está aumentada na fase luteal de mulheres com ciclo
menstrual normal. Estes achados sugerem que a pró-renina é secretada em resposta ao LH ou
hCG, enquanto a renina é secretada pelos rins em resposta a progesterona luteal [16]. Formas
incompletas de pró-renina produzidas pela ação de peptidases têm demonstrado uma atividade
“semelhante à renina” [17]. Mulheres com ciclo menstrual normal apresentam atividade
semelhante à renina mais elevada no fluido folicular do que no plasma, sugerindo uma produção
local desta proteína. Em um modelo in vitro usando ovários perfundidos de coelhas, a atividade
semelhante à renina aumenta 2 a 4 horas após exposição ao hCG [18], sugerindo que as
gonadotrofinas desempenham uma função importante na regulação da atividade de renina.
O angiotensinogênio é expresso no fígado e em alguns outros tecidos incluindo os ovários.
Durante a exposição à dexametasona ou 17-etinilestradiol ocorre um aumento nos níveis hepáticos
s85
de mRNA de angiotensinogênio, sugerindo uma possível regulação ovariana [2]. A ECA apresenta
diferentes níveis de atividade em diferentes tecidos [19]. Em ovários de ratas, a ECA foi
identificada em veias do epitélio germinativo ao redor do corpo lúteo e nas células da granulosa
de alguns folículos [20]. A regulação da ECA nas células endoteliais é controlada pelo acúmulo
de AMPc [21], sugerindo que esta enzima pode ser controlada por gonadotrofinas. Entretanto, a
ECA não apresenta uma variação cíclica durante o ciclo estral [22].
Há muitos fatores que evidenciam uma produção ovariana de Ang II. Animais tratados
com hCG demonstram concentrações mais altas de Ang II no fluido folicular em comparação ao
plasma, sugerindo produção local desse peptídeo [18]. Husain et al. [4] detectaram altos níveis
ovarianos de Ang II em animais nefrectomizados bilateralmente. Alguns trabalhos demonstram
um aumento de Ang II no fluido folicular após o pico ovulatório de gonadotrofinas. Yoshimura
et al. [18] verificaram um aumento na secreção folicular de Ang II após administração de hCG
em ovários de coelhas perfundidos in vitro. Este aumento parece estar relacionado com o aumento
da atividade intrafolicular da renina. Em bovinos, foi demonstrado in vivo, através de um sistema
de microdiálise, um aumento nas concentrações de Ang II no fluido folicular após o pico de LH
[23].
Os receptores da Ang II foram descritos nas células da teca e granulosa de ratas e coelhas
[24] e nas células da teca em vacas e macacas [25;26]. Com base nas diferentes propriedades
farmacológicas e bioquímicas, os receptores Ang II foram classificados em dois subtipos [27;28].
O receptor AT1 tem sido demonstrado mediando um número de funções bem conhecidas da Ang
II como contração de musculatura lisa, síntese e secreção de aldosterona e angiogênese. Já o
receptor AT2 é responsável por efeitos opostos ao receptor AT1 e por mediar funções reprodutivas
como esteroidogênese, maturação de oócitos e ovulação em algumas espécies.
Papel da Ang II na maturação de oócitos
Os oócitos permanecem em estádio de vesícula germinativa (VG) durante o desenvolvimento

folicular até próximo da ovulação. In vitro, os oócitos reiniciam a meiose espontaneamente e
progridem até o estádio de metáfase II (MII) quando são removidos de seus folículos e cultivados
sob condições adequadas. Entretanto, células da teca (mas não da granulosa) são capazes de
manter oócitos bovinos em estádio de VG quando cultivados in vitro [29;30]. Por outro lado,
fisiologicamente, a maturação meiótica dos oócitos bovinos ocorre dentro do folículo, levantando
o questionamento a respeito do envolvimento de sinal(is) positivo(s) que induzam ao reinicio da
meiose in vivo. Quando oócitos bovinos são cultivados diretamente com Ang II ou saralasina
(antagonista dos receptores de Ang II), não há efeito na maturação. Entretanto, em oócitos
cultivados com células foliculares, a Ang II reverte o efeito inibitório das células da teca
promovendo a maturação nuclear do oócito bovino; inibindo ou estimulando a produção de
algumas substâncias pelas células da teca [30]. Em folículos bovinos, receptores de Ang II foram
detectados principalmente nas células da teca e em menor quantidade nas células da granulosa
[26;31;32]; isto explica porque o efeito da Ang II ocorreu somente quando as células foliculares
estavam presente no sistema de cultivo de oócitos. A Ang II também reverteu a inibição da
maturação nuclear in vitro causada pelo meio que estava condicionado com células foliculares.
O mecanismo pelo qual a Ang II reverte o efeito inibitório das células foliculares requer estudos
mais aprofundados. No entanto, parece que a Ang II é um dos fatores positivos envolvidos na
maturação de oócitos bovinos.
s86
Em diversos estudos, condições e meios utilizados para maturação de oócitos, fertilização

e desenvolvimento embrionário têm sido modificados para melhorar a produção in vitro de
embriões (PIV). Entretanto, as taxas de blastocisto, prenhez e criopreservação obtidas a partir de
oócitos maturados e fertilizados in vitro são inferiores às obtidas nos sistemas de produção in
vivo [33;34], provavelmente devido a incompleta maturação citoplasmática do oócito que reflete
na capacidade de desenvolvimento embrionário subseqüente. In vivo, a maturação meiótica do
oócito ocorre próxima à ovulação, quando o folículo atinge seu diâmetro folicular máximo,
entretanto, in vitro, a maturação meiótica inicia imediatamente após a remoção do oócito do
interior do folículo. Os oócitos utilizados na PIV geralmente são aspirados do interior de folículos
com diâmetro entre 3 e 8 mm, antes da divergência folicular. Sendo assim, nosso grupo
desenvolveu um estudo para mimetizar as condições fisiológicas do folículo para a maturação
do oócito, usando células foliculares e hormônios que agem no crescimento folicular final.
Portanto, foi utilizado um sistema de cultivo com células foliculares e Ang II e esse peptídeo em
combinação com IGF-1 ou insulina, para que a maturação do oócito ocorresse em um ambiente
mais próximo ao fisiológico. Complexos cumulus-oócito (CCOs) foram cultivados em meio de
maturação por 1 h (1 + 23 h), 12 h (12 + 12 h) ou 24 h na presença de células foliculares e
respectivos hormônios e durante o período complementar na ausência de células foliculares até
completar as 24 h. Quando foram cultivados os CCOs no sistema 12 + 12 h, na presença de Ang
II e IGF-1 ocorreu um aumento nas taxas de clivagem e, especialmente, nas taxas de blastocisto
e número total de eclosão. Além disso, nós demonstramos que, nesse sistema, a presença de LH
e FSH não influencia os resultados de maturação nuclear [35].
Papel da Ang II na Ovulação e Desenvolvimento Folicular
Diversas evidências sugerem que o RAS tem um importante papel no processo de ovulação
em bovinos. Estudos in vitro têm demonstrado que a Ang II atua como mediador na ovulação
induzida por gonadotrofinas em coelhas [36;37] e ratas [38]. Em bovinos, a presença de receptores
de Ang II nas células foliculares [26;31;32] e o aumento nas concentrações de Ang II após o pico
de LH [23] sugerem uma atividade biológica desse peptídeo nesta espécie. Recentemente, nosso
grupo demonstrou que a Ang II atua como mediador na ovulação induzida por gonadotrofinas
em bovinos [39]. Foi adaptado um modelo in vivo o qual permite estudar o papel da Ang II na
ovulação, injetando antagonistas dos receptores de Ang II em folículos pré-ovulatórios. Esse
modelo in vivo possibilita estudos em diversas áreas da reprodução sem alterar o crescimento
follicular e a fisiologia da ovulação. Nestes estudos, as vacas receberam injeções intrafoliculares
de acordo com cada tratamento quando os folículos atingiram um diâmetro mínimo de 12 mm, e
foram desafiadas com uma aplicação IM de análogo do GnRH. A aplicação intrafolicular de 100
ì M de saralasina (inibidor dos receptores de Ang II) bloqueou a ovulação somente antes do
estro, portanto, antes do pico de LH (14.3% e 83.3% das vacas ovularam nos grupos saralasina e
controle, respectivamente). O pico ovulatório de LH ocorre cerca de uma hora após o início do
estro e a Ang II aumenta no fluido folicular após este acontecimento. Uma vez que a Ang II se
liga aos seus receptores e inicia o mecanismo de ovulação, não há efeito da saralasina na taxa de
ovulação o que explica porque a inibição da Ang II não bloqueia a ovulação após o início do
estro. Baseado nesses resultados, outro experimento foi conduzido para determinar o momento
em que a Ang II desempenha seu papel na ovulação. A saralasina bloqueou a ovulação somente
quando aplicada no momento e 6 horas após o tratamento com análogo do GnRH, mas não
quando este inibidor foi administrado 12 horas após o GnRH. As concentrações de Ang II
s87
permanecem elevadas durante todo o processo de ovulação [23]; entretanto, nossos resultados
demonstraram que a Ang II desempenha uma função fundamental somente no início do mecanismo
de ovulação em bovinos.
Yoshimura et al. [37] induziram a ovulação com Ang II na ausência de gonadotrofinas em
um modelo utilizando ovários de coelhas perfundidos in vitro. Estes dados mostram que a Ang II
participa como iniciador do processo de ovulação induzido por gonadotrofinas. Em ovários de
coelhas perfundidos, as concentrações de Ang II no fluido folicular aumentam quatro horas após
exposição à gonadotrofinas, isto provavelmente ocorre devido a um aumento na atividade
intrafolicular de renina [18]. Essas descobertas estão de acordo com nossos resultados, nos quais
foi observado um bloqueio parcial da ovulação quando a Ang II foi inibida 6 horas após a injeção
de análogo do GnRH.
Para determinar qual subtipo de receptor de Ang II está envolvido na ovulação induzida
por LH, uma injeção intrafolicular de losartan (antagonista dos receptores AT1), PD123,319
(antagonista AT2), losartan+PD123,319 ou solução salina foi realizada no momento em que as
vacas foram desafiadas com análogo de GnRH. A ovulação foi inibida pela aplicação de PD123,319
e losartan+PD123,319, mas não pela aplicação de losartan ou solução salina. Portanto, a injeção
intraflicular do antagonista AT2 PD123,319 bloqueou a ovulação independente da presença do
antagonista do receptor AT1 losartan, mostrando que somente o receptor AT2 desempenha uma
função indispensável no processo de ovulação. Schauser et al. [32] observaram um aumento na
expressão de receptor AT2 em folículos pré-ovulatórios, sugerindo uma participação deste receptor
nos estádios finais de crescimento e ovulação destes folículos.
Tem sido demonstrado que a Ang II aumenta as concentrações de prostaglandina em folículos
pré-ovulatórios [23], e que a ovulação é inibida quando receptores de Ang II são bloqueados [39-
41]. A Ang II pode atuar diminuindo a secreção de inibidores do ativador do plasminogênio (PA)
[42;43], portanto melhorando o remodelamento da matriz extracelular. Há evidência de que o PA
pode desempenhar funções no desenvolvimento de pequenos folículos antrais. A expressão do
PA se altera durante o crescimento folicular de bovinos, assim como ocorre com a expressão de
um inibidor específico do PA das células da granulosa, a protease nexin-1 (PN-1).
Não houvve diferença na expressão de receptor AT1 nas células da teca e da granulosa entre
folículos estrogênicos e não-estrogênicos. Da mesma forma, não houve alterações na expressão
de receptor AT2 nas células da teca de acordo com a viabilidade do folículo. Entretanto, os níveis
de mRNA do receptor AT2 foram significativamente mais elevados nas células da granulosa de
folículos estrogênicos em comparação aos não-estrogênicos e a quantidade de mRNA de receptor
AT2 apresentou uma correlação positiva com as concentrações de E2 no fluido folicular [44].
Esses dados demonstram uma possível função da Ang II no controle do crescimento folicular via
receptor AT2. A adição de Ang II em células da granulosa tratadas com FSH ou IGF não teve
efeito na secreção de E2. A Ang II inibiu significativamente os níveis de mRNA de PN-1 e
secreção de proteína de células tratadas com FSH mas não teve efeito sobre células tratadas com
IGF [44].
Conclusão
A Ang II desempenha importantes funções na maturação de oócitos, desenvolvimento

folicular e ovulação. A Ang II reverte o efeito inibitório de células foliculares na maturação
nuclear de oócitos bovinos e o IGF-1 potencializa sua ação, resultando em uma melhora na
maturação citoplasmática de oócitos, com uma conseqüente maior taxa de desenvolvimento
s88
embrionário. A Ang II desempenha uma função indispensável no início do mecanismo de ovulação

em bovinos via receptor AT2. Níveis de mRNA de receptor AT2, mas não de AT1, são regulados
durante o crescimento folicular em bovinos, e a Ang II regula a expressão e a secreção de PN-1
da granulosa.
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CONFERÊNCIAS
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Acta Scientiae
poli-ovulatórias: do feto à fertilização. Veterinariae
Acta Scientiae 34(Suplemento
Veterinariae. 1): 2006
34 (Supl 1): 95-114.
DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM ESPÉCIES MONO E POLI-

OVULATÓRIAS: DO FETO À FERTILIZAÇÃO
R. Webb1, K. Dugan, R. L. Quinn, A. Fouladi-Nashta-Nashta2 and M.G. Hunter
School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough,

Leicestershire, LE12 5RD, UK
Resumo
O fator mais importante na determinação da eficiência reprodutiva é a taxa de ovulação, sendo

esta seguramente controlada por ambas as maneiras: dentre e entre as espécies. Em ambas as
espécies mono- ovulatórias e poli- ovulatórias os mecanismos que controlam a taxa de ovulação
e o contínuo crescimento folicular envolvem a relação entre os fatores de crescimento produzidos
localmente e os fatores extra- foliculares, incluindo as gonadotrofinas e os hormônios metabólicos.
Em ambas as espécies mono e poli- ovulatórias, as gonadotrofinas não estão provavelmente
envolvidas no início do crescimento folicular. No entanto, elas podem influenciar os estágios
pré- antrais de crescimento folicular e são claramente requeridas nos estágios mais tardios de
desenvolvimento de folículos antrais. O FSH é o principal hormônio que controla o crescimento
folicular em ambas as espécies mono e poli- ovulatórias e a sua secreção é em contrapartida
controlada através dos principais productos secretados por folículo(s) dominante(s), como o
estradiol e inibina. Fatores de crescimento locais, como IGFs e BMPs, são expressos durante o
desenvolvimento folicular em as ambas espécies, mono e poli ovulatórias e interagem com
outros fatores de crescimento e com gonadotrofinas para estimular o desenvolvimento. Na medida
que o folículo se torna dominante, há também uma transferência de dependência do FSH para o
LH. Adicionalmente as interações parácrinas dentre os folículos, em ambas as espécies mono e
poli- ovulatórias, os oócitos, e seu desenvolvimento potencial, podem ser influenciados por outros
fatores como a nutrição. A qualidade do oócito é importante já que influenciará na fertilização
e no subsequente potencial de produzir embriões viáveis, o que é essencial para a manutenção do
tamanho das ninhadas em espécies poli- ovulatórias e na prenhez de espécies mono-ovulatórias.
Concluindo, muitos mecanismos de controle locais são bastante similares entre espécies poli e
mono-ovulatórias. No entanto, existem diferenças importantes e futuras pesquisas devem ter
como objetivo a elucidação destas diferenças e a identificação de novos fatores de crescimento
assim como seu papel fisiológico em controlar o desenvolvimento folicular e a maturação.
Introdução
Em muitas espécies mamíferas o crescimento do folículo primordial, uma vez iniciado,

continua até que o folículo entre em atresia ou ovule. Na verdade a grande maioria dos folículos
(<0.1%) nunca ovula, chegando a atresia ou regredindo. O mecanismo preciso que controla o
início e o número de folículos primordiais que iniciam o crescimento e evitam a regressão estão
ainda sendo investigados. Estudos de enxertos ovarianos em espécies mono e poli-ovulatórias
têm confirmado que são necessários 3 meses para que um folículo primordial chegue ao estágio
pré- ovulatório(Baird et al., 1999; Hunter et al., 2004a).
Em ambas as espécies mono e poli-ovulatórias, este contínuo crescimento folicular é
controlado por ambas as (retirar) gonadotrofinas e fatores de crescimento produzidos localmente,
existindo uma interação entre estes fatores. A importância relativa destes fatores também varia
s95
com o estágio de desenvolvimento e com o número de fatores ambientais, assim como a nutrição,
também influenciando no desenvolvimento folicular (Webb et al., 2003, 2004; Hunter et al.,
2004b).
A taxa de ovulação é o fator determinante na eficiência reprodutiva e é seguramente
controlada de ambas as maneiras dentre e entre as espécies. Os mecanismos que controlam a
taxa de ovulação também envolvem a relação fatores de crescimento produzidos localmente e
fatores extra- foliculares incluindo as gonadotrofinas e os hormônios metabólicos (GH, insulina,
IGF-1).
Esta revisão focará as interações entre gonadotrofinas e fatores intra-foliculares no
desenvolvimento folicular e na taxa de ovulação. Uma vez que o folículo é o veículo para o
oócito, fatores que influenciam a qualidade do oócito e a sobrevivência embrionária também
serão discutidos. Para uma abordagem mais profunda dentro dos mecanismos envolvidos serão
feitas comparações entre espécies mono-ovulatórias, como as vacas, e espécies poli-ovulatórias,
como as porcas.
Gonadotrofinas e outros fatores extra- ovarianos
Em ambas as espécies mono e poli-ovulatórias, as gonadotrofinas não estão provavelmente

envolvidas no início do crescimento folicular. No entanto, elas podem influenciar os estágios
iniciais de crescimento folicular (Driancourt et al., 1995, Miller et al., 1999; Webb et al., 2003,
2004), sendo claramente necessárias nos estágios mais avançados de desenvolvimento folicular.
O FSH é o principal hormônio no controle do crescimento folicular em ambas as espécies mono
e poli-ovulatórias, sendo sua secreção em contrapartida controlada através dos principais produtos
secretados por folículo(s) dominante(s) grandes(s), como o estradiol e a inibina A. Em ovelhas e
vacas a emergência das ondas foliculares é precedida por um aumento transitório de FSH (Webb
et al., 2003), e ao redor do momento da seleção folicular as células da granulosa adquirem
receptores para LH, os quais são essenciais para o desenvolvimento mais adiante (Campbell et
al., 1995; Webb et al., 2003). Ocorre então uma diminuição no FSH, devido a uma retro-
alimentação negativa do estradiol e da inibina, encontrando-se abaixo do nível necessário para a
seleção folicular, no entanto o(s) folículo(s) dominante(s) passa(m) a depender do LH para
favorecer a continuação do crescimento (Webb et al., 2003).
Este modelo também parece ser aplicável em suínos (Lucy et al., 2001), de maneira que as
concentrações plasmáticas de FSH estão elevadas no momento do recrutamento folicular.
Similarmente, há uma troca de dependência do FSH para o LH na medida em que os folículos se
tornam maduros e as concentrações de FSH diminuem (Lucy et al., 2001). Ao contrário das
espécies mono-ovulatórias, o suíno tem uma fase folicular prolongada, provavelmente devido
ao fato de que durante a fase luteal os folículos não se desenvolvem com a mesma magnitude na
qual ocorre nas ovelhas e nas vacas. Por esta razão, a existência de uma fase folicular mais
prolongada é necessária para a maturação dos folículos, até que cheguem ao tamanho pré-
ovulatório (Hunter et al., 2004b). A importância relativa de ambos FSH e LH nos diferentes
estágios de desenvolvimento folicular têm sido investigada em ambas as espécies mono e poli-
ovulatórias. Em suínos, quando as concentrações de gonadotrofinas são reduzidas por meio de
tratamento com agonistas de GnRH, os folículos não crescem além de ~4mm de diâmetro (Miller
et al., 1999), no entanto o crescimento folicular pode ser reiniciado pela administração de FSH
(Miller et al., 1999; Picton et al., 1999b). Similarmente, em ovelhas e vacas, o tratamento com
agonistas de GnRH também inibe o crescimento folicular. Por exemplo, em vacas, os folículos
crescem apenas até ~8mm em diâmetro quando a pulsatilidade de liberação do LH é inibida
(Gong et al., 1996) e apenas até ~4mm quando a concentração periférica de FSH é reduzida,
s96
além da inibição dos pulsos de LH (Gong et al., 1996). Os achados de que o FSH sozinho pode
induzir o crescimento folicular até o tamanho de folículo pre-ovulatório em ambos suínos e
vacas (Picton et al., 1999b; Garverick et al., 2002) indicam que a troca em relação à dependência
ao LH pode ser superada, se a concentração de FSH permanecer alta o suficiente, embora a
funcionalidade do corpo lúteo possa ser comprometida (Webb et al., 2003, 2004).
Diferenças genéticas marcantes quanto às taxas de ovulação têm sido encontradas em
diferentes raças de ovelhas e estas raças proporcionam um forte instrumento para a elucidação
dos mecanismos que controlam a taxa de ovulação. Nas ovelhas FecB, que carregam um simples
ponto de mutação no domínio quinase intracelular do gene da BMPR-1B, os folículos tornam-se
maduros ao atingirem diâmetros menores em relação àqueles que não carregam esta mutação
(Juengel et al. 2004). Eles também passam por uma diferenciação precoce das células da granulosa
com a expressão de receptores para LH, com respostas aumentadas ao cAMP e com aumento na
expressão da aromatase e dos genes Ba da inibina (McNatty et al., 1986; Campbell et al., 1998,
Webb et al., 1999). Similarmente, nas células da teca há uma diferenciação precoce dos receptores
de LH e da 17alfa-hidroxilase. No entanto, os folículos de ovelhas que possuem o FecB,
secretam coletivamente quantidades similares de estradiol, androstenediona e de inibina A,
assim como os não carreadores, resultando em concentrações similares de FSH. Campbell et al.
(2003) em um estudo recente in vivo, confirmou que a mutação Booroola age primeiramente no
ovário, de maneira que as ovelhas que possuem a mutação do gene FecB são capazes de ovular
mais folículos do que as não carreadoras do gene, independente de receberem infusões com
concentrações idênticas e padrões de FSH e LH.
Uma interessante inferência sobre a prolificidade das raças de ovelhas é o porco Chinês
Meishan, o qual é caracterizado por uma ninhada maior quando comparado às raças do Oeste
(Haley and Lee, 1993), devido a uma maior taxa de ovulação combinada a um aumento nos
níveis de sobrevivência embrionária (Wilmut et al., 1992). A secreção de gonadotrofinas na
Meishan mostrou-se menos sensitiva à retro-alimentação negativa da inibina e do estradiol
(Tilton et al., 1994; Hunter et al., 1996) com folículos ovulando ao atingerem tamanhos menores
e exibindo outras características de diferenciação precoce, como o aumento da atividade da
aromatase e da resposta do AMPcíclico à estimulação de gonadotrofinas (Tilton et al., 1994;
Miller et al., 1998; Hunter and Picton, 1999). O paralelo sobre a precocidade dos folículos entre
ovelhas e porcas prolíferas sugere que mecanismos desconhecidos podem ser similares entre as
espécies. Quando raças suínas do Oeste foram selecionadas para altas taxas de ovulação, elas
freqüentemente mostraram elevadas concentrações de FSH (Kelly et al., 1988; Knox and
Zimmerman, 1993; Knox et al., 2003). O aumento nas taxas de ovulação destes animais, como
para as ovelhas, também podem ter ocorrido devido à seleção de um maior número de folículos
durante um período de tempo prolongado para a fase folicular. Outros fatores extra-foliculares
que afetam a função reprodutiva incluem os hormônios metabólicos clássicos (ex: insulina) e
uma gama de hormônios de crescimento.
Fatores locais de crescimento
Durante as duas últimas décadas toda uma gama de fatores de crescimento tem sido
identificada, incluindo EGF, TGFα, TGFβ e FGFs. No entanto, os dois fatores de crescimento
mais intensivamente estudados (da família dos fatores de crescimento) são os fatores de
crescimento ligados a insulina (IGFs) e os fatores ósseos morfogenéticos (BMPs). Com isto,
esta revisão tem se centrado nos possíveis papéis destas duas famílias de fatores de crescimento
nas espécies mono e poli-ovulatórias, bem como nas interações de uma com outra e com os
fatores extra- ovarianos com as gonadotrofinas.
s97
Fatores de Crescimento Ligados à Insulina
Em um estudo recente em vacas, Armstrong et al., (2002) demonstraram que as células da

granulosa de folículos pré-antrais em bovinos expressam RNAms codificando IGFBP-2 e o
receptor de IGF tipo 1. A teca externa de folículos antrais e o estroma tecidual ao redor dos
folículos pré-antrais mostraram-se como sítios de expressão do RNAm da IGFBP-3 e a IGF-II
foi detectada na camada de células da teca de folículos antrais de bovinos (Yuan et al., 1998;
Armstrong et al., 2000). Desta maneira, as IGFs controlam o crescimento de folículos pré-antrais
primariamente através de mecanismos endócrinos, com as IGFBP-2 e -3 regulando a
biodisponibilidade do IGF-I extra-ovariano. Por exemplo, a IGF-1 também tem mostrado estimular
o crescimento de folículo pré-antral em bovinos in vitro (Gutierrez et al., 2000). Contrariamente,
o IGF-II, possivelmente derivado de folículos antrais adjacentes, estimula a esteroidogênese de
células da teca em bovinos, agindo através dos receptores IGF tipo 1 (Spicer et al., 2004). Desta
maneira, IGF-II, assim como IGF-1, podem talvez terem um papel significativo na esteroidogênese
das células da teca durante o desenvolvimento folicular em espécies mono-ovulatórias. Nos
folículos antrais em vacas, a expressão do gene IGF-II é restrita a teca dos folículos antrais
(Armstrong et al., 2000), apoiando o fato de que IGF-II é a mais importante IGF intra- ovariana
em espécies mono- ovulatórias.
As ações das IGF-I e II são reguladas por uma gama de proteínas de ligação de IGF,
localmente produzidas (Webb et al., 1999, 2003, 2004). Existem seis IGFBPs (1-6) principais,
no entanto, modificações pós-tradução destas IGFBPs resultam na produção de pelo menos 51
isoformas de IGFBP (Nicholas et al., 2002), embora o papel fisiológico destas isoformas não
seja conhecido. Em folículos antrais sadios de bovinos com até 9 mm de diâmetro, o tamanho
aproximado no qual os receptores para LH nas células da granulosa podem ser encontrados, a
expressão de RNAm das IGFBP-2 e –4 é restrita aos tecidos da granulosa e teca respectivamente
(Armstrong et al., 1998). A conversão do folículo subordinado a um futuro folículo dominante
em vacas tem sido associada com à diminuição na IGFBP-2 (Kojima et al., 2003) e com o
aparecimento de receptores de LH nas células da granulosa (Webb et al., 2003). Além disso, as
concentrações de IGFBP-2, e possivelmente a IGFBP-4 e –5, as quais são maiores em fluido
folicular de folículos antrais de tamanho pequeno e médio, são significativamente reduzidas ou
não detectadas no fluido folicular de folículos grandes e/ou de folículos dominantes (Nicholas et
al., 2002). Esta redução nas concentrações de IGFBP-2 e -4 em fluido folicular, acoplada a um
aumento nas concentrações de estradiol, tem sido associada à seleção de folículo dominante em
vacas (Mihm et al., 2000).
As IGFs também influenciam o desenvolvimento folicular de suínos poli-ovulatórios. Por
exemplo, Cosgrove et al. (1992) observaram um aumento no crescimento folicular em porcas
realimentadas, o que foi associado a maiores concentrações de IGF-I e de insulina, indicando
que o aumento na responsividade do ovário ao LH foi devido ao seu efeito nos hormônios
metabólicos. Similarmente, concentrações reduzidas de IGF-I estão associadas com taxas de
ovulação reduzidas (Cosgrove et al., 1992; Quesnel et al., 1998). As IGFs são também expressas
localmente dentro do folículo de suínos, sendo a IGF-I expressa predominantemente dentro das
células da granulosa de folículos de 2-8 mm (Yuan et al., 1996). RNAm de receptores de IGF
tipo I foram expressos constitutivamente em folículos de 2-8mm (Liu et al., 2000), sugerindo
que IGFI e os receptores de IGF tipo I são requeridos para todas as fases do crescimento pré-
ovulatório. A expressão da IGF-II, no entanto foi elevada nas células da teca de folículos de
~6mm e permaneceram altas até depois do pico do LH, indicando o papel do IGF-II na ovulação
e ou na luteinização em suínos. De acordo com Liu et al. (2000), a expressão de IGFBP-2 em
s98
folículos de suínos é inversamente correlacionada ao diâmetro dos folículos, sugerindo que o

potencial de ação do IGF em folículos maiores é aumentado assim que o folículo cresce.
Interações entre IGFs e outros fatores
Estas mudanças reguladas na expressão dos padrões de IGFs estão provavelmente associadas
à ação das gonadotrofinas. Utilizando-se um sistema de cultivo fisiologicamente relevante
(Gutierrez et al., 1997a), demonstrou-se que o FSH pode induzir a produção de estradiol pelas
células da granulosa em bovinos e que esta indução está relacionada a um aumento na expressão
do RNAm da aromatase P450 (Silva and Price, 2001). Além disso, tem sido demonstrado que a
IGF-1 assim como a insulina, interagem com o FSH no estímulo da produção de estradiol pelas
células da granulosa (Gutierrez et al., 1997a). Da mesma maneira, utilizando um sistema de
cultivo fisiologicamente relevante para células da granulosa de suínos, Picton et al. (1999a)
mostraram que o complexo da enzima aromatase, e conseqüentemente a produção do estradiol,
foi mantida na presença da insulina, IGF-I e FSH. A luteinização das células de suínos através
do cultivo com soro ou com altas concentrações de FSH inibiram a expressão da aromatase e
aumentaram a expressão da enzima que cliva a cadeia lateral do colesterol (scc).
Concluindo, em ambas espécies mono e poli-ovulatórias, o desenvolvimento dos folículos
no estágio de antro até a ovulação é controlado por interações entre gonadotrofinas e IGFs. Até o
presente momento, as evidências sugerem que IGFs produzidas localmente dentro dos folículos,
como as IGF-II em vacas, IGF-I e IGF-II em porcas, além da IGF-1 que pode se originar de
fontes extra-ovarianas, como o fígado, são reguladas em parte por influências nutricionais. É
também bem conhecido que esses fatores podem influenciar a taxa de ovulação. No entanto,além
das IGFs uma série de outros fatores localmente produzidos como as BMPs também possuem
um papel no controle do desenvolvimento folicular e da taxa de ovulação.
Proteínas ósseas morfogenéticas
As BMPs são membros da super-família TGFβ e agem como citocinas multifuncionais

capazes de regularem a proliferação celular, diferenciação, morfogênese e apoptose. Atualmente,
existem aproximadamente 20 BMPs conhecidas, incluindo membros da família dos fatores de
crescimento, de diferenciação(GDF) e o hormônio anti- Mülleriano (AMH), resultando de suas
altas homologias no que diz respeito às suas sequências com as BMPs (Yamashita et al. 1996).
Dentre esses fatores, muitos são expressos dentro dos ovários de mamíferos, incluindo BMP-4,
-6, -7, -15 (GDF-9B) e GDF-9 (Shimasaki et al. 1999; Otsuka et al. 2000; Erickson & Shimasaki,
2003).
As BMPs exercem seus efeitos através dos receptores para BMP (BMPR-IA, -IB e -II). Em
suínos a imunohistoquímica para esses receptores mostrou a presença de todos os três receptores
nos ninhos de ovos fetais, nos oócitos e nas camadas de células da granulosa de folículos
abrangendo desde os folículos primordiais até estágios antrais finais (Quinn et al., 2004; Figura
1). Alguma imunocoloração também tem sido observada na camada da teca, do corpo lúteo e na
superfície epitelial do ovário (Quinn et al., 2004). O padrão de expressão é similar para todos os
3 receptores, apresentando expressão das BMPRs em ovários de fetos suínos, sendo possivelmente
relacionados a formação de folículos. No entanto, a expressão em animais pré e pós púberes
sugere um papel na regulação do crescimento folicular no ovário de suínos. Em um estudo
subseqüente em suínos, a expressão da proteína BMP-2 foi identificada nos oócitos, através de
Western blotting, no fluido folicular e em menor magnitude nas células da granulosa (Brankin et
al., 2005a). GDF-9 foi também identificado nos oócitos assim como a BMP-15 onde o RNAm
s99
foi localizado através de hibridização in situ exclusivamente para oócito(Quinn et al., 2002),
sendo consistente com os dados para as espécies mono- ovulatórias.
Figure 1. Immunohistochemical localization of the BMP receptor 1A in porcine A) fetal ovary;

B) preantral follicle and C) antral follicle. PF, primordial follicle; EN, egg nests; OS,
surface epithelium; O, oocyte; G, granulosa cellsa; T, theca cells. Scale bars =100µm.
Adapted from Quinn et al., 2004.
Pela primeria vez, a BMP-6 e os receptores IA, IB e II para BMP, têm se mostrado presentes
em ovários de fetos bovinos a partir do segundo ao nono mês de gestação (Dugan et al., 2004;
Fouladi-Nashta et al., 2005), com um padrão similar de expressão do RNAm em ovelhas (Juengle
et al., 2006). Padrões similares de expressão foram observados para BMPR-IB e BMPR-II em
ovários fetais. Uma fraca expressão foi observada para BMPR-IA no primeiro trimestre, tornando-
se mais intensa no segundo e no terceiro trimestre. Esses achados estão em concordância com os
achados de Souza et al. (2002), os quais demonstraram uma forte expressão de BMPR-IA, BMPR-
IB e BMPR-II no oócito e na camada de células da granulosa do folículo de ovinos a partir do
estágio primordial até os estágios pré- ovulatórios, com uma imunocoloração mais fraca observada
nas células da teca. Oócitos bovinos em todos os estágios de desenvolvimento também mostraram
uma coloração intensa de BMPR-IB e BMPR-II, mas uma coloração fraca de BMPR-IA (Fouladi-
Nashta et al., 2005). Durante o desenvolvimento ovariano fetal, um grau de coloração de moderado
a intenso nas células da granulosa e de maneira geral uma intensa expressão de BMPR-IB e –II
foi detectada. Assim como em suínos, a presença do ligante (BMP-6) e receptores em estágios
mais iniciais, ilustram a presença de todos os componentes de um sistema completamente funcional
nos estágios iniciais de desenvolvimento. A expressão da BMP-6 parece estar localizada no
oócito, com observações visuais indicando que a intensidade da coloração aumenta com a idade
do feto, e também nas células da granulosa a partir dos 6 meses de gestação.
Estudos de localização também têm sido realizados em ovários de ovelhas adultas (Souza
et al., 2002) e de vacas (Glister et al., 2004), e os resultados destes estudos mostram que parece
haver um sistema funcional para BMP dentro dos ovários assim como nos suínos. Essas BMPs
incluem BMP-4 a qual tem sido localizada nas células da teca no ovário de bovinos (Glister et
al., 2004), embora Juengal et al., (2006) não conseguiram demonstrar a expressão de RNAm de
BMP-2, -4 e –7 em folículos de ovinos em concordância com estudos de imuno-localização em
folículos de fetos bovinos (Dugan et al., 2004). BMP-6 tem se mostrado abundante em ambos os
oócitos e células da granulosa em folículos de fetos bovinos (Glister et al., 2004, Dugan et al.,
2004).
Interações entre BMPs e outros fatores
Os efeitos das BMP- 2, -6 e –15 na função das células da granulosa em suínos e suas
potenciais interações com FSH e IGF-I também têm sido investigados (Brankin et al., 2005a;
s100
Hunter et al., 2005). As BMPs utilizadas in vitro suprimem significativamente a produção de

progesterona ( Figura 2). Interações significativas também foram demonstradas entre ambas
BMP- 2, -6 e IGF-1 na produção de progesterona. BMP- 2, -6 e –15 também modificam a
síntese de estradiol. BMP-2 e –6 mostraram interações com ambos IGF-I e FSH, enquanto
BMP-15 interage apenas com o FSH.
a) 3.0
BM P P<0.001
log progeste rone production BM P*IGF-1 P<0.001
se d
(pg/1000cells/48h)
2.0
1.0
0 3 30 100
b) 1.5
BM P P=0.244
sed
log oestra diol production
BM P*IGF-1 P<0.001
(pg/1000cells/48h)
1.0
0.5
0 3 30 100
c) 300 BM P P<0.001
se d
me an via ble gra nulosa ce ll
BMP*IGF-1 P<0.05
numbe r (x 1000)
200
100
0
0 3 30 100
BM P-6 dose (ng/ml)
Figure 2. The effect of BMP-6 on (a) mean (± sed) log10 progesterone production by porcine
granulosa cells, (b) mean (± sed) log10 oestradiol production by porcine granulosa cells
and (c) mean viable porcine granulosa cell number after 144 hours in serum free culture
in the absence (F) and presence (J) of 100ng/ml LR3 IGF-1. Values are from 3
independent cultures.
s101
Ambas as BMP-2 e BMP-6 também aumentam o número de células viáveis. Esses resultados
demonstram que as BMPs interagem com outros fatores intra e extra- ovarianos como o IGF-I
and FSH na regulação da função e proliferação das células da granulosa em suínos.
Nós também temos mostrado que a BMP-2 e a BMP-6 diminui a expressão da proteína
(3β-HSD) 3β-hidroxiesteróide desidrogenase e da proteína esteroidogênica aguda reguladora
(StAR; apenas BMP-6 ; Brankin et al., 2005a) em cultivo de células da granulosa de suínos. A
produção de AMPc, monofosfato de adenosina cíclica foi significativamente suprimida em ambas
as células da teca e da granulosa, e mais adiante a ativa fosforilada BMPR- reguladora de
sinalização da mólecula Smad-1 (p-Smad-1) foi regulada em células tratadas com BMP (R.L.
Quinn & M. G. Hunter, observações não publicadas, Figura 3). Esses achados proporcionam
evidência da presença de um mecanismo de sinalização complexo em ovários de suínos, assim
como para espécies mono- ovulatórias (Knight and Glister, 2006) e suporta a hipótese de que,
BMP-2 e BMP-6 agem de maneira parácrina no controle da função de células da granulosa, no
qual um dos aspectos seria a inibição da luteinização.
figura webb deficil de capturar
Figure 3. Western blot analyses of phosphorylated Smad-1 protein (pSmad-1) expression by

porcine granulosa cells after (a) 4 hours and (b) 48 hours of culture under serum free
conditions supplemented with 100ng/ml LR3 IGF-1 and 1ng/ml FSH and either 0ng/
ml (control) or 30ng/ml BMP-6. The images in figures (a) and (b) represent the
immunoblots (n=3). The graphs represent the densitometric analysis of the immunoblot
(n=9 for each BMP treatment). Molecular weight is indicated to the left of each blot.
s102
As células da teca de suínos têm sido também investigadas na medida que elas expressam
receptores para BMP (Quinn et al. 2004). Todas as BMPs investigadas (2, 6 e 15) estimularam a
proliferação de células in vitro (Brankin et al., 2005). A síntese de progesterona e estradiol foi
suprimida pela BMP-2 e –6, após 48 horas em cultivo, embora interessantemente foi estimulada
pela BMP-15. A produção de androstenediona é aumentada pela BMP-15 e pela BMP-2 na
presença de IGF-I, mas suprimida pela BMP-6 na presença de LH. Em geral, uma gama de
BMPs parecem suprimir a produção de esteróides e interações têm sido observadas entre BMPs
e ambos IGF-I e LH (Brankin et al., 2005b).
Experimentos têm sido também conduzidos para determinar se as respostas da BMP nas
células da teca são afetadas pela adição de células da granulosa ao sistema de cultivo, mimetizando
de maneira mais próxima a situação fisiológica. A síntese de progesterona e de androstenediona
por co-cultivo de células da teca e de células da granulosa, foram suprimidas enquanto que a
proliferação foi estimulada (Brankin et al. 2005b). Adicionalmente, uma modificação significativa
na resposta de ambas as células da granulosa e células da teca às BMPs ocorre quando as células
são co- cultivadas com 5 oócitos/gota comparado à BMPs ou oócitos sozinhos; indicando um
complexo círculo de retroalimentação envolvendo BMPs, oócitos e células somáticas. Todos
estes resultados proporcionam uma forte evidência sobre a funcionalidade do sistema BMP no
ovário de suínos, o qual interage com outros fatores de crescimento produzidos localmente e
gonadotrofinas, mostrando que as BMPs modulam a função das células somáticas e
conseqüentemente o desenvolvimento folicular.
Funcionalmente, em espécies mono-ovulatórias, a BMP-4 tem mostrado aumentar a
produção de FSH estimulado por estradiol em ovelhas (Campbell et al., 2004) e a BMP-2 tem
um efeito similar a BMP-4 no ovário de ovinos(Souza et al., 2002; Campbell et al., 2004).
Estudos funcionais têm mostrado que a BMP-6 age nas células da granulosa de bovinos
aumentando a secreção de estradiol enquanto suprimindo a produção de progesterona (Glister et
al., 2004), o que sugere um papel no atraso da atresia de folículos antrais grandes. Este trabalho
também demonstrou uma interação entre BMPs e outros fatores locais sinalizando que BMP-4,
-6 e –7 aumentam a secreção basal e as secreções induzida por IGF de estradiol, inibina-A,
ativina-A e folistatina. Mais recentemente foi publicado trabalho envolvendo a ação das BMP-
2, -4 e –6 em ovelhas com mutação FecB (Booroola, Campbell et al., 2006), a qual leva a um
aumento nas taxas de ovulação e nascimentos múltiplos em ovelhas. Assim como a confirmação
da expressão da BMP-6 em ambos os carreadores e não carreadores, os resultados demonstram
um papel fundamental das BMPs nas espécies mono- ovulatórias em modular as respostas
proliferativas e de diferenciação nas células da teca e da granulosa às gonadotrofinas. Estes
resultados também demonstraram uma interação significativa entre BMPs e IGFs (Campbell et
al., 2006), como também demonstraram os resultados da mutação FecB no aumento das respostas
de diferenciação de ambas as células da granulosa e da teca às BMPs, IGFs and gonadotrofinas.
Além do gene FecB em ovelhas, estudos genéticos em ovelhas Inverdale (FecXI) têm
identificado um ponto de mutação no gene da BMP-15 (Galloway et al., 2000), o qual afeta o
desenvolvimento folicular e a taxa de ovulação. Ovelhas heterozigóticas aumentaram a taxa de
ovulação enquanto ovelhas homozigóticas apresentaram ovários pequenos e não funcionais, sendo
inférteis (Hanrahan, 2003). Mais recentemente, pontos de mutações da BMP-15 foram
identificados em Belclare (FecXB) e em Cambridge (FecXC), novamente, apesar do ponto no
qual a mutação ocorre, ser dependente da raça, eles todos exibem o mesmo fenótipo ligado ao X
(Hanrahan et al., 2004). De maneira completamente contrária a ovelha com a mutação BMP-15,
camundongos homozogóticos e BMP-15 knockout permanecem capazes de produzir ninhadas,
apesar da fertilidade diminuída. Esta subfertilidade parece ser causada por uma falha na liberação
s103
de oócitos dos folículos e reduzidas taxas de fertilização e não pela diminuição no número de
folículos pré- ovulatórios (Yan et al., 2001). Baseando-se nestes estudos que investigam o
fenótipo de camundongos transgênicos super- expressando folistatina (Guo et al., 1998; Otsuka
et al., 2001), tem sido sugerido que a perda da função da BMP-15 em camundongos mutantes,
assim como em ovelhas monozigóticas, poderia ser atribuída à super- expressão de folistatina.
Conseqüentemente, a neutralização de BMP-15 pelo excesso de folistatina, pode contribuir em
parte para a parada no desenvolvimento folicular durante o estágio de desenvolvimento pré-
antral. Achados mais recentes descritos por Glister et al.,(2004), colocam a folistatina como
uma potencial moduladora da ação da BMP no ovário. Estes estudos, de maneira conjunta,
demonstram que a folistatina pode ser um fator extremamente importante na regulação das BMPs
dentro do ovário.
Maiores evidências quanto a importância da BMP-15 no desenvolvimento folicular foram
levantadas por Juengel et al. (2002), os quais imunizaram ovelhas contra a BMP-15. Este
estudo concluiu que a imunização contra BMP-15 afetou a taxa de ovulação e ou a função luteal.
Além disso, os achados destes autores suportam a idéia de que BMP-15 tem papéis biológicos
diferentes em mamíferos com baixas taxas versus altas taxas de ovulação e que em mamíferos
com fenótipo de baixa taxa de ovulação, a BMP-15 é essencial para o desenvolvimento folicular
ovariano normal. Hanrahan et al. (2004), em um estudo mais recente, descobriu novas mutações
para BMP-15. Carreadores heterozigóticos dessas mutações (FecXG and FecXB) mostram um
aumento na taxa de ovulação similar ao encontrado nas ovelhas de raças, Inverdale (FecXI) e
Hanna (FecXH)).
De maneira geral, esses estudos demonstram um papel para BMP-15 em ambas as espécies
mono- e poli- ovulatórias. No entanto, estudos envolvendo o papel preciso da BMP-15 no
desenvolvimento folicular ovariano em bovino e suíno são escassos. Utilizando hibridização in
situ o RNAm da BMP-15 foi recentemente localizado em pequenos folículos pré-antrais de
bovino e suíno (K Dugan, D G Armstrong; R Webb, observação não publicada; Quinn et al.,
2002). No entanto, mais trabalhos são necessários para confirmação da localização da proteína
BMP-15 nesses tecidos, para identificar mutações específicas nessas espécies, e também para
determinar os padrões temporais de expressão durante o desenvolvimento folicular.
Fatores afetando a qualidade do oócito
A comunicação oócito e célula somática é bi-dimensional (Brankin et al., 2003, 2004) e

essencial para ambas as funções do oócito e das células foliculares da granulosa e da teca , bem
como para o desenvolvimento das mesmas, como discutido acima. No entanto, além das interações
parácrinas dentro do folículo de ambas as espécies mono e poli-ovulatórias o oócito e seu potencial
de desenvolvimento pode também ser influenciado por fatores adicionais como o consumo de
nutrientes.
Em espécies poli- ovulatórias, nós temos demonstrado que a alimentação de porcas com
um alto plano de nutrição durante 19 dias antes da ovulação aumenta a qualidade dos oócitos
comparada aos animais controle alimentados com uma dieta de manutenção, como determinado
pela maturação do oócito in vitro (Ferguson et al., 2003; Hunter et al., 2005). Isto foi associado
a um número de mudanças nos hormônios reprodutivos e metabólicos circulantes e também no
fluido folicular no qual o oócito é nutrido. Por exemplo, aumento no consumo de alimentação
não foi apenas associado a um aumento na proporção de oócitos em metáfase II, como também
no aumento do número de pulsos de LH, reduzindo as concentrações circulantes de estradiol e
progesterona, e aumentando as concentrações de IGF-I e de leptina.
s104
Além da quantidade, a composição da dieta consumida antes do acasalamento também

afeta a maturação oocitária e a sobrevivência prenatal. Estudos em suínos envolvendo alterações
no conteúdo de proteína, amido ou fibras da dieta do pré-acasalamento, mostraram que
aumentando-se o conteúdo de fibra antes do acasalamento, obtem-se uma melhora na
sobrevivência embrionária (Ferguson et al., 2006). Uma série de estudos foram então conduzidos
examinando os efeitos de uma dieta rica em fibras antes do acasalamento nas características
reprodutivas em suínos. Uma maior quantidade de oócitos recuperados no Dia 19 de porcas que
receberam uma dieta rica em fibras, encontravam-se em metáfase II após 46 horas de cultivo em
meio contendo 10% do seu próprio fluido folicular. Porcas alimentadas com tais dietas também
apresentaram 18% a mais de sobrevivência embrionária nos Dias 27-29 de gestação, quando
comparado às porcas alimentadas do grupo controle (Ferguson et al. 2006). Isto proporciona a
primeira evidência da ligação direta entre maturidade oocitária e sobrevivência embrionária em
porcas. Este regime de alimentação alcançou um benefício médio próximo de um leitão extra
por leitegada quando testada em porcas multíparas em um ambiente comercial (Ferguson et al.
2004). Mais recentemente estudos, acessando a qualidade dos oócitos, através da sua habilidade
em originar blastocistos viáveis in vitro, revelaram maior rendimento em blastocisto e em número
de células de blastocistos nos Dias 6-7 após a fertilização in vitro de oócitos coletados de porcas
alimentadas com dieta rica, a base de fibras, quando comparadas aos animais controle (Ashworth
et al. 2006). Coletivamente, estes achados indicam que os regimes nutricionais que aumentam a
sobrevivência embrionária são também associados aos efeitos benéficos na maturidade e qualidade
oocitária, suportando a idéia de que a viabilidade embrionária origina-se durante o
desenvolvimento oocitário.
Em espécies mono- ovulatórias, como as vacas de alta produção leiteira, o status metabólico
dos animais, por exemplo, balanço energético negativo no pós- parto, afeta uma variedade de
hormônios circulantes e de fatores de crescimento como GH, IGF-I, insulina, leptina, cortisol e
tiroxina (Webb et al., 2004). Existe um aumento nas evidências que associam a diminuição da
fertilidade das vacas de leite ao balanço energético negativo pós- parto e a reduzidas concentrações
de IGF-I e de insulina (Beam and Butler, 1999; Butler, 2000). O início da primeria ovulação
pós- parto é atrasado em vacas de leite selecionadas por alto mérito genético em relação ao
rendimento na produção de leite e isto tem também mostrado estar associado com uma menor
concentração de insulina (Butler, 2000).
Dietas especificamente designadas ao aumento das concentrações de insulina circulante
durante a fase inicial de lactação, podem adiantar a primeira ovulação pós parto(Gong et al.,
2002) e também estimular o desenvolvimento folicular em novilhas(Gutierrez et al. 1997b),
evidenciando o papel da insulina no estímulo do desenvolvimento folicular. Por exemplo, a
insulina que tem sido repetidamente citada como estimuladora da proliferação e esteroidogênese
das células da teca e da granulosa(Campbell et al. 1995, Duleba et al. 1997) é rotineiramente
incluída nos meios de cultivo de tecido e de célula. O papel da insulina na maturação oocitária
tem sido descrito, mas parece não ter efeito na taxa de fertilização ou no desenvolvimento
subsequente (Stubbings et al.1990). Em vacas, o RNAm codificando o receptor para insulina
tem sido detectado em todos os estágios embrionários a partir de um zigoto de uma célula até o
estágio de desenvolvimento de blastocisto(Schultz et al., 1992). Um trabalho recente de nosso
laboratório analisou os efeitos da insulina durante o cultivo de folículo antral na qualidade do
oócito e desenvolvimento, como também nas IGFBPs. Foi mostrado que, em folículos maiores
(>4mm) a adição de insulina eliminava IGFBP-2 and –5 no fluido folicular (Fouladi-Nashta-
Nashta and Campbell, 2006). Isto é importante, na medida que essas proteínas de ligação aumentam
durante a atresia folicualr havendo um efeito direto na qualidade do oócito bovino (Nicholas et
al., 2005).
s105
Em vacas, o IGF-1 estimula a proliferação e a mitogênese de células da granulosa,

aumentando a esteroidogênese induzida por FSH através das células da granulosa (Gutierrez et
al. 1997a). Recentemente, a injeção intra- ovariana de IGF-I aumentou a produção de blastocisto
e a expressão de RNAm transportador de glicose 1(Glut-1) e a iniciação do fator-1 A (eIF1A) de
tradução eucariótica à níveis encontrados em embriões produzidos por vacas adultas (Oropeza et
al., 2004), e quando adicionadas a um meio de maturação melhorou o potencial de
desenvolvimento dos oócitos(Moreira et al., 2002). No entanto, mudanças nutricionalmente
induzidas na circulação e nas concentrações locais de IGF-1, as quais são adequadas para o
crescimento folicular podem não necessariamente ser ótimas para a maturação de oócito bovino
(Armstrong et al. 2003). Na realidade, altas concentrações de IGF-1 podem ter um efeito negativo
no crescimento do oócito (McCaffery et al., 2000), o que pode ser uma razão para a expressão de
IGFBPs nos folículos.
A expressão de uma proteína de ligação folicular, IGFBP-5, é particularmente interessante
na medida que não encontra-se presente universalmente durante o período de seleção folicular
em vacas (entre o Dia 0 e o Dia 2 da primeira onda folicular), mas é altamente regulada na
maioria dos folículos subordinados no dia 5. Ela parece estar presente em altas quantidades
apenas durante o período no qual esses folículos estão iniciando o processo de atresia (Donadeu
et al., 2002). Nós recentemente mostramos altas correlações entre as concentrações baixas de
IGFBPs em fluido folicular, atividade da enzima caspase-3 ( um marcador de atresia) nas células
da granulosa e na qualidade e desenvolvimento oocitário (Nicholas et al., 2005; veja Figura 4).
90
80
70
60 r = 0.57
Caspase-3 p<0.0001
50
activity
(DF/min/mg) 40
30
20
10
0
0 5 10 15
[IGFBP-4/5] (mmOD)
Figure 4. Scatter plots showing the relationship between caspase-3 activity in granulosa cell
homogenates and IGFBP-4/5 levels in follicular fluid. Caspase-3 activities (DF/min/
mg) and IGFBP-4/5 (29-31 kDa) quantities (mmOD) were determined from isolated
follicles from synchronised heifers. The results were compared by scatter plot, showing
a regression line of best fit, and found to be highly significant (p<0.001). After Nicholas
et al. 2005.
s106
Sinais endócrinos e metabólicos que regulam o crescimento folicular podem também

influenciar o desenvolvimento do oócito através de mudanças nas concentrações de hormônios/
fatores de crescimento no fluido folicular ou via interação granulosa-oócito (Webb et al., 1999;
Leese, 2003). Por exemplo, assim como a regulação do crescimento folicular (Gutierrez et al.,
1997b), mudanças por um curto período no consumo de dietas energéticas influenciam a
morfologia do oócito e o potencial de desenvolvimento (McEvoy et al., 1995; O’Callaghan et
al., 1999, 2000), com a gordura sendo uma fonte de energia (ex: ésteres de glicerídeo de ácidos
graxos). A dieta gordurosa influencia a função reprodutiva aumentando o balanço energético ou
através das ações nos processos reprodutivos que não estão relacionados a energia. A
suplementação de rações com gordura, aumenta a concentração de energia na dieta, podendo
resultar em um aumento no consumo de energia e no status energético da vaca (Staples & Thatcher,
2005; Thatcher et al., 2006). Nós e outros colaboradores também demonstramos que os ácidos
graxos podem talvez influenciar o potencial do desenvolvimento oocitário em vacas de leite de
alta produção (Fouladi-Nashta-Nashta et al., 2004; Thatcher et al., 2006).
Resumindo, em ambas as espécies mono e poli-ovulatórias, a nutrição afeta os fatores
extra- ovarianos como: IGF-I, insulina, leptina e LH. A nutrição tem também um efeito direto no
compartimento folicular, alterando padrões de crescimento e qualidade de oócito. A qualidade
do oócito vai subseqüentemente influenciar a fertilização e o potencial do oócito em produzir
um embrião viável, essencial para a manutenção do tamanho da ninhada em espécies poli-
ovulatórias e a gestação em espécies mono- ovulatórias.
Conclusões
Tem se tornado cada vez mais óbvio, que em ambas as espécies mono ovulatórias e poli-
ovulatórias, para que um folículo se desenvolva, do estágio primordial tornando-se dominante e
então ovulando um oócito de boa qualidade para a fertilização é necessário o envolvimento de
uma gama de fatores locais (Figura 5). É uma relação entre estes fatores foliculares extra-ovarianos
e fatores produzidos localmente, tendo ações autócrinas, parácrinas e endócrinas, que determinam
o contínuo desenvolvimento do folículo, o número de folículos que vão ovular e a competência
no desenvolvimento do oócito ovulado. Uma comparação dos sistemas que controlam o
crescimento folicular e o desenvolvimento entre as espécies mono e poli-ovulatórias revelam
muitas similaridades (Figura 5), mas com algumas diferenças espécie específicas. Apenas
aumentando o entendimento de ambas as diferenças e o preciso papel desses fatores, é que uma
melhoria será atingida na eficiência reprodutiva em ambas as espécies mono e poli-ovulatórias.
No entanto, recentes progressos em nosso entendimento sobre alguns destes mecanismos têm
resultado no desenvolvimento de regimes nutricionais com melhora na qualidade de oócito,
tamanho da ninhada e taxa de gestação. É muito provável que este progresso continuará, na
medida em que fatores específicos adicionais forem identificados e os mecanismos precisos
através dos quais esses fatores controlam o desenvolvimento folicular e taxa de ovulação forem
elucidados.
s107
Action of oocyte secreted factors (OSF)
Figure 5. Diagrammatic representation of the regulation of follicle function and oocyte secreted
factors in mono-ovulatory and poly-ovulatory species. They all secrete a range of factors
from the oocyte, including GDF-9, BMP-15 and BMP-6 which can inhibit
androstenedione (A4) and progesterone (P4) production. A large blue arrow represents
the interaction between the oocyte secreted factors and granulosa cells. A second blue
arrow represents the interaction between theca and granulosa cell. A growth factor
having such an effect will include IGF-II. In addition steroids, including oestradiol,
also have positive effects on follicle development. After Webb et al., 2003; Brankin et
al., 2003, 2005a.
Acknowledgements
Muitos dos trabalhos de autores citados foram gentilmente financiados pela BBSRC e
Defra.
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2006 34 (Supl 1): 115-130.
AVANÇOS NA MATURAÇÃO OVOCITÁRIA EM BOVINOS
Margot Alves Nunes Dode
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia PqB Final W5 Norte, Brasília, DF 70770-900

Telefone: (61) 3340 3459; Fax: (61)33403657; margot@cenargen.embrapa.br
Resumo
A maturação envolve mudanças nucleares, citoplasmáticas e moleculares que conferem ao

ovócito a capacidade de se desenvolver ao estágio de blastocito, sendo um processo chave na
produção in vitro de embriões. Apesar dos avanços obtidos nos últimos anos no sistema de
produção in vitro de embriões bovinos, a percentagem de embriões produzidos de ovócitos
maturados in vitro ainda é inferior àqueles maturados in vivo. Vários fatores afetam o sucesso da
maturação in vitro, dentre eles a presença das células do cumulus e as condições de cultivo tem
destacada importância. Entretanto, o fator mais importante em determinar o destino final do
ovócito é a sua competência para o desenvolvimento. Em que momento ocorre à aquisição dessa
competência e qual o mecanismo responsável, ainda não são conhecidos. Estudos indicam que
a competência está determinada pela composição e quantidade de transcritos, que são estocados
durante o crescimento e fase final da foliculogênese. Portanto, a diferença entre ovócitos
competentes e incompetentes se deve a expressão diferenciada de genes. Somente pela
identificação e avaliação funcional de genes associados à competência, será possível desvendar
os mecanismos envolvidos na sua aquisição. Esse conhecimento possibilitará a definição de
sistemas mais eficientes, para aumentar a disponibilidade de ovócitos com capacidade de
desenvolvimento e, otimizar a utilização das técnicas de reprodução assistida. Palavras chaves:
ovócito, maturação, competência, expressão gênica.
Introdução
A maturação de ovócitos é um procedimento chave na produção in vitro de embriões (PIV),

visto que as demais etapas do processo dependem da quantidade de ovócitos maturos e com
potencial de desenvolvimento (Dieleman et al., 2002). Portanto, o sucesso tanto da PIV como de
várias técnicas de reprodução assistida dependem, basicamente, da disponibilidade de uma
população uniforme e competente de ovócitos imaturos para serem utilizados na maturação in
vitro.
Mesmo após a rigorosa seleção de ovócitos, a taxa de produção de embriões viáveis é
menor em ovócitos maturados in vitro do que naqueles produzidos in vivo (Van de Leemput et
al., 1999; Takagi et al., 2001; Rizos et al., 2002). Portanto, pode-se supor que a maturação ainda
é um fator limitante na PIV, e que apesar de milhares de produtos terem sido produzidos a partir
de ovócitos imaturos em bovinos, os eventos fisiológicos que ocorrem durante a maturação são
pouco conhecidos.
Inúmeras evidências têm sido apresentadas nos últimos anos indicando que o potencial de
desenvolvimento de embriões in vitro, depende da qualidade dos ovócitos dos quais se originam
(Sirard et al., 2003, Lonergan et al., 2003, Rodriguez & Farin, 2004), sendo que essa qualidade
afeta não só o desenvolvimento embrionário, mas também a prenhez e o desenvolvimento fetal
s115
posterior (Krisher, 2004). A maioria dos ovócitos proveniente de folículos antrais é capaz de
completar a maturação nuclear, mas somente os competentes têm a capacidade de ter
desenvolvimento embrionário normal (Sirard et al., 2006). Os mecanismos que controlam a
aquisição dessa competência têm sido extensivamente estudados, e as pesquisas nessa área estão
sendo progressivamente direcionadas para uma abordagem mais molecular, na tentativa de elucidar
esses mecanismos.
Essa revisão aborda alguns aspectos celulares e moleculares da maturação ovocitária e
aquisição da competência, que afetam a capacidade do ovócito de sustentar o desenvolvimento
embrionário.
Maturação Ovocitária
Durante a ovogênese, os ovócitos de mamíferos permanecem retidos no estágio de diplóteno

da prófase da primeira divisão meiótica, desde a vida fetal até pouco antes da ovulação (Wassarman
& Albertini, 1994). A retomada da meiose pode ser mediada por um estímulo hormonal in vivo,
em resposta ao pico pré-ovulatório de LH, ou pela retirada do ovócito de dentro do folículo.
Sendo o período da maturação o estágio final da preparação do ovócito para a fecundação.
Somente ovócitos competentes têm a capacidade de sofrer a maturação completa. Essa
competência é progressivamente adquirida durante os estágios finais da foliculogênese, através
de várias mudanças celulares e moleculares que conferem ao ovócito a capacidade de completar
a divisão meiótica, garantir uma fecundação monospérmica, descondensar a cabeça do
espermatozóide, transpor a transição materno-zigótica (MZT) e prosseguir o seu desenvolvimento
(Coticchio et al., 2004). Portanto, quando um ovócito imaturo é removido do folículo ele deve
ser capaz de sofrer não só a maturação nuclear e citoplasmática, mas também a maturação
molecular. A maturação molecular, apesar de ser um componente da citoplasmática (Sirard, 2001),
pode ser abordada separadamente devido a sua complexidade .
Os eventos nucleares que ocorrem durante a maturação envolvem a reorganização da rede
de microtúbulos, rompimento do envoltório nuclear, condensação dos cromossomos e progressão
da meiose para metáfase I, anáfase I, telófase I, expulsão do primeiro corpúsculo polar e retenção
no estágio de metáfase II (Cha & Chian, 1998). A programação da maturação nuclear no ovócito
é automaticamente ativada após a sua remoção do folículo (Sirard et al., 2006). Os ovócitos que
atingem o seu crescimento total completam a maturação nuclear, mesmo na ausência de qualquer
agente estimulador como, por exemplo, as gonadotrofinas (Dode & Adona, 2001; Ali & Sirard,
2005). A retomada da meiose induz a inativação da transcrição e imediatamente limita o programa
molecular do ovócito requerido para passar a MZT. Portanto, ações para modificar o programa
molecular do ovócito devem ocorrer antes do rompimento da vesícula germinativa (GVBD).
O primeiro indicativo de mudança citoplasmática é a compactação do nucléolo, sugerindo
a diminuição e/ou perda da atividade transcricional (Fair et al., 1995; Hyttell et al., 1997). Ainda
durante a maturação, ocorrem mudanças na organização do citoplasma tais como um contínuo
desenvolvimento dos estoques de lipídios, redução do aparelho de Golgi, redistribuição de
ribossomos, rearranjo das mitocôndrias, e alinhamento dos grânulos corticais próximo à membrana
plasmática (Hyttell et al., 1997). Portanto, a maturação citoplasmática está associada com as
mudanças celulares que permitem que a fecundação ocorra com sucesso.
Um aspecto importante durante o crescimento do ovócito é seu alto grau de atividade
transcricional, refletindo a importância do acúmulo de proteínas e RNAm de origem materna, os
quais são necessários não só para o crescimento e maturação mas, especialmente, para o
desenvolvimento embrionário inicial (Song & Wessel, 2005). Em mamíferos superiores, o ovócito
s116
precisa acumular, durante a foliculogênese, todos os fatores maternos necessário para sustentar a
maturação e o desenvolvimento até a ativação do genoma embrionário. Em bovinos a retomada
da meiose induz a perda da capacidade de transcrição, e apesar de haver uma pequena atividade
transcricional no estágio de 1-2 células (Viuff et al., 1996), o aumento substancial nessa atividade
só ocorre no estágio de 8-16 células (Memili & First, 2000). A formação desse estoque de RNAm
e proteínas de origem materna, que confere ao ovócito o programa molecular necessário para a
MZT, se refere à maturação molecular.
Tendo em vista que ovócitos maturados in vitro apresentam menores taxas de blastocisto
após a fecundação e o cultivo in vitro quando comparados aos in vivo (Takagi et al., 2001; Rizos
et al., 2002), pode-se presumir que o baixo desenvolvimento embrionário se deve a deficiência
do ovócito seja na maturação nuclear, citoplasmática ou na molecular. Vários fatores podem
afetar o sucesso da maturação ovocitária, entre eles pode-se destacar a morfologia do complexo
cumulus-ovócito (CCO), as condições de maturação e a competência do ovócito.
Papel das Células do Cumulus
A associação íntima entre células do cumulus e o ovócito é um requisito básico para o

crescimento folicular e ovocitário, para a aquisição da competência e para a coordenação da
maturação nuclear e citoplasmática (Vozzi et al., 2001; Fair, 2003; Rodriguez & Farin, 2004; Ali
et al., 2005).
O crescimento e desenvolvimento das células somáticas e das célula germinativas que
formam o folículo ovariano, é altamente coordenado e mutuamente dependente (Gilchrist et al.,
2004). Essas células formam uma unidade funcional consistindo de contato físico, mediado por
junções gap, e por sinais parácrinos, sendo essa comunicação bi-direcional (Albertini & Barrett,
2003; Gandolfi et al., 2005). Sinais parácrinos secretados pelo ovócito regulam a função folicular,
sendo que os principais são os fatores da superfamília TGF-â, particularmente GDF9, GDF-9B
(BMP-15) (Vanderhyden et al., 2003; Gilchrist et al., 2004). As células somáticas, por sua vez,
também regulam o ovócito através de secreção de fatores tais como kit ligand, esterol ativador
da meiose (MAS) e peptídeos semelhantes ao EGF (Byskov et al., 1997; Albertini & Barret,
2003; Gilchrist et al., 2004; Conti et al., 2006; Wang et al., 2006).
À medida que o folículo cresce e o antro é formado, as células da granulosa se separam em
dois subtipos anatomicamente distintos, as células do cumulus que são íntima e metabolicamente
ligadas ao ovócito, e as células murais, que formam a parede do folículo (Gilchrist et al., 2004).
As células do cumulus são altamente especializadas e tem projeções celulares que atravessam a
zona pelúcida e formam pequenas junções com o citoplasma (gap). Essas junções são formadas
por proteínas, as conexinas, que são classificadas de acordo com seu peso molecular (Rodriguez
& Farin, 2004), e cuja expressão em bovinos varia com o estágio de desenvolvimento folicular
(Fair, 2003). Sendo que a conexina 43 (Cx43) é a mais abundante no ovário e seu estado de
fosforilização é o que determina a permeabilidade e condutibilidade das junções gap (Sela-
Abramovich et al., 2006). Essas junções permitem a transferência, direta para o ovócito, de
moléculas de pequeno peso molecular tais como íons, metabólitos, nucleotídeos e aminoácidos
que são necessários para o seu crescimento, assim como pequenas moléculas reguladoras como
o AMPc (Thomas et al., 2004; Gandolfi et al., 2005). Enquanto que, moléculas maiores, são
transferidas também por essas junções, mas de forma indireta, ou seja, após se ligarem a seus
receptores celulares.
Além de ter um papel importante na manutenção dos ovócitos em estágio de VG (Thomas
et al., 2004) e na indução da retomada da meiose (Vozzi et al., 2001), o contato funcional entre
s117
células do cumulus e ovócitos durante a maturação é essencial para expressão da total competência
ovocitária (Vozzi et al., 2001; Ali et al., 2005). Visto que, a presença de um inibidor das junções
gap, durante o período inicial da maturação, causa uma diminuição drástica na taxa de blastocisto
em bovinos (Ali et al., 2005). Além disso, as células do cumulus, que permanecem em contato
com os ovócitos, são fundamentais para a regulação da repressão transcricional necessária em
ovócitos pré-ovulatórios (De La Fuente, 2006).
Papel das Condições de Cultivo
Além das características morfológicas, as condições de cultivo também afetam o sucesso

da maturação in vitro. A presença de hormônios, substâncias antioxidantes, fatores de crescimento,
temperatura, atmosfera gasosa, tipo de suplemento protéico, e densidade (número de estruturas
por volume de meio) são alguns dos fatores que influenciam a maturação (Shi et al., 1998;
Khurana & Niemann, 2000; Watson et al., 2000; Dode & Graves, 2002; Dode & Graves, 2003;
Beker-van Woudenberg et al. 2004; Livingston et al., 2004; Oyamada & Fukui, 2004; Dalvit et
al., 2005).
Entretanto, mesmo que modificações no meio de maturação possam afetar a produção de
blastocistos in vitro, os benefícios obtidos com essas modificações são geralmente modestos e
mesmo nos melhores resultados, aproximadamente metade dos ovócitos ainda falha em atingir o
estágio de blastocisto. Os efeitos mais marcantes na maturação, quando o meio é modificado,
são observados quando os ovócitos são ou não expostos às gonadotrofinas.
O papel do LH in vivo é estimular a retomada da meiose, devido à indução da hiper-
fosforilização da Cx43 que compõem as junções gap, causando com isso o fechamento dessas
junções (Pant et al., 2005). Com a perda de comunicação entre essas células, cessa o suprimento
de AMPc das células do cumulus para o ovócito, resultando em uma diminuição de sua
concentração intra-ovocitária. (Sela-Abramovich et al., 2006). O LH age nas células somáticas,
e seu efeito parece ser mediado por fatores de crescimento semelhantes ao EGF como a epiregulina,
anfiregulina e beta-celulina (Conti et al., 2006). Apesar da controvérsia, estudos tem mostrado
que a GVBD ocorre após a perda de certo grau da funcionalidade das junções gap (Sutovsky et
al., 1993; Thomas et al., 2004), mesmo assim é possível que outros efeitos possam estar envolvidos
na diminuição do AMPc intra-ovocitário, e na retomada da meiose in vivo.
In vitro, a retirada do ovócito de dentro do folículo induz a maturação espontânea (Bevers
& Izadyar, 2002). A remoção da influência inibitória imposta pelo ambiente folicular causa uma
diminuição do AMPc intra-ovocitário, que pode ocorrer passivamente ou por ativação da
fosfodiesterase A3 presente no citoplasma do ovócito (Conti et al. 1998; Richard et al. 2001),
causando a retomada da meiose.
Em contraste, quando o FSH está presente ele se liga ao seu receptor nas células do cumulus
aumentando o AMPc, que é transmitido para o ovócito através de junções gap (Webb et al.,
2002) e ativa dois tipos de proteínas kinase A (PKA) I e II. A PKA I, causa um aumento
temporário dos níveis de AMPc no ovócito, prevenindo a GVBD (Rodriguez & Farin, 2004). A
ativação da PKA II, por outro lado, resulta na transcrição de genes necessários para o início da
maturação. Entretanto, a PKC também tem sido apontada como tendo papel importante na
transdução do sinal do FSH, especialmente, no que se refere aos processos de transcrição e
tradução que são requeridos para a fase estimulatória da GVBD mediada pelas gonadotrofinas in
vitro (Ali & Sirard, 2005). É possível que a inibição temporária da retomada da meiose seja
essencial para que esses processos ocorram, e com isso a presença do FSH melhore o potencial
de desenvolvimento dos ovócitos. O que pode ser comprovado pelo fato do FSH ser necessário
s118
somente nas primeiras horas da maturação in vitro (Ali & Sirard, 2005). Portanto, in vitro, o
FSH e não o LH é o hormônio chave para a maturação ovocitária.
Além das gonadotrofinas outros hormônios têm sido utilizados durante a maturação de
ovócitos bovinos com resultados similares aos obtidos com a presença de FSH. O EGF é utilizado
rotineiramente em alguns laboratórios em substituição às gonadotrofinas, e seu efeito na expansão
da células do cumulus (Lonergan et al., 1996), na maturação (Lonergan et al. 1996; Oyamada et
al., 2004) e no desenvolvimento embrionário (Watson et al., 2000, Oyamada et al., 2004), tem
sido relatado. Entretanto, o envolvimento do EGF, e de outros fatores que fazem parte da grande
família do EGF, na maturação não está bem claro (Dekel, 2005).
Da mesma forma, o GH adicionado no meio de maturação, acelera a GVBD, induz a
expansão das células (Izardyar et al., 1996), melhora a maturação citoplasmática (Izadyar et al.,
1998b) e aumenta as taxas de blastocisto (Izadyar et al., 1996). A adição de GH no meio de
maturação provoca uma diminuição significativa nas junções gap e uma menor expressão da
Cx43 (Kolle et al., 2003), sugerindo que o efeito do GH em acelerar a meiose se deve a mudanças
na comunicação intercelular, agindo nas células do cumulus (Kolle et al., 2003). Apesar de ação
do GH e do FSH depender do AMPc, o efeito parece ser diferente no que se refere a acelerar a
retomada da meiose, e ao grau de expansão das células do cumulus (Bevers & Izadyar 2002).
Mesmo assim, ambos melhoraram as taxas de blastocisto in vitro (Izadyar et al., 1998a).
A presença de RNAm para receptor de GH, assim como a presença do próprio hormônio
tem sido demonstrado nas células da granulosa, do cumulus e em ovócitos de folículos antrais
médios (Izardyar et al., 1997; Kolle et al., 1998). Entretanto, o RNAm para GH está presente
somente nas células murais da granulosa (Izadyar et al., 1999) e em ovócitos imaturos e maturos
(Joudrey et al., 2003). Além disso, transcritos para Pit-1, que é o regular da transcrição do GH,
foram detectados em ovócitos (Joudrey et al., 2003), sugerindo que esse é sintetizado pelo ovócito.
Considerando que a presença de GH e de seu RNAm só foi observada em folículos maiores
do que 2 mm de diâmetro e não em folículos pré-antrais ou antrais pequenos (Joudrey et al.,
2003), pode-se supor que a capacidade do ovócito de sintetizar GH é adquirida concomitantemente
com a capacidade de completar a meiose. Portanto, apesar da ação do GH e sua importância na
maturação in vivo e in vitro não estar clara, é possível que esse tenha um papel fisiológico nesse
processo e que possa estar relacionado com a competência ovocitária.
Competência Ovocitária
Existem inúmeras evidencias de que a origem do ovócito é crucial em determinar a sua

capacidade de ser fecundado e ter desenvolvimento embrionário normal (Hendriksen et al., 2000;
Lonergan et al, 2003; Rodriguez & Farin, 2004).
A identificação de novos métodos para selecionar os ovócitos mais competentes tem sido
uma busca constante, entretanto, além da morfologia do CCO e do tamanho do folículo, que são
extensivamente utilizados em vários laboratórios, nenhum outro parâmetro foi identificado com
indicador de competência. Isso, porque as várias mudanças ultra-estruturais e moleculares que
ocorrem durante o crescimento do ovócito e que estão associadas com a competência, somente
podem ser observadas por métodos invasivo que causam a destruição do ovócito (Hyttell et al.,
1997).
Existe uma correlação evidente entre o tamanho dos folículos e a competência dos ovócitos.
Ovócitos provenientes de folículos de maior diâmetro apresentam maior potencial de
desenvolvimento do que os provenientes de folículos de menor diâmetro (Pavlok et al., 1992;
Lonergan et al., 1994; Dode et al., 2000; Kauffold et al., 2005). Essa relação foi recentemente
s119
confirmada em um estudo envolvendo três laboratórios distintos, que mostrou que o tamanho do
folículo foi altamente relacionado com a capacidade dos ovócitos maturados in vitro de se
desenvolverem até o estágio de blastocisto (Lequarre et al., 2005).
Durante a foliculogênese o ovócito cresce até atingir um diâmetro de cerca de 110 ìm, o
que corresponde a um tamanho folicular de 3 mm. Nesse estágio é que os ovócitos atingem o seu
crescimento, cessam a atividade do nucléolo e adquirem a competência meiótica (Fair et al.,
1995, Hyttell et al., 1997; Dieleman et al., 2002; Merton et al., 2003). Apesar da drástica
diminuição transcricional que ocorre quando o ovócito completa seu crescimento, a transcrição
não é totalmente inativada (Baran et al., 2004) e o diâmetro do ovócito pode ter um pequeno
aumento na período final do desenvolvimento folicular (Dode at al., 2000; Bevers & Izadyar,
2002; Gandolfi et al., 2005). Portanto, em folículos entre 3 e 8 mm, o diâmetro do ovócito não
muda, a transcrição é praticamente inativada e seu crescimento está completo (Hyttell et al.,
1997; Dieleman et al., 2002; Merton et al., 2003).
Em folículos entre 8 e 15 mm de diâmetro, período que corresponde à dominância folicular,
o ovócito de mamífero sofre mudanças significativas que se completam antes do pico pré-
ovulatório de LH, essas mudanças são chamadas de capacitação ou pré-maturação, e tem papel
fundamental na aquisição da competência (Fair et al., 1995; Hyttell et al., 1997; Dieleman et al.,
2002; Merton et al., 2003). Entretanto, muitos dos eventos citoplasmáticos e moleculares que
ocorrem durante esse período, ainda não são conhecidos (Humblot et al., 2005). Tentativas para
elucidar esses mecanismos têm sido realizadas avaliando ovócitos obtidos em diferentes momentos
próximos ao pico de LH (Hendriksen et al., 2000; Knijn et al., 2002; Humblot et al., 2005).
Entretanto, os resultados são variáveis e não conclusivos, no que se refere à alteração no padrão
de expressão de genes durante o período próximo a ovulação. Isso se deve, principalmente, a
diferenças nos protocolos de superovulação, momento da aspiração transvaginal (OPU) (Merton
et al., 2003), manipulação dos ovócitos (Watson et al., 2000; Merton et al., 2003) e ao pequeno
número de genes avaliados. Desta forma, ainda não se conhece a mudança no padrão geral da
expressão gênica durante esse período, o que auxiliaria na elucidação dos eventos que ocorrem
durante a aquisição da competência.
Diferente do que ocorre in vivo, ovócitos utilizados para OPU e FIV são normalmente
obtidos de folículos de 3-8 mm, que não são expostos às mudanças pré-ovulatórias do ambiente
folicular, e são menos competentes do que os de folículos acima de 8 mm (Hendriksen et al.,
2000). A população de folículos de 3-8 mm de diâmetro é muito heterogênea no que se refere aos
estágios de desenvolvimento e grau de atresia (Hendriksen et al., 2000). É possível que a
competência, de uma porção desses ovócitos, seja induzida por uma atresia inicial e/ou moderada.
Essa hipótese pode ser embasada em estudos ultra estruturais que mostraram que ovócitos de
folículos em atresia inicial, sofrem uma remodelação citoplasmática semelhante ao que ocorre
no período de pré-maturação (Hyttell et al.,1997), proporcionando a esses ovócitos uma alta
capacidade de desenvolvimento. Efeito benéfico da atresia inicial na aquisição da competência,
tem sido demonstrado também, quando ovários são mantidos por algumas horas após o abate,
antes da obtenção dos ovócitos, resultando em uma aumento da taxa de blastocisto, por simular
o início de atresia (Sirard & Blondin, 1996). Além disso, a análise bi-dimensional das proteínas
produzidas nas células do cumulus de folículos pré-ovulatórios e folículos subordinados, em
diferentes graus de atresia, mostrou haver uma semelhança marcante entre folículos pré-ovulatório
e folículos de 3-8 mm levemente atrético (Dieleman et al., 2002). Esses resultados confirmam
que o início de atresia aumenta a competência dos ovócitos, por causar mudanças semelhantes às
que ocorrem no período de capacitação. Essa idéia também explicaria o fato de que, alguns
ovócitos coletados de folículos grandes continuam incapazes de se desenvolver até blastocisto,
s120
enquanto outros de folículos pequenos em torno de 3 mm são totalmente competentes (Robert et

al., 2001).
Modificações do ambiente folicular pela utilização de diferentes protocolos hormonais
aumentaram a competência de ovócitos obtidos por OPU (Blondin et al., 1997; Bordignon et al.,
1997; Pivato et al., 1999). Esses resultados indicam que o folículo de origem é vital para conferir
aos ovócitos o ambiente necessário para adquirir competência para o desenvolvimento, e que a
qualidade intrínseca do ovócito no início do processo de PIV, é o fator mais importante em
determinar o seu destino final.
Portanto, a competência pode ser adquirida em condições foliculares específicas (Blondin
et al., 1997). Sendo assim, Blondin et al, (2002) propôs um tratamento hormonal, em que após a
administração de FSH, os animais eram submetidos a um período de coasting, ou seja, sem FSH,
por 48 horas. Esse protocolo resultou em um aumento da competência, sendo que 80% dos
ovócitos maturados, fecundados e cultivados in vitro se desenvolveram até blastocisto. O período
de privação induziu o início da atresia enviando aos ovócitos o sinal apropriado, de forma que
quando foram removidos dos folículos estavam competentes. Entretanto, quando um período de
coasting de 40 horas foi utilizado em sistema comercial de PIV, o aumento da taxa de blastocisto,
apesar de satisfatória, não foi significativa (Durocher et al., 2006). Da mesma forma, quando
animais de raças diferentes foram utilizados mantendo o período de coasting de 48 horas associado
(Barros et al., 2006) ou não à administração de LH (Durairaj et al., 2005), nenhuma melhora na
taxa de blastocisto foi observada. Esses resultados sugerem que a janela para o coasting é pequena
e pode variar de acordo com a raça, o período do ciclo em que o FSH é administrado, entre outros
fatores. A variação nos resultados, não invalida a hipótese de que os eventos que ocorrem antes
da retirada dos ovócitos do ambiente folicular, têm efeito determinante no seu desenvolvimento
posterior. Deste modo, o estabelecimento de um modelo, em que se possa simular o ambiente
folicular no qual a competência é adquirida, seria muito útil para determinar as mudanças
moleculares e celulares que ocorrem nesse período, e com isso proporcionar aos ovócitos condições
adequadas para melhorar a eficiência das tecnologias in vitro.
Como já mencionado anteriormente, ovócitos competentes necessitam ter estocado fatores
importantes, na forma de proteínas e RNAm estável que deverão ser utilizados durante a
maturação, fecundação e início do desenvolvimento embrionário (Gandolfi et al., 2005). O papel
crítico do ovócito até a MZT, quando o genoma embrionário se torna funcionalmente ativo, pode
ser comprovado pelo fato de que, durante esse período, o embrião depende de mecanismos pós-
transcricionais para controlar o desenvolvimento . Isso indica que a competência do ovócito,
pode estar determinada pela composição e quantidade de transcritos específicos no seu pool de
RNAm, que são estocados durante o crescimento e fase final da foliculogênese (Sirard et al.,
2001,2006; Lonergan et al., 2003; Robert et al., 2003; Gandolfi et al., 2005).
Para prevenir a degradação de RNAm e proteínas durante a estocagem, mecanismos de
pós-transcrição e pós-tradução são essenciais no ovócito (Wang & Kiledjian, 2000). Tem sido
demonstrado que a tradução dos RNAm maternos no ovócito, é regulada pela mudança na cauda
poli-A, que são seqüências localizadas na região não traduzível do final 3’ da molécula do RNAm
(Gandolfi & Gandolfi, 2001). Portanto, a poliadenilização representa um fator chave na regulação
da expressão gênica, sendo que seu padrão pode ser correlacionado com a capacidade de
desenvolvimento. Estudos em bovinos têm demonstrado que ovócitos incompetentes contêm
RNAm de alguns genes, com cauda poli-A mais curta (traducionalmente inativas) dos que os
totalmente competentes, sendo que essa diferença está presente tanto no estágio de GV como em
MII (Brevini-Gandolfi et al., 1999, Lequarre et al., 2004). Da mesma forma, Trenblay et al.
(2005) mostraram que o RNAm para a ciclina B1, que é um fator importante para a maturação
ovocitária, apresentava uma cauda poli-A significativamente mais longa em ovócitos obtidos de
s121
ovários transportados a 35°C do que os de ovários transportados em gelo. Apesar dos autores
terem sugerido que o padrão de poliadenilização possa ser utilizado como marcador para
competência, cuidados devem ser tomados, visto que mesmo que o ovócito possua RNAm,
esses podem não ser efetivamente traduzidos. A falha na tradução pode ser devido a presença de
repressores específicos ou mesmo, a uma insuficiência na ativação do próprio maquinário de
tradução (Tomek et al., 2002).
Avanços nos Estudos da Maturação e Competência Ovocitária
Um ovócito competente difere de um incompetente por sua capacidade de sustentar o

desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto (Robert et al., 2001). Essa diferença é
o resultado da expressão diferenciada de genes. Se os estoques de RNAm maternos contribuem
para a competência, mudanças qualitativas e quantitativas devem existir entre RNAs de ovócitos
competentes e incompetentes. Portanto, a variação na expressão gênica permite a identificação e
o isolamento de genes associados com o grau de competência do ovócito (Robert et al.,
2001;Robert et al., 2002; Fair et al., 2004), o que forneceria informações valiosas dos mecanismos
moleculares envolvidos na maturação ovocitária completa .
Existe um crescente número de informações na literatura com relação à expressão de genes
em ovócitos em diversos estágios de desenvolvimento (Robert et al., 2000, 2002; Dalbies-Tran
& Mermillod, 2003; Donnison & Pfeffer 2004; Assou et al., 2006). Entretanto, existe também
uma falta de informação de como esse genes estão envolvidos nos processos celulares e, como
são afetados por mudanças no ambiente do ovócito.
O estudo de genes e de suas funções em ovócitos e embriões tem sido mais lento em
relação a outros tipos de células e tecidos. Isto ocorre principalmente, pela limitada disponibilidade
de material de ovócito e embriões. Entretanto, nos últimos anos novas técnicas têm surgido
possibilitando utilizar quantidade mínimas de material para avaliação da expressão gênica.
Bibliotecas de subtração associadas à técnica de microarranjos são ferramentas muito úteis
para selecionar genes candidatos que estão envolvidos em um determinado estágio fisiológico
(Sirard et al., 2005). Através da formação de bibliotecas de subtração utilizando duas populações
distintas, é possível gerar milhares de clones que são diferencialmente expressos em uma das
populações (Diatchenk et al., 1996). E se o resultado dessa biblioteca de subtração for hibridizado
em uma lâmina de microarranjos, contendo milhares de seqüências de cDNA ou oligonucleotídeos
(Schena et al., 1995), é possível identificar rapidamente uma coleção de genes candidatos, que
posteriormente poderão ser seqüenciados e selecionados. Entretanto, a eficiência desse método
para identificar candidatos está relacionada com a diferença que existe entre os dois tecidos ou
amostras comparadas. Portanto, a confirmação da expressão diferencial deve ser realizada por
outros métodos, como por exemplo, o PCR em tempo real (Q-PCR). Embora na maioria dos
estudos, os perfis encontrados na análise de microarranjos são confirmados pelo Q-PCR (Donnison
& Pfeffer, 2004; Zeng et al., 2004; El-Halawany et al., 2005), alguns estudos não mostram essa
mesma relação e, reportam que menos de 30% dos genes selecionado após a hibridização mantém
a diferença significativa após a quantificação pelo Q-PCR ( Sisco et al., 2003; Fair et al., 2004;
Dode et al., 2006).
Esforços para identificar marcadores potenciais para competência em ovócitos bovinos,
com o auxilio dessas técnicas, tem sido realizados utilizando ovócitos de diferentes tamanhos de
folículos (Robert et al. 2000; Donnison & Pfeffer 2004), células do cumulus (Robert et al. 2003)
e ovócitos que clivam em diferentes momentos após a fecundação (Fair et al. 2004; Dode et al.
2006). Apesar de alguns genes terem sido identificados como relacionados à competência,
s122
ainda não se tem um consenso sobre que gene ou genes podem ser usados como marcadores.
Entretanto, a identificação desses genes que são mais expressos nos ovócitos competentes, sugere
que esses, provavelmente, têm um papel importante na competência ovocitária. Estudos posteriores
de avaliação funcional desses genes contribuirão para a elucidação dos mecanismos responsáveis
pela aquisição dessa competência.
É importante ressaltar, que quando da utilização dessas técnicas, os níveis de RNAm
fornecem uma medida de quantidade e que essa pode ser afetada não só pelos níveis de transcrição,
mas também pelo processamento e degradação dos transcritos. Além disso, a quantidade de
RNAm pode não corresponder aos níveis da proteína, e nem fornece qualquer informação quanto
a sua modificação, atividade ou localização. Desta forma, uma análise mais criteriosa deve ser
realiza antes de se tirar conclusões sobre o significado funcional dos níveis de RNAm de um
gene específico. Somente após a avaliação do conteúdo da proteína correspondente, é que se
pode relacionar a quantidade de RNAm ao seu papel funcional no desenvolvimento embrionário.
Considerações Finais
A maturação ovocitária é um processo complexo que envolve a modificação do estado da

cromatina do estágio de vesícula germinativa à metáfase II, alterações no citoplasma que levam
a mudanças na distribuição e organização de organelas e o acúmulo de instruções moleculares
que controlam a progressão nuclear e citoplasmática. Portanto, ovócitos devem conter todas as
informações em forma de RNAm estável, que se acumula durante o crescimento e fase final da
foliculogênese, para que sejam capazes de maturar, sofrer as primeiras divisões e ativar o genoma
embrionário. Essa competência adquirida gradativamente é o que permite que um ovócito tenha
capacidade de ter um desenvolvimento embrionário adequado após a fecundação.
Não restam dúvidas de que a competência não se deve a alteração de apenas um gene, mas
sim a mudança no nível de expressão de vários genes. E, somente unindo esforços de vários
grupos de pesquisas e utilizando técnicas apuradas de identificação e avaliação funcional de
genes associados a essa capacidade de desenvolvimento, será possível desvendar os mecanismos
responsáveis pela aquisição da competência. A partir desse conhecimento, será possível determinar
as condições mais adequadas e reproduzir essas condições in vitro, definindo sistemas mais
eficientes para a maturação in vitro, aumentando a disponibilidade de ovócitos competentes para
serem utilizados nas técnicas de reprodução assistida.
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O BLOQUEIO MEIÓTICO E A MATURAÇÃO IN VITRO
Cláudia Lima Verde Leal e Paulo Roberto Adona
ZAB – FZEA – USP, Pirassununga-SP
Resumo
A demanda por oócitos bovinos tem sido crescente para produção de embriões por
fecundação in vitro (FIV), clonagem ou transgênese. A FIV vem sendo cada vez mais utilizada
comercialmente, inclusive no Brasil. A produção de blastocistos, porém, tem se mantido em 30-
40%. In vivo, o oócito termina sua fase de crescimento bloqueado em prófase da meiose I contido
em um folículo de 2-3 mm, que continua crescendo até atingir um diâmetro ≥ 15mm. Após a
onda pré-ovulatória de LH, o oócito retoma a meiose até metáfase II (maturação) quando é
ovulado. Entre o final do crescimento do oócito e o início da maturação (capacitação ou pré-
maturação), ocorrem modificações ultra-estruturais e moleculares relacionadas com a competência
para o desenvolvimento após a fecundação. Na maturação in vitro (MIV) são normalmente
selecionados oócitos de folículos de 3-6mm. O oócito removido do folículo retoma
espontaneamente a meiose sem ter passado pela capacitação, o que poderia estar relacionado
com a menor competência do oócito. Um cultivo pré-maturação, mantendo-se o oócito em
bloqueio meiótico in vitro, permitiria ao mesmo um período adicional para passar pela capacitação
e melhorar sua competência. Inibidores de quinases dependentes de ciclinas, como a butirolactona
I, têm sido utilizados para este fim. Embora esse procedimento ainda não tenha resultado, de
forma geral, num aumento das taxas de desenvolvimento embrionário, tem se prestado como
ferramenta importante para obter informações acerca do gameta feminino. Estas informações
são de grande valia para melhorar os sistemas de MIV, e conseqüentemente, a produção in vitro
(PIV) de embriões.
Palavras-chave: meiose, butirolactona I, inibidores de CDK, MPF, capacitação, pré-maturação
Introdução
A demanda por oócitos bovinos para produção de embriões por fecundação in vitro (FIV),
ou ainda, para utilização em clonagem por transferência de núcleos (TN) ou transgênese (TG)
tem sido cada vez mais intensa. Embora estas técnicas tenham ainda uma maior aplicação para
pesquisa, elas já vêm tendo alguma aplicação comercial nos países desenvolvidos, no caso da
TN e TG, e no caso da FIV, já vem sendo mais amplamente utilizada comercialmente, inclusive
no Brasil (Dayan et al., 2000; Rodrigues e Garcia, 2000). No entanto, apesar dos muitos estudos
e grandes avanços nessas áreas, a obtenção de oócitos competentes para o desenvolvimento
embrionário tem se mantido nos últimos anos relativamente estável na faixa dos 30-40% de
blastocistos após a FIV (Hyttel et al., 2001; Lonergan et al., 2001; Rizos et al., 2002).
Estas técnicas envolvem uma série de etapas, mas certamente a maturação in vitro, é uma
das etapas cruciais. O desenvolvimento de embriões obtidos por métodos de manipulação in
vitro depende largamente da qualidade e competência dos oócitos para a maturação, fecundação
e subseqüente desenvolvimento.
Já foi demonstrado que oócitos in vivo, ao final de seu período de crescimento, mas antes
de seu período de maturação propriamente dito, passam por um período denominado de
capacitação ou pré-maturação, importante para o desenvolvimento pleno de sua competência.
s131
Neste período ocorrem modificações ultra-estruturais e moleculares no oócito importantes para

a retomada da meiose (maturação final) e desenvolvimento pós-fecundação (Hyttel et al., 1997,
Dieleman et al., 2002).
Sabe-se que a remoção do oócito do ambiente folicular, prática realizada para obtenção de
oócitos para maturação in vitro (MIV), resulta na retomada espontânea da meiose nos mesmos,
interrompendo o período de capacitação. Foi sugerido que uma das formas de promover esse
período de capacitação oocitária in vitro, seria pela inibição da retomada da meiose por um
determinado período de tempo antes da maturação (pré-maturação; Lonergan et al., 1997;
Hendriksen et al., 2000).
Inibidores específicos de quinases dependentes de ciclinas (CDKs do inglês cyclin dependent
kinases), tais como a butirolactona I e seu análogo sintético a roscovitina, vêm sendo utilizados
para estudos sobre o papel do fator promotor da maturação (MPF do inglês maturation promoting
factor) na regulação da meiose, durante a maturação de oócitos, uma vez que atuam de forma
específica sobre a atividade desta quinase. Além disso, ambos inibidores têm sido utilizados
para promover o bloqueio meiótico em bovinos (Kubelka et al., 2000; Ponderato et al., 2001,
2002; Hashimoto et al., 2002), suínos (Marchal et al., 2001; Krischek e Meinecke, 2002; Wu et
al., 2002) e eqüinos (Hinrichs et al., 2002).
Embora os inibidores sejam eficientes na promoção de bloqueio reversível (Kubelka et al.,
2000; Pavlok et al., 2000), seus efeitos sobre o desenvolvimento embrionário não têm sido
prejudiciais, mas também, na maioria dos casos, não apresentam melhorias no desenvolvimento
embrionário. As taxas de desenvolvimento de blastocistos têm sido, em geral, semelhantes às
dos controles não inibidos (Lonergan et al., 2000; Mermillod et al., 2000; Ponderato et al.,
2001). Hashimoto et al. (2002), porém, obtiveram taxas de desenvolvimento a blastocistos
superiores aos controles, bem como um incremento significativo do número de células nos
embriões obtidos. Ponderato et al. (2002) observaram ainda que o desenvolvimento fetal normal
após esse tipo de tratamento é possível. Coy et al. (2005b) obtiveram o nascimento de leitões
oriundos de oócitos pré-maturados com roscovitina.
Essas observações sugerem que o bloqueio meiótico não é prejudicial ao potencial de
desenvolvimento embrionário e dessa forma possa ser uma ferramenta para o estudo do controle
da meiose e também para o desenvolvimento de protocolos mais adequados para a aquisição de
competência para o desenvolvimento de oócitos utilizados para a produção in vitro de embriões.
Oogênese, foliculogênese e competência para o desenvolvimento
Nos mamíferos, a oogênese tem início durante o desenvolvimento fetal. Por volta dos 80
dias de gestação (bovinos) inicia-se a meiose (Rüsse, 1983). O ciclo celular, no entanto, é
bloqueado na prófase da meiose I, conhecido também como estádio de vesícula germinativa
(VG), e assim permanece por meses ou anos até a puberdade. Pouco antes da ovulação, os oócitos
são estimulados a retomar a meiose em resposta à onda pré-ovulatória de hormônio luteinzante
(LH) e o ciclo celular progride até o estádio de metáfase II (MII), quando bloqueia novamente.
Este ciclo só será reiniciado e completado, após a ovulação, quando houver a fecundação pelo
espermatozóide que provoca a sua ativação. Uma vez ativado o oócito completa a meiose e
inicia os ciclos mitóticos do desenvolvimento embrionário.
O processo que ocorre quando o oócito reinicia a meiose a partir de prófase I e a conclui até
a fase de metáfase II é chamado de maturação oocitária. A maturação é caracterizada por três
componentes: 1) a maturação nuclear que consiste na modificação da configuração da cromatina,
característica da progressão do ciclo celular: prófase I (PI), metáfase I (MI), anáfase I (AI),
telófase I (TI), metáfase II (MII) com emissão do 1º corpúsculo polar; 2) a maturação citoplasmática
s132
que envolve uma série de modificações na distribuição e organização de organelas e modificações

do citoesqueleto e 3) a maturação molecular representada pelo acúmulo de instruções produzidas
durante o período de crescimento do oócito e que controlam a maturação nuclear e citoplasmática
(Sirard, 2001). A maturação culmina com a aquisição, pelo oócito, da capacidade de ser fecundado
e desenvolver-se em um embrião.
A foliculogênese, por usa vez, inicia-se com a formação dos folículos primordiais, quando
uma única camada de células pavimentosas (células pré-granulosas) se posiciona em torno do
oócito primário por volta dos 90 dias de gestação em bovinos (Szollosi,1991 apud Meyes, 2002).
Esta estrutura tem um diâmetro de cerca de 40 μm (van Wezel e Rodgers, 1996), contendo um
oócito de cerca de 30 μm (Picton, 2001). Posteriormente, as células tornam-se cubóides (células
da granulosa) dando origem ao folículo primário aos 140 dias de gestação. Inicia-se a formação
da zona pelúcida e das junções comunicantes entre as células da granulosa e o oócito (Rüsse,
1983). Em torno de 210 dias de gestação, as células foliculares multiplicam por mitose dando
origem ao folículo secundário, que apresenta pelo menos duas camadas de células da granulosa
e um oócito de 50-60 μm (Hyttel et al., 1997). Na fase seguinte, começa a surgir uma cavidade
preenchida com líquido (antro), dando origem ao folículo antral ou terciário aos 230 dias de
gestação (Rüsse, 1983). O folículo tem agora cerca de 120-280 m de diâmetro (Monniaux et al.,
1997). Quando o folículo atinge ~3 mm de diâmetro, o oócito chega a cerca de 120 μm, reduzindo
muito seu ritmo de crescimento e cessando a sua atividade de síntese de RNA (Hyttel et al.,
1997). Daí por diante, o folículo cresce em tamanho até atingir o diâmetro pré-ovulatório (15-20
mm) enquanto o oócito tem um pequeno crescimento (Arlotto et al., 1996). Após o pico de LH,
será retomada a meiose do oócito nele contido, que será ovulado em metáfase II (Callesen et al.,
1986).
A competência para o desenvolvimento se refere à capacidade do oócito em produzir um
novo indivíduo após a fecundação (Hyttel et al., 1997). Ao longo do desenvolvimento folicular
há um aumento gradual da competência para o desenvolvimento (Gandolfi e Gandolfi, 2000).
Dentre vários fatores, o tamanho do folículo e do oócito parecem ter estreita correlação com a
competência oocitária (Hyttel et al., 1997; Hendriksen et al., 2000).
Lonergan et al. (1994), obtiveram 66% de blastocistos a partir de oócitos de folículos
maiores (6-8 mm) e 34% a partir de folículos menores (2-6 mm). Yang et al. (1998) demonstraram
que oócitos oriundos de folículos pequenos (<2 mm) são incompetentes para o desenvolvimento
tanto após a fecundação in vitro (FIV) como após ativação partenogenética e concluíram que a
incompetência dos oócitos de folículos pequenos é devido a ambos o núcleo e o citoplasma.
Oócitos de diferentes diâmetros também apresentam competência meiótica e de
desenvolvimento distintos. Na medida em que o oócito aumenta de diâmetro, este vai adquirindo
progressiva e seqüencialmente a capacidade de retomar a meiose (quebra da VG), progredir até
MI, MII e, finalmente, de desenvolver-se em um embrião (Hyttel et al., 1997). Parece haver um
limite mínimo de competência em que oócitos estão aptos a desenvolver após a fecundação. Em
bovinos esse limite ocorre quando os oócitos atingem um diâmetro mínimo de 110-120 μm e
que tenham sido obtidos de folículos de pelo menos 3 mm de diâmetro (Hyttel et al., 1997,
2001). Isso indica, que a competência para retomar e concluir a meiose, e posteriormente para
ser fecundado e desenvolver-se em um embrião viável, é adquirida de forma gradual com o
crescimento do oócito e do folículo ovariano. Pode-se dizer, porém, que a competência para a
maturação citoplasmática pode ser adquirida juntamente, mas não é coincidente com a maturação
nuclear. Isso é patente, uma vez que se observa que uma proporção bem menor de oócitos atinge
o estádio de blastocisto (30-40%) em relação àquela que atinge a maturação nuclear (>80% de
MII).
s133
O bloqueio meiótico in vivo
Está bem estabelecido que o oócito, enquanto mantido dentro do ambiente folicular,
permanece bloqueado em VG. O AMPc presente em altos níveis dentro do oócito tem sido
apontado como o principal responsável pela manutenção do bloqueio da meiose do oócito até o
momento da maturação, visto que sua redução é um sinal necessário para a maturação ovocitária
(Conti et al., 1998; Eyers et al., 2005). O AMPc é uma molécula sinalizadora intracelular que
exerce um importante controle na meiose em mamíferos, anfíbios e em alguns invertebrados
(Bilodeau-Goeseels, 2003). As células da granulosa seriam responsáveis pela síntese do AMPc
que passaria ao oócito pelas junções comunicantes (gap junctions; Edry et al., 2006). Por outro
lado, observou-se que o oócito também possui a enzima necessária para a síntese desse nucelotídeo
(adenilato ciclase), sendo, portanto, capaz de sua produção (Mehlman et al., 2005). Ainda não
foi provado se uma ou ambas as vias são utilizadas para manter o oócito em VG, porém está claro
que altos níveis de AMPc são necessários para tal bloqueio e que o mesmo ocorre pela ação do
AMPc em manter o MPF inativado (Duckworth et al., 2002).
A retomada da meiose – maturação
A retomada do ciclo celular meiótico (maturação) está sob o controle, principalmente, do

MPF. O MPF é uma proteína quinase composta por duas subunidades, a p34cdc2 e a ciclina B. A
p34cdc2 é sintetizada constantemente enquanto a ciclina B é sintetizada e destruída ciclicamente,
dando desta forma o controle cíclico característico do ciclo celular. O MPF encontra-se em níveis
basais em oócitos em estádio de VG e com o reinício da meiose começa a se elevar atingindo
níveis máximos em metáfase I (MI). Depois declina entre MI e MII para se reativado e atingir um
novo pico em metáfase II (MII). Neste ponto, mantém-se elevado até que haja a ativação do
oócito na fecundação (Motlik et al., 1998).
O que desencadeia a ativação do MPF, que caracteriza bioquimicamente a retomada da
meiose e, conseqüentemente, o início da maturação, parece ser a concentração de AMPc no
complexo cumulus-oócito. Quando há uma redução dos níveis de AMPc, finda a inibição sobre
a atividade do MPF (Goren e Dekel, 1994). Uma vez ativo, o MPF desencadeia os eventos
observados na maturação nuclear: quebra da VG (germinal vesicle breakdown - GVBD),
condensação dos cromossomos, formação do fuso meiótico e extrusão do 1º corpúsculo polar.
Além do MPF um outro fator importante que participa do controle da meiose do oócito é a
proteína quinase ativada por mitógeno (mitogen activated protein kinase - MAPK). De acordo
com Gordo et al. (2001), enquanto o MPF estaria relacionado à retomada da meiose, a MAPK
estaria relacionada com o segundo bloqueio meiótico em metáfase II, manutenção dos níveis
elevados de MPF durante essa fase e organização do fuso meiótico. A MAPK está envolvida na
dinâmica dos microtúbulos que são responsáveis pelo deslocamento da cromatina para a periferia
e rearranjo das organelas no citoplasma do oócito (Verlhac et al., 1994). A MAPK também é
inativa em VG e torna-se ativada com a retomada da meiose (observada pela GVBD) ligeiramente
depois do MPF, mas ao contrário deste, a MAPK mantém-se elevada na transição MI-MII (Motlik
et al., 1998).
A capacitação ou pré-maturação in vivo
Blondin et al. (1997) estudando o efeito do intervalo entre o abate e a recuperação dos
oócitos dos ovários, observaram que melhores resultados poderiam ser obtidos mantendo os
oócitos dentro dos folículos ovarianos por até 4 horas após o abate, comparativamente aos
s134
puncionados imediatamente após o abate. Concluíram neste estudo, que a aquisição de

competência para o desenvolvimento pode ocorrer, em parte, antes mesmo da maturação in
vitro. Os estudos do Blondin et al. (2002) in vivo, também reforçam essa observação. Trabalhando
com intervalos variáveis entre o tratamento de superovulação de vacas e a aspiração folicular
guiada por ultra-som, seguida de maturação, fecundação e o cultivo in vitro, observaram que
intervalos maiores levavam a maiores taxas de desenvolvimento, alcançando até cerca de 80%
de blastocistos. Rizos et al. (2002a,b), concluíram que a qualidade dos embriões obtidos na PIV
seria relacionada ao sistema de cultivo in vitro, mas que as taxas de desenvolvimento (porcentagem
de blastocistos) seria relacionada à qualidade intrínseca do oócitos antes mesmo da maturação.
Tais observações correspondem bem às conclusões dos estudos de Assey et al. (1994),
onde oócitos de folículos dominantes antes da onda de LH e, portanto, antes da maturação,
sofrem modificações nucleares e citoplasmáticas envolvidas com a competência para o
desenvolvimento. Hyttel et al. (1997) estudando a ultra-estrutura de oócitos ao longo de sua fase
de crescimento in vivo antes de maturação, observaram que durante essa fase, onde o oócito
encontra-se dentro de um folículo também em crescimento, ocorre uma série de eventos que
incluem: desenvolvimento de organelas e inclusões tais como retículo endoplasmático liso,
complexo de Golgi, vesículas, gotículas de lipídios, grânulos corticais; formação da zona pelúcida;
modificação morfológica das mitocôndrias; formação das gap junctions com as células da
granulosa. Além disso, os oócitos acumulam transcritos e proteínas necessários para a competência
para o desenvolvimento que correspondem à intensa atividade do nucléolo.
Quando o oócito atinge o diâmetro de 110 μm, já ao fim da fase de crescimento, o nucléolo
vai sendo inativado. No entanto, no período entre o final do crescimento do oócito até a onda
pré-ovulatória de LH que estimula a retomada da meiose e início da maturação oocitária, o
oócito não entra numa total quiescência. Algumas modificações são observadas e incluem redução
dos microvilos e do complexo de Golgi, retração das ligações com as células da granulosa,
aumento do espaço perivitelino, aumento da quantidade de gotículas de lipídios, início do
deslocamento dos grânulos corticais para a periferia, ondulação da membrana nuclear e
modificação da morfologia do nucléolo. Essa modificação nucleolar poderia estar relacionada a
uma retomada de sua atividade transcricional. Esse intervalo foi denominado de “capacitação
oocitária” e estaria relacionado com a aquisição final de competência para o desenvolvimento
pelo oócito (Hyttel et al., 1997).
Bloqueio meiótico ou pré-maturação in vitro
Nos procedimentos de maturação in vitro (MIV), utilizam-se usualmente folículos entre 3-

6 mm de diâmetro, no entanto, é provável que uma parte considerável desta população seja
incompetente para o desenvolvimento. Os oócitos ao serem removidos do ambiente folicular,
deixam de ter o sinal que mantém o bloqueio meiótico e reiniciam espontaneamente a meiose.
Este reinício poderia ser, em muitos casos, precoce, ou seja, o oócito ainda não estaria apto para
maturar eficientemente e, portanto, para fecundar e desenvolver (Hyttel et al., 1997; Hendriksen
et al. 2000). Possivelmente seria necessário manter os oócitos por mais tempo em VG para que
tenham tempo suficiente para adquirir a competência.
Lonergan et al. (1997) e Hendriksen et al. (2000) sugeriram que uma pré-maturação in
vitro poderia permitir que oócitos, que tiveram o final de seu desenvolvimento encurtado pela
remoção precoce do ambiente folicular, fossem capazes de “alcançar” os estádios finais de seu
desenvolvimento. Mantendo-se os oócitos bloqueados seria possível procurar mimetizar o período
da capacitação.
s135
A regulação nas atividades enzimáticas de uma série de proteínas quinases e fosfatases

controla a meiose em ovócitos de mamíferos. Desta forma, a meiose pode ser bloqueada por
drogas que mantenham altas concentrações de AMPc no interior do oócito (Bilodeau-Goeseels,
2003), por inibidores não específicos da síntese protéica (Saeki et al, 1997; Meinecke et al.,
2001), de proteínas quinases (Andriesz et al., 2000; Dode e Adona, 2001) ou por inibidores
específicos do MPF (Kubelka et al., 2000; Hashimoto et al., 2002; Adona e Leal, 2004).
A manipulação dos níveis de AMPc tem tido algum sucesso na pré-maturação de oócitos
de camundongos (Nogueira et al., 2003) e humanos (Nogueira et al., 2006). Oócitos bovinos,
porém, parecem ser menos sensíveis à manipulação dos níveis de AMPc para controlar a meiose.
O bloqueio é possível por períodos mais curtos de tempo e parece retardar a perda de comunicação
entre as células da granulosa e o oócito, que ocorre logo após a remoção do oócito do folículo
(Thomas et al., 2004). Grupen et al. (2006), porém, obtiverem resultados semelhantes entre a
milrinona (inibidor de fosfodiesterase) e butirolactona I (inibidor de CDK) em termos de bloqueio,
reversibilidade e desenvolvimento embrionário após tratar oócitos suínos na primeira metade do
período de maturação.
Inibidores de síntese protéica como a cicloheximida e de fosforilação protéica como a 6-
DMAP (Saeki et al., 1997; Lonergan et al., 1997; Lonergan et al. 1998; Avery et al., 1998; Dode
e Adona, 2001) também foram utilizados para manter os oócitos em bloqueio meiótico pré-
maturação. No entanto, embora obtivessem bloqueio reversível e desenvolvimento de blastocistos,
o desenvolvimento foi inferior aos controles. Estas substâncias são de amplo espectro e poderiam
estar interferindo com outras vias bioquímicas/metabólicas importantes. Como a retomada da
meiose é caracterizada pela ativação do MPF, um inibidor específico de MPF permitiria a
manutenção dos oócitos em bloqueio meiótico.
Algumas drogas inibem especificamente a fosforilação do MPF, mantendo-o inativo e,
conseqüentemente, permitindo um bloqueio meiótico sem interferência com outras proteínas do
oócito. A butirolactona I (BLI) é uma purina derivada de micélios de Aspergillus sp e inibe
especificamente quinases dependentes de ciclinas (Motlik et al., 1998). Além desta, existem
seus análogos sintéticos como a roscovitina (ROS) e a bohemine (BOH).
A ROS (Mermillod et al., 2000), a BLI (Kubelka et al., 2000; Lonergan et al., 2000; Motlik
et al., 2000), a associação das duas (Ponderato et al., 2001) e a BOH (Adona e Leal, 2004) já
foram utilizadas com algum sucesso para bloquear a meiose em oócito de vacas adultas e mesmo
de bezerras (Donnay et al., 2004; Alabarracín et al. 2005). Essas drogas também já foram utilizadas
em outras espécies como suínos (Wu et al., 2002; Ju et al., 2003; Le Beaux et al., 2003; Romar
e Funahashi, 2006), eqüinos (Hinrichs et al., 2002) e caprinos (Jimenez-Macedo et al., 2006;
Han et al., 2006).
A meiose é inibida de forma eficiente e reversível por períodos variados de tempo, de 24 h
(Mermillod et al., 2000; Kubelka et al., 2000; Lonergan et al., 2000), 48 h (Kubelka et al., 2000)
e até 70 h (Pavlok et al. 2000). No entanto, as taxas de desenvolvimento a blastocisto nesses
trabalhos não chegaram a ser melhores que as obtidas sem o uso de inibidores, mantendo-se em
30-40% (Mermillod et al., 2000; Lonergan et al., 2000; Ponderato et al., 2001). Hashimoto et al.
(2002), por outro lado, conseguiram um aumento significativo nas taxas de desenvolvimento e
número de células dos blastocistos em relação aos controles, incluindo soro fetal bovino no meio
de inibição com 100 μM de BLI e reduzindo a tensão de O2 durante o cultivo de pré-maturação.
O impacto do bloqueio meiótico na ultraestrutura dos oócitos após 8 h (Faerge et al., 2001)
ou 40 h de bloqueio (Fair et al., 2002) revelou que no primeiro caso o período de cultivo foi
insuficiente para induzir as alterações esperadas e no segundo caso foi excessivo, causando
danos consideráveis em diversas estruturas e organelas dos oócitos tratados. Avery et al. (2002),
por sua vez, observaram que oócitos oriundos de folículos de diferentes tamanhos tratados com
s136
ROS por 24 horas assemelhavam-se, em termos de distribuição de mitocôndrias, com oócitos

obtidos por punção folicular in vivo de folículos de maior diâmetro.
Embora haja indícios de que um bloqueio meiótico pré-maturação poderia ser benéfico
para o desenvolvimento embrionário posterior, ainda não foram desenvolvidos sistemas que
permitam um bloqueio meiótico mais eficiente de forma a mimetizar in vitro o ambiente inibitório
presente in vivo no folículo até momentos antes da ovulação, de modo que o oócito seja capaz de
sofrer a capacitação. Boa parte dos trabalhos limitou-se a avaliar a eficiência do bloqueio, sua
reversibilidade e seu feito sobre o desenvolvimento embrionário, tendo havido poucos estudos
sobre outros parâmetros ou modificação nas condições do cultivo pré-maturação. A manipulação
das condições de cultivo e do momento da fecundação poderia melhorar os resultados da inibição
meiótica sobre o desenvolvimento embrionário.
Alguns estudos foram realizados visando determinar melhores condições para a indução
do bloqueio meiótico e verificar a ocorrência de modificações estruturais e moleculares nos
oócitos. Inicialmente diferentes inibidores de quinases dependentes de ciclinas foram comparados
e observou-se que a BLI induz um bloqueio meiótico mais eficaz e reversível sem reduzir o
desenvolvimento embrionário (Adona e Leal, 2004). A ROS e a BOH, embora tenham bloqueado
a meiose de forma reversível, levaram a uma redução do desenvolvimento embrionário.
Alguns trabalhos utilizando tais inibidores mostraram que a cinética da maturação após o
bloqueio é acelerada (Ponderato et al., 2001; Lagutina et al., 2002; Hashimoto et al., 2002; Wu
et al., 2002), o que interferiria no momento ideal para realização da FIV. Averiguando-se o efeito
do tempo de exposição e da concentração da BLI sobre a cinética da maturação nuclear in vitro,
observou-se que quanto maior o tempo de exposição à droga, mais rápida é a cinética da maturação,
com antecipação da retomada da meiose durante a MIV em cerca de 3 horas. Mesmo uma
exposição por tempo mais curto (6h), já foi capaz de acelerar a maturação nucelar. Além disso,
verificou-se também que para períodos de bloqueio mais curtos (6-12h) uma concentração mais
baixa de BLI (50μM) pode ser usada, mas para manter o bloqueio por 24h é necessário utilizar
uma concentração maior de BLI (100μM) (Adona e Leal, 2006).
Na tentativa de minimizar o efeito da BLI na cinética da maturação buscou-se reduzir a
concentração de BLI. Ponderato et al. (2001) utilizaram uma mistura de inibidores a baixas
concentrações (12,5μM BLI e 6,25μM de ROS), mas também observaram a aceleração da meiose.
Ao utilizar uma concentração ainda mais baixa (10μM BLI), Adona (2006) observou que a cinética
ainda assim manteve-se acelerada, sendo esse padrão um efeito do bloqueio da meiose utilizando
essas drogas e não um efeito apenas de concentração.
Essa aceleração, no entanto, não reduz o desenvolvimento embrionário posterior. Diversos
estudos mostraram desenvolvimento similar aos controles apenas maturados in vitro (Adona e
Leal, 2004; Adona e Leal, 2006), podendo em alguns casos melhorar as taxas de blastocisto
(Hashimoto et al., 2002; Coy et al., 2005a). Além disso, esse tipo de tratamento não prejudica
fases posteriores do desenvolvimento. Já foram obtidas gestações de embriões bovinos produzidos
por FIV (Ponderato et al., 2001) e por clonagem (Adona et al, 2006, dados não publicados) e
desenvolvimento a termo em suínos (Coy et al., 2005b) e bovinos (Adona et al., 2003, dados não
publicados).
O significado e as causas dessa aceleração não estão esclarecidos, mas sugere-se que durante
o bloqueio ocorreria o acúmulo de fatores necessários à progressão meiótica e que ao remover-se
o inibidor a meiose se daria de forma mais rápida. Durante o bloqueio, a síntese protéica (Marchal
et al., 2001), a fosforilação protéica (Vigneron et al. 2004a) e a transcrição (Lequarre et al.,
2004) não são bloqueadas. Wu et al. (2002) notaram que a MAPK é rapidamente ativada após o
bloqueio. O MPF também parece ser reativado mais rapidamente durante a maturação in vitro,
s137
quando os oócitos são bloqueados por 24h tanto com alta (100μM) ou baixa (10μM) de BLI
antes da MIV (Leal et al., 2006, dados não publicados).
O bloqueio da meiose deve ser induzido de forma reversível e também não deve produzir
danos estruturais ao oócito. E efeito do uso da BLI sobre o citoesqueleto (microtúbulos e
microfilamentos) e alguns aspectos da maturação citoplasmática como a migração de mitocôndrias
e grânulos corticais (GC) também foram analisados. O bloqueio da meiose não provocou alterações
observáveis ao citoesqueleto (Adona, 2006), observação importante, pois a reorganização da
distribuição das organelas e dos cromossomos durante a maturação é dependente do citoesqueleto
e importante para a maturação do oócito (Connors et al., 1998; Kim et al., 2000; Sun et al.,
2001abc). A migração dos GC foi bloqueada, indicando que tal migração é de alguma forma
também controlada pelo MPF. As mitocôndrias por outro lado, migraram em parte dos oócitos,
indicando que o MPF pode não ser o responsável ou único responsável pelo controle da migração
de mitocôndrias nos oócitos. Após a remoção da BLI, a migração das organelas durante a maturação
ocorreu de forma similar aos oócitos apenas maturados in vitro, indicando que ao menos esses
parâmetros não são negativamente afetados pelo bloqueio meiótico induzido in vitro com BLI.
De forma geral, os trabalhos indicam que o bloqueio da meiose per se, não é capaz de
mimetizar todas as condições a que se submete um oócito dentro do um folículo antes da
maturação. A maioria dos estudos utiliza condições de cultivo com meios relativamente pobres,
sendo TCM-199 sem aditivos (Ponderato et al., 2001; Lagutina et al., 2002; Adona, 2006) ou
acrescidos apenas de BSA (Kubelka et al., 2000; Imai et al., 2003; Adona e Leal, 2004), SFB
(Hashimoto et al, 2002; Ponderato et al., 2002; Coy et al., 2005a), hormônios (Beker van
Woundenberg et al., 2006). Mais estudos são necessários para determinar melhores condições
de cultivo durante o bloqueio (pré-maturação) e a maturação, que poderão resultar em protocolos
mais eficazes para a PIV.
De toda forma, o bloqueio da meiose pode ser usado como ferramenta de pesquisa como
modelo para compreensão dos mecanismos envolvidos no envelhecimento do oócito (Tatone et
al., 2006), em estudos sobre o controle da identificação de marcadores de competência (Sanfins
et al., 2004), o efeito de diferentes fatores durante o período de bloqueio da meiose como
hormônios (Sirard e Coenen, 1994; Beker van Woundenberg et al., 2006) ou fontes energéticas
(Bilodeau-Goeseels, 2006), controle dos vários processos envolvidos na maturação do oócito
como condensação de cromossomos (Kubelka et al., 2002; Jeliková e Kubelka, 2006), expansão
das células do cumulus (Vigneron et al., 2003), vias de sinalização (Vigneron et al., 2004b),
tradução, transcrição (Vigneron et al., 2004a) e poliadenilação de RNAm (Lequarre et al., 2004).
Além disso, o bloqueio pode ser utilizado para flexibilização de horários de maturação mais
convenientes para procedimentos de FIV ou clonagem (Imai et al., 2002; Lagutina et al., 2002),
transporte de oócitos aspirados em locais distantes dos laboratórios de PIV (Hashimoto et al.,
2003). Mais conhecimentos acerca do oócito e do ambiente folicular a que é exposto in vivo,
aliado aos dados obtidos de estudo in vitro, permitirão o desenvolvimento de condições mais
eficientes para a produção de embriões in vitro.
Conclusões
Apesar dos grandes avanços na produção in vitro, a obtenção de embriões se mantém em

média nos 30-40%. Parte do problema reside na qualidade intrínseca do oócito utilizado nos
procedimentos de maturação, fecundação e cultivo in vitro. A competência para o desenvolvimento
do oócito parece se influenciada, ao menos em parte, pelo período que permanece no folículo
antes da maturação, onde sofre uma série de modificações chamadas de capacitação ou pré-
maturação. Ao remover os oócitos do ambiente folicular para cultivo in vitro, a meiose é logo
s138
retomada e a fase de capacitação é interrompida. A utilização de drogas que interferem no controle

da meiose do oócito, permite mantê-lo bloqueado in vitro para que tenha tempo adicional para
passar pelo processo de capacitação. Tal processo, porém, bem como o próprio controle da meiose,
não estão completamente elucidados.
Embora a indução do bloqueio meiótico in vitro não seja capaz de melhorar o
desenvolvimento embrionário, pode ser uma ferramenta importante para estudar diferentes
aspectos da biologia do oócito, envolvendo o controle da meiose e sua preparação para tornar-se
um gameta competente para o desenvolvimento. À medida que se tenham mais dados acerca do
que ocorre com o oócito dentro do folículo dominante e do controle do ciclo celular meiótico do
gameta feminino, melhores condições haverá para o desenvolvimento de protocolos mais eficientes
de PIV.
Agradecimentos
À Faperj e Fapesp pela concessão de auxílios à pesquisa. À Capes, CNPq, Faperj e Fapesp pela
concessão de bolsas. À UENF e FZEA-USP pelo apoio institucional. Aos estudantes de graduação
e pós-graduação, técnicos e colaboradores dos trabalhos realizados.
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Peter J. Hansen
Department of Animal Sciences, University of Florida, Gainesville, Florida 32611-0910

Endereço para correspondência e pedidos de reimpressão: P.O. Box 110910, Gainesville, FL
32611-0910; Telefone: 352-392-5590; Fax: 352-392-5595; Hansen@animal.ufl.edu.
Resumo
A transferência de embriões pode ser uma estratégia eficaz para melhorar a fertilidade em
vacas sob stress térmico porque a maioria dos efeitos do stress térmico na redução da fertilidade
ocorrem antes do estágio de blastocisto, quando os embriões são normalmente transferidos. Além
disso, os efeitos do stress térmico na detecção de cio, que limitam a capacidade de transferir os
embriões, podem ser contornados através do uso de protocolos de sincronização da ovulação e
da transferência de embriões em tempo fixo. Pode-se melhorar o resultado de transferências de
embriões sob condições de stress térmico através da exposição dos embriões ao IGF-I (insulin-
like growth factor-I), que provavelmente age como uma molécula termoprotetora. Embriões
produzidos por fertilização in vitro a partir de oócitos coletados em abatedouros são fonte barata
e prontamente disponível para programas de transferência de embriões em larga escala durante
períodos de stress térmico. Atualmente, embriões produzidos in vitro têm uma reduzida capacidade
de sobrevivência após a criopreservação e subsequente transferência para receptoras. Há também
a preocupação com a proporção entre sexos e a incidência de anormalidades fetais. Para a
otimização de programas de transferência utilizando embriões produzidos in vitro, será necessário
o desenvolvimento de condições de cultivo que produzam embriões com propriedades mais
próximas daqueles produzidos in vivo. O aperfeiçoamento dos processos de produção, seleção e
transferência de embriões, assim como o manejo de receptoras, deve propiciar condições para
que a transferência de embriões possa ser um método econômico para melhorar a fertilidade.
Palavras-chave: transferência de embriões, fertilização in vitro, transferência de embriões em
tempo fixo, stress térmico, gado leiteiro, fertilidade
I. Transferência de embriões como tratamento para melhorar a fertilidade
As tecnologias de transferência de embriões em bovinos têm sido desenvolvidas

primariamente como um meio de aprimorar a seleção genética. A transferência de embriões pode
ser usada para aumentar a intensidade e a precisão da seleção, e também permite que os embriões
sejam examinados para a presença de alelos específicos desejáveis antes da transferência (vide
Hansen & Block, 2004). Teoricamente, a transferência de embriões também deve melhorar a
fertilidade, porque perdas de gestação causadas por problemas na oogênese, ovulação, maturação
do oócito, fertilização ou desenvolvimento embrionário inicial podem ser contornadas através
da transferência de um blastocisto saudável. Existe a necessidade desta utilização da TE em
vacas em lactação por causa do declínio na fertilidade nessa população nos últimos 30-50 anos
(Royal et al., 2000; Lucy, 2001). Usando a tecnologia atual, entretanto, as taxas de gestação em
receptoras de embrião em lactação não são superiores às taxas de gestação após inseminação
artificial (Rodrigues et al., 2004; Sartori et al., 2006). O aperfeiçoamento dos processos de
s145
produção, seleção e transferência de embriões, assim como o manejo de receptoras, deve propiciar
condições para que a transferência de embriões possa ser um método eficaz e econômico para
melhorar a fertilidade.
Existe, contudo, uma situação onde a transferência de embriões pode ser usada para melhorar
a fertilidade com a tecnologia existente, que é com vacas em lactação submetidas a stress térmico.
A transferência de embriões pode ser uma estratégia eficaz para melhorar a fertilidade em vacas
sob stress térmico porque a maioria dos efeitos do stress térmico na redução da fertilidade ocorrem
antes do estágio de blastocisto, quando os embriões são normalmente transferidos (Ealy et al.,
1994). Os benefícios da transferência de embriões durante períodos de stress térmico foram
primeiro descritos em dois experimentos em rebanhos comerciais na Flórida, nos quais vacas
em lactação foram inseminadas ou receberam embriões produzidos por superovulação, durante
o verão (Putney et al., 1989a; Drost et al., 1999). Em ambos experimentos, as taxas de gestação
foram maiores para as vacas que receberam embriões do que para as que foram inseminadas.
Posteriormente, os benefícios da transferência de embriões durante o verão na Flórida foram
demonstrados usando embriões produzidos in vitro transferidos a fresco (não criopreservados)
(Ambrose et al., 1999; Al-Katanani et al., 2002a). Um resumo dos resultados dos trabalhos na
Flórida é mostrado na Tabela 1.
Tabela 1. Eficácia da TE para melhorar as taxas de gestação de vacas Holandesas em

lactação na Flórida durante o verão.a
Tratamento Taxa de gestação (n)b Referência
IA 13.5% (524) Putney et al., 1989a
TE, embrião SO a fresco 29.2% (113)
IA 24.1% (84) Drost et al., 1999

TE, embrião SO congelado 35.4% (48)
TE, embrião PIV congelado 18.8% (48)
IATF 4.9% (n=390 total) Ambrose et al., 1999

TETF, embrião PIV a fresco 14.3%
TETF, embrião PIV congelado 4.8%
IATF 6.2% (68) Al-Katanani et al., 2002ª

TETF, embrião PIV fresco 19.0% (33)
TETF, embrião PIV vitrificado 6.5% (54)
a
Abreviaturas: IA, inseminação artificial; TE, transferência de embriões; PIV, embrião produzido in
vitro; SO, embrião produzido por superovulação; IATF, inseminação artificial em tempo fixo;
TETF, transferência de embriões em tempo fixo.
b
A gestação foi diagnosticada por palpação retal entre 40-60 dias de gestação
A transferência de embriões em larga escala pode ser desenvolvida como um método prático
para alcançar um alto grau de fertilidade durante períodos de stress térmico. Para alcançar este
objetivo, será necessário um maior refinamento na tecnologia de embriões para que a TE possa
ser feita em larga escala e de modo econômico. Esta revisão irá discutir as mudanças fisiológicas
induzidas pelo stress térmico que fazem com a TE seja útil para melhorar a fertilidade, identificar
alguns dos fatores que determinam a eficácia da TE e resumidamente destacar áreas de pesquisa
futura.
s146
II. Bases fisiológicas para a utilização da TE para melhorar a fertilidade durante períodos
de stress térmico
A idéia que a TE pode melhorar a fertilidade durante períodos de stress térmico é baseada
em duas características dos efeitos do stress térmico na reprodução. Primeiro, o stress térmico
tem efeitos significativos na oogênese, no desenvolvimento folicular, na maturação do oócito,
na fertilização e no desenvolvimento embrionário inicial. Segundo, os efeitos do stress térmico
diminuem no estágio de blastocisto. Dessa forma, um embrião transferido para uma receptora
sob stress térmico tem uma boa probabilidade de desenvolvimento subsequente.
Oogênese . Uma das causas da infertilidade durante períodos de stress térmico é o dano
causado ao oócito durante a oogênese. Por isso, a competência do oócito para a fertilização e a
manutenção do desenvolvimento embrionário subsequente é reduzida durante o stress térmico.
Em vacas holandesas, a taxa de fertilização de oócitos foi reduzida no verão quando avaliada in
vivo (Sartori et al., 2002) ou in vitro (Rocha et al., 1998; Zeron et al., 2001). Também existem
relatos de redução na capacidade dos oócitos em formarem embriões e se desenvolverem até o
estágio de blastocisto durante o verão (Rutledge et al., 1999; Al-Katanani et al., 2002b). Oócitos
coletados no verão também diferiram daqueles coletados durante o inverno com relação à
composição de ácidos graxos, tendo os primeiros uma percentagem maior de ácidos graxos
saturados (Zeron et al., 2001).
Os efeitos na competência dos oócitos podem persistir por várias semanas após o término
do stress térmico (Roth et al., 2001a), sugerindo que o oócito se torna comprometido ainda na
oogênese. De fato, a produção de esteróides por folículos de tamanho médio e pré-ovulatórios
foi reduzida pelo stress térmico ocorrido 20 e 26 dias antes para folículos médios e pré-ovulatórios,
respectivamente (Roth et al., 2001b). Estes autores estimaram que os danos aos folículos
observados neste estudo ocorreram em pequenos folículos em início de fase antral de 0,5 a 1 mm
de diâmetro.
O mecanismo pelo qual o stress térmico compromete a oogênese não é conhecido. Poderiam
haver efeitos diretos da hipertermia no oócito em desenvolvimento, mas estes efeitos não foram
estudados. Além disso, o stress térmico pode alterar a dinâmica folicular, a expressão gênica e a
esteroidogênese [vide Wolfenson et al. (2000) e trabalhos mais recentes de Roth et al. (2000),
Roth et al. (2001b), Argov et al. (2005), e Bridges et al. (2005)].
Maturação do oócito. O oócito permanece susceptível ao stress térmico durante o período
pré-ovulatório. A exposição de vacas superovuladas a stress térmico por 10 h a partir do início do
cio reduziu a proporção de embriões classificados como normais coletados no dia 7 após o cio
(Putney et al., 1989b). Alguns dos efeitos do stress térmico durante este período poderiam
refletir alterações na função folicular assim como na maturação do oócito. Os efeitos de
temperaturas elevadas na maturação de oócitos não foram esclarecidos. Em vários estudos, o
choque térmico durante a maturação reduziu a proporção de oócitos que se tornaram blastocistos
após a fertilização. Entretanto, os resultados entram em conflito sobre a possibilidade desta
redução ocorrer tanto na taxa de fertilização quanto na capacidade um embrião clivado se tornar
blastocisto (Roth & Hansen, 2004a, 2004b) ou somente no potencial de desenvolvimento em
blastocisto (Edwards & Hansen, 1996; Ju et al., 1999; Lawrence et al., 2004; Payton et al., 2004;
Edwards et al., 2005; Ju et al., 2005). Alguns trabalhos indicam que a exposição de oócitos em
maturação a 41oC reduziu a proporção de oócitos que completou a maturação nuclear (Payton et
al., 2004; Roth & Hansen, 2005), aumentou a proporção dos que tiveram formação anormal do
fuso meiótico (Tseng et al., 2004; Ju et al., 2005; Roth & Hansen, 2005), e induziu a formação de
pró-núcleos apoptóticos (Roth & Hansen, 2004a, 2004b, 2005). Além disso, os efeitos do
s147
choque térmico durante a maturação na proporção de oócitos que clivaram e se tornaram

blastocistos após a fertilização foi evitada pela inibição da apoptose (Roth & Hansen, 2004a,
2004b, 2005). Esses resultados sugerem que a apoptose é a causa da alteração na competência do
oócito causada por choque térmico. Por outro lado, outro estudo observou que a exposição de
oócitos em maturação a 41ºC acelerou o término da maturação nuclear e citoplasmática (Edwards
et al., 2005).
Desenvolvimento embrionário. Após a fertilização, o embrião no estágio de pré-implantação
permanece muito susceptível a alterações causadas por temperaturas elevadas. Por conseguinte,
o stress térmico in vivo (Dunlap & Vincent, 1971; Putney et al., 1988a; Ealy et al., 1993) ou a
exposição a temperaturas elevadas in vitro (Edwards & Hansen, 1997; Ju et al., 1999; Krininger
et al., 2002; Paula-Lopes et al., 2003a; Sakatani et al., 2004) reduz o potencial de embriões no
estágio de pré-implantação de se desenvolver até o estágio de blastocisto. Alterações no
desenvolvimento estão associadas a uma diminuição da síntese protéica (Edwards et al., 1997),
ao “inchaço” mitocondrial e mudanças no citoesqueleto (Rivera et al., 2003, 2004a) e ao aumento
na formação de radicais livres (Sakatani et al., 2004).
À medida que o embrião progride no seu desenvolvimento, ele se torna mais resistente aos
efeitos adversos do choque térmico. O stress térmico reduziu o desenvolvimento e a viabilidade
de embriões no dia 8 após o cio quando as vacas superovuladas foram expostas ao stress térmico
no dia 1 após o cio, mas não quando o mesmo ocorreu nos dias 3,5 ou 7 (Ealy et al., 1993). In
vitro, o choque térmico causou uma maior redução no desenvolvimento subsequente dos embriões
quando aplicado nos estágios de 2 ou 4-8 células do que quando aplicado nos estágios posteriores
(Edwards and Hansen, 1997; Ju et al., 1999; Krininger et al., 2002; Paula-Lopes et al., 2003a;
Sakatani et al., 2004).
Os mecanismos responsáveis pela aquisição da termotolerância não são bem compreendidos.
Coincidentemente, a aquisição da termo-resistência embrionária está relacionada à grande ativação
do genoma embrionário que ocorre no estágio de 8 células (Memili & First, 2000). Um trabalho
indica que ocorre a produção de substâncias reativas ao oxigênio em embriões nos dias 0 e 2
após a fertilização, mas não em embriões nos dias 4 e 6 (Sakatani et al., 2004). O choque
térmico no estágio de 2 células resultou em inibição do desenvolvimento no estágio de 8-16
células (Rivera et al., 2004b) e pode ser que o choque térmico seja tão eficiente em bloquear o
desenvolvimento em estágios iniciais de clivagem porque a transição materno-zigótica é
comprometida.
Blastocistos. O fato de que os efeitos do choque térmico sobre o desenvolvimento do
embrião diminuem à medida que o desenvolvimento progride (Edwards & Hansen, 1997; Ju et
al., 1999; Krininger et al., 2002; Paula-Lopes et al., 2003a; Sakatani et al., 2004) e que o stress
térmico no dia 7 após o cio não teve nenhum efeito na sobrevivência de embriões coletados no
dia 8 (Ealy et al., 1993) sugere que o blastocisto é um embrião que aumentou substancialmente
a resistência ao choque térmico. Por esta razão, o stress térmico deve ter pouco efeito na fertilidade
de receptoras de embrião. De modo compatível com esse conceito, dados de um laboratório de
TE comercial do sul dos Estados Unidos indicaram que a proporção de receptoras que permaneram
gestantes após a transferência não foi afetada pelas temperaturas médias do ar nos 10 dias após a
transferência, mesmo em vacas em lactação (Putney et al., 1988b). Da mesma forma, não houve
variação sazonal na taxa de gestação após a transferência de embriões produzidos in vivo em um
experimento usando vacas em lactação no Brasil, apesar da fertilidade ter diminuído em animais
inseminados no verão (Rodrigues et al., 2004). Este estudo é um excelente exemplo da eficácia
da TE para melhorar a fertilidade em condições de stress térmico e é ilustrado na Figura 1. Como
discutido a seguir, entretanto, é possível que o stress térmico da receptora possa afetar a
s148
sobrevivência embrionária sob certas circunstâncias, tanto porque o desenvolvimento embrionário

é diretamente afetado como porque o ambiente uterino torna-se alterado.
Figura 1. A transferência de embriões evita a variação sazonal nas taxas de gestação (número de
animais gestantes/ número de animais inseminados ou que receberam embriões) no
Brasil. Vacas Holandesas em lactação foram inseminadas ou receberam um embrião,
produzido por superovulação, a fresco ou descongelado. Os meses nos quais a
temperatura média do ar ambiente foi menor do que 22,5ºC são mostrados com a barra
cinza. Os dados foram adaptados de Rodrigues et al. (2004).
III. Fatores determinantes da eficácia da TE no aumento da fertilidade sob condições de

stress térmico
Produção de embriões in vivo vs in vitro. Os primeiros estudos demonstrando um aumento

nas taxas de gestação para receptoras de embrião no verão quando comparadas com vacas
inseminadas foram feitos utilizando embriões produzidos por superovulação (Putney et al., 1989a;
Drost et al., 1999). Posteriormente, foi demonstrado que um aumento na fertilidade durante o
verão poderia ser alcançado com embriões produzidos por fertilização in vitro (Ambrose et al.,
1999; Al-Katanani et al., 2002). Um resumo desses estudos é apresentado na Tabela 1. Nota-se
que a transferência de embriões produzidos in vitro, comparada à inseminação, só resultou em
maiores taxas de gestação quando os embriões foram transferidos a fresco. Não houve melhora
na taxa de gestação comparada à inseminação artificial quando embriões produzidos n vitro
foram submetidos ao congelamento convencional (Drost et al., 1999; Ambrose et al., 1999) ou
vitrificação (Al-Katanani et al., 2002).
Os problemas associados à criopreservação de embriões produzidos in vitro são vários,
não se limitando a receptoras sob stress térmico. Será necessário o aperfeiçoamento das condições
de cultivo ou das técnicas de criopreservação para tornar viável a transferência de embriões
produzidos in vitro e criopreservados. Técnicas de vitrificação promissoras têm sido descritas
(Vajta and Kuwiyama, 2006) e talvez seja possível melhorar a sobrevivência dos embriões ao
congelamento através da alteração do metabolismo lipídico durante o cultivo (Seidel, 2006).
s149
Outros problemas associados a embriões produzidos in vitro, incluindo a redução nas taxas de
gestação mesmo com embriões a fresco, a alteração da proporção entre os sexos e a ocorrência
da síndrome do bezerro grande [vide revisões de Hansen & Block (2004) e Farin et al. (2006)]
também devem ser equacionados através da mudança nas condições de cultivo ou através de
uma melhor seleção de oócitos ou embriões.
TE em tempo fixo. Programas de TE que dependem da detecção de cio para alcançar a
sincronização entre a receptora e o embrião são ineficientes durante períodos de stress térmico
porque muitas vacas em cio não são detectadas. Uma análise de dados de fazendas leiteiras da
Flórida indicou que 76-82% dos cios não foram detectados no verão (Thatcher & Collier, 1986).
A baixa detecção de cios durante o verão é o resultado dos efeitos do stress térmico sobre a
intensidade e duração do cio (vide Hansen & Aréchiga, 1999 para revisão).
Pode-se contornar as consequências da baixa detecção de cio através da TE em tempo fixo
após a utilizaçãode um dos protocolos de sincronização da ovulação desenvolvidos para
inseminação em tempo fixo. Um protocolo típico de TE em tempo fixo usado em nosso laboratório,
que é baseado no protocolo OvSynch (Pursley et al., 1995), está detalhado na Tabela 2. As taxas
de gestação em vacas secas foram semelhantes entre aquelas submetidas a TE em tempo fixo e
inseminação em tempo fixo (Block et al., 2005). Além disso, como mostrado na Tabela 1, as
taxas de gestação para vacas em lactação no verão foram superiores para receptoras submetidas
a TE em tempo fixo do que para vacas submetidas a inseminação em tempo fixo, apenas quando
os embriões não eram criopreservados (Ambrose et al., 1999; Al-Katanani et al., 2002). Apesar
das taxas de gestação terem sido maiores para as receptoras submetidas a TE em tempo fixo, elas
não foram ótimas e variaram de 14-19%. Entre 22-32% das vacas que receberam embriões nesses
estudos foram classificadas como não tendo sido sincronizadas de modo bem sucedido, porque
a concentração de progesterona no plasma no dia suposto da ovulação estava elevada ou porque
a concentração de progesterona no dia da transferência estava baixa. Entre as receptoras
sincronizadas, as taxas de gestação após a TETF foram de 17,5-27%. A melhora na eficiência
dos protocolos de sincronização da ovulação irá melhorar os resultados dos procedimentos de
transferência de embriões em tempo fixo.
Tabela 2. Protocolo recomendado para transferência de embriões em tempo fixo usando

embriões produzidos in vitro.
Dia Procedimento
Dia 0 Injeção de 100 μg GnRH, i.m.
Dia 7 Injeção de 25 mg prostaglandina F2α, i.m.
Dia 9 Injeção de 100 μg GnRH, i.m.
Dia 10 (Dia previsto para a ovulação)
Dia 17 Transferir a fresco os embriões produzidos in vitro fertilizados no dia 10
A transferência deve ser feita apenas para as vacas com corpo lúteo - colocar o
embrião no corno uterino adjacente ao corpo lúteo.
Stress térmico na doadora. Quando os embriões são transferidos a fresco durante o verão,
os oócitos usados para a fertilização in vitro e os embriões produzidos por superovulação são
obtidos de uma fêmea que é potencialmente sujeita ao stress térmico. Nós habitualmente tentamos
contornar esses efeitos comprando oócitos usados para a fertilização in vitro de fornecedores
localizados em áreas ao norte dos Estados Unidos. Esta estratégia provavelmente não é totalmente
eficaz em eliminar os efeitos do stress térmico na doadora de oócitos porque os efeitos sazonais
na taxa de fertilidade (Sartori et al., 2002) e nos resultados da fertilização in vitro (Rutledge et
al., 1999) têm sido notados em Wisconsin, um estado com clima temperado.
s150
Uma questão importante é se o blastocisto formado de um oócito ou embrião derivado de

uma fêmea sob stress térmico tem sua capacidade de sobrevivência pós-transferência
comprometida ou, por outro lado, se embriões que se desenvolvem em blastocistos têm alta
qualidade devido ao ambiente térmico anterior. Recentemente, Barros et al. (2006) relataram
que as taxas de gestação foram menores para vacas que receberam blastocistos da raça Angus
produzidos in vitro, que foram expostos in vitro a temperatura de 41oC por 12 h, 96 h após a
inseminação, do que blastocistos semelhantes que não foram expostos ao choque térmico. São
necessários mais trabalhos para determinar a capacidade de desenvolvimento de blastocistos
originados de oócitos ou embriões expostos à hipertermia in vivo.
Stress térmico da receptora. Como afirmado anteriormente, o blastocisto é mais resistente
ao stress térmico do que o oócito ou o embrião em estágios iniciais de clivagem e, em dois
experimentos, não houve efeito aparente das condições ambientais nas taxas de gestação após a
TE (Putney et al., 1988b, Rodrigues et al., 2004). Apesar disso, o embrião não está incólume ao
stress térmico após a transferência e é possível que a gestação em receptoras de embrião possa
ser comprometida pelo stress térmico em algumas situações. A aplicação experimental de stress
térmico de 8-16 dias após o cio reduziu o crescimento do concepto em gado de corte (Garrett et
al., 1988). O stress térmico também pode diminuir as concentrações de progesterona circulantes
(Wolfenson et al., 2000) e reduzir o fluxo sanguíneo no útero (Roman-Ponce et al., 1978); esses
efeitos possivelmente poderiam também comprometer a sobrevivência do embrião.
O efeito do stress térmico sobre a sobrevivência embrionária após a transferência de
blastocistos foi demonstrado por Vasconcelos et al. (2006) que verificaram que a temperatura
retal no dia da transferência estava negativamente associada a taxas de gestação em receptoras
da raça Holandesa em lactação no Brasil. Existe ainda um trabalho indicando uma maior perda
de gestações aos 34-45 e aos 90 dias de gestação em vacas inseminadas durante um período
quente, quando comparadas a vacas inseminadas durante um período frio (García-Ispierto et al.,
2006). Por outro lado, não houve efeito sazonal nas taxas de aborto em um rebanho leiteiro na
Flórida (Jousan et al., 2005).
Raça do embrião. Considerando-se o potencial do embrião de ser afetado pelo stress térmico
após a transferência, a identificação dos fatores que afetam a resistência de embriões transferidos
ao stress térmico poderia ser explorada para melhorar as taxas de gestação em receptoras de
embrião sob stress térmico. Um desses fatores é o genótipo do embrião. Diferenças genéticas
entre raças termotolerantes e termosensíveis podem ser estendidas ao nível celular, e embriões
de Bos indicus e de Romosinuano, um tipo de B. taurus termotolerante, são menos afetados por
choque térmico em cultivo do que embriões de Holandês ou Angus (Block et al., 2002; Paula-
Lopes et al., 2003b; Hernández-Cerón et al., 2004; Barros et al., 2006). Apesar da sobrevivência
pós-transferência de blastocistos da raça Angus produzidos in vitro ter sido reduzida através de
cultivo a 41ºC, não houve efeito do choque térmico in vitro na sobrevivência pós-transferência
de embriões da raça Nelore (Barros et al., 2006). Será importante determinar se as taxas de
gestação durante o verão podem ser melhoradas através da transferência de embriões
termotolerantes, comparadas à transferência de embriões de raças termosensíveis.
Uso do IGF-I (insulin-like growth factor-I) para melhorar a resistência térmica do
embrião. Outra forma de melhorar a resistência embrionária ao choque térmico é expor os
embriões ao IGF-I (insulin-like growth factor-I). O cultivo com IGF-I reduziu os efeitos do
choque térmico in vitro na indução da apoptose e no desenvolvimento até o estágio de blastocisto
(Jousan & Hansen, 2004; Jousan & Hansen, 2006). As taxas de gestação após a transferência de
embriões no verão também poderiam ser melhoradas se os embriões fossem tratados com IGF-
I durante o cultivo (Block et al., 2003). Em um estudo recente, foi demonstrado que os efeitos
benéficos da IGF-I não foram observados durante o inverno. As taxas de gestação aos 41-49 dias
s151
de gestação para receptoras em lactação no verão foram de 18% e 42% para vacas que receberam
embriões controle e embriões tratados com IGF-I, respectivamente. As taxas de gestação no
inverno, entretanto, foram de 28% e 22% para vacas que receberam embriões controle e embriões
tratados com IGF-I.
Fatores relacionados à receptora. A análise de vários conjuntos de dados nos as taxas de
gestação após transferências duplas foram avaliadas indica que a receptora é um fator determinante
no resultado da gestação após a TE (McMillan, 1998). Para vacas em lactação, um fator
determinante na sobrevivência embrionária após a transferências é a produção de leite - a taxa de
gestação em receptoras foi inversamente relacionada à produção de leite (Al-Katanani et al.,
2002; Vasconcelos et al., 2006).
Existem no momento algumas estratégias para modificar a fisiologia da receptora com
objetivo de melhorar a taxa de gestação. Foi relatado que o tratamento com somatrotopina bovina
no momento do cio ou próximo a ele melhora a taxa de gestação após a TE em vacas em lactação
(Moreira et al., 2002) mas não em vacas secas (Block et al., 2005). A eficácia desse tratamento
não foi avaliada para receptoras sob stress térmico. Também tem havido esforços para melhorar
a taxa de gestação em receptoras sob stress térmico através da administração de GnRH no dia 11
após a ovulação presumida, mas os resultados tem sido inconsistentes (Block et al., 2003; Franco
et al., 2006).
VII. Viabilidade da TE para melhorar a fertilidade durante o stress térmico - estado atual
e futuras linhas de pesquisa
A tecnologia existente é adequada para implementação de um programa de TE eficiente no

verão porque o aumento da fertilidade em relação à inseminação pode ser alcançado através da
transferência de embriões produzidos tanto por superovulação (embriões a fresco ou congelados)
como por fertilização in vitro (apenas embriões a fresco). Além disso, a TE em tempo fixo
permite que esse tipo de programa seja implementado de uma forma que contorne os efeitos do
stress térmico na detecção de cio.
Um aspecto fundamental na implementação de um programa de TE em larga escala é o
fornecimento dos embriões. Produzir embriões por superovulação é caro e, sob o aspecto prático,
pode ser difícil produzir uma quantidade adequada desses embriões para atender grandes fazendas
leiteiras. Embriões produzidos in vitro usando oócitos obtidos de material de abatedouro
representam uma fonte abundante e barata. Nossa experiência pessoal mostra que os fazendeiros
muitas vezes relutam em usar esses embriões por considerá-los geneticamente inferiores. Na
realidade, o valor genético de vacas descartadas é apenas ligeiramente inferior à média (Rutledge,
1997) e o mérito genético de embriões produzidos a partir de oócitos oriundos de abatedouros
pode ser melhorado sem custo através da seleção de touros com alta PTA (predicted transmitting
ability) para características desejáveis. Um único paete de sêmen caro de um touro de elite pode
ser usado para produzir muitos embriões. Além disso, sêmen sexado pode ser usado de modo
mais econômico para a FIV do que para a IA pela mesma razão.
Considerando o atual desenvolvimento das tecnologias e procedimentos para a identificação
permanente de bovinos, pode ser possível num futuro próximo a identificação de animais no
abatedouro e, através da consulta de registros individuais de desempenho em bancos de dados,
selecionar ovários baseados nas características produtivas do animal do qual eles foram originados.
Uma melhora no mérito genético de embriões produzidos in vitro pode ser obtida através da
utilização da técnica de punção folicular transvaginal guiada por ultrasom (van Wagtendonk de
Leeuw , 2005) para coletar oócitos de fêmeas valiosas do ponto de vista genético, apesar dessa
técnica também aumentar os custos e a mão de obra envolvidos.
s152
Apesar da vantagem que embriões produzidos in vitro oferecem em termos de obtenção e

custo, mais pesquisas se fazem necessárias para reduzir muitos problemas importantes associados
a esses embriões. Problemas associados à criopreservação e à redução da taxa de gestação já
foram mencionados. Outros problemas incluem alteração na proporção entre os sexos e a
ocorrência da síndrome do bezerro grande (Hansen & Block, 2004; Farin et al., 2006). Para
solucionar esses problemas, será necessária a identificação das condições de cultivo que induzem
mudanças a nível celular e molecular nos embriões produzidos in vitro semelhantes àquelas
ocorridas in vivo. Existe também a possibilidade de se aumentar a taxa de gestação através do
desenvolvimento de marcadores para a identificação de embriões com maior potencial de
sobrevivência pós-transferência, do aumento da resistência do embrião ao stress térmico após a
transferência (com o tratamento com IGF-I, por exemplo), e através de uma melhor compreensão
das bases fisiológicas responsáveis pelas diferenças de fertilidade entre receptoras, que podem
dessa forma ser tratadas para melhorar a fertilidade.
Existem fortes razões para empregar recursos na melhoria da eficiência da TE como
ferramenta para amenizar os efeitos do stress térmico na reprodução. O stress térmico pode
causar efeitos devastadores na fertilidade, particularmente para vacas em lactação produzindo
grandes quantidades de leite (Al-Katanani et al., 1999). Dados coletados na Espanha sugerem
que uma proporção significativa da recente redução da fertilidade em vacas leiteiras pode ser
atribuída ao aumento da sensibilidade desses animais ao stress térmico, juntamente com aumentos
na produção de leite (López-Gatius, 2000). Implementados de forma apropriada, programas de
TE podem ser uma ferramenta que permita aos produtores em climas tropicais maximizar a
produção de leite minimizando os efeitos do stress térmico sobre a fertilidade.
Agradecimentos
The author’s research has been supported by Grant No. US-3551-04 from the Binational
Agricultural Research and Development Fund, Grant No. 2004-34135-14715 from the USDA-
Tropical Subtropical Agricultural Research Program, and USDA Initiative for Future Agricultural
and Food Systems Program, Grant # 2001-52101-11318.
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PROGRAMA DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES PARA VACAS DE LEITE EM

AMBIENTE TROPICAL
José Luiz Moraes Vasconcelos*1; Daniela G. B. Demétrio1; Ricarda Maria dos Santos1; Débora
T. G. Jardina1, Carlos Alberto Rodrigues2; José Renato Chiari3
1 Departamento de Produção Animal - FMVZ – Unesp – Botucatu-SP; 2 Clínica Veterinária

Samvet – São Carlos-SP; 3 Samvet Embriões – Morrinhos-GO; * Autor correspondente:
vasconcelos@fca.unesp.br Telefone: 0xx14- 3811 7185 r 209
Resumo: A produção de leite e o estresse térmico são importantes fatores que reduzem a eficiência
reprodutiva. O uso da transferência de embriões deve ser estimulado como ferramenta para
aumentar a concepção em vacas de leite, pois pode restaurar pelo menos parte da fertilidade, já
que se evitam os efeitos negativos ocorridos no desenvolvimento folicular, na ovulação, na
fecundação e no desenvolvimento embrionário inicial (até o sétimo dia). Para diminuir as perdas
com falhas de observação de cio e aumentar a sincronia doadora-receptora, sugere-se a
sincronização da ovulação das receptoras. Os embriões a serem transferidos podem ser
provenientes de vacas em lactação, produzidos no inverno, para transferência em receptoras
sincronizadas, no verão. A seleção da doadora é importante para reduzir custos, pois é uma das
variáveis que mais afeta a produção de embriões.
Palavras chave: transferência de embriões, concepção, estresse térmico, sincronização; vacas
de leite
Introdução
A eficiência reprodutiva de vacas de leite de alta produção vem reduzindo nas últimas
décadas e está associada com o aumento da produção de leite (Nebel & McGilliard, 1993; Lucy,
2001; Washburn et al., 2002). Em vacas leiteiras, a correlação entre produção de leite e ingestão
de matéria seca (IMS) é alta e positiva (Harrison et al., 1990). A relação inversa entre a IMS e a
concentração plasmática de progesterona (P4) foi verificada em estudos realizados por Parr et al.
(1993) em ovelhas e Vasconcelos et al. (2003) em vacas. A P4 controla a pulsatilidade do LH
(Bergfeld et al., 1996), a dinâmica folicular (Stock & Fortune, 1993), o ambiente uterino (Thatcher
et al., 2001; Green et al., 2005) e influencia o desenvolvimento embrionário (Mann & Lamming,
2001).
O desempenho reprodutivo também é afetado por efeitos deletérios do estresse térmico no
oócito, na fecundação e no desenvolvimento embrionário inicial (Hansen & Arechiga, 1999).
Vacas em lactação têm o metabolismo aumentado decorrente da produção de leite, o que aumenta
a produção de calor, que quando associado às altas temperaturas ambientais causam problemas
na manutenção dos processos biológicos (Kadzere et al., 2002). Temperaturas elevadas reduzem
a proporção de embriões que continuam o desenvolvimento (Hansen & Arechiga, 1999). Sartori
et al. (2002) e Leroy et al. (2005) demonstraram que os embriões produzidos nas vacas em
lactação possuem qualidade inferior aos produzidos em vacas não lactantes, novilhas ou vacas
de corte.
A transferência de embriões é uma ferramenta importante para aumentar a probabilidade
de concepção de vacas em lactação, pois evita diversos fatores deletérios que prejudicam antes
da fertilização e no desenvolvimento embrionário nos primeiros sete dias.
s159
Influência da produção de leite, IMS, concentração de P4 e estresse térmico na eficiência

reprodutiva
A produção de leite está altamente relacionada com a IMS (Harrison et al., 1990). O estresse
térmico leva a redução da IMS (West, 1994), e este efeito é mais exacerbado em multíparas do
que em primíparas (Holter et al., 1996, 1997). Para reduzir os impactos negativos da redução de
IMS na produção de leite, a densidade da dieta oferecida às vacas é aumentada (Morrison, 1983;
Cummins, 1989) garantindo o suplemento dos nutrientes necessários para a produção de leite.
Vacas de alta produção de leite apresentam menores concentrações plasmáticas de P4
(Vasconcelos et al., 1999), provavelmente devido aos picos de ingestão de dieta com alta densidade
nutricional, levando ao incremento do fluxo sangüíneo para o fígado, que resulta em maior
metabolização da P4 (Vasconcelos et al., 2003). Como o fígado é o local de maior metabolização
de P4 (Parr et al., 1993), estima-se que o aumento da ingestão aumente a taxa de metabolização,
devido ao aumento do fluxo sangüíneo para o fígado.
Santos (2005), trabalhando com vacas Holandesas não-lactantes com P4 exógena
(dispositivo intravaginal de P4) ou endógena (presença de corpo lúteo), mantidas em pastagem e
recebendo quantidades diferentes de concentrado, em dois fornecimentos diários, observou que,
as vacas que recebiam oito quilogramas de concentrado por dia, apresentaram menor concentração
plasmática de P4 quatro e doze horas após a ingestão do mesmo, do que aquelas que receberam
dois kg.
A P4 controla as mudanças do ambiente uterino e influencia o desenvolvimento embrionário
(Mann & Lamming, 2001; Green et al., 2005; Mann et al., 2006). A comunicação entre as células
do trofoblasto embrionário e as células epiteliais do endométrio é crítico para a manutenção do
CL e para a sobrevivência do embrião (Thatcher et al., 2001), e essa sincronia entre ambiente
uterino e embrião é essencial para o estabelecimento da gestação. Stronge et al. (2005) concluíram
que a baixa P4 cinco a sete dias após a IA está associada à baixa taxa de fertilidade em vacas em
lactação. Mann et al. (2006) observaram que a suplementação de progesterona cinco dias após a
IA resultou em um maior desenvolvimento do embrião. Esses achados sugerem que a concentração
sérica de P4 é importante principalmente nos primeiros dias após a inseminação e talvez seja uns
dos fatores que determinam o sucesso ou a falha da gestação de vacas em lactação.
O desempenho reprodutivo também é afetado por efeitos deletérios do estresse térmico no
oócito, na fecundação e no desenvolvimento embrionário inicial (Hansen & Arechiga, 1999).
Vacas em lactação têm o metabolismo aumentado decorrente da alta IMS, o que aumenta a
produção de calor, que quando associado às altas temperaturas ambientais causam problemas na
manutenção dos processos biológicos (Kadzere et al., 2002). As vacas de maior produção têm
maiores problemas, devido a maior dificuldade na dissipação do calor produzido (Kadzere et al.,
2002). O aumento da temperatura corporal tem efeitos negativos diretos na função celular (Kadzere
et al., 2002). A elevada produção leiteira exerce efeito negativo na qualidade do oócito e no
desenvolvimento embrionário inicial que pode ser potencializado pelo estresse térmico (Hansen
& Arechiga, 1999).
O estresse térmico e a alta produção de leite levam à redução da taxa de observação de cio
(Washburn et al., 2002), provavelmente devido à diminuição do tempo de manifestação de estro
(Lopez et al., 2004). Diferentes tipos de estresse podem levar à falha da ovulação (Lopez-Gatius
et al., 2005), que é uma das causas de infertilidade em rebanhos leiteiros (Wiltbank et al., 2002).
Lopez-Gatius et al. (2005) observaram falha de ovulação de 3,4% em estações com temperaturas
ambientais até 25°C e de 12,4% quando as temperaturas foram superiores a isto. Sartori et al.
(2002) observaram que com o aumento da temperatura ambiente, a temperatura corporal de
novilhas (38,7 ± 0,01°C) elevou menos (p<0,05) que a de vacas em lactação (39,3 ± 0,03°C), e
s160
que em novilhas, por serem menos susceptíveis a essas variações climatológicas, não houveram
alterações nos índices reprodutivos no verão.
Os períodos próximos à ovulação até o terceiro dia do desenvolvimento embrionário são
mais susceptíveis ao estresse térmico, e temperaturas elevadas reduzem a proporção de embriões
que continuam em desenvolvimento (Ealy et al., 1993). Os efeitos do estresse térmico reduzem
conforme os embriões se tornam mais desenvolvidos, ou seja, o embrião adquire resistência aos
efeitos negativos com o passar do tempo (Ealy et al., 1993; Hansen & Arechiga, 1999). Ju et al.
(2005) verificaram que oócitos expostos a 42°C durante quatro horas apresentaram alterações
nos componentes responsáveis pela meiose. Apesar de não haver diferença na taxa de clivagem,
houve redução da porcentagem de blastocistos produzidos. Os embriões produzidos apresentaram
menor número de células, principalmente as trofoblásticas. Efeitos de altas temperaturas no
desenvolvimento embrionário após o sétimo dia também foram relatados por Ryan et al. (1993).
Sartori et al. (2002) recuperaram embriões e oócitos de vacas e novilhas Holandesas no
verão, seis dias após a observação de cio natural e verificaram que a taxa de fecundação foi
maior (p<0,05) em novilhas (100%) do que em vacas em lactação (55%), e a qualidade dos
embriões foi superior (p<0,05) em novilhas (72%) do que em vacas em lactação (33%). Esse
fato pode ser confirmado com dados de campo coletados por Santos (1999) na Companhia Agrícola
Nova América, em Assis, SP, durante os anos de 1996 a 1998, que mostram que as taxas de
concepção de novilhas caem pouco durante o verão, quando comparados com vacas em lactação
(Figura A). Quando Sartori et al. (2002) compararam vacas lactantes e não lactantes no inverno,
a taxa de fecundação não diferiu, porém a qualidade embrionária foi superior (p=0,06) em vacas
não lactantes (82%) do que em vacas em lactação (53%). Leroy et al. (2005) observaram que a
porcentagem de embriões grau 1 coletados de vacas em lactação superovuladas (13,1%) foi
inferior a de novilhas Holandesas (62,5%) ou vacas de corte (55,0%). Esses dados mostram que
a fecundação pode estar comprometida no verão, e que vacas em lactação possuem embriões de
menor qualidade.
Figura A: Taxa de concepção de vacas e novilhas durante o ano (1996 a 1998), Cia. Agrícola
Nova América, Assis, SP (dados de campo coletados por Santos, R.M. 1999).
Uso da transferência de embriões como ferramenta para aumentar a eficiência

reprodutiva
A transferência de embriões (TE) além de multiplicar os indivíduos geneticamente superiores

de um rebanho, pode ser utilizada para minimizar os efeitos negativos da alta produção de leite
e do estresse térmico na qualidade do oócito e desenvolvimento embrionário inicial (Putney et
al., 1989; Drost et al., 1994; Ambrose et al., 1999; Demétrio 2006).
s161
Putney et al. (1989) compararam IA e TE no verão. Embriões frescos produzidos em novilhas

foram transferidos em vacas Holandesas em lactação que possuíam CL e comparadas com todas
as vacas inseminadas. Houve aumento da taxa de concepção na avaliação da gestação aos 45
dias (13,5% IA x 29,2% TE).
Drost et al. (1999) compararam embriões congelados-descongelados produzidos in vivo
ou in vitro a partir de ovários de abatedouro com IA no verão. A avaliação da taxa de ovulação foi
pela presença do CL em vacas que receberam embrião e pela P4 no dia 7 (>1ng/ml) nas vacas
inseminadas. Houve acréscimo da taxa de concepção em relação a IA quando embriões produzidos
in vivo foram utilizados (35,4% in vivo x 18,8% in vitro x 21,4% IA).
Ambrose et al. (1999) compararam embriões produzidos in vitro a partir de ovários de
abatedouro, frescos ou congelados-descongelados, com IA no verão. As vacas foram sincronizadas
com o protocolo Ovsynch e aquelas que possuíam concentrações séricas de P4 d” 1,5ng/ml no
dia 0 e e” 2,0 ng/ml no dia 7 foram comparadas. Houve acréscimo da taxa de concepção em
relação a IA quando embriões produzidos in vitro frescos foram utilizados (17,5% fresco x 6,1%
congelado-descongelado x 6,7% IA).
Sartori et al. (2006) não obtiveram diferença na taxa de concepção entre IA (35,6%) e TE
(40,3%) em 365 dias de experimento. Os autores sugerem que não foi verificada diferença
possivelmente porque as temperaturas do ano do estudo não foram tão elevadas e porque 78,5%
dos embriões utilizados eram congelados.
No trabalho de Demétrio (2006) foi realizada a transferência de embriões frescos produzidos
em vacas Holandesas não-lactantes. O experimento foi conduzido em uma fazenda localizada
em Descalvado, SP, Brasil durante os meses de outubro de 2003 a setembro de 2004. Vacas
ciclando (n=1025) produzindo 33,3±7,2kg de leite por dia com 162±103,7 de dias em lactação
receberam PGF2α e foram divididas aleatoriamente em dois grupos: IA ou TE. As vacas que
apresentaram estro 48 a 96h após aplicação de PGF2α receberam IA (n=227) 12h após detecção
do estro ou TE (n=160) 6 a 8 dias após. Todas as vacas da TE receberam embriões frescos (grau
1 ou 2) de vacas Holandesas não lactantes produzidos in vivo. A taxa de ovulação foi de 84,8%
(328/387) e foi afetada negativamente pelo número de dias em lactação (p=0,05). A taxa de
concepção no dia 25, das vacas ovuladas foi de 37,9% (74/195) para IA e de 59,4% (79/133) para
TE (p<0,01).
Além da maior taxa de concepção, outra grande vantagem da TE em relação à IA é que na
TE há prévia avaliação da presença do CL no momento da inovulação. A avaliação da presença
do CL minimiza o decréscimo da probabilidade de concepção por falhas de ovulação, fator não
avaliado quando se utiliza IA.
Fatores que influenciam a taxa de concepção de receptoras holandesas lactantes
No trabalho de Demétrio (2006), que comparou vacas inseminadas e que receberam embrião,
verificou-se efeito positivo (p=0,03) da P4 do dia 7 na concepção no grupo IA enquanto que no
grupo TE não (Figura B). A produção de leite afetou negativamente a taxa de concepção do
grupo IA (p=0,04) mas não do grupo TE (Figura C). A temperatura corporal aferida no dia 7 (T7)
afetou negativamente a taxa de concepção do grupo IA (p=0,09) e do grupo TE (p=0,08; Figura
D). Quanto maior a concentração sérica de P4 no dia 7, maior a probabilidade de concepção no
grupo IA, enquanto que no grupo TE, não há efeito da concentração de P4 no dia 7 na probabilidade
de concepção. A P4 é importante no desenvolvimento embrionário antes do sétimo dia, já que as
vacas do grupo TE não foram influenciadas pela concentração sérica de P4, pois receberam
embrião desenvolvido em condições melhores. Maiores temperaturas corporais avaliadas no dia
7 afetaram negativamente da mesma maneira a IA e a TE, reduzindo a probabilidade de concepção
s162
e, portanto, a avaliação da temperatura corporal no dia 7 é importante para predizer a probabilidade

de concepção. A utilização da transferência de embriões deve ser estimulada como ferramenta
para aumentar concepção em vacas de leite de alta produção.
Jardina et al. (2006c) avaliaram os resultados de 873 transferências de embriões realizadas
no ano de 2005 em vacas Holandesas em lactação. Foram utilizados embriões frescos ou
congelados/descongelados produzidos em vacas lactantes ou não lactantes. As receptoras
receberam uma aplicação de PGF2α e foram observadas em estro 48 a 96 horas após. Nas vacas
que apresentaram estro, um embrião foi transferido nas receptoras com CL presente por palpação
retal, 6 a 8 dias após o estro. A taxa de concepção no dia 25 foi influenciada (p=0,053) pelo
sincronismo doadora-receptora (-1: 37,7%; 0: 46,9%; +1: 45,6%). Não foi detectado efeito de
estágio de desenvolvimento embrionário (M: 45,6%; BI: 41,8%; BL: 46,9%; BX: 43,8%),
qualidade do embrião (Grau 1: 44,2%; Grau 2: 47,4 %; Grau 3: 42,3 %), classificação do CL (CL
1: 47,9%; CL 2: 43,5% e CL 3: 30,0%), condição do embrião (fresco: 45,8% e congelado: 43,1%)
e das doadoras (em lactação: 45,5% e secas: 47,08%). A taxa de concepção no dia 39 foi
influenciada somente pela sincronismo doadora-receptora (-1: 29,9%; 0: 34,9%; +1: 38,2%;
p=0,021).
Estes dados sugerem que na seleção das receptoras Holandesas que deverão ser inovuladas,
a temperatura corporal da receptora e o sincronismo embrião/receptora são parâmetros que devem
ser considerados.
Figura B: Representação gráfica da probabilidade de concepção aos 25 dias das vacas ovuladas
com sincronismo 0 do grupo IA e TE em relação à concentração de P4 do dia 7, em
que “___” representa a probabilidade esperada para IA em relação a P4 do dia 7, e
“___” representa a probabilidade esperada para TE, “x” representam os dados
observados para IA e “o” para TE.
s163
Figura C: Representação gráfica da probabilidade de concepção aos 25 dias das vacas

ovuladas com sincronismo 0 em relação à produção de leite, em que “____”
representa a probabilidade de concepção esperada para IA em relação à produção de
leite, “_____” representa a probabilidade esperada para TE, “x” representam os dados
Figura D: Representação gráfica da probabilidade de concepção aos 25 dias das vacas ovuladas
com sincronismo 0 do grupo IA e TE em relação à temperatura corporal do dia 7, em
que “____” representa a probabilidade esperada de concepção para IA em relação a T7,
“_____” representa a probabilidade esperada para TE, “x” representam os dados
s164
Sincronização da ovulação de receptoras para transferência de embriões
Taxas de observação de cio menores do que 50% são comumente observadas em rebanhos
leiteiros e estão associadas à alta produção de leite (Washburn et al 2002). Lopez et al. (2004)
observaram uma diminuição no tempo de manifestação do estro nas vacas que produziam mais
de 39,5 kg de leite por dia e associaram à redução da concentração de estradiol circulante. A
sincronização da ovulação das receptoras para a realização de TE em tempo fixo (TETF) pode
minimizar os efeitos negativos do estresse térmico na observação cio, aumentando a utilização
das receptoras e maximizando o sincronismo doadora-receptora.
Jardina et al. (2006b) compararam a taxa de concepção de receptoras detectadas em cio
(n=43) após aplicação de PGF2a (Ciosin®, Coopers, 2 mL) com receptoras sincronizadas (n=49)
com o protocolo HEATSYNCH [dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR® 1,9 mg Pfizer
Saúde Animal, Brasil) + aplicação de GnRH (1 mL Fertagyl® Intervet) - 7 dias - remoção do
CIDR + aplicação de PGF2a (5 mL Lutalyse® Pfizer Saúde Animal, Brasil) - 1 dia - aplicação de
Cipionato de estradiol (0,5 mL ECP® Pfizer Saúde Animal, Brasil) – 24 a 48 horas – estro]. No
grupo que recebeu PGF2a, 41,8% (18/43) foram observadas em cio e inovuladas 6 a 8 dias após,
com avaliação da presença do corpo lúteo (66,7%; 12/18). O estro também foi detectado no
grupo sincronizado (57,1%, 28/49) e todas as vacas foram examinadas para detecção da presença
do corpo lúteo no dia da inovulação, e as vacas com CL foram inovuladas (79,6%, 39/49). A taxa
de concepção foi de 50,0% (6/12) e 53,9% (21/39) e a taxa de prenhez de 14,0% (6/43) e 42,9%
(21/49) para o grupo com observação de cio e para o grupo sincronizado, respectivamente. Animais
do grupo sincronizado (Protocolo HEATSYNCH) apresentaram a mesma taxa de concepção,
mas maior taxa de prenhez (p<0,01) que animais do grupo observação de cio (PGF2a + detecção
de cio). Vacas detectadas em cio após o protocolo HEATSYNCH tiveram a mesma concepção
das vacas não detectadas em cio (56,3 vs. 52,2%, respectivamente).
A transferência de embriões pode ser realizada com sucesso após o protocolo HEATSYNCH,
pois a taxa de concepção é mantida e a taxa de prenhez aumenta.
Fatores que influenciam a produção de embriões
Jardina et al. (2006a) avaliaram os resultados de 195 coletas de embriões (94 coletas em
vacas lactantes e 101 coletas em vacas não-lactantes) realizadas no ano de 2005, com o objetivo
de avaliar o efeito da fase da doadora (lactantes ou não-lactantes) e da estação do ano na produção
de embriões (número total de estruturas obtidas, de embriões viáveis e de não viáveis) em vacas
Holandesas. As estações do ano foram divididas em: 1 (janeiro, fevereiro e março, n=56); 2
(abril, maio e junho n=37); 3 (julho, agosto e setembro n=50) e 4 (outubro, novembro e dezembro
n=52). Foi detectado efeito de doadora em todas as variáveis (p<0,01), mostrando a importância
da seleção das doadoras. Foi detectado efeito de estação do ano no número de estruturas coletadas
(1: 10,2 ± 1,2; 2: 6,6 ± 1,0; 3: 10,0 ± 1,1; 4: 11,2 ± 1,2; p=0,016), e no número de embriões
viáveis (1: 3,7 ± 0,5; 2: 2,4 ± 0,5; 3: 5,9 ± 0,9; 4: 4,4 ± 0,7; p=0,001). Fase da doadora influenciou
o número de estruturas coletadas (lactantes: 10,9 ± 0,9 e não-lactantes: 8,7 ± 0,7; P<0,001), e de
embriões não viáveis (lactantes: 6,7 ± 0,8 e não-lactantes: 4,4 ± 0,5; P<0,01), porém não foi
detectado efeito da fase da doadora no número de estruturas viáveis (lactantes: 4,14 ± 0,5 e não-
lactantes: 4,29 ± 0,5). Estes dados mostram que o número de embriões viáveis é influenciado por
estação do ano e doadora, não sendo influenciado por fase da doadora (lactante ou não-lactante).
s165
Mortalidade embrionária
A mortalidade embrionária ocorre, principalmente, nos primeiros dias após fecundação e

durante o processo de placentação (Vanroose et al., 2000; Sartori, 2004). Os fatores que afetam
a morte embrionária ainda não estão bem caracterizados. Mais de 70% das causas de morte
embrionária são devido a causas não infecciosas, que geralmente são multifatoriais e de difícil
diagnóstico (Vanroose et al., 2000). Os índices de morte embrionária em vacas em lactação
variam de 10 a 60,5% (Vasconcelos et al., 1997; Cartmil et al., 2001; Moreira et al., 2001;
Chebel et al., 2003; Chebel et al., 2004; Sartori, 2004; Sartori et al., 2006). No estudo de Chebel
et al. (2004) verificou-se que a produção de leite, número de serviços anteriores e número da
lactação não afetaram a mortalidade embrionária.
Sartori et al. (2006) não obtiveram diferenças nas taxas de morte embrionária entre IA
(18,6%) e TE (26,2%). Demétrio (2006) encontrou 11,1% (8/74) de morte embrionária nas vacas
inseminadas e 21,5% (17/79) nas vacas que receberam TE, verificando que com o aumento da
temperatura corporal no dia 7, houve aumento da morte embrionária (Figura E). Apesar da maior
tendência de morte embrionária na TE, a probabilidade de concepção na TE permaneceu superior
à IA.
Figura E: Representação gráfica da probabilidade de morte embrionária em relação à

temperatura corporal do dia 7 em que “____” representa a probabilidade esperada para
IA em relação a T7, “_____” para TE em relação a T7, “x” representam os dados observados
para IA e “o” para TE.
Conclusão
O uso da transferência de embriões deve ser estimulado como ferramenta para aumentar a
concepção em vacas de leite de alta produção, pois pode restaurar pelo menos parte da fertilidade,
já que se evitam os efeitos ocorridos no desenvolvimento folicular, na ovulação, na fecundação
e no desenvolvimento embrionário inicial (até o sétimo dia).
s166
Sugere-se a produção de embriões no inverno, em vacas lactantes, para serem utilizados

em receptoras sincronizadas, para aumentar a taxa de aproveitamento das receptoras e a sincronia
doadora-receptpora, no verão.
Ambrose JD, Drost M, Monson RL, Rutledge JJ, Leibfried-Rutledge ML, Thatcher MJ, Kassa T,
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CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES DE MAMÍFEROS
Andras Dinnyes1,2, 5; Qinggang Meng1; Zsuzsanna Polgar1; Duangjai Boonkusol1,3;

Tamas Somfai1,4
1
Agricultural Biotechnology Center, Godollo, Hungary; 2Research Group on Applied Animal
Genetics and Biotechnology, Hungarian Academy of Sciences and Szent Istvan University,
Godollo, Hungary; 3Department of Biology, Faculty of Science, Srinakharinwirot University,
Bangkok, Thailand; 4Genetic Diversity Department, National Institute of Agrobiological
Sciences, Tsukuba, Ibaraki, Japan; 5Autor correspondente, endereço: Agricultural
Biotechnology Center, Szent Gyorgyi A. u. 4., Godollo, H-2100, Hungary, Email:
dinnyes@abc.hu, Fax: +36-28 526 151, Phone:+36-20 510 9632;
Palavras-chave: congelamento, vitrificação, bovinos, ovinos, suínos, roedores
Introdução
Apesar das intensivas pesquisas que têm sido conduzidas em escala mundial, a
criopreservação de embriões de várias espécies ainda não tem sido possível com resultados
satisfatórios. A criopreservação em animais pecuários é uma ferramenta valiosa para manter a
diversidade genética e para fins de reprodução. Em espécies ameaçadas, a conservação de embriões
criopreservados poderia ajudar nos esforços de preservação. A criopreservação de embriões
humanos, em combinação com métodos de reprodução assistida, é de extrema importância no
tratamento da infertilidade. Esta revisão está focada nos avanços e problemas da criopreservação
de embriões nas espécies mais importantes de animais pecuários e de laboratório.
Métodos de criopreservação e potenciais efeitos deletérios
Desde o primeiro relato de congelamento de embrião de camundongo por Whittingham et

al. (1972), os métodos de criopreservação de embriões se desenvolveram de maneira significativa
e esta tecnologia se tornou a principal ferramenta para a manutenção de recursos genéticos de
animais domésticos e selvagens. Os métodos de congelamento “lento” e “rápido” se
desenvolveram gradualmente, à medida que se tornaram disponíveis modelos e dados relativos
à permeabilidade da membrana dos embriões à água e aos crioprotetores (CPAs) em diferentes
temperaturas. Os métodos de congelamento aplicam uma taxa de resfriamento controlada (de -
0,3 a -0,6ºC/min) e induzem o “seeding”, com objectivo de evitar o aparecimento de grandes
cristais de gelo dentro das células, o que causaria danos físicos e a morte das células. O espaço
extracelular é congelado primeiro, e as células são desidratadas gradualmente durante o processo
de resfriamento. A velocidade de descongelamento deve respeitar os níveis de desidratação dos
embriões (final do congelamento a aproximadamente -60ºC (“lento”) ou a -30ºC (congelamento
“rápido”)), dessa forma, o congelamento “lento” necessita de descongelamento lento com
velocidade controlada, e o congelamento “rápido” permite o descongelamento rápido. Da mesma
forma, embriões descongelados devem ser reidratados. Os métodos de congelamento tentam
manter um delicado equilíbrio entre vários fatores, para evitar danos tais como a formação de
cristais de gelo, choque osmótico, efeitos tóxicos dos crioprotetores, concentração intracelular
de eletrólitos, danos por resfriamento, rompimento da zona pelúcida ou do embrião e alterações
do citoesqueleto e organelas intracelulares.
s171
Um método alternativo ao congelamento é a vitrificação. A vitrificação foi usada

primeiramente para conservar tecidos biológicos há mais de 60 anos atrás (Luyet, 1937), e
posteriormente para embriões de camundongos (Rall & Fahy, 1985). Esta técnica usa
concentrações muito altas de crioprotetores e taxas de resfriamento rápidas, resultando na
solidificação da solução, que dessa forma previne a formação de cristais de gelo e os danos
celulares a ela associados. Entretanto, a vitrificação aumenta a probabilidade de haver outras
formas de dano, especialmente as causadas por efeitos osmóticos e tóxicos; a curta exposição
aos crioprotetores devido à velocidade de resfriamento auxiliam a diminuir ou evitar esses danos.
CPAs em altas concentrações podem ser tóxicos para as células, especialmente para embriões
com uma célula e oócitos. O etileno-glicol (EG) é um dos mais eficientes crioprotetores testados
para embriões de camundongos (Kasai et al., 1990). Recentemente, os resultados da vitrificação
têm sido melhorados por ferramentas que aumentaram substancialmente a velocidade de
resfriamento e descongelamento durante o processo, tais como: uso de grades de cobre de
microscopia eletrônica (Martino et al., 1996), uso da técnica open pulled straw (OPS; Vajta et
al., 1998), cryoloop (Lane et al., 1999), microgotas (Papis et al., 2000), superfície sólida (SSV;
Dinnyes et al., 2000), grades de nylon (Matsumoto et al., 2001), cryotop (Hochi et al., 2001),
pipeta de desnudamento tipo flexipet (FDP; Liebermann et al., 2002) e sistema hemi-straw
(Vanderzwalmen et al., 2003). As vantagens da técnica de vitrificação quando comparada ao
congelamento são: baixo custo do equipamento, simplicidade do procedimento e o pouco tempo
necessário.
Comparada ao congelamento, a vitrificação pode melhorar a capacidade de desenvolvimento
dos embriões após o descongelamento. Entretanto, em alguns casos, a alta taxa de de resfriamento
e a alta concentração de crioprotetores alteraram o arranjo dos cromossomos e microtúbulos em
oócitos de camundongos (Cooper et al., 1996; O’Neil et al., 1997). Microfilamentos parecem
ser menos afetados pelo resfriamento do que microtúbulos, mas eles podem ser alterados pela
exposição ao crioprotetor. A exposição ao propanediol foi relatada como a causa de vesiculação
em oócitos de camundongos (Joly et al., 1992) e a exposição ao dimetil sulfóxido causaria a
ruptura da rede de actina em oócitos de camundongos (Vincent et al., 1990), resultando em
retardo no desenvolvimento embrionário. Em embriões vitrificados, esses efeitos deletérios podem
ser menos intensos, entretanto, a estabilização do citoesqueleto durante a vitrificação pode ser
benéfica para o aumento da sobrevivência após o descongelamento e subsequente
desenvolvimento. Descobriu-se que a citocalasina-b (CB), um estabilizador de citoesqueleto,
protege estruturas microfilamentosas de embriões suínos durante a criopreservação e aumentou
significativamente o desenvolvimento embrionário in vitro e in vivo após o descongelamento
(Dobrinsky et al., 2000).
Modificações a nível molecular são pouco conhecidas em embriões criopreservados. Na
revisão de Sonna et al. (2002) o stress do resfriamento é descrito como o iniciador de uma
resposta celular que pode ativar o processo de apoptose ou levar à necrose. Evidências de uma
resposta celular ao stress induzida pelo resfriamento incluem relatos da ativação do gene HSP
(heat shock protein) após o descongelamento. A apoptose induzida pelo resfriamento tanto é
influenciada pela temperatura mínima alcançada como pela duração da exposição. Esta revisão
menciona vários genes que são afetados pelo stress de resfriamento, como os genes da ASP
(proteína específica da apoptose), o E-selectina (adesão celular), o HSP, o p53 (ciclo celular), e
o IL-8 (interleucina-8). Historicamente, desde a descoberta acidental do glicerol como crioprotetor,
a criopreservação de gametas e embriões se desenvolveu de forma basicamente empírica para
alcançar boas taxas de sobrevivência (considerando os aspectos morfológicos e funcionais) e
desenvolvimento. Talvez esta seja a razão para a falta de informação sobre as modificações
biológicas a nível molecular causadas pela criopreservação de embriões. A combinação de dados
s172
do desenvolvimento (taxas de clivagem e formação de blastocistos) e dados de biologia molecular

qualitativa, como a abundância relativa de mRNA em certos genes, poderiam nos dar uma idéia
mais ampla das consequências dos tratamentos de criopreservação. A análise das diferenças na
expressão do mRNA também podem nos ajudar na compreensão da tolerância à criopreservação,
que é dependente do estágio de desenvolvimento. O recente estudo de Boonkusol et al (2006)
teve como objetivo criar uma ligação entre as observações morfológicas e de desenvolvimento e
as mudanças na atividade dos genes subsequentes à criopreservação de embriões. A eficiência de
dois métodos de vitrificação - em superfície sólida e em paetes - em zigotos de camundongo no
estágio de pro-núcleo (pré-MZT) e embriões de camundongo no estágio de 8 células (pós-MZT)
foi comparada, baseada na sobrevivência (levando em consideração aspectos morfológicos) ,
formação de blastocistos e mudanças na expressão gênica embrionária. Diferenças significativas
nos níveis de expressão gênica após a vitrificação pelos dois métodos foram observadas,
correspondendo aos dados de desenvolvimento subsequentes.
Particularidades Espécie-específicas
Camundongo
A criopreservação e armazenamento a baixas temperaturas de embriões de camundongo é

uma alternativa com bom custo-benefício para a manutenção de cepas, variedades e linhagens
importantes do ponto de vista científico. Embriões de camundongos podem ser criopreservados
de modo eficiente em uma ampla variação de estágios de desenvolvimento, mais comumente
nos estágios de 2 células, 8 células ou mórula. Inicialmente, foram utilizados processos de
congelamento lento (Leibo et al., 1974). Mais tarde, vários protocolos de vitrificação foram
relatados para camundongos (Shaw et al., 1991; Bernart et al., 1994; Van der Elst et al., 1995;
Uechi et al., 1999). Nos anos 70, vários laboratórios montaram bancos de embriões congelados
para preservar linhagens úteis e pouco utilizadas de camundongos que poderiam ser necessárias
no futuro. O protocolo original de congelamento lento descrito por Whittingham et al. (1972)
usava DMSO 1M como solução crioprotetora. O descongelamento lento (~10°C/min) foi
considerado necessário para a sobrevivência dos embriões, assim como uma diluição do DMSO
em uma etapa. Este protocolo é essencialmente semelhante ao utilizado atualmente no Jackson
Laboratory. Este banco de embriões, o maior do mundo, mantém em torno de 2000 linhagens de
camundongos congeladas, abrangendo mais de 1,3 milhão de embriões (Peter et al. 2000).
Durante as décadas passadas, foram publicados vários estudos sobre o congelamento de
embriões de camundongo com diferentes crioprotetores (Shaw et al. 1995). O método proposto
por Renard and Babinet (1984) foi adotado pela MRC Mammalian Genetics Unit em 1989. Este
protocolo utiliza propileno-glicol 1,5 M como crioprotetor, sacarose 1 M como diluente, e
congelamento lento a 0,3°C/min até “30°C. Os embriões são envazados em paetes plásticos de
0,25ml e necessitam de descongelamento rápido (>1000°C/min) para sua sobrevivência. Estes
métodos de congelamento lento são confiáveis, com crioprotetores relativamente pouco tóxicos
(na concentração usada) e permitem a obtenção de quantidade suficiente de animais nascidos
vivos. Os métodos de vitrificação e congelamento ultra-rápido oferecem uma alternativa aos
métodos de congelamento, com pouca necessidade de equipamentos (Trounson. et al. 1987, Rall
& Wood 1994, Dinnyes et al. 1995, Kasai et al., 1990).
O sucesso da criopreservação de embriões é influenciado pelo estágio de desenvolvimento
e outras condições (micromanipulação, maturação in vitro, cultivo) do embrião (Hershlag &
Feng 2005). Zigotos de camundongo criopreservados em estágio de pró-núcleo podem ser usados
para produzir camundongos transgênicos (Leibo et al., 1991; Bagis et al., 2005). Bagis et al.
(2002) comparou dois métodos de vitrificação em zigotos de camundongo em estágio de pró-
s173
núcleo, o SSV e a vitrificação em paetes. O método SSV resultou em maior eficiência em gerar
produtos transgênicos de zigotos que foram vitrificados e descongelados do que de zigotos obtidos
por microinjeção. Várias linhagens de camundongo têm diferenças na taxa de sobrevivência ao
congelamento, podendo a composição genética exercer um efeito sobre a habilidade de embriões
congelados/ descongelados se desenvolverem in vivo (Dinnyes et al. 1995).
Rato
O rato é um importante modelo animal para pesquisas médicas. Embriões de ratos são
menos comumente criopreservados, e poucos dados estão disponíveis sobre métodos eficazes
para a sua criopreservação (Reinhold et al. 2000). Vários protocolos para o congelamento de
ratos têm sido publicados (Whittingham 1975; Miyamoto & Ishibashi 1977, 1978; Rajotte et al.
1983; Utsumi et al., 1992; Stein et al. 1993), e mais recentemente métodos de vitrificação também
foram eficazes para embriões de ratos nos estágios de 1 célula (Anzai et al. 1994), 2 células
(Sato et al. 1996, Jiang et al. 1999), 8 células (Isachenko et al. 1997), mórula e blastocisto
(Nakamichi et al. 1993), ou comparando vários estágios com altas taxas de desenvolvimento a
termo a partir de embriões no estágio de 4 células, 8 células e mórula (Han et al., 2003). A maior
parte desses experimentos foi conduzida utilizando como base genética ratos Wistar. A dificuldade
na criopreservação em ratos está relacionada à geralmente pobre resposta superovulatória e à
dificuldade de se obter embriões de boa qualidade. Ratas pós-púberes, não superovuladas, cobertas
por monta natural, são comumente usadas como doadoras de embrião. Isachenko et al. (1997)
obteve uma média de aproximadamente 5,4 embriões (7–12 blastômeros por embrião no dia 4)
utilizando ratas Wistar adultas ciclando naturalmente.
Coelho
Em coelhos, tanto os métodos convencionais de congelamento lento de embriões (Bank &

Maurer 1974, Renard et al. 1984, Kojima et al 1987, Vincente & Garcia-Ximenez 1994), quanto
a vitrificação (Smorag et al 1989, Kasai et al 1992, Vincente & Garcia-Ximenez 1994, Smorag
& Gajda 1998) foram utilizados com sucesso. O dimetilsulfóxido (DMSO), o propileno glicol
(PG) e o glicerol ou EG, têm sido usados, isoladamente ou combinados, como CPAs para
congelamento ou vitrificação de embriões de coelhos. Kojima et al. (1987) obteve, com mórulas
congeladas em DMSO, 72% de desenvolvimento em blastocistos in vitro; Kasai et al. (1992),
utilizando mórulas vitrificadas numa mistura de EG, ficoll e sacarose (EFS), obteve 89% de
desenvolvimento em blastocistos. Para embriões no estágio de 2 células, a sobrevivência in vitro
tem variado de 58% de desenvolvimento em blastocistos, quando vitrificados em EFS (Smorag
& Gajda 1998), a 89% de desenvolvimento em mórula, quando congelados em PG (Renard et
al.. 1984). Apenas 18% dos zigotos de coelho vitrificados em solução EFS se desenvolveram em
blastocistos (Smorag & Gajda 1998). O primeiro nascimento de coelho resultante de embrião
criopreservado no estágio de pró-núcleo foi relatado por Hochi et al. (2001). A técnica OPS foi
adaptada com sucesso a embriões de coelhos (Naik et al. 2005). A criopreservação também é
importante na preservação de várias linhagens selecionadas de coelho (Vicente et al. 2003).
Bovinos
O primeiro bezerro resultante de transferência de embriões nasceu após a transferência

cirúrgica de um embrião de 5 dias oriundo de matadouro em 1951 (Willett et al., 1951). Duas
décadas depois, devido ao desenvolvimento de métodos eficazes para a criopreservação de
s174
embriões bovinos utilizando o congelamento lento (Wilmut & Rowson, 1973) e a vitrificação
(Massip et al., 1986), a transferência de embriões bovinos se tornou uma tecnologia industrial
eficiente que não era mais dependente da disponibilidade imediata de receptoras adequadas.
Embriões criopreservados são amplamente usados na reprodução assistida de bovinos: dados
mostram que aproximadamente 500.000 embriões são produzidos de vacas superovuladas por
ano em todo o mundo, e milhares de embriões congelados são rotineiramente vendidos e
transportados entre países (Hasler, 2003).
O armazenamento e transporte em nitrogênio líquido de embriões produzidos in vivo e in
vitro é essencial para seu uso em larga escala. A transferência direta, ou seja, a transferência de
embriões criopreservados/ descongelados diretamente do recipiente em que foram armazenados
para o animal receptor, sem as etapas de recuperação e exame, reduz o tempo, o equipamento e
o treinamento necessários nas etapas finais do manuseio do embrião. No caso de embriões bovinos
produzidos in vivo, as técnicas de transferência direta têm sido empregadas usando o congelamento
lento convencional (Renard et al., 1982; Leibo 1984; Massip et al., 1987; Voelkel & Hu 1992).
Um teste em larga escala de um método usando soluções de glicerol-sacarose obteve uma taxa
de gestação de 60,5% e uma taxa de nascimentos de 59% (Touati et al., 1992). Um método de
vitrificação para a transferência direta de embriões após o descongelamento (VS3a) adaptado
para bovinos (Dinnyes et al., 1994) resultou em taxas de gestação de 44,5% em experimentos a
campo (Van Wagtendonk-de Leeuw et al., 1997).
Vários grupos têm relatado que a sobrevivência de embriões após a criopreservação é
fortemente influenciada pela idade, estágio de desenvolvimento e qualidade dos embriões, sendo
esta última normalmente avaliada pelas características morfológicas dos mesmos (para revisão
veja Palasz & Mapletoft, 1996). O tempo da inseminação até a primeira clivagem tem efeitos
expressivos e duradouros no desenvolvimento subsequente dos embriões, incluindo a taxa de
desenvolvimento em blastocistos, o número de células dos embriões resultantes e seu potencial
de sobrevivência à criopreservação (Dinnyes et al, 1999). A sobrevivência à criopreservação foi
significativamente afetada pelo estágio embrionário, com maior sobrevivência de blastocistos
eclodidos do que de blastocistos ou de mórulas compactas (Pugh et al., 1998). Alguns
pesquisadores relataram que embriões no dia 7 toleraram os tratamentos de criopreservação
melhor do que embriões nos dias 6 ou 8 (Hasler et al., 1997; Markkula et al., 2001), enquanto
outros relataram que a idade do embrião à vitrificação não teve efeito na sobrevivência (Martinez
et al., 1998).
O sistema de cultivo afeta a qualidade dos embriões resultantes e consequentemente o seu
potencial para a criopreservação. Tem sido demonstrado que embriões bovinos produzidos in
vitro são mais sensíveis aos procedimentos de congelamento do que aqueles produzidos in vivo.
Apesar da notável sensibilidade ao resfriamento de mórulas produzidas in vitro (Leibo & Loskutoff
1993) não estar presente em estágios mais avançados, de blastocisto (Dinnyes et al, 1994, 1996;
Mahmoudzadeh et al, 1994), as taxas de gestação após a transferência de embriões in vitro são
geralmente inferiores àquelas de embriões in vivo (Kuwayama et al, 1992; Reichenbach et al,
1992; Hasler et al., 1995; Agca et al., 1996; Donnay et al.,1998). Embriões produzidos in vitro
são diferentes na sua morfologia quando comparados com embriões in vivo; por exemplo, eles
tendem a conter mais vacúolos e tem complexos juncionais mais curtos e em menor quantidade
(Shamsuddin et al, 1992), a compactação é menos pronunciada em embriões in vitro (Van Soom
et al, 1992), e o disco embrionário é geralmente menor (Iwasaki et al, 1990). Embriões gerados
por um certo sistema de cultivo podem responder de modos diversos a diferentes métodos de
criopreservação (Mahmoudzadeh et al, 1994). No caso de embriões fertilizados in vitro, um
período de cultivo in vivo (em oviduto de ovelha) comparado com cultivo in vitro (em células
epiteliais de oviduto bovino, BOEC) melhorou consideravelmente não somente a morfologia,
s175
mas também a resistência ao congelamento (Greve et al. 1993). Blastocistos produzidos sob
condições semi-definidas em TCM 199 suplementado com BSA, insulina, transferrina e selênio
sobreviveram ao congelamento significativamente melhor do que aqueles produzidos em TCM
199 apenas com soro de vaca em cio (ECS) ou com soro e BOEC (Shamsuddin et al, 1994).
Vários autores têm relatado que a suplementação com soro aumentou o número de células nos
embriões (Van Langendonckt et al.,1997). Entretanto, outros autores observaram que a
suplementação com soro não traz benefícios (Gomez & Diez, 2000) ou pode ser até prejudicial
para o número total de células (Byrne et al.,1999). Um estudo recente sugere que a presença de
soro foi prejudicial para a eclosão de embriões bovinos após o descongelamento (Mucci et al.,
2006). Este resultado contradiz um relato de que blastocistos bovinos vitrificados pelo método
OPS necessitam suplementação de soro no meio para a eclosão (Vajta et al.,1999). Comparada à
suplementação com BSA, a suplementação com FCS durante o co-cultivo reduziu a viabilidade
de embriões bovinos que sofreram biópsia e subsequente vitrificação (Yotsushima et al., 2004).
A presença de soro no meio pode afetar a velocidade de desenvolvimento do embrião e reduzir a
tolerância ao congelamento de blastocistos (Dinnyes et al., 1996; Rizos et al., 2003) e pode
aumentar o número e o tamanho de gotículas de lipídios no embrião (Abe et al., 2002). Estudos
demonstraram que o ácido hialurônico melhora a capacidade de desenvolvimento de embriões
bovinos sob condições in vitro (Stojkovic et al., 2002), a suplementação com â-mercaptoetanol
no meio de cultivo após a vitrificação e o descongelamento aumentou significativamente a
sobrevivência de blastocistos, a taxa de eclosão e o número total de células (Nedambale et al.,
2006); e a adição de ácido linoléico no meio de cultivo dos embriões aumentou a sobrevivência
de mórulas após congelamento lento (Hochi et al.,1999). Esta melhora ocorreu provavelmente
em função de modificações na membrana celular ou nos lipídios citoplasmáticos. O efeito positivo
da suplementação com ácido linoléico pode ser explicado pelo aumento na fluidez (grau de
insaturação). A análise do metabolismo oxidativo de embriões bovinos indicou que embriões
produzidos in vitro ou pré-expostos a condições de cultivo in vitro são mais sensíveis a danos
durante o congelamento do que embriões produzidos in vivo (Khurana & Niemann, 2000).
O etileno glicol (EG) é um dos CPAs mais frequentemente usados para a criopreservação
de embriões bovinos. Estudos sobre toxicidade indicaram que o EG é um composto de baixa
toxicidade para embriões bovinos (Mahmoudzadeh et al., 1993; Dochi et al., 1998), e seu uso
pode resultar em melhores taxas de sobrevivência de embriões bovinos congelados/ descongelados
(Saha et al.,1996). A alta taxa de penetração e a baixa toxicidade deste crioprotetor permite a
transferência direta após o descongelamento sem uma etapa de diluição (Voelkel & Hu, 1992;
Dochi et al., 1995). Mas outros pesquisadores observaram que mais blastocistos sobreviveram
quando congelados em glicerol 1,4 M do que em etileno glicol 1,5 M, e a adição de sacarose 0,25
M a etileno glicol 1,5 M na solução de congelamento não melhorou a sobrevivência dos embriões
(Hasler et al., 1997). A vitrificação de embriões bovinos produzidos in vitro oferece várias
vantagens quando comparado ao congelamento convencional. A vitrificação, combinada à
transferência direta, seria um ótimo método para a transferência em fazendas de embriões
produzidos in vitro relativamente baratos. Soluções de vitrificação contendo polietileno-glicol
(Ohboshi et al.,1997) ou PVP (Suzuki et al.,1995) foram benéficas para a criopreservação de
blastocistos bovinos produzidos in vitro ou que sofreram biópsia. O método OPS também foi
aplicado com sucesso em embriões bovinos FIV (Vajta et al., 1999; Lazar et al., 2000). Agca et
al. (1996) não observou diferenças significativas nas taxas de gestação com blastocistos bovinos
produzidos in vitro congelados em glicerol ou vitrificados numa mistura de glicerol e etileno
glicol, entretanto, a morfologia das células embrionárias de embriões de Nelore e Holandês foi
melhor preservada após congelamento controlado do que com congelamento rápido ou vitrificação
(Visintin et al., 2002).
s176
Vários grupos observaram que a vitrificação pode ser mais adequada para a criopreservação
de embriões bovinos produzidos in vitro do que os métodos de congelamento lento (Dinnyes et
al., 1996; Martinez et al., 2002; Nedambale et al., 2004; Mucci et al., 2006). Kaidi et al. (2001)
observou que tanto o congelamento quanto a vitrificação diminuíam as taxas de sobrevivência e
eclosão e induziam alterações celulares semelhantes, mas o congelamento foi mais prejudicial
para as células do trofoblasto do que a vitrificação, levando à uma diminuição da captação de
nutrientes pelo embrião. Além disso, também foi observado um aumento da atividade glicolítica
em embriões congelados.
Uma abordagem alternativa para lidar com os baixos resultados na criopreservação é
modificar as próprias células ao invés de modificar os procedimentos de criopreservação, para
torná-las mais passíveis de ser criopreservadas (Seidel, 2006). O conteúdo lipídico do citoplasma
pode ser reduzido com a adição ao meio de cultivo de etosulfato de fenazina, um potente receptor
de elétrons que oxida prontamente o NADPH, o que faz com que blastocistos bovinos sobrevivam
à criopreservação convencional melhor do que os controles (Seidel, 2006). A remoção ou
polarização de gotículas lipídicas por centrifugação aumentou a tolerância de embriões bovinos
ao congelamento (Murakami et al., 1998; Ushijima et al., 1999; Tominaga et al.,2000).
Embriões originados de diferentes raças de bovinos demonstraram diferentes resultados
na criopreservação, particularmente em Bos taurus vs. Bos indicus. Têm sido encontradas
diferenças nos componentes celulares de embriões Bos taurus e Bos indicus (Visintin et al.,
2002), tais como as gotículas de lipídios, maiores e em maior número em embriões de Holandês
do que em embriões de Nelore. Durante os processos de congelamento rápido ou vitrificação,
embriões de Holandês exibiram melhor morfologia do que embriões de Nelore. Apesar de após
o descongelamento os embriões aparentemente manterem sua forma e estrutura semelhante quando
comparados a embriões a fresco, uma análise detalhada demonstrou que as células embrionárias
no Nelore sofreram danos significativos (Visintin et al., 2002). Após o descongelamento e
transferência dos embriões, taxas de gestação mais baixas têm sido obtidas com Bos taurus
(Zanenga, 1993) e com Jersey do que com embriões de Holandês (Steel & Hasler, 2004).
Ovinos e caprinos
Os primeiros nascimentos de animais resultantes de embriões de ovinos (Willadsen et

al.,1976) e caprinos (Bilton & Moore 1976) criopreservados com congelamento lento foram
relatados em 1976. O primeiro nascimento de cordeiro resultante de um embrião vitrificado foi
relatado somente em 1990 (Szell et al., 1990); no mesmo ano, também foi relatada a primeira
transferência bem-sucedida de embriões de caprino vitrificados (Yuswiati & Holtz, 1990).
Posteriormente, transferências bem-sucedidas de embriões descongelados de ovinos e caprinos
(Chemineau et al.,1986; Songsasen et al.,1996) confirmaram esses experimentos pioneiros. Em
combinação com a tecnologia de bipartição de embriões, dois produtos gestados por receptoras
diferentes foram produzidos após a transferência de embriões caprinos bipartidos e descongelados
sem zona pelúcida (Nowshari & Holtz, 1993). A primeira transferência direta bem-sucedida de
embriões de ovinos vitrificados foi relatada por Baril et al.,( 2001).
A vitrificação, quando comparada com métodos de congelamento, deu resultados
semelhantes ou melhores em ovinos (Dattena et al., 2004) e caprinos (El-Gayar & Holtz, 2001);
e blastocistos de ovinos produzidos in vitro foram vitrificados com sucesso (Dattena et al.,
2004). Vários crioprotetores têm sido estudados em ovinos: Cocero et al. (2002) observou que o
EG é mais eficiente que o glicerol para embriões nos estágios de mórula e blastocisto; a vitrificação
com solução de EG, ficoll e sacarose (EFS) também foi bem-sucedida (Martinez &
Matkovic,1998). A combinação de EG com glicerol funcionou melhor do que o EFS para a
s177
vitrificação, e taxas de nascimento semelhantes foram obtidas com embriões produzidos in vitro
e in vivo (Martinez et al., 2006). Naitana et al. (1997) observou que a substituição do soro por
PVA nas soluções de vitrificação e descongelamento não reduziu a viabilidade; enquanto outros
observaram o contrário sobre o PVA, com uma diminuição da viabilidade e uma redução na
síntese de proteínas após o descongelamento (Leoni et al., 2002). As taxas de gestação ou
nascimento de embriões ovinos produzidos in vitro foram menores do que de embriões produzidos
in vivo (Dattena et al., 2000, 2004) e a vitrificação resultou em uma redução significativa na taxa
de gestação no caso dos embriões produzidos in vitro (Papadopoulos et al., 2002). A correlação
entre estágio embrionário e a tolerância ao congelamento foi estudada em ovinos, tendo sido
demonstrado que estágios avançados toleram a vitrificação melhor do que os estágios de mórula
ou de pré-compactação (Naitana et al., 1995); e este resultado estava de acordo com um relato
sobre a melhora na sobrevivência após o descongelamento de embriões ovinos jovens produzidos
in vivo, cultivados até o estágio de blastocisto antes do congelamento (Garcia-Garcia et al.,
2005). Entretanto, outros autores não observaram diferenças significativas no número de cordeiros
nascidos após a criopreservação de mórulas e blastocistos (Cocero et al.,1996).
Suínos
Por décadas o desenvolvimento de métodos de criopreservação de embriões suínos esteve

muito aquém daquele de outras espécies domésticas. Isto ocorreu por duas razões: a transferência
de embriões em suínos é muito difícil devido à anatomia e fisiologia do trato genital nessa
espécie, dessa forma, a TE como tecnologia reprodutiva não pôde ser amplamente aplicada na
criação de suínos. A outra razão é a enorme sensibilidade dos embriões suínos a baixas
temperaturas, o que tem limitado a sua capacidade de ser criopreservado (Wilmut, 1972; Polge
et al, 1974). Ainda assim, a criopreservação de embriões suínos tem sua importância na preservação
de material genético e na distribuição internacional de linhagens genéticas e raças. Além disso,
recentes avanços nas tecnologias in vitro e a produção de embriões transgênicos em suínos sugerem
uma crescente importância da TE e tecnologias relacionadas no futuro (Kikuchi et al., 2002).
Apesar dos avanços recentes, a criopreservação de embriões de suínos ainda luta contra certas
limitações, causadas pela fisiologia do embrião suíno.
Intolerância ao resfriamento relacionada aos lipídios Sabe-se que embriões de suínos contém
um alto teor de lipídios intracelulares. Em embriões, gotículas de lipídios intracitoplasmáticas
normalmente formam complexos com elementos do citoesqueleto, membranas e organelas
citoplasmáticas (Sathananthan et al., 1992) e têm um importante papel no metabolismo, como
fonte de energia durante a maturação, fertilização e no início do desenvolvimento embrionário
(Brown 2001). Foi relatado que oócitos de suínos contém 156 ng de lipídios (McEvoy et al.,
2000), o que é extremamente alto, mesmo comparado com o bovino (89 ng/oócito) (Ferguson &
Leese, 1999). Quando embriões de suínos são resfriados abaixo da temperatura crítica de 15 oC,
ocorre uma separação de fases na membrana lipídica, causando danos irreversíveis na estrutura
da membrana (Edidin & Petit, 1977). Isso faz com que os embriões suínos sejam muito difíceis
de ser criopreservados, especialmente pelos métodos tradicionais de congelamento lento. Para
superar o problema dos danos causados pelo resfriamento foram desenvolvidas diferentes
estratégias, tais como a técnica de remoção de lipídeos, aplicação de métodos de vitrificação e
estabilização do citoesqueleto. Além da sensibilidade causada pelos lipídios, outros fatores, como
o estágio e a origem dos embriões, também afetam o resultado da criopreservação.
s178
Remoção de lipídeos do oócito/ embrião. Nagashima et al. (1994) relatou a técnica de

remoção de lipídeos dos embriões, que envolve a polarização dos lipídios embrionários por
centrifugação e a remoção dos lipídios polarizados com uma pipeta de sucção. Foi relatado que
mais de sessenta por cento dos embriões em estágios iniciais (estágio de uma célula ou 2-4
células) que sofreram a remoção de lipídeos sobreviveram ao resfriamento a 4oC, enquanto sem
a remoção nenhum dos embriões sobreviveu. Além disso, o desenvolvimento de embriões
congelados que sofreram a remoção de lipídeos até o estágio de blastocisto foi semelhante ao
desenvolvimento de zigotos controle que não sofreram congelamento. Em outro estudo, nenhum
dos embriões controle sobreviveu ao método de congelamento convencional, todavia, após a
remoção de lipídeos 55,6-90,6% de embriões suínos no estágio de 2-4 ou 4-8 células sobreviveu
ao congelamento, e 30,6-64,1% deles de desenvolveu até blastocisto (Nagashima et al., 1995).
Esses resultados provaram claramente que a sensibilidade de embriões suínos ao congelamento
está relacionada à concentração de lipídios intracelulares, e que os embriões suínos podem ser
criopreservados, com a remoção de lipídios citoplasmáticos, mesmo por um método tradicional
de congelamento lento.
Vitrificação de embriões suínos. O congelamento convencional de embriões suínos contendo

lipídios não foi bem-sucedida. Era esperado que o congelamento rápido dos embriões por
vitrificação fosse superar o problema dos danos às membranas causados pelo resfriamento e pela
formação de gelo. As técnicas de vitrificação foram aplicadas em embriões suínos com resultados
muito variáveis (Yoshino et al., 1993; Vajta et al., 1997; Kuwayama et al., 1997), afetados pela
origem e estágio de desenvolvimento dos embriões. Até agora, a maioria dos leitões oriundos de
embriões vitrificados foi obtida de blastocistos produzidos in vivo. (Dobrinsky et al., 2000;
Berthelot et al., 2000; Beebe et al., 2002) com taxas de gestação variando entre 40-60%, taxas de
nascimento entre 33-55% e número de leitões entre 4-7,2. Foi relatado que embriões de suínos
nos estágios de blastocisto expandido e blastocisto eclodido sobreviveram ao processo de
vitrificação numa porcentagem mais alta do que embriões nos estágios de mórula e blastocisto
jovem (Dobrinsky et al., 2000; Cuello et al., 2004). No entanto, a vitrificação bem-sucedida de
embriões suínos nos estágios de mórula e blastocisto jovem pelos métodos OPS (Berthelot et al.,
2000) e de microgotas (Misumi et al., 2003) também foi relatada recentemente, resultando no
nascimento de produtos vivos. Isso demonstra que, com o aperfeiçoamento da técnica, embriões
de suínos em estágios mais precoces de desenvolvimento também podem ser criopreservados
com sucesso. A combinação da técnica de remoção de lipídeos e da vitrificação melhorou as
taxas de sobrevivência subsequentes de embriões produzidos in vivo no estágio de blastocisto a
impressionantes 95% (Ushijima et al., 2004). Recentemente, foi relatado um aumento no número
de leitões (71%-75% de taxa de gestação com 5,3-7,2 leitões) após a transferência de embriões
que haviam sofrido a remoção de lipídeos e foram vitrificados com um sistema modificado
(Beebe et al., 2005).
Estabilização do citoesqueleto. O citoesqueleto, uma complexa rede de microfilamentos

de actina e microtúbulos formados pela polimerização de tubulina, tem um importante papel na
fisiologia das células embrionárias, através da manutenção da sua estrutura, formato, força
mecânica e da regulação da divisão celular e movimentos. No entanto, a criopreservação tem um
efeito deletério para o citoesqueleto e por conseguinte na sobrevivência dos embriões. Enquanto
os crioprotetores tendem a despolimerizar os microtúbulos e microfilamentos, o resfriamento
pode causar a ruptura total do citoesqueleto. Um avanço importante na criopreservação de embriões
suínos foi alcançado por Dobrinsky et al. (2000), que compreenderam a importância da
estabilização do citoesqueleto antes da criopreservação. A inovação introduzida por eles foi o
s179
tratamento dos embriões suínos com citocalasina b, um agente despolimerizador de

microfilamentos, antes do procedimento de vitrificação. As citocalasinas inibem a polimerização
de microfilamentos. A despolimerização de microfilamentos antes da criopreservação torna a
membrana celular elástica e, dessa forma, acredita-se que ela mantenha a integridade estrutural
das membranas e das organelas citoplasmáticas. Após o descongelamento e a reidratação, os
embriões são mantidos em um meio livre de citocalasina, dessa forma os microfilamentos se
repolimerizam e um citoesqueleto estável se regenera. Dobrinsky et al (2000) aplicou o tratamento
com citocalasina antes da vitrificação de embriões de suíno nos estágios de mórula e blastocisto.
Apesar da sobrevivência de mórulas e blastocistos jovens não ter sido afetada, foi alcançada uma
significativa melhora na sobrevivência de blastocistos expandidos, o que resultou em uma taxa
de nascimentos de 57%, com número médio de crias de 7,25 após a transferência de blastocistos
vitrificados.
Criopreservação de embriões produzidos in vitro. Pouco progresso tem sido feito na

criopreservação de embriões suínos produzidos in vitro, quando comparado com embriões
produzidos in vivo. O método SSV foi aplicado para criopreservar blastocistos de suínos MIV/
FIV cultivados in vitro (Dinnyes et al., 2003) com uma taxa de sobrevivência de aproximadamente
25% de blastocistos expandidos. Uma alta taxa de sobrevivência de blastocistos partenogenéticos
produzidos in vitro (83,3%) e embriões no estágio de 4 células (36%) foi relatada quando embriões
que sofreram a remoção de lipídeos foram resfriados com o método do volume mínimo (Esaki et
al., 2004). Recentemente, uma melhora na sobrevivência de blastocistos suínos MIV/ FIV/CIV
foi relatada quando o meio de cultivo foi suplementado com 10% de soro fetal bovino ao invés
de BSA (Men et al., 2005). Isso demonstra claramente o impacto do sistema de cultivo na
capacidade de sobrevivência ao congelamento de embriões PIV. Entretanto, apesar dos recentes
avanços nos sistemas de cultivo in vitro e vitrificação em suínos, até agora não existem relatos
de animais nascidos da transferência de embriões congelados produzidos in vitro. Isso enfatiza a
importância da maiores avanços nos sistemas de produção in vitro e criopreservação em suínos.
Considerações finais
A criopreservação de embriões é uma tecnologia vital, propiciando o avanço de biotécnicas

e da biotecnologia em várias espécies domésticas e fazendo com que embriões com alto valor
agregado se tornem produtos atrativos e alcancem vários mercados no mundo. As tecnologias de
congelamento são essenciais para as técnicas de reprodução assistida em seres humanos e mesmo
aos esforços na preservação de espécies ameaçadas. Mais de 30 anos de progressos na
criopreservação de embriões agora permitem que esta tecnologia seja aplicada em várias espécies
importantes, como descrito em detalhes acima. Entretanto, esses métodos ainda são muitas vezes
empíricos e as técnicas mais comumente empregadas muitas vezes não são as mais avançadas.
Para o futuro existe a necessidade de entender e talvez manipular as mudanças a nível molecular
durante e após a criopreservação. Praticamente não existem conhecimentos sobre os efeitos a
longo prazo das modificações epigenéticas causadas pelos procedimentos de criopreservação.
Novos métodos podem ser necessários para melhorar as taxas de sobrevivência, contudo, a física
dos métodos de vitrificação pode estar alcançando certas limitações no aumento das taxas de
congelamento e descongelamento. Não é provável que métodos como a liofilização e o
armazenamento à temperatura ambiente sejam bem-sucedidos para embriões num futuro próximo.
Diferenças entre técnicos e pequenos erros durante o manuseio dos embriões durante a vitrificação,
que exige treinamento intensivo, são importantes obstáculos para a repetibilidade de bons
s180
resultados. A inclusão de novos avanços em microfluídica e em nanotecnologia pode criar métodos

mais confiáveis e bem padronizados, com potencial para ser individualizados para as necessidades
específicas do embrião a ser criopreservado.
Agradecimentos:
Este trabalho foi apoiado por fundos bilaterais de colaboração científica e tecnológica
entre a Hungria e a Alemanha (TET, No. D6/01), Japão (TET, No. JAP-11/02) e China (TET No.
CHN-28/04).
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CRIOPRESERVAÇÃO DE OÓCITOS E EMBRIÕES BOVINOS
Alceu Mezzalira; Arnaldo Diniz Vieira
Laboratório de Reprodução Animal Assis Roberto de Bem / Centro de Ciências Agroveterinárias

- CAV - Lages SC / Universidade do Estado de Santa Catarina - UDESC.
mezzalira@cav.udesc.br
Resumo
O avanço na criobiologia de embriões mamíferos se desenvolveu paralelamente às pesquisas

relacionadas à produção de embriões. Com embriões produzidos in vivo, o congelamento
convencional possibilita a obtenção de taxas de prenhez muito próximas às obtidas com embriões
frescos. Entretanto, para embriões produzidos in vitro, apesar das tentativas de adequação, o
método convencional não se mostrou efetivo, pela sensibilidade dos embriões ao resfriamento,
possivelmente em função de seu alto teor lipídico. Neste cenário, a vitrificação é reconhecida
como o método mais promissor. Entretanto, embora com alguns resultados expressivos, os
diferentes protocolos não se mostraram consistentes na criopreservação dos embriões produzidos
in vitro. Para oócitos, embora a vitrificação seja o método de escolha, não existe um protocolo
definido, sendo os melhores resultados relatados com estratégias que aumentam a velocidade de
resfriamento. Finalmente, evidências apontam a necessidade de adequação no sistema de produção
in vitro de embriões com estratégias que minimizem as diferenças in vivo e in vitro, durante o
desenvolvimento embrionário, o que poderá reduzir a sensibilidade à criopreservação.
Palavras Chave: Vitrificação, Congelamento, Congelamento ultra-rápido, embriões PIV.
Introdução
Os avanços na criobiologia voltada para preservação de embriões mamíferos, se desenvolveu

paralelamente ao avanço das pesquisas relacionadas à produção de embriões. Desde os primeiros
relatos de nascimento de produtos de embriões congelados de camundongo e bovino (Whittingham
et al., 1972; Wilmut et al., 1973), a criobiologia passou por modificações graduais para permitir
seu emprego rotineiro. Hoje, o congelamento de embriões produzidos in vivo segue um protocolo
que permite a obtenção de taxas de prenhez próximas das obtidas com a transferência de embriões
frescos. Entretanto, o mesmo não ocorre com embriões produzidos in vitro e oócitos. A maior
sensibilidade destas estruturas ao processo de criopreservação gerou a necessidade de métodos
alternativos, que permitam garantir seu máximo aproveitamento, tanto com propósitos científicos,
como comerciais, ou conservacionistas. O estabelecimento de bancos de material genético permite
a utilização em biotécnicas como a clonagem, bem como permite a preservação de características
peculiares a determinadas raças ou linhagens, criando a possibilidade de retorno em caso de
adoção de estratégia equivocada de seleção. Assim, o desenvolvimento de uma eficiente
metodologia para a criopreservação de embriões produzidos in vitro (PIV) e oócitos, é ainda
necessário.
Criopreservação de embriões produzidos in vivo
A criopreservação de embriões emprega os mesmos princípios do congelamento de

espermatozóides, ou seja, está baseada na necessidade de impedir a formação de grandes cristais
s191
de gelo no compartimento intracelular. Entretanto, o fato destas estruturas apresentarem distintos

tamanho, formato e coeficiente de permeabilidade, cria a necessidade de cuidados especiais
relacionados com a falta, ou excesso da desidratação celular. O método que permitiu os primeiros
produtos nascidos nos anos 70 (Whittingham et al., 1972; Wilmut et al., 1973) previa o equilíbrio
entre a desidratação celular e formação de gelo, o que era obtido mediante o uso de baixas
concentrações de crioprotetores e um gradual resfriamento (1 a 2°C/min) até temperaturas muito
baixas (-60°C), quando o embrião (envasado em tubos ou ampolas de vidro) era mergulhado no
nitrogênio líquido (N2). Apesar de eficiente, este método demandava um longo período de
execução, tanto no congelamento, como no descongelamento, que também devia ser processado
de forma lenta. Essa limitação determinou o desenvolvimento de metodologias mais rápidas,
que culminaram no chamado método “rápido,” hoje conhecido como convencional. Esta
metodologia prevê queda de temperatura de 0,3 a 0,6°C/min., desde -7°C até -30°C, quando o
embrião (envasado em palheta plástica) é mergulhado em N2. O resfriamento até temperaturas
intermediárias, permite adequada desidratação, possibilitando o descongelamento em maior
velocidade. Esta metodologia é ainda hoje empregada, sendo desenvolvidos procedimentos que
possibilitam a transferência direta, quando o descongelamento é realizado sem retirar o embrião
da palheta.
Nos anos 80, buscando acelerar ainda mais o processo e eliminar a necessidade de
equipamentos capazes de controlar a curva de resfriamento, foi desenvolvido o protocolo ultra-
rápido, em que os embriões eram previamente desidratados pela exposição a açúcares de alto
peso molecular (não permeáveis), associado à concentrações mais elevadas (2,0 a 5,0 molar) de
crioprotetores permeáveis, que as usadas no congelamento convencional (1,0 a 1,8 molar). Como
o embrião desidrata adequadamente, mesmo sem queda da temperatura, pode ser congelado
rapidamente (2 cm acima do nível do LN2), sem o risco da formação de grandes cristais de gelo
intracelulares. Com este método, bons resultados foram obtidos no congelamento de embriões
murinos (Takeda et al., 1984; Williams e Johnson, 1985; Széll e Shelton, 1986; Chupin, 1987;
Bernardi, 1989; Mezzalira, 1991). Entretanto, com embriões bovinos, as taxas de prenhez obtidas
não foram satisfatórias (Mezzalira et al., 1996; Almeida, 2001), apesar do nascimento de produtos
normais.
Concomitantemente, surge também nos anos 80, como metodologia promissora a
vitrificação de embriões, capaz de eliminar totalmente a formação de cristais de gelo. O princípio
da técnica esta baseado na aceleração na velocidade de resfriamento a ponto de não permitir a
cinética de formação de cristais de gelo. Apesar de teoricamente ser possível vitrificar água pura,
as condições práticas para obtenção deste estado inexistem. Assim, para a criopreservação de
embriões, a obtenção do estado vítreo é dependente da associação entre alta concentração de
crioprotetores e alta velocidade de resfriamento. Com essa metodologia, Rall & Fahy (1985)
obtiveram o nascimento do primeiro camundongo derivado de embrião vitrificado. Entretanto,
apesar de demonstrada sua eficiência, com embriões produzidos in vivo, a vitrificação não
prosperou em função da dificuldade de execução, bem como por não melhorar os resultados
obtidos com a técnica de congelamento convencional.
Criopreservação de embriões produzidos in vitro.
O crescente número de grupos envolvidos na produção in vitro de embriões, bem como o

aumento de sua utilização comercial, gerou a necessidade de criopreservar os embriões excedentes.
Entretanto, apesar das tentativas de adequação, a metodologia de congelamento convencional
não se mostrou efetiva para este tipo de embriões. A baixa taxa de sobrevivência pós-
descongelamento é determinada pela sensibilidade dos embriões ao resfriamento, possivelmente
s192
em função de seu alto teor de lipídios. Como as lesões são tempo dependentes, buscou-se
metodologias alternativas que empregam altas velocidades de resfriamento a fim de reduzir o
tempo de exposição dos embriões as temperaturas críticas. Neste cenário, a vitrificação foi eleita
como o método mais promissor (Para revisão consulte Vajta, 2000a,b; Vajta & Kuwayama,
2006). A metodologia de vitrificação passou por diferentes adequações para tornar-se simplificada
o bastante para permitir o uso rotineiro. Inicialmente, os trabalhos foram orientados no sentido
de reduzir os efeitos tóxicos e osmóticos da elevada concentração de crioprotetores. Neste período,
constatou-se que a redução destes efeitos seria obtida mediante adaptação osmótica, uso de
associações de crioprotetores e redução da temperatura da solução concentrada. Apesar de efetivos,
estes procedimentos tornavam a técnica lenta e laboriosa, com o agravante de empregar volumes
elevados de crioprotetores, que limitavam a velocidade de resfriamento. Num segundo momento,
as pesquisas foram orientadas para aumentar a velocidade de resfriamento, com a redução no
volume das amostras, associada ao contato direto com o líquido refrigerante (N2 -196°C), nas
chamadas metodologias abertas. A partir da tecnologia das microgotas (Landa e Tepla, 1990) e
das grades de microscopia eletrônica (Martino et al., 1996), foram desenvolvidas diferentes
alternativas com intuito de facilitar a manipulação, a identificação e o armazenamento das
amostras. Neste aspecto, as metodologias baseadas no já estabelecido método de armazenamento
em palhetas tiveram maior difusão. Um dos mais importantes avanços nesta área foi obtido por
Vajta et al. (1997), que usando palhetas plásticas estiradas pelo calor (OPS), associaram a redução
no volume da amostra com o contato direto com o LN2, proporcionando praticidade de manuseio,
possibilidade de identificação e armazenamento da amostra. A partir desta técnica, diversas
variações foram propostas para aumentar a troca de calor entre a amostra e o líquido refrigerante,
buscando a aceleração na velocidade de resfriamento. O benefício potencial desta aceleração
está na possibilidade de obter o estado vítreo com menores concentrações de crioprotetores,
reduzindo assim os efeitos tóxicos. Buscando aumentar a velocidade de resfriamento, foram
testados materiais com maior capacidade de condução térmica, como as micropipetas de vidro
(Mezzalira et al., 1999) e tubos de metal (Bunn et al., 2006), em substituição às palhetas de
plástico. Entretanto, o principal fator limitante da taxa de resfriamento é a formação de vapor
entre a amostra e o N2, no momento da imersão. Duas estratégias foram desenvolvidas com
intuito de minimizar este efeito: 1) o método “solid surface vitrification” (Dinnyés et al., 2000),
que prevê a vitrificação de embriões em microgotas depositadas sobre um bloco metálico,
parcialmente submerso no N2, com uma temperatura de aproximadamente -150°C, e 2) o método
de vitrificação que usa N2 super-resfriado, com o ponto de ebulição deprimido pela ação de
pressão negativa (vácuo) e temperatura inferior a -210°C. O uso do N2 super-resfriado permite o
aumento na velocidade de resfriamento com diferentes tipos de materiais usados no envase das
estruturas, sendo assim mais versátil. Entretanto, seu uso não resultou em efeito positivo na
vitrificação de embriões de camundongos (Nowshari & Brem, 2001), nem melhorou as taxas de
eclosão in vitro de embriões bovinos vitrificados em OPS (Werlich et al., 2006). Isto provavelmente
deve-se ao fato dos blastocistos serem multicelulares, portanto com distinta relação superfície/
volume e assim, distinto coeficiente de permeabilidade. Desta forma, embora com alguns
resultados expressivos, os diferentes métodos não foram consistentes na criopreservação de
embriões produzidos in vitro.
Criopreservação de oócitos
Um dos principais objetivos dos criobiologistas é o desenvolvimento de uma metodologia

adequada para criopreservar oócitos. A possibilidade de armazenamento destas estruturas permite
solucionar problemas logísticos relacionados com a produção de embriões em momentos que
s193
existam receptoras disponíveis, bem como, pode permitir aos pesquisadores eliminar obstáculos
relacionados a flutuações na disponibilidade de oócitos, redução na qualidade, motivada por
efeitos sazonais ou problemas sanitários. Adicionalmente, o armazenamento de oócitos tem um
enorme impacto conservacionista, facilitando a preservação de raças ou linhagens ameaçadas de
extinção. Entretanto, a criopreservação de oócitos ainda não possui uma metodologia definida,
em função da alta sensibilidade ao resfriamento. Apesar de haver melhores resultados com oócitos
maturados (metáfase 2: MII), a criopreservação de oócitos imaturos (vesícula germinativa: VG),
apresenta uma grande vantagem ao permitir a criopreservação logo após sua obtenção, por
aspiração folicular guiada por ultra-som (OPU). O congelamento convencional também não se
mostrou adequado para oócitos, sendo os resultados mais promissores obtidos pela vitrificação.
Empregando a tecnologia OPS, Vieira et al., (2002) obtiveram o nascimento de três bezerros,
dois dos quais, produtos de embriões vitrificados derivados de ovócitos VG, também vitrificados,
comprovando a efetividade da técnica. Isachenko et al. (2001) reportaram que o emprego de
nitrogênio super-resfriado na vitrificação de oócitos VG ovinos permite a obtenção de melhores
resultados. O uso de nitrogênio super-resfriado a -200°C, com um equipamento artesanal aumentou
as taxas de blastocistos obtidas após vitrificação de oócitos bovinos, tanto maturados quanto
imaturos (Santos et al., 2006). Utilizando palhetas metálicas, associadas ao emprego de nitrogênio
super-resfriado na vitrificação, Bunn et al., (2006a) obtiveram aumento da taxa de embriões a
partir de oócitos bovinos imaturos. Entretanto, quando reduziram a concentração dos crioprotetores
em 25-50%, houve queda da taxa de embriões (Bunn et al., 2006b). Embora resultados positivos
tenham sido relatados, a taxa de desenvolvimento embrionário após vitrificação de oócitos é
usualmente muito baixa, demonstrando que são ainda necessários ajustes na técnica, para que
sejam obtidos resultados compatíveis com sua aplicação comercial.
Perspectivas futuras
Apesar de serem necessárias pesquisas direcionadas ao desenvolvimento de técnicas de

criopreservação adaptadas às necessidades especiais de determinadas estruturas, como embriões
PIV e oócitos, as evidências apontam que existe a necessidade de adequação no sistema de
produção in vitro de embriões. A percepção que os embriões ainda são produzidos em condições
sub ótimas está motivando um novo enfoque no futuro da pesquisa. O objetivo é identificar
protocolos e condições mais fisiológicas, que possibilitem a obtenção de embriões de melhor
qualidade e desta forma, menos sensíveis à criopreservação. É possível que embriões produzidos
nestas condições, com redução dos fatores estressantes, possam ter a capacidade de resistir ao
processo de congelamento convencional. Evidência deste fato é demonstrada por Rizos et al.
(2002), que observaram aumento na criotolerância de embriões PIV, após cultivo em oviduto de
ovelhas. Um aumento na sobrevivência após criopreservação, após o uso de estratégias (elevada
pressão hidrostática) para induzir a expressão de proteínas relacionadas ao estresse, as chamadas
“shock proteins” (Pribenszky et al., 2005), tem sido relatado. Adicionalmente, o enriquecimento
dos meios com aditivos como o β-mercaptoetanol, cisteína ou cisteamina (Matos & Furnus,
2000; Ali et al., 2003; Nedambale et al., 2006), que aumentam a produção de antioxidantes
endógenos, também permitem taxas superiores de desenvolvimento embrionário, após a
criopreservação. Estas estratégias possivelmente minimizam os efeitos das anormalidades celulares
e subcelulares, durante o desenvolvimento embrionário, o que deve reduzir a sensibilidade à
criopreservação.
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USO DE MARCADORES MOLECULARES EM PROGRAMAS DE

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES
José Fernando Garcia; Laércio Ribeiro Porto-Neto
Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal – Departamento de Apoio, Produção

e Saúde Animal - UNESP – Araçatuba e International Atomic Energy Agency (IAEA)
Collaborating Centre on Animal Genomics and Bioinformatics
José Fernando Garcia; Universidade Estadual Paulista – UNESP; Departamento de Apoio,
Produção e Saúde Animal; Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal; IAEA
Collaborating Centre in Animal Genomics and Bioinformatics; Rua Clóvis Pestana, 793 -
16050-680 - Aracatuba - SP – Brazil; Phone: 00 55 18 3636 3200 (ext 3636); Fax: 00 55 18
3622 6487; jfgarcia@terra.com.br
Resumo
Biotecnologias acopladas aos programas de melhoramento genético ganharam crescente

posição de destaque nos sistemas de produção de ruminantes. A criopreservação de
espermatozóídes e a inseminação artificial, associadas à transferência de embriões e à produção
de embriões in vitro, marcaram fase importante e decisiva para o melhoramento genético dos
animais de produção. Mais recentemente, graças ao acelerado desenvolvimento tecnológico, a
seleção genética entrou em nova fase na qual a avaliação fenotípica passou a contar com o
auxílio da avaliação genômica dos animais, pelo uso de ferramentas da genética molecular. A
sexagem de embriões, os estudos de expressão gênica diferencial, a identificação de QTL
(Quantitative Trait Loci) e de marcadores genéticos específicos, são partes integrantes da atual
tecnologia que está a disposição da seleção animal. O presente artigo sumariza conceitos atuais
sobre marcadores moleculares e as perspectivas atuais de sua utilização em programas envolvendo
transferência de embriões e tecnologias correlatas.
Palavras-chave: marcador molecular, PCR, transferência de embriões, fecundação in vitro,
SNP
Introdução
O Brasil segue a tendência mundial na busca de maior eficiência e qualidade na produção

de alimentos destinados à população humana em constante crescimento. A pecuária moderna
baseia-se na intensificação da atividade, tanto em relação a busca de qualidades produtivas dos
animais, quanto ao aumento da velocidade do ciclo de produção, favorecendo a maior produção
por área/ano (Milazzotto, 2001).
Para manter a competitividade comercial da produção de derivados animais num cenário
de mercados internos e externos em desenvolvimento, a agroindústria brasileira vêm investindo
em programas de melhoramento genético buscando aumentar a eficiência da produção,
padronização dos animais e de seus produtos. Dentre das estratégias utilizadas nos programas de
seleção podemos destacar: 1) o direcionamento de cruzamentos entre animais geneticamente
provados, 2) a importação e disseminação de material genético (animais, sêmen e embriões) de
rebanhos selecionados e 3) a utilização de cruzamentos entre raças aumentando a heterose,
geralmente refletida no aumento de produtividade.
s197
Como exemplo desses investimentos pode-se tomar o caso dos bovinos. No cenário atual,
os bovinos representam atividade pecuária de destaque no Brasil onde diversas raças das sub-
espécies zebuínas e taurinas são prevalentes. Os animais zebuínos são possuidores de diversas
vantagens em relação à produção nos trópicos quando comparados aos taurinos. É relatada maior
resistência ao calor, aos ectoparasitas, aos hematozoários e maior adaptabilidade a alimentos
com menor qualidade nutricional. Entretanto, como desvantagens são citadas a menor capacidade
produtiva, qualidade inferior da carcaça e desenvolvimento tardio, comparativamente aos taurinos
avaliados em seu ambiente natural (Koger, 1980; Pringle et al., 1997; Lobo, 1998; Associação
de Criadores de Nelore do Brasil; Associação Brasileira de Criadores de Zebu).
Animais taurinos apresentam muitas características desejáveis, destacando-se entre elas a
produção e qualidade do leite, a precocidade sexual e de qualidade e terminação de carcaça.
Entretanto como desvantagens demonstram maior susceptibilidade a infestação por ecto e
endoparasitas e menor tolerância ao calor. Buscando contornar os problemas apresentados pelos
grupos raciais individualmente, muitos sistemas produtivos utilizam o cruzamento entre animais
taurinos e zebuínos para aumentar a produção e produtividade dos animais.
Em menor número populacional, mas não em menor importância, a bubalinocultura,
ovinocultura e caprinocultura apresentam cada vez maior destaque no cenário das raças animais
exploradas no Brasil, consolidando-se como contribuintes efetivos para o aumento do PIB
nacional, através da seleção e melhoramento de raças nacionais bem como com a introdução de
germoplasma importado. A mesma situação não pode ser observada setor de suínos e aves onde
a padronização fenotípica de animais chegou a ponto de estabilizar o “tipo” animal requerido
que, via de regra, é comercializado por grandes empresas internacionais de melhoramento genético,
sendo o aprimoramento de sistemas de manejo, nutrição e sanidade de maior importância nessas
espécies, em detrimento de programas de melhoramento genético locais.
Neste contexto, as biotecnologias acopladas ao melhoramento genético ganharam crescente
posição de destaque nos sistemas de produção de ruminantes. A criopreservação de
espermatozóídes e a inseminação artificial, associadas à transferência de embriões e à produção
de embriões in vitro, marcaram fase importante e decisiva para o melhoramento genético dos
animais de produção. Mais recentemente, graças ao acelerado desenvolvimento tecnológico, a
seleção genética entrou em nova fase na qual a avaliação fenotípica passou a contar com o
auxílio da avaliação genômica dos animais, pelo uso de ferramentas da genética molecular. A
sexagem de embriões, os estudos de expressão gênica diferencial, a identificação de QTL
(Quantitative Trait Loci) e de marcadores genéticos específicos, são partes integrantes da atual
tecnologia que está a disposição da seleção animal (Garcia, 1995; Garcia, 2001).
Contexto Histórico
Os chamados marcadores moleculares, originados das variações no código do material

genético (genoma) dos animais e que segregam pelas gerações segundo padrão de herança
Mendeliana relacionada a características monogênicas ou que apresentam distribuição compatível
com as esperadas em características poligênicas, são também denominados de marcadores
genéticos (Ferreira e Grattapalia, 1998).
Os principais marcadores genéticos descritos são: 1) as inserções e deleções (Indels), 2) os
polimorfismos de base única (SNP) e 3) as regiões repetitivas. Quando estão localizados em
regiões codificantes dos genes, os polimorfismos podem levar a alteração no aminoácido da
seqüência protéica, nesse caso são chamados de polimorfismo “não sinônimo”, o que pode
determinar diferenças na função protéica e consequente variação fenotípica. As variações em
s198
regiões não codificantes podem também alterar significativamente a expressão genética por
diversos fatores tais como: promover processamentos alternativos do RNA, geração ou supressão
de códons de terminação/iniciação para a tradução ou alterar seqüências promotoras (Curi, 2004).
O elevado grau de polimorfismo, a inexistência de influência ambiental e a praticidade na
análise (devido à variedade de materiais biológicos passíveis de serem utilizados e à simplicidade
das técnicas envolvidas na análise) são algumas das vantagens da utilização desse tipo de
informação para análise genética individual ou populacional de animais (Ferreira e Grattapalia,
1998).
Dentre os marcadores baseados em seqüências repetitivas estão os marcadores
microssatélites, normalmente localizados em regiões não codificantes, com elemento repetitivo
entre 1 e 6 pares de bases posicionados em estrutura concatenada (em tandem) e com número
menor do que 100 repetições (Ferreira e Grattapalia, 1998). O polimorfismo de marcadores
microssatélites pode ser determinado pela amplificação por PCR da região desejada, seguida de
separação eletroforética, revelando padrões de banda variáveis de acordo com o número de
elementos repetitivos (Neuenschwander, 2001).
Os marcadores microssatélites estão amplamente distribuídos em todo o genoma de
eucariotos, apresentam elevado grau de polimorfismo, padrão de herança Mendeliana,
codominância e facilidade em detecção por PCR e conseqüente determinação dos alelos e
genótipos, sendo atualmente a ferramenta de eleição para execução de testes de paternidade
(Page e Holmes, 1998).
A caracterização fenotípica dos animais, de forma simplificada, é determinada pela interação
entre genótipo e o meio ambiente. Para estudar essa relação e suas conseqüências fisiológicas, é
preciso fixar uma das variáveis para melhor analisar a outra. Mantendo os animais nas mesmas
condições ambientais, é possível de forma segura, determinar a influência do genótipo no
desenvolvimento animal (Lewontin, 2002).
Como exemplo clássico, desde a domesticação dos bovinos há aproximadamente 10.000
anos (Bruford et al., 2003) e exploração destes animais como fonte de alimento e matéria prima,
o ser humano vem selecionando os melhores indivíduos para características de seu interesse,
concomitantemente à seleção natural. Com o conhecimento de que características fenotípicas
podem ser herdadas pelos descendentes, mesmo muito antes da descoberta do papel do DNA
como código genético, intensificou-se a seleção, primeiramente na área vegetal e posteriormente
na área animal, buscando-se plantas e animais de maior interesse pela seleção daqueles
considerados “superiores”.
Os sistemas de seleção clássica dependem da avaliação e mensuração das características
fenotípicas, havendo necessidade de esperar o desenvolvimento natural do animal avaliado para
a realização das mensurações nos momentos em que os fenótipos se manifestam natualmente.
Essa abordagem possui um forte componente de subjetividade uma vez que está sujeita a erros
humanos e estatísticos, mas foi a única base técnica disponível para o melhoramento genético
até o presente.
Uma das vantagens do uso de marcadores moleculares em programas de seleção é a de
apresentar o potencial de complementar a seleção clássica. As principais vantagens na sua
utilização estão relacionadas à precocidade de avaliação dos animais para características
específicas, uma vez que esta tecnologia emprega amostras de DNA, permitindo análises desde
momentos imediatamente após o nascimento, ou até mesmo durante a fase embrionária pré-
implatação, podendo ser inclusive incorporada em programas de produção in vitro e transferência
de embriões, agilizando e otimizando os sistemas de seleção genética/produção animal (Garcia,
2001). Além da objetividade envolvida na análise do DNA, outro importante benefício refere-se
à possibilidade de seleção de características não observadas tradicionalmente tais como aquelas
s199
que envolvem dificuldades técnicas de mensuração (precocidade sexual e de terminação de

carcaça), elevado custo das análises (maciez/marmoreio da carne e resistência a ectoparasitas)
ou por ser uma característica avaliada tardiamente (longevidade).
Em termos práticos, o principal foco na da aplicação de tecnologias de biologia molecular
relacionadas a avaliação de marcadores moleculares no melhoramento genético animal, consiste
em identificar e analisar a variabilidade e correlação de marcadores indiretos com fenótipos de
interesse (p.ex. microssatélites) ou o polimorfismo de genes que codificam proteínas que influam
em características fenotípicas desejadas quer seja pela função da própria proteína quer seja por
sua atuação como intermediário em vias metabólicas relacionadas ao fenótipo, contribuindo
para a melhor compreensão dos mecanismos regulatórios de controle da função gênica (p.ex.
SNP) (Curi, 2004).
A maior parte das características de interesse econômico apresentam padrão de manifestação
quantitativo e consequentemente controlados por vários genes, cujos efeitos se somam para
constituir o fenótipo manifestado efetivamente. Entretanto acredita-se que certos genes apresentem
papel majoritário na expressão dessas características, por serem responsáveis por grande parte
da manifestação do fenótipo, sendo denominados por isso como genes principais (ou do inglês:
major genes) (Montaldo e Meza-Herrera, 1998).
As duas principais metodologias utilizadas para a identificação das bases genéticas que
levam a manifestação de características de interesse em programas de seleção, são a abordagem
do gene candidato e a da identificação de QTL através do mapeamento genético. Os estudos
baseados em genes candidatos buscam indentificar polimorfismos diretamente nas regiões
codificantes de um dado gene alvo ou nos elementos regulatórios flanqueadores dessas regiões
(Fitzsimmons et al., 1998; Liefers et al., 2002; Almeida, 2003). Já a metodologia baseada no
mapeamento genético busca identificar polimorfismos relacionados a regiões genéticas de
interesse, mesmo que não se conheça o gene diretamente envolvido no fenótipo em questão
(Womack, 1993). Os marcadores mais utilizados atualmente para essa abordagem são os
microssatélites pois, graças às suas características peculiares previamente descritas, são ferramenta
fundamental para a associação entre o fenótipo e o genótipo monogênico ou poligênico (Ihara et
al., 2004).
Embora a abordagem de caracterização do mapa genético envolva maior número de
marcadores e aponte para maior número de regiões com potencialidade de relação positiva entre
fenótipo e genótipo, a metodologia do gene candidato é mais assertiva por buscar a própria
região de interesse que apresenta o efeito direto.
Recentes avanços biotecnológicos vem permitindo a descoberta de marcadores genéticos
aplicáveis à seleção e melhoramento em animais, sendo que em bovinos já foram descritos
polimorfismos e variantes moleculares nos genes de diversos hormônios e receptores hormonais
(Campagnari, 2002, Pringle et al., 1997; Liefers et al., 2002; Li et al., 2004; Di Stasio et al.,
2005; Curi et al., 2005; Almeida, 2003) e em enzimas relacionadas a importantes vias metabólicas,
como por exemplo as da calpaína e a calpastatina relacionadas a qualidade da carne (Barendse,
1997; Page et al., 2002; Grisart et al., 2004, Casas et al., 2005). Esses achados têm elevado os
genes evolvidos com a manifestação e controle dessas etapas fisiológicas como fortes candidatos
a possuírem marcadores moleculares de utilidade para a seleção genética. Entretanto faz-se
necessária a validação do efeito desses marcadores nas populações locais, em especial em raças
de bovinos zebuínos, pequenos ruminantes e bubalinos existentes no Brasil, objetivando a melhor
compreensão dos mecanismos fisiológicos envolvidos com essas manifestações, que ainda estão
longe de serem simples e diretamente explicados.
s200
Perspectivas e Conclusões
Apesar de serem grandes os avanços observados na literatura especializada nos últimos 10

anos, diversamente do que vem ocorrendo com aves e suínos, as aplicações de marcadores de
DNA em seleção e melhoramento genético nos ruminantes tem se restringido apenas a iniciativas
pontuais e isoladas tais como a sexagem de embriões, os testes de paternidade para fins de
registro genealógico e a detecção de alguns marcadores individuais para doenças genéticas ou
características funcionais.
Avanços oriundos das diversas iniciativas atualmente existentes no mundo para sequenciar
o genoma bovino deverão gerar grande quantidade de dados em breve (expetativa para final de
2006). Além do descobrimento da totalidade de seqûências gênicas no genoma bovino, em projeto
liderado pelo Consórcio Internacional do Sequenciamento do Genoma Bovino, a identificação
de sítios polimórficos do tipo SNP (do inglês: single nucleotide polymorphism) em grandes
quantidades, consistirá ferramenta para a busca de correlações entre genótipos e fenótipos com
maior acurácia do que pelo uso de alguns poucos marcadores individuais.
Nesse sentido, uma das iniciativas científicas mais promissoras da atualidade é o projeto
BovHapMap (ligado ao Consórcio Internacional do Sequenciamento do Genoma Bovino), que
segue os moldes do Projeto Genoma Humano e objetiva a identificação e análise dos diferentes
perfis polimórficos de marcadores SNP em diversas raças bovinas.
Espera-se que com essas informações seja possível aumentar a acurácia dos testes para
correlação fenótipo e genótipo, e validar marcadores para características de produção em curto
espaço de tempo, não somente nos bovinos, mas eventualmente com extrapolações nos demais
ruminantes (bubalinos, ovinos e caprinos).
Especialmente no caso das raças zebuínas existentes no Brasil (bem como de seus
cruzamentos), o presente momento é de crucial importância pois será necessário realizar os
testes de validação dos marcadores candidatos em populações controladas, o que consistirá da
primeira fase dessa nova etapa tecnológica que está a caminho.
O resultado desses testes deverá fornecer critérios adicionais para a realização dos
cruzamentos e acasalamentos entre animais, refletindo diretamente nas atividades práticas de
transferência de embriões in vivo (TE convencional) e de produção de embriões in vitro (FIV).
Com respeito à adaptação da tecnologia de análise de marcadores moleculares diretamente
no embrião, a partir de biópsia embrionária, apesar de tecnicamente exeqüível, não encontra
respaldo nos aspectos econômicos e práticos uma vez que o uso dos marcadores moleculares
(principalmente aqueles relacionados às caraterísticas funcionais) encontra-se ainda em estágio
de validação. A exemplo da recente expansão no uso da sexagem de embriões bovinos por PCR,
quando da sua incorporação às rotinas de produção de embriões in vitro após uma década da
demonstração de sua exeqüibilidade (Garcia, 1995; Garcia, 2001), o mesmo pode ocorrer com
os marcadores funcionais, entretanto nenhuma previsão pode ser estabelicida nesse momento.
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s203
s204
Dell’Aqua Jr. J.A., Papa F.O., Araújo Jr. J.P., Freitas C.P., Ponchirolli C.B., Figueiredo A.S., Melo C.M., Alberti K., Crespilho A.M., Siqueira
Filho, E.R. & Orlandi, C. 2006. Aplicação do sêmen sexado na produção de embriões. Acta Scientiae Veterinariae. 34 (Supl 1): 205-212.
APLICAÇÃO DO SÊMEN SEXADO NA PRODUÇÃO DE EMBRIÕES
Dell’Aqua Jr, J.A.1; Papa, F.O.1; Araújo Jr., J.P.2; Freitas, C.P.1; Ponchirolli, C.B.1; Figueiredo,
A.S.2; Melo, C.M.1; Alberti, K.1; Crespilho, A.M.1; Siqueira Filho, E. R.1; Orlandi,C.1
1
Dept. Reprodução Animal – FMVZ – Unesp – Botucatu; 2Dept. Microbiologia e Imunologia
– IBB – Unesp – Botucatu
Resumo
A utilização do sêmen sexado nos diferentes sistemas de produção de bovinos tem aumentado
nos últimos anos, com sua implantação na produção comercial, e isto o que levou vários produtores
começar a utilizar deste recurso em seus plantéis. O uso desta biotécnica contribui para uma
maior pressão de seleção junto a programas de melhoramento genético. Dentre as possibilidades
de sua aplicação, as relacionadas com a produção de embriões são as que apresentam maior
potencial. A seleção do sexo da progênie em rebanhos de leite e carne, pode contribuir com
grande incremento no sistema de produção, direcionando o nascimento de animais para o sexo
desejado. A técnica de separação espermática por citometria de fluxo, é atualmente a única que
apresenta resultados satisfatórios para produção comercial de doses sexadas. Sua eficácia na
seleção para o sexo proposto é em torno de 90%, resultando em nascimentos acima dos 85%
para o sexo selecionado. Porém, os índices de prenhez ainda apresentam grandes variações,
sendo necessário mais estudos em relação a metodologia, de forma que sua utilização apresente
taxas de fertilidade mais regulares. Esta revisão tem como objetivo explorar as possibilidades de
melhoramento da técnica de seleção espermática, e suas aplicações na produção de embriões in
vivo e in vitro.
Palavras chaves: sêmen sexado, produção de embrião in vitro, transferência de embriões,
congelação.
Introdução
Nos últimos 15 anos, houve um grande avanço em relação ao aprimoramento da técnica de

seleção de espermatozóides por citometria de fluxo. Um dos fatores que possibilitou sua
implantação na rotina comercial de produção de doses foi o aumento significativo na velocidade
de separação de espermatozóides X e Y.
A seleção do sexo tem um valor econômico significativo na pecuária de leite e de corte, em
sistemas onde a produtividade é favorecida pela progênie de um dos sexos (Taylor et al., 1985;
Van Vleck et al., 1987; Ruvuna et al., 1992; Hohenboken, 1999). Em programas de melhoramento
genético, a sexagem de espermatozóides associada à inseminação artificial (IA) e a transferência
de embriões (TE) incrementará o melhoramento genético animal pelo aumento do progresso
genético anual em até 25% para produção de leite e carne (Hohenboken, 1999).
A utilização do sêmen sexado poderá contribuir para o aumento da rentabilidade na produção
animal (Seidel & Johnson, 1999) devido à possibilidade de se produzir descendentes com o sexo
desejado visando a vantagem da diferença de características entre machos e fêmeas para mercados
específicos (Rorie, 1999). Sua aplicação em testes de progênie, pode reduzir os custos inerentes
a esse programa, devido ao direcionamento do sexo dos animais nascidos, diminuindo o número
convencional de inseminações hoje efetuadas (Hohenboken, 1999).
s205
Dentre os diferentes sistemas de produção animal, o direcionamento da seleção genética

do sexo ao nascimento de animais mais rentáveis, em relação ao tipo de manejo empregado, nas
diferentes categorias animais contidas no plantel, se mostra como uma das melhores opções de
emprego do sêmen sexado.
Estratégias de utilização do sêmen sexado nos diferentes sistemas de produção

Sistemas de produção de leite
Uma das principais áreas de utilização do sêmen sexado é no rebanho destinado a produção
de leite, onde, dependendo do sistema e do tipo de animais empregados, os machos não tem
valor agregado. Nos casos, em que as vacas são de alta produção leiteira como na raça Holandesa,
os bezerros machos são descartados acarretando em perdas econômicas ao sistema de produção.
Desta forma, a utilização do sêmen sexado para nascimentos de fêmeas, contribuiria positivamente
para este sistema de produção.
Dentre as vantagens relacionadas, a seleção genética de animais com características que
promovam uma melhor relação custo-benefício ao sistema de produção, se apresenta como
interessante opção de emprego desta biotécnica. Desta forma, as vacas mais adequadas e adaptadas
ao sistema de produção seriam as doadoras de embriões para as demais fêmeas do plantel,
direcionando a seleção das características desejáveis desses indivíduos para os futuros animais
de reposição, encurtando em várias gerações a seleção genética objetivada.
Outra vantagem, seria que a produção de embriões direcionada em épocas mais favoráveis
do ano, reduzir-se-ia a necessidade de inseminações artificiais nos meses de temperatura e umidade
elevadas, responsáveis pelo “Heat Stress”, resultando com isso melhoria nas taxas de prenhez.
Desta forma, um planejamento estratégico para produção de embriões pelas vacas que
apresentam maior retorno econômico, realizado nas épocas do ano mais favoráveis e transferidos
aos demais animais do plantel, maximizaria tanto os índices reprodutivos como diminuiria o
intervalo de tempo para seleção das características produtivas desejadas para todo rebanho.
Já nos sistemas menos intensivos de produção de leite onde o bezerro macho é
comercializado como animal de corte e os proprietários apresentam um menor poder aquisitivo,
a melhor estratégia seria adotar a implantação de um sistema misto, onde os animais mais rentáveis
doariam embriões aos menos produtivos e os restantes seriam inseminados com sêmen não
sexado ou até cobertos por monta natural com reprodutores provenientes do próprio criatório.
Desta forma, possibilitando a esse tipo de produtor de leite uma adequação do seu plantel a
geração de animais mais produtivos, dentro de sua realidade financeira.
Sistemas de produção de carne
Em rebanhos destinados a produção de carne, Ruvuna et al., 1992, relatam que ao abate de
animais exclusivamente do sexo masculino, com 24 meses de idade, gera um retorno econômico
27% maior do que um lote com 50% para cada sexo. Entretanto, neste tipo de sistema de produção,
os animais são produzidos através de IA e posteriormente os que não emprenharem, destinados
a repasse com touros por monta natural, desta forma o emprego do sêmen sexado deve ser baseado
em cálculos relacionados com os índices de fertilidade obtidos, custo da dose sexada e expectativa
do valor da arroba da carne na época de venda.
s206
Sistema de produção de reprodutores
A utilização do sêmen sexado em rebanhos destinados a seleção genética para produção de

reprodutores é de grande interesse por contribuir para a realização de acasalamentos direcionados
visando maximizar a performance de produção das matrizes com nascimentos de machos ou
fêmeas conforme as características desejáveis ao cruzamento. As doadoras de embriões com
aptidão para produção de carne ou leite teriam uma adequação da produção de embriões, uma
vez que quase a totalidade das prenhes geradas seria direcionada para o sexo desejado.
Fatores que afetam a utilização do sêmen sexado
Atualmente o emprego do sêmen sexado na reprodução de bovinos já é uma realidade,

entretanto alguns fatores contribuem para uma utilização restrita a alguns setores da produção. A
quantidade de doses produzidas é reduzida colaborando para o aumento do custo de produção e
conseqüentemente alto valor de comercialização. A grande variação nas taxas de fertilidade, faz
com que seu emprego necessite alguns pré-requisitos restringindo sua utilização a determinados
segmentos dentro do sistema de produção. A viabilidade do sêmen sexado, foi verificada em um
estudo onde foram analisados os parâmetros espermáticos pós-descongelação de doses comerciais.
As características de movimentação espermática e integridade das membranas plasmática e
acrossomal bem como o potencial da função mitocondrial foram avaliados pelo CASA e teste
com sondas fluorescentes (Celeghini, 2005) respectivamente, demonstrados na tabela 1.
Tabela 1: Valores médios e desvio padrão dos parâmetros

espermáticos de 20 doses de sêmen sexado comercial,
através de análise computadorizada pelo CASA e
integridade das membranas plasmática e acrossomal e
potencial de função mitocondrial pela técnica de
fluorescência
MT (%) 56,7±13,9
MP (%) 32,8±12,6
VAP (µm/s) 109,4±27,0
VSL (µm/s) 89,7±10,4
CASA VCL (µm/s) 208,6±32,9
AHL (µm) 8,0±1,4
BCF (Hz) 24,3±3,4
STR (%) 79,8±5,2
LIN (%) 45,6±5,4
IMP (%) 39,4±10,5
Fluorescência IMA (%) 71,2±9,8
PM (%) 62,6±20,6
Com base nos resultados obtidos, pode-se sugerir que os padrões espermáticos do sêmen
sexado pós-descongelação possuem características que indicam uma hiperativação. A
hiperativação espermática ocorre em mamíferos dentro do oviduto da fêmea, caracterizando-se
por apresentar um movimento vigoroso, não progressivo e não linear, relacionado com a
capacitação e a fertilização. Durante a hiperatividade observa-se um aumento da amplitude lateral
de cabeça (AHL) e da velocidade real dos espermatozóides (VCL). Verstegen et al., 2002, indicam
que amplitudes laterais de cabeça superiores a 7,0µm e altos valores de VCL em relação ao VSL
caracterizam um movimento vigoroso e desordenado condizentes com a hiperatividade
s207
espermática. Estes fatores em associação a um alto potencial de função mitocondrial refletindo

um intenso gasto de energia requerido nesta fase, sugerem uma hiperatividade do sêmen sexado
após a descongelação.
Desta forma, o direcionamento de pesquisas que possibilitem minimizar este efeito e
conseqüentemente aumentando viabilidade do sêmen sexado são importantes para melhorias
dos índices de fertilidades obtidos.
Aplicação do sêmen sexado na produção de embriões in vitro
Desde meados da década de 80, vários laboratórios de produção in vitro de embriões

iniciaram um trabalho comercial nos Estados Unidos, Europa e América Latina. O propósito
inicial da FIV (fertilização in vitro) comercial é a obtenção de embriões de doadoras que não
estão aptas a produzir embriões utilizando outras técnicas convencionais, mas atualmente, a FIV
é utilizada como um complemento para programas de TE. Uma particularidade especial dessa
biotécnica, em comparação com outras, é a maximização do uso do sêmen, permitindo a utilização
de reprodutores com alto valor comercial, inclusive doses de sêmen sexado (Faber et al., 2003).
Por esse motivo, a técnica de produção in vitro de embriões associada ao sêmen sexado
apresenta-se, atualmente, como a associação de biotécnicas mais aconselhável para geração de
descendentes com o sexo pré-determinado. Devido ao limitado número de espermatozóides
contidos nas doses comerciais de sêmen sexado, esta técnica maximiza seu aproveitamento em
relação à quantidade de embriões produzidos, podendo até uma dose ser compartilhada entre
mais de um animal doador de ovócitos. Faber et al., 2003, chegaram a afirmar que a otimização
da técnica de PIV (produção in vitro) depende, entre outros fatores, da utilização bem sucedida
do sêmen sexado.
Wilson et al., 2005, ressaltam que a determinação do sexo embrionário pré-fecundação
(com uso de sêmen sexado) aumenta a relação custo-benefício na transferência de embriões ao
comparar esta biotécnica com determinação do sexo do embrião, já em fase de desenvolvimento,
por biópsia. Esta última, por se apresentar com uma técnica invasiva pode em algumas vezes,
inviabilizar a utilização de determinado embrião ou promover injúrias a sua integridade
ocasionando reduções nas taxas de gestação.
Entretanto, a utilização do sêmen sexado em programas de PIV, tem ocasionado grande
variação na geração de embriões viáveis a transferência. Estudos recentes comparam a utilização
de sêmen sexado por citometria de fluxo ao sêmen convencional (não sexado) em relação à
produção in vitro de embriões bovinos em programas comerciais. Zhang, et al. 2003, não
observaram diferenças significativas entre as taxas de produção de embriões utilizando sêmen
sexado, sêmen submetido somente ao corante para sexagem ou sêmen convencional (20,3%,
21,6% e 22,3% respectivamente), concluindo que a separação dos espermatozóides ou o corante
utilizado para a separação por citometria de fluxo não interferem no desenvolvimento embrionário
in vitro.
Lu et al., 1999, encontraram diferenças significativas nas taxas de produção de blastocistos
utilizando sêmen sexado ou convencional, mas afirmam que a utilização dessa biotécnica é
viável para programas de PIV.
Em um recente estudo, Wilson et al., 2006, obtiveram taxas de produção de blastocistos
significativamente inferiores com a utilização de sêmen sexado em comparação ao sêmen
convencional, ressaltando a necessidade de mais estudos para otimização da técnica de utilização
do sêmen sexado e sua aplicação comercial.
s208
Como foi ressaltado anteriormente, os parâmetros espermáticos do sêmen sexado apresentam

características próprias e assim sendo, a utilização de protocolos de seleção espermática utilizados
para o sêmen convencional na PIV, não é o mais adequado quando se trata de sêmen sexado.
Além das doses comerciais de sêmen sexado apresentarem concentração espermática inferior ao
convencional, o padrão alterado de movimentação espermática resulta em dificuldade de
sedimentação dos espermatozóides após a seleção em Percoll, portanto, o número de células
recuperadas é menor, resultando em uma concentração inadequada e conseqüentemente,
restringindo a quantidade de oócitos que poderiam ser fecundados. A baixa concentração
espermática obtida após seleção em gradiente Percoll está relacionada com taxas mais baixas de
clivagem e conseqüentemente, taxas inferiores de produção de blastocistos, comparando a
produção com sêmen convencional ou não sexado.
Várias metodologias de preparação espermática têm sido desenvolvidas especificamente
para a utilização de sêmen sexado nos processos de fertilização in vitro. Alguns autores testaram
o efeito de diferentes concentrações de heparina e de espermatozóides no meio de fertilização,
objetivando determinar a concentração ótima dessas variáveis. Os resultados demonstraram que
houve aumento significativo na taxa de penetração espermática quando a concentração de heparina
aumentou de 0 para 2 µg/ml e a concentração espermática aumentou de 0,5 a 1,0 x 106
espermatozóides/ml, utilizando sêmen sexado. Porém, as taxas de clivagem e blastocistos não
foram diferentes. No mesmo estudo, quando se comparou a concentração de 10 µg/ml de heparina
e 1,5 x 106 espermatozóides/ml utilizando sêmen sexado ou convencional, o grupo de oócitos
fertilizados com sêmen convencional gerou taxas de blastocistos significativamente superior
(Lu & Seidel Jr., 2004).
Frente a estas peculiaridades e a inconstância das taxas de embriões produzidos com o
emprego do sêmen sexado em protocolos de PIV, Ponchirolli, et al., 2006, desenvolveram uma
metodologia onde os resultados obtidos viabilizam a utilização em conjunto destas duas
biotecnologias. As modificações propostas basicamente estão relacionadas ao procedimento de
seleção espermática, que é efetuada por centrifugação em gradientes de densidade Percoll, em
uma microcentrífuga de alta rotação. O protocolo proposto por Ponchirolli et al., 2006, diminui
o volume de Percoll geralmente utilizado na fertilização in vitro com sêmen convencional e o
tempo de centrifugação. Além disso, utiliza alta rotação, a fim de recuperar maior número de
células, proporcionando melhor aproveitamento da dose comercial de sêmen sexado, viabilizando
sua utilização em rotinas comerciais de PIV, os resultados obtidos estão expostos na tabela 2.
Atualmente vários laboratórios de PIV do Brasil adotaram essa metodologia e obtêm
resultados satisfatórios com a utilização do sêmen sexado comercial.
A tendência é de que todos os laboratórios de PIV do Brasil passem a utilizar rotineiramente
o sêmen sexado em suas rotinas de trabalho comercial, tendo em vista as inúmeras vantagens
que essa técnica traz para o mercado de embriões bovinos.
A produção in vitro utilizando sêmen convencional, gera um grande número de embriões
do sexo indesejado. Desta forma a obtenção de bons resultados na PIV utilizando sêmen sexado,
contribuiria para a determinação do sexo dos embriões produzidos com grande índice de acerto,
maximizando os recursos utilizados com esta biotécnica.
s209
Produção in vivo de embriões através da utilização de sêmen sexado
A produção in vivo de embriões, através de técnicas de superovulação e transferência, é

tida como outra importante ferramenta de utilização com sêmen sexado. Por se tratar de um
procedimento mais próximo do fisiológico do que a PIV, que ainda apresenta alguns fatores
indesejados, como natimortos, gestações com fetos absolutamente grandes, abortamentos e outras
inconvenientes decorrentes de sua utilização, seria a biotécnica mais adequada para utilização
do sêmen sexado. Entretanto, os índices de produção de embriões viáveis com a utilização do
sêmen sexado pelas metodologias convencionais com duas inseminações, não apresentam
resultados satisfatórios, havendo a necessidade de utilização de um maior número de doses por
vaca superovulada.
Provavelmente as características espermáticas de hiperatividade observadas no sêmen
sexado, podem estar contribuindo para uma menor longevidade destes espermatozóides,
acarretando com isso a possibilidade de uma menor taxa de fertilização, devido a dispersão das
ovulações de vacas superovuladas e conseqüentemente redução nos índices de embriões
produzidos.
Outro aspecto importante a ser analisado em relação à taxa de recuperação embrionária
com a utilização do sêmen sexado é a grande variabilidade de resultados gerada entre touros.
Determinados animais apresentam índices de fertilização próximos aos obtidos com sêmen
convencional, como pode ser visto na tabela 3.
A existência deste fato, até que a técnica apresente uma maior homogeneização de resultados
entre touros, deve ser avaliada no momento da aquisição de doses sexadas a fim de obter taxa de
recuperação de embriões viáveis mais vantajosas.
A técnica de citometria de fluxo para sexagem espermática, aparentemente não traz
decréscimos a fertilidade de alguns touros, entretanto necessita de aperfeiçoamentos para se
tornar mais abrangente a animais menos resistentes ao seu procedimento.
Os touros 3 e 4 apresentaram porcentagens de embriões viáveis bem próximas a de um
sêmen não sexado, entretanto os animais 1 e 2 produziram um baixo número de embriões
transferíveis em relação a taxa de estruturas recuperadas, expressando a maior sensibilidade do
sêmen de determinados touros a sexagem por citometria de fluxo.
s210
Tabela 3: ValoresConclusões
do número de estruturas recuperadas e embriões transferidos de vacas
superovuladas inseminadas com 3 doses de 5x106 de espermatozóides sexados.
O sêmen sexado
Doadora Touro No Estruturas Óvulosé uma biotecnologia
Degenerados que recentemente
Mórulas Blastocistos esta disponível comercialmente.
Transferidos
1 1 Sua aplicabilidade
6 nos
3 diferentes
2 sistemas de
1 produção0bovina, proporcionarão
1 tanto o aumento
2 1 9
da pressão 7 genética,
de seleção 0 como incremento
1 na 1produção de 2carne e leite. Entretanto,
3 1 avanços8 científicos4sobre a viabilidade
2 0
espermática 2
pós-sexagem, 2
aumento da velocidade de
4 1 9 3 3 1 2 3
sexagem e principalmente regularidade nos índices de fertilidade, são fatores importantes que
Total touro 1 32 17 7 3 5 8
5 2 contribuirão
7 para consolidar
6 seu
1 emprego no0 mercado de0 doses congeladas
0 em bovinos.
6 2 8 7 0 1 0 1
7 2 Referências
15 12 3 0 0 0
8 2 9 6 0 2 1 3
Total touro 2 39 E.C.C. Efeitos
Celeghini, 31 4
da criopreservação 3 do sêmen1bovino sobre 4as membranas plasmática,
9 3 15 10 0 3 2 5
acrossomal e mitocondrial e estrutura da cromatina dos espermatozóides utilizando sondas
10 3 14 8 0 0 6 6
11 3 fluorescentes.
7 Tese 2Doutorado,1Universidade 1 de São Paulo,
3 São Paulo-SP,
4 2005.
12 3 8
Faber, D.C., Molina,4 J.A., Ohlrichs,
0 0
C.L., Vander Zwaag, 4 D.F., Ferre, L.B.
4 Commercialization of
Total touro 3 44 24 1 4 15 19
animal biotechnology. Theriogenology, 59: 125-138, 2003.
13 4 13 2 1 3 7 10
14 4 11
Hohenboken, W. D. Applications of sexed semen in cattle production. 7Theriogenology, 52: 1421-
4 0 1 6
15 4 12
1433, 1999. 3 0 6 3 9
16 4 8 1 2 4 1 5
Total touro 4 Lu, K.H.,
44 Gram, D.G.,
10 Seidel Jr.,3 G.E. in vitro
14fertilization
17with flow-cytometrically-sorted
31 bovine
Total 159 82 15
sperm. Theriogenology 52: 1393-1405, 1999. 24 38 62
* Dados de campo gentilmente fornecidos pelo M.V. Osvaldo Teobaldo Filho
Lu, K.H., Seidel Jr., G.E. Effects of heparin concentration on cleavage and blastocyst development
rates of bovine oocytes inseminated with flow cytometrically-sorted sperm. Theriogenology, 62:
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Hossepian de Lima V.F.M. 2006. Espermatozóide sexado bovino: quando utilizá-lo? Acta Scientiae Veterinariae. 34 (Supl
1): 213-224. Acta Scientiae Veterinariae 34(Suplemento 1): 2006
ESPERMATOZÓIDE SEXADO BOVINO: QUANDO UTILIZÁ-LO?
Profa. Dra. Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal

14870-000 FCAV, Unesp, Câmpus de Jaboticabal-SP, Brasil.
RESUMO
A viabilidade da sexagem de espermatozóides em bovinos é esperada por muitos anos e os

desenvolvimentos recentes tornaram essa tecnologia de aplicação comercial. Entretanto, muitas
limitações ainda existem, principalmente, referentes à taxa de gestação em condições de campo.
Isso restringe a utilização dessa tecnologia no melhoramento genético e produção animal. O
foco deste trabalho será discutir os potenciais sistemas de criação e produção que poderão difundir
a sexagem de espermatozóides, apesar dessas limitações.
Palavras chave: seleção do sexo, sexagem de espermatozóides, bovino.
INTRODUÇÃO
Diferentes rotas tecnológicas são percorridas na tentativa de selecionar-se o sexo em

mamíferos, tanto nas espécies de interesse zootécnico quanto em espécies ameaçadas de extinção,
animais de companhia e na reprodução humana assistida. Neste sentido, existem duas alternativas:
a separação de espermatozóides portadores do cromossomo X, daqueles portadores do
cromossomo Y; ou a sexagem de embriões pré-implantados.
O mercado demanda, desde final da década de 20, uma tecnologia para a sexagem de
espermatozóides que possa ser inserida na indústria de produção de sêmen congelado e que
tenha as características que foram contempladas na presente invenção. Desta forma, tal invento
não altera a viabilidade espermática a índices inferiores àqueles recomendados pelos órgãos de
fiscalização (por exemplo, Ministério da Agricultura); é compatível com a congelação dos
espermatozóides após o tratamento para sexagem; permite a sexagem de espermatozóides após
o descongelamento dos mesmos; e permite a produção de várias doses de sêmen sexado (com
acuidade de até 86 %) congelado por dia a um custo compatível com o mercado.
A importância dessa tecnologia é a sua utilidade para maximizar produção animal com
menor custo e vem sendo estudada durante vários anos. A possibilidade de produzir, em escala
comercial, doses de sêmen enriquecido com espermatozóides portadores do cromossomo X ou
Y, aumentará os benefícios da utilização da inseminação artificial (IA), conferindo-lhe um papel
decisivo na maximização do progresso genético entre gerações, de acordo com as necessidades
de cada programa de melhoramento genético e da aptidão do rebanho.
Produção de leite
Um exemplo são as raças especializadas para a produção de leite, nas quais a manutenção
de gestações e o nascimento de animais do sexo masculino é um dos fatores de diminuição da
produtividade e aumento dos custos de produção. O progresso genético será maximizado em
programas de criação para a produção de leite em que a proporção sexual é controlada por ocasião
da inseminação artificial, obtendo-se machos ou fêmeas, quando desejado (VAN VLECK et al.,
s213
1976). Van Vleck (1981) e Dematawewa & Berger (1998) estimaram um custo aproximado de
US$19-US$35.00 por unidade de sêmen. Atualmente, cerca de 150-200 doses de sêmen
enriquecidas com espermatozóides X podem ser produzidas por citômetro por dia e isso
compreende menos que 0,5% das necessidades diárias de doses de sêmen do mercado dos Estados
Unidos. Além disso, a taxa de prenhez de novilhas a campo está em torno de 35-40% e 55-60%
utilizando sêmen sexado e convencional, respectivamente. Está baixa taxa (35-40%) é o fator
limitante para a utilização do sêmen sexado naquele país. (WEIGEL, 2004).
Nos rebanhos de elite, as últimas estimativas um progresso genético mais modesto do que
aquele predito anteriormente. Baker et al. (1990 citado por WEIGEL, 2004) sugeriram que a
habilidade de alterar a proporção sexual da progênie de touros e vacas de elite tem menor impacto
no ganho genético anual, que é aumentado em torno de 0,4 a 1,4%, mesmo quando associado a
múltiplas ovulações e transferência de embriões Montaldo et al. (1998 citado por WEIGEL,
2004). Entretanto, Baker et al., (1990) estimou que a seleção do sexo teria um efeito maior nos
rebanhos comerciais de produção de leite, particularmente naquelas situações onde o macho tem
valor econômico mínimo ou negativo. Além disso, o uso de seleção do sexo na produção in vitro
de embriões (PIV) minimizaria o custo do teste de progênie em cerca de 33% já que permitiria
apenas a transferência dos embriões do sexo desejado (NICHOLAS, 1996).
Produção de carne
Nos programas de cruzamento industrial a seleção do sexo de espermatozóides maximizará

a produtividade e permitirá obter-se maior proporção de machos (75-90 %) em relação às fêmeas
(10-25 %; HOHENBOKEN, 1999). Devido às diferenças entre os sexos nas características de
carcaça - o peso morto do macho, aos 24 meses é cerca de 25 % maior que o peso morto da fêmea
da mesma idade - o valor de uma progênie com 100 % de machos será cerca de 34 % maior do
que aquela composta de 40 % de machos (RUVUNA et al., 1992). Entretanto, existem programas
de cruzamento que são beneficiados pelo nascimento de maior proporção de fêmeas na primeira
geração (F1). Essas fêmeas são utilizadas como matrizes, ou seja, inseminadas com touros de
raças terminais (com características de carcaça e conversão alimentar), o que possibilita maior
rendimento na produção de carne após o abate (HOHENBOKEN, 1999). Esses programas
assemelham-se àqueles sistemas de produção de carne com raças puras, nos quais a máxima
produtividade é obtida quando toda a progênie é do sexo feminino (TAYLOR, 1985).
Em sistemas de produção de carne utilizando-se raças puras, a conversão alimentar da
matriz é inversamente proporcional ao número de bezerros que compõe a sua progênie. Assim,
no sistema de produção de carne, a máxima eficiência é alcançada quando a fêmea é acasalada
quando novilha produz uma fêmea que a reporá no rebanho e é abatida logo após a desmama da
mesma (“single-sex bred heifer” ou SSBH). As razões são as seguintes:
a) nesta idade a matriz assume o papel do produto no abate, o que minimizará o custo de
produção do bezerro; b) quanto maior o número de parições menor a conversão alimentar da
fêmea.
Com o controle do sexo, por sexagem dos espermatozóides ou embriões, cada matriz poderá
produzir uma bezerra, ou várias (pela indução de múltiplas ovulações), na primeira gestação e
então, ser abatida após a desmama deste produto (TAYLOR, 1985; HOHENBOKEN, 1999).
Na população de elite, Villanueva et al (1995, citado por HOHENBOKEN, 1999) testaram
se a resposta de seleção em um rebanho fechado e submetido a MOTE seria melhorado pelo
aumento da proporção de novilhas de 50% para 67% ou 75%. Como rebanho era fechado, e
assim, não haviam mais fêmeas escolhidas a partir da população, a intensidade de seleção das
fêmeas aumentou. Concomitantemente, houve uma diminuição na intensidade de seleção dos
s214
machos e nenhum benefício líquido com a seleção do sexo. Assim, como predito por Foote &
Miller (1971 citado por HOHENBOKEN, 1999), em uma população fechada, o controle da
proporção sexual na progênie tem pouco efeito nas taxas de resposta seleção devido à manipulação
das intensidades de seleção de machos ou fêmeas.
Perspectivas para a aplicação comercial da sexagem de espermatozóides
A aplicabilidade comercial da sexagem dos espermatozóides depende do estabelecimento

de uma metodologia que além de ser compatível com o processo de congelação, minimize a
perda de espermatozóides durante o processo e não reduza o poder fecundante dos mesmos.
Considerando estes aspectos, é necessário avaliar a qualidade não somente em relação à acuidade
de sexagem, mas também no que diz respeito à viabilidade dos espermatozóides após a
descongelação das doses de sêmen enriquecidas com espermatozóides portadores do cromossomo
X ou Y. Estes aspectos são decisivos para tornar factível a produção de doses de sêmen enriquecidas
com espermatozóides X ou Y pela indústria da inseminação artificial a um custo compatível com
a realidade do mercado.
Em bovinos, a IA é a principal responsável pelo incremento da produtividade. No Brasil,
cerca de 5 % das fêmeas em idade de reprodução são inseminadas (ASBIA 2000), com perspectivas
de atingir-se de 60 a 100 % como em alguns países desenvolvidos como EUA e Japão, Austrália
e Dinamarca, respectivamente (BETTERIDGE, 1986). O número crescente de rebanhos
submetidos a Programas de Melhoramento Genético e Cruzamento Industrial, que tem tido
crescimento expressivo desde 1989, é que permitiu que a utilização da IA apresentasse um
crescimento de 350% nos últimos 10 anos. Estes mesmos Programas é que permitem que,
atualmente, as vendas de sêmen sustentem-se em patamar acima de 7 milhões de doses/ano
(ASBIA, 2005). Além das vantagens zootécnicas (HOENBOKEN, 1999), este mercado crescente
e potencial para IA é o que justifica o grande interesse na sexagem de espermatozóides por parte
das empresas de colheita e comercialização de sêmen que operam no Brasil. Entretanto, a IA
tanto no Brasil como no mundo está restrita a cerca de 5% e 1% do mercado considerando as
fêmeas em idade de reprodução ou registradas, respectivamente (HASLER, 2003).
Atualmente, considera-se que o desenvolvimento de uma técnica para a sexagem de
espermatozóides também beneficiará a reprodução assistida de espécies animais ameaçadas de
extinção e animais de companhia (SEIDEL & JOHNSON, 1999).
Várias técnicas descritas até o momento para separação de espermatozóides X ou Y
envolvem procedimentos complicados com o uso de equipamentos sofisticados que ainda se
encontram em processo de aperfeiçoamento para se adequarem à indústria de produção de sêmen,
como é o caso do citômetro de fluxo. Além disso, todas estas técnicas, principalmente a citometria
de fluxo, causam danos irreparáveis aos espermatozóides e ao seu DNA, comprometendo, portanto,
a eficiência do espermatozóide no processo de fertilização e produção de embriões capazes de se
desenvolver sem alterações no DNA.
Para selecionar o sexo de embriões bovinos, o mercado também é restrito já que o volume
de transferências corresponde à cerca de 1% do total das vacas registradas no Brasil e em países
como Estados Unidos e Canadá (dados da Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões,
2003; HASLER, 2003).
A separação dos espermatozóides portadores do cromossomo X daqueles portadores do Y
baseia-se na detecção de pelo menos uma das seguintes diferenças fenotípicas (físicas ou químicas)
entre esses dois tipos de células
BLECHER et al. (1999) relataram a identificação e isolamento de proteínas específicas do
sexo (SSP, Sex Specific Protein) para obtenção de anticorpos específicos do sexo masculino e do
s215
sexo feminino. Após a incubação com espermatozóides bovinos, os anticorpos antiproteínas

específicas do sexo feminino promoveram a aglutinação de 50 % daquelas células. As células
que não sofreram aglutinação produziram in vitro 106 embriões, dos quais apenas 72 puderam
ser sexados por citogenética sendo 92 % destes do sexo masculino. Não foi relatado se a incubação
de espermatozóides com anticorpos antiproteínas macho específica também promoveu o desvio
da proporção sexual em favor do sexo feminino. É importante ressaltar que, a validação do
método foi por citogenética, sendo que cerca de 28 % embriões não puderam ser sexados por
esta técnica. Os autores postularam a presença de diferentes proteínas cromossomais específicas
do sexo, na superfície dos espermatozóides X e Y, originárias de transcrição e tradução pós-
meiótica e que não seriam capazes de atravessar as pontes interespermáticas. Os autores
consideram que após um aprimoramento deste novo método seria possível desenvolver uma
técnica imunológica de separação de espermatozóides portadores do cromossomo X e Y, apesar
de estudos prévios (HENDRIKSEN et al., 1997, HOWES, et al. 1997) reportarem insucesso no
sentido de estabelecer diferenças de proteínas de membrana entre os espermatozóides X e Y.
BLECHER registrou em patente (US 5,840,504; 24/11/1998) a identificação das moléculas
sexo específicas relatadas no seu trabalho de 1999, descrevendo as possíveis utilizações práticas
do seu invento, relatando o desenvolvimento de um método para a sexagem imunológica dos
espermatozóides, pela identificação de proteínas específicas do sexo (SSP, Sex Specific Protein).
Esses métodos baseiam-se na identificação e isolamento dessas proteínas, na sua purificação por
cromatografia de coluna e na obtenção de anticorpos antiproteínas específicas do sexo masculino
e do sexo feminino. Após a incubação com espermatozóides bovinos, os anticorpos antiproteínas
específicas do sexo feminino promoveram a aglutinação de 50 % daquelas células. As células
que não sofreram aglutinação produziram in vitro 92% de embriões do sexo masculino. Não foi
relatado se a incubação de espermatozóides com anticorpos antiproteínas macho específicas
também promoveu o desvio da proporção sexual em favor do sexo feminino. Os autores postularam
a presença de diferentes proteínas cromossomais específicas do sexo, na superfície dos
espermatozóides X e Y, originárias de transcrição e tradução pós-meiótica e que não seriam
capazes de atravessar as pontes interespermáticas.
Um aprimoramento deste método se faz necessário para sua aplicação em escala comercial
e em programas de melhoramento genético e produção animal já que os autores não relatam o
desvio da proporção sexual em favor do sexo feminino, o qual é preferido nestes programas. O
autor afirma que o resultado preliminar da identificação destas moléculas poderia, no futuro ser
utilizado em escala comercial para sexagem de espermatozóides por técnica imunológica.
A despeito da existência das Patentes citadas acima sobre sexagem de espermatozóides
pelo método imunológico, estudos eletroforéticos da membrana dos espermatozóides X ou Y,
separados por citometria de fluxo, têm demonstrado que não é possível identificar-se diferenças
entre as proteínas de membrana dos portadores do cromossomo X ou Y (HENDRIKSEN et al.,
1999). A explicação poderia ser a existência de vários mecanismos biológicos para prevenir a
expressão haplóide e a possível troca de mRNA devido à presença de pontes citoplasmáticas
entre as espermátides X e Y (ERICKSSON et al., 1981).
A quantidade de DNA entre os cromossomos X e Y varia significativamente entre as espécies
e, até o momento é a única diferença estabelecida e validada cientificamente para a separação
eficiente de espermatozóides X ou Y in vitro (JOHNSON, 1994). Em bovinos, esta diferença no
conteúdo de DNA chega à cerca de 4,0 % (GARDNER et al., 1983; JOHNSON, 1994). Com
base nesta diferença, existem duas técnicas que podem ser utilizadas para a seleção do sexo dos
espermatozóides: a citometria de fluxo e a centrifugação em gradiente de densidade.
A diferença entre a quantidade de DNA dos espermatozóides X ou Y é evidenciada
utilizando-se um corante fluorescente. Após a coloração, os espermatozóides X ou Y são separados
s216
de acordo com a intensidade de fluorescência em um citômetro de fluxo (JOHNSON & PINKEL,

1986; JOHNSON 1992, 1994). JOHNSON em agosto de 1992, na Patente Americana US
5,135,759 descreve a técnica de citometria para separar estas duas populações de espermatozóides.
Enquanto ainda experimental, a separação tem sido incrementada pela utilização de citômetros
com fluxo de alta velocidade, como o MoFlo discutido em várias patentes US 5,150,313; US
5,606,039; US 5,602,349; US 5,643,796 e na patente internacional WO96/12171.
As primeiras publicações sobre a sexagem de espermatozóides bovinos utilizando citometria
de fluxo (US 5,135,759, Johnson) relatavam acuidade de 90% quando a velocidade do fluxo é de
cerca de 100 células por segundo, o que corresponde a aproximadamente 2x106 espermatozóides
a cada 5-6 horas. Naquela época, eram necessárias cerca de 30 horas para separar a quantidade
de espermatozóides necessária para produzir uma dose de sêmen congelado para inseminação
artificial por via cervical, que é a via utilizada convencionalmente (JOHNSON et al., 1994;
SEIDEL et al., 1996). No entanto, durante os últimos anos muitos estudos foram efetuados no
sentido de otimizar os resultados obtidos com esta técnica. Alguns aspectos foram
substancialmente modificados com o objetivo de vencer as limitações da técnica como pode ser
verificado nas patentes US 6,149,867; US 6,263,745; US 6,357,307 e WO 99/05504. Como por
exemplo, a variabilidade ou heterogeneidade do sinal de fluorescência dos espermatozóides devido
à pequena variação de DNA (3 a 4 %), nas distintas espécies de mamíferos, nos cromossomos X
ou Y, a qual é superada pelo uso de um novo sistema orientado por um funil. Este novo sistema
aliado ao uso de um equipamento separador de células com elevada velocidade promoveu a
separação de mais de 11 milhões de espermatozóides portadores do cromossomo X por hora,
com 85 a 90% de pureza (JOHNSON & WELCH, 1999).
Neste sentido, vale lembrar que a pureza dos espermatozóides separados pela citometria
de fluxo pode ficar em torno de 85 % quando a velocidade de separação de apenas uma das
subpopulações é de 11 milhões/hora. Entretanto, quando essa velocidade de fluxo é aumentada
para 18 milhões/hora a pureza dos espermatozóides diminui para 75 %.
Entre os fatores que ainda limitam a eficiência desta técnica destacam-se principalmente o
baixo número de espermatozóides sexados viáveis; a longa exposição ao corante tóxico sob alta
temperatura e a necessidade de utilizar sêmen “in natura” (JOHNSON et al. 1994).
Com o aumento da eficiência dos protocolos de fecundação “in vitro” poucos
espermatozóides são necessários para fecundar um oócito. Assim, a probabilidade do emprego
desta técnica é maior. Em bovinos, utilizando-se 5 a 10 mil espermatozóides sexados/oócito é
possível, por citometria de fluxo, separar-se por hora espermatozóides X suficientes para se
fecundar até 2200 oócitos. Entretanto, utilizando espermatozóides sexados, sem submetê-los a
congelação, obtém-se índice de apenas 66 % de clivagem, 16 a 20 % de desenvolvimento (LU et
al., 1999; GUTHIE et al., 2002). A utilização de espermatozóides sexado congelado poderá
reduzir drasticamente estas taxas.
JONHSON (2000) destaca que a capacitação prematura é claramente uma característica
do espermatozóide sexado pelo citômetro, o que é uma desvantagem para o espermatozóide que
será destinado a estocagem (congelação), mas é uma vantagem para o espermatozóide que será
usado imediatamente após a separação para fazer FIV, dispensando a indução da capacitação dos
espermatozóides antes da fertilização.
Outra limitação é a diminuição da eficiência de sexagem de espermatozóides descongelados,
devido ao fato da congelação prejudicar a uniformidade da coloração dos núcleos, com o corante
Hoechst 33342 (JOHNSON et al., 1994). Isto restringe a utilização dos melhores touros (touros
provados), dentro de cada raça, nos programas de melhoramento animal e teste de progênie que
utilizam a produção in vitro de embriões.
s217
Apesar dos tratamentos utilizados no método de citometria de fluxo (coloração com Hoechst
33342 e exposição à luz ultravioleta) aparentemente não impedirem o desenvolvimento in vitro
do zigoto, LIBBUS et al. (1987) observaram aberrações cromossômicas em 50 % dos
espermatozóides de Microtus oregoni, após a sexagem por esse método. A freqüência das quebras,
por exemplo, foi de 0,6 e 2,9 no grupo controle e naquele que recebeu o tratamento,
respectivamente. O número total de aberrações por célula chegou a 7,5.
Além disso, em bovinos a motilidade de espermatozóides sexados por essa técnica foi de
apenas 51 % para as frações X ou Y (JOHNSON et al., 1997). Após o processo de congelação/
descongelação a motilidade diminuiu para 45% (laser regulado para 100 mW; 351, 364 nm) e
apenas 65 % dos espermatozóides sexados mantiveram a integridade do acrossoma (SCHENK
et al., 1999).
Esses espermatozóides descongelados (1 a 3 milhões/dose) quando depositados no corpo e
nos cornos do útero de novilhas produziram um índice de prenhez médio de 48,5 % e 50,5%,
respectivamente. Neste trabalho, foram obtidas 108 prenhezes utilizando espermatozóides
congelados portadores do cromossomo X em IA no corpo ou cornos uterinos, das quais 88 (81,5%)
eram de fetos do sexo feminino, conforme diagnóstico por ultra-sonografia (SEIDEL et al., 1999).
Esses fatores, associados ao pequeno número de células separadas/hora, dificultam a aplicação
comercial desta técnica e incentivam a investigação de outra diferença fenotípica entre os
espermatozóides X e Y que possa ser discriminada por citometria de fluxo. Um exemplo é o
trabalho de VAN MUNSTER et al. (1999a,b) que confirmaram a existência de diferença no
volume da cabeça entre os espermatozóides X ou Y e a propuseram como um parâmetro alternativo
para sexagem por citometria de fluxo. Entretanto, os autores ainda não descreveram as
modificações que serão necessárias no citômetro de fluxo, para viabilizar a sexagem utilizando
esse parâmetro. Além disso, não há garantia de que este novo sistema mantenha a viabilidade
espermática durante o processo, já que outros fatores ainda não quantificados podem prejudicar
essa viabilidade, tais como: a) a velocidade em que o fluxo de espermatozóides passa pelo
citômetro; b) a temperatura na qual os espermatozóides são mantidos durante o processo; c) o
tempo gasto durante o processo para separação dos espermatozóides.
Apesar da necessidade de uso de doses de sêmen com baixíssima quantidade de
espermatozóides (compatível com a produção do citômetro) e da baixa viabilidade espermática
pós sexagem, a citometria de fluxo tem sido o método mais estudado por vários grupos nos
últimos vinte anos devido, principalmente, a acuidade de sexagem que pode atingir até 95 %
(GARNER, 2000). Entretanto, a revisão da literatura denota que os resultados de fertilidade a
campo utilizando os espermatozóides sexados por este método demonstram índices favoráveis
em condições experimentais e estritamente controladas. Espermatozóides descongelados (1 a 3
milhões/dose) quando depositados no corpo do útero de novilhas produziram um índice de prenhez
médio de 48,5 % e 50,5 % quando depositados nos cornos uterinos (SEIDEL et al., 1999). Neste
trabalho foram obtidas 108 prenhezes utilizando espermatozóides congelados portadores do
cromossomo X em IA no corpo ou cornos uterinos, das quais 88 (81,5 %) eram de fetos do sexo
feminino, conforme diagnóstico por ultra-sonografia (SEIDEL & JOHNSON, 1999).
Nos Estados Unidos, resultados de um teste de campo compararam as taxas de prenhez,
conseguidas com espermatozóides sexados por citometria de fluxo, em rebanhos com baixa,
media e alta eficiência reprodutiva. A taxa média de prenhez utilizando doses de sêmen
convencional foi de 58%, enquanto que utilizando sêmen com espermatozóides sexados nesses
rebanhos as taxas de gestação foram 21, 37, e 35%, respectivamente. Considerando esses
resultados, torna-se evidente que os espermatozóides sexados por citometria de fluxo
comprometem a taxa de gestação, pelo menos atualmente, e estratégias para a aplicação comercial
s218
in vivo desse sêmen deveriam ter como foco caminhos para se obter um benefício efetivo, incluindo
idade a primeira parição, frente ao custo de utilização (WEIGEL, 2004).
A citometria de fluxo é considerada por alguns autores a técnica mais promissora, devido
à acuidade de separação estar em torno de 90 %. Entretanto, ela tem se demonstrado altamente
dispendiosa, e a capacidade de fecundação dos espermatozóides é significativamente reduzida
(CRAN et al., 1995).
Para exemplificar, há dados da literatura (JOHNSON e WELCH, 1999) que demonstram
que, por citometria de fluxo, é necessária uma hora para se produzir 18 milhões de espermatozóides
sexados com pureza de 75% e com viabilidade comprometida após descongelação na maioria
das vezes. Utilizando a centrifugação em gradiente de densidade conseguiu-se produzir no mesmo
período de tempo pelo menos 450 milhões de espermatozóides sexados com pureza de até 81%
e mantendo-se a viabilidade espermática em índices comparáveis ao sêmen não sexado (FAPESP/
UNESP/USP BR PI 0300604-2, 17 Jun. 2003).
Os procedimentos envolvendo, sedimentação ou centrifugação de espermatozóides baseiam-
se na diferença de densidade existente entre os portadores do cromossomo X ou Y. SUMNER &
ROBINSON (1976) analisaram por microinterferometria a cabeça dos espermatozóides e
verificaram que os portadores do cromossomo X contêm mais DNA e proteína nuclear que os
espermatozóides Y e que esta diferença é proporcional à diferença de massa entre os dois tipos
de células. A análise de espermatozóides X ou Y de várias espécies por mensuração das cromátides
(MORUZZI, 1979) ou por citometria de fluxo (GARNER et al., 1983) revelaram que a diferença
no conteúdo de DNA varia de 2,8 % na espécie humana a 12,5 % no Microtus oregoni (PINKEL
et al., 1982a; JOHNSON & CLARKE, 1990). Nos animais domésticos, as diferenças de DNA
entre os espermatozóides X ou Y variam de 3,5 % a 4,2 %, sendo que nos bovinos ela é de cerca
de 4,0 % (GARNER et al., 1983; JOHNSON et al.,1987a; JOHNSON,1992, 1994). Nesta espécie,
observou-se uma diferença média significativa do conteúdo de DNA dos espermatozóides X ou
Y entre as raças, mas não entre os indivíduos da mesma raça. Entre os espermatozóides X ou Y
de touros Jersey observou-se a maior diferença (4,24 %) quando comparada com as raças Angus
(4,05 %), Hereford (4,03 %), Holstein (3,98 %) e Brahman (3,73 %) que apresenta a menor
diferença. A grande quantidade de água e de lipídeos contida na cabeça dos espermatozóides, já
que o DNA corresponde a apenas 18% da massa fazem com que a diferença do conteúdo de
DNA produza uma pequena diferença no peso e, conseqüentemente, na densidade. Em 1982,
Meistrich (citado por WINDSOR et al., 1993) estimou que a diferença no conteúdo de DNA dos
espermatozóides X ou Y de bovinos resulta em uma diferença de densidade de 7X10-4 g/cm3 , ou
0,06 % da densidade em relação a um espermatozóide X. O autor salientou que esta diferença faz
com que a separação dos dois tipos de espermatozóides seja possível desde que se utilizem
gradientes com alta resolução de densidade.
Em bovinos, BLOTTNER et al. (1993) utilizaram centrifugação em gradiente de Percoll
para a separação dos espermatozóides bovinos portadores do cromossomo X ou Y. O gradiente
consistiu de 10 camadas de 0,6 ml de soluções de Percoll com concentrações variando entre 22%
e 48%. Este método propiciou um enriquecimento de mais de 75 % de espermatozóides X ou Y
nas frações inferior e superior, respectivamente, como verificado por hibridização in situ. Após
as duas centrifugações, os espermatozóides de ambas frações não demonstraram nenhuma
diferença significativa quanto à morfologia. A indução da reação acrossômica demonstrou
capacitação normal. Os espermatozóides de ambas frações foram utilizados para produção in
vitro de embriões que foram sexados por PCR, o que demonstrou que a utilização de
espermatozóides da fração superior e inferior resultaram em 75 % e 92 % de embriões do sexo
masculino e feminino, respectivamente.
Recentemente, HOSSEPIAN DE LIMA et al. descreveram em patente (FAPESP/UNESP/
s219
USP BR PI 0300604-2, 17 Jun. 2003) gradientes compostos de soluções isotônicas feitas a partir
de substâncias compostas de partículas coloidais ou gradientes feitos com soluções isotônicas a
partir de componentes iodinatados que permitem em uma única centrifugação, separar as
impurezas (partículas leves, espermatozóides imaturos, células, bactérias, etc) dos espermatozóides
viáveis e, dentre estes, separar os espermatozóides X dos Y. A diminuição do número de
centrifugações permite, sem alterar a acuidade de separação dos espermatozóides X e Y, diminuir
as injúrias causadas nos espermatozóides pelas sucessivas centrifugações e manipulações e assim
preservar a resistência dos mesmos ao processo de congelação.
A introdução de componentes iodinatados (desenvolvidos para uso como contraste em
procedimentos utilizando raios-X) como meio para gradientes de densidade ofereceu novas
oportunidades para melhorar os métodos de separação de material biológico, especialmente células
e organelas subcelulares.
O iodixanol é um componente iodinatado não iônico desenvolvido para estudos envolvendo
raios-X (NOSSEN et al., 1990; BOLSTAD et al., 1991) e caracteriza-se por ser uma forma
dimérica do Nycodenz e ter o dobro do seu peso molecular. Na separação de organelas subcelulares,
o iodixanol apresenta vantagens sobre o Percoll e o Nycodenz, já que é denso o suficiente para
produzir gradientes com densidades superiores a 1,32 g/ml e com osmolaridade inferior a 300
mOsm (GRAHAM et al., 1994).
A venda de sêmen previamente sexado é um evento tão esperado no mercado que vem
sendo anunciado há alguns anos pelas indústrias do setor, conforme se pode constatar em artigo
da revista DBO RURAL, de fevereiro de 2000, no qual a GENUS-GENSEL previa o início da
comercialização de sêmen sexado dentro de dois anos pela ABS. A técnica anunciada pela GENUS
baseia-se em métodos imunológicos (patente US 5,840,504) e prevê que o sêmen sexado por
este método custará mais que o dobro do sêmen convencional e acredita que devido ao custo a
demanda do mercado (nacional e internacional) será dividida entre os dois tipos, sexado e não-
sexado. Em outubro de 2001 a GENUS-GENSEL encerrou suas atividades anunciando que a
tecnologia desenvolvida por eles, apesar de competitiva, é capaz de processar pequenas
quantidades de sêmen, permanecendo ainda no estágio de pesquisa. Outra previsão de venda de
sêmen sexado foi feita pela XY Inc.(ARBL Building, CSU Foothills Campus, Fort Collins, CO
80523 USA) em parceria com GEORGE SEIDEL (patente US 6,149,867) e está publicada no
“Proceedings, The range beef cow Symposium XVI”, Dezembro de 1999, intitulado: “Imminent
commercialization of sexed bovine sperm”. Neste artigo, os autores previam a comercialização
em larga escala de sêmen sexado por citometria de fluxo em dois anos. A XY Inc. licenciou a
técnica para empresa COGENT que lançou comercialmente em Julho de 2000 o sêmen sexado
na Inglaterra. Entretanto, apesar de contar com 10 aparelhos de citometria de fluxo MoFlo tem
capacidade de produzir um pequeno número de doses (apenas atendendo o mercado local).
Nenhuma dessas previsões foi concretizada já que a comercialização está restrita ao mercado
local, com um pequeno número de doses produzidas por ano, muito aquém da demanda mundial.
Além disso, as empresas afirmam que essas doses terão um baixo número de espermatozóides
(nos testes foram utilizados 1-3x106 espermatozóides por dose) o que poderá inviabilizar a
utilização deste método para produção de doses de sêmen destinadas a IA convencional.
Provavelmente, a comercialização do sêmen sexado nesta concentração encontrará barreiras na
legislação brasileira e de outros países que têm como número mínimo para comercialização 10
X 106 espermatozóides vivos viáveis por dose (TELFORD et al., 2003).
Estimativas da literatura científica demonstram que os métodos de sexagem de
espermatozóides poderiam ter as seguintes vantagens para aumentar o progresso genético e
produção animal:
s220
- produzir doses de sêmen enriquecidas com espermatozóides portadores do cromossomo

X ou Y por centrifugação em gradiente de densidade, em escala comercial, por um processo
compatível com o processo de envase e congelação de sêmen existentes em empresas
especializadas na produção e comercialização de sêmen congelado;
- não comprometer a capacidade fecundante dos espermatozóides;
- ser comercializada para utilização em programas de IA (Inseminação Artificial) utilizando
a técnica tradicional (sêmen depositado logo após a cérvix) e em variadas condições de manejo
reprodutivo, obtendo-se índice de prenhez e nascimentos de pelo menos 50 % em bovinos de
leite e 85% em bovinos de corte;
- ser utilizada em sêmen congelado após a descongelação, o que permite a utilização dos
melhores touros (touros provados), dentro de cada raça, nos programas de melhoramento animal
e testes de progênie que utilizam a produção in vitro de embriões, ao contrário da técnica por
citometria, na qual a congelação/descongelação dos espermatozóides diminui a eficiência de
sexagem devido ao fato da congelação prejudicar a uniformidade da coloração dos núcleos, com
o corante Hoechst 33342;
- ser utilizada para PIV (Produção in vitro de embriões) obtendo-se índices de clivagem e
desenvolvimento embrionário acima de 75% e 35%, respectivamente;
- ter baixo investimento em equipamentos
A aplicabilidade comercial da sexagem dos espermatozóides depende do estabelecimento
de uma metodologia que além de ser compatível com o processo de congelação, minimize a
perda de espermatozóides durante o processo e não reduza o poder fecundante dos mesmos.
Considerando estes aspectos, é necessário avaliar a qualidade não somente em relação à acuidade
de sexagem, mas também no que diz respeito à viabilidade dos espermatozóides após a
descongelação das doses de sêmen congelado enriquecidas com espermatozóides portadores do
cromossomo X ou Y.
Assim, é difícil concluir como seriam os resultados em países como o Brasil, que possuem
uma pecuária caracterizada por heterogeneidade de condições de manejo. Neste sentido, considera-
se que para a realidade brasileira, é mais interessante optar-se por desenvolver uma metodologia
de baixo custo, que atinja acuidade de sexagem em torno de 75 %, mas que permita, em condições
variadas de manejo, obter-se índices de fertilidade satisfatórios.
O cenário da pecuária brasileira se comparado ao mundial permite prever que, no curto
prazo, os criadores utilizarão os espermatozóides sexados nos procedimentos de PIV enquanto o
retorno monetário obtido, com o bezerro do sexo desejado, exceder o custo de produzí-lo.
Entretanto, no longo prazo, os criadores somente utilizarão os espermatozóides sexados se esse
procedimento efetivamente maximizar o ganho genético anual e a produtividade. Além disso,
caso a biossegurança seja negligenciada, no longo prazo a seleção do sexo poderá contribuir
nesse sentido. Nos Estados Unidos, por exemplo, rebanhos comerciais e de elite tem expandido
rapidamente em muitos estados, já que a pressão financeira leva muitos pecuaristas a buscar a
economia em escala. Para essa expansão, os rebanhos fechados vêm utilizando a PIV e a seleção
do sexo em matrizes do próprio rebanho e adquiridas em leilões, exposições agropecuárias ou de
outros criadores. Quando essas matrizes ou as receptoras prenhez chegam, todos os animais da
propriedade podem ser expostos a muitos novos patógenos (por exemplo, Leptospirose,
Paratuberculose). A taxa de descarte involuntário subseqüente aumenta devido a maior freqüência
de doenças, inabilidade das vacas se adaptarem e pobre potencial genético entre os animais
comprados e seus descendentes (WEIGEL, 2004). Como resultado, os pecuaristas necessitam de
mais animais de reposição, e o ciclo continua. Provavelmente, a possibilidade de utilização da
seleção do sexo na PIV imporá aos técnicos o desafio de permitir que os criadores aumentem o
número de fêmeas a partir de rebanhos fechados para evitar os problemas sanitários.
s221
Agradecimentos: FAPESP, São Paulo, Brasil pelo suporte financeiro para o depósito da Patente
BR PI 0300604-2, 17 Jun. 2003.
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AVANCES EN CLONAGEN E TRANSGENESIS NA ARGENTINA
Daniel F Salamone
Laboratorio Biotecnología Animal. FA-Universidad de Buenos Aires, Argentina.
Resumen
La transgénesis que significa la introducción de ADN exógeno en el genotipo de un animal

es una herramienta importante tanto para la agricultura, la farmacología, la biomedicina y la
biotecnología. Una gran variedad de métodos han sido desarrollados para introducir ADN. En
esta presentación se describirá algunos de los aspectos generales de la clonación animal que hoy
se a convertido en uno forma mas eficientes para generar animales transgénicos. Luego se
detallarán algunas experiencias en el terreno de la clonación y transgénesis bovina realizadas en
la Argentina en un proyecto desarrrolado por la empresa Biosidus como en la Facultad de
Agronomía de la UBA.
El principio básico de la clonación por transplante o transferencia nuclear consiste en
remover el núcleo de un ovocito maduro no fertilizado y transferirle un núcleo o una célula
entera. Las células somáticas se reproducen in vitro con gran facilidad y como toda célula diploide
no reproductiva de un individuo tiene la misma información genética, por lo que mediante el
transplante nuclear teóricamente se pueden producir tantos animales idénticos como se deseen.
La extracción del núcleo del ovocito se realiza generalmente por micromanipulación y aspiración
con pipetas de vidrio, controladas por equipos de movimiento de precisión denominados
micromanipuladores. Luego se realiza la activación por químicos para inducir el desarrollo
embrionario.
En un primer experimento destinado a incrementar la tasa de supervivencia de los embriones
clonados a partir de animales adultos, comparamos diferentes sistemas de cultivo embrionario y
diferentes tipos de células somáticas donantes. El objetivo de este experimento fue establecer las
condiciones mas adecuadas para producir embriones clonados, en paralelo, se realizaban
experiencias de transfección con células fetales. En un segundo experimento se comparo el
desarrollo de embriones bovinos producido de líneas fetales no transfectadas y transfectadas, en
este último grupo se utilizo ovoplastos tratados con roscovitina o no. Esta droga permite inhibir
la maduración por un periodo de 24 horas lo que favorece la posibilidad de ir un día al matadero
y trabajar 2 días diferentes. Nuestra hipótesis era también que la roscovitina eventualmente puede
mejorar la viabilidad del embrión producido. A diferencia de otros autores la transgénesis no
indujo una reducción en la capacidad de desarrollo de los embriones clonados. En tanto que el
tratamiento con roscovitina no solo no redujo la viabilidad sino que permitió observar un tendencia
positivo en el desarrollo embrionario. También se han realizado experiencias en la cual se han
producido bovinos luego de una segunda ronda de clonación a partir de bovinos clonados y
transgénicos. Finalmente se describirán la extensión de las técnicas de clonación y transgénesis
a otras especies de granja. En la Argentina se han adoptado muchas de las llamadas “Biotecnologías
de la Reproducción” con relativa rapidez, tanto por la acción de profesionales de la actividad
privada como la realizada por investigadores de organismos oficiales, pocos años después de
generadas estas tecnologías en los países desarrollados y pionera en relación a otros países del
tercer mundo. Lo que nos permite ser optimistas respecto a las posibilidades futuras para el
desarrollo y aplicación de estas técnicas en nuestros países.
s227
Introducción
La transgénesis que significa la introducción de ADN exógeno en el genotipo de un animal

es una herramienta importante tanto para la agricultura, como para la farmacología, la biomedicina
y la biotecnología. Una gran variedad de métodos han sido desarrollados para introducir ADN,
entre ellos la inyección de ADN en embriones y la transfección de células somáticas seguidas
del transplante nuclear o clonación. En el presente articulo se describirá algunos de los aspectos
generales de la clonación animal (para una revisión detallada recomendamos los artículos de
Renard et al., 2002 y Dinnyés et al., 2002), luego se detallarán algunas experiencias en el terreno
de la clonación y transgénesis bovina realizadas en nuestro país en un proyecto desarbolado por
la empresa Biosidus.
El principio básico de la clonación por transplante o transferencia nuclear consiste en
remover el núcleo de un ovocito maduro no fertilizado (ovoplasto recipiente) y transferirle un
núcleo o una célula entera (núcleo o célula donante).
Las células somáticas se reproducen in vitro con gran facilidad y como toda célula diploide
no reproductiva de un individuo tiene la misma información genética, por lo que mediante el
transplante nuclear teóricamente se pueden producir tantos animales idénticos como se deseen.
Este grupo de animales idénticos se denomina clón y el procedimiento para generarlos clonación.
La extracción del núcleo del ovocito se realiza generalmente por micromanipulación y
aspiración con pipetas de vidrio, controladas por equipos de movimiento de precisión denominados
micromanipuladores. El núcleo del ovocito madurado in vitro, normalmente se detiene después
de la primera división meiótica en el estadio de metafase II, hasta el momento de ser fecundado
por un espermatozoide. Después de la fecundación será el espermatozoide mediante un proceso
denominado “activación” quien inicia una serie de sucesivas duplicaciones del ADN y divisiones
celulares. En la clonación la activación debe ser realizada artificialmente por la aplicación de
diversos métodos químicos o físicos.
La tecnología básica para la clonación por transplante nuclear en mamíferos fue desarrollada
en el ratón en los años 80 usando como donante células de embriones (blastómeros), pero los
resultados en esta especie fueron desalentadores. Sin embargo, Willadsen (1986), usando como
donante blastómeros de embriones tempranos produjo los primeros corderos clonados. Un año
después Robl et al., (1987) con el mismo tipo de células donante produjeron los primeros terneros
clonados.
La técnica de clonado con células embrionarias no logro tener gran aceptación a los entre
investigadores y profesionales debido a numerosos factores. Entre ellos el hecho que se debía
trabajar con células embrionarias cuyo mérito genético era desconocido, además los embriones
tempranos tienen un reducido número de células. Sumando a esto las bajas tasas de preñez y
dificultades en el parto producidas por el excesivo peso de las crías no se promovió la aplicación
comercial de la técnica. El entusiasmo inicial fue disminuyendo y prácticamente ninguna compañía
estaba usándola comercialmente hasta 1997. En este año Wilmut et al. (1997) publican el
nacimiento de la oveja Dolly la cual fue producida por clonación de células provenientes de un
animal adulto.
Como inicialmente los resultados de clonación con células donantes adultas eran poco
eficientes, se considero la posibilidad de usar células fetales como células donantes. Los grupos
del Instituto de Roslin (Schnieke et al., 1997) y de la Universidad de Massachusetts (Cibelli et
al., 1998) produjeron los primeros ovinos y bovinos respectivamente clonados y transgénicos.
Se demostró que la técnica de transplante nuclear es extremadamente eficiente para producir
animales modificados geneticamente. Las células fetales pueden multiplicarse in vitro por periodos
s228
mas prolongados que las adultas, lo que permite introducir e incluso eliminar genes y además
obtener un mayor número de clones a término y una mayor supervivencia después del nacimiento
que las obtenidas a partir de células adultas (Heyman et al. 2002).
Los telómeros (la parte extrema de los cromosomas) de la primera oveja clonada (Dolly)
eran mas cortos y no correspondían su edad real, sino con la edad de la célula donante (Ashworth
et al., 1998). En otras palabras, sus telómeros eran los de una oveja varios años más vieja que la
que correspondía a la edad de Dolly. Los telómeros se van acortando cada vez que las células se
dividen llegando hasta un determinado tamaño, a partir del cual las células no se dividen más.
Normalmente este mecanismo protege al organismo de que se multipliquen en exceso células
potencialmente peligrosas. Sin embargo investigadores de la compañía ACT con base en
Massachusetts han demostrado exactamente lo contrario (Lanza et al., 2000), y por clonación
podrían elongarse los telómeros y en términos celulares rejuvenecer las células.
Algunos de los grandes problemas de la clonación, inicialmente descriptos en los trabajos
de neozelandeses y japoneses (Wells et al., 1999; Kato et al., 1999), siguen siendo actuales,
como son las numerosas perdidas durante la preñez y la alta mortandad perinatal, obligando ésta
ultima a realizar cuidados intensivos en los recién nacidos. La causa aparente de este problema,
al menos en parte, se debe a anomalías placentarias. Una de las hipótesis es que la expresión de
los genes de los animales clonados es incorrecta y que la célula donante fue reprogramada
ineficientemente por el ovocito enucleado.
A continuación describimos algunos experimentos que si bien los realizamos en bovinos,
nos describen algunas de las variables a considerar para la producción de animales clonados y
transgénicos en otras especies. A continuacion se describen una serie de experimentos desarrolladas
un equipo de trabajo integrada por personas convocadas y financidas por la empresa Biosidus en
las referencias se citan partes de los los integrantes de dicho grupo de trabajos.
Experimento 1: Clonación de células adultas y sistema de cultivo e (Salamone et al. 2003)
En un primer experimento destinado a incrementar la tasa de supervivencia de los embriones

clonados a partir de animales adultos, comparamos diferentes sistemas de cultivo embrionario y
diferentes tipos de células somáticas donantes. El objetivo de este experimento fue establecer las
condiciones mas adecuadas para producir embriones clonados, en paralelo, se realizaban
experiencias de transfección con células fetales.
Células de la granulosa y fibroblastos provenientes de animales adultos fueron utilizadas
como células donantes al comparar diferentes sistemas de cultivo embrionario. Después del
transplante nuclear, fusión y activación, tres sistemas de cultivo se utilizaron, cuando las células
donantes fueron fibroblastos adultos: TCM-199+5% FCS o Menezo+5% FCS (ambos con células
Vero como co-cultivo y atmósfera con 5 % de CO2 en aire) y SOF sin co-cultivo pero con una
baja concentración de 5 %O2, 5% CO2, y 90 % de N2. Para las células de la granulosa, los
embriones producidos solo se cultivaron con Menezo+5% FCS y células Vero como co-cultivo
y 5 % de CO2 en aire.
Los resultados de este experimento se describen en la tabla 1. El grupo tratamiento SOF
obtuvo clivaje y desarrollo hasta blastocisto en mayor proporción que los otros tratamientos,
además se simplifico el trabajo de laboratorio dado que entre otras ventajas no se necesitaba
preparar la línea celular para el co-cultivo, por lo que se decidió su utilización en el siguiente
experimento. Sin embargo el único animal que llego a término fue producido a partir de TC199
+ VERO, pero murió durante el parto.
s229
Tabla 1. Experimento 1: Clonación con células adultas

Tratamiento n Clivaje Blastocisto Preg. Nacimientos
(%) (%) (%)
Granulosa C199+VERO 92 59 a 26 (28)b 11 (12) 0
Fibroblasto TC199+VERO 294 53.9 a 22(7.5)a 5(38.4) 1
Fibroblasto Menezo+VERO 324 72.3 bc 29(8.9)a 5(29.4) 0
Fibroblasto SOF 108 75.0 bc 24(22.2)b 5(45.4) 0
abc Porcentages dentro columnas con diferente letras son diferentes (P<0.05)
Experimento 2: Clonación de células fetales transgénicas y ovoplasto tratados con

roscovitina (salamone et al. 2003)
En un segundo experimento se comparo el desarrollo de embriones bovinos producido de

líneas fetales no transfectadas y transfectadas, en este último grupo se utilizo ovoplastos tratados
con roscovitina o no. Esta droga permite inhibir la maduración por un periodo de 24 horas lo que
favorece la posibilidad de ir un día al matadero y trabajar 2 días diferentes. Nuestra hipótesis era
también que la roscovitina eventualmente puede mejorar la viabilidad del embrión producido.
La técnica utilizada con algunas modificaciones fue descripta previamente (Salamone et al.,
2001).
Los embriones producidos en los todos los tratamientos fueron cultivados en SOF sin co-
cultivo pero con una atmósfera de 5% de O2, 5 % de CO2 y 90 % de N2. Se utilizaron como
célula donante fibroblastos fetales, transfectados o no. Para la línea transfectada también se
determino si la roscovitina podía incrementar la disponibilidad de ovocitos recipientes a lo largo
de la semana y o incrementar su viabilidad.
Los resultados se describen en la tabla 2. No se observaron diferencias entre los tratamientos.
La transfección no afecto la capacidad de desarrollo de los animales clonados, tampoco afecto el
tratamiento de la receptora con roscovitina, sorprendentemente con este último tratamiento se
observo una tendencia positiva en el desarrollo. Se produjeron trece animales transgénicos en
menos de un año de trabajo lo que demuestra el potencial de clonación en la transgénesis de
animales de granja.
Tabla 2. Experimento 2: Clonación utilizando como células donantes fibroblasto (F.) fetales
transgénicas y recipientes tratados con roscovina.
Tratamiento n Clivaje Blastocisto Implantes Preñez Nacidos
(%) (%)
F. no transfectado 197 122(62) 33(16.7) 16 5(31) 1
F. transfectado 646 476(74) 128(19.8) 56 25(44.6) 7
F. transfectado roscovitina 228 191(84) 51(22.3) 30 16(53.3) 6
Utilizando células donantes adultas se observo que un solo feto prospero hasta la fecha de
parto a pesar de haber producido numerosas preñeces (ver Tabla 1). Esto coincide con otros
autores (Wells et al., 1999; Kato et al., 1999). Estos autores describen alta mortandad perinatal
de los terneros producidos por clonado, en nuestra experiencia el único animal producido muere
en el parto demostrando la necesidad de incrementar los cuidados intensivos del recién nacidos.
A diferencia de otros autores la transgénesis no indujo una reducción en la capacidad de
desarrollo de los embriones clonados (Forsberg et al., 2002). En tanto que el tratamiento con
roscovitina no solo no redujo la viabilidad sino que permitió observar un tendencia positivo en el
s230
desarrollo embrionario. La roscovitina es un inhibidor de MPF y MAPK, dos complejos

reguladores de la maduración ovocitaria. Después de iniciada la maduración normal todos los
eventos son regulados por un rápido incremento en MPF y MAPK citosólicos. Los cuales
previenen la reconstrucción de la membrana nuclear y la entrada del núcleo en fase de síntesis de
ADN hasta la fertilización o activación. La maduración nuclear se puede detener con roscovitina
dado que mantiene MPF y MAPK bajos. Esto permite retrasar la maduración 24 horas. La
combinación del uso o no uso de esta droga posibilita trabajar por 2 días después de una sola
visita al matadero. Si no se tratan los ovocitos con roscovitina 24 hs después se tendrán numerosas
metafases II para enucleación y el transplante nuclear. Por el contrario, si son tratadas con
roscovitina recién podrá realizarse el transplante nuclear 48 hs después, dado que las primeras
24 hs en roscovina inhiben la maduración manteniendo el ovocito como vesícula germinal y
luego se requiere 24 horas mas para llegar a metafase II.
Experimento 3: Efecto de las diferente origen para la reclonació de bovinos transgénicos

(Salamone et al. 2004)
En un tercer experimento se intento incrementar el número de clones por reclonación de

animales recién nacidos clonados y transgénicos. Como control se usaron células fetales
transfectadas, inmediatamente luego del parto de un clon se obtuvieron fibroblastos cordón
umbilical (Cord Umb) y fifroblastos de oreja utilizando ambos para una segunda ronda de
clonación. Los resultados se presenta en la tabla 3.
Tabla3. Experimento 3: Efecto de las diferente origen celular para la reclonación de

bovinos transgénicos (Salamone et al. 2004)
Tratamiento n Blast Impl Preg.30d Preg.60d Nacidos
(%) (%) (%)
Control 966 213(22)a 145 63(43)a 36(25)a 8
Reclon. oreja 680 119(18)b 101 24(24)b 3(3)b 2
Reclon. Cord Umb 93 14(15)b 7 3(43)a 2(29)a 1
Total 1739 346(19) 253 90(36) 46(18) 11
Es interesante que el comportamiento de los fibroblastos umbilicales es semejante a los de

fetos luego de la primera ronda de clonación.
En la Argentina se han adoptado muchas de las llamadas “Biotecnologías de la
Reproducción” con relativa rapidez, tanto por la acción de profesionales de la actividad privada
como la realizada por investigadores de organismos oficiales. Prueba de esto es la realización en
1978 de las primeras transferencias quirúrgicas de embriones por el doctor Rodríguez Dubra y
colaboradores, los primeras nacimientos por fertilización in vitro (Salamone et al. 1995), las
preñeces (Salamone et al. 2003) y el nacimiento de terneras por clonación y transgénesis (presente
artículo). Todos estos hechos fueron producidos pocos años después de generadas estas tecnologías
en los países desarrollados y pionera en relación a otros países del tercer mundo. Lo que nos
permite ser optimistas respecto a las posibilidades futuras para el desarrollo y aplicación de estas
técnicas en nuestro país asi como en el resto de Latinoamérica.
El clonado ha tenido un progreso tan vertiginoso y un interés general tan grande que ha
sido fácil seguir su evolución por los medios de divulgación masiva. Sin embargo, ha prevalecido
el enfoque alarmista debido a su potencial aplicación en humanos. Por el contrario es nuestra
opinión que esta técnica ayudará a generar conocimientos básicos para descubrir las bases de la
s231
totipotencialidad celular y la rediferenciación de los tejidos, permitiendo su aplicación terapéutica,

para regenerar tejidos lesionados, incluyendo el tejido nervioso, y el pancreático entre otros.
La técnica de recombinación homóloga permite la modificación precisa de los genes
existentes, evita los problemas derivados de los efectos posiciónales y de inactivación por inserción
y permite además la inactivación de genes específicos así como el reemplazo de un gen por otro.
La utilización de la técnica de recombinación homóloga favorecera aplicaciones sumamente
atractivas en el campo de la producción animal (Piedrahita, 2000).
La expresión de proteínas de valor biológico especialmente de interés farmacológico usando
como biorreactores animales transgénicos a demostrado ser un sistema muy eficiente de
producción en numerosas especies. Las limitaciones han sido el nivel de expresión, modificaciones
post-transcripcionales y el efecto biológico de la proteínas exógenas sobre el animal que las
produce. Una vez que el animal fundador ha sido obtenido también es una limitante llegar a tener
un buen numero de animales a escala comercial.
A la pregunta ¿cuales serán sus aplicaciones agropecuarias en nuestro sistema de producción?
La respuesta es que nuestra capacidad de imaginación e innovación es insuficiente. La aplicación
más inmediata será la multiplicación de animales de elite. La utilización de animales clonados
facilitara la producción y difusión de animales transgénicos. Por ejemplo, existe interés en Europa
en reemplazar el gen PrP que torna a los bovinos susceptibles al virus de la vaca loca por otro que
le otorgue mayor resistencia. Numerosas compañías ya han producidos animales transgénicos y
clonados especialmente expresando nuevas proteínas en leche de valor farmacéutico (Baguisi et
al., 1999, Salamone et al. 2005, 2006).
Agradecimientos
A la empresa Biosidus por la financiación total del proyecto, facilidades y a los profecionales
que participaron en los experimentos mencionados.
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Valim, J.R.2; Watanabe, Y.F.3
1
Departamento de Ciências Básicas, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos
(FZEA) Universidade de São Paulo (USP), Rua Duque de Caxias Norte 225, Pirassununga SP,
Brasil, Cep 13635-900 - Fone: (19) 35654112, meirellf@usp.br; 2Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia (FMVZ) Universidade de São Paulo (USP) Pirassununga, SP Brasil;
3
Vitrogem, Pesquisa e Desenvolvimento, Cravinhos SP, Brasil
Resumo:
A transferência de núcleos de células somáticas (clonagem de animal) esta sendo explorada

comercialmente em muitos países e espécies. Hoje centenas de animais clonados foram produzidas
comercialmente e entregues aos seus proprietários em todo o mundo. Esta revisão pretende discutir
o estados da arte da tecnologia e sua contribuição para o ganho genético e seleção genética nos
animais com ênfase no rebanho bovino. Temas como baixa eficiência, problemas gestacionais,
parto e epigenética são discutidos visando estudar as perspectivas da clonagem em larga escala e
sua possível aplicação no futuro.
Palavras chave: commercial cloning, nuclei transfer; somatic cells; clone; oocyte; embryo.
Título curto: Clonagem comercial
Introdução
Ultimamente tem-se discutido muito sobre a evolução da transferência de núcleo nas últimas
décadas. A maioria destas discussões teve início com o nascimento da Dolly o primeiro mamífero
derivado de transferência de núcleo de célula somática (TNCS; Wilmut, 1997) e outros animais
à posteriori foram produzidos por diversos outros laboratórios (Latham, 2004). A possibilidade
de produzir indivíduos idênticos foi tão interessante a ponto de trazer muitos pesquisadores e
técnicos para a bancada dos laboratórios. Apesar dos interessas na ciência básica, onde a clonagem
levou a conhecimentos importantes como regulação do ciclo celular e mecanismos epigenéticos
de controle da expressão gênica, a técnica também semeou interesse tecnológico no campo da
produção animal. Este esforço levou a uma melhoria na técnica e ao início da aplicação comercial.
Na agricultura, clones são freqüentemente observados, e não raramente nos deparamos em
rodovias atravessando florestas imensas de clones (eucaliptus, por exemplo). Então porque não
usar a clonagem na produção animal?
De fato, desde o final da década de 90 muitos laboratórios vem aplicando a TNCS para
produzir clones de diferentes espécies, e mais uma vez a aplicação da técnica –desta vez
comercialmente – tem favorecido o avanço da ciência. Células diferentes são capazes de sofrer
reprogramação quando exposta ao citoplasma do oócito produzindo animais com variável taxa
de gestação e viabilidade (Cibelli et al., 1998a; Kato et al., 1998, 2000; Baguisi et al., 1999; Hill
et al., 2000; Kubota et al., 2000; Ogura et al., 2000; Polejaeva et al., 2000; Kasinathan et al.,
2001; Park et al., 2002; Keefer et al., 2002; Galli et al., 2003; Woods et al., 2003). As gestações
destes animais são freqüentemente problemáticas e o parto e os cuidados iniciais também não
raramente frustrantes (Bertolini e Anderson 2002; Wakayama et al., 2000; Ogura et al., 2002).
s235
Sendo assim, apesar da aplicação comercial da clonagem, questões importantes ainda

precisam de resposta. Estudos com o objetivo de responder porque a clonagem é ineficiente? E
como melhorar a eficiência da clonagem? Deverão contribuir para o melhor conhecimento da
embriogênese, biologia celular e mecanismos de regulação da expressão dos genes. Os avanços
nestas áreas deverão por feedback melhorar a tecnologia de clonagem.
Como a clonagem pode ajudar a produção animal?
Dada a importância que teve a TN para a ciência, a evolução nos anos recentes e o potencial
da técnica, nos discutiremos aqui as perspectivas da técnica em uma escala atual e em larga
escala (CLE) possivelmente viável no futuro.
Clonagem de indivíduos com alto mérito genético, alto valor afetivo ou comercial.
Atualmente existem muitos estabelecimentos comerciais com animais nascidos vivos

entregues aos clientes no mundo. A iniciativa privada tem produzido clones de bovinos ovinos
caprinos suínos e eqüinos além de outras espécies com taxa de sucesso variáveis. Estes animais
são geralmente superiores em certas características fenotípicas, de alto valor comercial, de alto
valor afetivo ou de alto mérito genético. Obviamente o último justifica o esforço do ponto de
vista da produção animal.
A bovinocultura é responsável pela maioria dos clones produzidos comercialmente e é
difícil estimar o número total de animais clonados para fins comercias, todavia pode-se indicar
que algumas centenas de animais já foram clonados no mundo.
O processo de clonagem só é justificado se os animais forem geneticamente superiores
para algumas características fenotípicas onde foram selecionados. Touros com alta DEP e suas
mães são bons exemplos de como a clonagem pode acelerar o ganho genético. No entanto cabe
lembrar que quem decide que animal multiplicar é o seu proprietário. Que nem sempre baseia
sua decisão no mérito genético.
A clonagem favoreceu a multiplicação de animais famosos (vivos e mortos), animais que
foram castrados para prática de esportes e finalmente animais com demanda de gametas maior
que a produção.
No Brasil, 13 animais das raças nelore, holandeza, simental, e mocho nacional e algumas
mestiçagens foram produzidos por TNCS (3 machos e 10 fêmeas) e aproximadamente 30 animais
estão vivos (mais que uma cópia por animal clonado). O animal mais velho passa de 3 anos de
idade e dos animais produzidos alguns estão iniciando a reprodução, outros a puberdade e a
maioria está mamando.
Estes dados mostram a competência da pesquisa e da tecnologia nacional e uma pequena
contribuição para o ganho genético e melhoramento do nosso rebanho. Finalmente a aplicação
atualmente esta restrita a rebanhos elite e de nenhuma maneira poderia ser transportado para os
rebanhos comerciais salvo se modificações importantes modificassem a eficiência da técnica.
Clonagem de animais para produção (clonagem em larga escala CLE).
A TNCS pode vir a contribuir muito com a produção animal se a CLE se tornar possível.
Clones produzidos diretamente para produção poderiam mudar o paradigma da produção
animal, especialmente nas criações de baixo número de descendentes e intervalo de geração
longo com o caso dos bovinos, por exemplo. A transferência de núcleo em larga escala permitiria
nestas espécies o desenvolvimento de linhagens, que a semelhança com aves e suínos poderiam
s236
trazer homogeneidade genética para o rebanho multiplicando o melhor animal para um dado
manejo. Como mencionado anteriormente a clonagem permite a multiplicação de indivíduos
híbridos o que levaria não só a um ganho genético aditivo, mas também a utilização da genética
não aditiva (a clonagem permite a utilização de efeitos de dominância e epistasia, intra e
interespecífica).
A figura 1 mostra um estudo teórico produzido por simulação Monte Carlo de um rebanho
Nelore com seleção genética apurada em comparação com um rebanho de clones. Animais que
se reproduziram mediante concepção foram produzidos mediante utilização do melhor animal
disponível no programa para peso aos 550 dias. Os pesos dos animais clonados foram simulados
aplicando o mérito genético do touro (portanto os animais clones e controles são meio irmãos) e
a curva de crescimento desenvolvida previamente (Meirelles et al., 2004). Animais clonados
mostraram vantagem de aproximadamente 50 Kg em média por animal, com uma distribuição
mais homogênea (ausência de variação genética). Esta diferença poderia justificar um investimento
de 3,4 US$/ animal no processo de clonagem. Obviamente este é um estudo preliminar, que leva
em consideração somente os efeitos aditivos (efeitos não aditivos e outras vantagens dos clones
como homogeneidade de sexo, resistência à doença e tolerância ao meio ambiente não foram
avaliados). Sendo assim, a CLE tem potencial para melhorar a produção animal, no entanto,
tendo em vista que os custo é sempre muito próximo da receita na agropecuária, o custo-benefício
de uma tecnologia desta deve ser avaliado antes da aplicação.
Barreiras para a aplicação da CLE.
Como mencionado anteriormente, a clonagem está disponível aos criadores. Entretanto o

procedimento de clonagem ainda é muito artesanal, com um número muito pequeno de produtos
originados no final do dia de trabalho (Vajta e Gjerris 2006). Este processo moroso aumenta o
custo de produção e, portanto justifica clonar somente animais com alto valor comercial (nem
sempre o indicado). A automação do processo de clonagem mediante a eliminação da
micromanipulação, ou mediante o desenvolvimento de novas estratégias de produção de clones
a partir de células tronco podem modificar a situação atual e juntamente com outras modificações
viabilizar a clonagem em larga escala.
Taxas de gestação de embriões produzidos por TN são baixas em comparação com taxas
de gestação de embriões produzidos in vitro. Somando-se as baixas taxas de gestação a TNCS
têm uma alta taxa de morte embrionária inicial e tardia independente da espécie (Wells et al,
2004). Nos camundongos, relatos das taxas de implantação são relativamente altos (51 a 71%),
porém num baixo desenvolvimento fetal (5 a 16%) e muito baixo desenvolvimento a termo (2 a
3%) foram observados nos trabalhos de TNSC (Wakayama et al., 1998). Bovinos clonados também
apresentam alta taxa de mortalidade nos períodos peri-natal e pré-natal, limitando a eficiência da
clonagem nesta espécie para 5 à 6% na melhor das hipóteses (Chavatte-Palmer et al., 2004;
Wells et al., 2004).
Partos de animais clonados são muito mais sujeitos à assistência e os animais originados
não raramente apresentam peso acima do normal (figura 2) com alterações placentárias, aumento
da incidência de hidroalantóide e dificuldade para sinalizar o parto (Miglino 2004; Hansen et al.,
2005). Uma taxa significante de bezerros morre na primeira semana de vida devido a vários
problemas de saúde. Complicações peri-natais e pós-natais consistem em desenvolvimento de
deficiências como síndrome da membrana hialina, desenvolvimento anormal dos rins, dificuldade
na regulação da glicemia e esteatóse hepática (Chavatte-Palmer et al., 2004). As perdas pós-
natais podem atingir 30% dos clones que desenvolvem a termo.
s237
2500
número de animais 2000
1500
1000
500
0
200 250 300 350 400 450 500 550
Peso (Kg)
Figura 1. Simulação monte Carlo de pesos de bovinos da raça nelore aos 550 dias. Barras
brancas representam a distribuição individual do peso de uma população derivada de
IA filhos de um touro com DEP para ganho de peso aos 405 dias. As barras hachuradas
em cinza representam a distribuição de peso nos clones. Notar a superioridade de
aproximadamente 50Kg na média da população clonada em relação aos animais de
IA. A seta abaixo do gráfico mostra a variabilidade do rebanho. Observar a distribuição
mais homogênea dos clones com um descio equivalene à 82% da população de IA
devido à alta herdabilidade da característica e a ausência de variação genética na
população (van Vleck, 1998).
Embora a TN produza indivíduos normais com uma certa freqüência, por vezes ela leva a
problemas. Parte destas alterações são observadas imediatamente, mas alguns estudos têm
demonstrado anormalidades que se manifestam somente na idade adulta e que, portanto estudos
longitudinais de clones são necessários. Padrões aberrantes de metilação no DNA e expressão de
genes marcados (imprinted) são descritos nos embriões e animais clonados de diferentes espécies
(Humpherys et al., 2001; Cezar et al., 2003; Han et al., 2003; Mann et al., 2003). Um exemplo de
modificações observada em adultos é a composição corporal dos camundongos clonados, que
mostra um aumento no peso, associado ao aumento do tecido adiposo, hiperinsulinemia e
hiperleptinemia (Tamashiro et al., 2002)
s238
2000
1500
Número de animais
1000
500
0
20 40 60 80
peso ao nascer (kg)
Figura 2. Simulação Monte Carlo do peso de bezerros ao nascer. As barras brancas representam
a distribuição do peso inividual de animais de uma população produzida por IA de um
touro com DEP média para peso ao nascer. As barras hachuradas em cinza representam
a distribuição do peso dos clones conforme observado na nossa experiência (Meirelles
et al., dados não publicados). As setas abaixo do gráfico indica a variabilidade da
característica. Notar uma variação 3 vezes maior nos bezerros clonados comparados
aos bezerros de IA.
O(s) mecanismo(s) responsável(is) pelo desenvolvimento da obesidade nos camundongos

clonados ainda não foi(ram) determinado(s). Apesar de não haver descrição de aumento no peso
corporal em espécies domesticadas exames postmortem de fetos bovinos mostraram uma
concentração mais de tecido adiposo abdominal, e com leptina plasmática mais elevada (Chavatte-
Palmer et al., 2002).
Em conjunto estes problemas levam a uma taxa menor de sucesso na reprodução e, portanto
alto custo do procedimento de clonagem. O custo relacionado aos problemas mencionados acima
junto com a incerteza sobre a saúde dos indivíduos certamente não permite a aplicação da CLE
atualmente.
Finalmente, apesar eventuais anormalidades estarem presentes nos clones, seus descendentes
são normais. Isto indica que a passagem pelo ciclo germinal é suficiente para reprogramar alguma
s239
falha epigenética eventual nos clones e que os gametas dos clones são geneticamente e
epigeneticamente semelhantes aos indivíduos originais (Tamashiro et al., 2002).
Conclusões e perspectivas
Como mencionado, a clonagem comercial é uma realidade na produção animal em diversos

países. Estes animais clonados embora tenham contribuído pouco para o melhoramento genético
favoreceram o estudo das alterações nas gestações e nos animais clonados e, portanto à geração
de larga experiência em aspectos da epigenética, placentação, obstetrícia, e neonatologia dos
clones.
Espera-se que uma contribuição à produção animal ocorra quando a clonagem em larga
escala se tornar possível.
No futuro, a clonagem será certamente acompanhada da produção de animais transgênicos
(Schnieke et al., 1997; Cibelli et al., 1998; Hill et al., 1999; Park et al., 2002; Lee et al., 2003) e
proteínas recombinantes (lactoferrina, fator IX, por exemplo) serão produzidas no leite dos animais
clonados (Schnieke et al., 1997; Eyestone and Campbell, 1999; Lee et al., 2003) contribuindo
para aumentar a produção e diminuir o custo comparado a outros métodos de produção/purificação
(Brink et al., 2000; Fan and Watanabe, 2003; van Arendonk and Bijma, 2003). A modificação
dos indivíduos também poderá vir a permitir a produção de animais para xenotransplantes
(Eyestone and Campbell, 1999; Phelps et al., 2003).
Sendo assim, no futuro as biotecnologias da reprodução e do DNA recombinante como a
IA, TE, FIV, TN, transgenese além do melhoramento assistido por marcadores serão utilizados
em conjunto para produção, seleção e multiplicação de animais mais produtivos. Os animais
selecionados serão multiplicados pela CLE, modificados ou não por recombinação e depois de
avaliados distribuídos para os produtores. Os últimos poderão produzir animais em sistema de
manejo definido à semelhança de outras criações e vender seus produtos para empresas
especializadas de alimento ou da cadeia farmacêutica.
Agradecimentos
À FAPESP pelo auxílio financeiro e Capes e CNPq pelo auxílio recebido para manutenção
dos bolsistas.
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34 (Supl 34(Suplemento 1): 2006
1): 243-244.
EPIGENÉTICA DO DESENVOLVIMENTO: DE GAMETOGÊNESE A

EMBRIOGÊNESE
Flavia L. Lopes; Amanda Fortier; Sophie La Salle; Diana Lucifero; Jacquetta M. Trasler
Montreal Children’s Hospital Research Institute and the Departments of Pediatrics, Human
Genetics and Pharmacology & Therapeutics, McGill University, Montreal, Quebec, Canada.
O processo de metilação do DNA é presentemente o mais conhecido modulador

epigenético. Funções essenciais para este processo têm sido demonstradas nas células
germinativas e no embrião, assim como no processo de “imprinting” do genoma,
caracterizado pela variação na expressão gênica baseada na origem, materna ou paterna,
do alelo. Aproximadamente 30 milhões de sítios são metilados no genoma dos mamíferos,
predominantemente nos chamados sítios CpG, onde 60-80% das citosinas são metiladas.
Metilação de novo permite a aquisição de novos padrões de metilação no genoma, onde
a manutenção da metilação é necessária para assegurar a propagação dos padrões
previamente estabelecidos durante a replicação celular. O processo de metilação do DNA
envolve uma família de DNA (citosina-5)-metiltransferases (DNMTs) e está associado
ao silenciamento gênico, especialmente quando a metilação ocorre em citosinas localizadas
na região promotora dos genes. Já a perda da metilação pode ocorrer passivamente
durante o processo de replicação do DNA, ou ativamente, no entanto a enzima responsável
por este processo in vivo ainda não foi identificada. Anormalidades na metilação do
DNA afetam o crescimento, a função placentária, alguns processos neurocomportamentais
e podem também induzir certos tipos de câncer. Estudos recentes associaram um aumento
na incidência de doenças genéticas raras, relacionadas a alterações na metilação de genes
“imprinted”, ao uso de técnicas de reprodução assistida e/ou infertilidade.
Espermatogênese, oogênese e desenvolvimento embrionário são períodos de intensa
mudança nos padrões de metilação do DNA, onde os padrões são apagados, restabelecidos
e mantidos. Seguindo a perda dos padrões pré-estabelecidos de metilação nas células
germinativas primordiais, um novo é estabelecido antes do nascimento nos machos e
durante o período de crescimento oocitário (após o nascimento) nas fêmeas. Estudos
utilizando camundongos em nosso laboratório demonstraram que a metilação dos genes
“imprinted” ocorre em momentos variados durante o período de crescimento oocitário,
dependendo do gene.
Durante o período de pré-implantação, uma intensa perda de metilação ocorre no
genoma embrionário. No entanto, a metilação nos genes “imprinted” e também em
algumas “repeat sequences” do genoma são mantidas durante este período. Uma segunda
onda de metilação do genoma acontece durante o período de peri-implantação.
Experimentos envolvendo “gene-targeting” em camundongos demonstraram a importância
das enzimas DNMTs no estabelecimento do “imprinting” nas células germinativas
(DNMT3a e DNMT3L), no processo de meiose nos machos (DNMT3a e DNMT3L), na
s243
manutenção da metilação nos genes “imprinted” durante o período de pré-implantação

(DNMT1o) e no desenvolvimento embrionário (DNMT3 e DNMT1). Estudos de
expressão sugerem que as diferentes enzimas DNMTs, e suas isoformas, apresentam
funções distintas durante o desenvolvimento das células germinativas e também durante
a embriogênese. Evidências de que a técnica de superovulação e as condições de cultura
in vitro podem afetar a aquisição e/ou manutenção da metilação do DNA também serão
discutidas.
s244
Herrera C., Miragaya H.M. & Losinno L. 2006. Uso da injeção espermática intracitoplasmática na produção in vitro de
embriões equinos. Acta Scientiae Veterinariae. 34 (Supl 1): 245-249.
USO DA INJEÇÃO ESPERMÁTICA INTRACITOPLASMÁTICA NA PRODUÇÃO IN

VITRO DE EMBRIÕES EQUINOS
Herrera, C.1; Miragaya, H.M.2; Losinno, L.3
1
Halitus Biotecnología, Halitus Instituto Medico, Buenos Aires, Argentina; 2Area de
Teriogenologia, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, Argentina
and 3Laboratorio de Reproducción Equina, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad
Nacional de Río Cuarto, Córdoba, Argentina. llosinno@ayv.unrc.edu.ar
RESUMO
A injeção intracitoplasmática de espermatozóides(ICSI) tem sido atualmente utilizada como a

técnica fundamental para a produção in vitro de embriões eqüinos.O uso da ICSI permite a
produção de embriões de amostras de sêmen não adequadas para inseminação artificial pelo fato
de que somente um espermatozóide é injetado em cada ovócito maduro. Apesar de ter ocorrido
nos últimos anos um aumento significativo na produção in vitro de embriões com o uso da ICSI,
determinados procedimentos como a ativação do ovócito e o desenvolvimento embrionário
necessitam ser melhor estudados e aprimorados.
INTRODUÇÃO
A fertilização in vitro (FIV) não tem se mostrado uma técnica eficiente para a produção in
vitro (PIV) de embriões eqüinos.Somente dois potros nasceram a partir da FIV e os oócitos
utilizados nestes experimentos foram maturados in vivo (1,2). A partir do momento no qual se
introduziu a técnica de ICSI para a PIV de embriões eqüinos, vários potros tem nascido. Em
cavalos, a técnica de ICSI é capaz de transpassar determinados problemas encontrados na FIV
como capacitação espermática e falhas na fusão espermática.
Pelo menos duas revisões bastante extensas forma recentemente publicadas realizadas por
especialistas em ICSI em eqüinos.(3,4). Nosso foco nesta publicação estará voltado a alguns
aspectos técnicos do procedimento e também em resultados recentes obtidos em nossos
laboratórios.
A TÉCNICA DE ICSI
Esta técnica foi primeiramente descrita em 1992 (5) e desde então milhares de crianças
saudáveis nasceram em todo o mundo. A técnica envolve a injeção de um espermatozóide no
interior de um ovócito em metafase ll (Mll) por meio de sistemas de micromanipulação. Em
eqüinos a técnica foi primeiramente utilizada em 1996 (6) e desde então a ICSI tem sido utilizada
para a PIV de embriões por diferentes grupos de pesquisadores que trabalham com eqüinos para
fins de pesquisa bem como comerciais.
A FONTE DE OVÓCITOS
s245
Os ovócito utilizados para ICSI podem ser obtidos por aspiração folicular de éguas vivas
ou por aspiração de ovócitos provenientes de matadouro. Os ovócitos podem também ser obtidos
por fatiamento ou dessecação dos ovários. A disponibilidade de éguas para fins de pesquisa não
é tão comum como para pesquisa em bovinos e suínos, e isto tem sido um dos grandes obstáculos
para o progresso da produção in vitro de embriões eqüinos. Uma vez que os ovócitos são
recuperados dos folículos, eles são maturados in vitro por 24 a 30 hs ou submetidos a ICSI no
mesmo dia se eles forem obtidos de doadoras vivas estimuladas por gonadotrofinas.
AMOSTRA DE SÊMEN
Durante o procedimento de ICSI, somente um é injetado em cada Mll ovócito. Através da

ICSI é possível se produzir embriões utilizando-se amostras de sêmen de diferentes fontes e
qualidade os quais não são adequados para uso em Inseminação artificial. Entre estas podemos
citar o sêmen congelado , sêmen com baixa motilidade e espermatozóides de epidídimo.. Tem
sido demonstrado que não existe diferença significativa no desenvolvimento embrionário quando
utilizados sêmen fresco ou congelado para ICSI (7). Experimentos tem demonstrado também
não haver diferença no desenvolvimento embrionário após ICSI quando do uso do sêmen
congelado de diferentes garanhões que apresentam na IA diferentes padrões de fertilidade (8).
Embriões eqüinos também tem sido produzidos quando do uso de espermatozóides de
epidídimo em ICSI (9). Da mesma forma não observou-se diferença quando do uso de sêmen de
epidídimo congelado com Glicerol ou Dimethylformamida, também não foi observada diferença
entre estes dois tratamentos e o sêmen congelado proveniente de ejaculação(10).
TRATAMENTO DO ESPERMATOZÓIDE E DO OVÓCITO
Duas a quatro horas antes da maturação in vitro haver se completado, os ovócitos são
denudados das células do cumulus através de uma rápida incubação com hialuronidase ou desta
associada com tripsina.Somente ovócitos com citoplasma intacto e corpúsculo polar visível são
selecionados e mantidos incubados até o momento da injeção. Os espermatozóides são lavados
para eliminação do diluente e crioprotetores sendo então colocados em uma micro gota de meio
contendo polivinilpirrolidona (PVP) a qual esta na placa de micromamipulação.
INJEÇÃO
Se possível somente um espermatozóide móvel deve ser selecionado para ICSI. Antes da
injeção, a célula espermática é imobilizada pela ruptura da membrana plasmática com a pipeta
de injeção. A ruptura da membrana plasmática e a penetração da zona pelúcida podem ser
realizadas com a ajuda do Piezzo drill. Este acessório produz pulsos mecanicos que atravessam
longitudinalmente a pipeta de injeção vibrando a extremidade desta. A utilização do Piezzo Drill
demonstrou melhorar os resultados de ativação e clivagem (8,11). A ativação dos ovócitos injetados
pode ser induzida por diferentes métodos. Ionomicina, 6-DMAP e cycloheximidinatem sido
utilizados em diferentes combinações e diferentes tempos de exposição.
s246
CULTURA DO EMBRIÃO
Os ovócitos injetados são cultivados in vitro. Diferentes meios tem sido utilizados para
este fim, entre estes estão: Menezo B2 (12), fluido de oviduto sintético (SOF) (11), G1.2 (13),
fluido tubárico sintético humano (Q-HTF) (14), DMEM/F12 (10,12;15). Apesar de terem sido
reportados vários sistemas de cultura, não existe ainda disponível um meio definido para embriões
equinos.Os melhores índices de clivagem e desenvolvimento embrionário tem sido obtidos através
da ICSI com o uso do Piezzo Drill.(8,11).Esta tecnologia não está disponível para todos os
grupos de pesquisa e consequentemente os resultados obtidos com ICSI convencional em cavalos
são baixos (9,10,12,14).
RESULTADOS
Uma variação entre 21 e 68 % de formação de pronúcleo masculino e de 20 a 65% de

clivagem tem sido reportados (12,16,17,18,19). Choi et al e Galli et al. Obtiveram um índice
entre 72% e 80% quando da realização de ICSI utilizando-se o Piezo Drill com formação normal
do núcleo (8 e 11).
APLICAÇÕES CLÍNICAS
Atualmente a ICSI tem uma aplicação clínica limitda em cavalos. Alguns fatores críticos
como sistemas de cultura de embriões necessitam ser adequados para que se transfira por via não
cirúrgica mórulas ou blastocistos, visando a otimização do processo (21).
O procedimento atual onde se transfere ovócitos injetados ou embriões jovens aumento
significativamente nos últimos anos mas a aplicação mais importante aplicação clínica da técnica
está relacionada a casos de garanhões subférteis,êmen congelado com baixa motilidade pós
descongelamento, espermatozóides de epidídimo de garanhões que faleceram, em resumo o fator
macho. Recentes publicações reportando produção de embriões depois de ICSI com
espermatozóide recongelado ou espermatozóides de epidídimo são aplicações adicionais (8-10).
Uma das aplicações em éguas poderia ser em éguas velhas com limitado número de ovócitos
ou com falhas na ovulação.
Raramente proprietários de éguas valiosas solicitam que Veterinários utilizem sêmen de
baixa qualidade de garanhões valiosos.
A transferência de ovócitos, é uma ferramenta clínica mais efetiva de se obter gestações do
que a ICSI, mas em éguas idosas os resultados são significativamente mais baixos.
CONCLUSÕES
A injeção inntra-citoplasmática de espermatozóides tem se mostrado uma técnica viável

para a produção in vitro de embriões equinos. Contudo, os resultados obtidos com eqüinos está
abaixo dos obtidos em humanos. Uma possível explicação para este sucesso limitado pode estar
relacionada a inabilidade de espermatozóies eqüinos de iniciar as oscilações in vitro de cálcio,
s247
quando eles são injetados nos ovócitos (20). Apesar da ICSI em eqüinos Ter se mostrado mais
eficiente que a FIV convencional, os resultados demonstram que a técnica necessita ser aprimorada.
Existem ainda algumas questões á serem respondidas a respeito da produção in vitro de embriões
eqüinos, tendo sido lentos os progressos nesta área devido a dificuldade de obter ovócitos de
éguas. Inicialmente os grupos de pesquisa que trabalharam com ICSI convencional eram incapazes
de obter ativação dos ovócitos e desenvolvimento de embriões in vitro. O uso do Piezo Drill tem
ajudado a melhorar estes resultados e esperamos que resultados á serem obtidos em estudos
futuro próximos irão melhorar a eficiência da técnica de produção in vitro de embriões eqüinos.
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s249
s250
Rubianes E. & Menchaca A. 2006. Dinâmica folicular, sincronização do estro e superovulação em ovinos. Acta Scientiae
DINÂMICA FOLICULAR, SINCRONIZAÇÃO DO ESTRO E SUPEROVULAÇÃO

EM OVINOS
Edgardo Rubianes1,2; Alejo Menchaca2
1
Departmento de Producción Animal y Pasturas, Facultad de Agronomía, Garzón780;
2
Laboratorio de Fisiología de la Reproducción, Facultad de Veterinaria, Lasplaces 1550;
Montevideo; Uruguay; rubianes@adinet.com.uy
Resumo
Os recentes avanços na fisiologia ovariana ovina (e.g. existência de ondas foliculares, sensibilidade
precoce do corpo lúteo a prostaglandina F2α) permitiram o desenvolvimento de novos tratamentos
que visam melhorar a predição e sincronização da ovulação, e a resposta ovariana a
superestimulação hormonal. Esta revisão tem por objetivo resumir as novas informações e
conceitos sobre a dinâmica folicular e sensibilidade do corpo lúteo, e suas aplicações na
manipulação da resposta ovariana de pequenos ruminantes.
Palavras-chave: Folículo, ovino, progesterona, sincronização, superovulação.
1. Ondas Ovarianas Foliculares
Durante o ciclo inter-ovulatório em ovinos, o crescimento folicular ocorre em padrão de

ondas, tanto dentro da estação de acasalamento (Ginther et al, 1995; Evans et al, 2000; Viñoles et
al, 2000), como na estação de anestro (Souza et al, 1996; Bartleswki et al, 1998) e no período de
transição entres estas duas estações (Ravindra & Rawlings, 1997). Uma onda folicular é definida
como a emergência de um grupo de pequenos folículos antrais, com normalmente um ou dois
folículos atingindo um diâmetro de 5 mm ou mais. O número de ondas foliculares por ciclo varia
entre 2 e 4, com alta variação individual, mas com um padrão mais freqüentemente encontrado
de três ondas foliculares (Leyva et al, 1998; Gibbons et al, 1999; Evans et al, 2000; Viñoles et al,
2000).
Tanto em ovinos quanto em caprinos, as características mais freqüentes das ondas foliculares
são (Evans, 2003; Rubianes & Menchaca, 2003): 1) pelo menos um folículo atinge o diâmetro ≥
5 mm por onda; 2) o maior folículo de cada onda cresce por 5-7 dias, com uma taxa de crescimento
de 1 mm/dia; 3) o diâmetro máximo do maior folículo difere entre ondas; 4) à medida que a fase
luteal avança, a concentração plasmática de progesterona eleva-se, o “turnover” folicular
(renovação folicular) é facilitado e os intervalos entre ondas tornam-se menores do que durante
a fase luteal inicial; 5) durante as fases luteal intermediária e final, os folículos que não crescem
acima de 4 mm não fazem parte do fenômeno da onda, sugere-se que representam um pool de
folículos em dinâmica subjacente; 6) os maiores folículos, presentes nos ovários no dia da luteólise,
são aqueles que irão ovular; 7) na maioria dos ciclos com duas ovulações, os folículos ovulatórios
emergem como parte da mesma onda folicular, mas em alguns casos eles podem ter emergido
em ondas foliculares diferentes; 8) as duplas ovulações ocorrem com um intervalo de 24 horas
entre as mesmas.
A associação temporal e fisiológica entre os picos de FSH e a emergência da onda folicular
é bem documentada em ovinos (Ginther et al, 1995; Gibbons et al, 1999; Viñoles et al, 2002). A
emergência da onda folicular é normalmente precedida por um aumento na concentração de FSH
e seguida, posteriormente, por um decréscimo na concentração de FSH, devido a sua correlação
s251
negativa com o estradiol produzido pelo maior folículo da onda (Viñoles et al, 2002) (Figura 1).
No entanto, durante a fase intermediaria do ciclo estral, a emergência de algumas ondas não é
precedida por um aumento detectável nas concentrações de FSH (Viñoles et al, 2002), e algumas
flutuações na concentração de FSH não são seguidas pelo surgimento de uma onda folicular.
(Gibbons et al, 1999).
8 14
P ro g e s te ro n e(pmol/L)
D ia m et e r o f fo llic le (m
Diameter of follicle (mm)
(p m o
7 12
10
6
Progesterone
8
5
6
4
4
3 2
2 0
ac 12
E s tr a d io (pmol/L)
l (p m o l
10
a 8
Estradiol
6
4
ab
b b 2
d
3
ad
ac
F S H μ(µg/L)
ac
(g /L )
2 c
FSH
1
1 3 5 7 9 11 13 15 17
D a ys a fter o vu la tio n
Figura 1. Padrão de três ondas de crescimento folicular durante o ciclo inter-ovulatório (folículo
dominante durante a onda 1 , maior folículo durante a onda 2 e folículo ovulatório
), progesterona (linha preta) e, concentrações de FSH (%) e de estradiol ( ), em
ovelhas, apresentando bom estado de condição corporal (adaptado de Viñoles et al.,
2002).
2. Progesterona e desenvolvimento folicular
Os efeitos da progesterona sobre a dinâmica folicular em ovinos tem sido estudados (Johnson
et al, 1996; Rubianes et al, 1996; Leyva et al, 1998, Viñoles et al, 1999), focando-se principalmente
os efeitos de concentrações subluteais de progesterona sobre a saúde folicular. Estudos demonstram
que concentrações subluteais de progesterona promovem um excessivo crescimento folicular e
persistência do maior folículo (Viñoles et al, 1999), aumentando a idade do folículo ovulatório
(Johnson et al, 1996). Tratamentos com progestágenos por 12 dias induzem a ovulação de
s252
“folículos velhos” nesta espécie (Flynn et al, 2000; Viñoles et al, 2001). Em bovinos, a ovulação
de folículos velhos é seguida por baixa fertilidade (Savio et al, 1993, Stock & Fortune, 1993;
Mihm et al, 1994; Austin et al, 1999), aparentemente porque os ovócitos reassumem
prematuramente a meiose (Revah & Butler, 1996). Embora efeito deletério similar de tratamentos
prolongados sobre a taxa de concepção com progestágenos (Viñoles et al, 2001) ou o uso de
dispositivos com baixa concentração de progesterona (Ungerfeld & Rubianes,1999) tenham sido
reportados em ovinos, este assunto permanece em debate (Evans, 2003).
A progesterona tem um feedback negativo sobre a secreção e os pulsos de LH (Goodman
& Karsh, 1980), regulando o crescimento final dos folículos antrais (McNeilly et al, 1991). A
redução na concentração plasmática de progesterona aumenta os pulsos de LH e,
consequentemente o diâmetro do maior folículo (dominante). Normalmente, quando as
concentrações de progesterona são muito baixas (i.e. após a luteólise), um feedback positivo é
estabelecido entre o estradiol, produzido pelo folículo dominante em crescimento, e o GnRH e
LH, produzidos a partir do eixo hipotalâmico-hipofisário. Isto culmina em um pico pré-ovulatório
de LH e na ovulação do folículo. As concentrações subluteais de progesterona aumentam a
freqüência dos pulsos de LH, mas não ocasionam a ocorrência do pico de LH. Em conseqüência,
o folículo dominante persiste e sua dominância é prolongada.
O aumento na concentração de progesterona, no entanto, causa um efeito positivo no
“turnover” folicular, aumentando o número de grandes folículos com potencial ovulatório. Níveis
supraluteais de progesterona afetam a dominância do maior folículo da onda, induzindo sua
regressão precoce e aceleram a emergência da próxima onda folicular, e um folículo novo e
saudável pode ovular.
Em geral, estes achados indicam que tratamentos com elevados níveis de progesterona por
períodos curtos podem controlar melhor a dinâmica folicular e aumentar a taxa de concepção em
programas de acasalamento em ovinos, quando comparado aos tratamentos longos períodos.
3. Protocolos de curta duração com progesterona
Progestágenos (progesterona e seus análogos sintéticos) são os principais hormônios

utilizados na sincronização do estro em ovinos. Os tratamentos tradicionais com progestágenos
são utilizados por longos períodos de tempo, simulando a meia vida natural do corpo lúteo (CL),
e independentemente do estádio do ciclo estral ou do ¨status¨ folicular do ovário no início do
tratamento. Tratamentos de longa duração são capazes de sincronizar o estro eficientemente,
mas, no entanto, promovem uma fertilidade variável. Estes protocolos foram desenvolvidos antes
dos anos 90 e não consideram o atual conhecimento sobre dinâmica folicular. O uso de dispositivos
com progesterona por longos períodos de tempo pode levar a baixas concentrações de progesterona
ao final do tratamento e, como as ondas foliculares emergem a cada 5-7 dias, não se justifica seu
uso por longos períodos. Nos últimos anos, alguns estudos têm avaliado o uso de tratamentos de
curta duração (5-7 dias) com progesterona, também chamados protocolos de curta duração, em
ovinos e caprinos (Menchaca & Rubianes, neste simpósio).
Durante a estação de anestro, experimentos foram conduzidos em ovinos utilizando
diferentes agentes e períodos de duração dos progestágenos, associando uma aplicação de eCG
(300 a 400 IU) no momento da retirada do dispositivo. A taxa de gestação após a aplicação de
esponjas contendo MAP (60 mg) por 1, 2, 3, 6 e 12 dias, utilizando-se a monta natural, resultou
em taxas de gestação de 13 %, 20 %, 50 %, 75 % e 69 %, respectivamente (Ungerfeld & Rubianes,
1999). O uso de dispositivos intravaginais contendo diferentes progestágenos (esponjas contendo
FGA ou MAP; ou CIDR-G com progesterona) durante 6 dias, resultou em uma porcentagem de
animais em estro induzido semelhante entre os tratamentos (91.5%, 94.1% e 95.9 %;
s253
respectivamente) e uma taxa de concepção (67.4%, 62.5% e 59.6%; respectivamente). Assim,

nos concluímos que os protocolos de curta duração, utilizados por 6 dias, induzem eficientemente
os animais ao estro durante a estação não reprodutiva, resultando em alta fertilidade.
Durante a estação reprodutiva, ou de acasalamento natural, Viñoles et al. (1999) tiveram
uma alta taxa de gestação com o protocolo de curta duração (esponjas contendo MAP por 6 dias,
87%), quando comparada ao tratamento tradicional, de 12 dias, com (67%) ou sem (63%) a
aplicação de eCG no momento da retirada de esponja. Contudo, o inicio da manifestação do
estro foi variável, provavelmente, pela demora na regressão luteal em alguns ciclos, visto que
alguns CLs ainda estavam funcionais ao fim do tratamento. Desta forma, para se obter uma
aceitável sincronia na manifestação do estro, após o uso de protocolos de curta duração na estação
reprodutiva, tornou-se necessário assegurar a regressão luteal. Dessa maneira, se a luteólise é
induzida no início do protocolo de curta duração, todas as fêmeas devem manter níveis de
progesterona exógena semelhantes e adequados durante o tratamento, o que pode ser alcançado
por meio da aplicação de uma dose de PGF2α no momento da inserção da esponja (Beck, 1993).
Este método já foi utilizado com sucesso em programas de Inseminação Artificial em Tempo
Fixo (IATF) em caprinos, mas seu uso em ovinos ainda é limitado.
α na IATF: Synchrovine
4. Uso da Prostaglandina F2α
A prostaglandina F2α tem sido amplamente utilizada na reprodução de ruminantes. A

aplicação ao acaso de PGF2α em ovelhas cíclicas é efetiva em induzir a regressão luteal na
maioria dos animais, com conseqüente retorno ao estro (Acritopoulou & Haresign, 1980). Contudo,
a dispersão na manifestação do estro impede o seu uso de forma mais extensiva, particularmente,
em associação com protocolos de IATF em ovinos. Esta dispersão é atribuída aos diferentes
¨status¨ ovarianos entre os animais no momento do início do tratamento.
A aplicação de PGF2α no início do ciclo estral ocasiona um menor intervalo estro-ovulação
do que a mesma quando aplicada mais tardiamente no ciclo, isso é devido ao menor tempo
necessário para que as concentrações de progesterona atinjam níveis basais (Houghton et al,
1995). Wiley et al, (1997) observaram que quando os níveis basais de progesterona são atingidos
(i.e. < 0.2 ng/ml), o intervalo ao estro era constante. Dessa maneira, a variação na manifestação
dos estros observada quando a PGF2α é administrada ao acaso no ciclo estral é, parcialmente,
explicada pela prevalência dos níveis de progesterona. Além disso, a variação na resposta ao
tratamento com PGF2α também é relacionada ao status do folículo de cada animal no momento
da aplicação da PGF2α (Viñoles & Rubianes, 1998). Desta maneira, se um grande folículo está
presente no início do tratamento, este folículo continua seu desenvolvimento, e o estro e a ovulação
vão ocorrer logo após a aplicação da PGF2α. Contudo, se a luteólise é induzida quando o maior
folículo estiver em regressão, um novo folículo precisa emergir e crescer, e em conseqüência o
estro e a ovulação vão ocorrer mais tardiamente.
O corpo lúteo ovino recém formado tem sido considerado refratário ao efeito da PGF2α
(Acritopoulou & Haresign, 1980; Wiltbank & Niswender, 1992), mas recentemente, nós
demonstramos que esta refratariedade restringe-se aos dois primeiros dias após a ovulação
(Rubianes et al, 2003). A luteólise, manifestação do estro, ovulação e formação no CL são eventos
relatados em ovinos após a aplicação de PGF2α no dia 3 após a ovulação, similarmente ao
observado em ovelhas tratadas no dia 5. Entretanto, apenas 1 animal, do total de 8, respondeu ao
efeito da PGF2α administrada no dia 1. Interessantemente, a ovulação ocorreu em um intervalo
consistente (~60 horas) em todos os animais após tratamento no dia 3, e na maioria dos animais
tratado no dia 5. A homogeneidade de resposta à PGF2α, quando aplicada na presença de um
s254
folículo em crescimento durante a fase luteal inicial é apresentada na figura 2. Essas observações
nos levaram e propor um novo protocolo de indução e sincronização da ovulação (SynchovineTM),
que vem sendo atualmente avaliado em ovinos.
8
Ovulação
7 60 horas
PGF2α Onda 1 (1/8)
6
Dia 1
5
2
8
diâmetro (mm) do maior folículo
PGF2α Ovulação
7 Dia 3 60 horas
6
Figura 2. Perfil de crescimento do maior
Onda folículo ovariano de ovelhas tratadas com um análogo
1 (8/8)
5 da PGF2α, no dia 1 (a, n = 8), dia 3 (b, n = 8) ou dia 5 (c; n = 8), após a ovulação. A
luteólise foi induzida em todas as ovelhas tratadas nos dias 3 e 5. Todas as ovelhas
4 tratadas no dia 3 e, seis tratadas no dia 5, tiveram folículos ovulatórios originados na
primeira onda folicular. As outras duas ovelhas tratadas no dia 5 tiveram folículos
3
ovulatórios originados na segunda onda folicular. A luteólise seguida de ovulação do
PGF2α Ovulação
2 maior
Dia 5 folículo foi observada em somente uma das ovelhas tratadas no dia 1, após a
60 horas Onda 1 (5/8)
8
ovulação (adaptado de Rubianes et al., 2003).
7 Ovulação
84 horas
6
Onda 1 (1/8) s255
5 Onda 2 (2/8)
4
3
Tratamentos tradicionais com PGF2α consistem na administração de duas doses intercaladas

de 9 a 14 dias (Gordon, 1983; Evans & Maxwell, 1990; Durán Hontou, 1993), e têm base no
conceito refratário do CL recém formado. Utilizando este protocolo, uma alta proporção de ovinos
demonstra estro após a segunda aplicação de PGF2α, no entanto ocorre uma variação de 4 dias
no intervalo para o estro entre os animais (Gordon, 1983; Evans & Maxwell, 1990; Durán Hontou,
1993), fazendo-se necessário a observação de estro e tornando-os impraticáveis para programas
de IATF.
O protocolo SynchovineTM diminui o intervalo entre as duas aplicações de PGF2α para
somente 7 dias, com o objetivo de aumentar a sincronização da ovulação em ovinos após a
segunda dose (Figura 3). Quando a primeira dose de PGF2α é aplicada sem o conhecimento do
¨status¨ ovariano, a ovulação ocorre em um intervalo de 2 a 4 dias, determinando a emergência
da primeira onda do próximo ciclo. O maior folículo continua a crescer por 4 a 7 dias,
simultaneamente ao desenvolvimento do novo CL. Dessa maneira, a segunda aplicação de PGF2α
(7 dias após a primeira dose), coincide com os dias 3-5 após ovulação, quando o maior folículo
da onda permanece em fase de crescimento e o corpo lúteo torna-se responsivo à PGF2α. Isto é
suportado pelo estudo de Rubianes et al (2003), no qual uma dose de PGF2α é aplicada no início
da fase luteal (dia 3 ou 5; Figura 2) induzindo a luteólise, a manifestação do estro e a ovulação
sincronizada em 60 horas após a segunda aplicação de PGF2α em 81% das ovelhas tratadas.
Assim duas doses de PGF2α intervaladas de 7 dias resultariam em uma melhor sincronia da
ovulação, permitindo obter uma taxa de gestação aceitável com apenas uma inseminação em
tempo fixo.
Diferentes experimentos foram realizados objetivando avaliar o protocolo Synchrovine™.
Os resultados consistentes encontrados confirmam uma elevada sincronização do estro,
reafirmando a sensibilidade do CL com 3-5 dias a PGF2α. A manifestação do estro foi observa
do dentro de 72 horas (média: 41 horas) após a segunda aplicação da PGF2α em 92% dos animais
multíparos, com a maior porcentagem de estros (78%) iniciando ente 25 – 48 horas (Menchaca
et al, 2004). Contudo, a taxa de concepção obtida após a aplicação deste protocolo varia entre
30 e 55% após uma única Inseminação em tempo fixo, 42 horas após a segunda aplicação de
PGF2α. Vários fatores podem influenciar estes resultados, como: condição corporal e ordem
de parto. Mais estudos são necessários para que seja possível obter conclusões definitivas.
5. Dominância Folicular e Superovulação
A existência da dominância folicular durante as ondas de crescimento folicular em ovinos

foi, por muito tempo, uma questão controversa (Driancourt et al, 1991). Entretanto, as seguintes
observações, revisadas por Adams (1999), corroboram com a ocorrência deste fenômeno na
espécie, particularmente durante a primeira e a última onda do ciclo inter-ovulatório: 1) a
emergência de ondas foliculares associadas à presença de um folículo maior que os demais, foi
detectada durante o início da fase luteal e o início da fase folicular; 2) a indução da luteólise
(prostaglandina) em diferentes dias do ciclo estral promove uma variação no número de animais
que ovulam o maior folículo, e no intervalo entre a aplicação do tratamento e a manifestação do
estro (Houghton et al, 1995), e 3) as respostas folicular e ovulatória ao tratamento
superestimulatório foram influenciadas pelo “status” folicular no início do tratamento, e a presença
do maior folículo em fase de crescimento foi associada com um menor número de folículos
recrutados, poucas ovulações e um reduzido número de embriões (Rubianes et al, 1997).
Em bovinos, a dominância folicular parece ser controlada por inúmeros mecanismos que
atuam conjuntamente, os quais incluem as alterações na concentração endógena de FSH, induzidas
pelo estradiol e pela inibina secretados durante a fase de crescimento do folículo dominante. Os
s256
folículos subordinados não podem sobreviver em um meio com reduzida concentração de FSH,
sendo destinados a atresia (Ginther et al, 2001). Por outro lado, o folículo dominante desenvolve
mecanismos intra-foliculares que ampliam o suporte desta gonadotrofina, podendo sobreviver
nesse meio (Fortune et al, 2001). Para obter um contínuo crescimento e sobrevivência de um
“pool” de pequenos e médios folículos, é necessário manter a concentração sangüínea de FSH
alta. Entretanto, a presença de um grande folículo no momento da superestimulação poderá
afetar a resposta ovariana.
Descobertas semelhantes foram observadas em ovelhas (Rubianes et al, 1997). Um
tratamento superestimulatório com FSH, dividido em seis aplicações iguais a cada 12 horas, foi
realizado em ovelhas, tendo início no momento da emergência da primeira onda de crescimento
folicular (imediatamente após a ovulação) ou três dias mais tarde (i.e. na ausência ou presença
do maior folículo, respectivamente). Todos os animais foram avaliados, por meio da ultra-
sonografia transretal duas vezes ao dia, quanto ao número total de folículos iguais ou maiores do
que 3 mm. O recrutamento folicular promovido pelo FSH foi afetado pela presença do maior
folículo em fase de crescimento no momento em que se iniciou o tratamento (i.e. ovelhas tratadas
no dia 3). Nas ovelhas tratadas no dia 0, o FSH promoveu um aumento da população de grandes
folículos nas 48, 72, e 96 horas posteriores. Em contraste, a presença de um folículo grande no
início do tratamento (ovelhas tratadas no dia 3) reduziu o número de folículos recrutados, sendo
este fato atribuído ao efeito inibitório da presença de um folículo grande (dominante).
Diferentes protocolos comerciais desenvolvidos para sincronizar a emergência da onda
folicular, antes do início da superestimulação ovariana, têm mostrado bons resultados em
programas de superovulação em bovinos (Bo et al, 1995). Apesar da presença do folículo
dominante também exercer efeito deletério sobre a resposta ovariana de ovinos (Rubianes et al,
1997) e de caprinos (Menchaca et al, 2002), os protocolos de superovulação, tradicionalmente
utilizados para pequenos ruminantes, não consideram as informações atuais sobre a dinâmica
folicular ovariana.
O chamado “Protocolo do dia 0” foi desenvolvido a partir do conhecimento atualmente
disponível sobre dinâmica folicular de ovelhas, considerando uma técnica mais eficiente e natural
para a sincronização da onda folicular. No dia 0 do intervalo inter-ovulatório (dia da ovulação),
todas as ovelhas tem um “pool” homogêneo de pequenos folículos em crescimento, e nenhuma
delas possui um folículo dominante. Folículos ovarianos responsivos ao tratamento, quando se
encontram em um status de maturação similar ao início da superestimulação, desencadeiam um
processo adequado de ovulações múltiplas. Por outro lado, se o pool de folículos apresenta uma
grande heterogeneidade, a resposta é caracterizada por um processo assincrônico no crescimento
e luteinização folicular, sendo considerada como uma resposta inadequada (i.e. função luteal
inadequada, cistos foliculares luteinizados) (Rubianes et al, 1997). O “Protocolo do Dia 0” esta
sendo usado comercialmente em programas de superovulação e transferência de embriões de
pequenos ruminantes. O tratamento com FSH é iniciado após a detecção ultra-sonográfica da
ovulação ou a partir do momento esperado para que ela ocorra (Dia 0), podendo ser 36 horas
após o início do estro ou 84 horas após a aplicação do Protocolo de curta duração (veja a Figura
3). A dose total de FSH é dividida em seis ou oito aplicações iguais, ou em forma de doses
decrescentes e são aplicadas, juntamente com as duas últimas doses, duas meias doses de PGF-
2á, administradas para assegurar a luteólise. O uso deste protocolo, inicialmente desenvolvido
para ovinos, tem sido utilizado com sucesso em caprinos. Dados do programa Chinês de
transferência de embriões, em ovinos da raça Merino, confirmam o sucesso deste protocolo,
quando comparado com os tratamentos tradicionais. Os resultados estão resumidos na Tabela 1.
s257
Tabela 1. Resposta de ovelhas submetidas à superestimulação usando o “Protocolo do dia 0” (veja

no texto) ou um tratamento tradicional. O último consiste no fornecimento de
progesterona exógena por 14 dias (dois CIDR mantidos por 7 dias cada), iniciando o
tratamento com FSH dois dias antes da retirada do segundo implante. Ambos os grupos
receberam uma dose de FSH total (240 mg NIH-FSH-P1, Folltropin, Bioniche, Ontario,
Canada) (A. Menchaca, M. Vilariño, S. Kmaid, A. Pinczak, JM Saldaña, observações não
publicadas).
Tratamento Ovelhas Número de Estruturas Embriões ET/EC
em CLs Coletadas Transferíveis %
Estro (EC) (ET)
Tradicional (n=22) 20/22 10,1 ± 1,1 8,0 ± 0,9 5,9 ± 1,1 118/160 (74%)
Dia 0 (n=22) 22/22 13,5 ± 1,4 10,3 ± 1,2 7,9 ± 1,4 165/217 (76%)
P= >0,10 <0,05 <0,10 <0,10 >0,10
Figure 3. Resposta ao protocolo Synchrovine. O esquema demonstra duas diferentes situações

encontradas em um rebanho: ovelhas apresentando o maior folículo em fase de
crescimento (Painel A) ou de regressão (Painel B), no início do protocolo Synchrovine.
Após a primeira PGF2α a ovulação ocorre dentro de 2 a 4 dias. Uma nova onda folicular
emerge em torno do dia da ovulação e, no momento da segunda dose PGF2α (7 dias
após a primeira), o maior folículo se encontra com 3 a 5 dias de idade. Desta forma, a
ovulação seguinte, dentro de um rebanho, ocorre em um período restrito de 48 a 72
horas (~60 horas). A inseminação artificial em tempo fixo é realizada 42 horas após a
segunda dose de PGF2α (adaptado de Mecnhaca & Rubianes, 2004).
s258
6. Comentários e conclusões
Nos últimos anos, o uso da ultra-sonografia no estudo do trato reprodutivo de ovelhas,

permitiu um avanço sustentável no conhecimento e controle da fisiologia ovariana, em diferentes
espécies. Os novos conhecimentos gerados serviram de suporte para o desenvolvimento de duas
novas abordagens (Protocolos de curta duração e Synchrovine™) em sincronização do estro e da
ovulação. Adicionalmente, um novo protocolo de superovulação (“Dia 0”) foi desenvolvido,
apresentando respostas ao tratamento superestimulatório mais eficientes em programas de
transferência de embrião. Todas estas contribuições podem aumentar a produção da indústria de
ovinos em nossa região.
7. Agradecimentos
Os autores agradecem aos co-autores J. Gil, J. Olivera, V. Miller, V. Salveraglio, T. de

Castro, B. Carbajal, A. Pinczak, M. Laca, C. Viñoles and R. Ungerfeld; a M. Pintos do
Departamento de Fisiologia. Os agradecimentos se estendem a I. Videla (Syntex, Argentina); a
E. Campos e S. Kmaid (Universal Lab, Uruguay) D. Hughes e E. Dixon (ICPbio, New Zealand)
pela concessão dos hormônios utilizados nos diferentes experimentos. Suporte Financeiro foi
fornecido por PEDECIBA e CSIC (Universidad de la República). ER e AM são pesquisadores
do FNI.
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steroidogenic cells of the corpus luteum in domestic ruminants. Anim Reprod Sci 1992;28: 103-
110.
s261
s262
Resumos Incritos:
Competição de Estudantes
s263
PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS NUCLEARES DE

ESPERMATOZÓIDES DE TOUROS
Guardieiro, M.M.1; Welter, B.M.1; Jacomini, J.O.1; Oliveira, F.2; Goulart, L.R.3
1
FAMEV-UFU, 38400-902, Uberlândia-MG, Brasil, 2 ICBIM-UFU, 38400-902, Uberlândia-
MG, Brasil, 3LGM-UFU, 38400-902, Uberlândia-MG, Brasil.
moniqueguardieiro@yahoo.com.br
A condensação da cromatina que ocorre durante a espermiogênese em mamíferos é resultado da

substituição de histonas por protaminas (ROUX, C.; Gynécologie Obstétrique e Fertilité, 32,
792-798, 2004). A presença de histonas somáticas ou anormalidades nas protaminas podem
ocasionar distúrbios na condensação da cromatina dos espermatozóides, repercutindo sobre a
fertilidade (BELETTI; M.E.; Brazilian Journal of Genetics, 19, 97-103, 1996). Este trabalho tem
como objetivo apresentar um método de extração de proteínas nucleares de espermatozóides de
touros, que foi baseado no experimento de KATAYOSE et al.(Fertility and Sterility, 79, 670-676,
2003). Foram coletados 4 ejaculados de touros da raça pardo suíça, com auxílio de eletroejaculador
e processados por centrifugação (300 x g, 10 minutos, 4oC) para remover o plasma seminal. Os
péletes resultantes foram ressuspendidos em 2 mL de solução A (Tris/HCl, pH 7,5, 150mM de
KCl, 0,34M sacarose) e sonicados até formar uma cavitação nas amostras, com a finalidade de
separar as cabeças das caudas espermáticas. Depois de lavar 2 vezes (700 x g, 15 minutos, 4oC),
adicionaram-se 3 mL de sacarose 1,4M e realizou-se centrifugação (700 x g, 45 minutos, 4oC).
Para provocar a ruptura da membrana plasmática das cabeças dos espermatozóides, adicionou-
se 1 mL de Tween 80 a 4% e as amostras foram agitadas por 15 minutos. Após centrifugação com
a adição de 2 mL da solução A (700 x g, 15 minutos, 4oC, 2 vezes), os péletes foram ressuspendidos
em 0,5ìL de solução de HCl 0,25M e incubados por 2 horas a 4oC para extração das
nucleoproteínas. Foi realizada uma centrifugação (700 x g, 15 minutos, 4oC) e os sobrenadantes
obtidos foram misturados com 24 ìL de deoxicolato de sódio, agindo por 30 minutos, a 4oC.
Adicionaram-se 200 ìL (400 ìL/mL) de ácido tricloroacético 20% em cada amostra, incubando-
a por 1 hora em banho de gelo. Os precipitados foram coletados após a centrifugação de 950 x g,
45 minutos, 4oC e adicionaram-se 100 ìL de acetona acidificada. Uma nova centrifugação foi
feita a 1300 x g, 10 minutos, a 4 oC. O pélete foi ressuspendido com 50 ìL de água destilada e foi
acrescentado tampão Tris-HCl 0,0625M, pH 6,8; contendo 10% β-mercaptoetanol, 10% de
glicerol; 0,2% de SDS, 0,001% de azul de bromofenol e uréia 2,5M. Estas amostras foram
congeladas até o seu uso. A eletroforese em gel de poliacrilamida a 20% com uréia a 2,5M e
dodecil sulfato de sódio foi realizada aplicando-se 20 ìL de amostra de cada touro. Em seguida,
o gel foi corado em nitrato de prata. As nucleoproteínas obtidas possuíam massas moleculares
aparentes de 9 a 83 KDa.
s264
EFEITOS DO FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO-2 SOBRE O

CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS
Matos, M.H.T.1; van den Hurk, R.2; Lima-Verde, I.B.3; Luque, M.C.A.4; Santos, K.D.B.1;
Martins, F.S.1; Báo, S.N.4; Lucci, C.M.5; Figueiredo, J.R.1
1
Faculdade de Medicina Veterinária, PPGCV, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE,
Brasil, 2Departamento de Patobiologia, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de
Utrecht, P.O.Box 80157, NL-3508 TD, Yalelaan 1, Utrecht, Holanda, 3Faculdade de Medicina
Veterinária, PPGCV, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil,
4
Laboratório de Microscopia Eletrônica, Departamento de Biologia Celular, Universidade de
Brasília, Brasília, DF, Brasil, 5Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Brasília,
Brasília, DF, Brasil. htmatos@yahoo.com
Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos do Fator de Crescimento Fibroblástico-2

(FGF-2) sobre a sobrevivência, a ativação e o crescimento de folículos pré-antrais caprinos
utilizando análises histológica e ultra-estrutural. Fragmentos de córtex ovariano caprino foram
cultivados por 1 ou 5 dias, a 39oC, em atmosfera contendo 5% CO2 em ar, em Meio Essencial
Mínimo (Cultilab, Rio de Janeiro, Brasil) enriquecido com suplementos (MEM+ - meio controle)
e adicionado ou não de diferentes concentrações de FGF-2 (10, 50 or 100 ng/mL) (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO, USA). Os fragmentos de tecido ovariano não-cultivado (controle), bem
como daqueles tecidos cultivados por 1 ou 5 dias foram processados para Histologia Clássica
(HC) ou Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) para avaliar a qualidade morfológica de
folículos pré-antrais caprinos e calcular as percentagens de folículos normais. Os folículos foram
classificados como primordiais ou em desenvolvimento (transição, primários e secundários),
bem como em normais ou degenerados, de acordo com a morfologia do oócito e das células da
granulosa. Além disso, foram analisados os efeitos do FGF-2 sobre os diâmetros oocitário e
folicular de folículos pré-antrais do controle e dos cultivados. As percentagens de sobrevivência
folicular, média das percentagens de folículos primordiais e em crescimento, bem como os
diâmetros oocitário e folicular após os diferentes tratamentos e períodos de cultivo foram
analisados por ANOVA e teste de Fisher (P < 0,05). Os resultados mostraram que, embora as
percentagens de folículos morfologicamente normais foram inferiores nos fragmentos de tecido
ovariano cultivados quando comparados aos não-cultivados, não houve diferenças entre os
tratamentos nos dias 1 ou 5 de cultivo. Após 1 ou 5 dias de cultivo, uma percentagem
significativamente superior de folículos em crescimento foi observada no meio suplementado
com 50 ng/mL de FGF-2. Este tratamento também resultou em um aumento significativo dos
diâmetros oocitário e folicular após 5 dias de cultivo. A MET mostrou que a integridade ultra-
estrutural dos folículos pré-antrais foi mantida durante os 5 dias de cultivo na presença de 50 ng/
mL de FGF-2. Em conclusão, este estudo demonstrou que a concentração de 50 ng/mL mantém
a integridade morfológica de folículos pré-antrais caprinos cultivados por 5 dias, além de estimular
a ativação de folículos primordiais e o crescimento dos folículos ativados.
s265
INFLUÊNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE FSH SOBRE O

DESENVOLVIMENTO DE FOLÍCULOS PRIMORDIAIS CAPRINOS
Matos, M.H.T.1; Lima-Verde, I.B.2; Luque, M.C.A.3; Maia Jr., J.E.1; Silva, J.R.V.1; Celestino,
J.J.H.1; Martins, F.S.1; Báo, S.N.3; Lucci, C.M.4; Figueiredo, J.R.1
1
Brasil, 2Faculdade de Medicina Veterinária, PPGCV, Universidade Federal Rural de
Pernambuco, Recife, PE, Brasil, 3Laboratório de Microscopia Eletrônica, Departamento de
Biologia Celular, Universidade de Brasília, Brasília, DF, Brasil, 4Faculdade de Medicina
Veterinária, Universidade de Brasília, Brasília, DF, Brasil. htmatos@yahoo.com
O papel das gonadotrofinas na regulação do desenvolvimento de folículos pré-antrais permanece

pouco conhecido. Os objetivos deste estudo foram investigar os efeitos do FSH sobre a
sobrevivência, a ativação e o crescimento de folículos primordiais caprinos utilizando análises
histológica e ultra-estrutural. Para isto, fragmentos de córtex ovariano caprinos foram cultivados
por 1 ou 7 dias, a 39oC, em atmosfera contendo 5% CO2 em ar, em Meio Essencial Mínimo
(Cultilab, Rio de Janeiro, Brasil) enriquecido com suplementos (MEM+ - meio controle) e
adicionado ou não de diferentes concentrações de FSH (0, 10, 50 or 100 ng/mL). Os fragmentos
de tecido ovariano não-cultivado, bem como daqueles cultivados por 1 ou 7 dias nos diferentes
tratamentos foram processados para histologia clássica e Microscopia Eletrônica de Transmissão
(MET) para avaliar a integridade folicular e calcular as percentagens de folículos normais. Os
folículos foram classificados como primordiais ou em desenvolvimento (transição, primários e
secundários), bem como em normais ou degenerados, de acordo com a morfologia do oócito e
das células da granulosa. Além disso, foram avaliados os efeitos do FSH sobre os diâmetros
oocitário e folicular. As percentagens de sobrevivência folicular, média das percentagens de
folículos primordiais e em crescimento, bem como os diâmetros oocitário e folicular após os
diferentes tratamentos e períodos de cultivo foram analisados por ANOVA e teste de Fisher (P<
0,05). Os resultados mostraram que a menor percentagem de folículos normais foi observada
após 7 dias em tecidos cultivados no meio controle. Após 1 dia de cultivo, foi observada uma
percentagem significativamente superior de folículos em crescimento no meio suplementado
com 50 ng/mL de FSH. Na presença de 10 e 50 ng/mL de FSH, foi observado um aumento
significativo dos diâmetros oocitário e folicular após 7 dias de cultivo. A MET mostrou que a
integridade ultra-estrutural foi mantida nos folículos caprinos após 1 dia de cultivo no meio
controle e após 7 dias de cultivo em MEM suplementado com 50 ng/mL de FSH, mas a análise
ultra-estrutural não confirmou a integridade dos folículos cultivados por 7 dias no meio controle.
Em conclusão, este estudo demonstrou que o FSH, na concentração de 50 ng/mL, mantém a
integridade morfológica de folículos pré-antrais caprinos cultivados por 7 dias, além de estimular
a ativação de folículos primordiais e o crescimento folicular.
s266
EFICÁCIA DE DUAS TÉCNICAS UTILIZANDO PGE2 PARA PROMOVER A

MIGRAÇÃO ANTECIPADA DE EMBRIÕES COM POTENCIAL PARA
CRIOPRESERVAÇÃO EM ÉGUAS SUPEROVULADAS – DADOS PRELIMINARES
Peres, K.R.1; Arruda, R.P.1*; Andrade, A.F.C.1; Silva, L.C.L.C.2
1
Centro de Biotecnologia em Reprodução Animal – VRA/FMVZ/USP, 13635-900,
Pirassununga-SP, Brasil. 2Dep. Cirurgia – FMVZ – USP, 05508-900, Cidade Universitária,
São Paulo-SP, Brasil.*arrudarp@usp.br
Sabe-se que embriões eqüinos menores que 250 µm e nos estágios iniciais de desenvolvimento
sobrevivem melhor ao processo de criopreservação. Contudo, para recuperá-los com estas
características o lavado uterino deve ser realizado no 6º dia após a detecção da ovulação, momento
em que as taxas de recuperação são menores. Estas menores taxas são explicadas, principalmente,
pelo fato de que os embriões podem levar até 156 horas (6,5 dias) para sair do oviduto e entrar no
ambiente uterino (Battut et al., Eq. Vet. J., suppl. 25, p.60-62, 1998). Considerando-se que a
PGE2, secretada pelo embrião a partir do D5, parece ser a principal responsável pelo transporte
do embrião pelo oviduto e pela passagem deste para o útero (Weber et al., Biol. Reprod., v.45,
p.540-543, 1991), testamos a hipótese de que a aplicação exógena de PGE2 anteciparia a descida
de embriões para o útero de éguas superovuladas, possibilitando a recuperação de um maior
número de embriões com potencial de sobrevivência à criopreservação. Para isso, cinco éguas
de diferentes raças, de três a 10 anos, foram submetidas a tratamento com Extrato de Pituitária
Eqüina (EPE), recebendo uma dose de 6 mg, IM, uma vez ao dia, a partir do 5º ou 6º dia do
diestro. No momento em que elas apresentaram ao menos um folículo e” 35 mm, receberam
2500 UI de hCG, IV, (Vetecor ® - Calier-SP) e foram inseminadas com um bilhão de
espermatozóides móveis. A partir deste momento, o desenvolvimento folicular foi acompanhado,
a cada 12 horas, até a determinação do momento da(s) ovulação(ões) (D0). O tratamento durou
de quatro a sete dias e 40% das éguas (2/5) tiveram duplas ovulações. No 4º dia após a ovulação,
duas éguas (uma delas com duas ovulações no ovário direito e outra com uma ovulação, também
no ovário direito) foram submetidas à laparoscopia pela fossa paralombar para a deposição,
sobre o oviduto ipsilateral à ovulação, de 1 ml (0,4 mg) de PGE2 (Prostaglandin E2 – Cayman
Chemical, MI, USA) diluída em gel a base de pelemol e aerosil, conforme técnica descrita por
Robinson et al. (2000) (J. Reprod. Fert. Suppl. 56, p.587-592, 2000). As outras três éguas (uma
com duas ovulações no ovário direito e as outras duas, com apenas uma ovulação) receberam a
mesma quantidade de PGE2, no D4, mas, a deposição foi realizada sobre a junção útero-tubárica
(JUT) ipsilateral à ovulação, via transcervical, com auxílio de uma pipeta flexível para inseminação
na JUT (Minitub®-RS). Vinte e quatro horas após a deposição do gel (D5), para ambos os métodos,
foi realizada uma primeira tentativa de recuperação embrionária pelo método não-cirúrgico, sendo
que não foram recuperados embriões. Uma nova tentativa foi realizada entre o D6-6,5, sendo
que desta vez, foram recuperados dois embriões das cinco éguas (40%), sendo um obtido de uma
das éguas submetidas a laparoscopia e outro de uma égua submetida à técnica não-cirúrgica,
ambas com apenas uma ovulação. Os resultados obtidos demonstram que a PGE2, dentro das
condições apresentadas e utilizando as técnicas descritas, não foi eficiente em antecipar a descida
do embrião eqüino para o útero de éguas, sendo estas superovuladas ou não. As técnicas serão
testadas em um maior número de éguas para confirmar os resultados obtidos. Agradecimentos:
CAPES; TK Tecnologia em Congelação Ltda; Farmaco – Farmácia de Manipulação; Arte e
Fórmula – Farmácia de Manipulação.
s267
ENUCLEAÇÃO QUÍMICA E FORMAÇÃO DE PROTRUSÃO NA REGIÃO

CORTICAL EM OÓCITOS BOVINOS TRATADOS COM DEMECOLCINA
Saraiva, N.Z.1; Perecin, F.1; Méo, S.C.2; Ferreira, C.R.1; Tetzner, T.A.D.1;
Vantini, R.1; Garcia, J.M.1
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil,2CPDGRA-IZ-APTA/SAA, Nova Odessa -
SP, Brasil. naiaravet@hotmail.com
Vários procedimentos que promovem ou facilitam a enucleação oocitária, na técnica de

transferência nuclear (TN), têm sido relatados. A enucleação química é um procedimento não-
invasivo atrativo por causar mínima diminuição do volume citoplasmático e consiste na remoção
dos cromossomos maternos durante a formação do primeiro corpúsculo polar (Fulka, Mol. Reprod.
Dev., v.34, p.427-430). Recentemente, foi descrita também a técnica de enucleação assistida
quimicamente (Yin, Reproduction, v.124, p.41-47; Yin, Biol. Reprod., v.67, p.442-446), que
visa à formação de uma protrusão com o material nuclear condensado, na região cortical oocitária,
eliminando, dessa maneira, a necessidade de coloração e exposição do oócito à irradiação UV. O
objetivo deste trabalho foi verificar a menor concentração eficiente de demecolcina no processo
de enucleação, em oócitos bovinos expostos a esse agente em metáfase I (MI) e na formação de
protrusão, em oócitos em metáfase II (MII). Oócitos bovinos maturados in vitro (TCM 199
suplementado com 10% SFB, 1,0ìg/mL de FSH, 50ìg/mL de hCG, 1,0ìg/mL de estradiol,
0,20mM de piruvato e 83,4ìg/mL de amicacina) durante 12h (MI) ou 21h (MII) receberam
tratamento com demecolcina nas seguintes concentrações: 0 (controle); 0,025; 0,05; 0,2 e 0,4ì g /
mL. No grupo MI, os oócitos foram expostos à demecolcina durante 12h e no grupo MII, apenas
por 2h. A droga foi diluída diretamente no meio de maturação presente nos poços de placas
Nunc®, nos quais os oócitos estavam sendo maturados. Em seguida, os oócitos foram desnudados
em hialuronidase (2mg/mL) e corados com 10ìg/mL de Hoechst 33342 diluído em meio TCM
199 Hepes, durante 10 minutos. Após a coloração, os oócitos foram observados em microscópio
de epifluorescência (330-385nm) e avaliados quanto à formação de protrusão na região cortical
ou enucleação. Em cada uma das 10 repetições, foram utilizados 30 a 50 oócitos por tratamento
e os resultados foram submetidos à ANOVA e teste de Duncan, no programa SAS v.8.2 (P=0,05).
No grupo MI, as concentrações 0,025 e 0,05µg/mL foram superiores (p<0,05) ao grupo controle
e às concentrações 0,2 e 0,4µg/mL na indução de enucleação (16,2 e 15,2% de oócitos enucleados,
respectivamente) e não diferiram entre si, sendo consideradas as melhores concentrações. No
grupo MII, a concentração 0,05µg/mL foi superior (p<0,05) às concentrações 0,025 e 0,4µg/mL
e semelhante (p>0,05) à concentração 0,2µg/mL, possibilitando a formação de protrusão em
55,1% dos oócitos tratados. Não houve diferença significativa (p>0,05) entre as concentrações
0,025; 0,2 e 0,4µg/mL. Em conclusão, verificamos que a demecolcina foi capaz de promover
enucleação oocitária e formação de protrusão na região cortical, em concentrações inferiores
àquelas utilizadas rotineiramente (normalmente 0,4µg/mL) e, dessa maneira, a redução da
concentração da droga, com manutenção de seu efeito, poderá se traduzir em melhor
desenvolvimento embrionário.
Apoio financeiro: FAPESP 03/12351-0 e CNPq.
s268
PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS CLONADOS APÓS ENUCLEAÇÃO

QUIMICAMENTE ASSISTIDA PELA DEMECOLCINA
Saraiva, N.Z.1; Perecin, F.1; Méo, S.C.2; Ferreira, C.R.1; Tetzner, T.A.D.1;
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil,2CPDGRA-IZ-APTA/SAA, Nova Odessa -
SP. naiaravet@hotmail.com
A enucleação oocitária é um fator fundamental no sucesso da transferência nuclear (TN). Esse

procedimento geralmente envolve a coloração do núcleo e exposição do oócito à irradiação UV
para confirmação da enucleação. Ainda, por ser um processo invasivo, a injúria causada ao oócito
receptor é agravada pela remoção concomitante de grande volume de citoplasma ao redor da
placa metafásica. A demecolcina é um agente desestruturador de microtúbulos que pode ser
utilizada para auxiliar a enucleação oocitária e minimizar as injúrias provocadas ao citoplasto. O
objetivo deste trabalho foi verificar a capacidade de desenvolvimento embrionário após a TN,
empregando-se citoplastos oriundos de enucleação assistida quimicamente pela demecolcina.
Oócitos bovinos foram maturados in vitro (TCM 199 com 10% SFB, 1,0ìg/mL de FSH, 50ìg/
mL de hCG, 1,0ìg/mL de estradiol, 0,20mM de piruvato e 83,4ìg/mL de amicacina) por 19h,
desnudados e expostos à demecolcina (0,05μg/mL) por 2h. Em seguida, foram enucleados com
uma pipeta de diâmetro interno entre 22,5 e 25μm, por meio da remoção do 1º. corpúsculo polar
(CP) e da protrusão formada próxima a esse, contendo todo o material nuclear do oócito Parte
dos citoplastos foram corados com Hoechst 33342 por 10 minutos (10μg/mL) e avaliados quanto
à eficiência da enucleação. Os conjuntos citoplasto-fibroblasto foram submetidos à eletrofusão
(2,0kV/cm por 20μseg cada, em solução de manitol 0,28M) e ativados partenogeneticamente
com ionomicina (5μM por 5min) seguida de 6-DMAP (2mM por 4h). Os embriões reconstituídos
foram co-cultivados com células do cumulus em SOF 2,5% SFB + 0,5% BSA por 7 dias. Verificou-
se alta eficácia da técnica de enucleação (90,6%), possibilitando o uso dessa em procedimentos
de transferência nuclear, sem a necessidade de coloração do núcleo, orientando-se somente pelo
CP e protrusão formada. Foram avaliados 515 oócitos, em três repetições, dos quais 219 (42,5%)
possuíam protrusões e estavam aptos a serem enucleados. Fibroblastos foram transferidos com
êxito para 203 citoplastos, obtendo-se taxa de fusão celular de 46,8% e médias de 84,5% de
embriões clivados (49/58) e 27,6% de blastocistos (16/58). Dessa maneira, não verificamos ação
prejudicial da demecolcina ao desenvolvimento embrionário, considerando-se que os índices de
clivagem e produção de blastocistos foram semelhantes ou superiores àqueles relatados em
procedimentos prévios de TN tradicional (Yamazaki, Zygote, v.13, p.295-302). Essa técnica
elimina a necessidade de coloração do núcleo, já que é possível remover o conteúdo nuclear
orientando-se somente pelo 1oCP e protrusão formada. Além da avaliação do desenvolvimento
embrionário até o estádio de blastocisto, a capacidade desses embriões em estabelecer gestações
e desenvolver-se a termo, bem como análises moleculares que determinem a qualidade e a
viabilidade dos embriões obtidos pela técnica ainda precisam ser realizadas, evidenciando a
necessidade de mais estudos na área.
Apoio financeiro: FAPESP 03/12351-0 e CNPq.
s269
INTRODUÇÃO DA OVALBUMINA COMO SUPLEMENTO PROTÉICO NA

MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS
Tetzner, T.A.D.1; Saraiva, N.Z.1; Perecin, F.1; Ferreira, C.R.1,2; Resende, M.V.1; Méo, S.C.1,3;
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil,2ZAB-FZEA - USP, Pirassununga-SP,
Brasil, 3CPDGRA-IZ-APTA/SAA, Nova Odessa-SP, Brasil. tatiane_tetzner@yahoo.com.br
O desenvolvimento de um meio de cultivo livre de soro para embriões de animais domésticos é

altamente desejável uma vez que pode facilitar estudos do desenvolvimento embrionário inicial
e aumentar a eficiência dos procedimentos de maturação e fecundação in vitro (Gardner e Lane,
Biol. Reprod., v.50, p.390-400, 1994). A albumina sérica bovina (BSA) e o soro fetal bovino
(SFB) são preparados e purificados através de produtos sangüíneos e, conseqüentemente,
apresentam risco de contaminação com patógenos, vírus e príons (Krisher et al., Biol. Reprod.,
v.60, p.1345-52, 1999). Nosso objetivo foi avaliar a influência da ovalbumina (OVA) na dinâmica
de maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos. Até o momento, não há registro na
literatura da utilização da OVA na produção in vitro de embriões. De acordo com Barlian (Cell
Biol. Inter., v.17, p.677-84, 1993), a OVA é um suplemento protéico não aparentado ao BSA,
mas que também possui a capacidade de manter a proliferação celular, além de apresentar menores
riscos de transmissão de doenças em relação ao BSA e ao SFB. Os oócitos foram maturados in
vitro (MIV) em meio TCM-199 Bicarbonato com sais de Earles, 1,0ìg/mL de FSH, 50ìg/mL de
hCG, 1,0ìg/mL de estradiol, 0,20mM de piruvato e 83,4ìg/mL de amicacina e suplementado de
acordo com os tratamentos: SFB (10% SFB), BSA (4mg/mL BSA), OVA (4mg/mL OVA) ou BO
(2mg/mL BSA + 2mg/mL OVA), durante 24h a 38,5-39°C e atmosfera gasosa de 5% de CO2 em
ar. Para a coloração dos grânulos corticais (GC), indicativa de maturação citoplasmática, foi
utilizada a metodologia descrita por Cherr et al. (1988) com algumas modificações. Após a MIV,
os oócitos foram coletados, tiveram a zona pelúcida removida em pronase 0,5% em PBS.
Posteriormente, foram fixados em 3% de formaldeído em PBS por 30 min à temperatura ambiente
e mantidos a 4ºC por 24 h em solução de bloqueio (SB). Para a permeabilização, os oócitos
foram tratados em SB acrescida de 0,1% de Triton X-100. Os oócitos foram incubados em 10
μg/mL de Lens culinaris aglutinina conjugado a isotiocianato de fluoresceína em SB por 15
minutos. Em seguida, foram lavados em SB, corados com 10 μg/mL de Hoechst 33342, para
avaliação da maturação nuclear, e visualizados em microscópio de epifluorescência. Os oócitos
apresentando Metáfase II (MII) foram considerados com maturação nuclear completa. Em relação
à maturação citoplasmática, oócitos apresentando distribuição dos GC “clusters” foram
classificados como imaturos e oócitos com GC periféricos, classificados como maturos. Em
cada repetição foram avaliados 80 a 100 oócitos por tratamento e foram realizadas 4 repetições,
num total de 1505 oócitos. Os resultados foram submetidos à ANOVA e teste de Tukey com 5%
de significância, no programa SAS v.8.2. Não houve diferença significativa (p>0,05) para
maturação citoplasmática entre os grupos SFB (64,36%), BSA (58,89%), OVA (65,48%) e BO
(66,76%), e também para maturação nuclear, SFB (75,66%), BSA (74,0%), OVA (78,78%) e BO
(73,92%). Esses resultados demonstram que nessas condições, a ovalbumina pode ser utilizada
como suplemento protéico na maturação in vitro de oócitos bovinos.
Apoio financeiro: FAPESP 04/12248-8
s270
A OVALBUMINA CAUSA DESVIO DA PROPORÇÃO SEXUAL EM EMBRIÕES

BOVINOS CULTIVADOS IN VITRO?
Tetzner, T.A.D.1; Resende, M.V.1; Lucio, A.C.1; Perini, A.P.1; Saraiva, N.Z.1; Perecin, F.1;
Ferreira, C.R.1,2; Méo, S.C. 1,3; Vantini, R.1; Garcia, J.M.1
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil, 2ZAB-FZEA-USP, Pirassununga-SP,
Brasil, 3CPDGRA-IZ-APTA/SAA, Nova Odessa-SP, Brasil. tatiane_tetzner@yahoo.com.br
Historicamente, o meio de cultivo para o desenvolvimento de embriões de mamíferos contém

albumina como suplemento, na forma de albumina sérica bovina (BSA) ou albumina sérica
humana (HSA) (Gardner e Lane, Biol. Reprod., v.50, p.390-400, 1994; Bavister et al.,
Theriogenology, v.37, p.124-46, 1992). Ambos, BSA e soro fetal bovino (SFB), por promoverem
o crescimento (Mingoti, Tese Doutorado, USP, 141p., 2000) são as fontes protéicas mais
comumente utilizadas como suplemento do meio de cultura para produção in vitro de embriões
bovinos (Leese, Journal Reprod. Fertility, v.82, p.843-56, 1988; Pratten et al., Develop., v.104,
p.137-45, 1988). O BSA e SFB são preparados a partir de produtos sangüíneos e,
conseqüentemente, apresentam risco de transmissão de vírus, príons (como o da encefalopatia
espongiforme bovina) e outros patógenos (Batt et al., Reprod. Fert. and Develop., v.3, p.601-07,
1991; Krisher et al., Biol. Reprod., v.60, p.1345-52, 1999). Até o momento não existem registros
na literatura sobre a utilização da ovalbumina (OVA) na produção in vitro de embriões. No
entanto, de acordo com Barlian (Cell Biol. Inter., v.17, p.677-84, 1993), a ovalbumina é um
suplemento protéico não aparentado ao BSA, com capacidade de manter a proliferação celular,
além disso, a origem heteróloga (aves) da OVA diminui os riscos de transmissão de doenças. O
objetivo deste trabalho foi avaliar se a substituição do BSA e do SFB pela OVA no meio de
cultivo de desenvolvimento causa desvio da proporção sexual dos embriões produzidos in vitro,
utilizando a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Oócitos bovinos provenientes
de ovários de abatedouro foram maturados in vitro em TCM199 com SFB, piruvato e hormônios
por 24 horas, fecundados in vitro em TALP com PHE e heparina por 20-22 horas e destinados ao
cultivo de desenvolvimento em meio SOF em dois grupos: OVA: com 6mg/mL OVA ou Controle:
6mg/mL BSA + 2,5% SFB. O cultivo foi realizado a 38,5-39°C em atmosfera gasosa de 5% de
CO2 em ar. Embriões em estádio de blastocisto no dia 7 foram congelados individualmente em
microtubos contendo 10ìL de água ultra-pura e armazenados a -20°C. Para a PCR, os embriões
foram tratados com 5ìg de Proteinase K, e cada embrião foi destinado a duas reações distintas,
uma primeira contendo uma seqüência autossômica (280bp) e uma Y-específica (250bp), e uma
segunda reação composta por outra seqüência Y-específica (196bp). A reação foi composta de
1U de Taq DNA Polimerase, 2mM de dNTPs, 1X de tampão PCR, 2mM de MgCl2, 5pmol/ì L
de cada primer, as amplificações foram realizadas em termociclador. As amostras amplificadas
foram aplicadas em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio, e os produtos de
amplificação foram observados em equipamento para documentação fotográfica e digitalização
de imagens. A proporção sexual obtida foi 50% de embriões fêmeas e 50% de machos, no grupo
da OVA (n=74), e 51,5% de embriões fêmeas e 48,5% de machos, no grupo controle (n=97).
Pelo teste do qui-quadrado, não foram detectadas diferenças significativas (p>0,284) entre o
grupo cultivado com ovalbumina e o grupo controle. Assim, o cultivo com OVA não promove
desvio da proporção sexual dos embriões bovinos produzidos in vitro.
Apoio financeiro: FAPESP 04/12248-8
s271
TAXA DE PRENHEZ EM ÉGUAS RECEPTORAS DE EMBRIÕES NO PRIMEIRO

ESTRO PÓS-PARTO
Bueno, L.M.1; Freire, A.F.2; Freire, S.E.2; Andrade, A.F.C.2; Arruda, R.P.2;
Celeghini, E.C.C.1,2
1
Faculdade de Jaguariúna – Curso de Medicina Veterinária; 2Departamento de Reprodução
Animal – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade de São Paulo
celeghin@usp.br
Em eqüinos, o primeiro estro pós-parto, comumente chamado de cio do potro, ocorre entre 3 e
18 dias após o parto. Apesar da completa involução uterina ocorrer somente em seis semanas,
uma recuperação considerável do útero é observada entre o 5° e o 15° dia pós-parto, o que torna
a égua apta a conceber nesse estro. Uma das vantagens na cobertura no primeiro estro pós-parto
é a redução do intervalo entre partos. Alguns estudos apresentam menor taxa de prenhez, enquanto
outros não relatam nenhum efeito da cobertura no primeiro estro pós-parto. Para que ocorra a
prenhez no primeiro estro pós-parto, o animal precisa apresentar adequadas condições uterinas.
Em programas de transferência de embriões, muitas vezes não se dispõe de número suficiente de
receptoras, o que se deve ao alto custo de manutenção destas fêmeas, sendo um dos maiores
entraves para maior utilização desta técnica. Portanto, o emprego de fêmeas logo após o primeiro
estro pós-parto é uma alternativa para aumentar a possibilidade de inovulações. Dessa forma, foi
objetivo deste trabalho avaliar a taxa de prenhez de receptoras de embriões seguido do primeiro
estro pós-parto. Este trabalho foi realizado no Haras 3 R, localizado no município de Santo
Antônio de Posse-SP, durante a estação de monta 2005/2006. Foram utilizadas 100 éguas da raça
Mangalarga como receptoras de embrião, sendo 26 no primeiro estro pós-parto e 74 no segundo
estro pós-parto. Utilizou-se receptoras que estavam entre o D3 e o D7, considerando D0 o dia da
ovulação. Os embriões foram colhidos das doadoras no D7, avaliados e transferidos
imediatamente. O diagnóstico de gestação foi realizado por ultra-sonografia transretal no D14 e
confirmado no D30. A análise estatística foi realizada pelo teste de X2 (qui-quadrado), considerando
o nível de significância de 5%. Foi observada maior (P=0,0386) taxa de prenhez para receptoras
no segundo estro pós-parto, de 68,92%, do que para as receptoras no primeiro estro pós-parto, de
46,15%. Contudo, conclui-se que a taxa de prenhez de receptoras no primeiro estro pós-parto é
reduzido, mas é uma alternativa na falta de receptoras.
s272
QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE GENES APOPTOTICOS EM PLACENTA

BOVINA PROVENIENTE DE GESTAÇÕES PRODUZIDAS POR TRANSFERENCIA
NÚCLEAR.
Braga, F.C.1,2; Miglino, M.A.1; Hernandez-Blazquez, F.J.1; Ripamonte, P.2;

Merighe, G.K.F.2; Meirelles, F.V.2;
1
VCI-FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil, 2 LMMD-ZAB-FZEA-USP, Pirassununga-SP, Brasil.
bragafc@gmail.com
A produção comercial de bovinos produzidos por transferência nuclear (TN) permitiu o

desenvolvimento de novo modelo no estudo da placenta. A necessidade da cesariana para o
nascimento do embrião favorece a coleta das membranas fetais. Alterações como número total
de placentonios, tamanho, formato, arvores vilosas, cordão umbilical, assim como alterações no
recém nascido já foram mostradas anteriormente. Gestações produzidas por TN freqüentemente
apresentam retenção de placenta e durante a palpação retal dois dias após a cesariana podemos
notar os placentonios com mesmo tamanho e sem alteração na consistência, esta observação que
de ausência de regressão levam à formulação da hipótese de placentonios provenientes de gestações
produzidas por TN apresentam menor freqüência de apoptose quando comparados com
placentonios provenientes de gestações produzidas por monta natural (MN). Para testar essa
hipótese 15 placentonios provenientes de gestações produzidas por TN e 3 placentonios
provenientes de MN foram coletados e congelados em nitrogênio líquido. A extração de RNA foi
realizada mediante protocolo Trizol (Invitrogen, Brasil) e a reação de trascriptase reversa feita
com Kit Impron II (Promega, Brasil), usando 1µg de RNA total. A quantificação relativa foi
desenvolvida no “7500 Real Time PCR System” (Applied Biosystems, EUA), em reação de
25µL contendo 1X “Power SYBR Green PCR Master Mix” (Applied Biosystems, EUA), 1µg de
cDNA e 0,6µM de cada primer (BAX, BCL2, e GAPDH). Para a quantificação dos genes ITM2B
e PI3K, também se utilizou o gene GAPDH como gene endógeno e reação contendo 1x “Taqman
Universal Master Mix” (Applied Biosystems, EUA), 40ng de cDNA, 0,72µM de cada primers
(ITM2B, PI3K e GAPDH) e 0,2µM de cada sonda. O programa “LinRegPCR” (Ramakers et al.,
2003) foi usado para o calculo da eficiência individual de cada reação e para o calculo estatístico
usou-se o programa “REST2005” (Pfaffl et al., 2002). Os resultados mostraram que o gene BAX
possui redução da expressão relativa no grupo TN (P=0,02), enquanto os genes BCL2, ITM2B e
PI3K foram iguais entre grupo TN e MN. A relação BAX/BCL2 foi maior que 1 em 12 dos
indivíduos analisados 12/15 (80%). Nenhuma diferença significativa foi encontrada quando
comparadas variáveis como sexo, sobrevivência e peso ao nascimento para todos os genes
estudados. A redução da expressão do BAX no grupo TN sugere que a apoptose é menor neste
grupo e a relação BAX/BCL2 indica que a redução na taxa de morte celular programada pode ser
responsável pela redução na taxa de regressão dos placentonios. Auxilio Financeiro: CAPES –
FAPESP.
s273
ASPIRAÇÃO FOLICULAR NO PERÍODO PERI-LUTEÓLISE EM BOVINOS:

EFEITOS NO CRESCIMENTO FOLICULAR E DURAÇÃO DO CICLO ESTRAL
Bisinotto, R.S.1; Ibiapina, B.T.1; Pontes, E.O.1; Fedozzi, F.1; Bergamaschi, M.A.C.M.1;
Bertan, C.M.1; Binelli, M.1
1
CBRA-VRA-FMVZ-USP, 13635-900, Pirassununga, SP. rsbisinotto@yahoo.com.br
Baixas taxas de prenhez em rebanhos bovinos estão associadas às perdas da gestação, uma vez
que taxas de fertilização de 90-100% resultam em apenas 50% de partos (Ayalon et al., J. Reprod.
Fertil. 54:483). Grande parte dessas perdas ocorre no período do reconhecimento materno da
gestação (Diskin e Sreenan, J. Reprod. Fertil. 59:463), provavelmente por falhas neste mecanismo
e, conseqüentemente, no bloqueio da luteólise. Uma vez que o 17β-estradiol E2) de origem
folicular estimula a liberação de PGF2á e a luteólise (Thatcher et al., Prostaglandins 31:745), a
hipótese deste estudo foi que a remoção de folículos durante a fase peri-luteólise retarda a
ocorrência da luteólise em bovinos. Objetivou-se no presente estudo avaliar o crescimento folicular
e a duração do ciclo estral em vacas submetidas a aspirações foliculares estratégicas. Vacas
Nelore (Bos taurus indicus) ou mestiças, não-prenhes e não-lactantes tiveram as ovulações
sincronizadas com um implante de norgestomet associado a aplicações de benzoato de estradiol
e d-cloprostenol sódico. As vacas que ovularam de forma sincronizada (dia da ovulação=D1)
foram divididas em dois grupos. Do D13 ao D25, os animais do grupo aspiração (GA; n=12)
tiveram os folículos com diâmetro igual ou superior a 6mm aspirados diariamente via trans-
vaginal e os animais do grupo controle (GC; n=10) foram submetidos a aspirações “placebo”. A
partir do D13 até o estro subseqüente, todos os animais foram observados duas vezes ao dia para
a detecção do comportamento de cio e tiveram os diâmetros dos folículos ovarianos mensurados
por ultrassonografia. Concentrações plasmáticas de progesterona foram mensuradas do D13 ao
D31 ou estro. Variáveis discretas foram analisadas por ANOVA considerando o efeito de tratamento
como variável independente. Variáveis contínuas foram analisadas por split-plot ANOVA,
considerando os efeitos de tratamento, animal, tempo e interações como variáveis independentes.
Foram aspirados 15±1,2 folículos por vaca, sendo o intervalo médio entre aspirações 1,5±0,1
dias. O diâmetro diário médio do maior folículo foi menor (P<0,01) para vacas do GA
(0,68±0,02mm) comparado com as do GC (0,88±0,02mm). O dia da luteólise foi similar entre
vacas dos GC e GA (19,9±0,4 vs. 19,5±0,3; P>0,1) enquanto o intervalo entre cios (21,1±1,3 vs.
31,4±1,2 dias; P<0,01) e o intervalo entre a luteólise e o cio (1,25±1,3 vs. 11,9±1,3 dias; P<0,01)
foi maior para as vacas do GA. O diâmetro do maior folículo no dia da luteólise foi maior para
as vacas do GC (0,97±0,05 vs 0,74±0,06mm; P<0,01). O número de dias do D15 ao D19 do
ciclo estral apresentando folículos >6mm foi menor para as vacas do GA (4,6±0,5 vs. 2,3±0,4;
P<0,01). O folículo ovulatório teve crescimento mais rápido no GA (interação tratamento x
tempo; P<0,05) mas o diâmetro do folículo ovulatório foi similar para ambos os grupos (1,08±0,1
vs. 1,07±0,1mm; P>0,1). Em sumário, a aspiração folicular reduziu o diâmetro folicular no
período peri-luteólise e alongou o ciclo estral, mas não retardou a luteólise. Especula-se que as
concentrações de E2 após as aspirações foram suficientes para desencadear a luteólise e a
manutenção de diâmetros foliculares inferiores a 6mm é necessária para retardá-la.
Agradecimentos: FAPESP, CNPq, Intervet, Centro Paulista de Desenvolvimento Farmacotécnico,
Prefeitura do Campus Administrativo de Pirassununga.
s274
DIMETIL-FORMAMIDA NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN OVINO
Fidelis, A.A.G.1; Polidoro, R.F.Q.1; Blume, H.1; Mondadori, R.G.1
1
Laboratório de Reprodução Animal, Departamento de Medicina Veterinária, UPIS -
Faculdades Integradas, SEPS EQ 712/912, Conjunto A, Brasília - DF, 70390-125.
mondadori@upis.br
O objetivo do presente experimento foi avaliar a eficácia de diferentes concentrações de dimetil-

formamida (DF) na criopreservação do sêmen ovino. O pool de sêmen utilizado no experimento
foi obtido de cinco carneiros SRD, com idade entre 2 e 4 anos, através da coleta com vagina
artificial. A coleta foi realizada duas vezes por semana, por duas semanas consecutivas,
correspondendo, cada coleta, a uma repetição do experimento. As frações do pool (0,5mL) foram
diluídas em cinco diferentes meios de congelação (1,5mL): (1) tris-gema com 5,3% de glicerol
(Controle); (2) tris-gema com 3% de DF (DF3); (3) tris-gema com 5% de DF (DF5); (4) tris-
gema com 7% de DF (DF7) e; (5) tris-gema com 9% de DF (DF9). Durante as diluições o sêmen
foi mantido em banho-maria a 30°C. Após a diluição, as amostras foram resfriadas por 2 horas
até 4ºC, sendo então envasadas em palhetas médias que eram submetidas ao vapor de nitrogênio
por 15 minutos, até atingir -60ºC quando foram submergidas em nitrogênio líquido. As palhetas
foram descongeladas à 37ºC/30 segundos, tendo permanecido, pelo menos, uma semana em
nitrogênio líquido. A motilidade progressiva e o vigor do sêmen foram avaliados em 4 momentos
distintos: logo após a formação do pool, após a diluição, após o resfriamento e após a
descongelação. Para avaliar a morfologia espermática, foram feitos esfregaços do pool antes da
diluição e após o descongelamento do sêmen. Os esfregaços corados com Vermelho do Congo
foram avaliados em microscopia ótica de contraste de fase com aumento de 1000X. Além disso,
após o descongelamento as amostras foram submetidas aos testes hipo-osmótico e de termo-
resistência (TTL - 5 horas a 37°C). Os resultados de motilidade, vigor e patologia espermática
foram transformados por raiz quadrada e avaliados, dentro dos diferentes momentos de
processamento, por análise de variância e a comparação entre as médias foi feita pelo teste de
Duncan. A motilidade progressiva e o vigor do pool de sêmen foram, respectivamente, de 85% e
4,75. Logo após a diluição e após o período de resfriamento, o grupo DF9 apresentou uma queda
estatisticamente significativa na motilidade progressiva e no vigor, demonstrando um possível
efeito tóxico da alta concentração de crioprotetor. Após o descongelamento, os grupos Controle
e DF3 apresentaram motilidade progressiva estatisticamente semelhante entre eles, e superior ao
DF9, já o vigor foi estatisticamente semelhante para todos os grupos, exceto o DF9. Os grupos
que estatisticamente apresentaram mais espermatozóides respondendo positivamente ao teste
hipo-osmótico foram o Controle, DF3 e DF7. Não foram observadas diferenças significativas
entre os morfologia espermática, demonstrando que os crioprotetores utilizados têm capacidade
semelhante de manter morfologia do espermatozóide. A motilidade progressiva analisada após o
TTL foi significativamente inferior nos grupos DF7 e DF9. Concluindo, os resultados revelam
que a DF pode ser utilizada como crioprotetor em sêmen ovino, sendo necessário mais estudos,
principalmente com concentrações inferiores a 5%.
s275
ESTRATÉGIAS ENVOLVENDO TRANSFERÊNCIA DE OOPLASTO PARA O

CONTROLE DA HERANÇA GENÉTICA CITOPLASMÁTICA EM EMBRIÕES
BOVINOS
Ferreira, C.R.1,2; Meirelles, F.V.2; Chiaratti, M.R.2; Perecin, F.1; Méo, S.C.1,3; Burgstaller, J.4;
Steinborn, R.4; Tetzner, T.A.D.1; Saraiva, N.Z.1; Landim Jr., L.P.1; Yamazaki, W.1;
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil, 2ZAB-FZEA - USP, Pirassununga-SP,
3
CPDGRA-IZ-APTA/SAA, Nova Odessa-SP, Brasil, Brasil. 4DPA, Universidade de Viena,
Áustria. christina.ferreira@posgrad.fcav.unesp.br
O controle da herança do DNA mitocondrial (mtDNA) pode auxiliar na terapia de doenças

mitocondriais humanas, na seleção de genes de interesse em produção animal e na preservação
do mtDNA de animais clonados. O objetivo deste trabalho foi avaliar duas estratégias inéditas,
que envolveram a transferência de ooplasto (TO), para o controle da herança de mtDNA durante
o desenvolvimento pré-implantação in vitro de embriões bovinos. Oócitos mtDNA B. taurus
obtidos de vacas abatidas e oócitos mtDNA B. indicus obtidos por aspiração folicular guiada por
ultra-sonografia foram maturados in vitro (MIV). Às 22h de MIV, os oócitos doadores de ooplasto
(mtDNA B. indicus) foram enucleados em MII e partenogeneticamente ativados (ionomicina
5μM/5min e 6-DMAP 2mM/4h). Para produzir zigotos (zig) receptores, oócitos mtDNA B. taurus
foram fecundados in vitro (FIV) durante 10-12h. Em seguida, os prováveis zig tiveram as células
do cumulus removidas e o 2o CP + citoplasma adjacente aspirados antes da introdução de ~10-
15% de ooplasto (grupo TO-Controle) no espaço perivitelínico, seguida de eletrofusão (2 pulsos
de 1,5kV/cm por 30μseg em solução de manitol 0,28M). Os embriões foram co-cultivados com
células do cumulus em SOF 2,5% SFB + 0,5% BSA. Com o objetivo de favorecer a replicação
do haplótipo de mtDNA introduzido (B. indicus), oócitos receptores foram expostos a 7µg/mL
de brometo de etídeo (EB) durante as 4h finais da MIV (grupo TO-EB); ou os zig receptores
foram centrifugados (10.000XG por 15 min) em presença de citocalasina B e tiveram o extrato
citoplasmático rico em mitocôndrias aspirado antes da transferência de 20-30% de ooplasto
(grupo TO-CENT). Embriões (zig e blastocistos– blx) foram analisados por PCR em tempo real,
utilizando-se sonda TaqMan em conjunto com “primers” específicos (para mtDNA B. indicus)
ou inespecíficos (para mtDNA total) para amplificação de parte do gene 16S (rRNA) do mtDNA.
Os dados foram submetidos à ANOVA considerando um delineamento inteiramente casualizado
de arranjo fatorial 3 x 2 e nível de significância de 5%. Houve manutenção da condição de
heteroplasmia no grupo TO-EB (média de 14,31% e 13,86%, para zig e blx, respectivamente) a
qual não diferiu do grupo TO-Controle (média de 14,41% e 13,20%, para zig e blx,
respectivamente). Quando comparada aos demais grupos, a estratégia TO-CENT aumentou
(p<0,05) a heteroplasmia nos zig (38,74%), porém não nos blx (19,47%). Entretanto, os blx do
grupo TO-CENT apresentaram padrões distintos de segregação para o mtDNA introduzido, com
a formação de um subgrupo com maior (4 blx, média de 32,6% de heteroplasmia) e outro com
menor heteroplasmia (5 blx, média de 9% de heteroplasmia). Pode-se concluir que a estratégia
TO-EB, em relação ao grupo TO-Controle, não foi eficaz no controle na herança de mtDNA. Por
outro lado, a estratégia TO-CENT aumentou a heteroplasmia em ~45% nos blx, reafirmando a
existência do mecanismo de gargalo genético do mtDNA nessa fase do desenvolvimento
embrionário.
Apoio financeiro: FAPESP 02/05054-7 e 04/01841-0.
s276
ESPERMATOZÓIDE BOVINO COMO VETOR DE TRANSGENE: INTERAÇÃO DO

DNA EXÓGENO E VIABILIDADE ESPERMÁTICA
Feitosa, W.B.1; Mendes, C.M.1; Milazzotto, M.P.1; Martins, E.A.L.2; Rocha, A.M.1;
Avanzo, J.L.3; Visintin, J.A.1; Assumpção, M.E.O.A.1
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ – USP. 2Centro de Biotecnologia – Instituto
Butantan. 3Departamento de Patologia Animal, FMVZ – USP. wfeitosa@usp.br
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tamanho, da concentração e da estrutura da

seqüência de DNA exógeno na indução de apoptose e necrose e na associação com
espermatozóides. Para avaliar o efeito do tamanho e da concentração da seqüência de DNA
exógeno foram utilizadas seqüências de aproximadamente 2,2; 5,5 e 8,5 kpb, nas concentrações
de 500ng ou 5 X 1011 moléculas. Para avaliação do efeito da estrutura do DNA exógeno foram
utilizadas três seqüências com aproximadamente 541pb, a primeira contendo 65,7% de AT
(seqüência AT), a segunda 46,4% de AT (seqüência intermediária - IN) e a terceira com 38,6% de
AT (seqüência GC). Para avaliação da apoptose e necrose, os espermatozóides, após a incubação
com as diferentes seqüências de DNA exógeno, foram incubados com 2ì L de Yo-pro (100ìM)
por 20 minutos, 10ìL de Iodeto de propídeo (6ì M ) por 10 minutos e analisadas no citômetro de
fluxo. Para avaliação dos índices de transfecção, os espermatozóides, após a incubação, foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose 2,5% para separar os espermatozóides das moléculas
de DNA exógeno livres, evitando falsos positivos. O DNA (endógeno e exógeno) foi extraído
pelo método de fenol clorofórmio. O índice de associação foi detectado pela PCR quantitativa
em tempo real. A quantidade de DNA exógeno associado aos espermatozóides dos diferentes
grupos foi estimada pela eficiência de amplificação (CT), normalizada pela equação da reta
obtida pela curva de amplificação padrão das diferentes seqüências, nas concentrações de 25;
2,5; 0,25; 0,025 e 0,0025ng. Os dados foram submetidos à análise de variância e comparados
pelo teste Tukey (p<0,05). Não foram observadas pela citometria de fluxo diferenças nas
quantidades de espermatozóides viáveis, em apoptose, em necrose e em necrose inicial e/ou
apoptose tardia quando incubados com as diferentes concentrações e seqüências de DNA exógeno.
Na concentração de 500ng, houve diferença na associação da seqüência de 5,5kpb (0,0745ng)
quando comparadas às de 2,2 (0,02917ng) e 8,5kpb (0,00717ng). Já na concentração de 5 x 1011
moléculas, a associação das seqüências de 2,2kpb (0,02883) e 5,5kpb (0,03383) diferiram da
seqüência de 8,5kpb (0,00250ng), que apresentou a menor associação. A estrutura da seqüência
também influenciou a associação do DNA com os espermatozóides, sendo observado maior
interação da seqüência AT (0,8165ng) comparadas à seqüência IN (0,0788ng) e GC. (0,1965ng).
Segundo a literatura, seqüências grandes de DNA exógeno apresentam vantagem na interação
com os espermatozóides em relação as menores. Porém, o presente trabalho é o primeiro a
demonstrar que a vantagem da utilização de seqüências maiores na interação com os
espermatozóides se transforma em desvantagem em relação à internalização do DNA exógeno
com o espermatozóide.
Suporte financeiro FAPESP 03/10234-7 e 03/07456-8
s277
RESPOSTA OVARIANA DURANTE A SUPEROVULAÇÃO PRECEDIDA PELA

EMERGÊNCIA DA ONDA FOLICULAR INDUZIDA POR ASPIRAÇÃO DOS
FOLÍCULOS EM ÉGUAS CÍCLICAS
Orlandi, C.1; Bergfelt, D.R3; Wechsler, F.S.2; Nogueira, G.P.4; Puoli Filho, J.N.P.2; Meira, C.1
1
Depto. Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, 2Depto. Produção Anima l- FMVZ
Unesp /Botucatu SP., 3Repro-Endo-Tox, Ashburn, VA. 4Depto. Apoio, Produção e Saúde
Animal FO Unesp/Araçatuba, SP
O presente estudo teve por objetivo determinar o melhor momento para se iniciar o tratamento com
gonadotrofina (extrato de pituitária eqüina: EPE) em éguas, em relação ao momento esperado do
desvio folicular (maior folículo aproximadamente 23 mm). A expectativa foi reduzir o número de
dias de tratamento e verificar a resposta ovariana com início dos tratamentos antes, durante ou após
o desvio folicular. No décimo dia após a ovulação, as éguas foram submetidas à aspiração de todos
os folículos ≥8mm por meio da ultra-sonografia trans-vaginal, sendo distribuídas ao acaso em quatro
grupos tratados e um controle. Em 19 éguas, os ciclos estrais de um mesmo animal foram tratados
sucessivamente com interrupção de um ciclo sem tratamento, perfazendo um total de 31 ciclos.
Quando o maior folículo da onda induzida atingiu e”13 mm (EPE-13, n=6 ciclos), e”20 mm (EPE-
20, n=5 ciclos), e”23 mm (EPE-23, n=7 ciclos) ou e”26 mm (EPE-26, n=6 ciclos), deu-se o início
ao tratamento com EPE, 12,5 mg, IM a cada 12 horas. Correspondentemente, um grupo controle
com folículos aspirados, n=7 recebeu solução salina (0,9% NaCL, IM) com intervalos de 12 horas
quando o maior folículo da onda induzida atingiu e”13 mm. Após 12 horas do início dos tratamentos
com EPE ou salina, todas as éguas receberam dose única de 7,5 mg de PGF (Dinoprost-trometamina).
Quando a maioria dos folículos alcançou e”32 mm, os tratamentos com EPE ou salina foram
interrompidos e ao atingirem diâmetro e”35 mm, a ovulação foi induzida com 2,500 UI de hCG i.v.
(Vetecor®, Barcelona, Spain). A resposta ovariana foi avaliada por meio de ultra-sonografia diária a
partir da aspiração folicular até a detecção das ovulações. Os dados foram analisados pelo SAS Proc
Mixed, sendo submetidos à ANOVA, Tukey-Kramer e teste Exato de Fisher. Os valores médios e as
proporções para as variáveis nos respectivos grupos controle, EPE-13, EPE-20, EPE-23 e EPE-26
foram, 1) Número de folículos ≥30 mm: 1,1a; 1,6 ab; 1,8 ab; 2,1b e 1,2a; 2) Número de ovulações: 1,1a;
1,6 ab; 1,8 ab; 2,1b e 1,2a; 3) Proporções de éguas com ≥2 ovulações: 14%a; 50%a; 60%a; 71%b e 16%a;
4) Número de dias em tratamento: 5,5a; 5,5a; 3,8 ab; 2,7b e 2,4b Valores médios e proporções com
letras diferentes sobrescritas para uma mesma variável diferem (Pd”0,05). Os resultados indicam
um maior número de folículos ≥30mm e ovulações por ciclo assim como um maior número de
ciclos com ≥2 ovulações, quando o diâmetro médio do maior folículo ao início do tratamento foi de
23,5 mm comparado ao controle ou EPE iniciando-se quando os maiores folículos atingiram em
média: 14,3; 13,6; 20,8 ou 26, 9 mm nos respectivos grupos. Apesar do menor tempo de tratamento
requerido por égua nos grupos EPE-23 e EPE-26 quando comparado aos demais grupos, o início do
tratamento na presença de folículos ≥26mm resultou em uma redução significativa na resposta
ovariana ao tratamento. Os resultados indicam que o melhor momento para o início do tratamento
superovulatório em uma onda induzida por aspiração folicular com menor período de tratamento é
quando o maior folículo atinge aproximadamente 23mm, antes ou durante o momento esperado do
desvio folicular, evitando desta maneira a influência negativa da dominância folicular sobre a resposta
superovulatória.
Apoio: FAPESP/ CAPES
Agradecimentos: Laboratórios Hertape Calier do Brasil e Shering-Plough
s278
CULTIVO DE EMBRIÕES CLONES BOVINOS PRODUZIDOS A PARTIR DE

DIFERENTES CÉLULAS DOADORAS EM SISTEMA WOW MODIFICADO
Feltrin, C.2; Forell, F.2; Arruda, N.S.2; Silva, D.S.2; Queiroz, L.M.V.1; Peixer, M.A.S.1; Malard,
P.F.1; Santana, G.M.1; Rodrigues, J.L.2
1
BIO Biotecnologia Animal, CEP 71.735-505, Brasília, DF, Brasil, 2Laboratório de
Embriologia e Biotécnicas de Reprodução, FAVET, UFRGS CP 15004, CEP 91501-970,
Porto Alegre, RS, Brasil – cristianofeltrin@terra.com.br
O objetivo deste experimento foi comparar o desenvolvimento in vitro de embriões clones bovinos
produzidos com a técnica de “Handmade Cloning”, a partir de células-tronco mesenquimais
encontradas no tecido adiposo e de células somáticas bovinas, cultivados no sistema “well of the
well” (WOW) modificado (Feltrin et al. 2006, Reprod. Fertil. Dev. 18: 126). Em oito replicações,
mil e trezentos oócitos bovinos foram selecionados após a escarificação da córtex de ovários
provenientes de abatedouro e maturados in vitro durante 19 horas, em TCM199 suplementado
com 10% de SVE, 0,5 μg/mL de FSH e 0,03UI de hCG, à 39°C, em atmosfera úmida contendo
5% CO2 em ar. Após a remoção das células do Cumulus oophorus, os oócitos em MII (969)
foram transferidos para gotas, sob óleo mineral, de SOF modificado, suplementado com hepes
(25mM) e 0,4% de BSA à 37ºC. Os oócitos tiveram a zona pelúcida digerida pela exposição a
uma solução contendo enzimas (Pronase E), sendo em seguida divididos manualmente, expostos
à luz ultra-violeta após incubação em 10 μg/mL bisbenzimide (Hoechst 33342), para identificação
e descarte da metade contendo material nuclear. As metades selecionadas e a célula doadora
eram então transferidas para uma solução contendo fitohemoaglutinina (500μg/mL) para serem
reconstruídas. Finalmente fusionou-se os complexos oócitos receptores-núcleos doadores
(CRNDs) com o auxílio de uma câmara de eletrofusão. A indução da ativação foi realizada pela
exposição à 5μM de ionomicina (5 min) e 2mM de 6-DMAP (3h e 30min). O cultivo in vitro foi
realizado em meio SOFaa com 10% de SVE, à 39ºC, em atmosfera úmida contendo 5% CO2, 5%
O2 e 90% N2. A taxa de clivagem foi avaliada 48hs após o início do cultivo e a de desenvolvimento
embrionário no 7º dia de cultivo. No cultivo in vitro os CRNDs foram divididos em três grupos:
1) Poço convencional (WOW, Vajta et al. 2000, Mol. Reprod. Dev. 55:256-264), célula somática
(controle); 2) Poço modificado, célula somática (PMCS); 3) Poço modificado, célula-tronco
(PMCT). Os dados de clivagem e desenvolvimento embrionário foram submetidos à análise
estatística pelo teste do chi-quadrado. Como controle do experimento (grupo 1) foram cultivados
98 CRNDs, dos quais 68 (69,3%) clivaram e 19 (19,3%) alcançaram o estádio de blastocisto. No
grupo PMCS, a taxa de clivagem foi de 81,4% (79/97) e a taxa de blastocisto foi de 32,9% (32/
97). No grupo PMCT, em que as células-tronco foram utilizadas na transferência nuclear, dos
108 CRNDs colocados em cultivo, 85 (78,7%) clivaram e 24 (22,2%) alcançaram o estádio de
blastocisto. A técnica de cultivo em WOW, convencional e modificada, possibilitou a observação
de taxas de clivagens semelhantes nos três grupos experimentais. Entretanto, o desenvolvimento
embrionário foi significativamente superior no grupo PMCS, quando comparado ao controle
(P<0,05). Por outro lado, o número de blastocistos observados no grupo das células-tronco não
diferiu do grupo controle nem do grupo das células somáticas mantidas em poços modificados.
Sendo assim, as modificações realizadas no poço de cultivo proporcionaram uma maior eficiência
na produção de embriões clones a partir de células somáticas.
Apoio: Cnpq
s279
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES MICROINJETADOS COM O GENE G-CSF

HUMANO PARA PRODUÇÃO DE CAPRINOS TRANSGÊNICOS NO BRASIL
Avelar, S.R.G.1; Moura, R.R.1; Silva, J.D.A.1; Pereira, A.F.1; Almeida, A.P.1; Andrade, M.L.L.;
Cajazeiras, J.B.; Teixeira, D.I.A.1; Lopes Júnior, E.S.1; Dias, L.P.B.2; Andreeva, L.E.2; Serova,
I.A.2; Serov, O.2; Freitas, V.J.F.1
1
Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução (LFCR), Universidade Estadual do
Ceará, 60.740-000, Fortaleza-CE, Brasil. 2 Laboratório de Biotecnologia Animal, Instituto de
Biofísica/UFRJ, 21.941-590, Rio de Janeiro-RJ, Brasil. vjff@uece.br
A produção de proteínas de interesse farmacêutico no leite de caprinos transgênicos é uma

alternativa atraente aos biorreatores convencionais. Portanto, a fim de produzir caprinos
transgênicos para o G-CSF (Fator Estimulante de Colônia de Granulócitos) humano, utilizou-se
24 cabras da raça Saanen, como doadoras e 48 cabras sem raça definida, como receptoras de
embriões microinjetados com esta construção de DNA. Todas as fêmeas foram submetidas à
sincronização do estro pelo uso de esponjas intravaginais impregnadas com 60 mg de MAP
(Progespon, Buenos Aires, Argentina), durante 10 dias. No oitavo dia do tratamento foi iniciada
a superovulação das cabras Saanen, administrando 200mg de pFSH (Folltropin, Ontario, Canadá)
em intervalos de 12 horas (50/50, 25/25 e 25/25mg). Trinta e seis horas após a retirada da
esponja, as doadoras receberam 100 mg de GnRH (Fertagyl, Boxmeer, Holanda). Nas receptoras,
foi realizada a aplicação intramuscular de 30UI de eCG (Novormon, Buenos Aires, Argentina)
48 horas antes da retirada da esponja. As cabras Saanen foram cobertas por monta natural, a qual
foi realizada às 36 h e 48 h após a retirada da esponja. A resposta ovariana foi avaliada por
laparoscopia. Assim, as cabras Saanen e sem raça definida que apresentaram pelo menos uma
ovulação foram submetidas, respectivamente, à colheita e à transferência de embriões por
laparotomia. As estruturas recuperadas, por colheita ovidutária, foram avaliadas sob
estereomicroscópio (Nikon SMZ-800, Kawasaki, Japão). Os zigotos foram transferidos para
placas com meio M2, selecionados, centrifugados e submetidos a microinjeção com 500 a 1000
cópias da construção para o G-CSF humano. A microinjeção foi realizada no pró-núcleo masculino
em microscópio invertido (Nikon TE-2000U, Kawasaki, Japão) munido com óptica Nomarski e
micromanipulador (Narishige, Tóquio, Japão). Com relação à transferência de embriões, as
receptoras receberam de três a nove embriões por via ovidutária. O diagnóstico de gestação foi
realizado aos 30 dias após a transferência, por ultra-sonografia. O índice de superovulação foi
de 95,8% e o de ovulação de 19,3 ± 1,7. Com relação à produção embrionária, o índice de
recuperação total foi de 81%, sendo que 86,6% das estruturas recuperadas estavam fecundadas.
Dentre as estruturas fecundadas, 71,6% estavam no estádio de uma célula (ideal para microinjeção)
e 28,4% no estádio de duas células. Foram microinjetados 117 embriões. Dentre as receptoras,
56,3% ovularam, apresentando média de 1,3 ± 0,2 ovulação/cabra. O índice de gestação foi de
37% (10/27). O método de produção in vivo de embriões mostrou ser eficiente para a microinjeção
embrionária em programa de transgênese. O índice de gestação mostrou ser similar ao da literatura
internacional. Os partos estão previstos para o mês de julho e se forem confirmados transgênicos
representará grande avanço para o programa de transgênese caprina no Brasil.
s280
AFERIÇÃO DE ECOGENICIDADE LUTEAL COM O USO DE DIFERENTES

TRANSDUTORES DE ULTRA-SOM
Siqueira, L.G.B.1; Viana, J.H.M.2; Diniz, E.S.2; Camargo, L.S.2; Amorim, L.S.1; Fonseca, J.F.3;
Fernandes, C.A.C.4; Torres, C.A.A.1
1
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG 36571-000; 2Embrapa Gado de Leite, Juiz
de Fora, MG 36038-330; 3Embrapa Caprinos, Sobral, CE 62011-970; 4Biotran Ass. e
Consult. em Reprodução Animal Ltda, Alfenas, MG 37130-000; luizvet10@hotmail.com
O advento da ultra-sonografia tornou possível o monitoramento seqüencial do desenvolvimento

do corpo lúteo (CL) pela sua identificação e mensuração de tamanho e densidade. A ecotextura
luteal é um importante parâmetro de avaliação, pois reflete o fluxo sangüíneo e, indiretamente, a
produção de progesterona. Contudo, sua avaliação, geralmente feita visualmente, está sujeita a
erros devido à subjetividade e à falta de sensibilidade para identificar pequenas variações de
tonalidade. A análise computacional de imagens é baseada na identificação, quadro a quadro
(pixel), da intensidade do retorno da onda ultra-sonográfica, refletida pela escala de cinza gerada
na imagem, e pode ser aplicada na avaliação da ecotextura do corpo lúteo. Contudo, ainda não
foi definida uma metodologia para obtenção, digitalização e processamento das imagens.
Objetivou-se comparar dois métodos de obtenção de imagens para análise de ecotextura luteal.
Novilhas mestiças Holandês-Zebu (n=10) com 20-27 meses de idade, tiveram o estro sincronizado
com dispositivo intravaginal impregnado com progesterona (CIDR®) e aplicação de cloprostenol
sódico. Foram realizadas avaliações ultra-sonográficas dos ovários diariamente após a
manifestação de estro, com um aparelho portatil (Aloka SSD 500, Aloka Co.) acoplado a um
transdutor linear de 5Mhz, via transretal (TR), e com um transdutor setorial 5Mhz, via transvaginal
(TV). As imagens dos corpos lúteos foram gravadas em fitas VHS e posteriormente digitalizadas
com placa de captura de vídeo (Pinnacle DC10, Pinnacle Systems) e salvas em arquivos de
extensão TIFF. Com auxílio de um software especifico, foram analisadas imagens adquiridas
pelas vias TR e TV nos dias 3 (metaestro), 6 (diestro inicial) e 10 (diestro) do ciclo estral, usando
uma escala de 256 tons de cinza (0 a 255). Houve uma correlação significativa entre os valores
obtidos pelas vias TR e TV (r = 0,5408; P<0,01), com um aumento linear na ecogenicidade do
tecido luteal em função do dia (Y=6,01x + 58,50; R2=0,96). A via TV resultou em valores médios
mais elevados de ecogenicidade, porém só foi observada diferença (P<0,05) no D6 (D3:
59,97±12,73a vs. 67,56±10,96a; D6: 65,35±13,50a vs. 81,34±14,11b; D10: 71,08±15,83a vs.
80,48±13,20a para as vias TR e TV, respectivamente). A menor ecogenicidade obtida pela via TR
pode estar associada à atenuação das ondas ultra-sonográficas ocorrida durante o exame retal,
em função da menor proximidade entre o transdutor e o corpo lúteo. Conclui-se que a via de
obtenção das imagens ultra-sonográficas deve ser considerada na análise dos valores obtidos
quando da avaliação da ecotextura luteal.
s281
SINCRONIZAÇÃO DE ESTRO E DA OVULAÇÃO, NAS TAXAS DE CONCEPÇÂO

E PRENHEZ EM VACAS LACTANTES DA RAÇA NELORE1
Nascimento, V.A.2; Torres, C.A.A.3; de Oliveira, M.M.N.F.4; Logrado, M.L.5; Viana, J.H.M.6;
da Costa, E.P.7; Sousa, K.R.S.5; Carneiro, C.8; Oliveira, F.A.9
1
Parte da dissertação de Mestrado do primeiro autor, financiada pela CAPES, 2 Doutorando do
DZO/UFV, 36571-000, Viçosa–MG, Brasil, 3 Professor do DZO/UFV, 36571-000, Viçosa–
MG, Brasil, 4 Professora do DZO/UFVJM, Diamantina-MG, Brasil, 5 Mestranda do DZO/UFV,
36571-000, Viçosa–MG, Brasil, 6 Pesquisador da EMBRAPA-CNPGL, Juiz de Fora-MG,
Brasil, 7 Professor do DVT/UFV, 36571-000, Viçosa–MG, Brasil, 8 Estudante de Zootecnia/
UFVJM, Diamantina-MG, Brasil, 9 Estudante de Medicina Veterinária/UFV- 36571-000,
Viçosa–MG, Brasil, vinicioaraujo@vicosa.ufv.br
A detecção de estro é o principal fator que influencia a inseminação artificial (IA) em bovinos.
Protocolos com o uso de dispositivos intravaginais de progesterona (LAMB et al. Journal Animal
Science, v.79, p.2253-2259) e do Benzoato de Estradiol (BE), substituindo GnRH, apresentam
taxas de prenhez satisfatórias e reduz custos. A aplicação de eCG, associada à PGF2α melhora o
desenvolvimento folicular (BARUSELLI et al. Theriogenology, v.59, p.214). Objetivou-se
verificar a eficiência de protocolos hormonais para Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF)
em vacas Nelore no pós-parto, e se peso (PV) e condição corporal (CC) influenciam a fertilidade.
O estudo foi realizado com 120 vacas Nelore lactantes, distribuídas ao acaso em três tratamentos:
T1 – inserção de um dispositivo intravaginal de progesterona (DIB®, Argentina) mais aplicação
(im) de 2 mg de BE (RIC BE®, Argentina) no dia 0, retirada do DIB no dia 8 e aplicação, im, de
300 UI de eCG (Novormon®, Argentina) mais 0,15 mg de PGF2α (Prolise®, Argentina), e a IA
realizada 48 horas após a retirada do DIB, simultânea a aplicação, im, de 25 mg de Lecirelina
(Gestran Plus®, Argentina); T2 - similar ao T1, sendo administrado 1 mg de BE, im, no dia 9,
substituindo a segunda dose de GnRH, e a IA realizada 50-56 horas após a retirada do DIB; T3 –
inseminação 12 a 18 horas após a detecção de estro, induzido por PGF2α. Na inserção do
dispositivo, as vacas foram pesadas, a CC determinada (escala de um a nove) e a ciclicidade dos
animais foi checada por exames de ultra-som pela presença de corpo lúteo. Na análise estatística,
utilizou-se o programa SAEG 8.0 a 5% de probabilidade e comparação de médias pelo teste de
Duncan. As variáveis qualitativas foram submetidas ao Teste do Qui-quadrado. A taxa de
concepção (vacas prenhes/inseminadas) das vacas do T2 e T3 foi superior (P<0,05) à taxa de
concepção das vacas do T1. A taxa de prenhez (vacas prenhes/total de vacas do tratamento) foi
53,2% (T1 e T2 = 52,25%, T3 = 55,0%), com maior taxa de prenhez para T2 (P<0,05).
Considerando as variáveis PV, dias no pós-parto e CC, não houve diferença (P>0,05) entre os
tratamentos. Por não haver influência da CC na taxa de prenhez entre os animais, os resultados
contrapõem aos de MOREIRA et al. (Theriogenology, v.53, p.1305-1319). As taxas de prenhez
de vacas cíclicas dos tratamentos 2 e 3 foram maiores (P<0,05) que as do T1. As vacas em
anestro de T1 e T2 (4 e 10 vacas, respectivamente) mostraram taxa de prenhez satisfatória (50 e
70%, respectivamente), corroborando os resultados obtidos por GEARY et al. (Journal of Animal
Science, v.76, p.1523-1527). As vacas do T2 e T3 apresentaram taxa de prenhez superior às
vacas do T1 quanto à ordem de parto (P<0,05). Com a utilização dos protocolos de IATF obteve
resultados satisfatórios semelhantes aos conseguidos por IA com detecção de estro e o anestro
pós-parto foi controlado com o emprego dos protocolos de sincronização da ovulação.
* Agradecimentos à empresa Tecnopec pela colaboração.
s282
EFICIÊNCIA DE PROTOCOLOS DE SINCRONIZAÇÃO DA OVULAÇÃO EM

VACAS DA RAÇA NELORE EM REGIÕES GEOGRÁFICAS DISTINTAS1
Nascimento, V.A.2; Torres, C.A.A.3; de Oliveira, M.M.N.F.4; de Oliveira, R.F.M.3;

Mourão, L.L.5; da Silva, A.F.6
1
Parte da dissertação de Mestrado do primeiro autor, financiada pela CAPES, 2 Doutorando do
DZO/UFV, 36571-000, Viçosa-MG, Brasil, 3 Professor do DZO/UFV, 36571-000, Viçosa–MG,
Brasil, 4 Professora do DZO/UFVJM, Brasil, 5 Mestranda do DZO/UFV – 36571-000 – Viçosa –
MG; 6 Médica Veterinária, mestre em Reprodução Animal pelo DVT/UFV,
vinicioaraujo@vicosa.ufv.br
O emprego da Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) mostra resultados variados

e as condições climáticas podem interferir. A zona térmica ótima para Bos taurus indicus é de 10
a 26,5°C e a homeotermia é alterada a partir dos 35°C (MÜLLER, P.B.; Bioclimatologia aplicada
aos animais domésticos. 2 ed., 1982). A sensação de conforto térmico está relacionada com a
umidade do ar (Índice de Temperatura e Umidade - ITU) e ITU superior a 72 indica estresse
térmico para rebanhos leiteiros (MACHADO, et al. 1998. SIMPÓSIO DE AMBIÊNCIA NA
PRODUÇÃO DE LEITE, p.179-188). Objetivou-se verificar a eficiência de protocolos hormonais
para IATF em vacas Nelore no pós-parto em regiões geográficas distintas. Foram utilizadas 75
vacas em uma fazenda (L1) no Estado de Minas Gerais e 45 (L2) no Estado de Goiás distribuídas
ao acaso e igualmente em três tratamentos: T1 – inserção de dispositivo intravaginal de
progesterona (DIB®, Argentina) mais aplicação (im) de 2 mg de benzoato de estradiol (RIC BE®,
Argentina) no dia 0, retirada do DIB no dia 8 e aplicação, im, de 300 UI de eCG (Novormon®,
Argentina) mais 0,15 mg de PGF2α (Prolise®, Argentina), e a IATF realizada 48 horas após a
retirada do DIB, simultânea a aplicação, im, de 25 mg de Lecirelina (Gestran Plus®, Argentina);
T2 – similar ao T1, sendo administrado 1 mg de BE, im, no dia 9, substituindo a segunda dose de
GnRH, e a IATF realizada 50-56 horas após a retirada do DIB; T3 – as vacas foram inseminadas
12 a 18 horas após a detecção de estro induzido por uma injeção, im, de PGF2α, determinada com
auxílio de rufião. A temperatura ambiente foi monitorada por 12 horas a cada duas horas, de
07:00 às 19:00 horas, sendo verificada a temperatura de máxima e mínima às 7:00 horas. Mediu-
se a temperatura de globo negro para cálculo de Índice de Temperatura de Globo e Umidade
(ITGU), de bulbo seco (Bs) e de bulbo úmido (Bu) para calcular o ITU: ITU = 0,72 (TBs + Tbu)
+ 40,6. No L1, as vacas de T2 e T3 apresentaram taxa de prenhez (vacas prenhes/total de vacas
do tratamento) superior às vacas de T1. No L2, as vacas de T2 exibiram taxa de prenhez inferior
(P<0,05) às de T1 e T3. Variações nos fatores climáticos afetam o ambiente ao alterarem as
trocas de calor entre animal e ambiente, podendo levá-los ao estresse, comprometendo a fertilidade
(GWAUDAUSKAS et al. Theriogenology, v.16, p.271-285). Observou-se que as vacas, nos dois
locais, permaneceram na zona de conforto térmico, exceto em certo período da tarde em L2.
Todavia, não se observou comprometimento por não atingir a temperatura máxima da zona
termoneutra. Os protocolos T1 e T2 apresentaram resultados satisfatórios, semelhantes aos obtidos
por IA com detecção natural de estro em ambientes diferentes. A eficiência reprodutiva em reposta
aos protocolos de sincronização de estro e da ovulação de vacas zebuínas em zona de conforto
térmico ou no limiar da termoneutralidade não é afetada em regiões de clima tropical semi-
úmido e tropical quente e seco.
* Agradecimentos à empresa Tecnopec pela colaboração.
s283
EFEITO DO ESTRESSE CALÓRICO MATERNO SOBRE A QUALIDADE E

COMPETÊNCIA IN VITRO DE OÓCITOS Bos indicus
Torres-Júnior, J.R.S.1; Pires, M.F.Á.2; Sá, W.F.2; Ferreira, A.M.2; Viana, J.H.M.2;
Camargo, L.S.A.2; Ramos, A.A.2; Folhadella, I.M.2; Polisseni, J.2; Freitas, C.2;
Clemente, C.A.A.2; Sá Filho, M.F.1; Souza, A.H.1; Martins, C.M.1; Baruselli, P.S.1
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ/USP, São Paulo-SP; 2Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária, EMBRAPA Gado de Leite, Juiz de Fora-MG. barusell@usp.br
Dez vacas da raça Gir foram alocadas em sistema tie-stall por um período adaptativo de 28 dias
(Fase I/ pré-experimental/ dias -28 a -1), tendo sido submetidas a duas sessões de OPU (dias -14 e -
7 ). Na Fase II (fase experimental/ dias 0 a 28) os animais foram divididos em Controle (GC/n=5) e
Estresse (GE/n=5). O GC permaneceu em normotermia, enquanto que o GE foi submetido a estresse
calórico em câmara climática com temperatura e umidade controladas [38°C e 80% UR (DIA);
30°C e 80% UR (NOITE)], por 28 dias, procendendo-se, nesta fase, cinco sessões de OPU/fêmea/
grupo. Na Fase III (pós-experimental/ dias 28 a 147) todas as fêmeas retornaram à normotermia
(ambiente), sendo realizadas mais 17 sessões de OPU/fêmea/grupo. No momento de cada sessão de
OPU (1x/semana), com auxílio de um ultra-som (Scanner 200s) equipado com transdutor setorial
intravaginal de 7,5 MHz, foram aferidas a população folicular e o diâmetro (Ø) dos dois maiores
folículos. Em seguida, todos os folículos com Ø ≥ 3mm foram puncionados e os oócitos obtidos
foram avaliados morfologicamente, selecionados, maturados, fertilizados e cultivados por sete dias
para avaliação das taxas de produção embrionária in vitro. As variáveis foram analisadas quanto à
normalidade dos resíduos, sendo transformadas quando necessário e comparadas por ANOVA e
pelo teste de Qui-quadrado. Adotou-se nível de significância de 5%. Um animal foi excluído do GE
após a sexta sessão, permanecendo 125 vs. 107 sessões de OPU para os grupos GC e GE
respectivamente. Houve interação entre número de folículos visualizados, oócitos recuperados e
sessão de OPU. As médias para os grupos GC vs. GE nas Fases I, II e III foram respectivamente:
Folículos visualizados: Fase I, 25,5±2,5 vs. 28,5±2,8; Fase II, 24,2±1,1 vs. 24,0±1,9; Fase III,
15,3±0,6 vs. 15,80,8; Folículos <6mm: Fase-I,23,9±2,4 vs. 26,9±3,1; Fase-II, 22,6±1,1 vs. 22,1±2,0;
Fase-III, 13,8±0,7 vs. 13,6±0,8); Folículos de 6-9 mm: Fase-I, 0,5±0,2 vs. 0,5±0,2; Fase-II, 0,5±0,1
vs. 0,4±0,1; Fase-III, 0,5±0,1 vs. 0,6±0,1; Folículos >9mm: Fase-I, 1,1±0,2 vs. 1,0±0,4; Fase-II,
1,0±0,2 vs. 1,5±0,1; Fase-III, 1,0±0,1b vs. 1,6±0,1a; Ø maior folículo: Fase-I, 12,1±1,5 vs. 11,1±1,7;
Fase-II, 13,3±0,8 vs. 13,0±0,6; Fase-III, 11,4±0,4b vs. 14,0±0,4a; Ø 2°maior folículo: Fase-I, 6,2±1,3
vs. 6,0±1,2; Fase-II, 5,9±0,6 vs. 7,1±0,8; Fase-III, 6,3±0,3b vs. 8,70,5a; Número de oócitos
recuperados por vaca/sessão: Fase-I, 11,2±2,8 vs. 14,3±2,5; Fase-II, 9,6±1,0 vs. 11,0±1,3; Fase-
III, 8,6±0,7 vs. 7,9±0,6; Número de oócitos viáveis por vaca/sessão: Fase-I, 7,3±2,1 vs. 10,8±1,8;
Fase-II, 6,6±1,0 vs. 7,5±1,0; Fase-III, 5,2±0,6 vs. 4,6±0,4; Taxa de oócitos viáveis: Fase-I, 69/
112(61,6%)b vs. 108/143(75,5%)a; Fase-II, 164/241(68%) vs. 172/265(64,9%); Fase-III, 426/
712(59,8%) vs. 305/535(57,0%); Taxa de clivagem: Fase-I, 44/59(74,5%) vs. 87/105(82,9%); Fase-
II, 72/101(71,3%) vs. 74/121(61,2%); Fase-III, 226/317(71,3%) vs. 159/230 (69,1%)]; Número de
embriões produzidos por vaca/sessão: Fase-I, 2,1±1,1 vs. 4,1±1,0; Fase-II, 0,4±0,3 vs. 0,5±0,3;
Fase-III, 0,9±0,2a vs. 0,4±0,1b e; Taxa de blastocistos: Fase-I, 16/59(27,1%) vs. 33/105(31,5%);
Fase-II, 11/31(35,5%) vs. 13/52(25,0%); Fase-III, 76/279(27,2%)a vs. 25/ 188(13,3%)b. O estresse
calórico materno ocasionou diminuição significativa na produção de embriões em doadoras Bos
indicus, sobretudo na fase de 28 a 147 dias pós-estresse. Além disso, o efeito mecânico prolongado
de sucessivas aspirações foliculares pode interferir no número de folículos visualizados e oócitos
recuperados.
FAPESP (processo 04/06096-0)
s284
ÉPOCA DE PARIÇÃO DE NOVILHAS NO ESCORE DE CONDIÇÃO CORPORAL E

NA RESPOSTA A PROTOCOLO DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO
FIXO
Meneghetti, M.1; Losi, T.C.2; Vilela, E.R.2; Martins Jr., A.P.2; Vilela Neto, J.M.2;
Vasconcelos, J.L.M.1
1
DPA–FMVZ-UNESP, Botucatu-SP, 2Lageado Consultoria Agropecuaria, Mineiros-GO,
Brasil, vasconcelos@fca.unesp.br
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da época de parição no escore de condição corporal
(ECC) no início de estação de monta (EM) e na resposta a protocolo de inseminação artificial em
tempo fixo (IATF) em vacas primíparas de corte. No experimento 1 foi avaliado o efeito da
época do parto na alteração do ECC pré e pós-parto em 87 novilhas Nelore e 68 ½ sangue Red
Angus x ½ sangue Nelore, que foram inseminadas em datas diferentes para parir de forma
distribuída nos meses de setembro a dezembro. O ECC foi avaliado mensalmente no pré e pós-
parto desses animais de junho a fevereiro. No experimento 2, foram utilizadas 538 primíparas de
duas fazendas (60 Nelore e 123 ½ sangue Red Angus na fazenda 1 e 355 Nelore na fazenda 2),
entre 33 e 104 DPP e parto entre setembro a dezembro. As vacas foram sincronizadas com o
protocolo: inserção do dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR ®, Pfizer, 1,9 g de
progesterona) novo ou pré-utilizado por 9 ou 18 dias), junto à inserção do CIDR® foi feita aplicação
de estrógeno (2,0 mg de Benzoato de Estradiol, Estrogin®, Farmavet, i.m.), após sete dias (dia 7)
foi aplicado PGF2a (12,5 mg de Dinoprost, Lutalyse®, Pfizer, i.m.). No dia 9 foi retirado o
CIDR®, os bezerros foram removidos das mães e aplicado 0,5 mg de Cipionato de Estradiol
(E.C.P.®, Pfizer, i.m.). Todos os animais foram inseminados 46 a 52 horas após a retirada do
CIDR®. Após a inseminação dos animais, os bezerros retornaram com suas mães. Apenas nos
animais da fazenda 2 foi avaliada a taxa de sincronização, por dois exames de ultra-som (Aloka
SSD-500, 5,0 MHz) e determinada de acordo com a presença e ausência de folículo dominante
no momento da IATF e 48 horas após. O diagnóstico de gestação foi feito por ultra-som 28 dias
após a IATF. A análise estatística do experimento 1 foi feita no PROC MIXED e do experimento
2 no PROC LOGISTIC do SAS. No experimento 1 o mês de parição teve efeito (p<0,001) na
dinâmica do ECC ao longo dos nove meses do período experimental, os animais com parto nos
meses de setembro e outubro apresentaram redução mais acentuada no ECC do que aqueles com
parto em novembro e dezembro. No experimento 2 houve tendência (p=0,07) do ECC influenciar
a sincronização ao protocolo, os animais com melhor ECC tiveram maior taxa de sincronização.
O ECC teve efeito linear (p<0,0001) sobre a taxa de concepção, mostrando melhora na taxa de
concepção proporcional ao aumento no ECC. Não foi observado efeito de raça ou de fazenda na
taxa de concepção. A taxa de concepção das vacas efetivamente sincronizadas foi de 58,9% (99/
168) e não foi verificado efeito de qualquer variável. Estes dados mostram a importância dos
animais apresentarem bom ECC no momento da IATF e para se conseguir isto não se deve
antecipar a parição das novilhas de corte. Palavras-chave: primíparas, escore de condição corporal,
IATF
s285
EFEITO DO TRATAMENTO COM PROGESTERONA E/OU 17â-ESTRADIOL

ANTES DA INDUÇÃO DA OVULAÇÃO NA DURAÇÃO DO SUBSEQÜENTE
CORPO LÚTEO EM VACAS NELORE EM ANESTRO
Sá Filho, O.G.; Dias, C.C.; Vasconcelos, J.L.M.
DPA-FMVZ-UNESP, Botucatu-SP, 18.610-000, Brasil. vasconcelos@fca.unesp.br
O objetivo deste experimento foi avaliar o efeito do pré-tratamento com progesterona (P4) e/ou
17â-estradiol (E2) na incidência de ciclos curtos após a indução da ovulação com remoção de
bezerros (54h) e GnRH em vacas Nelore em anestro. Vacas Nelore em anestro (avaliadas por 2
exames ultrassonográficos 8 dias aparte; 43,5±11,9 DPP; n=114) foram aleatoriamente designadas
a receber um dos 4 tratamentos (delineamento 2x2 fatorial): Grupo Controle - Remoção de
bezerros (RB) por 54 horas e injeção i.m. de 1mL de óleo de caroço de algodão (placebo) 48
horas após o início da RB; Grupo E2 - RB por 54 horas e injeção i.m. de 1mg de 17â-oestradiol
(1mg/mL preparado em solução oleosa pelo Centro Paulista de Desenvolvimento Farmacotécnico)
48 horas após o início da RB; Grupo P4 - Dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®, Pfizer Saúde
Animal, Brasil) por 6 dias seguido por RB (54 horas) e injeção de placebo 48 horas após o início
da RB; Grupo P4+E2 - Dispositivo intravaginal de P4 por 6 dias seguido por RB (54 horas) e
injeção i.m. de 1mg de 17â-oestradiol 48 horas após o início da RB. Ao final da RB, todas as
vacas receberam uma injeção i.m. de 200mcg de GnRH (Fertagyl®, Intervet, Brasil), sendo esse
momento considerado o dia 0 do experimento. A ovulação foi avaliada através de exames
ultrassonográficos nos dias 0 e 2 e somente as vacas que ovularam foram utilizadas no estudo
(Controle: n=23; E2: n=25; P4: n=19; P4+E2: n=18). Amostras de sangue foram coletadas nos
dias 0, 5, 7, 9, 12, 15 e 19 para avaliação da duração do corpo lúteo, através da dosagem de P4
sérica por radioimunoensaio. A porcentagem de vacas que apresentaram ciclo curto foi analisada
por regressão logística e as concentrações séricas de P4 foram analisadas pelo PROC MIXED.
Para todos os tratamentos, as concentrações séricas de P4 foram maiores no dias 5 em relação ao
dia 0 (P<0,01), porém não houve efeito dos tratamentos sobre as concentrações séricas de P4 nos
dias 0 e 5 (P>0,1). As concentrações séricas de P4 elevaram-se (P<0,05) entre os dias 5 e 7 nos
grupos tratados com P4 (de 2,3±0,5 para 3,7±0,5 ng/mL) e P4+E2 (de 2,4±0,5 para 3,3±0,5 ng/
mL) e reduziram-se (P<0,01) nos grupos controle (de 2,9±0,4 para 1,9±0,4 ng/mL) e E2 (de
1,9±0,4 para 0,8±0,4 ng/mL). As vacas dos grupos tratados com P4 (gruposP4 e P4+E2)
apresentaram maiores concentrações séricas de P4 em relação às vacas não tratadas com P4
(grupos Controle e E2) nos dias 7, 9, 12 e 15 (3,5±0,4 vs. 1,4±0,3; 3,8±0,4 vs. 1,2±0,3; 5,1±0,4
vs. 1,2±0,3; 4,6±0,4 vs. 1,1±0,3 respectivamente; P<0,0001). Os tratamentos com P4 foram
significativamente efetivos em prevenir ciclos curtos (86,5% vs. 20,8%; P<0,001), enquanto o
tratamento apenas com 17â-estradiol não diferiu do grupo controle (76,0% vs 82,6%; P>0,1).
Vacas não tratadas com P4 que manifestaram estro apresentaram a mesma incidência de ciclos
curtos em relação às vacas que não manifestaram estro (75,0% vs. 80,0%; P>0,1). Conclui-se
que o tratamento com P4 por 6 dias antes da indução da ovulação em vacas em anestro garantiu
duração normal do subseqüente corpo lúteo, enquanto a administração de 1mg de 17â-estradiol
não preveniu efetivamente a ocorrência de ciclos curtos.
s286
Resumos Incritos:
Melhor Trabalho na
Área Aplicada
s287
s288
RESPOSTA SUPEROVULATÓRIA DE DOADORAS BOVINAS UTILIZANDO

CINCO OU OITO APLICAÇÕES DE FSHp SUÍNO
Garcia, P.D.1; Lemos, F.O.2; Moreira, E.M.2; Lemos, T.N.2; Hucke, E.E.T.S.3
¹ Aluna do 5º ano do Curso de Medicina Veterinária do Centro Universitário da Fundação de

Ensino Octávio - Av. Dr. Octávio da Silva Bastos, s/n°, São João da Boa Vista/SP, 13874-159.
² Médico (a) Veterinário (a) Autônomo – região centro-oeste/MG. ³ Docente do Curso de
Medicina Veterinária do Centro Universitário da Fundação de Ensino Octávio Bastos. Av. Dr.
Octávio da Silva Bastos, s/n°, São João da Boa Vista/SP, 13874-159.
vetpamela@itelefonica.com.br
Neste estudo avaliou-se dois tipos de tratamentos superovulatórios (TSO) com redução de 8
para 5 aplicações de FSHp sobre a quantidade de estruturas palpáveis no ovário, embriões viáveis
ou degenerados e ovócitos em doadoras de embriões da espécie bovina e da raça Holandesa (n=
70). Foram avaliadas 178 TSO do programa de TE, já em curso, da Fazenda Colorado,
Caetanópolis/MG. Os animais foram selecionados por meio de palpação retal e ultrassonografia.
O manejo nutricional foi padronizado com acesso a água e sal mineral ad libitum. Os 2 tipos de
TSO utilizados foram: tratamento 1, 5 doses de FSHp (n= 102) e tratamento 2, 8 doses de FSHp
(n= 76). Inicialmente foi realizada (D0) a sincronização de estros com progestágeno (CIDR®)
mais benzoato de estradiol (RIC BE®). A gonadotrofina exógena utilizada (FHSp) foi o Pluset®
ou o Folltropin-V® aplicadas aleatoriamente em ambos os grupos (dose total de acordo com o
peso e idade dos animais: 350 a 450 UI Pluset®; 160 a 400 mg Folltropin-V®) a partir do D5. Para
o tratamento 1, dividiu-se a dose total em 5 doses decrescentes. A 1ª e 2ª doses foram administradas
no D5 em intervalos de 12 h. As doses seguintes foram realizadas em intervalos de 24 h. No D7,
com a 4ª dose, foi administrada PGF2á (Veteglan®). No D8, retirou-se o implante de progesterona
aplicando-se a última dose de FSHp e seis horas após, aplicou-se benzoato de estradiol. Para o
tratamento 2, dividiu-se a dose total em 8 doses decrescentes em intervalos de 12 h. No D7, junto
com a 6ª dose, foi administrado PGF2á. No D8 foi retirado o implante de progesterona e realizada
a 7ª dose, sendo que seis horas após, aplicou-se benzoato de estradiol. A primeira IA foi realizada
10 h após o cio e a segunda 12 h após, em ambos os grupos. Foi utilizado sêmen comercial de
qualidade reconhecida. Aplicou-se GnRH (Gestran®) no momento da primeira IA somente para
o tratamento 2 (8 doses). A colheita dos embriões foi efetuada sete dias após a IA através do
método não cirúrgico, circuito fechado com fluxo descontínuo e as estruturas recuperadas foram
examinadas no microscópio. Os resultados não revelam diferenças significantes entre as respostas
superovulatórias após a aplicação dos dois tipos de tratamentos. O número de estruturas palpáveis
no ovário, assim como número de embriões viáveis ou degenerados e ovócitos não foram
estatisticamente diferentes (Teste t de Student). Foi possível observar uma tendência a um aumento
de estruturas palpáveis no ovário das doadoras tratadas com o tratamento 1 (5 doses; p= 0,06;
t178= 1,86; Teste t de Student). Assim, o tratamento 1 (5 doses) parece não modificar a resposta
superovulatória, com a vantagem de facilitar o manejo, reduzir o estresse e a possibilidade de
erros nas aplicações. Porém, a redução do número de doses não foi o único fator a influenciar a
resposta superovulatória, uma vez que os tratamentos aplicados sofreram outras interferências
como o tipo de FSHp empregado, a aplicação do GnRH e do benzoato de estradiol.
s289
INFLUÊNCIA DA ALTA OU BAIXA INGESTÃO ALIMENTAR NA PRODUÇÃO IN

VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
Martins, A.C.1,2; Ramos, A.F.1,3; Mollo, M.R.1,4; Pivato, I.1,5; Camara, J.U.1; Carrijo, L.H.D.6;
Driessen, K.1,4; Rumpf, R.1; Sartori, R.1
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 70770-900, Brasília-DF, Brasil, 2FMVZ-
UNESP, 186018-000, Botucatu-SP, Brasil, 3UFMG, 30123-970, Belo Horizonte-MG, Brasil,
4
FAV-UnB, 70910-970, Brasília-DF, Brasil, 5CIDASC, 89130-000, Indaial-SC, Brasil,
6
Integral Nutrição Animal, 74477-228, Goiânia-GO, Brasil
sartori@cenargen.embrapa.br
Estudos com fêmeas bovinas superovuladas observaram maior produção de embriões transferíveis
nos animais que receberam dietas com menores níveis energéticos e relataram efeito negativo de
dietas com alta energia na taxa de sobrevivência embrionária. O objetivo deste estudo foi avaliar
a influência da alta ou baixa ingestão alimentar na produção in vitro de embriões em vacas
azebuadas. Após 14 dias de adaptação a uma dieta de manutenção, 20 vacas não lactantes com
ECC de 2,9 (escala de 1-5) e pesando 410,5 kg foram divididas aleatoriamente em dois grupos
recebendo dietas de 180% (alta ingestão; A) ou 70% (baixa ingestão; B) em relação à manutenção
durante 56 dias além de água e sal mineral à vontade. Com 21 dias nas dietas experimentais as
vacas tiveram o estro sincronizado. Entre 7 e 10 dias após o estro, todos os folículos com diâmetro
acima de 5 mm foram aspirados através de ultra-sonografia transvaginal e as vacas receberam
150 mg de d-Cloprostenol im, além da colocação de um implante auricular de norgestomet que
era trocado a cada 14 dias até o final do experimento. Quatro dias após a colocação do implante,
as vacas foram submetidas à aspiração folicular (OPU) seriada com intervalo de 3 e 4 dias entre
as coletas perfazendo um total de 7 coletas. Os ovócitos coletados (732 e 623 nos grupos A e B,
respectivamente) foram submetidos a uma seleção quanto à sua qualidade, maturados, fecundados
in vitro e incubados por 7 dias até atingirem o estágio de mórula ou blastocisto. Durante o
experimento, foram realizadas avaliações periódicas de peso vivo dos animais. Os grupos
experimentais foram comparados usando o modelo de efeitos mistos do SAS para variáveis
contínuas e pelo teste do qui-quadrado para variáveis binomiais. Os resultados estão apresentados
sob a forma de média ± erro padrão. As vacas ganharam 0,96 kg/dia de PV no grupo A e perderam
0,93 kg/dia de PV no grupo B durante o período que receberam dieta experimental. No momento
das OPUs, o número de folículos >3 mm observados no ovário foi maior (P<0,05) no grupo A
(17,1±0,8) em relação ao grupo B (14,1±0,8), assim como o número de folículos aspirados
(14,5±0,6 vs 11,9±0,6) e o tamanho do maior folículo (9,3±0,3 vs 7,8±0,3). Além disso, houve
uma tendência (P<0,10) de aumento nas vacas de alta ingestão quanto ao número de ovócitos
não viáveis recuperados por OPU (5,9±0,6 vs 4,6±0,6) e conseqüente diminuição da porcentagem
de ovócitos viáveis coletados (44,0% vs 48,6%). Não houve diferença, entretanto, no número de
ovócitos por coleta (10,5±0,9 vs 8,9±0,9), no número de ovócitos viáveis (4,6±0,4 vs 4,3±0,4),
na taxa de clivagem dos viáveis (67,5% vs 67,6%) e na taxa de embriões (36,4% vs 41,7%) para
os grupos A e B, respectivamente. Em resumo, alta ingestão alimentar aumentou a população
folicular no momento da OPU, mas não aumentou o número de embriões produzidos por
fecundação in vitro em relação à baixa ingestão alimentar.
Apoio financeiro do Edital Universal do CNPq, Embrapa-Macroprograma II, Integral Nutrição
Animal e Capes (bolsa de estudo de A.C. Martins).
s290
MORFOMETRIA DAS ESTRUTURAS OVARIANAS EM CABRAS SAANEN

DOADORAS DE EMBRIÕES PELO USO DA ULTRASONOGRAFIA EM TEMPO
REAL
Sousa, F.C.1; Pinheiro, E.S.P.1; Rondina, D.1; Freitas, V.J.F.1; Teixeira, D.I.A.1
1
Ceará, 60.740-000, Fortaleza-CE, Brasil. vjff@uece.br
Este estudo teve como objetivo utilizar a ultra-sonografia em tempo real (USTR) para avaliar a
morfometria das estruturas ovarianas em cabras da raça Saanen doadoras de embriões. Vinte e
quatro cabras com idades variando de 2 a 6 anos, foram mantidas em instalações apropriadas e
alimentadas com feno de Tifton (Cynodon dactylon) e concentrado comercial (18% P.B) A
sincronização do estro foi obtida pelo uso de esponjas vaginais contendo 60 mg de acetato de
medroxiprogesterona (Progespon®, Buenos Aires, Argentina) durante 10 dias. No oitavo dia foram
aplicados 75 µg de cloprostenol (Prolise®, Buenos Aires, Argentina). A estimulação ovariana foi
obtida pelo uso de 200 mg de pFSH distribuídas em seis injeções com 12 horas de intervalo.
Após 36 horas da retirada da esponja foi aplicado 100 mg de GnRH (Fertagyl®, Boxmeer, Holanda)
e simultaneamente foi realizada a primeira cobertura pelo uso de machos da raça Saanen. A
segunda monta realizou-se 12 horas após a primeira. Aproximadamente 48 horas após o estro, as
fêmeas doadoras foram submetidas a USTR, pelo uso de um equipamento ultra-som modo B
(Falco 100®, Pie-Medical, Holanda) acoplado a um transdutor linear de 6-8 MHz, para verificação
da presença de corpos hemorrágicos (ocorrência de ovulação) para posterior comparação pela
observação por laparotomia. Também foi determinado o diâmetro de cada ovário, assim como o
dos corpos hemorrágicos. Estas mensurações foram obtidas com o uso do programa para análise
de imagens e medições: Scion Image for Windows 2000 (Scion Corporation, Frederick, EUA),
após calibração prévia. A comparação entre as médias foi realizada pelo teste χ2. Os exames
foram bem tolerados pelos animais em estudo, não ocasionando dano físico após a avaliação
ultra-sonográfica. Foi possível a visualização de todos os ovários, sendo que a média (± d.p.) de
diâmetro maior foi de 2,350 ± 0,426 e 2,207 ± 0,536 cm para o ovário direito e esquerdo,
respectivamente. A média (± d.p.) do número de corpos hemorrágicos por ovário foi de 7,18 ±
0,96, por USTR, e de 9,60 ± 1,70, por laparotomia (P>0,05). A correlação entre o número de
corpos hemorrágicos verificados por USTR e aqueles identificados na laparotomia foi de 0,86.
O diâmetro médio (± d.p.) dos corpos hemorrágicos observados por ultra-sonografia foi de 0,32
± 0,12 cm. Os resultados obtidos indicam que a USTR é um método eficaz e não-invasivo,
podendo ser uma ferramenta útil na seleção de fêmeas doadoras para programas de transferência
de embriões. No entanto, o mesmo não permite determinar o número exato de ovulações.
s291
DETECÇÃO DE FALHA DE OVULAÇÃO PERMITE RESSINCRONIZAÇÃO

RÁPIDA E AUMENTO DE VACAS GESTANTES EM 28 DIAS.
Vasconcelos, J.L.M.1; Garcia, P.H.M.2
1
FMVZ-UNESP, Botucatu, SP, Brasil, 2Fazenda São João, Inhaúma, MG, Brasil
Taxa de ovulação após o estro foi de 84,8% em vacas Holandesas em lactação (Vasconcelos et al.
2006. Theriogenology 65:192-200). O objetivo deste estudo foi avaliar se a detecção de falha de
ovulação (presença de CL entre os dias 7 e 13 após a IA) associado à ressincronização rápida
aumenta o número de vacas gestantes em 28 dias. Este experimento foi realizado em uma fazenda
localizada em Inhaúma, MG, Brasil em 2005. Foram utilizadas vacas Holandesas em lactação
(n=3876) com produção de 26,7±8,3 kg leite/dia com 213,7±130,6 DEL que foram inseminadas
após detecção do estro ou IATF. O protocolo utilizado para IATF consistiu de um dispositivo
intravaginal de P4 (CIDR® 1,9mg Pfizer Animal Health, Brasil), associado com injeção de GnRH
(1mL Fertagyl® Intervet) no dia zero. Após sete dias, o CIDR® era removido e animais recebiam
uma injeção de PGF2α (5mL Lutalyse® Pfizer Animal Health, Brasil), e uma injeção de Cipionato
de Estradiol (0,5mL ECP® Pfizer Animal Health, Brasil), 24 horas após. As vacas foram
inseminadas 48h após o ECP. As vacas foram divididas aleatoriamente em dois grupos: G1
(n=2989) não foram avaliadas para presença de CL e G2 (n=887) foram avaliadas para presença
de CL por US. No G2, 597 vacas estavam no dia 7 apos a IATF e 290 vacas estavam entre os dias
7 a 13 após a IA. Vacas do G2 detectadas sem CL foram ressincronizadas com o protocolo citado
acima O Diagnóstico de gestação foi realizado por US entre os dias 28 a 34 pós IA. Vacas que
apresentaram cio entre a IA e o diagnostico de gestação foram inseminadas novamente. Estes
dados foram analisados pelo teste de Qui-quadrado Avaliação de presença de CL por US não
influenciou a taxa de concepção: G1: 23% (687/2989) e G2: 23,8% (211/887). Nas vacas avaliadas
para presença de CL, a taxa de falha de ovulação nas inseminadas pós detecção de estro foi de
24,5% (71/290) e nas que receberam IATF foi de 24,1% (144/597). Vacas com presença de CL
tiveram taxa de concepção de 28,3% (62/219) após IA convencional e de 32,9% (149/453) após
a IATF. Vacas sem presença de CL foram ressincronizadas e a taxa de concepção foi de 25,6%
(55/215). A taxa de detecção de cio nestes 28 dias e a taxa de concepção foram, respectivamente,
49,9% (1148/2302) e 23,6% (271/1148) para G1 e 70,1 (323/461) e 20,7% (67/323) para G2. A
taxa de detecção do estro foi maior (P<0,01) no G2, provavelmente devido as vacas com falhas
de ovulação terem sido ressincronizadas. A porcentagem de vacas gestantes em 28 dias foi maior
(P<0,01) no G2: 37,5% (211+55+67/887) do que no G1: 32,2% (687+271/2989). Estes dados
mostram que falha de ovulação é um fator negativo importante no decréscimo da concepção de
vacas Holandesas em lactação. O diagnóstico precoce de vacas vazias (ausência de CL por US)
não influenciou a concepção e associado à ressincronização rápida aumenta a prenhez.
s292
FATORES QUE AFETAM A TAXA DE CONCEPÇÃO APÓS INSEMINAÇÃO

ARTIFICIAL OU TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM VACAS HOLANDESAS
EM LACTAÇÃO
Demétrio, D.G.B.1; Rodrigues, C.A.2; Santos, R.M.1; Demétrio, C.G.B.3; Chiari, J.R.4;
Vasconcelos, J.L.M.1
1
FMVZ-UNESP, Botucatu, SP; 2 Clínica Veterinária Samvet, São Carlos, SP, 3ESALQ-USP,
Piracicaba, SP, 4Samvet Embriões, Morrinhos, GO, vasconcelos@fca.unesp.br
O objetivo deste trabalho foi avaliar fatores que afetam a taxa de concepção (TC) de vacas
Holandesas em lactação que receberam IA ou TE. O experimento foi conduzido em uma fazenda
localizada em Descalvado, SP, Brasil, durante os meses de outubro de 2003 a setembro de 2004.
Vacas ciclando (n=1025) produzindo 33,3±7,2kg de leite/dia com 162±103,7 de DEL receberam
PGF2α e foram divididas em dois grupos: IA ou TE. As vacas que apresentaram estro 48 a 96h
após aplicação de PGF2α receberam IA (n=227) 12h após detecção ou TE (n=160) 6 a 8 dias
após. Todas as vacas da TE receberam embriões frescos (grau I ou II) de vacas Holandesas não-
lactantes produzidos in vivo. Analisou-se a produção de leite média de -7 a 14d após o cio (LM).
A temperatura corporal (T7 e T14) foi aferida e amostras de sangue foram coletadas para análise
da concentração sérica de P4 por radioimunoensaio, nos dias 7 e 14. O diagnóstico de gestação
foi realizado nos dias 25 e 39 por ultra-sonografia. Morte embrionária (ME) foi considerada
quando as vacas gestantes no dia 25 estavam vazias no dia 39. As variáveis taxa de ovulação, TC
e ME foram analisadas pelo modelo logístico (GLM). Os modelos foram ajustados no software
R. A taxa de ovulação foi de 84,8% (328/387) e foi afetada negativamente pelo DEL (p=0,05).
Não houve diferença na TC do grupo TE em relação a assincronia entre doadora e receptora e
qualidade e estágio do embrião. TC no dia 25, das vacas ovuladas foi 37,9% (74/195) para IA e
59,4% (79/133) para TE (p<0,01). Temperatura corporal no dia 7 influenciou negativamente
(p=0,02) a TC nos dois tratamentos. Para avaliação da P4, foram consideradas somente as vacas
com sincronismo zero (estro 72 h após PGF2α) em ambos os grupos, e a TC no dia 25 foi 37,5%
(39/104) no grupo IA e 63,2% (55/87; p<0,01) no grupo da TE. No grupo IA houve evidência do
efeito da P4 do dia 7 (p=0,03), T7 (p=0,09) e LM (p=0,04). No grupo TE não houve evidência do
efeito da P4, nem da LM, mas sim da T7 (p=0,08). A ME foi 10,8% (8/74) para IA e 21,5% (17/
79) para TE (p=0,06). Houve uma tendência de aumento da ME quando as temperaturas corporais
do dia 7 (p=0,10) foram maiores A TC no dia 39 das vacas ovuladas foi 39,0% (66/195) para IA
e 46,6% (62/133) para TE (p=0,02), superior, mesmo após a perda embrionária. Altas temperaturas
afetaram TC e ME, independente do tratamento. A produção de leite afetou a probabilidade de
concepção na IA, mas não na TE, ou seja, está influenciando negativamente antes do dia 7. Os
resultados obtidos confirmam a importância da P4 no desenvolvimento embrionário antes do dia
7, já que as vacas do grupo TE não foram influenciadas pela P4, provavelmente porque receberam
embrião desenvolvido em condições melhores. A transferência de embriões frescos deve ser
utilizada para evitar os efeitos negativos no desenvolvimento embrionário inicial, aumentando a
TC de vacas em lactação.
Palavras chave: transferência de embriões, inseminação artificial, concepção
s293
s294
Resumos Incritos:
Melhor Trabalho na
Área Básica
s295
s296
GENES DE BODE (Capra hircus) CODIFICAM NOVOS MEMBROS DA FAMÍLIA

DAS ESPERMADESINAS
Melo, L.M.1; Teixeira, D.I.A.2; Havt, A.1; Cunha, R.M.S.3; Rádis-Baptista, G.1;
Freitas, V.J.F.2; Cavada, B.S.1
1
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BiomolLab), Universidade Federal do
Ceará, 60.455-970, Fortaleza-CE, Brasil, 2 Laboratório de Fisiologia e Controle da
Reprodução (LFCR), Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza-CE, Brasil, 3 Núcleo de
Biotecnologia de Sobral (NUBIS), Universidade Vale do Acaraú, 62.041-040, Sobral-CE,
Brasil. vjff@uece.br
Espermadesinas formam uma família de proteínas secretórias do trato reprodutor masculino e

constituem as proteínas majoritárias do plasma seminal. Elas formam um grupo de polipetídeos
com 12 a 16 kDa, apresentando um único domínio CUB e possivelmente estão envolvidas em
diferentes etapas do processo de fertilização. Em trabalho anterior (Teixeira et al., 2002, Prot.
Pep. Let., ) foi isolada e parcialmente caracterizada uma espermadesina do plasma seminal de
bode (BSFP), com peso molecular de 12,5 kDa. No presente estudo, nós procuramos identificar
o gene que codifica esta proteína. Para alcançar este objetivo foram preparados os cDNAs de
testículo e vesícula seminal de um bode sexualmente maduro. Para amplificar a extremidade 3‘
do cDNA (3‘-RACE) foram testados dois primers desenhados a partir de regiões conservadas de
diversas espermadesinas (SMD-SE1) ou no N-terminal da BSFP (SMD-SE2). Foram produzidos
vários amplicons de aproximadamente 700 pares de base somente a partir do PCR de vesícula
seminal e usando o primer específico SMD-SE2. A clonagem e sequenciamento dos produtos do
PCR levaram-nos a identificar três novos cDNAs que codificam as espermadesinas do bode em
vesícula seminal, as quais foram denominadas Bodesina-1, Bodesina-2 e Bodesina-3. Todas as
três seqüências de aminoácidos foram altamente similares (50%) à espermadesina de suíno AWN.
A seqüência da Bodesina-2 é idêntica ao N-terminal da BSFP. Provavelmente, esta isoforma
putativa trata-se da proteína BSFP previamente isolada. Estes resultados indicaram que as
Bodesinas parecem pertencer a uma família multigênica que codifica proteínas com um domínio
CUB, o qual é essencial para sua função biológica. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro
relato da clonagem molecular de espermadesinas de bode (Bodesinas).
s297
EFEITOS DA DEMECOLCINA NA MATURAÇÃO NUCLEAR E

CITOPLASMÁTICA DE OÓCITOS BOVINOS
Saraiva, N.Z.1; Bueno da Silva, R.1; Oliveira Júnior, E.G.1; Perecin, F.1; Vantini, R.1;
Garcia, J.M.1
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil. naiaravet@hotmail.com
A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é um processo que envolve essencialmente três
etapas: maturação, fecundação e cultivo embrionário in vitro. A maturação nuclear do oócito não
é suficiente para resultar em subsequente desenvolvimento embrionário. Recentemente, tem-se
empregado agentes químicos que inibem a retomada da meiose, permitindo mais tempo de
maturação citoplasmática. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da demecolcina, agente
anti-mitótico desestruturador de microtúbulos, sobre o retardo na maturação nuclear e maturação
citoplasmática (avaliada pelo comportamento dos grânulos corticais - GC). Oócitos bovinos
foram maturados in vitro por até 24 horas em meio TCM 199 suplementado com 10% SFB,
1,0ìg/mL de FSH, 50ìg/mL de hCG, 1,0ìg/mL de estradiol, 0,20mM de piruvato, 83,4ìg/mL
de amicacina e demecolcina nas seguintes concentrações: 0 (controle, Grupo C); 0,0125 (Grupo
1); 0,025 (Grupo 2) e 0,05ìg/mL (Grupo 3). Amostras foram obtidas com 0, 8, 16 e 24 horas de
maturação e exposição à droga, sendo os oócitos desnudados em hialuronidase (2mg/mL), corados
com 10ìg/mL de Hoechst 33342 durante 10 minutos e FITC-LCA por 15 a 20 minutos e avaliados
quanto à progressão nuclear e migração de GC para a periferia. Foram avaliados 50-70 oócitos
por tratamento em cada momento, em três repetições, sendo os resultados submetidos à ANOVA
e teste de Tukey, no programa SAS v.8.2 (P=0,05). Enquanto o Grupo 1 seguiu o mesmo padrão
de progressão nuclear do Grupo C, com um aumento significativo (P<0,05) de oócitos em metáfase
II (MII) a partir de 16h (29%) e novo aumento com 24h (69,2%), o Grupo 2 sofreu influência da
demecolcina sobre o núcleo após 16h de exposição à droga, quando ainda 80,0% dos oócitos
apresentaram-se imaturos. Porém, com 24h ocorreu diminuição significativa, com 54,1% dos
oócitos bloqueados meioticamente. No Grupo 3, observamos que não houve progressão nuclear
no decorrer do tempo, não verificando-se diferença estatística quanto ao número de oócitos em
MII em todos os momentos avaliados, com médias de 98,9; 97,9; 88,7 e 55,6% de oócitos imaturos
após 0, 8, 16 e 24h de tratamento, respectivamente. Ao contrário do efeito inibitório sobre o
núcleo, a demecolcina não prejudicou a migração de GC para a periferia do oócito, observando-
se em todos os grupos expostos à demecolcina padrão de comportamento semelhante ao grupo
controle, sendo que obtivemos médias de 60,3; 66,8; 68,9 e 62,6% de oócitos com GC na periferia,
após 24h de exposição à droga, nos grupos C, 1, 2 e 3, respectivamente. Assim, concluímos que
os resultados obtidos neste trabalho estão de acordo com objetivos buscados quanto à sincronização
entre maturação nuclear e citoplasmática, sendo a concentração 0,05ìg/mL considerada a mais
efetiva no bloqueio meiótico de oócitos expostos à demecolcina. Mais estudos devem ser
concentrados nessa área, para se verificar a reversibilidade da ação desse agente e o
desenvolvimento embrionário após a sincronização entre maturação nuclear e citoplasmática.
Apoio financeiro: FAPESP
s298
CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO FOLICULAR INICIAL EM CAPRINOS

POR ATIVINA-A E FOLISTATINA
Silva, J.R.V.1; Santo, R.R.1; Rodrigues, A.P.R.1; Figueiredo, J.R.1; van den Hurk, R.2
1
Brasil roberto_viana@yahoo.com; 2 Departamento de Saúde de Animais de Produção,
Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Utrecht, Utrecht, Holanda.
O objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos da ativina-A e folistatina sobre o

desenvolvimento in vitro de folículos primordiais e primários em caprinos. Para estudar o
desenvolvimento de folículos primordiais (experimento 1), fragmentos de córtex ovariano (3 x 3
x 1 mm) foram cultivados in vitro por 5 dias em MEM suplementado com ativina-A (0, 10 ou
100 ng/mL), folistatina (0, 10 ou 100 ng/mL) e combinações. Após cultivo, o número de folículos
primordiais ou em crescimento (intermediários, primários e secundários) foi comparado com o
córtex não cultivado. A expressão (proteínas e RNAm) de ativina-A, folistatina, Kit Ligand
(KL), fator de crescimento de diferenciação-9 (GDF-9) e proteína morfogenética óssea -15 (BMP-
15) em folículos não cultivados ou cultivados foram estudados por imunhistoquímica e PCR.
Para avaliar o crescimento de folículos primários (experimento 2), os folículos foram isolados e
cultivados por 6 dias em MEM adicionado de 100 ng/mL de ativina-A, 100 ng/mL de folistatina,
ou 100 ng/mL de ativina-A mais 200 ng/mL folistatina. Em ambos os experimentos, a morfologia
e o diâmetro folicular e oocitário foram avaliados antes e após o cultivo. A técnica de TUNEL foi
utilizada para estudar a fragmentação do DNA nos folículos antes e após cultivo. ANOVA e teste
de Tukey HSD foram usados para avaliar o crescimento folicular e incidência de atresia (P<0,05).
No experimento 1, os folículos primordiais caprinos foram ativados e cresceram para estágios de
folículos intermediários e primários durante o cultivo in vitro. No entanto, não foi observado
efeito da ativina-A ou da folistatina sobre o número de folículos primordiais ou em crescimento.
A ativina-A aumentou o número de folículos normais e o diâmetro folicular durante o cultivo de
córtex ovariano, mas estes efeitos não foram inibidos pela folistatina. Após cultivo, os folículos
mantiveram a expressão (proteínas e RNAm) de ativina-A, folistatina, KL, GDF-9 e BMP-15.
Menos de 30% dos folículos atrésicos após cultivo apresentavam oócitos ou células da granulosa
TUNEL-positivas. A ativina-A não afetou a ocorrência de fragmentação de DNA em folículos
cultivados no interior de córtex ovariano. No experimento 2, a adição de ativina-A estimulou o
crescimento de folículos primários isolados, sendo este efeito inibido pela folistatina. A ausência
de efeito neutralizante da folistatina no cultivo de córtex pode ser devido as menores concentrações
utilizadas ou a um bloqueio incompleto da ativina-A. Ao contrário do córtex ovariano, após o
cultivo de folículos primários, todos os folículos atrésicos tinham células positivas para a reação
de TUNEL, o que indica diferenças nos mecanismos que causam degeneração em folículos
cultivados no interior de córtex ou isolados. Em conclusão, este estudo demonstrou que folículos
primordiais caprinos cultivados in vitro são ativados e crescem para estágios de folículos
intermediários e primários. Durante o cultivo in vitro, os folículos mantiveram a expressão de
ativina-A, folistatina, KL, GDF-9 e BMP-15. A ativina-A estimulou o crescimento e sobrevivência
de folículos ativados no interior de córtex ovariano, bem como o crescimento in vitro de folículos
primários isolados.
s299
VARIAÇÃO INDIVIDUAL DE mRNA POLYA EM OÓCITOS E EMBRIÕES

BOVINOS
Biase, F.H.12; Merighe, G.K.F.1; Biase, W.K.F.S.1; Martelli, L.2; Meirelles, F.V.1
1
- Departamento de Ciências Básicas, FZEA – USP. 2- Departamento de Genética, FMRP –
USP. biase@genbov.fmrp.usp.br
RNAs mensageiros em oócitos são responsáveis pelo desenvolvimento embrionário até a ativação
do genoma. Neste trabalho testou-se hipótese de que a quantidade de mRNA no oócito está
associada ao potencial de desenvolvimento a blastocisto. Os objetivos foram: (i) estimar diferenças
quantitativas de mRNA polyA entre oócitos colhidos de COCs classificados morfologicamente
(grau A e B); (ii) estimar a diferença quantitativa de mRNA polyA entre oócitos de grau A antes
e após a MIV, (iii) estimar a variação quantitativa de mRNA polyA entre estágios de
desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro. Foi desenvolvido um procedimento
para estimar a diferença de mRNA polyA entre amostras, aplicado posteriormente a oócitos e
embriões individualmente. A técnica consistiu da amplificação de cDNA (acDNA) por PCR em
tempo real. Oócitos ou embriões foram congelados individualmente sem a zona pelucida em
solução PBS-PBP(0.1%)-inibidor de RNase(1U). O mRNA polyA foi transcrito reversamente
(RT) em protocolo padrão com a adição do oligo dGTP(12). A amplificação de cDNA (acDNA)
foi realizada por PCR contendo dGTP(12) e dTTP(12) como primers e SYBR Green I. O cDNA
equivalente a 0,5 oócito ou embrião foi utilizado para as reações de acDNA. O gene glyceraldehyde
3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) foi amplificado a partir das amostras como controle da
integridade de RNA e qualidade da RT (equivalente a 0,1 oócito ou embrião). A quantificação
das diferenças de transcritos entre as amostras foi estimada pelo método delta Ct e para as análises
estatísticas foi aplicado o teste de rearranjo aleatório entre amostras, programa REST. Os oócitos
obtidos de COCs grau B apresentaram menor quantidade de mRNA polyA (0,214; P<0,01) e
GAPDH (0,156; P<0,01) quando comparados aos oócitos obtidos de COCs grau A (1 unidade
arbitrária de razão de expressão). Em contraste com os oócitos não maturados (1 unidade arbitrária
de razão de expressão), a quantidade de mRNA polyA foi menor após a MIV (0,693; P>0,05) e
variou após a FIV e o cultivo embrionário (24hpi, 0,107, P<0,05; 36hpi, 0,437, P<0,05; 48hpi,
0,110, P<0,05; 90hpi, 0,077, P<0,05; 160hpi, 0,084, P<0,05; 210hpi, 0,7, P<0,05). Em comparação
com os oócitos imaturos (1 unidade arbitrária de razão de expressão), os transcritos de GAPDH
reduziram a 0,01 (P<0,01) em oócitos após as MIV e tiveram pequena variação após a FIV e
cultivo embrionário (24hpi, 0,019, P<0,05; 36hpi, 0,019, P<0,05; 48hpi, 0,016, P<0,05; 90hpi,
0,010, P<0,05; 160hpi, 0,004, P<0,05; 210hpi, 0,095, P<0,05). Os resultados obtidos mostram
que a amplificação de cDNA em PCR em tempo real foi eficiente para estimar diferenças
quantitativas de mRNA polyA entre oócitos e embriões. Além disso, sugerem que existe uma
associação entre a quantidade de mRNA polyA em oócitos e a qualidade morfológica dos COCs.
Os valores de quantificação do mRNA polyA em embriões bovinos durante o cultivo embrionário
são consistentes com a hipótese de que a ativação do genoma inicia após o estádio de 2 células.
Apoio financeiro: CAPES,FAPESP
s300
ASPIRAÇÃO FOLICULAR NO PERÍODO PERI-LUTEÓLISE EM BOVINOS:

EFEITOS NAS CARACTERÍSTICAS DA FASE LUTEÍNICA
Ibiapina, B.T.1; Bisinotto, R.S.1; Pontes, E.O.1; Fedozzi, F.1; Bertan, C.M.1;
Bergamaschi, M.A.C.M.1; Binelli, M.1
1
CBRA-VRA-FMVZ-USP, 13635-900, Pirassununga,SP. ibiapinavra@yahoo.com.br
Apenas 50% das fêmeas bovinas fertilizadas levam a gestação a termo (Maurer e Chenault, J.
Anim. Sci. 56:1186). Durante o período correspondente à luteólise, a vaca deve ajustar sua
fisiologia impedindo a regressão do corpo lúteo (CL). O 17β-estradiol (E2) folicular modula a
produção de PGF2α e estimula a luteólise. A hipótese deste estudo foi que a remoção de folículos
durante a fase peri-luteólise retarda a ocorrência da luteólise em bovinos. Vacas Nelore (Bos
taurus indicus) ou mestiças, não-prenhes e não-lactantes tiveram as ovulações sincronizadas
com um implante de norgestomet associado a aplicações de benzoato de estradiol e d-cloprostenol
sódico. As vacas que ovularam de forma sincronizada (dia da ovulação=D1) foram divididas em
dois grupos. Do D13 ao D25, os animais do grupo aspiração (GA; n=12) tiveram os folículos
com diâmetro igual ou superior a 6mm aspirados diariamente via trans-vaginal e os animais do
grupo controle (GC; n=10) foram submetidos a aspirações “placebo”. A partir do D13 até o estro
subseqüente, todos os animais foram observados duas vezes ao dia para a detecção do
comportamento de cio e tiveram os diâmetros dos folículos ovarianos mensurados por
ultrassonografia. Concentrações plasmáticas de progesterona (P4) foram mensuradas do D13 ao
D31 ou estro. Variáveis discretas foram analisadas por ANOVA considerando o efeito de tratamento
como variável independente. O diâmetro diário médio do maior folículo foi menor (P<0,01)
para vacas do GA (0,68±0,02mm) comparado com as do GC (0,88±0,02mm). A duração da fase
luteínica foi similar entre vacas do GC e GA (19,9±0,4 vs. 19,5±0,3; P>0,1) enquanto a duração
do ciclo estral experimental foi maior para as vacas aspiradas (21,1±1,3 vs. 31,4±1,2 dias; P<0,01).
O dia em que ocorreu a concentração máxima (14,5±0,7 vs. 15±0,7) e a concentração máxima de
P4 (8,6±0,8 vs. 7,1±0,8ng/ml) foi similar entre os grupos (P>0,1). A somatória das concentrações
plasmáticas de P4 entre o dia 13 e o dia da luteólise foi similar para vacas dos GC e GA (41,4±5,1
vs. 29,7±4,8 ng/ml; P>0,1), mas foi maior para o grupo de vacas aspiradas entre o dia da luteólise
e o dia do cio (0,2±0,9 vs. 4,2±0,8ng/ml; P<0,01). Associadas aos locais de aspiração, observaram-
se em média 0,49±0,2 estruturas hiperecóicas nos ovários por vaca aspirada/dia entre a luteólise
e o cio. Em sumário, aspirações foliculares não alteraram as características da fase luteínica,
porém aumentaram a produção de P4 entre a luteólise e o cio. Especula-se que é necessária a
manutenção de diâmetros foliculares menores que 6mm (diâmetro do desvio em zebuínos) a fim
de que as concentrações de E2 sejam suficientemente baixas para não estimularem a luteólise.
Ainda, a presença de estruturas hiperecóicas pode estar associada à produção de P4 pós-luteólise
e à maior duração do ciclo estral para vacas aspiradas.
Agradecimentos: FAPESP, PCAPS, CNPq, Intervet, Centro Paulista de Desenvolvimento
Farmacotécnico.
s301
O PAPEL DA LEPTINA NA MATURAÇÃO DE OÓCITOS BOVINOS
Paula-Lopes, F.F.1; Boelhauve, M.2; Habermann, F.3; Sinowatz, F.3; Wolf, E.2
1
Departamento de Medicina Veterinária, UFRPE, Recife-PE, CEP 52171-900, Brasil.
2
Department of Molecular Animal Breeding and Biotechnology, LMU, D-85764
Oberschleißheim, Germany. 3Department of Veterinary Anatomy, Histology and Embryology,
LMU, D-80539 Munich, Germany. ffpaulalopes@yahoo.com
A leptina é um peptídeo multifuncional secretado primariamente por adipócitos. Recentemente

foi demonstrado que a suplementação do meio de maturação in vitro (MIV) com leptina estimulou
a competência de oócitos bovinos. Além disso, os blastocistos derivados de oócitos maturados
com leptina apresentaram uma redução na incidência de apoptose, a qual esteve associada à
redução na expressão do RNA mensageiro (mRNA) do gene pró-apoptótico BAX e ao aumento
na expressão do inibidor de caspases BIRC4 em blastocistos (Boelhauve et. al., Biol Reprod, 73:
737-744). O objetivo do presente estudo foi determinar o mecanismo de ação da leptina durante
a maturação de oócitos bovinos. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância
e à metodologia de modelos lineares do programa estatístico SAS. Na primeira série de
experimentos, os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram maturados na presença de 0, 1 ou 10
ng/ml de leptina. Neste experimento, a leptina reduziu a proporção de células do cumulus (CC)
positivas para apoptose (p< 0,0001) e não afetou a incidência de apoptose oocitária (técnica de
TUNEL). A extrusão do primeiro corpúsculo polar (p< 0,05) e a proporção de oócitos no estádio
de metáfase II (p< 0,05) foram estimuladas por 1 e 10 ng/ml de leptina. A segunda série de
experimentos, foi conduzida, utilizando um esquema fatorial 2 x 2, a fim de determinar o papel
das CC na maturação oocitária estimulada por leptina. Os CCOs e os oócitos desnudos (ODs)
foram maturados na presença de 0 ou 10 ng/ml de leptina. A leptina estimulou a maturação
nuclear (p< 0,01) independentemente das CC. A capacidade de desenvolvimento do oócito foi
afetada pela interação estatística leptina x tipo de oócito (p< 0,05). A proporção de CCOs que se
desenvolveu ao estádio de blastocisto aumentou de 22,3 ± 4,6% no grupo controle para 35,2 ±
4,1% no grupo tratado com leptina (p< 0,05). Em contraste, os ODs não adquiriram competência
de desenvolvimento mesmo na presença de leptina. O último experimento fez uso da técnica de
RT-PCR quantitativo, para determinar o efeito de 0, 1 ou 10 ng/ml de leptina durante a MIV na
abundância de mRNA do receptor de leptina (LEPR), STAT3, BAX e BIRC4 em oócitos individuais
e CC. A leptina aumentou a abundância de mRNA dos genes LEPR (p< 0,001), STAT3 (p<
0,001), BAX (p< 0,001) e BIRC4 (p< 0,001) nas CC e a abundância de STAT3 em oócitos (10 ng/
ml de leptina, p< 0,05). Em conclusão, a leptina pode agir diretamente no oócito para estimular
a maturação nuclear, porém as CC são necessárias a fim de mediar a ação da leptina na capacidade
de desenvolvimento oocitária. É possível que a leptina exerça um efeito modulatório na liberação
de fatores derivados das CC, os quais podem ser secretados diretamente no oócito através das
junções gap e no meio extracelular. Além disso, os resultados sugerem que o aumento na expressão
do inibidor endógeno de caspases BIRC4 nas CC e a redução de apoptose nessas células estão
envolvidos com o efeito benéfico da leptina da competência oocitária.
s302
EXPRESSÃO GÊNICA DE TRANSCRITOS ESPECIFICOS EM OÓCITOS E

EMBRIÕES BOVINOS
Biase, F.H.1,2; Biase, W.K.F.S.1; Merighe, G.K.F.1; Puga, R.2; Giuliatti, S.2; Martelli, L.2;
Meirelles, F.V.1
1
- Departamento de Ciências Básicas, FZEA – USP 2- Departamento de Genética, FMRP –
USP. biase@genbov.fmrp.usp.br
Oócitos possuem RNAm e proteínas necessárias ao primeiro estágio do desenvolvimento

embrionário. A qualidade e quantidade de transcritos estão associadas ao potencial do oócito em
desenvolver um embrião. Aproximadamente 10.000 genes foram identificados e estudados
individualmente ou por análises de larga escala, especialmente em camundongos. Entretanto,
poucos genes tiveram caracterização da expressão em oócitos e embriões bovinos. Neste trabalho
realizou-se a caracterização de transcritos expressos de genes específicos de oócitos e embriões
bovinos. Subtração in silico foi utilizada para identificar possíveis genes expressos especificamente
em oócitos e durante o desenvolvimento embrionário de bovinos. Foram utilizadas quatro
bibliotecas contendo ESTs de oócitos e embriões de camundongos. As ESTs foram comparadas
com ESTs presentes em outras bibliotecas. ESTs representativas de doze genes foram encontradas
apenas nas bibliotecas de oócitos e embriões. Dois genes forma escolhidos para caracterização
em tecidos, oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro: Poly(A) binding protein nuclear-
like 1 (Pabpnl1) and Methyl-CpG binding domain protein 3-like 2 (Mbd3l2) Primers para PCR
foram desenhados de acordo com seqüências bovinas e reações monitoradas em tempo real foram
realizadas ulitizando o gene Glyceraldeyde 3-phosphate dehydrogenase (Gpdh) para a
quantificação relativa. Diferenças de expressão gênica entre as amostras foram estimadas
assumindo diferença entre as eficiências de PCR entre os primers e para as análises estatísticas
foi utilizado o teste de rearranjo aleatório de amostras, programa REST. Transcritos de ambos os
genes não foram encontrados em tecidos somáticos e gônadas de bovinos. Transcritos do gene
Pabpnl1 foram encontrados apenas em oócitos, enquanto transcritos do gene Mbd3l2 foram
apenas encontrados em embriões. A quantificação relativa do Pabpnl1 foi realizada entre oócitos
obtidos de COCs morfologicamente classificados como bons e ruins, antes e após a maturação
in vitro (MIV). Não houve diferença estatística significativa entre oócitos de COCs bons e ruins,
assim como entre oócitos de boa qualidade antes e após a MIV. Entretanto, transcritos do gene
Pabpnl1 não foram encontrados em oócitos oriundos de COCs ruim após a MIV. Transcritos do
gene Mbd3l2 foram encontrados em embriões produzidos in vitro. Entretanto a expressão foi
restrita nas fases de 4, 8 células e mórula. Em embriões 8 células houve um aumento significativo
na expressão do Mbd3l2 comparado aos embriões 4 células (17,9 vezes ; p<0,01). Comparado
com embriões 8 células, houve diminuição na expressão do Mbd3l2 no estágio de mórula (0,08
vezes; p<0,01). Em conclusão, os dois genes tiveram a expressão caracterizada em bovinos. Os
resultados indicam que o gene Pabpnl1 tem expressão restrita aos oócitos e Mbd3l2 em embriões.
O gene Pabpnl1 pode ser utilizado como um marcador de potencial de desenvolvimento em
oócitos maturados in vitro
Apoio financeiro: CAPES, FAPESP
s303
EFEITO DO TEMPO DE EXPOSIÇÃO À PROGESTERONA EXÓGENA (3 vs 6

DIAS) ANTES DA INDUÇÃO DA OVULAÇÃO NA LUTEÓLISE PREMATURA EM
VACAS NELORE EM ANESTRO
Sá Filho, O.G.; Zilioti, C.R.; Vasconcelos, J.L.M.
1
Em estudo realizado com vacas Nelore em anestro, Sá Filho et al. (2006; Acta Scientiae
Veterinariae, in press) observaram freqüência de 79,2% de luteólise precoce (entre os dias 5 e 7
do ciclo estral) após a primeira ovulação pós-parto. No mesmo estudo, os autores verificaram
que tratamento com progesterona (P4) exógena por 6 dias prévios à ovulação mantém a duração
normal do corpo lúteo (CL). O objetivo deste experimento foi avaliar se o pré-tratamento com
P4 exógena por 3 dias apresenta a mesma efetividade que o pré-tratamento por 6 dias na prevenção
de ciclos curtos. Vacas Nelore em anestro (avaliadas por 2 exames ultra-sonográficos com intervalo
de 8 dias; n=109) foram aleatoriamente designadas a receber um dos 2 tratamentos: Grupo 3d
(n=54) - Dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®, Pfizer Saúde Animal, Brasil) por 3 dias seguido
por remoção de bezerros (RB; 48 horas); Grupo 6d (n=55) - Dispositivo intravaginal de P4 por
6 dias seguido por RB. Ao final da RB (dia 0), todas as vacas receberam uma injeção i.m. de
100mcg de GnRH (Fertagyl®, Intervet, Brasil). A ovulação foi avaliada através de exames ultra-
sonográficos nos dias 0 e 2 e somente as vacas que ovularam foram utilizadas no estudo. Amostras
de sangue foram coletadas nos dias 0, 5, 7 e 9 para avaliação da duração do corpo lúteo, através
da dosagem de P4 sérica por radioimunoensaio. A porcentagem de vacas que ovularam e a
porcentagem de vacas que apresentaram ciclo curto foram analisadas por regressão logística e as
concentrações séricas de P4 foram analisadas pelo PROC MIXED. A taxa de ovulação foi menor
(P<0,001) no Grupo 3d (33,3%, 18/54) em relação ao Grupo 6d (65,5%; 36/55). A incidência de
ciclos curtos não diferiu (P>0,10) entre os grupos: 5,5% (1/18) para o Grupo 3d e 5,5% (2/36)
para o Grupo 6d. As concentrações séricas de P4 nos dias 0, 5, 7 e 9 não diferiram entre o Grupo
3d e o Grupo 6d (0,3±0,5 vs. 0,3±0,4; 1,8±0,5 vs. 2,1±0,4; 2,8±0,5 vs. 2,9±0,4; 3,4±0,5 vs.
3,6±0,4 ng/ml respectivamente; P>0,10). Em ambos os tratamentos, a P4 sérica elevou-se entre
os dias 0, 5, 7 e 9 (P<0,001), indicando desenvolvimento normal do CL neste período. Conclui-
se que o tratamento com P4 por 3 dias antes da indução da ovulação em vacas em anestro mantém
a duração normal do subseqüente corpo lúteo.
s304
Resumos
Criopreservação
s305
s306
EFEITO DA VITAMINA E NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE VEADO-

BORORÓ-DO-SUL (Mazama nana)
Abreu, C.O.1; Martinez, A.C.1; Moraes, W.2; Carvalho, A.2; Juvenal, J.C.2; Corteze, A.A.3
1
DZO, UEM, campus avançado de Umuarama, estrada da Paca, s/n, Umuarama-PR, 87507-
190; 2CASIB, Foz do Iguaçu-PR; 3 UFPR, campus Palotina, Palotina-PR.
cassianabreu@ig.com.br
A inseminação artificial tem um papel fundamental para a preservação de espécies ameaçadas de

extinção. Para que a técnica seja eficaz quando se utiliza sêmen congelado, é necessário que os
espermatozóides sejam capazes de sobreviver ao processo de congelação, onde há a formação de
grandes quantidades de espécies livres de oxigênio (EROS) que podem interferir na fertilidade
do sêmen descongelado. Devido à possibilidade de reduzir os danos causados pelas EROS nos
espermatozóides, a adição de substâncias antioxidantes ao sêmen congelado passou a ser
pesquisada, mas não existem informações sobre seu uso na conservação do sêmen de cervídeos.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da adição de vitamina E na congelação de sêmen de
cervídeo, visando obter maior número de células viáveis após a descongelação. Foram utilizados
nove machos de Mazama nana em idade reprodutiva mantidos em cativeiro. Os animais foram
anestesiados com cloridrato de tiletamina e cloridrato de zolazepam1 (5 mg/Kg) associados com
0,7 mg/Kg de xilazina2. A colheita do sêmen foi realizada por eletroejaculação. O sêmen foi
avaliado e diluído em TRIS e TRIS acrescido de vitamina E3 (200µl de vit.E/ml). Os ejaculados
que apresentaram características adequadas de volume, motilidade, vigor e concentração foram
submetidos à congelação em congelador portátil4 de sêmen. Após a descongelação, as amostras
foram submetidas a avaliações de motilidade, vigor, morfologia espermática e integridade de
acrossomo, além do teste de termo resistência (TTR) e hiposmótico (HOS). A integridade do
acrossomo foi avaliada em microscópio de interferência de fase. Os resultados foram avaliados
por análise de variância (Proc. GLM, SAS), seguido pelo teste de Tukey. Dos nove animais
contidos para colheita, apenas cinco (55,55%) produziram sêmen em condições de ser congelado.
A partida não influenciou nos resultados obtidos (p>0,05). Não houve efeito da vitamina E (p>0,05)
nas médias dos parâmetros de motilidade pós-descongelação (33,20 x 38,70%, para TRIS x
TRIS + vit.E, respectivamente), integridade de acrossomo (47,60 x 47,00%, para TRIS x TRIS +
vit.E, respectivamente), porcentagem de células positivas no HOS (37,55 x 40,45%, para TRIS
x TRIS + vit.E, respectivamente), motilidade no TTR-R (3,50 x 5,60%, para TRIS x TRIS +
vit.E, respectivamente) e TTR-L (3,50 x 5,60%, para TRIS x TRIS + vit.E, respectivamente).
Embora numericamente tenham sido observados menos danos no sêmen congelado com TRIS +
vit.E (50,45 % vs. 47,70 %), os resultados não difeririam estatisticamente (p>0,05). Apesar de
não terem sido observadas diferenças estatísticas, houve uma tendência a melhores resultados de
motilidade e qualidade celular no diluidor TRIS-vitamina E, evidenciando que mudanças na
concentração do Trolox possam promover melhores resultados.
_______________________
1
Zoletil® 50 - Virbac Saúde Animal
2
Rompum® - Pfizer
3
Trolox ® - Sigma
4
TK 3000, Tetakon Ltda, Uberaba, MG
s307
EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE PLASMA SEMINAL NA

PROTEÇÃO CONTRA ESTRESSE OXIDATIVO E NA VIABILIDADE
ESPERMÁTICA DURANTE A CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN EQÜINO
Almeida, J.L.1; Andrade, A. Jr.2; Zimmermann, M.F.1; Dode, M.A N.3; Neves, J.P.1
1
FAV, UnB, Brasília, DF, Brasil; 2 Oxyradical Research Group, Departamento de Biologia
Celular, UNB, Brasília, DF 70910-900, Brasil; 3 Cenargen – Embrapa, Brasília – DF;
jlalmeida@unb.br.
A baixa fertilidade é um dos fatores que restringe o uso da criopreservação de sêmen na espécie
eqüina. Durante o congelamento, os espermatozóides sofrem vários danos. Os espermatozóides
são suscetíveis ao estresse oxidativo. A reduzida fertilidade, muitas vezes, tem sido correlacionada
com a baixa capacidade antioxidante do sêmen e tal fato pode se dar devido à retirada do plasma
seminal durante o processo de criopreservação. O objetivo do presente estudo foi avaliar os
efeitos de diferentes concentrações de plasma seminal na proteção contra o estresse oxidativo e
danos na viabilidade da célula espermática. Foram utilizados 4 garanhões, sendo congeladas 4
partidas de cada animal. Após a colheita o plasma seminal foi retirado e os espermatozóides
ressuspendidos em diluente contendo diferentes concentrações de plasma 0% (T1), 5% (T2),
25% (T3) e 50% (T4). As análises realizadas pós-descongelação foram motilidade, vigor,
morfologia, integridade de membrana, integridade de acrossoma, integridade de DNA, peroxidação
lipídica e proteína carbonilada. A adição de plasma seminal não afetou (p>0,05) a morfologia e
a integridade de DNA. Espermatozóides congelados com 5% de plasma seminal (T2) foram
semelhantes ao controle (T1) em todas as variáveis estudadas (p>0,05), com exceção da
peroxidação lipídica, que foi maior (p<0,05) no tratamento sem plasma (T1). O T4 apresentou
menor (p<0,05) motilidade, vigor, percentagem de células com membrana íntegra e acrossoma
intacto. Efeitos do plasma seminal na proteção contra oxidação de proteínas não foram observados
(p>0,05). Em conclusão, o plasma seminal possui efeito antioxidante durante criopreservação,
entretanto esse efeito não protege a viabilidade das células espermáticas de outros danos
decorrentes da criopreservação, podendo, inclusive acentuar esses danos quando utilizado em
concentrações acima de 25%. Palavras chaves: criopreservação, eqüino, estresse oxidativo,
plasma seminal, viabilidade espermática.
s308
REDUÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CRIOPROTETORES NA VITRIFICAÇÃO

DE OÓCITOS BOVINOS IMATUROS, ASSOCIADA A ALTA VELOCIDADE DE
RESFRIAMENTO.
Bunn, S.; Bertolini, M.; Cruz, F.B.; Martins, L.T.; Gaudêncio Neto, S.; Wentz, K.C.;
Paulini, F.; Munhoz, J.J.; Mezzalira, A.
Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem – Centro de Ciências

Agroveterinárias CAV – Universidade do Estado de Santa Catarina UDESC – Lages SC,
A criopreservação de oócitos é ainda associada à baixa sobrevivência após o reaquecimento, o

que tem limitado sua aplicação. O método de vitrificação tem se mostrado mais eficiente na
criopreservação de oócitos que outros métodos de congelamento. O estado vítreo de uma solução
é obtido pelo aumento da viscosidade resultante da alta concentração de crioprotetores, bem
como por alta velocidade de resfriamento que impeça a cinética de formação de gelo. Em nosso
laboratório, o uso de nitrogênio super-resfriado (-210°C) e de palhetas metálicas inoxidáveis,
que possivelmente aumentou a velocidade de resfriamento, resultou em maiores taxas de
blastocistos, após vitrificação de oócitos imaturos, com o uso da solução composta por 20% de
etileno glicol (EG) + 20% de dimetil sulfóxido (DMSO) + 0,5M sacarose. Taxas elevadas de
resfriamento podem permitir uma concomitante redução na concentração de crioprotetores,
minimizando a toxicidade. O objetivo deste estudo é avaliar a redução na concentração de EG +
DMSO, entre 25 e 50%, na vitrificação de oócitos bovinos. Oócitos bovinos de qualidade excelente
ou boa, puncionados de ovários obtidos em abatedouro (n=709), foram expostos por 30 segundos
a uma solução composta de 10% EG + 10% DMSO + 20% soro de égua em estro (SEE) em
TCM Hepes. Logo após, os oócitos foram expostos por 20 segundos a uma das soluções de
vitrificação: SV100 (n=187), 20% EG + 20% DMSO + 0,5M Sacarose; SV75 (n=187), 15% de
EG + 15% de DMSO e 0,375M de sacarose; ou SV50 (n=146), 10% de EG, 10% de DMSO +
0,25M de sacarose, além de um grupo controle não vitrificado (n=189). Após o envase, realizado
em grupos de 5 ou 6, as palhetas metálicas foram submersas em nitrogênio líquido submetido ao
vácuo. O reaquecimento foi realizado logo após a vitrificação, por exposição ao ar por 3 segundos,
seguido da exposição por 5 minutos em cada solução de sacarose (0,30 e 0,15M). A seguir
procedeu-se a maturação e a fecundação, sendo os prováveis zigotos cultivados em meio SOFaaci,
à 39ºC com 5% CO2 e umidade saturada. Na avaliação da clivagem, não houve diferença (p>0,05)
entre os tratamentos SV100 (39,2%) e SV75 (31,2%), sendo ambos superiores (p<0,05) ao
tratamento SV50 (11,7%). No grupo controle a taxa de clivagem foi 87,0%, significativamente
superior aos tratamentos. Na avaliação da taxa de blastocistos houve diferença entre todos os
tratamentos (p<0,05). A maior taxa foi obtida com o grupo controle (38,0%), seguido do tratamento
SV100 (10,1%), SV75 (7,6%) e SV50 (0,5%), respectivamente. As taxas de eclosão dos grupos
SV100 e SV75 foram semelhantes, 59,0% e 62,0%, respectivamente, sendo inferiores (p<0,05)
ao controle (85,0%). Conclui-se que a redução dos crioprotetores em percentual igual ou superior
a 25% não permite uma adequada crioproteção para oócitos bovinos vitrificados, resultando na
redução da taxa de embriões obtidos. Novos estudos devem ser conduzidos para avaliar a
possibilidade de redução dos crioprotetores, em percentuais inferiores a 25%.
Suporte Financeiro – CNPq / UDESC
Agradecimento - Frigorífico Verdi
s309
EFICIÊNCIA DE DOIS DILUIDORES PARA A CONGELAÇÃO DE SÊMEN

BOVINO PROCESSADO EM BAIXAS CONCENTRAÇÕES ESPERMÁTICAS
Crespilho, A.M.1; Papa, F.O.2; Alberti, K.3; Siqueira Filho, E.R.4; Martins Jr., A.5;
Novaes, J.L.C.6
1,2,3,4
DRARV-FMVZ, Unesp Botucatu/SP; 5DCCRA –FMVA, Unesp Araçatuba/SP; 6 DM-IB,
Unesp Botucatu/SP. andremacc@yahoo.com.br
O desenvolvimento de novas técnicas de sexagem de sêmen bovino têm gerado a necessidade de

novos diluidores seminais voltados à congelação de doses com baixas concentrações espermáticas.
Nesse sentido, o objetivo do trabalho foi comparar a eficiência de dois diluidores na congelação
de sêmen bovino processado em baixas concentrações espermáticas por meio da análise
computadorizada do movimento espermático (CASA) e integridade de membrana plasmática
(IMP) pós-descongelação. Foram utilizados 10 ejaculados de diferentes touros da raça Nelore
(idade entre 20-24 meses), obtidos por meio de eletroejaculação. Cada ejaculado foi fracionado
em 2 alíquotas que foram processadas com os diluidores Tris-gema de ovo-frutose (TRIS) ou
Botu-Bov® (meio BB, Biotech Ltda, Botucatu/SP/Brasil) na concentração de 6 x 10 6
espermatozóides /palheta de 0,5 mL. Após o envase, as amostras foram resfriadas em geladeira
digital (Mini-Tüb®) a temperatura constante de 5ºC por 3 horas, mantidas a 5 cm da superfície do
nitrogênio líquido (N2) em caixa de isopor convencional de 35 L por 20minutos, e imersas
diretamente no N2. Após a descongelação (46ºC/20 segundos) as amostras foram avaliadas pela
técnica CASA (Hamilton-Thorn Resarch®-IVOS 10) e pela combinação de sondas fluorescentes
acetato de carboxifluoresceína e iodeto de propídeo, diferenciando espermatozóides portadores
de membrana plasmática íntegra ou lesada. As médias obtidas para cada variável foram comparadas
entre os diluidores através do teste “T” de Student (p < 0,05). Dentre as variáveis geradas pela
técnica CASA, foram observadas diferenças significativas para velocidade curvilinear (VCL =
116,8 ± 29,9 vs 173,5 ± 52,1 µm/s; p=0,007); amplitude lateral de cabeça (ALH = 4,4 ± 1,4 vs
6,7 ± 1,7 µm; p=0,004), freqüência de batimentos (BCF = 31,2 ± 3,4 vs 23,0 ± 4,3 Hz; p=0,0003),
retilinearidade (STR = 93,0 ± 1,8 vs 82,0 ± 4,9 µm/s; p=0,0001) e linearidade (LIN = 71,6 ± 5,7
vs 54,9 ± 6,5 µm/s; p=0,0001), respectivamente, para os espermatozóides criopreservados com
o diluidor BB e TRIS. Não foram observadas diferenças significativas na IMP pós-descongelação
entre os dois diluidores (28,3 ± 12,1 vs 31,7 ± 7,7 %, p=0,465). Segundo Verstegen et al. (2002),
elevados valores de VCL e ALH, e baixos de LIN correspondem a características compatíveis
com o estado de hiperativação espermática, condição indesejável freqüentemente relacionada ao
processo de capacitação. Nas doses criopreservadas com o diluidor BB, por apresentarem valores
significativamente maiores de LIN e menores de VCL e ALH, provavelmente não foram
desencadeados os fenômenos da hiperativação e conseqüente capacitação espermática. Os
resultados obtidos sugerem que o diluidor BB foi mais eficiente na criopreservação de doses
seminais bovinas processadas em baixas concentrações.
Apoio: FAPESP/Brasil.
s310
VIABILIDADE IN VITRO DE SÊMEN DE TOURO CRIOPRESERVADO COM DOIS

DILUENTES E REDUZIDA CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA
Martins Jr., A.1; Calegari, R.S.1; Crespilho, A.M.2; Papa, F.O.2
1
Departamento de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal, UNESP, 16050-680, Araçatuba-SP,
Brasil; 2Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, UNESP, 18618-000,
Botucatu-SP, Brasil. amartins@fmva.unesp.br
Esforços para produzir doses inseminantes com menor número de espermatozóides são de grande
interesse, principalmente em se tratando de touros de alto mérito genético. Este estudo foi delineado
para avaliar a influência de dois diluentes, contendo diferentes concentrações espermáticas, sobre
a qualidade do sêmen criopreservado. Todas as amostras seminais foram colhidas na Central
VR, a partir de seis touros da raça Nelore, em regime regular de coleta. Cinco ejaculados de cada
touro foram obtidos através de vagina artificial. O sêmen foi diluído com Tris-gema (constituído
de 2,42 g de Tris, 1,38 g de ácido cítrico, 1,0 g de frutose, 7 mL de glicerol, 20% de gema e
antibióticos, para 100 mL de solução) ou Botu-bov (Biotech Ltda, Botucatu, Brasil), designados
como TG e BT, respectivamente. Os ejaculados foram pesados e examinados antes de serem
divididos em três alíquotas, iguais, de acordo com os seguintes grupos de tratamento: TG-30
(controle), TG-20 e BT-20, correspondendo às concentrações espermáticas de 30 e 20 milhões
de espermatozóides, por palheta. A seguir, as amostras foram resfriadas a 4oC por 5 horas e,
então, congeladas em palhetas de 0,5 mL. Cinco amostras de cada touro, de cada colheita, foram
descongeladas em água a 40oC, por 20 s, e examinadas. Os parâmetros de motilidade espermática
pós-descongelação foram avaliados através de sistema de análise computadorizado (Hamilton
Thorne Research, Beverly, USA). Oito características espermáticas consideradas de interesse,
tais como: motilidade (M: %), motilidade progressiva (MP: %), velocidade curvilínea (VCL:
µm/s), velocidade em linha reta (VLR: µm/s), velocidade média de trajeto (VMT: µm/s),
retilinearidade (RET: %), linearidade (LIN: %) e amplitude de deslocamento lateral da cabeça
(ADLC: µm) foram determinadas. Sondas fluorescentes (6-diacetato de carboxifluoresceína e o
iodeto de propídeo) foram usadas para verificar a integridade de membrana. Espermatozóides
com fluorescência em vermelho foram considerados como tendo membranas danificadas, e os
em verde, como membranas intactas. Os dados foram analisados através de ANOVA e teste de
Tukey, com probabilidade de 5%. Maiores percentagens (P<0,05) de MP (60,3±10,7) e LIN
(69,8±6,7), bem como melhor ALDC (4,9±0,9 µm) foram obtidas para o diluente BT-20 do que
TG-30 (53,3±8,0, 61,9±5,5 e 5,9±0,8) e TG-20 (51,3±9,3, 60,1±5,9 e 6,3±1,2). Resultados
similares (%) foram encontrados entre os diluentes para M, RET e integridade de membrana,
com valores variando de 67,1±10,6 a 71,0±12,6, 82,4±4,7 a 88,0±5,4 e 46,1±10,2 a 51,7±11,5,
respectivamente. Contudo, VMT e VCL foram, significativamente, maiores (P<0,05) para os
diluentes TG-20 (122,3±12,8 e 177,8±26,4 µm/s, respectivamente) e TG-30 (114,7±13,6 e
166,3±19,5 µm/s) quando comparados ao BT-20 (105,4±11,9 e 142,5±19,1 µm/s), com VLR
sendo melhor para TG-20 (100,0±7,2 µm/s) do que TG-30 (97,0±8,1 µm/s) e BT-20 (93,0±10,5
µm/s), sem diferenças entre TG-30 e TG-20 ou TG-30 e BT-20. Com base nos resultados, outras
investigações são necessárias para elucidar esses achados. Assim, a capacidade fertilizante dos
espermatozóides, de amostras de TG-20 e BT-20, deve ser comparada em teste de fertilidade de
campo. (Autores agradecem à Central VR, Araçatuba-SP).
s311
CONGELAMENTO DE SÊMEN DE CAMUNDONGO COM A UTILIZAÇÃO DE

SACAROSE E LEITE DESNATADO
Lucca Neto, J.A.1; Amaral, V.L.L.1; Cordini, M.1; Frajblat, M.1
1
Laboratório de Biotecnologia da Reprodução, Centro de Ciências da Saúde, Universidade do
Vale do Itajaí, UNIVALI, Itajaí, SC, Brasil. frajblat@univali.br
Existe um grande número de linhagens de camundongos atualmente utilizados em pesquisas

científicas. Este número cresce constantemente devido à produção de novas linhagens transgênicas
e geneticamente modificadas. A criação de bancos genéticos de gametas e embriões
criopreservados é fundamental para que estas linhagens sejam preservadas de forma segura e
eficiente. O congelamento de espermatozóides de camundongo é uma das estratégias destes
bancos genéticos, pois através da FIV com linhagens diferentes torna-se possível a produção de
animais híbridos. O objetivo deste estudo foi testar o uso da sacarose diluída em água e leite
desnatado como meio de congelamento de espermatozóides de camundongos. Machos da linhagem
Swiss (n = 15) provenientes do biotério da UNIVALI com idade entre 2 – 3 meses foram utilizados.
O meio de congelamento (água Milli-Q, 0,3M sacarose e 3% leite em pó desnatado) foi preparado
e centrifugado (30 minutos, 11.000 rpm) e o sobrenadante utilizado (Sztein et al.,
Cryobiology,41:28-39,). Após a eutanásia dos animais através do deslocamento cervical, os ductos
deferentes foram removidos e seu conteúdo liberado em uma gota de 100 μl de meio de
congelamento a temperatura ambiente. Os espermatozóides foram transferidos para um volume
maior (300 μl) e incubados a 37ºC por 10 minutos. A avaliação da motilidade pré-congelamento
foi realizada com o registro de qualquer movimento dos espermatozóides. Estes foram envasados
em palhetas de 0,25 ml com uma concentração média de 468 ± 59 x 104/ml e colocados a 3 cm do
nitrogênio líquido por 2 minutos e imediatamente imersos. Para o descongelamento as palhetas
foram colocadas em água a 37ºC por 1 minuto e a motilidade pós-congelamento avaliada em
lâminas de microscopia pré-aquecidas cobertas por lamínulas. Duzentos espermatozóides foram
contados e a motilidade repetida. Três animais foram excluídos da análise devido a motilidade
inicial estar abaixo de 50% (22%, 41% e 48%). A média (± desvio padrão) da motilidade pré-
congelamento e pós-congelamento foi 66,5 ± 9 % e 26,3 ± 7%, respectivamente. Independente
da motilidade pré-congelamento, houve uma redução média de 40 % na motilidade pós-
congelamento. Os resultados deste estudo indicam que espermatozóides desta linhagem podem
ser congelados utilizando um meio a base de leite desnatado e sacarose. A utilização deste protocolo
utilizando vários animais em uma mesma amostra e associado a separação de espermatozóides
móveis com a técnica “swim up” antes ou depois do congelamento possivelmente resultará em
melhores resultados e deverá ser testada futuramente. A baixa motilidade pré-congelamento desta
cepa de Swiss deve ser melhor investigada por métodos mais precisos.
s312
COMPARAÇÃO DA EFICÁCIA DE DUAS SOLUÇÕES DE VITRIFICAÇÃO PARA

MÓRULAS DE CAMUNDONGO
Amaral, V.L.L.1; Cordini, M.1; Salvador, R.A.1; Weingril, R.B.1;

Mezzalira, A.2; Frajblat M.1
1
Laboratório de Biotecnologia da Reprodução, Centro de Ciências da Saúde, Universidade do
Vale do Itajaí, UNIVALI, Itajaí, SC, Brasil. 2Laboratório de Reprodução Animal,
Universidade do Estado de Santa Catarina, UDESC, Lages, SC, Brasil. frajblat@univali.br
Atualmente, inúmeras linhagens de camundongos geneticamente modificadas e transgênicas foram

desenvolvidas como modelos para estudo de diversas patologias encontradas em seres humanos.
A manutenção destes animais, além de custos elevados, envolve grandes riscos, seja em função
de acidentes com perdas, seja por contaminação genética de linhagens. Desta forma, o mais
seguro é manter os embriões criopreservados. Este trabalho foi realizado com o objetivo de
testar duas soluções de vitrificação para mórulas de camundongos com a combinação do etileno
glicol (EG) com dimetil sulfóxido (DMSO) ou com propanediol (PRO). Fêmeas F1 (Swiss x
C57BL/6) foram superovuladas com a administração de eCG (10UI, IP, Novormon®), seguida
de hCG (10UI, IP, Vetecor®), após 48 horas. A coleta das mórulas foi realizada três dias após a
visualização do tampão vaginal, por lavagem uterina com meio HTF-hepes (Life Global®, EUA)
suplementado com 10% SFB. Mórulas com qualidade excelente ou boa foram submetidas a um
de dois protocolos de vitrificação. No Grupo DMSO (n=131) procedeu-se a exposição por 2
minutos a uma solução de 10% EG, 10% DMSO, 0,25 M sacarose, 10% SFB, seguida da exposição
por 30 segundos à solução de vitrificação (20% EG, 20% DMSO, 0,5 M sacarose, 10% SFB). No
grupo PRO (n=157), procedeu-se a exposição por 2 minutos a uma solução de 10% EG, 10%
PRO, 0,25 M sacarose, 10% SFB, seguida da exposição por 30 segundos à solução de vitrificação
(10% EG, 10% PRO, 0,25 M sacarose, 10% SFB). Todas as soluções tiveram como base o meio
HTF-hepes. Como controle, 126 Mórulas não vitrificadas foram mantidas em cultivo. Para a
vitrificação, grupos de 10 mórulas foram envasadas em cada palheta de 0,25 ml e foram submersas
em nitrogênio líquido. O aquecimento foi realizado por 20 segundos de exposição ao ar seguido
de 40 segundos em água à 27ºC, sendo a remoção dos crioprotetores realizada com a exposição
a 100 μl de soluções decrescentes de sacarose (0,3 M, 0,15 M), com permanência de 5 minutos
cada. A seguir, as mórulas foram transferidas para gotas de 50 μl de meio Global (Life Global®),
sob óleo mineral e mantidas por 48 horas em estufa a 37ºC, com 5% CO2, em umidade saturada.
Como critério de avaliação utilizou-se a taxa de blastocisto, avaliada com 24 e 48 horas. Com 24
horas, observou-se maior taxa de blastocistos (P<0,05; Teste Qui-quadrato) no grupo controle
(50,8%), em relação aos grupos vitrificados com DMSO (33,3%) ou PRO (26,2%), que não
diferiram entre si. Na avaliação de 48 horas foram observadas diferenças significativas entre o
grupo controle (96,8%) e os vitrificados com DMSO (83,3%) ou PRO (81,5%). Os resultados
deste estudo indicam que a vitrificação de mórulas de camundongos utilizando o DMSO ou
PRO associados ao EG proporcionam excelentes taxas de formação de blastocisto. Apesar das
taxas de blastocisto semelhantes, os embriões vitrificados tiveram um desenvolvimento mais
lento em relação aos não vitrificados.
s313
INFLUÊNCIA DO DIÂMETRO EMBRIONÁRIO E EFEITO DA ADIÇÃO DE

SACAROSE AO MEIO DE VITRIFICAÇÃO SOBRE A TAXA DE SOBREVIVÊNCIA
DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO
Varago, F.C.1; Vasconcelos, A.B.1; Oliveira, C.H.1; Alvin, M.T.T.2;

Saliba, W.P.2; Elias, N.Q.2; Lagares, M.A.1
1
Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária - UFMG/Belo Horizonte - MG, 2Cenatte
Embriões - Pedro Leopoldo – MG. fafavarago@terra.com.br
As taxas de sobrevivência pós-descongelamento de embriões bovinos produzidos “in vitro” podem

ser afetadas por diversos fatores tais como: meio de cultivo, raça, estádio de desenvolvimento,
qualidade, tamanho do embrião, entre outros. O presente estudo teve como objetivo avaliar o
efeito da adição de sacarose ao meio de vitrificação e a influência do diâmetro embrionário sobre
as taxas de sobrevivência pós-criopreservação. Os oócitos foram obtidos por meio de punção
ovariana de vacas zebuínas guiada por ultra-som e maturados por 24 horas a 38.7°C, em incubadora
contendo (5% de CO2, 5% de O2, 90% de N2 e umidade saturada). Para a fecundação (D0), foi
utilizado sêmen de reprodutor da raça Nelore, selecionado por gradiente de Percoll. No 7º dia de
cultivo (5% de CO2, 5% de O2, 90% de N2 e umidade saturada), 64 blastocistos de excelente
qualidade foram divididos nos 2 tratamentos de vitrificação: T1) 25% etilenoglicol + 25%
dimetilsufóxido + 50% meio de manutenção (n=30) e T2) 20% etilenoglicol + 20%
dimetilsufóxido + 10% solução de sacarose + 50% meio de manutenção (n=34). Após 40 segundos
de exposição às soluções de vitrificação, os embriões foram envasados em “Open Pulled Straws”
(“OPS”), que foram imersas em nitrogênio líquido. A mensuração do diâmetro dos embriões foi
efetuada com auxílio de microscópio de campo claro, por meio de micrômetro ocular (escala
1mm/100).A cada medida encontrada foi aplicado um fator de correção obtido com um micrômetro
objetivo .O diâmetro inicial dos embriões variou de 160 a 220 µm, sendo que os embriões foram
distribuídos proporcionalmente entre os tratamentos, de acordo com as seguintes categorias: 160
a 175 µm- 8 embriões tanto no T1 como no T2, 180 a 200 µm- 18 e 20 embriões no T1 e T2,
respectivamente, 205 µm acima- 4 e 6 embriões no T1e T2, respectivamente. No aquecimento, a
extremidade da “OPS” foi inserida em solução de 0,5M de sacarose e subsequentemente os
embriões foram rehidratados em decrescentes soluções de sacarose e cultivados. Após 24 horas
de cultivo os embriões foram novamente mensurados e foi avaliada a taxa de re-expansão (30%
e 44,1%), e após 48 horas, foi avaliada a taxa de eclosão (13,3% e 26,7%), nos tratamentos 1 e 2
respectivamente. Os dados de sobrevivência embrionária foram analisados por meio da tabela de
contingência, e as possíveis diferenças comparadas pelo teste de Qui-quadrado (÷2), utilizando-
se o programa estatístico Statistical Analyses System. A avaliação do diâmetro embrionário foi
realizada pelo teste de Qui-quadrado (÷2) em fatorial 2x2. O teste t de Student foi utilizado na
comparação de médias. Não houve diferença estatística significativa (p<0,05) nas taxas de re-
expansão e eclosão entre os tratamentos 1 e 2, respectivamente. Neste experimento, 98,5% dos
embriões sobreviventes após o cultivo apresentaram diâmetro maior que 190 µm, enquanto
embriões menores que 180 µm não sobreviveram aos tratamentos. No entanto, não foi encontrada
diferença significativa (p>0,05) entre o diâmetro inicial daqueles embriões que sobreviveram
comparados àqueles que não sobreviveram. Portanto, a adição de sacarose ao meio, assim como
o diâmetro embrionário antes da vitrificação, não influenciaram a viabilidade embrionária pós
criopreservação.
s314
ANÁLISE DA EFICIÊNCIA DE UMA CONGELADORA PORTÁTIL NA

CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN SEXADO BOVINO
Franco, R.V.R.1; Oliveira, K.M.1,2; Reis, F.A.C.1; Nishikawa, M.F.A.1; Braga, M.Q.1;
Rodrigues, L.F.1; Galeli, G.1; Moura, E.P.1; Tavares, M.3
1
Goyaike Brasil Agropecuária Ltda – Laboratório de Sêmen Sexado – Uberaba-MG- Brasil; 2
Pós-Graduanda –Pós Graduação Ciências Veterinárias – FAMEV/ UFU; 3 Faculdade de
Matemética – FAMAT/ UFU; rfranco@goyaike.com ; kmello@goyaike.com
Durante o processo de congelação o espermatozóide passa por mudanças estruturais nas

membranas o que pode resultar em diminuição da fertilidade. Os resultados obtidos até hoje com
a criopreservação de células espermáticas são satisfatórios, porém deixam muitas dúvidas sobre
os efeitos deletérios que o processo de criopreservação causa sobre a viabilidade da célula
espermática (WATSON, P.F., Reproduction Fertility of Development, v.60-1, p.481,2000), o que
torna necessário uma padronização minuciosa da taxa de resfriamento e congelação nos
equipamentos utilizados. Este estudo foi realizado para comparar os efeitos de dois sistemas de
congelação automatizados sendo um deles portátil, sobre a motilidade e vigor do sêmen sexado
bovino criopreservado pelos mesmos. Para o presente experimento foram utilizados 43 ejaculados,
de 8 touros das raças Nelore, Gir leiteiro, Girolando e Holandês sendo utilizadas 43 ejaculados
nos dois equipamento de criopreservação. O sêmen foi sexado utilizando o protocolo para sexagem
de sêmen bovino (JOHNSON, L.A., Journal Animal Science, v.77, p.213,1999) o mesmo foi
processado no equipamento citômetro de fluxo MoFlo SX® (DaKocitomation, Fort Collins, CO),
mantidos á 4ºC durante 1h30’, posteriormente submetido a centrifugação, com o sobrenadante
descartado e o pellet rediluído em um meio sintético de congelamento Bioxcell® (IMV, França)
contendo glicerol como crioprotetor e envasadas em palhetas de 0,25 ml com concentração de
3x106 espermatozóides totais. Os sistemas de criopreservação utilizados foram: Digitcool 5300®
(IMV , França) usada pelas grandes centrais de colheita de sêmen bovino e um portátil Cryogen®
( Neovet, Uberaba, MG, Brasil) composto por um aparelho programável, equipado com um
porta-palhetas, um tubo de resfriamento e uma caixa térmica para nitrogênio líquido que pode
ser utilizada em laboratório e ou a campo. A seguinte curva de congelação foi utilizada em
ambos equipamentos (20ºC a 4ºC, 0,8ºC/ segundos; 4ºC a – 15ºC, 0,1ºC/ segundos; -15ºC a -
140ºC, 0,7ºC/ segundos) para criopreservação das palhetas sexadas. Após a congelação as palhetas
foram mantidas em botijões criogênicos e descongeladas para avaliação da motilidade (%) e
vigor (1-5) por microscopia óptica. A análise estatística foi realizada com o auxílio do Programa
SAS® (SAS Institute, Cary, NC, USA), utilizou-se o teste não paramétrico de MANN-WHITNEY
(p ≤ 0,05) este foi usado devido a não normalidade dos dados. A motilidade média e vigor médio
encontrado para o grupo de palhetas criopreservadas pela congeladora Digitcool 5300® foi 35%
e para o grupo criopreservado através da Cryogen foi 35,2 % e vigor 3 para ambas. Não houve
diferença significativa entre as médias dos dois grupos para motilidade e vigor já que as
significâncias do teste foram superiores a 0,05. Podemos concluir que o equipamento portátil
pode ser usado em laboratório e ou a campo com a mesma eficiência.
s315
EFEITO DE DIFERENTES TAXAS DE RESFRIAMENTO SOBRE A

CRIOPRESERVAÇÃO DE SEMEN CAPRINO
Rovay, H.1; Torres, C.A.A.1; Furst, R.1; Palhão, M.P.1; Araújo, R.R.1; Bispo, C.A.S.1;
Rodrigues, A.L.2; Zambrini, F.N.2
1
DZO- UFV, Av. P.H. Rolfs s/n, Cep 36570000, Viçosa-MG, Brasil; 2 DVT- UFV, Av. P.H.
Rolfs s/n, Cep 36570000, Viçosa-MG, Brasil. hrovay@yahoo.com.br
Baixas temperaturas afetam a estrutura física e os processos biofísicos dos organismos vivos de
uma maneira ampla e complexa. Durante o resfriamento alguns lipídios da membrana plasmática
dos espermatozóides sofrem alterações estruturais devido à redução da temperatura. Uma taxa
de resfriamento adequada é necessária para prevenir danos estruturais, bioquímicos e biofísicos
da membrana, devido ao choque térmico. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes
taxas de resfriamento (de 24 a 5°C) sobre as características de motilidade de espermatozóides
caprinos criopreservados. Um total de 20 ejaculados, de animais da raça Saanen (n=2) e Alpina
(n=2) foram congelados utilizando-se um meio a base de Leite Desnatado (LD), acrescido de 5%
de glicerol. Alíquotas do sêmen diluído foram então resfriadas a uma taxa linear (-0,5°C/minuto)
ou não linear (queda média = -0,5°C/minuto (FURST, R., Dissertação de Mestrado, Universidade
Federal de Viçosa, 2002)), antes de serem congeladas em nitrogênio liquido. O sêmen foi avaliado
quanto a sua motilidade total, vigor, resposta ao teste hiposmótico (HOST), a coloração supra-
vital e ao teste de termo-resistência (TTR), antes e após o congelamento. Não houve diferença
(P>0,05) entre os animais e as raças na avaliação das características físicas (volume, concentração,
vigor, motilidade total e progressiva) e morfológicas do sêmen fresco. A taxa de resfriamento
não linear resultou em uma maior (P<0,05) motilidade total (46 x 38%) e porcentagem de células
vivas (42 x 31%) após o descongelamento. Não houve diferença (P>0,05) no vigor e HOST
entre os tratamentos. A motilidade total avaliada pelo TTR no tempo 0 e 30 minutos após o
descongelamento foi maior (P<0,05) para a curva não linear, mas não apresentou diferença
(P>0,05) entre as curvas nos tempo de 1 e 2 horas após o descongelamento. As características
morfológicas não diferiram (P>0,05) entre as taxas de resfriamento do sêmen descongelado. Em
conclusão, o uso de uma curva de resfriamento não linear, durante a zona de temperatura do
choque térmico (entre 18 a 6°C) melhora a criopreservação do sêmen caprino.
s316
ANALISE ULTRAESTRUTURAL DE OÓCITOS EQÜINOS IMATUROS APÓS

VITRIFICAÇÃO COM COPOLÍMERO PVA
Curcio, B.R.1; Boff, A.L.N.1; Lins, L.2; Leite, D.S.P.2; Barros, S.S.3;
Nogueira, C.E.W.2; Deschamps, J.C.1
1
Centro de Biotecnologia/UFPel; 2 Dep. Clínicas Veterinárias/FV/UFPel, 3Dep. Patologia
Veterinária/FV/UFPel - Campus Universitário s/n°-Caixa Postal 354 CEP 96010-900, Pelotas/
RS. enderlebr@terra.com.br
O objetivo do presente estudo foi identificar lesões ultra-estruturais, em oócitos eqüinos imaturos,
após vitrificação em solução contendo copolímero PVA (SuperCool X-1000TM; 21st Century
Medicine). Oócitos provenientes de abatedouro (n=10) foram expostos durante 3 min a VS1
(1,4M DMSO +1,8M EG+1% Copolímero PVA), 1 min a VS2 (2,8M DMSO+3,6M EG+0,6M
Sacarose+1% Copolímero PVA) e vitrificados pelo método open-pulled-straws(OPS). O
reaquecimento foi realizado pela passagem dos oócitos em soluções com concentração decrescente
de sacarose. Um grupo de oócitos foi fixado imediatamente após a coleta, sendo utilizado como
controle (n=10). Após o reaquecimento, os oócitos foram mantidos durante 1 a 2 h em estufa à
38,5°C, sob atmosfera com 5% CO2, para estabilização das estruturas. Subseqüente, os oócitos
foram fixados em glutaraldeido e paraformaldeído a 2%. Sofreram fixação ósmica, foram
desidratados em concentrações crescentes de etanol e incluídos em blocos de resina. Os blocos
foram cortados com espessura de 50-70 nm, coletados em grades de cobre de 200 mesh e
contrastados por acetato de uranila e citrato de chumbo. Esses cortes foram observados e
fotografados em microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss-EM109). Os oócitos foram
classificados, de acordo com o grau de lesões encontradas após vitrificação, em três grupos: I)
Ótimo estado de conservação (n=3) ; II) Lesões intermediárias (n=2) e III) Lesões evidentes,
incompatíveis com a sobrevivência do oócito (n=5). Dois oócitos do grupo controle foram
classificados no grupo III, demonstrando sinais de degeneração. O restante não apresentou lesões
(n=8). Os oócitos classificados no grupo II apresentaram organelas íntegras. Porém, demonstraram
redução das microvilosidades na membrana plasmática e descontinuidade nas junções tipo
desmossomo, quando comparados aos oócitos do grupo I. No grupo III observou-se vesículas
coalescentes, que em alguns oócitos predominavam no ooplasma. A membrana plasmática
apresentou-se irregular e com ausência de microvilosidades. As organelas estavam degeneradas,
com exceção das gotas lipídicas e grânulos corticais. Em alguns oócitos observou-se extrusão
dos grânulos corticais para o espaço perivitelínico. As mitocôndrias não foram identificadas em
algumas células, e quando encontradas, apresentaram dilatação acentuada e perda da densidade
da matriz. As lesões encontradas de dilatação de mitocôndrias, presença de grandes vesículas
coalescentes e perda da continuidade das junções de comunicação são compatíveis com alterações
osmóticas. Essas são provocadas pela alta concentração de crioprotetores utilizada nas soluções
de vitrificação. Lesões ultra-estruturais similares foram descritas por Hochi (Cryobiology, 33,
300-310), porém esse autor encontrou lesões em 90% dos oócitos submetidos ao processo de
vitrificação. Conclui-se que oócitos eqüinos imaturos podem ser vitrificados com adição de
copolímero PVA. Contudo 70% das células apresentaram lesões de origem osmótica e citotóxicas,
proveniente da exposição às soluções crioprotetoras
s317
COMPARAÇÃO ENTRE DOIS PERÍODOS DE EQUILÍBRIO NA CONGELAÇÃO

DO SÊMEN DO GATO DOMÉSTICO (Felis catus)
Villaverde, A.I.S.B.1; Melo, C.M.1; Taconeli, C.A.2; Papa, F.O.1; Lopes, M.D.1
1
Depto de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária-FMVZ-UNESP, 18618-000,
Botucatu-SP, Brasil, 2 Depto de Bioestatística-IB-UNESP, Botucatu-SP, Brasil.
anavillaverde@fmvz.unesp.br
Pesquisas envolvendo a criopreservação de gametas masculinos e femininos nos gatos domésticos

vêm aumentando nos últimos anos com o objetivo de desenvolver técnicas que garantam maior
sucesso, quando aplicadas em programas de conservação para os felinos selvagens. A refrigeração
da célula espermática (39-25ºC até 0ºC) caracteriza-se como um dos momentos críticos dentro
do processo de criopreservação, podendo levar a danos permanentes à membrana espermática.
Portanto, para minimizar estas injúrias faz-se necessário um período de equilíbrio, o qual é
extremamente variável de acordo com o protocolo de congelação/descongelação e a espécie
animal utilizados. O objetivo deste estudo foi comparar dois períodos de equilíbrio para a
congelação de sêmen de gato doméstico, visando maior viabilidade das células espermáticas
após a descongelação. Foi coletado sêmen de 4 gatos adultos através de vagina artificial, por 3
vezes em dias alternados, totalizando 12 ejaculados. Após a coleta, o sêmen foi diluído em Tris/
OEP/glicose com 20% de gema de ovo (TOG) e, na seqüência, foram avaliadas; concentração,
motilidade (CASA), integridade de membrana (iodeto de propídio e diacetato de
carboxifluoresceína) e morfologia espermática, incluindo análise de acrossomo (Fast Green FCF/
Rosa Bengala). A amostra foi ajustada para 200x106 espermatozóides/mL, sendo posteriormente
diluída na proporção de 1:1 com TOG acrescido de 8% de glicerol e envasada em palheta de
0,25mL. Para cada coleta as palhetas foram divididas em dois grupos; (1) refrigeração por 20
minutos ou (2) refrigeração por 60 minutos, ambas realizadas em refrigerador (Minitüb®) à 5ºC.
Após o período de equilíbrio, as palhetas permaneceram por 15 minutos em vapor de nitrogênio
líquido, antes de serem mergulhadas. As amostras foram descongeladas à 46ºC durante 12
segundos e a avaliação espermática realizada da mesma forma que anteriormente à congelação.
Para a avaliação estatística foi utilizado o teste paramétrico de análise de variância para
delineamento em blocos, com p<0,05 como significativo. Não foi observada diferença significativa
entre os grupos com 20 ou 60 minutos de refrigeração, para todos os parâmetros analisados. Em
conclusão, uma vez que não foi constatada diferença entre os dois períodos de equilíbrio, a
refrigeração por 20 minutos pode ser utilizada, pois apresenta maior praticidade.
Agradecimento: FAPESP, Nestlé/Purina e Merial
s318
EFEITO DO PERÍODO DE ESTABILIZAÇÃO SOBRE A QUALIDADE DO SÊMEN

CAPRINO CRIOPRESERVADO
Bittencourt, R.F.2; Ribeiro Filho, A. de L.1; Chalhoub, M.1; Alves, S.G.G.1;

Biscarde, C.E.A.1; Vasconcelos, M.F.1; Silva, A.A.B.1; OBA, E.2
1-Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, 40170-110, Brasil.

2-Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia –UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil
rfbvet@yahoo.com.br
Sete amostras de sêmen, colhidas com a utilização de vagina artificial, foram submetidas a
criopreservação, com o objetivo de verificar a influência do período de estabilização (PE) sobre
a congelabilidade do sêmen caprino. O PE foi considerado o tempo total em que os
espermatozóides foram mantidos em contato com o glicerol e com os demais componentes do
diluidor, previamente a congelação. Logo depois da colheita e avaliação, o sêmen foi diluído e
envasado em palhetas de 0,25mL, com dose inseminante de 100 x 106 espermatozóides. Essas
foram encaminhadas para o resfriamento, com uma curva média de resfriamento de - 1,07oC/
min, até atingirem a temperatura de 5oC (30min de período de resfriamento). Depois desse período
as amostras foram mantidas a temperatura de 5oC até completarem 1, 2, 3 e 4h de tempo de
estabilização total, respectivamente G1, G2, G3 e G4. Posteriormente, congeladas em vapor de
nitrogênio líquido. A descongelação foi realizada em banho-maria à 37oC por 30s. As amostras
de sêmen também foram submetidas ao teste de termoresistência pós-descongelação, para a
espécie caprina. Para a análise estatística das características avaliadas, foi empregado o pacote
estatístico Statistical Analysis System (SAS), versão 5.0 (1996) (Procedimentos MEANS e GLM
com P<0,05). As médias obtidas para motilidade total e progressiva (%) à descongelação, para o
sêmen a fresco e para os grupos G1, G2, G3, G4 foram respectivamente, 62,8 e 57,8; 34,2 e 30,0;
43,5 e 38,5; 41,4 e 37,1; 45,0 e 40,7. Em relação a motilidade total os grupos G2, G3 e G4 foram
semelhantes entre si (P>0,05). O grupo G1 obteve o menor percentual de espermatozóides com
motilidade progressiva após a descongelação. Entretanto, esse valor não diferiu estatisticamente
em relação ao grupo G3. Após o teste de termoresistência, não foi verificada diferença significativa,
entre os diferentes grupos, para os parâmetros de motilidade total, progressiva e vigor espermático.
Os grupos G1 e G2 apresentaram menores índices (P<0,05) de defeitos maiores (14,1 x 11,4)
quando comparados aos grupos G3 e G4 (25,5 x 27,8). Para o grupo G2 (8,42), também foi
observado um menor percentual de espermatozóides com lesão de acrossoma, em relação aos
grupos G3 (20,4) e G4 (24,7). Os resultados obtidos permitem concluir que, através dos parâmetros
espermáticos estudados, o período de estabilização de 2h (G2) foi o protocolo que obteve os
melhores índices de viabilidade espermática após o processo de congelação-descongelação, quando
comparado com os demais protocolos estudados.
s319
DUAS TAXAS DE RESFRIAMENTO E DOIS PERÍODOS DE EQUILÍBRIO PARA A

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN CAPRINO
Bittencourt, R.F.2; Ribeiro Filho, A. de L.1; Alves, S.G.G.1; Vasconcelos, M. F.1;

Biscarde, C.E.A.1; Santana, R.C.M.1; Brandão, A.C.1; OBA, E.2

2-Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia –UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil
rfbvet@yahoo.com.br
Dez amostras de sêmen de dois caprinos adultos, colhidas com a utilização de vagina artificial,
foram submetidas a criopreservação com o objetivo de verificar a influência da taxa de resfriamento
e do período de equilíbrio, sobre a congelabilidade do sêmen caprino. Para tanto, o sêmen colhido
foi avaliado, diluído em meio à base de Tris-gema-Equex STM e envasado em palhetas de 0,25mL,
com dose inseminante de 100 x 106 espermatozóides. Posteriormente, as amostras de sêmen
foram distribuídas nos diferentes protocolos de resfriamento. Os grupos CL1 e CL2 foram
resfriados a uma taxa de -0,46oC/min e os grupos CR1 e CR2 foram submetidos a uma curva
mais rápida de resfriamento de -1,07°C/min, até atingirem a temperatura de 5°C. Depois desse
período, as amostras foram mantidas a temperatura de 5oC até completarem 1h de tempo de
equilíbrio total (grupos CL1 e CR1) ou 2h de tempo de equilíbrio (CL2 e CR2). Com o fim dos
respectivos protocolos, foi efetuado o processo de congelação em vapor de nitrogênio líquido. A
descongelação foi realizada em banho-maria à 37oC por 30s. As amostras de sêmen também
foram submetidas ao teste de termoresistência pós-descongelação, para a espécie caprina. Para a
análise estatística das características avaliadas, foi empregado o pacote estatístico Statistical
Analysis System (SAS), versão 5.0 (1996) (Procedimento MEANS e GLM com P<0,05). As
médias obtidas para motilidade total e progressiva (%) à descongelação foram 72,0 e 66,5 (sêmen
a fresco); 47,0 e 42,0 (CL1); 51,5 e 46,5 (CL2); 41,5 e 36,5 (CR1); 52,5 e 47,5 (CR2). Não foi
verificada diferença (P>0,05) nos parâmetros espermáticos de motilidade total e progressiva, vigor,
defeitos espermáticos e lesão de acrossoma, entre os diferentes grupos experimentais (CL1, CL2,
CR1 e CR2), tanto após a descongelação como depois do teste de termoresistência. Os resultados
obtidos permitem concluir que, não foi possível verificar a influência da taxa de resfriamento
nem do período de equilíbrio, sobre a viabilidade do sêmen congelado da espécie caprina.
s320
EFEITO DO EDTA, DO EQUEX STM PASTE E DA LECITINA DE SOJA SOBRE A

VIABILIDADE DO ESPERMATOZÓIDE CAPRINO PÓS-DESCONGELAÇÃO.
Bittencourt, R.F.2; Ribeiro Filho, A. de L.1; Vasconcelos, M. F.1; Alves, S.G.G.1;

Biscarde, C.E.A.1; Brandão, A.C.; OBA, E.2

2-Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia –UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil.
rfbvet@yahoo.com.br
Nove amostras de sêmen de dois caprinos adultos, colhidas com a utilização de vagina artificial,
foram submetidas a criopreservação, com o objetivo de verificar a eficácia do Equex STM Paste
(0,5%) (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA) e do EDTA (0,1%) (Vetec Ltda, RJ,
Brasil), adicionados a um diluidor a base de Tris-gema de ovo-glicerol, sobre a viabilidade
espermática pós-descongelação. Também foi objetivo desse trabalho, avaliar a utilização de um
diluidor comercial, a base de lecitina de soja (Bioexcell® - IMV, L’Aigle, França), para a congelação
do sêmen caprino. Assim, foram formados cinco grupos experimentais: TRIS; TRIS+EDTA;
TRIS+EQUEX; TRIS+EQUEX+EDTA e Bioexcell®. Logo depois da avaliação, o sêmen foi
diluído nos diferentes meios e envasado em palhetas de 0,25mL, com dose inseminante de 100 x
106 espermatozóides. Então, as amostras foram submetidas ao resfriamento, com uma curva
média de -0,46°C/min, até atingirem a temperatura de 5°C, mantidas por mais 75min em tempo
de equilíbrio e, posteriormente, congeladas em nitrogênio líquido. A descongelação foi realizada
em banho-maria à 37oC por 30s. As amostras de sêmen também foram submetidas ao teste de
termoresistência pós-descongelação (TTR), para a espécie caprina. Para a análise estatística das
características avaliadas, foi empregado o pacote estatístico Statistical Analysis System (SAS),
versão 5.0 (1996) (Procedimento MEANS e GLM com P<0,05). As médias obtidas para motilidade
total e progressiva (%) à descongelação, para o sêmen fresco e para os grupos TRIS; TRIS+EDTA;
TRIS+EQUEX; TRIS+EQUEX+EDTA e Bioexcell® foram respectivamente, 61,0 e 55,5; 38,7 e
34,3; 35,7 e 30,7; 44,3 e 39,3; 43,7 e 39,3 e 27,14 e 21,42 Não houve diferença (P>0,05) entre as
médias de motilidade total e progressiva, em relação aos grupos TRIS, TRIS+EQUEX e
TRIS+EQUEX+EDTA. O grupo Bioexcell ® obteve o menor (P<0,05) percentual de
espermatozóides com motilidade total e progressiva após a descongelação. Após o TTR, as
melhores (P<0,05) taxas de motilidade total e progressiva foram observadas para os grupos com
Equex STM (TRIS+EQUEX e TRIS+EQUEX+EDTA). E novamente, os piores (P<0,05) índices
de motilidade espermática foram verificados com o diluidor Bioexcell®. A adição do Equex
STM Paste promoveu um aumento nas taxas de viabilidade espermática após a descongelação,
quando comparado com os diluidores que não o continham.
s321
VITRIFICAÇÃO DE OÓCITOS BOVINOS IMATUROS ENVASADOS EM

SUPORTES COM DIFERENTES CONDUTIVIDADES TÉRMICAS
Bunn, S.; Bertolini, M.; Cruz, F.B.; Vieira, A.D.; Pedrazzi, C.; Cesaro, M.P.;
Ortigari, I.; Ribeiro, E.S.; Mezzalira, J.C.; Mezzalira, A.
Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem – Centro de Ciências

Agroveterinárias CAV – Universidade do Estado de Santa Catarina UDESC – Lages SC
O aumento na velocidade de resfriamento é tido como condição necessária para melhorar a

viabilidade pós-reaquecimento de oócitos vitrificados. Entretanto, esse aumento de velocidade
pode ser diretamente influenciado pela temperatura do liquido refrigerante e pela condutividade
térmica do suporte de vitrificação. O nitrogênio liquido (N2L) quando submetido ao vácuo se
resfria a temperaturas inferiores ao ponto de ebulição (-196°C), eliminando o vapor e favorecendo
a troca de calor entre o liquido super-resfriado e a amostra. Este efeito pode ser ampliado com o
uso de materiais de maior condutividade térmica. O objetivo deste estudo foi determinar se o uso
de nitrogênio super-resfriado (-210°C) associado ao uso de suportes construidos com materiais
de distinta condutividade térmica, podem afetar a subsequente produção embrionária a partir de
ovócitos imaturos vitrificados. Complexos cumulus oócitos (n=1454) de qualidade excelente ou
boa, obtidos de ovários coletados em abatedouro, foram expostos a uma solução composta de
10% etileno glicol (EG) + 10% dimetil sulfoxido (DMSO) + 20% soro de égua em estro (SEE)
em TCM Hepes, durante 30 segundos. Após, grupos de 5 ou 6 oócitos foram submetidos à
solução de vitrificação composta de 20% EG + 20% DMSO e 0,5M Sacarose, durante 20 segundos,
período em que foram envasados em um de quatro suportes: palhetas metálicas (PM, n=265);
micropipetas de vidro (MV, n=279); palhetas plásticas cortadas em bisel (PB, n=280); palhetas
plásticas estiradas (OPS, n=272). Como controle, foi utilizado um grupo de oócitos não vitrificados
(GC, n=358). A seguir foram mergulhados em N2L super-resfriado para a vitrificação. No
reaquecimento, procedeu-se a exposição dos suportes ao ar por 3 segundos, seguida da exposição
dos oócitos (5 minutos cada) às soluções decrescentes de sacarose (0,30 e 0,15M), aquecidas a
35ºC. Os oócitos foram então submetidos a maturação, fecundação e cultivo in vitro. Não foram
verificadas diferenças (p>0,05) nas taxas de clivagem (D2 pós-inseminação) entre os tratamentos
PM (43,6%), MV (31,8%), PB (32,6%) e OPS (31,4%) que, todavia, foram inferiores (p<0,05)
ao GC (86,0%). Nos grupos vitrificados a melhor taxa de blastocistos (D7) foi obtida com o
tratamento PM (10,2%), que foi superior (p<0,05) aos tratamentos PB (6,1%) e OPS (6,1%), não
diferindo do grupo MV (8,0%) embora com tendência de ser superior (p<0,1). A taxa de
blastocistos do GC (35,0%) foi superior (p<0,05) aos grupos vitrificados. Já na taxa de eclosão
(D9), não foram observadas diferenças (p>0,05) entre os grupos vitrificados em PM (53,0%),
MV (56,0%), PB (41,0%) e OPS (50,0%), que foram inferiores ao GC (77,0%). Os dados permitem
concluir que a condutividade térmica do material do suporte de vitrificação da amostra afeta a
subsequente produção embrionária a partir de ovócitos imaturos vitrificados. Neste aspecto, as
palhetas metálicas foram mais efetivas que os suportes plásticos e apresentaram uma tendência
de superioridade em relação as micropipetas de vidro.
Suporte Financeiro – CNPq / UDESC
Agradecimentos – Frigorífico Verdi Pouso Redondo SC
s322
EFEITO DA REMOÇÃO DO PLASMA SEMINAL SOBRE A FERTILIDADE DO

SÊMEN CONGELADO BOVINO
Alberti, K.1; Papa, F.O.1; Siqueira Filho, E.R.1; Crespilho, A.M.1;

Martins Jr., A.2; Dell’Aqua Jr., J.A.1
1
DRARV-FMVZ-UNESP, 18618-000, Botucatu-SP, Brasil. karinaalberti04@yahoo.com.br
2
DCCRA-FOA-UNESP, 16015-050, Araçatuba-SP, Brasil.
Atualmente a indústria bovina baseia-se na utilização de sêmen congelado permitindo o melhor

aproveitamento do potencial genético dos reprodutores facilitando a distribuição do sêmen para
qualquer parte do mundo. Portanto há necessidade de incrementar a qualidade do sêmen
criopreservado minimizando os efeitos deletérios envolvidos. Há muito a metodologia de
criopreservação de sêmen bovino não apresenta grandes alterações devido a obtenção de índices
considerados satisfatórios. Baseando-se nas metodologias de criopreservação espermáticas usuais
em outras espécies, testou-se a remoção do plasma seminal pré-congelação em sêmen bovino.
Testes laboratoriais mostraram que a congelabilidade das amostras sem plasma seminal superaram
as congeladas convencionalmente (Alberti, et al. Acta Scientiae Veterinariae, 33, p.324, supl. 1,
2005). O objetivo deste experimento foi testar a capacidade fecundante de sêmen congelado sem
plasma seminal. Foi utilizado um touro da raça Brahman, coletado em três ocasiões para atingir
o número de doses necessárias. Cada ejaculado foi dividido em três partes, uma diluída em TRIS
(grupo controle) e as outras duas diluídas em Botu-Bov®, com e sem a remoção do plasma
seminal. Todas as amostras foram envasadas em palhetas de 0,5 ml, previamente identificadas
com: nome do touro e tratamento. Os tratamentos foram A, B ou C (A= TRIS; B= Botu-Bov®
sem remoção do plasma seminal e C= Botu-Bov® com o plasma seminal removido). As palhetas
foram estabilizadas em geladeira automática (Minitub® Porto Alegre-Brasil), a 5oC por três horas,
e posteriormente criopreservadas. Foram realizadas 418 inseminações artificiais: 196 na Fazenda
Santa Marta, e 222 na Agropecuária Café no Bule Ltda., sendo 140 vacas inseminadas no grupo
A, 139 no grupo B e 139 no grupo C. A escolha das palhetas para inseminação foi feita
aleatoriamente. Para a realização das IA utilizou-se o manejo reprodutivo habitual das
propriedades, IATF em ambas. Após o diagnóstico de gestação o grupo A obteve, 47,5% de
fertilidade, contra 51,8% do grupo B e 58,6% do grupo C. As análises dos resultados mostraram
que para o número de vacas inseminadas neste experimento não houve diferença (p>0,05) entre
os meios diluentes e a metodologia. As comparações individuais dos contrastes ortogonais entre
os grupos mostram a existência de tendência estatística de superioridade nas comparações do
diluente Botu-Bov® centrifugado contra TRIS (p<0,0444) e Botu-Bov® não centrifugado
(p<0,0663), com valores de “q2” de 0,0402 e 3,3713, respectivamente. O número de vacas
inseminadas não permitiu a comprovação da superioridade dos resultados de fertilidade do sêmen
criopreservado com a remoção do plasma seminal, porém a tendência estatística de superioridade
apresentada pelos contrastes ortogonais entre os grupos, mostrou que neste experimento o
desempenho do grupo C foi melhor que os demais. A remoção do plasma seminal aliada ao
Botu-Bov®, mostrou-se eficiente com base na tendência de superioridade da metodologia estatística
empregada, ficando claro que em experimentos futuros, haverá a necessidade um maior número
de vacas inseminadas por grupo.
Apoio Financeiro: FAPESP
s323
EFEITO DE DOIS DILUIDORES E DOIS SISTEMAS DE REFRIGERAÇÃO SOBRE

A VIABILIDADE DE SÊMEN DE CÃES
Ferreira, M.A.R.1; Barcellos, B.P.1; Brandão, F.Z.1; Nogueira, L.A.G.1;

Santos L.J.1; Pinho, T.G.1
1
MPVCV- FV - UFF, 24230-340, Niterói – RJ, Brasil. marcorocha@vm.uff.br
O presente estudo teve como objetivo determinar os efeitos de dois diferentes meios diluidores,
Meio Mínima Contaminação (MMC) (KENNEY et al.,1975) e meio Lactose - gema de ovo
modificado (SILVA FILHO, 1987), e de dois sistemas de refrigeração Equitainer® II e caixa
isotérmica após 24 horas de refrigeração, sobre as características seminais de cães. Foram utilizados
15 ejaculados de cinco cães (três de cada) obtidos através de manipulação digital, que foram
avaliados quanto ao volume, cor, concentração, motilidade progressiva, vigor espermático,
patologia espermática, porcentagem de espermatozóides vivos e com membrana plasmática íntegra
(Teste hiposmótico). As amostras foram diluídas na proporção de 1:3 (sêmen:diluidor) e a seguir
foram armazenadas nos dois sistemas de transporte sendo então analisadas após 12 e 24 horas de
refrigeração. Os resultados obtidos mostram que não houve diferença significativa da motilidade
progressiva, vigor espermático, porcentagem de espermatozóides vivos e patologia espermática
entre o sêmen fresco e o refrigerado em lactose gema após 12 horas de armazenamento em
ambos sistemas de refrigeração, já as amostras refrigeradas com o diluidor (MMC) apresentaram
valores significativamente inferiores ao sêmen fresco para todos parâmetros avaliados (p<0,05).
Após 24 horas de armazenamento, houve um declínio significativo (p<0,05) de todas as
características seminais estudadas em ambos os sitemas. As porcentagens de espermatozóides
com membrana plasmática íntegra foram significativamente inferiores (p<0,05) em relação aos
meios e momentos estudados em ambos sistemas de refrigeração. Não houve diferença
significativa de nenhuma das características seminais entre os dois sistemas de refrigeração.
Conclui-se, que o meio Lactose gema é superior ao MMC na manutenção da maioria dos
parâmetros do sêmen após 12 horas de refrigeração e que tanto o transporte refrigerado a 15oC
como a 5oC demonstraram-se similares na viabilidade do sêmen de cães por 24 horas.
s324
Resumos
Fisiologia/Endocrinologia
da Fêmea
s325
s326
CONSEQÜÊNCIAS HISTOPATOLÓGICAS DA COLHEITA SERIADA DE

AMOSTRAS ENDOMETRIAIS EM VACAS DA RAÇA NELORE (Bos taurus indicus)
DURANTE CICLO ESTRAL.
Maziero, R.R.D.1; Martin, I.1; Mattos, M.C.C.1; Teixeira, L.B.C.2; Oba, E.1; Ferreira, J.C.P.1
1
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – 2 Departamento de Clínica
Veterinária – FMVZ – UNESP/Botucatu – Distrito de Rubião Jr.– CEP 18618-000 – Brazil.
jcferreira@fmvz.unesp.br
A avaliação endometrial através de biópsias transcervicais é um método pouco empregado na

espécie bovina, porém bastante difundido na espécie eqüina. Esta técnica é indicada para elaborar
um prognóstico da habilidade do endométrio em manter a gestação. Para tanto, o objetivo deste
estudo foi avaliar a resposta inflamatória do endométrio conseqüente à colheita repetida de
fragmentos uterinos de vacas Nelore (Bos taurus indicus) durante o ciclo estral. Foram colhidos
fragmentos endometriais por via transcervical do corno uterino contralateral ao corpo lúteo de
16 fêmeas nos dias zero (ovulação), cinco, nove, treze e dezenove do ciclo estral com o auxílio
de uma pinça Yomann. Esta era introduzida através do canal cervical, com auxílio de manipulação
transretal e protegida por uma bainha plástica a qual era rompida após a introdução no canal
cervical, a fim de evitar contaminação. Os fragmentos foram lavados em solução fisiológica,
acondicionados em cassete plásticos para inclusão, fixados em formol tamponado 10% por 24
horas e, posteriormente, mantidos em álcool 70 até o momento da inclusão em parafina. Após a
inclusão, cortes de 3 μm foram obtidos, montados em lâminas com extremidade fosca e corados
em Hematoxilina – Eosina (HE). A avaliação da resposta inflamatória foi realizada em microscópio
óptico em aumento de 400X e considerou duas variáveis: tipo de células inflamatórias
predominantes (polimorfonucleares ou mononucleares) e intensidade de infiltrado inflamatório,
avaliado em um escore variando de 0 a 4 de acordo com a área do fragmento com infiltrado (0-
infiltrado ausente, 2 – infiltrado observado em 25 a 50% da área do fragmento, 3 - 50 a 75% e 4
- 75 a 100%). Durante a colheita observou-se à presença e as características do muco vaginal e
este foi classificado em: claro, sanguinolento, mucopurulento e purulento. Para a análise estatística
das variáveis estudadas foi utilizado o procedimento MIXED do SAS 8.202. A comparação de
médias foi realizada por análise de variância e o nível de significância foi estabelecido em 95%.
A técnica de biópsia utilizada, neste estudo, forneceu bons resultados para a avaliação do
endométrio uterino. O infiltrado mononuclear foi predominante nas lâminas analisadas e sua
intensidade não variou ao longo do ciclo estral (p = 0,22), sendo sempre observado um baixo
escore (variação de 0,73 a 1,44) de infiltração. Com relação a intensidade do infiltrado
polimorfonuclear, este modificou-se ao longo do ciclo estral (p < 0,05), com níveis crescentes
até o dia 13 e ausentes no dia 19, contudo, sempre foi observado um baixo escore de infiltração
(variação de 0 a 0,86). Em alguns animais foi observada a presença de muco durante a colheita
de fragmentos endometriais. O muco vaginal sanguinolento foi observado logo após a colheita e
provavelmente estava associado a um sangramento da ferida endometrial. Já o muco vaginal de
característica purulenta/mucopurulenta poderia estar relacionada a contaminação do ambiente
uterino. Porém a realização de biópsias endometriais não levou a alteração do intervalo interestro,
quando comparado ao grupo controle (sem colheita de fragmentos endometriais). Os resultados
demonstram que a colheita dos fragmentos endometriais não levou a inflamação generalizada do
ambiente uterino.
Apoio Financeiro: FAPESP e FUNDUNESP
s327
DETECÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE RECEPTORES DE PROGESTERONA E

ESTRÓGENO NO ENDOMÉTRIO DE VACAS NELORE (Bos taurus indicus)
DURANTE O CICLO ESTRAL
Martin, I.1; Rodrigues, M.M.P.2; Torres Neto, R.2; Weschler, F.S.3;

Láufer-Amorim, R.2; Oba, E.1; Ferreira, J.C.P.1
1
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – 2 Departamento de Clínica
Veterinária – 3 Departamento de Produção Animal – FMVZ – UNESP/Botucatu – Distrito de
Rubião Jr.– CEP 18618-000 – Brazil. jcferreira@fmvz.unesp.br
O objetivo do presente estudo foi quantificar a expressão e verificar a distribuição endometrial

de receptores de progesterona e estrógeno pela técnica de imunoistoquímica em vacas Nelore
(Bos taurus indicus) durante o ciclo estral. Foram colhidos fragmentos endometriais do corno
uterino contralateral ao corpo lúteo de 16 fêmeas nos dias zero (ovulação), cinco, nove, treze e
dezenove do ciclo estral. Os fragmentos foram lavados em solução fisiológica, acondicionados
em cassete plásticos para inclusão, fixados em formol tamponado 10% por 24 horas e,
posteriormente, mantidos em álcool 70 até o momento da inclusão em parafina. Para a realização
da técnica de imunoistoquímica cortes histológicos de 3 μm de espessura foram colocados sobre
lâminas, previamente tratadas com Poly-Lisine®. Para a detecção dos receptores de estrógenos,
procedeu-se a desparafinização, hidratação, recuperação antigênica com solução de citrato 10
mM, bloqueio da peroxidase endógena em solução de água oxigenada 3%, lavagens em solução
tampão de TRIS e incubação com BSA 5%. Na seqüência foi realizada incubação com anticorpo
primário (Estrogen Receptor Ab-17, rabbit polyclonal antibody, Labvision - USA) por 18 horas
em câmara úmida a 4oC e, posteriormente, com anticorpo secundário e complexo ABC
(DakoCytomation - USA) segundo instruções do fabricante. Para a revelação foi utilizado o
DAB Cromogen (DakoCytomation – USA) e para contra-coloração a Hematoxilina de Mayer
(Merck – USA). Para a detecção dos receptores de progesterona foram seguidos os mesmos
passos, com exceção da recuperação antigênica, que foi realizada com solução de EDTA 10 mM,
e do anticorpo primário empregado (Progesterone Receptor Ab-8 clone hPRa2+hPRa3, mouse
monoclonal antibody, Labvision – USA). Após a reação imunoistoquímica realizou-se a
desidratação do material e montagem das lâminas. A imunomarcação foi avaliada pela intensidade
dessa marcação. Para a análise estatística das variáveis estudadas foi utilizado o procedimento
MIXED do SAS 8.202. A comparação de médias foi realizada por análise de variância e o nível
de significância foi estabelecido em 95%. A intensidade de marcação dos núcleos positivos para
ambos os receptores variou ao longo do ciclo estral (p<0,0001). A intensidade de marcação para
o receptor de progesterona foi maior no estroma uterino nos dias zero e cinco (p<0,01) e no
epitélio glandular nos dias zero, cinco e nove (p<0,001); para o receptor de estrógeno a marcação
foi mais intensa no estroma uterino nos dias zero e cinco (p<0,05) e no epitélio glandular nos
dias zero, cinco e nove (p<0,05). Os resultados obtidos demonstraram que a técnica de
imunoistoquímica empregada é eficiente em detectar os receptores de estrógeno e progesterona
no endométrio bovino, sendo que estes variaram ao longo do ciclo estral.
s328
EXPRESSÃO GÊNICA DO RECEPTOR DE OCITOCINA NO ENDOMÉTRIO DE

VACAS NELORE (Bos taurus indicus) DURANTE O CICLO ESTRAL
Martin, I.1; Costa, I.B. 1; Machado, M.F.1; Castilho, A.C.S.2; Vetoratto, L.F.1;
Buratini Jr., J.2; Oba, E.1; Ferreira, J.C.P.1
1
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – FMVZ. 2 Departamento de
Fisiologia – IB– Unesp/Botucatu –Distrito de Rubião Jr. s/n – Cep 18618-000 – Brazil.
jcferreira@fmvz.unesp.br
No útero bovino, o número de receptores para ocitocina aumenta entre os dias 17 e 18 do ciclo
estral e encontra níveis máximos ao redor do estro (MEYER et al., Acta Endocrinology, v.118,
p.96-104, 1988). Outros autores (ROBINSON et al., Reproduction, v.122, p.965-79, 2001)
demonstraram que o RNAm para receptor de ocitocina diminui após o estro, voltando-se a se
elevar entre os dias 16 e 17 alcançando as condições observadas durante o estro ao redor do dia
21 do ciclo estral. Portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar o padrão de expressão
gênica do receptor de ocitocina pela técnica de RT-PCR no endométrio de vacas Nelore (Bos
taurus indicus) durante o ciclo estral. Foram colhidos fragmentos endometriais do corno uterino
contralateral ao corpo lúteo de 16 fêmeas nos dias zero (ovulação), cinco, nove, treze e dezenove
do ciclo estral. Os fragmentos foram lavados em solução fisiológica, acondicionados em criotubos,
congelados em nitrogênio líquido e, posteriormente, mantidos em freezer a -80oC até o momento
da extração de RNA. Fragmentos endometriais de aproximadamente 50 mg foram imersos em 1
mL de Trizol (Invitrogen®- USA), triturados em homogeinizador de tecidos (Polytron UltraTurrax
T-25 - USA) e submetidos à extração de RNA total de acordo com o protocolo Trizol (Invitrogen®-
USA). A expressão do receptor de ocitocina foi examinada por RT-PCR semiquantitativo com
oligonucleotídeos iniciadores espécie-específicos. O RT-PCR semiquantitativo foi validado pela
escolha de números de ciclos de PCR e quantidade de RNA dentro da fase linear da curva de
amplificação. A intensidade das bandas foi analisada por densitometria computadorizada. A
amplificação do RNAm da enzima GAPDH foi usada como controle interno no PCR e os dados
foram submetidos à ANOVA seguido pela comparação das médias pelo teste de Tukey-Kramer
HSD. A expressão do receptor de ocitocina foi detectada em todos os momentos do ciclo estral
avaliados, e se modificou ao longo deste (p < 0,01). A expressão foi maior no dia zero em
comparação aos demais dias avaliados (p d” 0,01), e semelhante entre os dias cinco, nove, treze
e dezenove do ciclo estral (p > 0,05). Os valores médios e erro padrão (Receptor de ocitocina/
GAPDH ± EPM) para a expressão gênica do receptor de ocitocina foram 598,12 ± 99,00 (n=7),
181,96 ± 87,43 (n=6), 172,56 ± 42,57 (n=7), 73,50 ± 20,01 (n=7), 145,98 ± 31,04 (n=5) para os
dias 0, 5, 9, 13 e 19, respectivamente. Em conclusão, os dados sugerem que a expressão gênica
dos receptores de ocitocina é regulada durante o ciclo estral em Nelore atingindo valores máximos
no estro.
s329
EFEITO DO TRATAMENTO COM CLONIDINE (AGONISTA ALFA-

ADRENÉRGICO) NA SECREÇÃO DE LH EM NOVILHAS DA RAÇA NELORE
PRÉ-PÚBERES
Oliveira, D.J.C.1; Nogueira, G.P.2
1
APTA – Pólo Regional de Votuporanga, CxP: 61,15100-000, Votuporanga-SP, Brasil,
2
DAPSA, UNESP, Araçatuba-SP, Brasil. danieljco@aptaregional.sp.gov.br
Melhorias genéticas visando uma redução da idade à puberdade contribuem para um aumento na
vida reprodutiva do animal e conseqüentemente um maior número de bezerros produzidos, com
benefícios para toda a cadeia produtiva. Na fase que antecede a puberdade o aumento na secreção
de GnRH desencadeia um novo aumento na liberação de LH e FSH, restabelecendo a atividade
gonadal e dando início ao período de maturação sexual. Este aumento na secreção de GnRH
pode estar relacionado a liberação de neurotransmissores, regulando a secreção de gonadotrofinas.
Em nossa hipótese avaliamos a participação do clonidine (estimulador alfa adrenérgico, 10μg/
kg/PV/iv) na secreção de LH, na presença ou não de esteróides gonadais. O experimento utilizou
novilhas da raça Nelore dividida em dois grupos com cinco animais cada: novilhas intactas e
novilhas ovariectomizadas. Amostras de sangue foram colhidas a cada 15 minutos por 4 horas
aos 8, 12 e 15 meses de idade. A concentração plasmática de LH foi quantificada por RIA, com
sensibilidade de 0,05 ng/ml e CV de 19% . As médias dentro de cada tratamento foram submetidas
à análise de variância, sendo comparadas através do teste de Duncan para medidas repetidas ao
nível de 5% de significância, empregando-se o programa SAS (Statistical Analysis System). A
concentração de LH do período pré-tratamento foi comparada ao pós utilizando o teste t de
Student para amostras pareadas (GraphPad Instat 3.00 for Windows 95, GraphPad Software, San
Diego, Califórnia, USA). Nas novilhas inteiras, embora a média da concentração plasmática de
LH tenha aumentado com a idade não houve diferença (p≥0,05) quando o período pré (0,36±0,05;
0,68±0,14; 0,62±0,24 ng/ml) foi comparado ao pós (0,40±0,10; 0,38±0,04; 0,34±0,04 ng/ml)
administração do clonidine, respectivamente, aos 8, 12 e 15 meses de idade. Nas novilhas
ovariectomizadas a concentração de LH foi menor (p≤0,05) no período pós (0,94±0,10; 1,02±0,08
ng/ml) quando comparado ao pré (1,68±0,12; 2,40±0,17 ng/ml) tratamento com clonidine,
respectivamente aos 12 e 15 meses de idade. O estímulo em receptores alfa adrenérgicos diminuiu
a secreção de LH nas novilhas ovariectomizadas aos 12 e 15 meses de idade. A administração do
clonidine nas novilhas inteiras não diminuiu a concentração de LH. O presente experimento
comprova a capacidade das vias adrenérgicas modularem a neurotransmissão envolvida na
secreção de GnRH.
s330
EFEITO DE DIFERENTES NÍVEIS DE SUPLEMENTAÇÃO SOBRE O

DESEMPENHO REPRODUTIVO DE VACAS LEITEIRAS MANTIDAS A PASTO
Salmazo, R.1; Santos, G.M.G.1; Mizubuti, I.Y.2; Moreira, F.B.2; Ribeiro, E.L.A.2;
Rocha, M.A.2; Costa, M.C.1; Silva, K.C.F.1; Schroeder, R.V.1; Rigo, A.G.1; Seneda, M.M.1
1
DCV-CCA-UEL, Londrina-PR, Brasil, 86051-890, gugamgs@hotmail.com; 2 DZ-CCA-UEL,
Caixa Postal 6001, 86051-890, Londrina-PR, Brasil.
Este experimento teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes níveis de suplementação nos
períodos pré e pós-parto, sobre o desempenho reprodutivo em 27 vacas leiteiras mestiças. Foram
utilizados diferentes níveis de suplementação de concentrado (em base seca) compreendendo os
seguintes tratamentos nos períodos pré-parto (PRE) e pós-parto (POS): PRE1= 0% do PV; PRE2=
0,5% do PV; PRE3= 1,0% do PV; POS1= 1kg para cada 2,5 kg de leite produzido; POS2= 1kg
para cada 2,0kg de leite produzido e POS3= 1kg para cada 1,5kg de leite produzido. Os animais
submeteram-se à avaliação ultra-sonográfica e de escore corporal a cada 7 dias. Dos animais
avaliados, quatro apresentaram cisto ovariano, dois morte embrionária precoce e seis apresentaram
infecção uterina. A média de intervalo entre parto - primeiro cio foi de 53,13 dias, variando de 19
a 105 dias. No período avaliado, 20 animais apresentaram cio e 13 animais conceberam. Com o
aumento do nível de suplementação pós-parto, aumentou-se a quantidade de animais que entraram
no cio nos 120 dias de avaliação, sendo de 2, 4 e 7 animais para os tratamentos 1, 2 e 3,
respectivamente. Com relação à concepção, o único tratamento em que todos os animais
conceberam, foi o tratamento PRE3 e POS3. Observou-se também maior número de concepções
entre os animais que receberam tratamento 2 e 3, tanto no pré (3 e 7 concepções, respectivamente)
quanto no pós-parto (4 e 7 concepções, respectivamente), em relação aos que receberam o
tratamento 1 (3 e 2 concepções, respectivamente no pré e pós-parto). A dispersão dos dados na
análise de regressão para início de atividade folicular (IAF) e início de crescimento folicular
(ICF) demonstrou que a melhora nos tratamentos pré e pós-parto provocou diminuição linear do
número de semanas para essas variáveis. Houve correlação negativa entre os parâmetros de
início de atividade folicular (-0,34) e crescimento folicular (-0,31) e escore corporal ao parto.
Pode-se observar, portanto, que um maior escore corporal ao parto está correlacionado a um
menor tempo para início do desenvolvimento ovariano. Pode-se concluir que a melhora no nível
de suplementação, tanto no pré quanto no pós-parto, aumenta a quantidade de animais que
manifestam cio e concebem nos primeiros 120 dias pós-parto, assim como na manutenção da
gestação. Ocorre diminuição linear no tempo para início de atividade folicular (IAF) e início de
crescimento folicular (ICF) à medida que se aumenta o nível de suplementação no pré e pós-
parto, sendo que esses parâmetros estão correlacionados também com o escore corporal ao parto.
Palavras-chave: concentrado, pré-parto, pós-parto.
s331
EXPRESSÃO GÊNICA DO RECEPTOR DE PROGESTERONA NA PLANCENTA DE

CADELAS EM DIFERENTES FASES DA GESTAÇÃO E PARTO
Veiga, G.A.L.1; Milazzotto, M.P.1; Gonçalves, J.S.A.1; Lúcio, C.F.1; Silva, L.C.G.1;
Visintin, J.A.1; Vannucchi, C.I.1
Departamento de Reprodução Animal - FMVZ / USP, São Paulo – SP, 05508-000, Brasil.
gigveiga@usp.br
A identificação da expressão gênica dos receptores hormonais é ferramenta importante para

predizer a ação destes hormônios em determinados períodos fisiológicos. Entretanto, até a
atualidade não há relatos da utilização da expressão gênica dos receptores esteroidais na placenta
de cadelas, como forma de contribuir para o melhor entendimento dos eventos endócrinos da
gestação e parto. A progesterona desempenha importante função no mecanismo fisiológico da
gestação e do parto em cadelas, desta maneira, estudos sobre a ação deste hormônio fornecerão
importantes informações sobre a fisiologia reprodutiva na espécie canina. O objetivo deste trabalho
é a avaliação da expressão gênica dos receptores de progesterona na placenta de cadelas em
diferentes fases da gestação e parto. Foram selecionadas 9 cadelas separadas em 4 grupos, de
acordo com a idade gestacional: 0-20 dias (n=1), 20 a 40 dias (n=3), 40 a 60 dias (n=3) e no
momento do parto (fase I do parto eutócico) (n=2). O período da gestação foi determinado por
exame ultra-sonográfico e avaliação morfológica do útero gravídico. As amostras de placenta
foram colhidas das cadelas submetidas à interrupção da gestação por ovário-histerectomia e
armazenadas em nitrogênio líquido (-196ºC) até o processamento. Para análise das amostras,
inicialmente foi realizado o isolamento do RNA total do fragmento de tecido com reagente TRIzol
(Invitrogen, CA, USA), seguindo instruções do fabricante, e posteriormente quantificado por
espectofotometria. A síntese do cDNA foi realizada pela reação de transcrição reversa, utilizando-
se o sistema SuperScriptTm II RNAse H- reverse transcriptase (Invitrogen, CA, USA) com 1 µg
de RNA total na presença do oligo dT. 5µl do cDNA foram submetidos a reação de PCR para o
gene constitutivo 18S (controle endógeno) e o gene do receptor da progesterona. Após a
amplificação, os produtos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% corado com
Brometo de Etídeo, em tampão TBE 1x, a 100 volts por 30 minutos e visualizados sobre luz
ultravioleta. A análise do gel de eletroforese revelou a presença de produtos de tamanho esperado,
tanto para o 18S (96 pb) como para o receptor de progesterona (200 pb) em todas as amostras
estudadas. É possível concluir que a placenta de cadelas apresenta receptores de progesterona
durante todas as fases da gestação (inicial, terço médio e terço final) e no parto, o que lhe confere
habilidade para responder às ações deste hormônio, seja por mecanismos endócrinos ou autócrinos.
A avaliação quantitativa da expressão dos receptores de progesterona na placenta em futuras
pesquisas poderá contribuir para o estudo temporal dos mecanismos endócrinos durante a gestação
e parto em cadelas.
s332
EFEITO DO PRÉ-TRATAMENTO COM TRIANCINOLONA SOBRE O INTERVALO

ENTRE A INDUÇÃO DO PARTO E O NASCIMENTO EM RECEPTORAS DE
EMBRIÕES BOVINOS
Rezende; L.F.C.1; Zúccari, C.E.S.N.1; Ayres, H.2; Torres-Júnior, J.R.S.2;

Rezende, C.R.L.3; Nasser, L.F.3
1
Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, UFMS, Campo Grande-MS.; 2Departamento
de Reprodução Animal, FMVZ/USP, São Paulo-SP; 3FIRMASA Tecnologia para Pecuária,
Campo Grande, MS. lfcrezende@yahoo.com.br
Estudos demonstraram que a indução com dexametasona e prostaglandina possui eficiência na

indução do parto, porém aumenta a incidência de retenção de placenta e dispersão dos
nascimentos. Trabalhos mostram que o Acetonido de Triancinolona (TRI) possui capacidade
de induzir maturação placentária, aumentando a eficácia do método convencional de indução
do parto. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes momentos de indução do
parto e doses de TRI, como pré-tratamento, sobre o intervalo de nascimento entre o momento
de indução e nascimento. Foram utilizadas 193 novilhas Bos taurus x Bos indicus, gestantes de
embrião nelore obtidos por produção in vitro. Em esquema fatorial 2x2 (doses TRI vs momentos
pré-indução) os animais foram divididos nos seguintes tratamentos T1 – 1 mg / 60 kg PV de
TRI aos 280 dias; T2 – 1 mg / 100 kg PV de TRI aos 280 dias; T3 – 1 mg / 60 kg PV de TRI aos
285 dias; T4 – 1 mg / 100 kg PV de TRI aos 285 dias, homogeneizados de acordo com
acasalamento e sexo fetal. Os animais receberam, sete dias após a pré-indução com TRI, a
administração de 30 mg de Dexametasona (Azium®, Schering-Plough) e 150 µg de D-
Cloprostenol sódico (Preloban®, Intervet), para indução do parto. Os tratamentos de pré-indução
e indução foram considerados eficientes quando os nascimentos ocorreram entre 24 e 72 horas
após a indução. Os resultados foram analisados por ANOVA, sendo as comparações das médias
pelo teste de Tukey e Qui-quadrado e, a homogeneidade das variâncias pelo teste de Bartlett,
ao nível de significância de 5%. Não foram observadas interações entre os tratamentos, sendo
os efeitos dos tratamentos 1mg/60kg/PV vs. 1mg/100kg/PV e 280 vs. 285 dias de gestação,
respectivamente: partos entre a pré-indução (D-7) e a indução (D0) [18,1% (17/94) vs. 12,1%
(12/99) e 7,9%b (8/101) vs. 22,8%a (21/92)]; Partos até 24 horas após a indução: [30,8% (29/
94) vs. 30,3% (30/99) e 24,7% (25/101) vs. 35,9% (33/92)]; Partos entre 24 e 36 horas após a
indução: [60,6% (57/94) vs. 57,6% (57/99) e 57,4% (58/101) vs. 60,9% (56/92)]; Partos entre
36 e 48 horas após a indução: [6,4% (6/94) vs. 12,1% (12/99) e 14,8%a (15/101) vs. 2,2%b (2/
92)]; Partos acima de 48 horas após a indução [2,1% (2/94) vs. 1,0% (1/99) e 3,0% (3/101) vs.
0,0% (0/92)]. O intervalo em dias entre a pré-indução e o momento do parto para os respectivos
grupos foi de 7.0±2.0 vs. 7.3±1.8 e 7.6±1.4ay vs. 6.8±2.2bx; a‘“b, teste de Tukey; x‘“y, teste de
Bartlett) e o intervalo em horas da indução ao parto foi de 32.4±5.9 vs. 32.6±5.6 e 34.1±6.2ax
vs. 30.5±4.4by. A pré-indução de parto mostrou-se mais efetiva quando se aplicou TRI aos 280
dias de gestação, independentemente da dosagem utilizada. Isto decorre da maior concentração
de partos após 24 horas da indução, indicativo da eficiência do tratamento. Além disso, a pré-
indução aos 285 dias, possivelmente devido ao processo fisiológico de crescimento fetal e
maturação placentária, ocasionou antecipação e dispersão significativa dos partos, inviabilizando
a assistência ao neonato.
s333
TAXA DE RETENÇÃO DE PLACENTA EM RECEPTORAS DE EMBRIÕES

BOVINOS PRÉ-TRATADAS COM TRIANCINOLONA SETE DIAS ANTES DA
INDUÇÃO DO PARTO
Rezende; L.F.C.1; Zúccari, C.E.S.N.1; Ayres, H.2; Torres-Júnior, J.R.S.2;

Rezende, C.R.L, Nasser, L.F.3
1
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, UFMS, Campo Grande-MS; 2Departamento de
Reprodução Animal, FMVZ/USP, São Paulo-SP; 3FIRMASA Tecnologia para Pecuária,
Campo Grande, MS. lfcrezende@yahoo.com.br
Já foi demonstrado que o tratamento para indução de parto com a combinação de Dexametazona
e Prostaglandina embora eficiente, apresenta elevado índice de retenção de placenta (RP). Estudos
relatam que o Acetonido de Triancinolona (TRI) administrado sete dias antes da indução pode
diminuir a ocorrência de RP. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito de diferentes
dosagens de TRI como pré-tratamento para a indução, bem como o momento da administração
da TRI com relação à idade da gestação, sobre a incidência de retenção de placenta.em receptoras
de embrião bovino induzidos a parir com a combinação de Dexametasona e Prostaglandina.
Foram utilizadas 193 novilhas Bos taurus x Bos indicus, gestantes de embrião Nelore obtidos
por Produção in vitro. Em esquema fatorial 2x2 (doses TRI vs momentos pré-indução) os animais
foram divididos nos seguintes tratamentos T1 – 1 mg / 60 kg PV de TRI aos 280 dias; T2 – 1 mg
/ 100 kg PV de TRI aos 280 dias; T3 – 1 mg / 60 kg PV de TRI aos 285 dias; T4 – 1 mg / 100 kg
PV de TRI aos 285 dias, homogeneizados de acordo com acasalamento e sexo fetal. Os animais
receberam, sete dias após o pré-tratamento com TRI, a administração de 30 mg de Dexametasona
(Azium®, Schering-Plough) e 150 μg de D-Cloprostenol sódico (Preloban®, Intervet), para a
indução do parto. Os tratamentos de indução de parto foram considerados eficientes quando os
nascimentos ocorreram entre 24 e 72 horas após a indução. Foi considerada retenção de placenta
quando esta foi eliminada com intervalo >24 horas pós-parto. Os dados foram analisados pelo
teste de Qui-quadrado, em nível de significância de 5%. Não houve interação entre tratamentos.
Os resultados de retenção de placenta foram 8,16% (4/49), 11,76% (6/51), 11,11% (5/45) e
10,42% (5/48) para T1, T2, T3 e T4, respectivamente. Os resultados indicam que os pré-
tratamentos com TRI nas diferentes doses e momentos não diferiram entre si. Observou-se taxas
de retenção de placenta inferiores aos descritos na literatura, logo o Pré-tratamento com TRI
mostrou ser eficiente para este efeito colateral.
s334
DESENVOLVIMENTO DE UMA TÉCNICA CIRÚRGICA PARA O

MONITORAMENTO DO MICROAMBIENTE UTERINO EM BOVINOS
Lima, M.C.1; Freire, A.F.2; Fedozzi, F.2; Pimentel, J.R.V.2; Hucke, E.E.T.S.3; Arruda, R.P.2;
Assumpção, M.E.O.A.2; Miglino, M.A.1; Binelli, M.2
1
Setor de Anatomia-VCI-FMVZ-USP, 05508-900, São Paulo,SP; 2CBRA-VRA-FMVZ-USP,
13635-900, Pirassununga, SP; 3Laboratório de Fisiologia e Farmacologia – FMV-UNIFEOB,
13874-148, São João da Boa Vista, SP. binelli@usp.br
Em bovinos, a mortalidade embrionária associada à falhas no processo de reconhecimento materno

da prenhez atinge 30 a 40%. O sucesso da prenhez depende de uma apropriada interação
bioquímica entre o endométrio materno e o concepto. O objetivo deste estudo foi a validação de
uma técnica cirúrgica de implantação de cateteres intrauterinos para a obtenção de fluídos em
diferentes dias do ciclo estral e da prenhez inicial em bovinos de modo permitir à análise
sistemática e contínua das secreções do microambiente uterino. O funcionamento dos cateteres
foi testado e alterações morfológicas conseqüentes da implantação dos cateteres foram descritas.
Cateteres de silicone foram inseridos cirurgicamente nos cornos uterinos e exteriorizados pelo
flanco de nove vacas Holandesas. As vacas foram divididas para receberem (n = 6) ou não (n =
3) embriões no dia 7 de um ciclo estral sincronizado. Microlavagens uterinas foram realizadas
nos dias 14, 16, 18 e 20 pós-estro. Paralelamente, foram colhidas amostras de sangue para
quantificação das concentrações de progesterona plasmática por radioimunoensaio. Todas as
vacas foram abatidas no dia 20, seus tratos reprodutivos submetidos à análise macroscópica e
tecidos uterinos coletados e fixados para análise histopatológica. A técnica utilizada: (1) permitiu
a obtenção de fluídos uterinos, (2) resultou em 0% de taxa de prenhez, (3) causou alterações
patológicas nos órgãos reprodutivos, como aderências, infecções focais e endometrites, (4) levou
à baixa concentração de progesterona plasmática, incompatível com a manutenção da prenhez,
(5) afetou o tecido uterino com inflamações agudas e crônicas de grau leve, além de fibroplasias
e dilatações glandulares. Concluiu-se que a abordagem cirúrgica de implantação dos cateteres
não foi adequada para obtenção de fluídos uterinos, pois pode levar à alterações bioquímicas
importantes em conseqüência do processo inflamatório encontrado, além de não permitir a
manutenção da prenhez.
Agradecimentos: FAPESP, CNPq, Centro Paulista de Desenvolvimento Farmacotécnico, HPBio,
s335
EFEITOS DE UM MÉTODO DE MICROLAVAGEM UTERINA SOBRE A FUNÇÃO

LUTEÍNICA, O CRESCIMENTO FOLICULAR E A MANUTENÇÃO DA PRENHEZ
INICIAL EM BOVINOS
Freire, A.F.1; Lima, M.C.2; Fedozzi, F.1; Pimentel, J.R.V.1; Hucke, E.E.T.S.3; Arruda, R.P.1;
Assumpção, M.E.O.A.1; Miglino, M.A.2; Binelli, M.1
1
CBRA-VRA-FMVZ-USP, 13635-900, Pirassununga, SP; 2Setor de Anatomia-VCI-FMVZ-
USP, 05508-900, São Paulo,SP; 3Laboratório de Fisiologia e Farmacologia – FMV-UNIFEOB,
13874-148, São João da Boa Vista, SP. binelli@usp.br
Em bovinos, a mortalidade embrionária associada a falhas no processo de reconhecimento materno

da prenhez atinge 30 a 40%. O sucesso da prenhez depende de uma apropriada interação
bioquímica entre o endométrio materno e o concepto. O objetivo desse estudo foi desenvolver
uma técnica cirúrgica para monitorar o microambiente uterino de vacas cíclicas e prenhes nos
dias 14 a 20 após o estro avaliando-se possíveis interferências da mesma sobre o ciclo estral e a
prenhez inicial. Em vacas holandesas, cíclicas e não lactantes, foram implantadas cateteres de
silicone em ambos os cornos uterinos no segundo dia após o estro. No dia 15 pós-estro os animais
receberam uma injeção de D-cloprostenol e a ovulação foi confirmada por ultrasonografia
transretal. Após 7 dias, as vacas (n=6) receberam ou não (n=3) transferência de embriões via
transcervical no corno uterino ipisolateral ao ovário contendo o corpo lúteo (CL). Nos dias 14,
16, 18 e 20 pós-estro, estruturas ovarianas foram avaliadas por US, e cada corno uterino foi
lavado (18 ml de Ringer/corno) através dos cateteres implantados no lúmen uterino. Amostras
de sangue foram coletadas nos dias 1 a 20 da fase experimental e concentração de progesterona
(P4) foi mensurada por radioimunoensaio. As vacas foram abatidas no dia 20 e a prenhez
diagnosticada por visualização macroscópica do concepto após a dissecação do útero. A taxa de
presença do concepto ao abate foi 0%. No dia da transferência de embrião, um CL e um folículo
grande (9 a 17 mm) estavam presentes nos ovários das vacas. Até o dia 7 não houve aumento na
concentração de P4 em 7/9 vacas. A luteólise ocorreu antes do dia 15 em 3/9 vacas, entre os dias
16 e 20 em 3/9 e não ocorreu até o abate em 2/9 vacas. Não houve aumento de P4 na fase luteal
em uma vaca. Foi verificada ovulação antes do dia 20 em 3/9 vacas. A taxa de crescimento do
último folículo dominante foi de 1,3mm/dia em 2/9 vacas e menor nos animais restantes. Cistos
foliculares, CL subluteinizado e endometrite foram diagnosticados em 2/9, 2/9 e 1/9 vacas,
respectivamente. Foi possível concluir que as alterações nas funções ovarianas e uterinas foram
causadas pela presença e implantação dos cateteres e essas alterações foram incompatíveis com
a manutenção da prenhez. A abordagem cirúrgica testada não permitiu o estudo do microambiente
uterino de vacas prenhes.
Agradecimentos: FAPESP, CNPq, Centro Paulista de Desenvolvimento Farmacotécnico, HPBio,
s336
VALIDAÇÃO DE UM ENSAIO BIOLÓGICO PARA QUANTIFICAR A

COMPETÊNCIA DE CONCEPTOS BOVINOS
Marques V.B.1; Bertan C.M.2; Pontes E.O.2; Miguez P.H.P.2; da Cunha P.M.2; Lima M.C.1;
Bressan, F.F.3; Miranda, M.S.3; Meirelles, F.V.3; Papa, P.C.1; Miglino M.A.1; Binelli M.2
1
Setor de Anatomia-VCI-FMVZ-USP, 05508-000, São Paulo-SP; 2CBRA-VRA-FMVZ-USP, 13635-
900, Pirassununga, SP; 3ZAB-FZEA-USP; 13635-900, Pirassununga, SP binelli@usp.br
O estabelecimento da gestação em bovinos decorre de interações parácrinas entre os tecidos

maternos e do concepto. A principal conseqüência de tais interações é a inibição da liberação
pulsátil de PGF2á uterina pela ação do interferon-tau (IFN-ô) trofoblástico. Tal inibição é
fundamental para a manutenção da produção de progesterona pelo corpo lúteo e conseqüente
reconhecimento materno da gestação. Presume-se que a atividade inibitória à síntese de PGF2á
(atividade antiluteolítica) exercida pelo IFN-ô no microambiente uterino possa ser indicativa da
competência do concepto e que aumente proporcionalmente ao desenvolvimento do mesmo no
período de peri-implantação. Conceituou-se como atividade antiluteolítica a capacidade de inibição
da síntese de PGF2á estimulada pelo forbol 12,13 dibutirato (PdBu) em células endometriais
bovinas (BEND) em cultura. Especificamente, definiu-se como atividade antiluteolítica o recíproco
da concentração de proteínas em um fluido capaz de inibir em 50% a síntese de PGF2á estimulada
pelo PDBu. Objetivou-se elaborar um ensaio biológico para quantificar a atividade antiluteolítica
de fluidos biológicos relacionados ao processo reprodutivo. No Experimento 1 incubaram-se
células BEND na presença de 0 a 200 ng/ml de PDBu e determinou-se que a síntese de PGF2á
aumentou em função da concentração de PDBu no meio de cultura (P<0,01). A concentração de
25 ng/mL de PdBu provocou estímulo sub-máximo e foi utilizada nos experimentos subseqüentes.
No Experimento 2 incubaram-se células BEND na presença de PDBu associado a concentrações
crescentes de IFN-τ recombinante bovino (rbIFN-τ; 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2 ou 6,4 µg/mL).
Houve inibição crescente da produção de PGF2á estimulada pelo PdBu (P<0,01). A partir da
análise de regressão do percentual de inibição à síntese de PGF2á em função de diferentes
concentrações de rbIFN-τ definiu-se uma curva-padrão de resposta. A atividade antiluteolítica
do rbIFN-ô foi de 1.123,6 unidades antiluteolíticas por micrograma de proteína (UA/µg). No
Experimento 3, fêmeas bovinas foram abatidas 17 dias após a inseminação artificial. O lúmen
uterino foi lavado com 20 ml de PBS para a obtenção de lavados uterinos (LU) de três fêmeas
diagnosticadas como prenhes. Os conceptos foram recuperados e incubados em meio mínimo
essencial por 24 horas (38,5°C em atmosfera natural umidificada) para a obtenção de meios
condicionados por conceptos (MCC). A seguir, incubaram-se células BEND com diluições de
“pools” de LU ou MCC, contendo concentrações crescentes de proteína, associadas com PDBu.
Para LU notou-se aumento crescente e linear na inibição da produção de PGF2á quando utilizaram-
se concentrações de 0 a 20μg/ml de proteína. A atividade antiluteolítica calculada foi 0,069 UA/
ìg de proteína. Para MCC notou-se aumento crescente e linear na inibição da produção de PGF2á
quando utilizaram-se concentrações de 0 a 0,05μg/ml de proteína. A atividade antiluteolítica
calculada foi 29,65 UA/ìg de proteína. Concluiu-se que existe atividade antiluteolítica
quantificável em fluidos biológicos associados a fêmeas bovinas gestantes. Novos estudos devem
ser realizados para consolidar a utilização do presente ensaio biológico para mensurar a atividade
antiluteolítica em fluidos biológicos e associá-la à competência do concepto.
Agradecimentos: FAPESP, CNPq, Prefeitura do Campus Administrativo de Pirassununga, Centro
Paulista de Desenvolvimento Farmacotécnico.
s337
INFLUÊNCIA DA IDADE SOBRE AS TAXAS DE DEGENERAÇÃO DE FOLÍCULOS

OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS EM CADELAS
Alves, A.E.1; Perini, A.P.1; Covizzi, G.J.1; Apparício, M.F.1; Ribeiro, A.P.C.1; Pires, E. A.1;
Vicente, W.R.R.1
1
.DMVPRA-FCAV-UNESP, 14884-900, Jaboticabal-SP, Brasil. cellealves@yahoo.com.br
Aproximadamente 90% da população folicular é representada por folículos ovarianos (Saumande,

J.; Rec Méd. Vet. 1991:205-218). Depois da sua formação, mais de 99% destes sofrem
degeneração desde o nascimento até a maturação (Carrol et al., J. Reprod. Fert., 1990, p.321-
327) e somente 0,1% completam o desenvolvimento até ovulação durante a fase reprodutiva
(Medeiros.S.F. et al,. Reprod Clim 1998:13(1):18-27). Os folículos podem ser classificados em
primordiais (com oócitos envolvidos por apenas uma camada de células achatadas), primários
(circundados por uma ou mais camadas de células cubóides), e secundários (circundados por
várias camadas de células cubóides e início da formação de antro folicular) (Junqueira, L.C.;
Carneiro, J. Histologia Básica 1995, p.367-388). Alguns autores sugerem que a atresia ocorre in
qualquer fase do desenvolvimento (Byscov, A.G.S., et al, J. Reprod. Fert.. 1974, p.277-285),
outros autores acreditam que este processo é limitado a um estágio particular do desenvolvimento
folicular (Grimes et al, 1987 Biol. Reprod., 1987, p.82-88). O objetivo deste estudo foi avaliar as
taxas degeneração de folículos pré-antrais e comparar as taxas de degeneração entre dois grupos,
contendo seis cadelas cada, assim distribuídos: G1 1-7 anos de idade e G2 7-14 anos. Ambos os
ovários foram coletados e preparados histologicamente de acordo com o método de rotina. Os
folículos pré-antrais foram classificados como normais (quando a membrana nuclear dos oócitos,
ou das células da granulosa estavam intactas ou estas células unidas) ou degenerados (quando a
membrana nuclear dos oócitos, ou das células da granulosa estavam rompidos ou estas células
dispersas). Um total de 1038 folículos primordiais, 358 folículos primários, e 76 secundários
foram analisados. Em G1, 11.5%, 28.7%, e 32.9% e em G2 13.3%, 32.74% e 38.1% dos folículos
primordiais, primários e secundários respectivamente se encontravam degenerados. Houve
diferença significativa (ANOVA, p<0,05) entre as classes foliculares; sendo as maiores taxas de
degeneração entre folículos primários e secundários, mas quando comparamos as classes
foliculares de acordo com a idade das cadelas, não houve diferença significativa entre os grupos.
Em conclusão, não houve correlação entre taxas de degeneração folicular e idade das cadelas em
nosso estudo.
s338
AVALIAÇÃO DA MATURIDADE EPIDÉRMICA NO MOMENTO DO PARTO DE

BEZERROS NELORE ORIUNDOS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL E DE
EMBRIÕES PRODUZIDOS IN VIVO E IN VITRO
Moya, C.F.1; Prestes, N.C.1; Piagentini, M.1; Rocha, N.S.2
1
Departmento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária; 2Departmento de Clinica
Médica Veterinária da FMVZ/UNESP, Botucatu-SP, 18618-000 - Brasil.
carlafredrichsen@yahoo.com.br
A proposta do presente estudo foi descrever as possíveis diferenças na maturidade epidérmica do

concepto no momento do parto, comparando os bezerros Nelore oriundos de inseminação artificial
e de produção in vivo e in vitro. Utilizaram-se 60 animais, divididos em 3 grupos: 1 - vinte vacas
inovuladas com embriões Nelore produzidos in vitro (PIV) com oócitos aspirados de doadoras,
2 - vinte vacas inovuladas com embriões oriundos de doadoras superovuladas pelo método
convencional (TE) e 3 - vinte vacas nelore PO inseminadas artificialmente (controle). Próximo
ao parto as vacas foram transferidas para piquetes maternidade para acompanhamento. Durante
a fase de expulsão e após a ruptura do alantocórion realizou-se a punção do envoltório para
colheita de 15mL de líquido amniótico, que foi depositado em tubo plástico e congelado em
freezer. Para avaliação da maturidade epidérmica utilizaram-se as colorações Sulfato Azul do
Nilo e Hematoxilina-Shorr. Para a coloração Hematoxilina-Shorr, as amostras, pós-descongelação,
foram centrifugadas a 4000rpm por seis minutos e as lâminas histológicas montadas com
lamínulas, empregando-se Bálsamo do Canadá, para posterior observação em microscópio óptico
com aumentos de 200x e 400x e contagem do número de células queratinizadas. Para a técnica
de coloração Sulfato Azul do Nilo; as lâminas histológicas foram montadas com 50μL da amostra
e 50μL do corante sulfato azul do Nilo 0,1% e em seguida observadas em microscópio óptico
com aumentos de 200x e 400x para contagem do número de células orangeofílicas. A análise
estatística foi o teste Qui quadrado com nível de significância de 5%. A coloração Azul do Nilo
não apresentou resultados satisfatórios para avaliação da maturidade epidérmica fetal, embora
haja relato do emprego desta técnica em ovinos. Em relação à coloração Hematoxilina-Shorr,
não houve diferença estatística em relação à porcentagem de células queratinizadas, média de
90%, entre os grupos 01, 02 e 03 (p>0,05), o que é um indicativo de que não há diferenças no
desenvolvimento epidérmico entre os bezerros oriundos de inseminação artificial e de embriões
produzidos in vivo e in vitro.
Palavras-chave: bovino, líquido amniótico, PIV, TE, IA, maturidade epidérmica.
s339
PADRONIZAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA

EM OÓCITO E CÉLULA DO CUMULUS EM CADELAS
Gonçalves, J.S.A.; Milazzotto, M.P.; Marques, M.G.; Nascimento, A.B.; Martins, L.F.;
Vannucchi, C.I.; Assumpção, M.E.O.A.; Visintin, J.A.
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP, São Paulo, Brasil; jsergio@usp.br
O melhor conhecimento da fisiologia reprodutiva da espécie canina é necessário para o

desenvolvimento de biotécnicas já consolidadas nos animais de produção. Diversos estudos
têm sido conduzidos nessa espécie devido ao crescente interesse na preservação de gametas,
uma vez que os cães são utilizados como modelo experimental, estabelecendo referências
fisiológicas que podem ser extrapoladas para espécies ameaçadas de extinção. A expressão
gênica em oócitos e em células do cumulus nos carnívoros é pouco estudada, sendo que em
cães a maioria dos estudos utiliza o tecido ovariano total. O objetivo deste estudo foi
padronizar as técnicas de isolamento de RNA total e síntese de cDNA para estudos da
expressão gênica em oócitos e em células do cumulus de cadelas. Os complexos cumulus-
oócitos (COCs) foram recuperados pelo fatiamento dos ovários oriundos de ovário-
histerectomia com lâmina de bisturi, a espaços de aproximadamente 1mm, em placa de
Petri contendo solução salina fosfatada (PBS) e 10% de soro fetal bovino (FCS) a 7°C. Os
oócitos foram desnudados mecanicamente com pipeta fina (diâmetro dos oócitos) em gotas
de 100µl de PBS + 10% FCS a 7°C em fluxo laminar. Os oócitos que apresentavam qualidade
I foram selecionados e as gotas contendo as células do cumulus transferidas para microtubos
de 1,5ml e centrifugadas a 1.000g por 10min. O sobrenadante foi descartado e o sedimento
com as células, assim como os oócitos, foram transferidos separadamente para criotubos
que foram congelados a -80°C até o isolamento do RNA total. Cinqüenta oócitos e suas as
células do cumulus foram utilizadas para a obtenção do RNA total para análise da expressão
gênica O RNA total dos oócitos e das células do cumulus foi extraído com o sistema QUICK
PREP Total RNA Extraction Kit (Pharmacia Biotech), baseado no método do isotiocianato
de guanidina, resultando no volume final de 30µl. A síntese do cDNA foi feita com o sistema
SuperScriptTm II RNAse H- reverse transcriptase (GIBCO - BRL) com 10µl de RNA total na
presença do oligo dT. Para verificar a eficiência da metodologia, o gene constitutivo 18S
ribossomal foi amplificado por PCR. Após a amplificação, o produto (96pb) foi submetido
à eletroforese em gel de agarose em tampão TBE corado com brometo de etídeo e visualizado
sobre luz ultravioleta. Concluiu-se que é possível analisar a expressão gênica a partir de 50
oócitos e suas células do cumulus em cadela.
Suporte Financeiro: FAPESP projeto 04/11404-6
s340
ÍNDICE DE RECUPERAÇÃO DE OÓCITOS EM CADELAS
Gonçalves, J.S.A; Milazzotto, M.P.; Marques, M.G.; Simões, R.; Feitosa, W.B.;
Goissis, M.D.; Nascimento, A.B.; Vannucchi, C.I.; Assumpção, M.E.O.A.; Visintin, J.A.
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP, São Paulo, Brasil; jsergio@usp.br
Nos últimos anos diversos estudos têm sido conduzidos para o desenvolvimento de biotécnicas
na reprodução de cães. Para técnicas como a maturação in vitro (MIV) são necessários ovários
obtidos por ovário-histerectomia. A quantidade de oócitos recuperados nas diferentes fases do
ciclo estral, com peso e idade diferentes pode alterar o número de animais necessários para um
determinado experimento. O conhecimento da influência dessas variáveis nos índices de
recuperação oocitária será de grande valia para o desenvolvimento de um melhor delineamento
experimental. Assim, objetivou-se avaliar os índices de recuperação de oócitos de cadelas nas
diferentes fases do ciclo estral, com diferentes faixas etárias e de peso. Foram colhidos ovários
de 24 cadelas púberes entre 1 e 10 anos e divididos segundo os critérios descritos acima. Os
complexos cumulus-oócitos (COCs) foram recuperados pelo fatiamento dos ovários oriundos
de ovário-histerectomia com lâmina de bisturi, a espaços de aproximadamente 1mm, em placa
de Petri contendo solução salina fosfatada (PBS) e 10% de soro fetal bovino (SFB). Para classificar
o ciclo estral (fase folicular, fase luteínica (diestro) ou anestro), foram utilizadas a colpocitologia,
a colposcopia e a dosagem sérica de progesterona. Os animais foram divididos em 3 faixas
etárias (1-3 anos; 4-6 anos ou 7-9 anos) e 3 faixas de peso (1-10Kg; 10,1-20Kg; >20,1Kg). Os
resultados foram submetidos ao teste de análise de variância (ANOVA). Entre as diferentes
faixas etárias também não se observou diferença significativa (p>0,1), 1-3 anos (47,6%/n=10),
4-6 anos (28,6%/n=6) e 7-9 anos (23,8%/n=5). As médias de oócitos recuperados nas 3 faixas
etárias foram, respectivamente, 134,4; 112,8 e 92,2. Apesar da aparente diferença entre os índices
de recuperação oocitária nas diferentes faixas etárias, ocorreu alta variação individual do número
de oócitos recolhidos dentro do mesmo grupo, não havendo portanto diferença estatística. Em
relação a fase do ciclo estral não foi observada diferença (p>0,1) entre o número de oócitos
recuperados entre a fase folicular (52,4%/n=11), fase luteínica (23,8%/n=5) e anestro (23,8%/
n=5). Os números médios de oócitos recuperados nas 3 fases foram, respectivamente, 101,3;
137 e 113,6. A literatura em relação aos índices de recuperação oocitária nas diferentes fases do
ciclo estral permanecem controversas. Os resultados deste trabalho demonstram que não houve
relação entre fase do ciclo estral e índice de recuperação oocitária. A comparação entre as diferentes
faixas de peso também não evidenciou diferença (p>0,1), 1-10Kg (37,5%/n=9), 10,1-20Kg
(29,2%/n=7) ou >20Kg (33,3%/n=8). As médias de oócitos recuperados nas 3 faixas de peso
foram, respectivamente, 90,7; 68,3 e 155,9. Esses resultados estão de acordo com a literatura,
apesar de raças de maior porte apresentarem normalmente ninhadas co maior número de filhotes.
De acordo com esses resultados, concluiu-se não haver influência da fase do ciclo estral, bem
como da idade e do peso nos índices de recuperação de oócitos em cadelas.
Suporte Financeiro: FAPESP 04/11404-6
s341
EFEITO DO ESTRESSE AGUDO NO COMPORTAMENTO DE ESTRO E

OVULAÇÃO EM VACAS NA FASE PERI-OVULATÓRIA
Maziero, R.R.D.1; Martins, A.C.1,2; Mollo, M.R.2,3; Bastos, M.R.1,2; Ferreira, J.G.S.2;
Siqueira Filho, E.R.2, Ramos, A.F.4; Driessen, K.1,3; Comegno Jr, L.C.2; Leme, L.O. 2,3;
Rumpf, R.2; Sartori, R.2
1
FMVZ-UNESP, 18618-000, Botucatu-SP, Brasil, 2Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, 70770-900, Brasília-DF, Brasil, 3FAV-UnB, 70910-970, Brasília-DF, Brasil,
4
UFMG, 30123-970, Belo Horizonte-MG, Brasil. rosiaramaziero@fmvz.unesp.br,
Estudos em que ACTH foi administrado em novilhas 30 h após luteólise demonstraram atraso
no início do estro e no pico pré-ovulatório de LH, além de uma diminuição na duração do estro
em relação às fêmeas injetadas com diluente. Aparentemente, nenhum trabalho avaliou o efeito
de estresse induzido por manejo de animais sobre esses parâmetros reprodutivos. Dentre os
diversos fatores que causam estresse em vacas e outros ruminantes, o transporte tem se destacado
como um dos mais problemáticos. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do estresse
agudo através de transporte no comportamento estral e ovulação em vacas durante o período
peri-ovulatório. Utilizou-se doze vacas mestiças divididas em dois grupos: Controle e Estresse,
seguindo o modelo cross-over. Estes animais tiveram o estro sincronizado da seguinte forma:
D0 aplicação de 50 µg i.m. de GnRH (Gestran Plus, ARSA S.L.R., Argentina) e colocação de um
implante intravaginal de progesterona (DIB, Syntex S.A., Argentina) que foi mantido por 7 d.
No D6 e D7 foram administrados 0,50 mg e 0,25 mg i.m. de Cloprostenol (Sincrosin, Vallée
S.A., São Paulo, Brasil), respectivamente. Após 30 h da retirada do DIB, os animais do grupo
Estresse foram transportados em caminhão durante 60 min e os animais do grupo Controle
permaneceram no pasto. Exame ultra-sonográfico ovariano foi realizado a cada 12 h do momento
da retirada do DIB até a ovulação de cada vaca. A observação de estro foi feita 24 h ao dia do D8
até a ovulação. A comparação entre os grupos foi realizada através do teste t. Para nenhuma das
variáveis analisadas foi detectada diferença (P>0,10) entre os grupos, cujos resultados estão
apresentados sob a forma de média ± erro padrão. O tempo entre retirada do DIB e início do estro
foi de 66,2 ± 8,9 e 73,1 ± 8,4 h para os grupos Controle e Estresse, respectivamente. A duração
do estro, ou seja, tempo entre a primeira e última aceitação de monta foi de 14,8 ± 1,5 e 14,9 ±
1,8 h e as vacas aceitaram em média 30,3 ± 5,1 e 40,5 ± 6,6 montas durante o estro. O tempo
entre o início do estro e a ovulação foi de 36,3 ± 3,7 e 34,2 ± 3,0 h e entre o final do estro e a
ovulação foi de 23,6 ± 2,7 e 18,4 ± 2,1 h. Também não foi detectada diferença no diâmetro
máximo do folículo ovulatório entre o grupo Controle e Estresse (12,7 ± 0,3 versus 12,4 ± 0,5
mm, respectivamente). Diante dos resultados observados concluiu-se que, diferentemente dos
estudos com administração de ACTH, o transporte de caminhão durante 60 min no período pré-
ovulatório não promoveu condições de estresse suficientes que alterassem a expressão ou duração
do estro, nem o tempo entre a luteólise e a ovulação. Novos estudos são necessários para se
determinar o grau de estresse induzido pelas técnicas de manejo de animais e sua influência na
função reprodutiva da fêmea dependendo de sua intensidade e duração.
s342
OTIMIZAÇÃO DA FUNÇÃO LUTEÍNICA EM VACAS NELORE (Bos taurus indicus)

SUPLEMENTADAS COM GnRH E hCG
Bergamaschi, M.A.C.M.1,2 ; Machado, R.1; Figueiredo, R.A.1; Barbosa, R.T.1;

de Oliveira, C.A.2; Giassetti, M.I.2; Binelli, M.2
1
Embrapa Pecuária Sudeste, 13560-970, São Carlos, SP, 2 CBRA-VRA-FMVZ-USP, 13635-
900, Pirassununga, SP. binelli@usp.br
A mortalidade embrionária pode ser causada por disfunções luteínicas do período crítico (PC)
para o reconhecimento materno da prenhez (dias 15 a 17 após a fertilização) e relaciona-se à
luteólise, que ocorre na presença de um folículo dominante (DOM). O objetivo deste trabalho
foi avaliar os efeitos do GnRH e/ou da hCG sobre a dinâmica ovariana de vacas Nelore. Os
tratamentos visaram prevenir a existência de DOM no PC e aumentar a concentração de
progesterona circulante ([P4]), otimizando a função luteínica. Quarenta fêmeas adultas e sem
bezerro, foram sincronizadas com um implante auricular (3 mg de norgestomet-CRESTAR®,
Intervet) e 2mg de benzoato de estradiol (BE; Centro Paulista de Desenvolvimento
Farmacotécnico), IM. Após 9 dias o implante foi removido, as vacas receberam uma injeção de
cloprostenol sódico (PRELOBAN®, Intervet) e um dia depois foi aplicado 1mg de BE. Os animais
foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n=10, cada): Gcont- controle; GGnRH - 200mcg
de gonadorrelina, IM (FERTAGYL®, Intervet) no dia 5 (D5) do ciclo estral (D1 = ovulação); GhCG
– 2500 UI de hCG (CHORULON 5000 UI®, Intervet), IM, no D13 e GGnRH-hCG: gonadorrelina-D5/
hCG-D13. Diariamente, a partir de 48 h após a retirada do implante e até a ovulação subseqüente
(ou até D30) foram feitos: ultra-sonografias ovarianas; dosagem de [P4] e observação do estro. Os
resultados foram submetidos à ANOVA e ao teste do Qui-quadrado. O número de corpos lúteos
foi maior (P<0,01) no GGnRH-hCG (2,11±0,21) do que Gcont (1,00±0,00) ou GGnRH (1,30±0,14) e não
diferiu (P>0,05) do GhCG (1,70±0,16). A hCG provocou ovulação do DOM, novo recrutamento e
aumentou (P<0,01) o número de ondas (3,00±0,17 vs. 2,20±0,09). Em todos os grupos havia
DOM por pelo menos um dia do PC, embora o GhCG tendeu estar (P<0,10) sob essa influência
por menos tempo (0,80±0,38 dias) que os grupos GCont, GGnRH.e GGnRH-hCG (1,50±0,42, 1,80±0,38
e 1,67±0,43, respectivamente). Os intervalos inter-ovulatórios dos GGnRH (22,50±0,85 dias), GhCG
(25,75±0,55 dias) e GGnRH-hCG (24,40±0,90 dias) não diferiram do Gcont (23,70±1,07 dias). Não
houve diferença (P>0,05) para duração do ciclo estral entre os grupos. A luteólise foi retardada
pela hCG (P<0,01, χ2=5,72), pois até D18 45% das vacas GCont e GGnRH tinham [P4]<1,00ng/ml
contra apenas duas do GhCG e GGnRH-hCG. No D21, a luteólise havia ocorrido em 95% (19/20) de
GCont e GGnRH e em apenas (P<0,01, χ2=7,79) 42,1% (8/19) do GhCG e GGnRH-hCG . A [P4]média, ao
final da fase luteínica (D18 - D24) foi mais alta para o GGnRH-hCG , GhCG, GGnRH e GCont (na ordem
decrescente de concentrações). Concluiu-se que o GnRH não causou a ovulação do DOM da 1ª
onda em todas as vacas e os tratamentos não preveniram completamente a presença do DOM no
PC. Entretanto, a [P4] foi maior nos grupos tratados e a hCG no D13 prolongou a fase luteínica .
Agradecimentos: EMBRAPA, FAPESP, CNPq, Centro Paulista de Desenvolvimento
Farmacotécnico e INTERVET.
s343
REMOÇÃO FARMACOLÓGICA OU MECÂNICA DO FOLÍCULO DOMINANTE

COMO ESTRATÉGIA ANTÍ-LUTEOLÍTICA EM BOVINOS
Machado, R.1; da Silva, J.C.B.2,3; Barbosa, R.T.1; Bisinotto, R.S.4; Siqueira, A.F.P.4;
Binelli, M.4
1
Embrapa Pecuária Sudeste, 13560-970, São Carlos, SP, 2 Fazenda Cardinal, Mococa, SP,
3
Embryolife, Ouro Fino, MG, 4CBRA-VRA-FMVZ-USP, 13635-900, Pirassununga, SP.
binelli@usp.br
Em bovinos, ocorre de 15 a 40% de mortalidade embrionária (ME) decorrentes de disfunções

luteínicas e distúrbios do reconhecimento materno da prenhez (RMP). Estes fenômenos associam-
se à liberação uterina de prostaglandina F2α, que ocorre com um folículo dominante (DOM)
presente no período crítico (PC) do RMP. Este estudo testou uma estratégia de remoção
farmacológica (RF) e outra, mecânica (RM) para otimizar a função luteínica e prevenir a ação do
DOM no PC. Antecipava-se que a RF e a RM reprogramariam a função ovariana para não existir
DOM no PC, resultando em atraso do estímulo luteolítico. A RF estimularia a produção de
progesterona. Trinta vacas Red Angus com bezerro, foram sincronizadas entre 108 e 213 dias
pós-parto (DPP). Elas eram da fazenda Cardinal em Mococa, SP e receberam implante auricular
de 3mg norgestomet (Crestar®, Intervet) e injeção de 3mg norgestomet e 5mg de Valerato de
Estradiol (IM). Nove dias depois o implante foi removido e aplicadas, IM, 300 UI da eCG
(Folligon®, Intervet). As vacas que ovularam de forma sincronizada (avaliado por ultra-sonografia)
foram aproveitadas e distribuídas por: idade, ordem de parto, peso vivo, escore de condição
corporal e DPP nos grupos: GCT (n=5): sem tratamento adicional; GRF (n=6) receberam, IM,
200 μg gonadorelina (GnRH; Fertagyl®, Intervet) nove dias depois da retirada do implante (D4
pós-ovulação= pOv) e 3000 UI da hCG, IM, sete dias depois (D11 pOv); GRM submetidas a
aspiração de folículos (> 6mm) por sonda de Hill aos 13, 16 e 19 dias pOv. Em todas as vacas
foram feitas ultra-sonografias ovarianas nessas mesmas datas, bem como dosagens da concentração
de progesterona plasmática ([P4]) e observado o estro diariamente desde a retirada do implante
até a próxima ovulação. Os dados foram submetidos à ANOVA e estão apresentados como
média±erro padrão da média. A duração do ciclo estral (dias) foi 20,0±1,2; 29,0±1,1 e 22,7±4,0
respectivamente para GCT; GRF e GRM. Houve vacas com DOM em todos os grupos e em
todas datas de ultra-sonografia. A fase luteínica do GRF (22,6±1,05) foi mais longa (P<0,01) do
que a do GCT(17,2±1,05) ou do GRM (17,8±1,17). O GRF também teve a maior [P4] máxima
(13,50±1,74ng/mL; P<0,05) e [P4] média (7,95±0,9ng/mL; P<0,01) ao longo da fase luteínica
quando comparadas com GRM (4,54±1,9ng/mL e 3,06±1,0ng/mL, respectivamente) ou
GCT(6,37±1,7ng/mL e 4,070,9ng/mL, respectivamente), que não diferiram (P>0,05)entre si. A
RF com a combinação GnRH/hCG retardou a luteólise, prolongou a fase luteínica e aumentou a
produção de progesterona no PC e pode potencialmente reduzir a ME em bovinos. Por outro
lado, a RM com a metodologia utilizada não removeu o DOM no PC e a luteólise seguiu sua
programação fisiológica.
Farmacotécnico, INTERVET e Fazenda Cardinal.
s344
EFEITO DA INSULINA NA SUPEROVULAÇÃO DE OVELHAS
Brandão, H.M.1; Silva, M.N.2; Vinholis, M.M.B.3; Ferrão, A.A.2; Traldi, A.S.1
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ, USP – 13 630-000, Pirassununga, SP.
2
UNINCOR – 3EMBRAPA Pecuária Sudeste- humberto@usp.br
A flutuação de dieta no período que precede a colheita de embrião, muitas vezes foge ao controle
do veterinário. Durante o processo de digestão e absorção ocorre um aumento no nível plasmático
de insulina, que através de mecanismos diretos e indiretos favorece o recrutamento e crescimento
folicular, bem como melhora a taxa de ovulação, a formação dos corpos lúteos (CL) e o
desenvolvimento embrionário. Objetivando saber o efeito da insulina sobre os resultados
superovulatórios, bem como compreender as conseqüências de sua flutuação plasmática, este
experimento avaliou o tempo para a manifestação do cio após a retirada do pessário vaginal, o
tempo de duração do cio, número de CL formados, quantidade de embriões graus 1 e 2 transferíveis
e quantidade de estruturas não fecundadas em ovelhas normais, diabéticas e hiperinsulinêmicas.
Para tanto, foram utilizadas18 ovelhas tipo Santa Inês com 40-60kg, distribuídas aleatoriamente
em três grupos de 6 animais recebendo silagem de milho e sal proteinado comercial ad líbitum.
Os animais do grupo controle (GC) foram sincronizados em tratamento de 13 dias com pessários
vaginais contendo 60mg de acetato de medroxiprogesterona e superovuladas com 250mg de
pFSH (PLUSET ®) ministrado em doses decrescentes do 11 o ao 13 o dia do protocolo
superovulatório. O pessário foi retirado no momento de aplicação da 5a dose de pFSH. Todas as
doadoras receberam adicionalmente 200UI de eCG (NOVORMON®) e 75 μg de clorprostenol
(CIOSIN®) com a última dose de pFSH e os embriões foram colhidos no sétimo dia após o início
do cio. Os animais do grupo diabéticos (GD) e dos hiperinsulinêmicos (GI) receberam os mesmo
tratamentos do GC, porém nos GD a diabetes foi induzida no dia 8 com 0,05 mg/kg de peso vivo
I.V. de alloxano monohidratado (Sigma-Aldich, A7413). O status de hiperinsulinemia no grupo
GI foi conseguido com administrações diárias a cada 12 horas de insulina humana semi-sintética
de média duração (Biolin-N; BIOBRAS) a partir do dia oitavo dia do protocolo. A detecção de
estro teve início 24 horas após a retirada dos pessário e foi feita em intervalos de 4 h, e os
acasalamentos realizados a cada 8 h após o início do cio. Foi utilizado um macho por fêmea. Os
resultados foram avaliados por análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey.
Não houve diferença significativa no intervalo entre a remoção da P4 e início do cio, onde o GC
apresentou 28,7±2,4 h, o GI 32±4,6 h e o GD 34±4,4 h e na percentagem de estruturas não
fecundadas GC 15±5,8%, GI 6,9±4,7% e GD 36,8±19 %. Com relação ao tempo de duração do
cio o tratamento GD apresentou menor tempo (26±0,9 h) que os GI (47,3±3,8h) e GC (53 ±4,6h)
(pd”0,01). A quantidade de CL produzidos também foi menor (pd”0,01) no GD 4±0,8 quando
comparada aos grupos GI 11,6±1 e GC 13,8±3. O tratamento GI apresentou melhor taxa de
embriões transferíveis (p<0,01) que o GD (8,3±1,3% x 1,5±0,4), porém não foi diferente do GC
(5,3±1,7%). Os resultados obtidos neste experimento mostraram que a insulina abaixo dos níveis
fisiológicos desempenha um papel negativo na resposta ovulatória, na qualidade embrionária e
no tempo de duração de cio, porém o uso da insulina em protocolos de superovulação se mostrou
desnecessário. Uma dieta constante e capaz de manter o nível circulante de insulina elevado
durante o protocolo de superovulação pode ser fundamental para o sucesso da técnica.
s345
PRODUÇÃO DE PROGESTERONA EM NOVILHAS HOLANDESAS

SUPEROVULADAS SUPLEMENTADAS COM DUAS DOSES DE BETACAROTENO
ASSOCIADO AO TOCOFEROL
Sales, J.N.S.1; Souza, J.C.1
1
Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG, Cep:37 200-000,
Cx Postal 37, Brasil. znlogan@yahoo.com.br.
Avaliou-se o efeito da injeção intramuscular (IM) de betacaroteno associado ao tocoferol na

produção de progesterona plasmática coletadas de novilhas (n=43) que foram sincronizadas
(Crestar®) e superovuladas com 8 aplicações decrescentes de FSH/LHp em intervalos de 12
horas. Os animais foram inseminados 12 e 24 horas após a observação do cio e a coleta de
embriões realizada sete dias após a primeira inseminação. Os animais foram alocados
aleatoriamente para um de três tratamentos: 1) controle, 2) 800mg de betacaroteno e 500 mg
tocoferol e 3) 1.200 mg de betacaroteno e 750 mg de tocoferol. As injeções de suplementação
foram aplicadas no dia do implante e no início do protocolo superovulatório. Amostras de sangue
foram coletadas por venopunção de vasos coccígeos para determinar a concentração plasmática
de progesterona. Foram realizadas cinco coletas de sangue, nos dias 1, 6, 10, 13 e 17 do período
experimental, sendo 1 o dia do início do protocolo de sincronização e aplicação dos tratamentos.
As coletas de sangue nos dias 1 e 6 foram realizadas para dosar a concentração de progesterona
antes da aplicação dos tratamentos. Animais com progesterona abaixo de 1 ng/ml na amostra do
dia 10 foram considerados em estro. As coletas 13 e 17 foram realizadas para avaliar o efeito do
â-caroteno e vitamina E na produção de progesterona após a superovulação. A concentração de
progesterona no plasma foi analisada em duplicatas por radioimunoensaio utilizando o Coat-A-
Count Progesterone® (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, EUA). Os coeficientes de
variação intra-ensaio alto e baixo foram de 2,60% e 1,96%, respectivamente. A concentração
plasmática média de progesterona não diferiu entre os tratamentos (P=0,70), sendo 6,58 ng/mL
(controle), 6,86 ng/mL (T800) e 5,92 ng/mL (T1200). Houve diferença significativa da
concentração média de progesterona entre os dias de coleta, tendo a menor média sido obtida na
amostra de sangue retirada no dia 10, abaixo de 1 ng/ml de progesterona, e a maior média na
amostra de sangue retirada no dia 17 (18,10 ng/ml). As concentrações médias de progesterona
das coletas 1 e 6, foram respectivamente, 4,03 e 1,50 ng/ml. A média da concentração do dia 10
foi 0,13 ng/ml. A maior concentração de progesterona nas amostras de sangue retiradas no dia 13
(7,89 ng/ml) e 17 (18,10 ng/ml) pode ser explicada em função do maior número de corpos lúteos
produzidos pela superovulação. A aplicação de betacaroteno associado ao tocoferol não afetou a
produção de progesterona periférica de novilhas superovuladas da raça holandesa.
s346
EFEITO DE UM MENOR PERÍODO DE FOTOESTIMULAÇÃO NA ANTECIPAÇÃO

DA ATIVIDADE REPRODUTIVA DE ÉGUAS EM ANESTRO SAZONAL
DeVitto, L.G.1; Carmo, M.T.1; Alvarenga, M.A.1; Santos, J.F. 2 ; Oliveira, J.V.2
1
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, UNESP – Botucatu,SP –
Brasil. 2 Pólo Regional de Desenvolvimento Tecnológico da Alta Mogiana - Colina (SP)
lianidevito@yahoo.com.br
Muitos estudos têm demonstrado o efeito benéfico da extensão artificial do fotoperíodo em

acelerar o início da atividade reprodutiva de éguas em anestro sazonal.O objetivo do presente
estudo foi o de avaliar dois diferentes métodos de utilização da fotoestimulação, visando a
antecipação da estação de monta na espécie eqüina. O experimento foi conduzido na cidade de
Colina-SP (Latitude 20º 43' 05" S) onde foram utilizadas 28 éguas da raça Brasileiro de Hipismo
(BH) . Estes animais foram selecionados através de palpação retal e ultrassonografia, do qual
observou-se ovários pequenos com folículos de 10 a 15 mm e ausência de corpo lúteo, indicando
anestro estacional. As éguas foram divididas aleatoriamente em três grupos: G1) animais expostos
a 35 dias de luz artificial (n=9); G2) animais expostos a 60 dias de luz artificial (n=9) e G3)
grupo controle, sem luz artificial (n=10). Todos os grupos foram mantidos a pasto, com água à
vontade e suplementadas com 2kg de ração por animal contendo 12%PB e 60%NDT (Fri-ribe®),
diariamente. A fotoestimulação consistiu na entrada dessas éguas em um piquete contendo postes
de luz, onde entravam às 17:00h (luzes acessas) e eram soltas a pasto às 23:00h, perfazendo um
total de 6h na luz artificial e 11h de luz natural. O tratamento teve início em 21 de Junho para
todos os grupos e terminou dia 26 de Julho para o G1 (35 dias) e dia 20 de Agosto para o G2 (60
dias). Utilizou-se da ultrassonografia transretal duas vezes por semana durante 70 dias em todos
os grupos até a detecção da primeira ovulação, quando detectados folículos de 35 mm, este
controle passou a ser diário. Foi utilizado para análise estatística o teste de ANOVA para avaliar
o número médio de dias até a ocorrência da primeira ovulação e sincronia das ovulações, e o qui-
quadrado para o percentual médio de éguas que responderam ao tratamento. Não foram observadas
diferenças (p=0,188) em relação ao número de dias da primeira ovulação entre o G1 (55,89 ±
6,17) e G2 (48,857 ± 13,63). Observou-se tendência estatística (p=0,064) quanto à sincronia das
ovulações, onde em G1 as ovulações ocorreram em um intervalo de tempo de 10,56 ± 6,48 e em
G2 20,86 ± 13,63 de dias, notando-se que no grupo 1 ocorreu uma sincronização das ovulações.
Observamos que 90% das éguas em G1 e 77,78% das éguas em G2 ovularam nos 70 dias do
experimento, enquanto que no grupo controle não ocorreram ovulações ao longo do período. As
éguas continuaram ciclando normalmente após os 70 dias do experimento. Concluímos que o
tratamento com 35 dias de luz é tão eficaz quanto o tratamento com 60 dias de luz, apresentando
como principal vantagem à redução de gastos, bem como a diminuição do trabalho com o manejo
das éguas.
Apoio: Rações Fri-ribe S.A., Pitangueiras – SP, Brasil.
s347
AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO FLUNIXIN MEGLUMINE SOBRE OS NÍVEIS

SÉRICOS DE PROGESTERONA EM NOVILHAS E VACAS MESTIÇAS*
Pinto-Neto, A.1; Lucca, F.M.2; Alberton, J.2; Mota, M.F.3; Borges, A.M.4; Acco, A.5;
Fonseca, J.F.6; Silva, A.V.1
1
Prof. Curso de Mestrado em Ciência Animal - UNIPAR. Umuarama-PR. adalgiza@unipar.br;
2
Bolsistas Iniciação Científica – Med. Veterinária - UNIPAR;
3
Prof. Curso de Med. Veterinária-UNIPAR; 4Prof. EV-UFMG – BH-MG; 5Profa. UFPR
– Curitiba-PR; 6Pesq. CNPC-EMBRAPA – Coronel Pacheco-MG
Durante o reconhecimento materno da gestação ocorre interrupção da síntese de PGF2α, através

da inibição do metabolismo do ácido araquidônico. Baseando-se nesse mecanismo, objetivou-se
com esse estudo avaliar se a administração intramuscular de flunixin meglumine, um
antiinflamatório não esteroidal e, portanto, inibidor da síntese de prostaglandinas, prolongaria o
comprimento do ciclo estral, através do prolongamento da fase luteal, aumentando os níveis de
progesterona em novilhas e vacas. Para tanto, utizaram-se 24 animais mestiços, sendo 12 vacas
e 12 novilhas, mantidos sob pastejo de Brachiaria sp, suplementadas com cana-de-açucar e água
ad libitum. Os ciclos estrais desses animais foram sincronizados através da utilização de dispositivo
intra-vaginal de progesterona (Estro ForteR, Umuarama, Brasil), durante sete dias. Após a retirada
do mesmo, observou-se estro, duas vezes/dia, durante 30 dias. Do nono ao 12o dia do ciclo (estro
= dia zero) os animais foram submetidos à aplicação da droga luteolítica PGF2á (CiosinR, Cotia,
Brasil). No dia do estro, as vacas e as novilhas foram aleatoriamente divididas em dois tratamentos:
controle e experimental, sendo que cada grupo foi composto por seis vacas e seis novilhas.
Todos os animais foram submetidos à colheita diária de sangue do dia zero ao próximo estro. Do
13o ao 18o dia, aplicou-se nos animais dos grupos experimentais 1,65 mg/kg de flunixin meglumine
(BanamineR, Rio de Janeiro, Brasil e DesflanR, Ribeirão Preto, Brasil), enquanto que nos animais
dos grupos controle, aplicou-se o mesmo volume de solução placebo (solução fisiológica). O
soro sanguíneo foi congelado e encaminhado ao Laboratório de Reprodução Animal, da EV-
UFMG, em Belo Horizonte-MG, para determinação da concentração de progesterona, pela técnica
de radioimunoensaio (P4-CAC Fase SólidaR, São Paulo, Brasil). Os resultados foram comparados
entre os grupos pelo teste t de Student, e entre os momentos de colheita pela Análise de Variância,
utilizando-se o pacote de análise estatística InStat. Os resultados obtidos mostraram que não
houve diferença no comprimento do ciclo estral (P>0,05), entre animais tratados e não tratados,
sendo de 22,30 ± 4,16 e 22,40 ± 4,16 dias, respectivamente. Os resultados relativos à concentração
média de progesterona entre os dias 13 e 18 do ciclo estral, também foram semelhantes entre
novilhas e vacas tratadas (P>0,05), sendo 6,26 ± 3,04, 7,64 ± 1,02, 5,02 ± 3,71, 4,07 ± 4,12, 5,15
± 5,17, 2,45 ± 3,88 ng/mL e 6,50 ± 3,70, 5,32 ± 2,89, 6,48 ± 3,63, 4,58 ± 3,50, 2,20 ± 3,44, 0,50
± 0,44 ng/mL, respectivamente. Ao considerar somente uma categoria animal, a concentração
média de progesterona durante o período de tratamento, entre os animais tratado e controle também
não apresentou diferenças significativas (P>0,05). Diante dos resultados obtidos, conclui-se que
nas condições desse estudo, o uso do flunixin meglumine, utilizado entre o 13o e 18o dia do ciclo
estral, em vacas e novilhas, não prolongou a fase luteal do ciclo estral, mantendo a concentração
de progesterona semelhante entre os animais tratados e não tratados.
Palavras-chave: bovino, progesterona, luteólise, flunixin meglumine.
*Suporte Financeiro: IPEAC-UNIPAR (Protocolo: 696/04)
s348
GESTODENO UM NOVO PROGESTÁGENO COM ALTA ATIVIDADE PARA O

CONTROLE DO CICLO ESTRAL EM FÊMEAS BOVINAS
Granito, A.L.1; Pimentel, J.R.V.1; Andrade, A.F.C.2; Pardo, F.D.1; Almeida, A.B.1;
Braga, F.A.1; Madureira, E.H.1
1
Laboratório de Farmacologia e Endocrinologia da Reprodução, 2Laboratório de Biotecnologia
do Sêmen e Andrologia, FMVZ-USP,Campus Pirassununga. jrvalim@usp.br
Com o conseqüente aumento da demanda de produtos de origem animal, torna-se uma necessidade
a máxima eficiência reprodutiva dos rebanhos bovinos. Para isto, melhores índices de natalidade
poderiam ser alcançados com um maior emprego da técnica de inseminação artificial (IA). O
objetivo desta tese foi buscar um novo progestágeno (gestodeno) capaz de controlar de forma
mais eficiente a manutenção da onda folicular a fim de se obter protocolos de (IATF) com maior
eficiência e a um menor custo. Para a realização dos experimentos, os animais foram submetidos
à sincronização do ciclo estral. Considerou-se o dia do estro como o D0 do período experimental.
O tratamento com gestodeno foi iniciado no D7. e terminou no D19 do período experimental.
Foi empregado diferentes doses de gestodeno, para definir a concentração deste progestágeno
capaz de inibir o estro e a ovulação em fêmeas bovinas. Para isto, foram formados os seguintes
grupos: G0 Controle = placebo (n = 4), G187 = 187,5 µg/dia (n=5), G250 = 250 µg/dia (n = 9) e
G500 = 500 µg/dia (n = 5). No D8, todos os animais dos grupos, receberam uma única aplicação
intramuscular de cloprostenol sódico (530 ìg). Após a administração da PG, as vacas
permaneceram sendo observadas quanto a manifestação do estro.duas vezes ao dia (manhã e
tarde).até o D26. No último dia da aplicação de gestodeno (D19), as vacas foram submetidas ao
exame ultra-sonográfico. Nos dias 7, 11 e 19, foram colhidas amostras de sangue da análise da
concentração de P4. pela técnica de rádio-imuno-ensaio em fase sólida, os dados obtidos foram
analisados estatisticamente. Pela regressão polinomial linear dos dados pode-se afirmar que houve
efeito de tratamento sobre a taxa de ovulação (P = 0,015). Com base nas doses utilizadas, aplicações
diárias de 500ìg/dia de gestodeno são suficientes para inibir 100% das ovulações. Houve efeito
significativo de tratamento sobre o intervalo entre a aplicação da PG e a apresentação do estro,
(C1 / P=0,0012). Não houve efeito entre tratamentos G187,5 e G500 (C2 / P=0,4325), G250 e
G500 (C3 / P=0,1685). As médias dos teores de P4 no D7 não diferiram significativamente entre
os tratamentos (C1./ P=0,9087). As médias dos teores de P4 no D11 também não diferiram entre
os grupos (C2 / P=0,8442). Houve diferença estatística entre as médias dos teores de P4 no D19,
entre o grupo controle e os G187,5, G250 e G500.(C3 / P=0,0242). Não houve diferença entre as
médias dos intervalos entre a última aplicação de gestodeno e o estro(G187,5, G250 e G500 /
P=0,9065). Foi possível concluir que o gestodeno é capaz de inibir o comportamento de estro e
a ovulação em 100% dos animais na dose de 500ìg/dia, e pela equação de regressão foi obtida a
dose estimada de 428ìg/dia como sendo a dose necessária para inibir 100% das ovulações.
Palavras-Chave: Gestodeno. Controle do ciclo estral. Progestágeno. SHBG. Bovino.
s349
EFEITO DA APLICAÇÃO DE PROSTAGLANDINA F2Α NO TERCEIRO DIA DO

DIESTRO SOBRE A DURAÇÃO DO CICLO ESTRAL EM ÉGUAS-RESULTADOS
PARCIAIS
Oliveira, J.V.1; Alvarenga, M.A.2; Carmo, M.T.2; Araújo, G.H.M.2; Santos, J.F.1
1
Pólo Regional de Desenvolvimento Tecnológico da Alta Mogiana - Colina (SP)
2
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária–FMVZ/UNESP, Botucatu-SP.
victor@colina.com.br
Trabalhos recentes tem demonstrado que diferente do que ocorre em outras espécies o CL da
égua é responsivo a aplicação de prostaglandina já nos primeiros dias do diestro. Bergfelt et al
(2005) foi o primeiro autor á estudar o efeito do uso de PG (Dinoprost 10 mg) no terceiro dia do
diestro sobre o ciclo estral, observando encurtamento do ciclo em todos animais tratados. O
presente trabalho teve por objetivo comparar o efeito do tratamento com duas diferentes doses
de um outro análogo da Prostaglandina (Cloprostenol) no terceiro dia do diestro sobre o ciclo
estral de éguas. Um total de 18 éguas com idade variável entre 3 e 10 anos foram tratadas no
terceiro dia após ovulação com 250 ug (G1 n=09) ou 500 ug (G2;n=09) de Cloprostenol
(Sincrocio, Lab. Ouro Fino, Brasil). Amostras de sangue foram recuperadas diariamente durante
seis dias consecutivos desde o dia de tratamento para avaliação futura dos níveis séricos de
Progesterona. Avaliações ultra-sonográficas foram também realizadas diariamente após o
tratamento para acompanhamento do desenvolvimento folicular até que fosse detectada a ovulação.
As comparações entre os grupos foram realizada por ANOVA seguida pelo teste de Tukey, as
porcentagens de resposta aos tratamentos foi comparada por qui-quadrado, ambos testes ao nível
de significância de 5%. Encontrou-se um intervalo interovulatório menor que o normal relatado
na literatura nos dois grupos de 13,33 ± 4,47 e 14,56 ± 4,19 dias para o grupo 01 e 02,
respectivamente (p>0,05). Dividiu-se cada grupo quanto à resposta ao luteolítico em animais
com intervalos interovulatórios maiores e menores que 16 dias, usando como parâmetro o menor
intervalo interovulatório normal citado na literatura, que é de 16 dias, intervalos menores que
estes são considerados como ciclos encurtados (Ginther, O.J. – Reproductive biology of the
mare, 2ed., 1992). O intervalo interovulatório foi similar entre os dois grupos (p>0.05) tendo
sido de 14,5 dias (variando de 8 a 19 dias) para G1 e 13, 1 dias (variando de 9 a 20 dias) para G2,
respectivamente. Foi observado em G1 que 55 % (5/9) e em G2 que 44% (4/9) das éguas
apresentaram um intervalo interovulatório inferior a 16 dias. Os resultados obtidos neste trabalho
indicam que a aplicação de Cloprostenol no 3 dia do diestro foi eficiente em em reduzir o intervalo
interovulatório médio esperado para éguas (20 dias), contudo nem todos animais parecem
responder ao tratamento, o que discorda de achados de trabalho anterior onde se utilizou Dinoprost.
A avaliação do perfil sérico de Progesterona das amostras coletadas nos permitirá definir com
maior precisão o percentual de animais nos qual ocorreu luteólise.
s350
INCIDÊNCIA DE ESTRO DE OVELHAS SUBMETIDAS A PROTOCOLOS DE

SINCRONIZAÇÃO DE LONGA E CURTA DURAÇÃO UTILIZANDO
PROGESTÁGENO E GnRH – RESULTADOS PRELIMINARES
Almeida, A.K.; Chalhoub, M.; Ribeiro Filho, A. de L.; Freitas, D. S.; Alves, S.G.G.;
Bittencourt, R.F.; Santana, R.C.M.; Brandão, A.C.G.; Gusmão, A.L.
Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, 40170-110, Brasil.

akalmeida@yahoo.com.br
A sincronização do estro é base para muitas biotécnicas reprodutivas importantes para o

melhoramento genético e produtivo de rebanhos ovinos. O objetivo deste estudo foi avaliar o
efeito dos protocolos de curta e longa duração com progestágeno associado à administração de
GnRH nas taxas de incidência de estro em ovelhas. Foram utilizados 120 animais, entre ovelhas
e marrãs em idade reprodutiva, divididas em 4 grupos, onde foram testados 4 protocolos (P) de
sincronização de estro. No P1 e P2, os animais foram sincronizados com esponjas intravaginais
contendo 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (MAP) por 12 dias e na retirada do dispositivo,
uma aplicação de 300 UI de eCG. No P2, foi realizada uma aplicação de 50 μg de GnRH, 30
horas após a retirada da esponja. No P3 e P4, os animais também foram sincronizados com
esponjas intravaginais contendo 60 mg de MAP por 6 dias e na retirada do dispositivo, uma
aplicação de 300 UI de eCG (Novormon, Syntex) e 30 μg de D-cloprostenol (Prostaglandina,
Tortuga). No P4, foi realizada uma aplicação de 50 μg de GnRH (Profertil, Tortuga) 30 horas
após a retirada da esponja. A observação de estro foi realizada com a utilização de machos
vasectomizados com a região esternal impregnada de tinta óleo, na proporção de 4%, introduzidos
no rebanho logo após a retirada dos dispositivos. Duas vezes ao dia, pela manhã e à tarde, as
fêmeas eram observadas e as que estavam em cio foram identificadas pela presença da tinta na
região da garupa, caracterizando a receptividade destas ao macho. Para a análise estatística das
características avaliadas, foi utilizado o teste Qui-quadrado e empregado o pacote estatístico
Statistical Analysis System (SAS) – versão 5.0 (1996). No protocolo P1, 96,7% dos animais
entraram em cio e nos protocolos P2, P3 e P4 100% entraram em cio, sendo que o início do cio
diferiu entre os protocolos. No P1, a média do início do cio foi de 48,41 ± 12,61 horas; no P2, a
média foi de 52,00 ± 16,48 horas; e no P3, a média foi de 47,60 ± 17,11 horas, onde o mínimo e
máximo de início de cio em horas, para os três protocolos foi de 24,00 e 84,00 horas,
respectivamente. Já no P4, a média foi de 65,14 ± 22,72 horas, onde o mínimo e máximo em
horas foi de 36,00 e 108,00 horas, respectivamente. Houve diferença estatística entre o P4 e os
demais protocolos estudados para a média de início de cio (p<0,05). Conclui-se que os protocolos
estudados foram efetivos para sincronizar o cio de ovelhas, sendo que para melhor avaliação ou
escolha do protocolo mais eficiente é necessário associar esses resultados à taxa de prenhez.
Palavras-chaves: Sincronização de estro, progestágeno, GnRH, ovelhas.
Reconhecimentos: FAPESB, Tortuga
s351
INFLUÊNCIA DE DIFERENTES ORIGENS E CONCENTRAÇÕES DE SORO

SOBRE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS CULTIVADOS IN VITRO
Bruno, J.B.1; Martins, F.S.1; Lima-Verde, I.B.2; Matos, M.H.T.1; Wanderley, L.S.3;
Correia, J.C.2; Silva, J.R.V.1; Figueiredo, J.R.1; Rodrigues, A.P.R.1
1
Faculdade de Medicina Veterinária, PPGCV, LAMOFOPA, Universidade Estadual do Ceará,
Fortaleza, CE, Brasil; 2Faculdade de Medicina Veterinária, PPGCV, Universidade Federal
Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil; 3Faculdade de Medicina Veterinária, LAMOFOPA,
Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brasil. jamily_vet@yahoo.com.br
A adição de soro ao meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais (FOPA) tem sido utilizada no
intuito de garantir a sobrevivência durante os processos de crescimento e maturação. O objetivo
desse trabalho foi verificar o efeito da adição, origem e concentração de soro sobre sobrevivência
e ativação de FOPA caprinos cultivados in vitro. Para tanto, quatro pares de ovários oriundos de
abatedouros locais foram seccionados em 15 fragmentos de 3 mm3, sendo 1 destinado ao controle.
Os demais foram cultivados individualmente em placas de 24 poços, em estufa a 39ºC e 5% de
CO2 por 1 ou 7 dias em Meio Essencial Mínimo suplementado (MEM +) na ausência ou presença
de 10 ou 20% de soro fetal bovino (SFB), soro de cabra em estro (SCE) ou soro de cabra fora do
estro (SCFE), compreendendo um total de 14 tratamentos. Após o cultivo in vitro, os fragmentos
ovarianos foram fixados e submetidos à análise histológica. O número de folículos
morfologicamente normais e a taxa de ativação folicular foram avaliados pelo Teste do Qui-
quadrado (P< 0,05). A análise do diâmetro folicular entre os diferentes tratamentos foi feita
através do Teste de Fisher (P<0,05). Após 1 dia de cultivo, os tratamentos contendo apenas
MEM+ ou MEM+ + 10% de SFB apresentaram percentuais de folículos morfologicamente normais
semelhantes ao controle. Tecido ovariano cultivado somente com MEM+ ou MEM+ + 10 ou 20%
de SFB ou 10% de SCE resultou em maiores percentuais de FOPA morfologicamente normais.
Após 7 dias, os maiores percentuais de folículos normais foram observados nos tratamentos
contendo somente MEM+ ou MEM+ + 10% de SFB. Comparando-se os períodos de cultivo, após
7 dias houve uma redução significativa no percentual de folículos normais em todos os tratamentos.
As taxas de ativação folicular foram superiores ao controle em todos os tratamentos, independente
do período de cultivo, sendo que após 1 dia, o tratamento contendo 20% SCE apresentou dados
numericamente maiores. Neste tratamento verificou-se ainda um aumento significativo no
diâmetro folicular após 7 dias de cultivo, quando comparado ao controle e em relação ao período
de cultivo. Esses resultados permitem concluir que, a adição de soro é benéfica ao cultivo in
vitro de folículos pré-antrais caprinos, em especial o SFB 10%, o qual mantém a morfologia
folicular normal por um período de até 7 dias. Além disso, conclui-se também que a adição de
20% de SCE ao cultivo in vitro de tecido ovariano promove a ativação e o crescimento de folículos
pré-antrais caprinos.
s352
AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA ABORTIVA, INTERVALO DO ABORTAMENTO E

RETENÇÃO DE PLACENTA APÓS A APLICAÇÃO DE D CLOPROSTENOL
SÓDICO EM VACAS NELORE
Cavalca, L.G.1; Verneck, W.C.2; Detoni, A.L.3; Marques, L.F.A.4; Nunes, L.C.5
1
Diretor – Comtecnica Embriões; Especialista em Produção de Ruminantes – UFLA; 2Médico
Veterinário UFES; 3Acadêmico UVV; 4Prof . UFES; 5Profa UFES. cavalca.lg@terra.com.br
O estudo foi realizado em uma fazenda de animais da raça nelore registrados na Associação
Brasileira de Criadores de Zebu (ABCZ), com objetivo de avaliar a eficiência abortiva do D
Cloprostenol Sódico, período da aplicação e a ocorrência do abortamento e retenção de placenta.
Antes da estação de monta foi realizado exame ginecológico em todas fêmeas da fazenda,
observando-se 20 fêmeas com gestação indesejada por não apresentarem cobertura conhecida, o
período gestacional variou de 30 a 80 dias, período este estimado utilizando os programas de
ultra-sonografia de diâmetro de corno uterino ou diâmetro do crânio fetal, com o aparelho Pie
Medical Falcon 100. A interrupção da gestação foi realizada pela administração, por via
intramuscular, de 250μg de D Cloprostenol Sódico após o diagnóstico da gestação indesejada,
sendo o abortamento confirmado por palpação retal no sétimo dia após a aplicação do tratamento.
A eficiência abortiva do D Cloprostenol Sódico foi de 100%, sendo evidenciado o abortamento
entre os dias 2 e 4 após o tratamento. O abortamento induzido em vacas Nelore no terço inicial
da gestação não ocasionou retenção de placenta. O D Cloprostenol Sódico é eficiente em sua
ação abortiva, levando a interrupção da gestação em fêmeas Nelore.
s353
AVALIAÇÃO DA FERTILIDADE APÓS ABORTAMENTO INDUZIDO COM D

CLOPROSTENOL SÓDICO EM VACAS NELORE
Cavalca, L.G.1; Verneck, W.C.2; Detoni, A.L.3; Marques, L.F.A.4; Nunes, L.C.5
1
Diretor – Comtecnica Embriões; Especialista em Produção de Ruminantes – UFLA;
2
Médico Veterinário; 3Acadêmic UVV; 4Prof.UFES; 5Profa. UFES. cavalcalg@terra.com.br
No presente estudo foi avaliado a fertilidade de vacas nelore após a indução do abortamento com
D Cloprostenol Sódico, considerando-se: número de serviços por concepção, número de dias
entre a indução do abortamento à primeira inseminação artificial e, número de dias entre a indução
do abortamento até a concepção. Antes da estação de monta foi realizado exame ginecológico
em todas as fêmeas da fazenda, sendo encontradas 20 vacas com gestação indesejada por não
apresentarem cobertura conhecida. O período de gestação variou de 30 a 80 dias e foi estimado
com auxilio de um aparelho de ultra-sonografia Pie Medical Falcon 100, através do diâmetro de
corno uterino e diâmetro cranial do feto. A interrupção da gestação foi realizada sob administração
por via intramuscular de 250μg de D Cloprostenol Sódico análogo sintético da PGF2α. As vacas
foram inseminadas na primeira manifestação de cio. O número de serviços por concepção após
a interrupção da gestação foi de 1,25 ± 0,55. O número de dias entre a indução do abortamento à
primeira inseminação artificial foi de 17,8 ± 1,05 dias e entre a indução do abortamento à concepção
foi de 24,26 ± 15,12 dias. A análise das informações foi realizada com auxilio do programa
estatístico SAS (P>0,05). O restabelecimento da atividade ovariana, idade das vacas e o período
gestacional não interferiram na fertilidade após a indução do abortamento. A interrupção da
gestação em seu terço inicial, após a administração de D Cloprostenol Sódico em vacas nelore,
não comprometeu a fertilidade subseqüente.
s354
PRODUÇÃO DE 13,14-DIIDRO 15-CETO PROSTAGLANDINA F2α EM RESPOSTA

À OCITOCINA NO PERÍODO PÓS PARTO EM VACAS DA RAÇA NELORE.
Satrapa, R.A.1a; Pinheiro, V.G.2b; Ereno, R.L.1; Bertan, C.M.4; Piagentini, M.1;
Binelli, M.3; Barros, C.M.2
1
Depto. de Reprodução Animal – FMVZ, 2Depto. de Farmacologia, IB-UNESP, Botucatu-SP;
3
VRA-FMVZ-USP, Pirassununga-SP; 4UEL, Londrina-PR. cmbarros@ibb.unesp.br
Objetivou-se com o presente estudo avaliar, em vacas Nelore no período pós-parto inicial, se
altas concentrações de progesterona (P4) precedendo a ovulação (priming de P4) e o aumento de
estradiol, induzido por tratamento hormonal, seriam capazes de diminuir a liberação endógena
de PGF2α e, conseqüentemente, evitar a lise prematura do corpo lúteo formado após a ovulação.
Os protocolos hormonais foram testados em vacas Nelore lactantes (40 a 70 d pós-parto, n = 30),
com escore corporal acima de 2,5 (escala de 1 a 5), divididas aleatoriamente em 3 Grupos: GPE
(n = 10), GPE/eCG (n = 10) e GPG/eCG (n = 10). Em estágio aleatório do ciclo estral (D0), os
animais do grupo GPE (GnRH – Prostaglandina – Benzoato de Estradiol) receberam 50 μg de
um análogo do GnRH (lecirelina, IM, Gestran plus®). Sete dias mais tarde (D7) os animais
receberam injeção de um agente luteolítico (250 μg de d-cloprostenol, IM, Prolise®) e no dia 8
(D8) foi administrado 1,0 mg de benzoato de estradiol (BE, IM, Estrogin®). No grupo GPE/eCG
os animais, além de serem tratados com o protocolo GPE, receberam 400 UI de eCG (IM,
Novormon®), logo após a administração do agente luteolítico (D7). No grupo GPG/eCG, os
animais foram tratados de acordo com o protocolo GPE/eCG, exceto que no lugar do BE foi
administrada uma segunda dose de GnRH (50 μg de lecirelina, IM) no D8. Em todos os animais
foram realizados exames ultra-sonográficos dos ovários (Aloka SSD-500, probe de 7,5 MHZ) e
coletas sanguíneas nos dias das aplicações hormonais, com a finalidade de classificar os grupos
de acordo com a presença ou ausência de altas concentrações de P4 (priming de P4) antes da
ovulação do folículo dominante. O desafio com ocitocina (OT, 50 UI, IV, Univet®) foi realizado
em cada vaca 5, 8, 11, 14 e 17 dias após a ovulação do folículo dominante e as amostras de
sangue foram colhidas antes e 30 minutos após a administração de ocitocina. Além disso, os
bezerros foram removidos temporariamente das vacas, 48 h antes do início dos tratamentos.
Utilizou-se ANOVA para estimar os efeitos de tratamento, priming de P4 e a interação nas variáveis
discretas e utilizou-se split-plot ANOVA para estimar os efeitos de tratamento, priming de P4,
dia do ciclo estral e interações nas variáveis com repetição no tempo. A média das concentrações
plasmáticas de P4 durante o período de sincronização foi maior (P<0,01) para as vacas com (3,70
± 0,51 ng/mL) em comparação às sem priming de P4 (1,25 ± 0,11 ng/mL). Na vacas sem priming
de P4, houve diminuição das concentrações de P4 no dia 17 (1,73 ± 0,29 ng/mL), em todos os
tratamentos. Entretanto, nos animais com priming os tratamentos com BE promoveram
manutenção de altas concentrações de P4 (8,89 ± 1,27 ng/mL), enquanto as vacas que receberam
GnRH para indução da ovulação apresentaram queda na P4 (2,12 ± 1,05 ng/mL) no dia 17
(interação tratamento x priming de P4 x dia; P<0,01). A producão de PGFM em resposta à
ocitocina aumentou entre os dias 5 e 17 (efeito de dia; P<0,01) e tal aumento tendeu a ser mais
pronunciado nos animais sem priming de P4 (efeito de priming de P4; P<0,06). Especula-se que
a pré-exposicão à P4 diminua a sensibilidade do endométrio à OT e que o aumento de E2, induzido
por tratamento hormonal, seria responsável pela diminuição (“down regulation”) dos receptores
endometriais do próprio E2, diminuindo a probabilidade de luteólise precoce no período pós-
parto. Bolsistas da aFAPESP e bCAPES.
s355
RELAÇÃO ENTRE O DIÂMETRO DO FOLÍCULO OVULATÓRIO, ÁREA DO

CORPO LÚTEO E TAXA DE CONCEPÇÃO EM VACAS DE CORTE DE RAÇAS
COMPOSTAS SUBMETIDAS A INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO.
Gênova, L.G.1; Delboni, M.I.2; Seneda, M.M.3
1
Pós-Graduando de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Londrina; 2Graduanda
do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Londrina; 3Departamento de
Clínicas Veterinárias, CCA, UEL, PR, 86051-990; radag@femanet.com.br
O objetivo do presente experimento foi avaliar a sincronização da ovulação e a relação entre o

diâmetro do folículo ovulatório, área do corpo lúteo e a taxa de prenhez em vacas paridas de
raças compostas de corte. Foram utilizadas vacas Bonsmara (n=15) e ½ Nelore - ½ Red Angus
(n=19), com média de 5 anos de idade (3 a 7) e até 90 dias de puerpério, sendo o escore corporal
entre 3,5 e 4,0 (escala de 1 a 5). O experimento foi conduzido durante os meses de março a
outubro de 2005 no município de Assis, estado de São Paulo. Todas as vacas foram consideradas
cíclicas pela presença de corpo lúteo ou folículo maior ou igual a 8mm de diâmetro após exame
ultra-sonográfico. Em um momento aleatório do ciclo estral, todos os animais receberam um
dispositivo intravaginal de 1,9g de progesterona (CIDR, Pfizer, Brasil) e uma aplicação de 2mg
de Benzoato de Estradiol (BE) IM (Estrogin, Farmavet, Brasil). No oitavo dia os dispositivos
foram retirados e administrou-se 263µg de cloprostenol (Sincrocio, Ouro Fino, Brasil) IM. Vinte
e quatro horas depois, todos os animais receberam 1mg de BE por via IM. Os animais foram
examinados por ultra-sonografia para mensuração dos folículos e inseminados em tempo fixo
após 52 a 56 horas da retirada dos dispositivos de progesterona. A mensuração dos corpos
lúteos foi realizada 21 dias após a IATF e o diagnóstico de gestação foi realizado 30 dias após a
mesma, ambos por ultra-sonografia. Obtêve-se uma taxa de prenhez de 82,35% (28/34), folículos
com diâmetro médio de 1,32 cm e de corpos lúteos com área média de 3,25 cm2 para os 34
animais. Para a raça Bonsmara os valores médios corresponderam a 1,47 cm para os folículos,
3,13 cm2 para os corpos lúteos e 66,67% (10/15) de taxa de prenhez. Para os animais Nelore-Red
Angus esses valores corresponderam a 1,21 cm para os folículos, 3,34 cm2 para os corpos lúteos
e 94,74% (18/19) de taxa de prenhez. Estes resultados preliminares sugerem a possibilidade de
não haver uma correlação direta entre o diâmetro do folículo ovulatório e o CL subseqüente, mas
corroboram o conceito de melhores índices de gestação com corpos lúteos maiores.
s356
DIFERENTES DOSAGENS DA ECG NO PROTOCOLO DE INDUÇÃO E

SINCRONIZAÇÃO DO ESTRO EM CABRAS LACTANTES DURANTE O PERÍODO
DE TRANSIÇÃO DA ESTAÇÃO ANESTRO PARA A ESTAÇÃO DE
ACASALAMENTO (DADOS PRELIMINARES)
Palhão, M.P.1; Bispo, C.A.S.1; Rovay, H.1; Carvalho, G.R.1; Rodrigues, M.T.1;
Fonseca, J.F.2, Zambrini, F.N.1, Rodrigues, A.L.1
1
DZO-UFV, 36571-000, Viçosa-MG, Brasil. 2Embrapa Caprinos, Sobral-CE, 62011-970,
Brasil. millerpalhao@yahoo.com.br
A utilização de protocolos a base de progesterona ou progestágeno, eCG e um agente luteolítico

promovem um bom controle do ciclo estral de cabras, sendo amplamente utilizados na indução
de ciclicidade em caprinos leiteiros (WHITLEY e JACKSON, 2003). A proposta do presente
estudo foi verificar se a redução na dosagem de Gonadotrofina coriônica eqüina (eCG), em
protocolos de indução e sincronização do estro em cabras leiteiras lactantes, constitui uma
alternativa para baratear os custos envolvidos com os acasalamentos durante a fase de transição
do anestro para a estação de acasalamento, antecipando, desta forma, esta última. Para tanto,
foram utilizadas 58 cabras, vazias (151 dias pós-parto) e lactantes (média de partos = 1,60),
escore de condição corporal (média = 2,59). Em todos os tratamentos a permanência do implante
progestágeno intravaginal (Acetato de Medroxiprogesterona, Progespon® 60 mg, Syntex S.A.,
Indústria Bioquímica e Farmacêutica, Buenos Aires, Argentina) foi de 9 dias e a aplicação de 30
µg de D-cloprostenol (Prolise®, ARSA S.R.L., Buenos Aires, Argentina) ocorreu 36 horas antes
da retirada do implante (8º dia). Neste momento os animais foram distribuídos entre os três
tratamentos, T1 (200 UI da eCG), T2 (140 UI da eCG) e T3 não recebeu a eCG (Novormon®
5.000, Syntex S.A., Indústria Bioquímica e Farmacêutica, Buenos Aires, Argentina). A observação
do estro teve inicio 12 horas após a retirada do implante, e as fêmeas foram acasaladas (Monta
controlada) no momento da observação do estro e 24 horas após a primeira cobertura, caso
permanecessem em estro. Os dados de fertilidade foram avaliados pelo diagnóstico de gestação,
aos 45 dias, de todos os animais cobertos. Para as comparações entre tratamentos foi utilizado o
teste de qui-quadrado, em nível de 5 % de significância. Os tratamentos não diferiram (P>0,05)
quanto à manifestação do estro, 78,94%, 66,67% e 57,14%, para T1, T2 e T3, respectivamente.
Apesar de não significativo (P>0,05), o intervalo entre a retirada do implante e o início do estro
foi menor para os animais do T1 (23 h), em relação aqueles do T2 (30 h) e T3 (40 h). A duração
do estro não diferiu (P>0,05) entre os tratamentos, 46,4 hs, 52,0 hs e 34,0 hs, para T1, T2 e T3,
respectivamente. Entre os animais que manifestaram estro, a fertilidade geral foi de 61,5 %, não
sendo observada diferença significativa (P>0,05) entre os tratamentos, 60 % (T1), 58,3 % (T2) e
66,7 % (T3). Considerando todos os animais induzidos, a taxa de prenhez geral foi de 41,4 % e,
entre os tratamentos, 47,3 % (T1), 44 % (T2) e 38 % (T3) (P>0,05). Podemos concluir que a
redução da dose e/ou não administração da eCG é eficiente na indução do estro em cabras lactantes
e não compromete a fertilidade dos animais durante a estação de transição.
Apoio: CnPQ
s357
β MAS NÃO DE
ÓXIDO NÍTRICO MODULA A SÍNTESE DE ESTRADIOL 17β
PROGESTERONA VIA GMPc EM CÉLULAS DA GRANUOSA ANTRAIS EM MEIO
DE CULTIVO QUIMICAMENTE DEFINIDO
Faes, M.R.1; Caldas-Bussiere,M.C.1; Viana, K.S.1; Costa, F.R.2; Escocard, R.M.3
1
Laboratório de Melhoramento Genético Animal/Setor de Reprodução (CCTA), 2 Laboratório
de Citogenética (LMGV), 3 Laboratório de Biologia do Reconhecer (CBB); 1,2,3 Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Av. Alberto Lamego, 2000, Parque Califórnia,
Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil. marrfaes@uenf.br
No ovário bovino, o NO vem sendo caracterizado como um dos reguladores da esteroidogênese

e apoptose das células da granulosa (CGs). Uma das vias utilizadas pelo NO para exercer seus
efeitos é a via GMPc. O presente estudo teve como objetivo verificar o efeito do nitroprussiato
de sódio (SNP), um doador de NO, na viabilidade e celular e esteroidogênese da GCs, e se este
efeito ocorre via GMPc, por meio da combinação do SNP com 1H-[1,2,3] oxadiaziolo
[4,3a]quinoxaline-1-one (ODQ), um inibidor seletivo da guanilato ciclase. As CGs de folículos
antrais (3-5mm) de bovinos foram cultivadas sem tratamento (controle); com ODQ; com SNP
(10-5, 10-3 e 10-1 M) sem e com ODQ por 24 h. No final de 24 h foram avaliadas a concentração
de nitrato/nitrito pelo método de Griess, viabilidade e ciclo celular pelo MTT (3-[4,5-
dimethylthiazol-2yl]-2,3 dipheniltetrazolium bromide) e citometria de fluxo, repectivamente e
síntese de 17â-estradiol (E2) e progesterona (P4) pela quimioluminescência. A concentração de
nitrato/nitrito no meio de cultivo aumentou (P<0.05) de uma maneira dose-dependente no meio
de cultivo de acordo com a concentração de SNP. As CGs cultivadas sem tratamento, com ODQ
e 10-5 M de SNP na presença/ausência de ODQ formaram grumos celulares, enquanto que, as
CGs cultivadas com 10-3 e 10-1M de SNP apresentaram desorganização e não formação de grumos
celulares, respectivamente, diminuição (P<0.05) da viabilidade celular e da síntese de esteróides,
cujos efeitos não foram revertidos pela adição de ODQ. A maioria das CGs cultivadas sem o
tratamento (controle), com ODQ e SNP (10-3 e 10-5 M) sem e com ODQ encontrou-se na fase
Go/G1 (80 – 70 %) e 20 – 30 % na fase S/G2 do ciclo celular, enquanto, as CGs cultivadas com
SNP 10-1 M apresentaram níveis subplóides de DNA. O SNP 10-5 M aumentou (P<0.05) a síntese
do E2 e inibiu (P<0.05) a síntese de P4. O ODQ reverteu (P<0.05) o efeito do SNP 10-5 M na
síntese de E2, mas não de P4 (P>0.05). Estes resultados sugerem que a síntese de E2 pelas CGs
antrais de folículos <5mm pode ser modulada pelo NO em concentrações baixas via GMPc, mas
não a de P4 e que o NO em concentrações elevadas está envolvido na injúria celular e/ou apoptose
das CGs.
s358
PROTOCOLOS DE INDUÇÃO E SINCRONIZAÇÃO DE ESTRO EM CABRAS

DURANTE A ESTAÇÃO DE ANESTRO
Zambrini, F.N.1; Costa, E.P.1; Fonseca, J.F.2; Bruschi, J.H.3; Viana, J.H.M.; Soria, G.F.3;
Amorim, L.S.4; Palhão, M.P.4; Carvalho, B.P.3; Rovay, H.4
1
DVT- UFV, Av PH Rolfs s/n, Cep 36570000, Viçosa-MG, Brasil; 2Embrapa Caprinos,
Estrada Sobral/Groaíras, Km 4, CP D 10, Cep 62011000, Sobral-CE, Brasil; 3Embrapa Gado
de Leite, Rodovia MG 133, Km 42, 36155000, Cel Pacheceo-MG, Brasil; 4DZO- UFV, Av PH
Rolfs s/n, Cep 36570000, Viçosa-MG, Brasil. fabiana_zambrini@yahoo.com.br
A sincronização de estro pode ser obtida através do uso do fotoperíodo artificial, efeito macho,
uso de melatonina, ou ainda por uma combinação de hormônios. A resposta ovariana à
sincronização do estro varia com o tipo de dispositivo utilizado, a espécie de progestágeno, o
estado nutricional, o meio ambiente e a estação do ano. O objetivo deste estudo foi testar a
eficiência de dois protocolos sobre a resposta de indução e sincronização de estro em cabras.
Foram utilizadas 60 cabras da raça Toggenburg (18 lactantes, 21 secas e 21 nulíparas), sendo
essas divididas aleatoriamente de acordo com escore de condição corporal e estatus lactacional
em dois tratamentos. Todos os tratamentos consistiram na inserção de esponjas intravaginais
contendo 60 µg acetato de medroxiprogesterona (Progespon®, Dia 0) por seis dias, na
administração intravulvo-submucosal de 37,5 μg de D-cloprostenol (Prolise®), e intra muscular
de 200 UI de eCG (Dia 4). Nos animais de T1 (10 lactantes, 10 secas e 12 nulíparas) as esponjas
foram inseridas e removidas e os hormônios administrados sempre pela manhã (10 – 11 hs), e
em T2 (08 lactantes, 11 secas e 09 nulíparas) pela tarde (14 – 15 hs). Quatro cabras (uma nulípara
e duas secas de T1, e uma nulípara de T2) perderam as esponjas e foram retiradas do experimento.
Doze horas após a remoção da esponja, foi feito o acompanhamento para detecção do início do
estro com auxilio de um macho cirurgicamente preparado (rufião) duas vezes ao dia, pela manhã
e ao entardecer. As analises dos dados intervalo da retirada das esponjas ao inicio do estro e a
duração do estro, foram feitas pela analise de variância (ANOVA). A percentagem de animais em
estro foi comparada usando-se o teste do qui-quadrado (X2). Houve diferença significativa (P<0.05)
com relação ao percentual de animais em estro entre os tratamentos, sendo T1 de 92.3% e T2 de
66.7%. O intervalo da remoção da esponja ao inicio do estro (45.60 ± 18.33 h e 43.46 ± 25.14 h)
e a duração do estro (31.20 ±18.97 e 27.65 ± 20.92) não diferiram (P>0.05) entre os tratamentos
1 e 2, respectivamente. Embora não tenha ocorrido diferença com relação ao intervalo para o
estro e sua duração entre os tratamentos, o T1 demonstrou ser mais eficiente na indução de estro
em cabras Toggenburg na estação de anestro fisiológico podendo ser indicado quando da utilização
de coberturas ou inseminação artificial com observação de estro.
*Suporte financeiro: CAPRIMA e Tecnopec.
s359
CONCENTRAÇÃO SÉRICA DE LH EM VACAS NELORE CICLANDO OU

OVARIECTOMIZADAS SUBMETIDAS AO TRATAMENTO COM 2,0MG DE
BENZOATO DE ESTRADIOL
Maio, J.R.G.1; Sandoval, G.A.F.1; Souza, E.D.F.1; Nogueira, G.P.2; Cipriano, R.S.2;
Perecin, F.3; Garcia, J.M.3
1
Ouro Fino Saúde Animal, Ribeirão Preto/SP Brasil; 2 Depto. Apoio, Produção e Saúde
Animal- F.O.A. – UNESP, Araçatuba/SP, Brasil; 3 DMVPRA – FCAV – UNESP, Jaboticabal/
SP, Brasil. jose.maio@ourofino.com
O benzoato de estradiol tem sido eficiente na liberação de LH em vacas ciclando ou

ovariectomizadas, com baixa progesterona endógena. Com o objetivo de avaliar o efeito de um
novo medicamento comercial a base de benzoato de estradiol (B.E.) 5 novilhas Nelore
ovariectomizadas e 10 novilhas Nelore inteiras ciclando foram sincronizadas com dispositivo
intravaginal de progesterona (DIB®, Syntex, Argentina) e 2,0 mg de benzoato de estradiol
(Estrogin®, Farmavet, Brasil) em dia aleatório do ciclo estral (Dia 0). No dia 8 foram retirados os
dispositivos e administrado 500µg de Cloprostenol Sódico (Sincrocio, Ouro Fino, Brasil). No
dia 9 foram tratados conforme os grupos: Grupo 1 (G1) - Cinco novilhas Nelore ovariectomizadas
receberam injeção única intramuscular de 2,0 mg de Benzoato de Estradiol (Sincrodiol®, Ouro
Fino, Brasil); Grupo 2 (G2) - Cinco novilhas inteiras Nelore receberam 2,0 mg de Benzoato de
Estradiol (Sincrodiol®) e Grupo 3 (G3) - Cinco novilhas inteiras Nelore receberam 2,0 mg de
Benzoato de Estradiol (Estrogin®). Amostras de sangue foram colhidas da veia jugular no momento
da administração do B.E. (dia 9) e de hora em hora iniciando depois de transcorridas 11 horas da
aplicação até completar 35 horas da mesma. Dessas amostras dosou-se o LH pelo método de
radioimunoensaio, para a avaliação do momento e duração do pico de liberação de LH endógeno.
A concentração plasmática máxima (Cmax) média de LH nas novilhas do G1 foi de 21,30 ng/mL
e a variação individual de 13,52 a 23,00 ng/mL, portanto maior (p<0,007) ao compararmos com
as novilhas do G2 que apresentaram em média 11,39 ng/mL e variação individual de 10,16 a
12,54 ng/mL e das novilhas do G3 que apresentaram em média 14,32ng/mL e variação individual
de 6,94 a 20,00 ng/mL. O tempo médio que levou da aplicação do benzoato de estradiol para a
ocorrência da concentração máxima de LH (Tmax) no G1 foi de 19,6 horas com variação individual
de 17 a 23 horas não diferiu (p>0,05) das novilhas do G2 e G3 que apresentaram o pico com 22,4
horas e variação individual de 20 a 25 horas e 18 a 25 horas, respectivamente para os tratamentos.
Esta maior eficiência na liberação de LH e maior variação no momento e amplitude de liberação
observada nas novilhas ovariectomizadas pode ser justificada por estas apresentarem menor
influência dos esteróides sexuais. Os resultados apresentados nos levam a concluir que o
Sincrodiol® é tão eficiente quanto ao Estrogin® na liberação de LH em novilhas Nelore ciclando
e as novilhas ovariectomizadas apresentam melhor resposta de liberação de LH endógeno do
que as inteiras.
s360
PROGESTÁGENOS ASSOCIADOS À ESTROGENOS SÃO CAPAZES DE INDUZIR

A ATRESIA DE FOLÍCULOS COM BAIXA DEPENDÊNCIA DE
GONADOTROFINAS?
Siqueira, L.C.; Ferreira, R.; Loguercio, R.S.; Borges, L.F.K.; Oliveira, J.F.C.;
Barreto, K.P.; Gonçalves, P.B.D.
Universidade Federal de Santa Maria, Departamento de Clínica de Grandes Animais,

Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal - BioRep, Santa Maria, RS, Brasil.
bayard@biorep.ufsm.br
Em bovinos, aparentemente a biodisponibilidade de IGF-I e estradiol intra-folicular são

responsáveis por manter o crescimento do folículo dominante durante o processo de divergência.
Neste momento, a concentração de FSH está diminuindo para níveis basais e o LH não tem um
papel evidente durante o processo de seleção folicular. Protocolos que associam progestágenos
ao estradiol para induzir regressão folicular destes folículos “dependentes do sistema IGF”,
aparentemente causam apenas modificações endócrinas em um sistema entendido como sendo
exclusivamente autócrino/parácrino. Se esta hipótese estiver correta, estes folículos “não
responsivos” provavelmente ovularão oócitos envelhecidos, prejudicando os resultados de
fertilidade. Este experimento foi conduzido para avaliar a dinâmica folicular de vacas com baixas
concentrações plasmáticas de progesterona endógena, que receberam três tratamentos diferentes
de progestágenos associados ao benzoato de estradiol (BE), antes (5-7mm), durante (8-10mm)
ou depois (>10mm) do momento esperado da divergência folicular. Trinta e seis vacas (60-90
dias pós-parto), amamentando em condição corporal 3 (1-caquético; 5-obeso), receberam 2 doses
de cloprostenol (IM; 12/12 horas). Quarenta e oito horas após a primeira dose, todos os folículos
>5mm foram removidos e o exame ultrassonográfico transretal foi realizado a cada 24h (transdutor
linear de 8MHz) até o dia 7 (Dia 0 = tratamento). Quando o maior folículo atingiu o diâmetro
entre 5-7, 8-10 ou >10mm, os animais foram aleatoriamente alocados para receber 2mg de BE
(IM) associados à pessários vaginais contendo 250mg de acetato de medroxi-progesterona (MAP),
com ou sem a administração de 100mg de progesterona (P4; IM) ou pessários vaginais contendo
P4 em um experimento fatorial 3x3. Os tratamentos induziram a regressão folicular em todas as
vacas, independente do tamanho folicular no momento de aplicação dos tratamentos. Estes dados
demonstram que a associação de estrógenos com pessários de liberação lenta de progestágenos/
progesterona é capaz de induzir atresia em folículos de diferentes tamanhos, mesmo aqueles
com uma baixa dependência de gonadotrofinas. Não houve interação entre grupos e tamanho
folicular nas variáveis tamanho máximo, tempo para atingir o tamanho máximo, regressão
folicular, emergência de nova onda ou tempo em platô. As vacas tratadas com pessários vaginais
impregnados com MAP ou P4 apresentaram dinâmica folicular semelhantes. Em conclusão,
independentemente do tamanho folicular, vacas com folículos em crescimento apresentam
respostas semelhantes na regressão do folículo dominante quando tratadas com BE e
progestágenos. Trabalho realizado com apoio do CNPq e FAPERGS.
s361
EXPRESSÃO DOS FATORES DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO 7 E 10 (FGF-7

E FGF-10) EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS BOVINOS
Pinto, M.G.L.2; Castilho, A.C.S.1; Amorim, R.L.3; Price, C.A.4; Buratini Jr., J.1
1.
Departamento de Fisiologia, IBB/UNESP, 2. Departamento de Reprodução Animal e
3
.Departamento de Clínia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade
Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, Brazil; 4.Centre de recherche en reproduction animale,
Faculté de médecine vétérinaire, Université de Montréal, St-Hyacinthe, Québec, Canada
anthony.castilho@ig.com.br
Estudos recentes têm evidenciado o envolvimento de diferentes fatores de crescimento

fibroblásticos (FGF) no controle do desenvolvimento folicular ovariano, dentre eles o FGF-7 e o
FGF-10, também conhecidos como fatores de crescimento dos queratinócitos 1 e 2. Estes fatores
são codificados por genes altamente semelhantes e participam de interações parácrinas entre
células mesenquimais e epiteliais, regulando a proliferação e diferenciação celular, através da
ativação do seu receptor comum, o FGFR-2b. O FGF-7 e o FGF-10 são predominantemente
expressos em células da teca de folículos antrais bovinos. Recentemente, nosso laboratório
demonstrou que a expressão do FGF-10 é maior na fase inicial do desenvolvimento folicular
antral bovino e que ela também ocorre em oócitos, contrastando com a ausência do RNAm do
FGF-7 nesse tipo celular. A expressão do FGF-7 já foi localizada em folículos pré-antrais de
ratas, mas não há dados disponíveis sobre a expressão do FGF-7 e FGF-10 em folículos pré-
antrais de outras espécies. Sendo assim, o presente trabalho testou as hipóteses de que os RNAm
do FGF-7 e FGF-10 estão expressos nas distintas fases do desenvolvimento folicular pré-antral
em bovinos e de que o FGF-10 está presente nos folículos pré-antrais. Ovários bovinos foram
obtidos em matadouro e os folículos pré-antrais foram isolados por dispersão mecânica com o
auxílio de um “Tissue Chopper”. Grupos (“pools”) contendo de 100 a 200 folículos pré-antrais
de cada uma das categorias de desenvolvimento (primordiais, primários e secundários),
recuperados de um único feto, tiveram seu RNA total extraído. A expressão gênica do FGF-7 e
FGF-10 foi examinada por RT-PCR utilizando-se “primers” oligodT na RT e “primers” gene-
específicos previamente publicados para bovinos (FGF-7) e ovinos (FGF-10) na PCR. A
amplificação do gene constitutivamente expresso GAPDH foi utilizada como controle interno
do RT-PCR. Utilizou-se pulmão fetal como controle positivo para o FGF-7 e FGF-10 e água em
substituição ao cDNA como controle negativo. A expressão protéica do FGF-10 foi investigada
por imunohistoquímica em cortes histológicos de ovários bovinos, utilizando anticorpo anti-
FGF-10 policlonal humano comercialmente disponível e segundo anticorpo conjugado a
peroxidase. A expressão gênica do FGF-7 e do FGF-10 foi detectada em amostras pertencentes
às três categorias de desenvolvimento. A imunohistoquímica revelou a presença do FGF-10 em
oócitos de folículos pré-antrais. Em conclusão, os dados presentes sugerem o envolvimento do
FGF-7 e do FGF-10 no controle do desenvolvimento folicular pré-antral desde o estágio primordial
e sustentam a hipótese de que o RNAm do FGF-10 é traduzido em folículos pré-antrais bovinos.
Financiado por FAPESP (Brasil) e NSERC (Canadá)
s362
REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA DO RECEPTOR DE FATOR DE

CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO 2b (FGFR-2b) DURANTE O
DESENVOLVIMENTO LUTEAL EM BOVINOS
Castilho, A.C.S.1; Giometti, I.C.2; Costa, I.B.2; Machado, M.F.2; Teixeira, N.A.1;
Papa, P.C.4; Price, C.A.3; Buratini Jr., J.1
1
Departamento de Fisiologia – IB/UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil. 2Departamento
de Reprodução Animal –FMVZ/UNESP. 3Centre de Recherche en Reproducion Animale,
Faculty of Veterinary, Montreal, Canadá. 4Departamento de Cirurgia- USP,São Paulo-SP,
Brasil. anthony.castilho@ig.com.br
O corpo lúteo (CL) é formado a partir da ovulação e tem como produto secretório primário a
progesterona, que é fundamental para o estabelecimento e manutenção da gestação. O
desenvolvimento do CL requer angiogênese, proliferação e diferenciação celular. Há evidências
de que fatores de crescimento participem do controle desses processos, dentre eles os fatores de
crescimento fibroblástico (FGF). A expressão do FGF-7 e FGF-10 já foi detectada no CL bovino.
Estes fatores participam de interações parácrinas entre células mesenquimais e epiteliais, regulando
a proliferação e diferenciação celular, pela ativação do seu receptor, o FGFR-2b, exclusivamente
expresso em células de origem epitelial. Embora a expressão de seus principais ligantes tenha
sido detectada no CL bovino, não há informações disponíveis sobre a expressão do FGFR-2b no
CL. Sendo assim, o presente trabalho objetivou testar as hipóteses de que o RNAm do FGFGR-
2b é expresso no CL bovino e que o grau de expressão é regulado ao longo do desenvolvimento
luteal. Para tanto, CLs bovinos foram obtidos por dissecação de ovários oriundos de matadouro
e classificados em quatro estágios de desenvolvimento luteal (estágio 1 = corpo hemorrágico,
estágio 2 = CL em desenvolvimento, estágio 3 = CL maduro, e estágio 4 = CL em luteólise;
Ireland et al.1980, Journal of Dairy Science, v. 63, p. 155-160). Amostras de tecido luteal (50 a
100mg) de 10 CLs para cada um dos quatro estágios de desenvolvimento luteal foram submetidas
à extração de RNA. A expressão do FGFR-2b foi examinada por RT-PCR semiquantitativo com
oligonucleotídeos iniciadores espécie-específicos. O RT-PCR semiquantitativo foi validado pela
escolha de números de ciclos de PCR e quantidade de RNA dentro da fase linear da curva de
amplificação. A intensidade das bandas foi analisada por densitometria computadorizada. A
amplificação do RNAm da enzima GAPDH foi usada como controle interno do RT-PCR. A
análise estatística foi realizada por ANOVA, seguida de teste de Tukey-Kramer HSD. A expressão
do FGFR-2b foi detectada em todos os estágios de desenvolvimento luteal, sendo maior no
estágio 4 do que nos estágios 1 e 2 (P<0,05). Os valores médios (FGFR-2b/GAPDH; média ±
EPM) foram 7,27 ± 2,80; 8,64 ± 1,91; 12,20 ± 2,48; e 28,03 ± 8,18 para os estágios 1, 2, 3 e 4,
respectivamente. Em conclusão, os dados presentes indicam que a expressão do FGFR-2b é
regulada ao longo do desenvolvimento luteal bovino. O padrão de expressão gênica do FGFR-
2b reforça a hipótese de que o FGF-10 e FGF-7 participam da regulação do desenvolvimento
luteal e sugere que estes fatores de crescimento estão envolvidos, especialmente, no controle
parácrino da luteólise.
Financiado pela FAPESP (Brasil) e NSERC (Canadá).
s363
IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS ASSOCIADAS AO

METABOLISMO DE GLICOSE EM OVIDUTO DE VACAS ZEBUÍNAS
Gomes, H.F.1; Dias, A.J.B.1; Logullo, C.2; Paes de Carvalho, C.S.1;

de Souza Filho, G.A.3; Ferreira, B.S.3
1
LMGA-CCTA-UENF; 2LQFPP-CBB-UENF; 3LBCT-CBB-UENF, 28013-600, Campos dos
Goytacazes, RJ, Brasil. aburla@uenf.br
Transporte de gametas, capacitação espermática, fertilização e desenvolvimento embrionário

inicial são todos eventos fisiológicos que ocorrem no interior do lúmen do oviduto. Esses eventos
ocorrem in vivo com mais sucesso que in vitro. Os principais substratos energéticos no fluido do
oviduto são glicose e piruvato da circulação sanguínea. Eles são os substratos mais comumente
investigados devido à sua importância para o metabolismo de espermatozóides e embriões. A
Glicogênio sintase quinase 3 (GSK3) encontrada em todos os eucariotos, é um componente bem
estabelecido da via de sinalização Wnt, a qual é essencial para o estabelecimento do padrão
corporal do desenvolvimento embrionário e também um componente chave de um grande número
de processos celulares, tais como síntese de proteínas, proliferação e diferenciação celular.
Trabalhos prévios sobre a concentração de substratos energéticos em fluido de oviduto realizados
em taurinos descreveram concentrações de glicose de 0,02 a 0,04 mM em fluido de oviduto
inteiro (Carlson,. J. Reprod. Fert, 23, 549-552, 1970). Até o momento não existem relatos sobre
a concentração de piruvato em fluido de oviduto bovino. O objetivo desse trabalho foi determinar
as concentrações de glicose e piruvato no fluido de ovidutos de vacas zebuínas com e sem corpo
lúteo e a presença da GSK3 em células de oviduto. Ovidutos foram obtidos em matadouros
locais e transportados ao laboratório em no máximo duas horas. Todo o procedimento foi feito
sob refrigeração. Para a dosagem de glicose foi utilizado Kit enzimático Glucox®, enquanto para
a dosagem de piruvato e lactato foram utilizadas as enzimas piruvato quinase e lactato
desidrogenase (Sigma). Todas as medidas foram repetidas três vezes, utilizando seis ovidutos
para cada dosagem de glicose e um oviduto para cada dosagem de piruvato e lactato. As
concentrações médias de glicose variaram entre as regiões anterior, média e posterior do oviduto
(9,57±0,24; 11,95±0,74; 10,33±1,21µg/µL de fluido; respectivamente). Maiores concentrações
de glicose e piruvato foram encontradas em fluido de ovidutos de vacas, correlacionadas com a
presença de corpo lúteo. Foi demonstrada também a presença de GSK3â em células de oviduto
de vacas zebuínas. Bandas com peso molecular aproximado ao da GSK3â foram detectados pela
análise de Western-blot. Adicionalmente, com o uso de primers degenerados correspondentes ao
domínio quinase conservado, obtivemos a amplificação de um fragmento de 600 pb esperado
por RT-PCR. Os zebuínos compõem a maior parte do rebanho bovino brasileiro, no entanto
existe uma carência de informações sobre o metabolismo energético do oviduto dessas vacas.
Maiores informações sobre o metabolismo energético no microambiente do oviduto de vacas
zebuínas podem contribuir para otimização do processo de produção in vitro de embriões.
s364
MATURAÇÃO OOCITÁRIA E PRODUÇÃO DE PROGESTERONA EM CADELAS
Apparício, M.F.1; Vicente, W.R.R.1; Ribeiro, A.P.C.1; Pires, E.A.1; Alves, A.E.1;
Covizzi, G.J.1; Nogueira, G.P.2; Gadelha, C.R.F.
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, 14884-900, Jaboticabal-SP, Brasil, 2DAPSA-FOA-UNESP,
16015-050, Araçatuba-SP, Brasil. maricyap@fcav.unesp.br
A maturação in vitro de oócitos em cadelas ainda apresenta índices pouco satisfatórios quando
comparados ao de outras espécies, como a bovina, devido a particularidades de sua fisiologia
reprodutiva, a qual, diferentemente de outras espécies, é caracterizada por ovulação de oócitos
imaturos sob ação de níveis crescentes de progesterona. O objetivo deste estudo foi avaliar os
efeitos da suplementação de hCG, progesterona e estradiol no desenvolvimento meiótico e
citoplasmático de oócitos caninos bem como na produção de progesterona pelas células do cumulus
no meio de cultivo durante o período de 24, 48, 72 e 96 horas. Foram coletados 896 COCs grau
I de 18 cadelas hígidas submetidas à OSH, divididas em três grupos (n=6) de acordo com seu
status reprodutivo (fase folicular = 340, lútea = 344 e anestro = 212) e cultivados em TCM 199
+ 25 UI/mL de hCG + 1 μg/mL de progesterona + 1 μg/mL de estradiol ou em meio sem
suplementação hormonal (controle). Os COCs foram avaliados quanto à maturação nuclear e
citoplasmática através da técnica de coloração dos grânulos corticais descrita por Cherr et. al.
(1998); bem como em relação ao tempo de cultivo nas diferentes fases do ciclo estral e a
mensuração da concentração de progesterona dos meios de maturação por radioimunoensaio
utilizando o kit coat-a-count® (TKPG2 - DPC, Los Angeles). A análise estatística foi realizada
com o teste qui-quadrado para comparar os grupos em relação à maturação oocitária e os períodos
foram comparados utilizando o z-teste. As concentrações de progesterona foram agrupadas por
período de cultivo, meio de maturação e fase do ciclo estral, e calculada a média e desvio padrão,
comparadas através do z-teste. Os resultados demonstraram não haver diferença na taxa de
maturação entre os grupos no meio suplementado, mesmo com o grupo lúteo apresentando a
maior quantidade de oócitos recuperados (344) e o folicular a maior taxa de MII (10% contra
6,6% lúteo e 5% anestro). Somente os oócitos maturados no meio suplementado com hormônios
atingiram MII, apresentaram maturação citoplasmática completa e foram capazes de produzir
progesterona, demonstrando um efeito positivo da suplementação. A concentração deste esteróide
diminuiu nas primeiras 24 horas, aumentando posteriormente com o decorrer do tempo em todos
os grupos, sendo que o valor máximo foi mensurado às 72 horas no grupo folicular e às 96 horas
no lúteo e anestro, apresentando diferença estatística (p<0,05). Este grupo também foi o que
apresentou o maior valor de progesterona (1371,4 ng/mL), ultrapassando a quantidade colocada
inicialmente no meio, seguido pelo grupo lúteo (934,4ng/mL). Estes resultados nos permitem
inferir que os oócitos necessitam inicialmente da progesterona para adquirir a competência
meiótica e posteriormente, as células do cumulus são capazes de secretá-la, principalmente após
72 horas de cultivo. O consumo bem como a produção de progesterona pelo oócito, parece
depender do ambiente fisiológico prévio, uma vez que os COCs obtidos de cadelas em estro
apresentaram as maiores concentrações do esteróide e as em anestro, as mais baixas. Sendo
assim, concluímos que a fase do ciclo estral não exerceu influência na maturação nuclear, mas
diferiu entre os grupos na citoplasmática e na produção de progesterona, aventando um possível
efeito positivo da fase folicular.
s365
PERFIL DE LH E FSH NA DIVERGÊNCIA FOLICULAR EM NOVILHAS

BUBALINAS (Bubalus bubalis)
Gimenes, L.U.1; Sá Filho, M.F.1; Carvalho, N.A.T.2; Torres-Júnior, J.R.S.1; Souza, A.H.1;
Vannucci, F.S.3; Bianconi, L.L.1; Bisinotto, R.S.1; Reichert, R.2; Beltran, M.P.4;
Nogueira, G.P.4; Baruselli, P.S.1
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ – USP, SP, CEP 05508-000; 2APTA – Registro,
SP; 3Veterinário autônomo; 4Departamento de Apoio e Produção em Saúde Animal,
Laboratório de Endocrinologia – UNESP – Araçatuba, SP.
ligimenes@usp.br e barusell@usp.br
Durante o desenvolvimento folicular, o crescimento de um grupo de folículos promove o declínio

nas concentrações de FSH até o momento da divergência folicular ou um pouco após.
Concomitantemente, os níveis de LH sofrem elevação transitória antes da seleção folicular (Ginther
et al., Biol. Reprod., v.65, p.638-47, 2001). O objetivo do presente trabalho foi testar a hipótese
de que fêmeas bubalinas apresentam alterações no perfil de gonadotrofinas durante o período de
desvio folicular, à semelhan-ça do que ocorre em fêmeas Holandesas. Para este fim foram
empregadas 10 novilhas da raça Murrah, cíclicas, com idade variando entre 15 e 36 meses e peso
entre 340 e 518 kg, as quais foram mantidas a pasto na APTA de Registro, com suplementação
fornecida na forma de silagem de milho, e água ad libitum. Os animais foram previamente
submetidos ao protocolo “Ovsynch” para sincronização da ovulação. Em dia aleatório do ciclo
estral todas as novilhas foram tratadas com 50 μg de Lecirelina IM (Gestran Plus®, Arsa,
Argentina). Sete dias após, foi administrado 0,5 mg de Cloprostenol IM (Ciosin®, Schering-
Plough Coopers, Brasil), e 48 horas depois as fêmeas receberam 25 μg de Lecirelina IM. A partir
da ovulação (D0) foram colhidas amostras de sangue da veia jugular, a cada oito horas durante as
primeiras 24 horas pós-ovulação, e posteriormente a cada quatro horas até o D4. O método
empregado foi o de radioimunoensaio de duplo anticorpo para dosagem de FSH e LH plasmáticos,
padronizado para bovinos, sendo a validação do ensaio na espécie bubalina realizada pelo teste
de paralelismo. A sensibilidade no ensaio de LH foi de 0,01 ng/ml e os coeficientes de variação
intra e inter-ensaio foram de 16,6% e 9,7%, respectivamente. Para o FSH, a sensibilidade foi de
0,1 ng/ml e os coeficientes intra e inter-ensaio foram de 14,8% e 13,4%, respectivamente. Os
dados foram normalizados para o momento da divergência folicular e, posteriormente, analisados
por ANOVA e por regressão linear, cúbica e quadrática. Não houve efeito de momento sobre as
concentrações plasmáticas de LH (P=0,96) e FSH (P=0,32) pelo ANOVA, e tampouco para o LH
quando analisado por regressão (P>0,1 nas análises de regressão linear, quadrática e cúbica).
Quanto ao FSH, houve efeito apenas quando se empregou a regressão linear (P=0,0001). Contudo,
o coeficiente de regressão desta variável foi baixo (r2=0,10), indicando que apenas pequena parte
do efeito observado é atribuído à variável tempo. Apesar de não se verificar efeito significativo
de tempo sobre os níveis de FSH e LH em novilhas bubalinas, visualmente se pôde observar que
o nadir das concentrações plasmáticas de FSH ocorreu 4 horas antes da divergência até 16 horas
após (1,11ng/ml, em média), em relação aos níveis máximos observados 40 horas antes do desvio
(1,53ng/ml). O LH oscilou entre 0,47ng/ml, 40 horas antes do desvio, a 0,35ng/ml, no momento
do desvio, até 0,32ng/ml, 24 horas após a divergência folicular. Conclui-se que a despeito da
metodologia empregada, não se detectaram mudanças nos perfis de gonadotrofinas de bubalinos
próximo à divergência folicular, rejeitando a hipótese do presente estudo.
s366
PERFIL DE LH E FSH NA DIVERGÊNCIA FOLICULAR EM NOVILHAS

NELORE (Bos indicus)
Gimenes, L.U.1; Sá Filho, M.F.1; Torres-Júnior, J.R.S.1; Souza, A.H.1; Beltran, M.P.2;
Nogueira, G.P.2; Binelli, M.1; Baruselli, P.S.1
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ – USP, SP, CEP 05508-000; 2Departamento de
Apoio e Produção em Saúde Animal, Laboratório de Endocrinologia – UNESP – Araçatuba,
SP. ligimenes@usp.br e barusell@usp.br
Em bovinos da raça Holandesa o fenômeno de divergência folicular é marcado pela diferença

nas taxas de crescimento entre os dois maiores folículos, associado ao declínio nas concentrações
plasmáticas de FSH e à elevação transitória nas concentrações de LH antes do desvio (revisado
em Ginther et al., Biol. Reprod., v.65, p.638-47, 2001). Desta maneira, o presente estudo teve
como objetivo traçar o perfil hormonal de fêmeas Nelore, a fim de caracterizar as variações nas
concentrações de gonadotrofinas em função do tempo durante a seleção folicular. Foram utilizadas
13 novilhas cíclicas pertencentes à Área de Bovinos de Corte da USP – campus Pirassununga,
mantidas a pasto, com peso acima de 325 kg e idades entre 20 a 24 meses. Em dia aleatório do
ciclo estral, os animais foram tratados com 2mg de benzoato de estradiol i.m. (BE; Index
Farmacêutica, Brasil) e um implante auricular de Norgestomet (Crestar®, Intervet, Brasil). Oito
dias após, os implantes foram removidos e administrou-se 0,15mg de d-cloprostenol IM
(Preloban®, Intervet, Brasil). Vinte e quatro horas após a retirada dos implantes, as fêmeas
receberam 1mg de BE IM. A partir da ovulação (D0) foram colhidas amostras de sangue da veia
caudal a cada 12 horas até o D5, para a dosagem de FSH e LH plasmáticos, realizadas em um
único ensaio. Empregou-se o método de radioimunoensaio de duplo anticorpo. A sensibilidade
do ensaio de LH foi de 0,02ng/ml e a de FSH de 0,005ng/ml. Os coeficientes de variação intra-
ensaio foram 13,6% e 18,8%, respectivamente. Os dados (media±EPM) foram normalizados
para o momento da divergência folicular e, posteriormente, analisados por ANOVA e por regressão
linear, cúbica e quadrática. Não houve efeito de tempo sobre as concentrações plasmáticas de
FSH (P=0,15) e LH (P=0,80), quando se utilizou análise de variância. Entretanto, houve
significância em ambas gonadotrofinas quando se empregou análise de regressão linear (P=0,004
e P=0,005, respectivamente). Apesar disto, os coeficientes de regressão foram baixos (FSH:
r2=0,08; LH: r2=0,03), indicando que apenas pequena parte do efeito observado é atribuído à
variável tempo. Embora estatisticamente não se tenha verificado variação nas concentrações de
gonadotrofinas ao longo do tempo em novilhas Nelore, os níveis de FSH atingiram os menores
valores plasmáticos 36 (0,40±0,05ng/ml) e 60 horas (0,42±0,04ng/ml) após a divergência,
comparativamente às 36 horas anteriores ao desvio, quando as concentrações foram máximas
(0,63±0,08ng/ml). Quanto ao LH, foram encontrados os menores níveis 36 horas antes da
divergência folicular (0,38±0,03ng/ml), aumentando para 0,47±0,05ng/ml, 72 horas após o desvio.
Nas condições do presente experimento não foi possível confirmar a hipótese e isto poderia ser
parcialmente atribuído ao maior intervalo de colheita adotado no presente estudo (12h) em relação
aos trabalhos realizados em Bos taurus, que empregaram intervalos de 8 horas. Contudo, é
importante ressaltar que a escolha do intervalo de 12h no presente estudo foi proposital, visto
que há um relato em novilhas Nelore de que o manejo mais intenso promove grande estresse aos
animais, podendo comprometer os resultados (Sartorelli, Dissert. Mestrado, UNESP – Botucatu,
2003).
s367
FATORES QUE AFETAM O VOLUME DO CORPO LÚTEO DURANTE O CICLO

ESTRAL DE VACAS HOLANDESAS DE ALTA PRODUÇÃO
Souza, A.H.1; Wosniacki, A.M.2; Torres-Júnior, J.R.S.1; Martins, C.M.1;

Ayres, H.1; Baruselli, P.S.1
1 2
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ/ USP, São Paulo/SP, Brasil. Médico
Veterinário autônomo. ahsouza@usp.br
O presente estudo objetivou avaliar o efeito de alguns fatores que podem afetar o volume do
corpo lúteo em vacas Holandesas de alta produção submetidas a protocolos inseminação artificial
em tempo fixo (IATF). Os animais (n=45) receberam 2 mg de benzoato de estradiol (Estrogin,
Farmavet, Brasil) e um dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR, Pfizer, Brasil) por 8
dias. No momento da retirada do dispositivo intravaginal e da aplicação de PGF2á (Lutalyse,
Pfizer, Brasil) no D8, os animais foram homogeneamente divididos em 4 grupos: G1) eCG (400
UI; Folligon, Intervet, Brasil) + cipionato de estradiol (1 mg de ECP; Pfizer, Brasil) no Dia 8;
G2) eCG (400 UI) no Dia 8 + GnRH (Fertagyl; Intervet, Brasil) no Dia 10; G3) ECP (1 mg) no
Dia 8; G4) GnRH no Dia 10. Exames ultra-sonográficos freqüentes foram utilizados para
acompanhar a dinâmica ovariana desde o início dos protocolos hormonais até a ovulação do
ciclo estral subseqüente à ovulação sincronizada. Os dados foram analisados com o PROC MIXED
do SAS e a unidade experimental vaca foi o objeto das medidas repetidas ao longo do tempo.
Probabilidades de P < 0,05 foram consideradas como significantes, e probabilidades entre 0,05
e 0,10 foram discutidas como tendências. Vacas que ovularam folículos menores apresentaram
um CL de menor volume (mm3) do dia 9 ao dia 12 do ciclo estral subseqüente. Primíparas
apresentaram um menor volume do CL do dia 7 ao dia 14. Animais de baixa condição corporal
(d” 2,5) tiveram menor volume do CL do dia 9 ao dia 16. Animais com dupla ovulação
apresentaram maior volume do CL do dia 7 ao 21. Vacas com maior produção de leite apresentaram
maior volume de CL do dia 7 ao dia 9. Vacas que foram sincronizadas antes de 60 dias pós parto
tiveram menor volume de CL do dia 7 ao dia 16. O tratamento com eCG aumentou o volume do
CL formado no dia 12 (5689 vs. 6750 mm3) e tendeu a aumentar no dia 14 (5040 vs. 5850 mm3).
Vacas com presença de lesões no casco (broca) tenderam a ter um menor volume de CL no dia 9
(3956 vs. 5715 mm3) do ciclo subseqüente. No tratamento com ECP, a presença ou não de CL no
início do protocolo e o dia da emergência folicular durante o protocolo de sincronização não
afetaram o volume do CL formado. Estes resultados sugerem que alguns fatores como o tamanho
do folículo ovulatório, número de parições, condição corporal, dupla ovulação, produção de
leite, dias pós parto, problemas de casco afetam a função luteínica e que o tratamento com eCG
aumenta o volume do CL no diestro subsequente ao protocolo de sincronização.
Agradecimentos: Pfizer, Nutricell
s368
EFEITOS DE MULTIPLOS TRATAMENTOS COM CIPIONATO DE ESTRADIOL

(ECP) NO PÓS-PARTO IMEDIATO NA PRODUÇÃO DE LEITE EM VACAS
HOLANDESAS DE ALTA PRODUÇÃO
Souza, A.H.1; Viechnieski, S.2; Rodrigues, A.C.O.3; Ayres, H.1; Baruselli, P.S.1
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ/ USP, São Paulo/SP, Brasil.2 Médico
Veterinário, Gerente Geral – Fazenda Iguaçu/PR, Brasil.3 Departamento de Zootecnia,
ESALQ/ USP, Piracicaba/SP, Brasil.ahsouza@usp.br
O objetivo deste experimento foi avaliar os efeitos da utilização de múltiplos tratamentos com
cipionato de estradiol (ECP) no pós-parto na produção de leite de vacas Holandesas de alta
produção. A hipótese era de que o grupo tratado com estradiol apresentaria uma maior produção
de leite até os 60 dias pós-parto. Inicialmente, um total de 48 vacas foram aleatoriamente
subdividias em dois grupos experimentais: 1) ECP (múltiplos tratamentos com ECP, Pfizer,
Brasil); 2) Controle (sem suplementação com ECP). Vinte e cinco por cento destes animais (7
vacas no ECP e 5 no Controle) apresentaram problemas no pós-parto que afetaram
significantemente a produção de leite (mastite, deslocamento de abomaso) e seus dados de
produção de leite não foram considerados nas análises. O protocolo de múltiplas injeções (i.m.)
de ECP utilizado foi: 0 a 3 dias após o parto - 4mg de ECP; em seguida, os animais receberam
mais 5 tratamentos de 2mg de ECP com intervalos de 3 a 4 dias para que estes fossem efetuados
em apenas dois dias da semana (Segunda-feira e Sexta-feira). A produção diária de leite nos
primeiros 60 dias pós-parto foi mensurada pelo sistema eletrônico Alpro-De Laval. As curvas de
produção de leite foram comparadas com o PROC REG do SAS, as variáveis contínuas foram
analisadas com o PROC GLM do SAS e as variáveis binomiais foram avaliadas com o PROC
FREQ do SAS. As curvas de produção de leite até os 60 dias pós-parto foram significativamente
diferentes entre os grupos, e os animais tratados com ECP produziram mais leite durante os
primeiros 60 dias pós-parto (30,9 ± 0,8 vs. 28,7 ± 0,8 kg) Houve interação tratamento-ordem de
lactação, sendo que o tratamento com ECP produziu maior aumento relativo na produção de
leite em vacas primíparas (Controle=21,9 ± 0.5 vs. ECP=26,5 ± 0.5) comparado com vacas
multíparas (Controle = 30,9 ± 0,5 vs. ECP = 32,9 ± 0,6). O tratamento com ECP não afetou a
porcentagem de animais com infecção uterina entre os dias 27 à 33 pós-parto (Controle = 37%
[7/19] vs. ECP = 29% [5/17]). Além disso, a média de produção de leite foi similar entre animais
com (29,9 ± 0,9 Kg) ou sem (29,7 ± 0,8 Kg) infecção uterina. Os resultados são sugestivos de
que os múltiplos tratamentos com ECP no pós-parto podem aumentar a produção de leite nos
primeiros 60 dias de lactação em vacas Holandesas de alta produção. Este aumento na produção
de leite parece ser mais evidente em vacas primíparas Outros experimentos correlacionando
produção de leite e suplementação com ECP no pós-parto devem ser conduzidos para elucidar os
possíveis mecanismos de ação e a repetibilidade no aumento da produção de leite.
Agradecimento: Pfizer
s369
CARACTERÍSTICAS BIOFÍSICAS DO “MILIEU INTÉRIEUR” UTERINO EM

VACAS DA RAÇA NELORE SUBMETIDAS A PROTOCOLOS DE
SINCRONIZAÇÃO DE OVULAÇÃO E ESTRO1
Nascimento, V.A.2; Torres, C.A.A.3; de Oliveira, M.M.N.F.4; Mourão, L.L.5;

Carneiro, C.6; Dias, M.2; Sousa, K.R.S.5; Oliveira, F.A.7; Viana, J.H.M.8
1
Parte da dissertação de Mestrado do 1° autor, financiada pela CAPES, 2 Doutorando do DZO/
UFV, 36571-000, Viçosa–MG, Brasil, 3 Professor do DZO/UFV, 36571-000, Viçosa–MG,
Brasil, 4 Professora do DZO/UFVJM, Diamantina-MG, Brasil, 5 Mestranda do DZO/UFV, 6
Estudante de Zootecnia/UFVJM, 7 Estudante de Medicina Veterinária/UFV, 8Pesquisador da
EMBRAPA-CNPGL, *Agradecimentos às empresas Tecnopec e Sensoglass pela colaboração.
vinicioaraujo@vicosa.ufv.br
O pH uterino reduz na fase luteal sugerindo comprometimento da fertilidade devido a alterações

dos efeitos de progesterona, no microambiente uterino, gerando condições subótimas para o
desenvolvimento embrionário. Objetivou-se avaliar o pH e a temperatura uterina e temperatura
retal em vacas Nelore submetidas a protocolos de sincronização de estro e ovulação. Utilizou-se
30 vacas distribuídas ao acaso em três tratamentos: T1 – inserção de dispositivo de progesterona
(DIB, Argentina) mais injeção (im) de 2 mg de benzoato de estradiol (BE, RIC BE®, Argentina)
no dia 0, retirada do DIB no dia 8 e injeção, im, de 300 UI de eCG (Novormon®, Argentina) mais
0,15 mg de PGF2α (Prolise®, Argentina), e a IA realizada 48 horas após a retirada do DIB,
simultânea a injeção, im, de 25 mg de Lecirelina (Gestran Plus®, Argentina); T2 – similar ao T1,
sendo administrado 1 mg de BE, im, no dia 9, substituindo a segunda dose de GnRH, e a IA
realizada 50-56 horas após a retirada do DIB; T3 – inseminação 12 a 18 horas após a detecção de
estro induzido por uma injeção, im, de PGF2α. As vacas foram pesadas (PV) e a condição
corporal (CC) determinada (escala de 1 a 9). No dia da IA mensurou-se o pH e a temperatura
uterina com pHmetro máster portátil® (São Paulo, Brasil) e a temperatura retal com termômetro
digital em cinco observações a intervalos de 6 horas, iniciando 6 horas antes do horário previsto
para IA até 18 horas após. Na análise estatística, utilizou-se o SAEG 8.0 a 5% de probabilidade.
Os dados foram analisados com comparação de médias pelo teste de Duncan. Mesmo distribuídos
ao acaso, foi verificada distribuição uniforme dos animais nos tratamentos quanto ao PV, a CC,
os dias no pós-parto, a idade e a ordem de parto (P>0,05). Os valores do pH uterino foram 7,20;
7,24 e 7,26 para os animais de T1, T2 e T3, respectivamente. Os valores detectados foram
superiores aos relatados por BUTLER et al. (Journal Dairy Science, v.81,p.2533-2539) e por
OLIVEIRA et al. (Revista Brasileira de Zootecnia, v.33, p.123-127). Na terceira mensuração, os
animais de T1 e T2 tiveram pH superior ao de T3 (7,41 vs 7,25); na quarta, os de T3 (7,42) e T2
(7,34) foram superiores aos de T1 (7,24); e, na quinta, os de T2 (7,41) foi superior ao dos animais
de T1 (7,34) e T3 (7,34). As temperaturas uterinas foram 37,51; 37,63; e 37,51°C para as vacas
de T1, T2 e T3, respectivamente. As temperaturas dos animais de T1 e T3 foram inferiores às
citadas por LEWIS et al. (Journal Dairy Science, v.67, p.146-152) para vacas em estro (37,74°C).
As temperaturas retais foram 38,51; 38,80; e 38,68°C para os animais de T1, T2 e T3,
respectivamente. JASKOWSKI (Bulletim Veterinary Insitute Pulawy, v.39, p.43-47) verificou
que vacas em estro induzido apresentaram pico de temperatura retal correlacionado à ovulação o
que não foi observado neste experimento. A sincronização de estro e da ovulação não foram
afetadas pelo pH e temperatura uterina e temperatura retal.
s370
EFICIÊNCIA DE DUAS DOSES DE CLOPROSTENOL SÓDICO (CIOSIN®) PARA

LUTEÓLISE EM BOVINOS NOS DIFERENTES DIAS DO CICLO ESTRAL
Fernandes, C.A.C.1; Vasconcelos, T.D.2; Oliveira, E.R.2; Alves, B.F.L.2;

Figueiredo, A.C.S.3; Gioso, M.M.3; Oba, E.4
1
Unifenas e Biotran Ltda – R. Tatuin, 93 – Res. Teixeira. 37130-000 Alfenas MG
cacf@biotran.com.br. 2Biotran Ass. e Consult. em Reprod. Animal LTDA. 3Unifenas – Rod.
MG179 – Km 0 - 37130-000 Alfenas MG - 4FMVZ-Unesp-Botucatu
A sincronização do estro em bovinos através da aplicação de agentes luteolíticos tem sido

amplamente utilizada em programas reprodutivos para diferentes finalidades. Levam a estros de
fertilidade comparada ao natural e apresenta custo menos elevado em relação a outros protocolos.
Estes porém ainda são elevados, o que leva a busca de alternativas como a utilização de doses
menores. Vários trabalhos analisam a eficiência dos produtos luteolíticos pela manifestação
posterior de estros, o que nem sempre reflete a real e capacidade de luteólise do produto aplicado.
O correto para avaliação da luteólise seria a redução da concentração de progesterona (P4). O
objetivo deste trabalho foi o de verificar a eficiência, pela dosagem de P4, de diferentes duas
doses (normal e reduzida) de Cloprostenol Sódico (Ciosin®), via intramuscular, em diferentes
fases do ciclo estral (diestro). Foram realizadas 120 aplicações de 265μg (T1) e 120 de 530μg
(T2) de Cloprostenol sódico em novilhas e vacas mestiças entre os dias 6 e 17 do ciclo estral.
Duas amostras de sangue para dosagem de P4 foram obtidas, a primeira antes da aplicação do
luteolítico e a segunda 24 a 30 horas mais tarde. Os animais foram distribuídos no momento da
aplicação de acordo com o dia do ciclo em 4 períodos: A (n=40): 6° ao 8° dia; B (n=40): 9° ao
11°; C (n=40): 12° ao 14° e D (n=40): 15° ao 17° dia do ciclo. Os animais nos diferentes períodos
foram subdivididos aleatoriamente nos dois tratamentos. Para eficiência total não houve diferenças
entre os dois tratamentos (93,33 e 97,50% para T1 e T2 respectivamente - χ2). A eficiência nos
diferentes períodos também foi semelhante entre os dois tratamentos (P>0,05). Para os períodos
A, B, C e D foram observados os seguintes valores de luteólise: 90,00; 90,00; 93,33 e 100,00%
e 96,67; 93,33; 100,00 e 100,00%, para T1 e T2, respectivamente. Para T1, a eficiência no
período D (15º ao 17º Dia) foi superior (P<0,05 - χ2). Para T2 a eficiência nos diferentes períodos
foi semelhante (P>0,05). Conclui-se que o produto utilizado é altamente eficiente em induzir
luteólise, nas diferentes doses e períodos analisados.
Palavras chave: Bovino, Cloprostenol sódico, Luteólise
s371
INFLUÊNCIA DA LEPTINA SOBRE A PUBERDADE DE NOVILHAS NELORE

(Bos taurus indicus) – RESULTADOS PRELIMINARES
Beltran, M.P.1,2; Nogueira, G.P.2; Delavaud, C.3; Chilliard, Y.3
1
VRA-FMVZ-USP São Paulo-SP, Brasil, 2DAPSA-FMVA-UNESP Araçatuba-SP, Brasil,
3
Unidade de pesquisa com herbívoros - INRA, Theix, França. mpaula@usp.br
Testando a hipótese de que a leptina atue como sinalizador metabólico, determinando o momento
do início da puberdade, o presente experimento teve o objetivo de avaliar o perfil da secreção da
leptina em novilhas Nelore pré-púberes, comparando sua concentração sérica entre novilhas
Nelore avaliadas precoces ou não precoces considerando a fertilidade aos 16 meses de idade.
Foram utilizadas 17 novilhas, filhas de vacas com puberdade precoce cruzadas com touros com
grande incidência de filhas com puberdade precoce. Todos os animais permaneceram em piquetes
nas dependências do Curso de Medicina Veterinária da UNESP de Araçatuba e foram
suplementadas diariamente com silo de milho e ração e tiveram acesso livre a bagaço de cana
hidrolisado, sal mineral e água, o ganho de peso foi acompanhado mensalmente. Amostras de
sangue venoso foram colhidas em tubos de 10 ml heparinizados a cada 4 dias, até a puberdade,
aliquotados e armazenados a -20°C em tubos de polipropileno. A leptina foi quantificada de
amostras colhidas nos 32 dias anteriores à primeira ovulação com formação de corpo lúteo
detectável pelo ultra-som e produção de progesterona acima de 1 ng/ml (dia zero), através de um
RIA específico para bovinos. A técnica de RIA empregada foi de duplo anticorpo. Utilizamos
leptina bovina recombinante (DSL R01708) e anticorpo específico fornecido pelo INRA. A iodação
foi feita pelo método Tetracloro (Iodogen®) e utilizado para o ensaio 10.000 cpm/tubo, primeiro
anticorpo diluído 1:500 e segundo anticorpo 1:15. A ligação máxima foi 14%, a ligação não
específica, 1%, o coeficiente de correlação da curva, 0,99 e coeficiente de variação intra-ensaio
4,92%. O ensaio foi validado através de um paralelismo entre a curva padrão e os controles alto
e baixo. Não houve diferença entre a leptina plasmática dos animais precoces (2,24±0,34ng/ml)
e dos não precoces (2,4±0,37ng/ml)(p = 0,8196), através da comparação de médias (teste t não
pareado) do InStat, assim como não houve interação tempo-tratamento (p=0,6510), determinada
pelo teste de Greenhouse-Geisse, utilizando-se o comando REPEATED gerado pelo proc GLM
do SAS. É provável que nesse experimento a concentração de leptina não esteja relacionada com
o início da puberdade. Recentemente, a administração de leptina a novilhas pré-puberes
alimentadas adequadamente não foi capaz de acelerar o inicio da puberdade, o que sugere que
leptina seja um fator passivo, permitindo a ocorrência da puberdade quando a maturidade sexual
é atingida, atuando como um fator metabólico permissivo à secreção de gonadotrofinas em resposta
à condição nutricional do animal (Maciel, J.Anim. Sci., v.82, p.2930, 2004). Não foi possível
demonstrar em novilhas Nelore um aumento na concentração de leptina plasmática semelhante
ao relatado para novilhas Holandesas (Diaz-Torga, Theriogenology, v.56, p.111, 2001; Garcia,
J.Anim.Sci., v.60, p.2158, 2002).
s372
Resumos
Fisiologia/Endocrinologia
do Macho
s373
s374
CONCENTRAÇÃO SÉRICA DE TESTOSTERONA E SUA RELAÇÃO COM A

CIRCUNFERÊNCIA ESCROTAL E A QUALIDADE ESPERMÁTICA DE TOUROS
DA RAÇA NELORE
Welter, B.M.1; Jacomini, J.O.1; Guardieiro, M.M.1; Meira, C.2; Diniz, E.G.1;
Guimarães, E.C.3; Reis, F.C.4
1
Faculdade de Medicina Veterinária – FAMEV/UFU, Uberlândia – MG, 38400-714, Brasil.
bmwvet@bol.com.br. 2Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária –
FMVZ/UNESP, Botucatu-SP. 3Faculdade de Matemática – FAMAT/UFU. 4Médico
Veterinário.
O espermiograma e a circunferência escrotal (CE) são parâmetros utilizados no exame andrológico

para atestar a fertilidade de Touros. Na busca de métodos que auxiliem no diagnóstico reprodutivo,
o presente trabalho objetivou avaliar a concentração sérica de testosterona e sua relação com a
CE, Defeitos Maiores (DM), Defeitos totais (DT), Turbilhonamento (Turb), Motilidade
Progressiva (Mot) e Vigor (Vig). Foram utilizados 55 Touros da raça Nelore com idade de 24 a
28 meses, criados sob manejo extensivo em uma propriedade no município de Uberlândia-MG,
em janeiro de 2006. As coletas de sangue foram realizadas por punção da veia caudal, das 8:20 às
10:20 horas da manhã, utilizando Tubos Vacuntainer® sem anticoagulante. Após a coleta o sangue
foi centrifugado a 700g por 15 min e o soro armazenado a -20ºC, até o momento da análise por
radioimunoensaio em fase sólida (Kit comercial Coat-A-Count Total Testosterone, TKTT 1829,
DPC®, Los Angeles, USA). Posteriormente, foram realizados a mensuração da CE e a coleta do
sêmen com o uso de eletroejaculador. Os exames imediatos (Mot, Vig e Turb) foram feitos com
o auxílio de um microscópio óptico. Alíquotas de sêmen foram armazenadas em tubos contendo
formol salina para posterior análise da morfologia espermática utilizando microscopia de contraste
de fase de acordo com as normas do CBRA (1998). Os dados foram analisados pela correlação
de Pearson (p<0,05). O coeficiente de variação intraensaio para determinação da testosterona
total foi de 8,8%, sendo que os animais apresentaram média de 5,08±3,89 ng/mL, com amplitude
de variação de 0,24 a 15,70 ng/mL. Houve tendência de diminuição do nível de testosterona do
início para o final do período de coleta. Os resultados em média e desvio padrão para DM(%),
DT(%), CE(cm), Mot(0-100), Vig(0-5) e Turb(0-5), foram de 6,80±8,20, 15,50±12,20, 32,86±2,27,
61,73±17,54, 3,20±1,01 e 2,15±1,53, respectivamente. Apesar de estar intimamente relacionada
com a espermatogênese, não houve correlação (p>0,05) entre a concentração sérica de testosterona
com as variáveis estudadas.
s375
CORRELAÇÕES ENTRE CARACTERÍSTICAS ESPERMÁTICAS, INTEGRIDADE

DE DNA E PRESENÇA DE GOTA CITOPLASMÁTICA PROXIMAL EM SÊMEN
CONGELADO DE BOVINOS
Koivisto, M.B.1; Carreira, J.T.1; Mingoti, G.Z.2; Perri, S.H.V.2; Rodrigues, L.H.3;
Rödel, E.U.R.4
1
DCCRA, FOA-UNESP, 16050-680, Araçatuba, SP, 2 DAPSA, FOA-UNESP, 16050-680,
Araçatuba, SP, 3LAGOA DA SERRA-CCPS, 14174-000, Sertãozinho, SP, 4 SANTA CLARA-
JACAREZINHO, 16880-000 Valparaíso, SP koivisto@fmva.unesp.br
Os objetivos deste trabalho foram avaliar a correlação entre integridade da cromatina de

espermatozóides bovinos e a presença de altos índices de gota citoplasmática proximal (GCP).
Selecionou-se 15 ejaculados com concentração espermática e” 20x106 espermatozóides/ palheta,
motilidade e” 40% e porcentagem de defeitos totais d” 15% (G1, controle). Paralelamente
selecionou-se 15 ejaculados (G2) de touros com altos índices de alteração morfológica GCP
(e”15%). Palhetas de 250 e 500ìL foram congeladas por método automatizado, pré-programado
pelas centrais. Após descongelação a 35°C por 30 segundos os seguintes testes foram realizados:
motilidade, vigor, concentração, morfologia espermática e análise de integridade da cromatina
com coloração de Laranja de Acridina (AO). As amostras foram incubadas por 3 horas a 37°C
para realização do teste de termo resistência lento (TTL), re-avaliou-se a motilidade, vigor,
porcentagem de DNA lesado e porcentagem de acrossomas íntegros (PIA). Para coloração com
AO o plasma seminal foi removido pelo método de centrifugação com solução salina aquecida
a 37°C, dois esfregaços de cada partida foram fixados “overnight” em solução de Carnoy. As
lâminas fixadas foram mergulhadas por 5 minutos em solução contendo 0,2% de AO em solução
tamponada de citrato e fosfato, Foram avaliadas 200 células em microscópio de epifluorescência
utilizando filtro com excitação de 490 e emissão de 530 a 640 nm. A classificação das células foi
realizada de acordo com a fluorescência emitida, sendo que os espermatozóides com DNA íntegro
se coravam em verde e aqueles com DNA lesado, do laranja ao vermelho (TEJADA et al., 1984).
A PIA foi avaliada em câmara úmida (1000x) segundo a técnica descrita por Herman et al (1996).
Para a análise dos dados foi adotado nível de significância de 5% e realizadas as análises de
variância, teste de tukey e análise da correlação. Os resultados obtidos nas avaliações realizadas
demonstraram haver diferença significativa entre G1 e G2 tanto após descongelação 0 hora
(45,67±1,75 e 33,33±6,10, respectivamente) como após o TTL (35,332,015 e 16,25±3,85,
respectivamente). Houve diferença significativa entre o vigor do grupo G1 (4,47±0,03 e pós-
TTL 3,8±0,20) e G2 (3,42±0,51 e pós-TTL 1,96±0,44). A PIA do G1 e do G2 variou
significativamente (55,27±1,68 e 31,5±4,98, respectivamente). A porcentagem total de defeitos
maiores (G1 4,7±0,70 e G2 35,58±4,79), de defeitos menores (5,40±0,60 e G2 13,04±1,91) e de
defeitos totais (G1 10,10±0,92 e G2 48,63±5,58) também diferiram significativamente. A
motilidade, o vigor e a PIA apresentaram correlação negativa com a porcentagem de GCP, tanto
antes quanto após TTL (-0,70 e -0,76; -0,76 e –0,73; -0,88, P<0,0001; respectivamente). Os
grupos G1 e G2 não apresentaram diferença significativa quanto à porcentagem de DNA lesado
(0,53 ± 0,11 as 0h e 0,73 ± 0,14 após 3hs para G1 e 1,33 ± 0,32 e 1,54 ± 0,69 para G2) porém,
demonstraram correlação positiva nos dois momentos (antes 0,4106, P=0,0094 e após TTL 0,6055,
P<0,0001). Os resultados indicam que a presença de altos índices de GCP contribuem
negativamente para a qualidade do sêmen e quanto maior a porcentagem deste defeito, maior foi
à porcentagem de espermatozóides com DNA lesado Apoio financeiro: FUNDUNESP.
s376
CARACTERÍSTICAS FÍSICAS E MORFOLÓGICAS DO SÊMEN DE TOUROS DA

RAÇA NELORE CONFINADOS E TRATADOS COM SOMATOTROFINA BOVINA
RECOMBINANTE (r-bST)
Amorim, L.S.1; Torres, C.A.A.1; Amorim, E.A.M.1; Guimarães, J.D.2; Silva Filho, J.M.3;
Fonseca, J.F.4; Viana, J.H.M.5; Siqueira, L.G.B.1
1
DZO/UFV, 36570-000, Viçosa-MG, Brasil, 2DVT/UFV, 36570-000, Viçosa-MG, Brasil, 3EV/
UFMG, 30123-970, Belo-Horizonte, Brasil, 4Embrapa Caprinos – Núcleo Sudeste, 36155-000,
Sobral-CE, Brasil, 5Embrapa Gado de Leite, 36038-330, Juiz de Fora – MG, Brasil.
lnlsamorimufv@yahoo.com.br
Objetivou-se avaliar o efeito da r-bST (LACTOTROPIN® Injetável – Sometribove Zinco 500,0

mg, ELANCO SAÚDE ANIMAL, Brasil) sobre as características físicas (turbilhonamento -
TUR, motilidade - MOT e vigor - VIG) e morfológicas (defeitos maiores - DM, menores - Dm e
totais - DT) do sêmen de dezesseis touros da raça Nelore, que foram confinados individualmente
e, distribuídos em um delineamento experimental em fatorial 2 x 2, com duas idades (jovens e
adultos) e dois níveis de r-bST (0 e 500 mg). Aplicações de r-bST ou solução salina, s.c., foram
realizadas a cada 14 dias, totalizando nove aplicações por animal, em um período experimental
de 120 dias, as coletas de sêmen foram realizadas a cada 15 dias por eletroejaculação. A MOT e
VIG foram avaliados por análise de variância não paramétrica e submetidos ao teste de Kruskal-
Wallis. As variáveis TURB, DM, Dm e DT foram submetidas a ANOVA, tendo como fonte de
variação o dia da coleta e as idades. As diferenças observadas na ANOVA foram estudadas pelo
teste de Tukey, utilizando o programa SAEG 8.0. As características físicas e morfológicas do
sêmen dos animais jovens tratados ou não com r-bST não diferiram entre si (P>0,05) TUR: 1,60
± 1,29 vs 1,63 ± 1,27; MOT: 48,75 ± 33,47 vs 45,94 ± 35,61; VIG: 2,16 ± 1,67 vs 2,81 ± 3,40;
DM: 33,78 ± 28,6 vs 36,87 ± 23,87 e DT: 39,6 ± 29,9 vs 46,83 ± 22,41, entretanto os Dm foram
significativamente menores nos animais tratados com r-bST (5,82 ± 2,96) comparado aos não
tratados (11,17 ± 7,84; P<0,05). Nos animais adultos, as características físicas do sêmen MOT e
VIG foram influenciadas pelo tratamento com r-bST (79,70 ± 11,56 vs 64,06 ± 23,65; 3,80 ±
0,88 vs 2,92 ± 1,25; P<0,05), respectivamente. Porém, o TURB não foi afetado pelo tratamento
(3,12 ± 1,25 vs 2,12 ± 1,46; P>0,05). Os DM (8,73 ± 5,68 vs 19,60 ± 15,78); Dm (5,98 ± 4,44 vs
7,98 ± 7,00) e Dt (14,72 ± 7,95 vs 27,58 ± 19,89), não diferiram (P>0,05) entre si. Os resultados
mostraram que o GH é efetivo em aumentar as características físicas e morfológicas do sêmen de
touros adultos, porém diminui os defeitos menores em touros jovens.
Suporte financeiro: CNPq e Fazenda Aguadinha/Curvelo – MG – Brasil.
s377
EFEITO DE DIFERENTES NÍVEIS DE ENERGIA METABOLIZÁVEL SOBRE A

HISTOLOGIA TESTICULAR DE CORDEIROS DA RAÇA SANTA INÊS EM
CRESCIMENTO
Assis, R.M.1; Perez, J.O.2; Souza, J.C.3; Filho, J.B.4
1
Doutoranda em Zootecnia, Departamento e Zootecnia-UFLA; 2Professor Titular,
Departamento de Zootecnia-UFLA; 3Professor Adjunto, Departamento de Zootecnia-UFLA e
4
Professor Adjunto, Departamento de Medicina Veterinária-UFLA. 1betaassis@uol.com.br
O experimento foi conduzido no Setor de Ovinocultura do Departamento de Zootecnia da

Universidade Federal de Lavras, Minas Gerais, com o objetivo de avaliar aspectos da microscopia
testicular de cordeiros Santa Inês, em crescimento, alimentados com diferentes níveis de energia,
proveniente da inclusão de fibra insolúvel em detergente neutro (FDN) na dieta. Foram utilizados
64 cordeiros Santa Inês, distribuídos em quatro tratamentos: Dieta A - 8,67; Dieta B - 17,34;
Dieta C - 26,01 e Dieta D - 34,68% de FDN de forragem. Quatro animais de cada tratamento
foram abatidos nas idades pré-determinadas: 43, 83, 123 e 173 dias Amostras de parênquima
testicular foram retiradas e conservadas em Bouin e posteriormente submetidas ‘a metodologia
histológica apropriada. Quadrantes de 1mm2 foram sobrepostos na objetiva e as proporções
relativas de tecido intersticial, túnica própria, epitélio seminífero, lúmen e túbulo seminífero
computadas de maneira que nos mesmos pontos e no mesmo número de pontos (na confluência
das linhas limites de cada quadrante). Os dados foram submetidas a análise de variância e as
médias comparadas pelo teste de Tuckey (SAS). A proporção relativa de tecido intersticial foi
maior (P<0,05) na dieta D em relação a dieta A, sendo as dietas restantes semelhantes entre si e
aquelas duas. Os valores médios da proporção de tecido intersticial foram 43,1±2,0; 46,7±2,0;
47,7±2,0 e 51,7±2,0 para as dietas A, B, C e D, respectivamente. As proporções de túnica própria
e de lúmen não foram diferentes entre os tratamentos. As proporções de epitélio seminífero e
túbulos seminíferos foram influenciadas pelas dietas, sendo para as dietas A, B, C e D de 30,3±1,8
e 56,9±2,0; 27,5±1,8 e 53,3±2,0; 25,7±1,8 e 52,3±2,0 e 23,3±1,8 e 48,2±2,0, respectivamente.
Da mesma forma que ocorreu com o tecido intersticial, na dieta de maior consumo de energia, ou
seja, a de FDN de 34,7, foram registradas as maiores (P<0,03) porcentagens de epitélio e de
túbulo seminífero. No entanto, não ocorreram diferenças entre as dietas D, B e C e nem entre as
dietas A, B e C, demonstrando que somente diferenças mais extremas de consumo de energia
foram capazes de refletir sobre o desenvolvimento testicular, à luz das características estudadas.
Em conclusão, foram observadas diferenças entre as dietas de 8,6 e 34,7 de FDN que demonstram
que a nutrição pode ser usada para possivelmente manipular a idade a puberdade dos carneiros
assim como propiciar condições melhores para produção de sêmen de qualidade em idades mais
baixas.
s378
AVALIAÇÃO DA HETEROGENEIDADE ESPERMÁTICA DE CARNEIROS DA

RAÇA SANTA INÊS ATRAVÉS DA ANÁLISE MORFOMÉTRICA
COMPUTADORIZADA NÃO AUTOMATIZADA
Monteiro, C.D.; Bicudo, S.D.; Toma, H.S.; Azevedo, H.C.; Rodello, L.; Sicherle, C.C.
DRARV FMVZ UNESP, 18618-000, Botucatu, Brasil. vettragi@ig.com.br
O presente estudo objetivou demonstrar a existência de heterogeneidade espermática entre

carneiros da raça Santa Inês por meio da análise morfométrica computadorizada não automatizada
dos espermatozóides. Foram realizados exames andrológicos e colheitas de sêmen pelo método
da eletroejaculação em 10 carneiros, com idade entre um e cinco anos, em condições corporais,
sanitárias e nutricionais adequadas. Confeccionaram-se esfregaços espermáticos de cada colheita
para serem levados à coloração de Karras. Os espermatozóides foram submetidos à análise
computadorizada de imagens, para morfometria utilizando-se “Leica Q Win Image Processing
Analysis Software”. Foram obtidas nas lâminas de forma digital, imagens correspondentes a 100
células de cada carneiro para a morfometria dos seguintes parâmetros: largura maior; largura de
base; comprimento da cabeça; área da cabeça; área do acrossomo; comprimento da peça
intermediária; toda extensão da cauda; comprimento total e relações da área do acrossomo com:
a área da cabeça; da peça intermediária e da cauda. Os dados obtidos foram apresentados por
meio da estatística descritiva, sendo submetido à análise de variância e comparados pelo método
Tukey com 5% de probabilidade, levando-se em conta os parâmetros morfométricos dos
espermatozóides e o efeito do carneiro. As médias e desvios padrão das medidas morfométricas
foram para comprimento da cabeça do espermatozóide (μ) 8,59±0,28, para largura maior (μ)
4,9±0,25, para largura da base (μ) 2,5±0,25, para área da cabeça (μ)2 37,23±2,24, para área do
acrossomo (μ)2 22,77±1,96, para relação área da cabeça/acrossomo (%) 0,61±0,05, para peça
intermediária (μ) 16,49±1,13, para cauda (μ) 61,07±2,37 e para comprimento total (μ) 69,66±2,45.
Os animais apresentaram heterogeneidade em relação às medidas morfométricas dos
espermatozóides (comprimento da cabeça, largura maior, largura da base da cabeça; peça
intermediária, cauda, área da cabeça, área do acrossomo, relação área do acrossomo/área da
cabeça e comprimento total). Houve efeito do carneiro sobre as medidas obtidas neste experimento.
Novos estudos devem ser feitos com ampliação do número de animais, comparação de raças, e
com grupos de idades diferentes na tentativa de se elucidar qual o fator determinante da
heterogeneidade da biometria espermática entre carneiros.
s379
s380
Resumos
Inseminação Artificial e IATF
s381
s382
DOSES DE CIPIONATO DE ESTRADIOL COMO ESTÍMULO OVULATÓRIO EM

PROTOCOLO DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO
Meneghetti, M.1; Losi, T.C.1; Vilela, E.R.1, Maia, S.A.1; Vasconcelos, J.L.M.2
1
Lageado Consultoria Agropecuária, Mineiros-GO, Brasil; 2DPA–FMVZ-UNESP, Botucatu-
SP, Brasil, vasconcelos@fca.unesp.br
Meneghetti (Acta Scientiae Veterinariae, v.33, p.256) testou diferentes estímulos ovulatórios em
protocolo de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) no qual utilizou dispositivo intravaginal
de P4 (CIDR®) por nove dias associado à aplicação de 2,0 mg de benzoato de estradiol no início
do protocolo. No estudo não foi observada diferença nas taxas de concepção entre os animais
tratados com 0,5 ou 1,0 mg de cipionato de estradiol (ECP) como estimulo ovulatório no momento
da retirada do CIDR®. Em outro experimento (Meneghetti, Acta Scientiae Veterinariae, in press...)
não detectou diferença nas taxas de concepção dos animais sincronizados com CIDR® e 1,0 mg
de ECP ou 2,0 mg de benzoato de estradiol no início do protocolo. O objetivo deste experimento
foi comparar o efeito da dose de ECP utilizada como estímulo ovulatório em protocolo que
iniciou com aplicação de 1,0 mg de ECP junto com a inserção do CIDR®. Foram utilizadas 195
vacas Nelore paridas, sendo 121 na fazenda 1 com escore de condição corporal (ECC) 3,31 ±
0,22 e 74 animais na fazenda 2 com ECC 3,08 ± 0,26, mantidas em regime de pasto com
suplementação mineral. Todas as vacas foram sincronizadas com o mesmo protocolo base: no
dia 0 os animais receberam o dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR®, 1,9 g de P4,
Pfizer) novo ou pré-utilizado por 9 ou 18 dias e foi aplicado cipionato de estradiol (1,0 mg, i.m.,
E.C.P.®, Pfizer), o dispositivo permaneceu nos animais por nove dias e dois dias antes da retirada
do CIDR® (dia 9) os bezerros foram removidos e as vacas divididas aleatoriamente em dois
tratamentos, Grupo 0,25: foi aplicado 0,25 mL de ECP (0,5 mg, i.m., E.C.P.®, Pfizer); Grupo 0,5:
foi aplicado 0,5 mL de ECP (1,0 mg, i.m., E.C.P.®, Pfizer). A IATF foi realizada 46 a 50 horas
após a retirada do dispositivo. Os bezerros retornaram com as mães após a IATF. A análise
estatística foi feita por regressão logística no SAS. O diagnóstico de gestação foi feito com ultra-
som (Aloka SSD-500, 5,0 mHz) 28 dias após a IATF. Não foi observado efeito de dose de ECP
(0,25 vs. 0,5 mL) na taxa de concepção dos animais sincronizados, sendo 36,4% (36/99) nas
vacas do Grupo 0,25 e 36,5 (35/96) no Grupo 0,5. Foi verificado efeito (p<0,05) de fazenda na
concepção dos animais, na fazenda 1 foi 43,8% (53/121) e 24,4% (18/74) na fazenda 2. Os
resultados indicam que neste protocolo as duas doses de ECP testadas podem ser utilizadas, sem
alterar as taxas de concepção. Palavras-chave: cipionato de estradiol, concepção, vaca nelore
s383
EFEITO DO GnRH NA TAXA DE GESTAÇÃO EM PROTOCOLOS DE

SINCRONIZAÇÃO DE ESTRO EM OVELHAS
Cavalcanti, A.S.1; Fonseca, J.F.2; Nogueira, L.A.G.1; Brandão, F.Z.1; Silva, A.L.S.1;
Pinho, T.G.1; Pinna, A.E.1; Carvalho, B.C.3
1
Programa de Pós-Graduação em Clínica e Reprodução Animal - FV/UFF, 24.230-340,
Niterói – RJ, Brasil; 2 Embrapa Caprinos, 62011-970, Sobral – CE, Brasil, 3Pós-Graduação
EV/UFMG. cavalcantiamanda@hotmail.com
A sincronização de estro é de particular interesse em ovelhas para utilização da inseminação

artificial, com momento prefixado, sem observação das manifestações estrais. A eficiência de
um programa de inseminação artificial em tempo fixo requer o uso de protocolos que garantam
taxas de prenhes aceitáveis. Nos tratamentos tradicionais os progestágenos são utilizados por
períodos similares ao tempo de vida do corpo lúteo e são eficientes em sincronizar o estro, mas
com fertilidade variada. Viñoles et al. Theriogenology 51,1351-1361, 1999. obtiveram taxas de
gestação mais altas utilizando protocolos de curta duração quando comparadas às dos protocolos
tradicionais. Quando utilizado isolado o GnRH induz o pico pré-ovulatório de LH concentrando
as ovulações, porém seus resultados quanto a fertilidade em programas de sincronização em
ovelhas ainda são incertos (Menchaca A. and Rubianes E. Reprod. Fertil. and Develop. 16,403-
413, 2004.). O objetivo deste estudo foi verificar a influência do GnRH sobre as taxas de gestação
em ovelhas submetidas a monta natural e inseminação artificial após a indução e sincronização
do estro. O experimento foi conduzido em Janeiro e Fevereiro na Fazenda Escola - UFF em
Cachoeiras de Macacu – RJ (22o27’S, 43o39’W). Ovelhas Santa Inês puras e cruzadas com Dorper
(n=66) foram selecionadas e igualmente divididas em dois grupos de tratamento considerando o
escore de condição corporal (3,14 ± 0,48) e peso (41,8 ± 8,80). O estro foi sincronizado com
pessário vaginal impregnado com 60mg de acetato de medroxiprogesterona (Progespon®-
Tecnopec, SP, Brasil) mantido por seis dias. Vinte e quatro horas antes da retirada do pessário
foram administradas 300UI de eCG (Novormon 5000®- Tecnopec, SP, Brasil) IM e 30µg de d-
clorplorstenol (Prolise®- Tecnopec, SP, Brasil) intravulvar. Um dia após a retirada da esponja o
grupo controle (C, n=32) recebeu 1mL de solução fisiológica e o grupo tratado (T, n=34) 0,025mg
de GnRH (Gestran®- Tecnopec, SP, Brasil) IM. Os animais de ambos os grupos foram novamente
divididos para serem submetidos à IA laparoscópica (LP, n=26) ou monta natural controlada
(MN, n=40) utilizando reprodutores de fertilidade comprovada. A IA, com sêmen fresco diluído
na concentração de 100x106 espermatozóides/mL, foi realizada 55,07 ± 0,85 e 55,03 ± 1,08
horas após a retirada da esponja nos grupos C e T, respectivamente. Foram realizadas duas montas
naturais com intervalo de 24 horas, após a detecção do estro, sendo a primeira monta 28,92 ±
5,92 e 28,49 ± 5,89 horas após a retirada da esponja nos grupos C e T, respectivamente (P>0,05).
A taxa de gestação não diferiu (P>0,05) entre os grupos C e T, sendo de 50% (16/32) e 44,18%
(15/34), respectivamente. Em relação ao método de cobertura as taxas de gestação foram de
52,5% (21/40) na MN e 38,46% (10/26) na LP (P<0,05). O tratamento com GnRH associado a
protocolos de tempo curto com progestágenos não alterou as taxas de gestação.
Fonte de Financiamento: Tecnopec
s384
TAXA DE OVULAÇÃO EM PROTOCOLOS DE SINCRONIZAÇÃO COM

PROTESTÁGENOS ASSOCIADOS AO GNRH EM OVELHAS
Cavalcanti, A.S.1; Fonseca, J.F.2; Nogueira, L.A.G.1; Brandão, F.Z.1; Silva, A.L.S.1;
Pinho, T.G.1; Boité, M.C.1; Carvalho, B.C.3
1
Programa de Pós-Graduação em Clínica e Reprodução Animal - FV/UFF, 24.230-340,
Niterói – RJ, Brasil; 2 Embrapa Caprinos, 62011-970, Sobral – CE, Brasil, 3 Pós-Graduação
EV/UFMG - cavalcantiamanda@hotmail.com
O sucesso de programas de sincronização de estro utilizando esponjas impregnadas com

progestágenos, particularmente para inseminação artificial em tempo fixo, varia consideravelmente
(Leyva V.; Buckrell B.C.; Walton J.S. Theriogenology 50: 395-416, 1998). Segundo Rubianes et
al. Theriogenology 48: 1093-1104, 1997.o uso do GnRH induz o pico pré-ovulatório de LH
antecipando e concentrando a ovulação. O objetivo deste estudo foi verificar a influência do
GnRH sobre a dinâmica ovariana e taxa de ovulação em ovelhas submetidas a sincronização de
estro utilizando progesterona por período curto. O experimento foi conduzido em janeiro na
Fazenda Escola – UFF em Cachoeiras de Macacu – RJ (22o27’S, 43o39’W). Ovelhas Santa Inês
(n=20) foram selecionadas aleatoriamente e igualmente divididas em dois grupos de acordo com
o escore de condição corporal (3,22±0,46) e peso (38,24±5,04). O estro foi sincronizado com
pessário vaginal impregnado com 60mg de acetato de medroxiprogesterona (Progespon® -
Tecnopec, SP, Brasil) mantido por seis dias. Vinte e quatro horas antes da retirada do pessário
foram administradas 300UI de eCG (Novormon 5000® - Tecnopec, SP, Brasil) IM e 30µg de d-
cloprostenol intravulvar (Prolise® - Tecnopec, SP, Brasil). Um dia após a retirada da esponja o
grupo controle (C, n=10) recebeu 1mL de solução fisiológica e o grupo tratado (T, n=10) 0,025mg
de GnRH (Gestran® - Tecnopec, SP, Brasil) IM. Os animais de ambos os grupos foram novamente
divididos para serem submetidos a IA laparoscópica (5 em cada grupo) ou monta natural controlada
(5 em cada grupo) utilizando reprodutores de fertilidade comprovada. A IA, com sêmen fresco
diluído na concentração de 100x106 espermatozóides/mL, foi realizada 32,37±12,64h e
54,19±0,81h após a retirada da esponja para os grupos C e T, respectivamente. Foram realizadas
duas montas naturais com intervalo de 24 horas, após a detecção do estro, sendo a primeira
43,49±15,76h e 42,66±5,38h após a retirada da esponja nos grupos C e T, respectivamente
(P>0,05). Exames ultra-sonográficos foram realizados pelo mesmo operador, com aparelho modelo
Aloka SSD 500 (Aloka Co., Ltda., Tókio, Japan) equipado com transdutor linear de 5MHz. As
avaliações dos ovários foram feitas 12, 24, 36, 48 e 60 horas após a retirada da esponja. O
número, a posição relativa e o tamanho dos folículos ovarianos e” 3mm foram devidamente
anotados em fichas próprias. Considerou-se como dia da ovulação quando o maior folículo antes
identificado, não estava mais presente. O intervalo entre a retirada da esponja e ovulação foi de
50,09±5,59 e 48,31±6,18 horas nos grupos C e T, respectivamente (P>0,05, SNK). A taxa de
ovulação foi de 90% em ambos os grupos. A primeira monta natural ocorreu 15,86±18,85h antes
da ovulação no grupo C e 13,64±19,51h no grupo T. O intervalo entre a ovulação e IA foi
3,56±5,23h no grupo C e 4,94±6,43h no T. O tratamento com GnRH associado a protocolos de
sincronização com progestágenos em tempo curto não se mostrou eficiente em antecipar a ovulação
em ovelhas.
s385
DINÂMICA FOLICULAR E FERTILIDADE EM VACAS DE CORTE COM CRIA

SINCRONIZADAS COM DISPOSITIVO INTRAVAGINAL COM PROGESTERONA
E GnRH
Pincinato, D.1,2; Peres, L.C.1,2; Miranda, G.3; Cutaia, L.2; Bó, G.A.1,2
1
Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 3Pontifícia Universidade Católica (PUC),
Poços de Caldas-MG, Brasil. 2Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC), Jerónimo
Luis de Cabrera 106, X5000GVD, Córdoba, Argentina. gabrielbo@iracbiogen.com.ar
Dois experimentos foram realizados para avaliar o efeito de diferentes programas Co-Synch
com dispositivo intravaginal com progesterona (P4) e eCG sobre as taxas de prenhezes em vacas
de corte com cria inseminadas artificialmente em tempo fixo (IATF). No Experimento 1, 40
vacas com cria, cruza zebu, <90 dias pós-parto e condição corporal (CC) 2,5±0,34 (escala 1-5)
foram divididas aleatoriamente em 4 grupos em um esquema 2x2 fatorial. Todas as vacas
receberam um dispositivo DIB (Syntex, Argentina) e 50 μg de GnRH (Lecirelina, Gonasyn,
Syntex) IM no Dia 0 e foram divididas ao remover o DIB e receber 150 µg D+cloprostenol
(Ciclase, Syntex) no Dia 6 (6-dia Co-Synch) ou 7 (7-dia Co-Synch). As vacas foram subdivididas
no momento da remoção do DIB, ao receber ou não 400 UI eCG IM (Novormon, Syntex SA).
Todas as vacas receberam um segundo tratamento de GnRH 66h depois da remoção do DIB. Foi
realizado exame diário do ovário por ultra-sonografia nas vacas do Dia 0 a remoção do DIB, e
após este momento a cada 6h até a ovulação. As médias foram comparadas por ANAVA e as
proporções pelo teste de chi-cuadrado. Setenta e cinco por cento (30/40) das vacas ovularam
após o primeiro tratamento de GnRH e 95,0% (38/40) iniciaram uma nova onda folicular 1,9±1,6
dias depois do tratamento de GnRH. Não houve efeito significativo (P>0,05) de dia da remoção
do DIB ou tratamento de eCG sobre o diâmetro do folículo ovulatório (6-dia Co-Synch:
12,4±0,4mm vs. 7-dia Co-Synch: 12,2±0,4mm; eCG 12,6±0,4 mm vs. não eCG 12,0±0,4mm),
taxa de crescimento diário do folículo ovulatório (6-dia Co-Synch: 0,8±0,1mm vs. 7-dia Co-
Synch: 0,5±0,1mm; eCG 0,8±0,1mm vs. não eCG 0,5±0,1mm) e intervalo da remoção do DIB a
ovulação (6-dia Co-Synch: 90,1±2,8 h vs. 7-dia Co-Synch: 87,0±2,8h; eCG 87,8±2,8h vs não
eCG 89,3±2,9h). No Experimento 2, 286 vacas com cria da mesma fazenda receberam o mesmo
tratamento do Experimento 1 e foram IATF no momento do segundo tratamento de GnRH (66h
após remoção do DIB). As taxas de prenhezes foram detectadas por ultra-sonografia 30 dias
após a IATF e analisadas por regressão logística. Não houve efeito significativo de inseminador
e CC sobre as taxas de prenhezes. Não houve efeito do Dia da remoção do DIB (P>0,05) sobre as
taxas de prenhezes (6-dia Co-Synch: 36/143, 25,2% vs. 7-dia Co-Synch: 45/143, 31,5%).
Entretanto, houve um efeito significativo (P<0,05) do tratamento de eCG sobre as taxas de
prenhezes (eCG=49/139, 35,3% vs. não eCG=32/147, 21,8%). Embora a administração de eCG
não tenha aumentado o diâmetro do folículo dominante, sua aplicação aumentou as taxas de
prenhezes em vacas com cria, cruza zebu tratadas com o programa Co-Synch por 6 ou 7 dias
com dispositivo intravaginal com P4.
s386
INFLUÊNCIA DO DIÂMETRO UTERINO, TAMANHO DO OVÁRIO E

ESTRUTURAS OVÁRICAS SOBRE A FERTILIDADE EM NOVILHAS CRUZA
BONSMARA DE 15 MESES DE IDADE INSEMINADAS EM TEMPO FIXO
Cutaia, L.1,2,3; Peres, L.1,2; Pincinato, D.1,2; Bó, G.A.2,3
1
Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC), 2Universidad Nacional de Córdoba,
3
Syntex - e-mail: lcutaia@iracbiogen.com.ar
Realizou-se um experimento com o objetivo de avaliar a influência de diferentes características

do trato reprodutivo de novilhas de 15 meses e sua relação com as taxas de prenhezes em programas
de inseminação artificial em tempo fixo (IATF). As novilhas (n=107) utilizadas eram cruza
bonsmara, com condição corporal entre 3,0 a 3,5 (Escala 1-5) e com peso de 320 a 360 kg. No
Dia 0, todas as novilhas foram examinadas por ultra-sonografia transretal para determinar o
diâmetro médio dos cornos uterinos (imediatamente craneal a bifurcação), a média do tamanho
dos ovários (largura por altura/2) e a presença de estruturas ováricas [CL, Folículos > 8 mm de
diâmetro (Fol.) ou somente folículos pequenos (SE, < 8 mm de diâmetro)]. O diâmetro do útero
foi classificado como 1 (<1cm); 2 (e”1 e < 1,5 cm) e 3 (e”1,5 cm). Os ovários foram também
classificados como 1 (<1cm); 2 (e”1 e < 1,5 cm) e 3 (e”1,5 cm). Todas as novilhas receberam 2
mg de benzoato de estradiol IM (EB, Syntex, Argentina) e um DIB novo (Syntex) no Dia 0, 150
μg de D(+)cloprostenol IM (Ciclase, Syntex) no momento da remoção do DIB (Dia 8); 1 mg EB
IM no Dia 9 e foram IATF com sêmen congelado do mesmo touro entre as 52 e 56 h de retirado
o DIB. Determinaram-se as taxas de prenhezes por ultra-sonografia 30 dias mais tarde. Das 107
novilhas examinadas, 15 (14,0%) foram classificadas como útero classe 1, 68 (63,5%) como
útero classe 2 e 23 (21,5%) como útero classe 3. A distribuição do tamanho dos ovários foram:
ovário classe 1: 3 (2,8%); ovário classe 2: 30 (28,0%) e ovário classe 3: 74 (69,1%). A distribuição
por estruturas ováricas foram CL: 69 (64,4%); Fol.: 31 (29,9%) e SE: 8 (7,4%). Encontrou-se
uma tendência a uma maior taxa de prenhez (P=0,08) nas novilhas classificadas com útero classe
3 (12/23; 52,2%) que aquelas com útero classe 1 (5/15; 33,3%) ou 2 (22/68; 32,4%). Não houve
diferença (P>0,1) entre as taxas de prenhezes nas novilhas com ovário classe 1 (1/3; 33,3%), 2
(11/30; 36,7%) ou 3 (27/74; 36,5%). Não houve diferença (P>0,1) entre as novilhas que
apresentaram CL (24/68; 35,3%), Fol. (11/31; 35,5%) ou SE (4/8; 50,0%). Considerando somente
as novilhas que apresentaram um CL, as taxas de prenhezes foram maiores (P=0,01) nas novilhas
com útero classe 3 (11/18; 61,1%) que aquelas com útero classe 2 (13/45; 28,9%) ou 1 (0/5;
0,0%). Em conclusão, os dados sugerem que o desenvolvimento dos cornos uterinos é crítico
para obter altas taxas de prenhezes em novilhas de 15 meses e isso pode estar mais relacionado
com a maturidade da novilha que a presença ou ausência de um CL ao início de um programa de
IATF.
s387
EFEITO DO MOMENTO DA INSEMINAÇÃO E TRATAMENTO DE GnRH SOBRE

AS TAXAS DE PRENHEZES EM VACAS DE CORTE COM CRIA SINCRONIZADAS
COM O PROGRAMA CO-SYNCH COM DISPOSITIVO INTRAVAGINAL COM
PROGESTERONA
Pincinato, D.1,2; Peres, L.C.1,2; Chesta, P.2; Martinez, M.2; Cutaia, L.2; Bó, G.A.2
1
Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 2Instituto de Reproducción Animal Córdoba
(IRAC), Jerónimo Luis de Cabrera 106, X5000GVD, Córdoba, Argentina. e-mail:
gabrielbo@iracbiogen.com.ar
Um experimento foi realizado para avaliar as taxas de prenheez em vacas com cria tratadas com
programa Co-Synch com dispositivo intravaginal com progesterona (P4) e inseminadas
artificialmente em tempo fixo (IATF) em dois diferentes momentos. Vacas cruza zebu, com cria
(n=133), <90 dias pós-parto e condição corporal (CC) de 3,4±0,4 (escala, 1-5) foram
aleatoriamente dividias em dois grupos de tratamento. Todas as vacas receberam um dispositivo
DIB (Syntex SA, Argentina) e 50 µg de GnRH (Lecirelina, Gonasyn, Syntex SA) IM no Dia 0,
150 µg D (+) cloprostenol (Ciclase, Syntex SA) no momento da remoção do DIB (Dia 7) e foram
divididas ao receber o segundo tratamento de GnRH e IATF a 48 ou 66 h após a remoção do DIB.
As vacas foram IATF com sêmen congelado/descongelado de três touros diferentes por dois
inseminadores. As taxas de prenhezes foram detectadas por ultra-sonografia 45 dias após a IATF
e analisadas por regressão logística. Não houve efeito significativo de inseminador e touro sobre
as taxas de prenhezes (P>0,2). Ademais, as taxas de prenhezes não diferiram entre as vacas IATF
às 48 h (32/68; 47,1%) ou 66 h (32/65; 49,2%) após a remoção do DIB. Conclui-se que no
programa Co-Synch com dispositivo intravaginal com P4 é possível administrar o segundo
tratamento com GnRH e IATF, ambos às 48 ou 66 h depois da remoção do dispositivo intravaginal
com P4, sem afetar as taxas de prenhezes. Isto possibilita sincronizar e IATF um grande número
de animais, distribuindo o momento da IATF entre 48 e 66 h após a remoção do dispositivo
intravaginal com P4.
s388
EFICIÊNCIA DE UMA SUB DOSE DE CLOPROSTENOL SÓDICO

ADMINISTRADO NA SUBMUCOSA VULVAR PARA INDUÇÃO DE ESTRO EM
BÚFALAS MURRAH EM DIFERENTES PERÍODOS DE PÓS-PARTO
Bartolomeu, C.C.1; Del Rei, A.J.2; Neves, A.L.A.2; Balbino, S.C.2;

Oliveira, L.C.2; Álvares, C.T.3
2
Centro Biotecnológico de Reprodução Animal, CBRA, DTRA, UESB - Itapetinga-BA, 45
700-000, Brasil, delrei@uesb.br; 1UFRPE/ UAG – Garanhuns – PE; 3UESC – Ilhéus – BA.
No presente experimento foi analisada a resposta de 59 búfalas Murrah amamentando com período
de pós-parto entre 30 e 210 dias ao tratamento com cloprostenol sódico administrado na submucosa
vulvar. Os animais foram mantidos extensivamente em pasto de Panicum maximum com livre
acesso à água e sal mineral ad libitum. Após o parto, os animais foram mantidos sem touro e o
estro foi detectado com auxílio de rufiões e observado três vezes ao dia. O experimento foi
conduzido de janeiro a à julho de 2005 em uma fazenda no sudoeste da Bahia em clima tropical.
Todos os animais receberam uma primeira dose de 250μg de cloprostenol sódico (Ciosin – Shering
Plough – Coopers, SP – Brasil) por injeção na submucosa vulvar e após 12 dias o mesmo
tratamento foi repetido nos animais que não apresentaram estro após o primeiro tratamento. Para
identificar o melhor período pós-parto de resposta ao tratamento os animais foram divididos em
blocos ao acaso em 6 classes de acordo com a idade dos bezerros à intervalos de 29 dias. De
todos os animais tratados, 67,8% apresentaram estro sendo 25,4% após o primeiro tratamento e
42, 4% após o segundo tratamento. A melhor resposta ao tratamento (P < 0,01; Qui-quadrado)
ocorreu na classe de 120 – 140 dias pós-parto quando 83,3% apresentaram estro. Com pós-parto
entre 30 – 59 dias (n = 16), 2 animais apresentaram estro após o primeiro tratamento e 3 após o
segundo tratamento, totalizando 50% de resposta ao tratamento. Com pós-parto entre 60 – 89
dias (n = 11), dois animais apresentaram estro após o primeiro tratamento e 5 após o segundo
tratamento, totalizando 63,6% de resposta ao tratamento. Com pós-parto entre 90 – 119 dias (n =
9), dois animais apresentaram estro após o primeiro tratamento e 4 após o segundo tratamento,
totalizando 66,7% de resposta ao tratamento. Com pós-parto entre 120 – 149 dias (n = 12),
quatro animais apresentaram estro após o primeiro tratamento e 6 após o segundo tratamento,
totalizando 83,3% de resposta ao tratamento. Com pós-parto entre 150 – 179 dias (n = 10), três
animais apresentaram estro após o primeiro tratamento e 4 após o segundo tratamento, totalizando
70% de resposta ao tratamento. Com pós-parto acima de 180 dias (n = 7), dois animais
apresentaram estro após o primeiro tratamento e 3 após o segundo tratamento, totalizando 71,4%
de resposta ao tratamento. Após analisar o grupo inteiro de animais (n = 15) 25,4% apresentaram
estro após o primeiro tratamento, 42,4% (n = 25) ao segundo tratamento e 32,2% (n = 19) não
apresentaram estro após os dois tratamentos. A partir desses resultados pode ser concluído que
metade da dose recomendada pelo laboratório por via intramuscular administrado na submucosa
vulvar apresentou resposta satisfatória, especialmente na classe de 120 – 149 dias pós-parto
reduzindo o custo da indução de estro com cloprostenol sódico em búfalas Murrah. Palavras
Chave: Pós-parto, Búfala, Indução de estro.
s389
EFEITOS DA PROGESTERONA EXÓGENA, NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE

CORPO LÚTEO, NA DINÂMICA FOLICULAR DE NOVILHAS DA RAÇA NELORE
Cipriano, R.S.; Carvalho, B.A.; Marangoni, N.R.; Nogueira, G.P.
DAPSA, UNESP, Araçatuba-SP, Brasil. gpn@fmva.unesp.br
Os protocolos tratamento hormonal para a sincronização da ovulação visando a inseminação

artificial em tempo fixo (IATF) em bovinos são elaborados e ajustados através das observações
dos resultados obtidos. Neste projeto avaliamos o número de folículos, o diâmetro do maior e
do 2° maior folículo na presença de progesterona exógena e/ou endógena. Foram utilizadas 9
novilhas inteiras da raça Nelore submetidas a 6 protocolos hormonais diferentes com repetições
inteiramente casualizadas e pré-sincronizadas com Cloprostenol (Prolise®, 50 mg), com
intervalo de 12 dias entre as aplicações. Os animais foram divididos em 3 grupos com 3
animais cada: GRUPO 1: receberam implante de progesterona (dia 0, DIB®) durante 8 dias na
presença de Corpo Lúteo (CL); no Dia 8 foi retirado o implante e aplicou-se Cloprostenol e
24 h após receberam Benzoato de Estradiol (BE; RIC-BE®, 1mg) ou Lecirelina (Gestran®, 25
µg) 38 h após a retirada do implante; GRUPO 2: no dia 0 receberam (BE+DIB®) mais
cloprostenol, no D8 foi retirado o implante e aplicado Cloprostenol, 24 h após foi administrado
BE ou Lecirelina; GRUPO 3: D0 presença de CL após 8 dias da ovulação, D8 cloprostenol e
24 h após BE ou Lecirelina 38 h após. Os folículos ovarianos foram mensurados a cada 12 h
com ultra-som até 12 h após o pico previsto de LH e a cada 24 h durante 48 h para verificação
da ovulação. As médias dentro de cada tratamento foram submetidas à análise de variância,
sendo comparadas através do teste não paramétrico de Kruskal-wallis com 5% de significância.
Entre os 3 grupos; CL, Implante + CL ( Impl.+Cl) e Implante (Impl.); o número de folículos,
o diâmetro do maior e do 2° maior folículos foram comparados através do teste de Dunn’s. O
grupo CL apresentou menos folículos (7,93±0,10; p>0,05) se comparado aos grupos
Impl.(8,60±0,11) e Impl.+Cl (8,50±0,10). Por outro lado o grupo CL apresentou diâmetro do
maior folículo elevado (9,90±0,13mm) quando comparado aos outros dois grupos
Impl.(9,34±0,13mm) e Impl.+Cl (8,64±0,09mm) sendo que as novilhas com Impl+CL
apresentaram os menores diâmetros. Quando comparamos o diâmetro do 2º maior folículo, as
novilhas Impl. apresentaram o menor diâmetro (5,25±0,10mm) e as novilhas com CL o maior
diâmetro (5,57±0,12mm), o grupo Impl.+Cl apresentou um diâmetro intermediário
(5,42±0,07mm). No grupo sem implante (CL) as novilhas apresentaram menor número de
folículos ovarianos e o maior diâmetro do maior folículo em relação aos grupos com implante
(Impl.+Cl, Impl). A associação a progesterona exógena (implante) com a progesterona endógena
(CL) resultou no desenvolvimento de folículos dominantes menores, provável conseqüência
de uma menor secreção de LH. Como o folículo dominante foi menor isso possibilitou o
aparecimento de um número maior de folículos nas novilhas com Impl.+CL, provavelmente
por uma maior secreção de FSH.
s390
CIPIONATO OU BENZOATO DE ESTRADIOL ASSOCIADO A INSERÇÃO DO

DISPOSITIVO INTRAVAGINAL DE PROGESTERONA NA RESPOSTA À
PROTOCOLO DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO
Meneghetti, M.1; Losi, T.C.1; Vilela, E.R.1; Martins Jr, A.P.1 ; Vasconcelos, J.L.M.2
1
Lageado Consultoria Agropecuaria, Mineiros-GO, Brasil; 2DPA–FMVZ-UNESP, Botucatu-
SP, Brasil, vasconcelos@fca.unesp.br
A técnica de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) vem sendo largamente implementada
nos rebanhos de gado de corte nacional. Protocolos que iniciam com aplicação de benzoato de
estradiol (BE) e inserção de dispositivo intravaginal de progesterona têm alcançado boas taxas
de prenhez em rebanhos zebuínos (Meneghetti, Acta Scientiae Veterinariae, v.33, p.256; Baruselli,
Rev.Bras.Reprod.Anim., v.27, p.418-419). A utilização do cipionato de estradiol (ECP) para
sincronizar a emergência de nova onda folicular pode ser uma opção ao BE e foi utilizada com
sucesso em novilhas holandesas (Colazo, Animal Reproduction Science; v.81, p.25-34; Ambrose,
Theriogenology, v.64, p.1457-1474). O objetivo desse experimento foi avaliar o uso de diferentes
estrógenos (BE x ECP) no início de protocolo de IATF em vacas de corte zebuínas. Vacas Nelore
paridas (n=751) com escore de condição corporal 3,31 + 0,28 e entre 38 e 90 dias pós-parto,
mantidas em regime de pasto com suplementação mineral, foram sincronizadas com o protocolo:
no dia 0 os animais receberam um dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR®, 1,9g de P4,
Pfizer) novo ou pré-utilizado por 9 ou 18 dias. O dispositivo permaneceu nos animais por nove
dias e dois dias antes da retirada (dia 7) foi aplicado PGF2á (12,5 mg de dinoprost trometamina,
i.m., Lutalyse®, Pfizer), na retirada do CIDR® (dia 9) foi aplicado ECP (0,5 mg, i.m., E.C.P.®,
Pfizer) e os bezerros foram removidos das mães. A IATF foi realizada 48 a 54 horas após a
retirada do dispositivo e os bezerros retornaram com as vacas após a IATF. Os animais foram
divididos aleatoriamente em três grupos no dia 0, quando foi aplicado: 2,0 mg de BE (Estrogin®,
Farmavet) no grupo 1 (G1), 1,0 e 2,0 mg de ECP (E.C.P.®, Pfizer) nas vacas dos grupos 2 e 3 (G2
e G3), respectivamente. No momento da IATF e 48 horas após foi realizado exame de ultra-som
(Aloka SSD-500, 5,0 mHz) para determinar a taxa de ovulação. O diagnóstico de gestação foi
feito por ultra-som 28 dias após a IATF. A análise estatística foi feita por regressão logística. Não
houve diferença na taxa de sincronização entre os grupos que foi de 89,8% (212/236) no G1,
88,4% (297/336) no G2 e 88,3% (158/178) no G3. Foi observada tendência (p=0,10) de efeito de
grupo na taxa de concepção, sendo 48,3% (114/236) no G1, 45,5% (153/336) no G2 e 40,2%
(72/179) no G3. O G2 foi semelhante ao G1 e G3 e o G1 superior ao G3. O uso de maior
dosagem de ECP (2,0 mg) resultou em menor número de animais gestantes pela redução na
concepção dos animais tratados, pois não foi verificada redução na taxa de sincronização deste
grupo. A utilização de 2,0 mg de BE ou 1,0 mg de ECP no início do protocolo de IATF descrito
resulta em taxa de concepção semelhante em vacas Nelore lactantes. Palavras-chave: estradiol,
concepção, progesterona
s391
ADIÇÃO DE eCG OU REMOÇÃO DE BEZERRO NO FINAL DE PROTOCOLO DE

INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO
Meneghetti, M.1; Losi, T.C.2; Vilela, E.R.2; Vilela Neto, J.M.2; Vasconcelos, J.L.M.1
1DPA–FMVZ-UNESP, Botucatu-SP, Brasil, 2Lageado Consultoria Agropecuaria, Mineiros-

GO, Brasil, vasconcelos@fca.unesp.br
A suplementação de LH no final de protocolos de inseminação artificial em tempo fixo (IATF)

melhora o desenvolvimento folicular resultando em incremento nas taxas de sincronização e
concepção. Este efeito pode ser obtido através da aplicação de eCG (Baruselli,
Rev.Bras.Reprod.Anim., v.26, p.218-221; Perez, Journal of Animal Science, v.82, p.371, Abst.)
ou com a remoção temporária dos bezerros (RB) (Meneghetti, Rev.Bras.Reprod.Anim., v.25,
p.286-288), porém a adição do eCG não teve efeito aditivo à remoção de bezerros quando
utilizadas em protocolo de IATF a base de estrógeno e dispositivo intravaginal de progesterona
(Meneghetti, XVI Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, 188/366, Abst.). O objetivo
deste experimento foi comparar o efeito da aplicação de eCG ou RB no final de protocolo de
IATF à base de P4 e estradiol. Vacas paridas da raça Nelore (n=559) com escore de condição
corporal 3,40 + 0,31 e entre 40 e 90 dias pós-parto, mantidas em regime de pasto com
suplementação mineral, foram sincronizadas com mesmo protocolo base: no dia 0 os animais
receberam um dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®, 1,9 g de P4, Pfizer) novo ou pré-utilizado
por uma (9 dias) ou duas vezes (18 dias) e foi aplicado cipionato de estradiol (1,0 mg, i.m.,
E.C.P.®, Pfizer). O dispositivo permaneceu nos animais por nove dias e dois dias antes da retirada
do CIDR® (dia 9) foi feita nova aplicação de cipionato de estradiol (0,5 mg, i.m., E.C.P.®, Pfizer).
A IATF foi realizada 48 a 54 horas após a retirada do dispositivo. Os animais foram divididos
aleatoriamente em quatro grupos, sendo: Controle; RB: remoção de bezerros entre a retirada do
CIDR® e a IATF; 300 eCG ou 400 eCG: receberam no momento da retirada do CIDR® aplicação
de 300 ou 400 UI de eCG (i.m., Folligon®, Intervet), respectivamente. No momento da IATF e 48
horas após foi realizado exame de ultra-som (Aloka SSD-500, 5,0 mHz) para determinar a taxa
de ovulação. O diagnóstico de gestação foi feito por ultra-som 28 dias após a IATF. A análise
estatística foi feita por regressão logística. Não foi observada diferença na taxa de sincronização
entre os grupos, sendo 82,3% (107/130) no grupo controle, 86,5% (135/156) no grupo RB,
80,8% (105/130) no grupo 300 eCG e 83,9% (120/143) no grupo 400 eCG. Foi verificado efeito
de grupo (p=0,10) na taxa de concepção que foi 41,5% (54/130), 51,3% (80/156), 46,9% (61/
130) e 54,5% (78/143) para os grupos controle, RB, 300 eCG e 400 eCG, respectivamente. Os
grupos remoção e 400 eCG foram superiores ao grupo controle enquanto o grupo 300 eCG foi
semelhante aos demais. Estes dados sugerem que no protocolo testado a remoção de bezerros ou
a aplicação de eCG devem ser utilizadas pois resultaram em maior taxa de concepção em vacas
paridas da raça Nelore.Palavras-chave: Remoção de bezerros, eCG, sincronização, concepção
s392
EFEITO DO CIPIONATO DE ESTRADIOL ANTES DA INDUÇÃO DA

OVULAÇÃO NA DURAÇÃO DO SUBSEQÜENTE CORPO LÚTEO
EM VACAS NELORE EM ANESTRO
Sá Filho, O.G.; Vasconcelos, J.L.M.
O objetivo deste experimento foi avaliar o efeito do pré-tratamento com cipionato de estradiol
na prevenção de luteólise precoce em Nelore em anestro induzidas a ovular com remoção de
bezerros (RB) por 48 horas e GnRH. Vacas Nelore em anestro (avaliadas por 2 exames
ultrassonográficos 8 dias aparte; 37,17±3,10 DPP; n=35) sofreram, no dia -2, RB (48 horas),
sendo neste momento designadas aleatoriamente a receber um dos dois tratamentos: Grupo
Controle - Injeção i.m. de 0,5mL de óleo de caroço de algodão (placebo); Grupo ECP - Injeção
i.m. de 1,0mg (0,5mL) de cipionato de estradiol (ECP®, Pfizer Saúde Animal, Brasil). No dia 0
(final da RB) todas as vacas receberam uma injeção i.m. de 200mcg de GnRH (Fertagyl®, Intervet,
Brasil). A ovulação foi avaliada através de dois exames ultrassonográficos (dias 0 e 2), sendo
que somente as vacas que ovularam foram utilizadas no experimento (Controle, n=12; ECP,
n=8). Amostras de sangue foram coletadas nos dias 0, 5, 9 e 15 para avaliação da duração do
corpo lúteo através da dosagem de progesterona sérica (P4) por radioimunoensaio. A porcentagem
de vacas que apresentaram ciclo curto foi analisada por regressão logística e as concentrações
séricas de P4 foram analisadas pelo PROC MIXED. A incidência de ciclos curtos não diferiu
entre os grupos (83,3% vs. 75,0%, P>0,10), bem como as concentrações séricas de P4 nos dias 0,
5, 9 e 15 (0,4±0,4 vs. 0,4±0,5; 3,0±0,4 vs. 2,4±0,5; 0,9±0,4 vs. 1,3±0,5; 0,8±0,4 vs. 0,9±0,5
respectivamente; P>0,10). Em ambos os tratamentos, a P4 sérica elevou-se entre os dias 0 e 5
(P<0,01), porém decresceu entre os dias 5 e 9 (P<0,01), indicando luteólise precoce. As
concentrações séricas de P4 foram similares entre os dias 9 e 15 (P>0,1). Conclui-se que o
tratamento com 1,0mg de cipionato de estradiol não preveniu a ocorrência de ciclos curtos em
vacas Nelore em anestro após indução da ovulação com RB e GnRH.
s393
REDUÇÃO AGUDA E CRÔNICA DA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE

PROGESTERONA APÓS A INGESTÃO DE CONCENTRADO EM VACAS
HOLANDESAS
Santos, R.M.; Perez, G.C.; Demétrio, D.G.B.; Vasconcelos, J.L.M.
FMVZ–UNESP, Botucatu, SP, Brazil, ricarda@fca.unesp.br
Este estudo testou a hipótese de que o aumento da ingestão de matéria seca (IMS) reduz a
concentração plasmática de progesterona (P4) de forma aguda (5h após a IMS) e crônica (12h
após a IMS) em vacas tratadas com dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®, 1,9g), sem CL
(Exp1) ou durante o ciclo estral, com CL (Exp.2). No Exp. 1, vacas Holandesas não-lactantes
(n=21) foram sincronizadas com o protocolo Ovsynch. No dia 7, após a segunda aplicação de
GnRH, todas as vacas receberam uma aplicação de PGF2α, para regressão do CL (95%; 20/21),
e foram divididas (Fatorial 2x2) de acordo com o número de CIDR (1 vs. 2) e a IMS (2 vs. 8 kg
de concentrado, oferecido duas vezes ao dia, por 14 dias). Para avaliar o efeito agudo da IMS na
concentração plasmática de P4, amostras de sangue foram colhidas a cada 15 minutos por 6
horas no dia 14 do experimento. No Exp. 2, vacas Holandesas não-lactantes, foram sincronizadas
como o mesmo protocolo e no dia da segunda aplicação de GnRH foram divididas em dois
grupos: 8 kg (n=7) ou 2 kg (n=4) de concentrado. Foi realizada uma replicata. Em ambos os
experimentos, para avaliar o efeito crônico da IMS na concentração plasmática de P4, foram
colhidas diariamente amostras de sangue, 12 horas após a ingestão. A concentração plasmática
de P4 foi determinada por RIA. Os dados foram analisados pelo procedimento MIXED do SAS.
No Exp. 1 foi detectada interação (P<0,01) entre número de CIDR, IMS e dia da colheita na
concentração plasmática de P4, 12 horas após a IMS. Vacas que receberam 1 CIDR e 8 kg/dia de
concentrado tiveram a menor concentração plasmática de P4, e vacas que receberam 2 CIDR e 2
kg/dia de concentrado tiveram maior concentração, e foi verificado que essa diferença entre os
grupos se alterava durante o período de 14 dias. No dia 14 do Exp. 1 foi detectada interação
(P<0,01) entre IMS e momento da colheita da amostra de sangue na concentração plasmática de
P4, mostrando o efeito agudo da IMS na concentração plasmática de P4. Vacas que receberam 8
kg de concentrado apresentaram maior decréscimo na concentração plasmática de P4. No Exp.
2, foi detectada interação (P<0,05) entre IMS e dia na concentração plasmática de P4, 12 horas
após a IMS. A concentração plasmática de P4 foi menor no grupo que recebeu 8 kg/dia de
concentrado, mostrando o efeito crônico da IMS na concentração plasmática de P4 exógena
(Exp. 1) e endógena (Exp. 2). A redução aguda e crônica da concentração plasmática de P4 pela
IMS ocorre provavelmente devido ao aumento do metabolismo da P4. Palavras-chaves: ingestão
de matéria seca, progesterona, vaca de leite.
s394
EFEITO DA QUANTIDADE DE CONCENTRADO DA DIETA DE NOVILHAS

RECEPTORAS DE EMBRIÃO NA PROGESTERONA SÉRICA E NA TAXA DE
CONCEPÇÃO
Santos, R.M.; Dias, C.C.; Ferreira Jr., N.; Vasconcelos, J.L.M.
FMVZ–UNESP, Botucatu, SP, Brazil, ricarda@fca.unesp.br
O objetivo desse experimento foi avaliar o efeito da ingestão de diferentes quantidades de

concentrado, antes ou depois da ovulação, na progesterona (P4) sérica e na taxa de concepção
(TC) de receptoras de embrião Novilhas (n=102) ¾ Holandês/Zebu, de 18 a 36 meses de idade,
recebendo 4kg/dia de concentrado, a base de farelo de soja, farelo de milho, cana-de-açúcar
triturada e pasto à vontade, por 28 dias para adaptação, foram sincronizados com o protocolo: D-
11 aplicação de 2mg benzoato de estradiol (Estrogin®, Farmavet Produtos Veterinários) e inserção
de dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®, Pfizer Saúde Animal), D-4 aplicação de 12,5mg de
PGF2a (Lutalyse®, Pfizer Saúde Animal), D-2 retirada de CIDR e aplicação de 0,5mg de cipionato
de estradiol (E.C.P.®, Pfizer Saúde Animal). O dia do cio foi considerado d0. No d-11 as novilhas
foram divididas em três grupos, de acordo com a quantidade de concentrado oferecida (2 vs.
8kg/dia) em relação ao dia do cio: Grupo-1 (n=47): 2kg de concentrado durante todo o período
experimental (d-11 até a confirmação da prenhez); Grupo-2 (n=27): 8kg de concentrado do d-11
até o d0 e 2kg de concentrado do d1 até o dia da confirmação da prenhez; Grupo-3 (n=28): 2kg
de concentrado do d-11 até o d0 e 8kg de concentrado do d1 até a confirmação da prenhez. A
presença do CL foi determinada na inovulação por ultra-sonografia (d7). O diagnóstico de gestação
foi realizado no d28 e re-confirmada no d42. Foi considerado perda de gestação quando a vaca
estava gestante no d28 e vazia no d42. As novilhas com CL no d7 receberam embriões, congelados-
descongelados de graus 1 ou 2, produzidos in vivo em de doadoras ¾Holandês/Gir, pelo do
método não-cirúrgico A P4 sérica foi determinada por RIA em amostras colhidas no d7 Os dados
foram analisados pelos procedimentos GLM e LOGISTIC do SAS. Não foi detectado efeito de
tratamento na taxa de sincronização, avaliada pela presença de CL no d7 (84,5%; 87/103). Não
foi detectado efeito (P=0,39) da quantidade de concentrado antes da ovulação na P4 sérica no d7,
sendo que no Grupo-1, a P4 sérica foi de 2,48±0,19ng/ml e no Grupo-2 de 2,56±0,13ng/ml Foi
detectado efeito (P<0,01) da maior ingestão de concentrado depois da ovulação na P4 sérica, os
animais do Grupo-3 apresentaram menor P4 sérica no d7 (1,84±0,18ng/ml), provavelmente,
devido ao aumento do fluxo sanguíneo para o sistema digestivo e à conseqüente maior
metabolização da P4 Não foi detectado efeito de tratamento na TC no d28. A TC foi de 42,1%
(16/38); 40,0% (10/25) e 47,8% (11/23) nos grupos 1, 2 e 3, respectivamente. No d42 o Grupo3
apresentou maior (P=0,05) TC (47,8%; 11/23) do que os grupos 1 (31,6%; 12/38) e 2 (20%; 5/
25). A ingestão de maior quantidade de concentrado depois da ovulação reduziu a P4 sérica no
d7 e não teve efeito na TC no d28, porém teve efeito positivo na TC no d42, provavelmente
devido a menor de perda embrionária. Palvras-chave: ingestão de matéria seca, progesterona,
embrião,
s395
INFLUÊNCIA DA APLICAÇÃO DE FLUNIXIN MEGLUMINE (BANAMINE®)

APÓS INSEMINAÇÃO EM TEMPO-FIXO SOBRE A TAXA DE PRENHEZ EM
NOVILHAS DE CORTE
Pfeifer, L.F.M.1; Schneider, A.2; Wilson Neto, J.2; Castilho, E.M.2;

Dionello, N.J.L.3; Corrêa, M.N.4
1
Médico Veterinário, MSc., Programa de pós-graduação em Zootecnia, UFPel. 2Estagiário,
NUPEEC, departamento de Clínicas Veterinária, UFPel. 3Prof. Dr. Departamento de
Zootecnia, Faculdade de Agronomia, UFPel. 4Prof. Dr. Departamento de Clínicas Veterinária,
Faculdade de Veterinária, UFPel. lpfeifer@ufpel.tche.br
As perdas embrionárias são as principais responsáveis pelas falhas na manutenção da gestação

pós-inseminação em bovinos (Zavy, CRC Press, 99–140). Este problema é agravado quando se
trata de programas de inseminação artificial em tempo-fixo (IATF), em que as perdas embrionárias
podem comprometer os custos de implantação desta técnica. Estima-se que as taxas de perda
embrionária precoce (0-16 dias pós-IA) são de 33-38% em gado de corte (Mialon, Reproduction
Nutrition Development, 33, 269-282). No intuito de aumentar as chances de sobrevivênica
embrionária após a concepção, um experimento foi realizado utilizando anti-inflamatório não
esteróide (Banamine®) 14 dias após a IA em novilhas submetidas à um programa de IATF, para
que ocorra a inibição da síntese de prostaglandina endometrial no período do reconhecimento
materno da gestação. Foram utilizadas 43 novilhas da raça Braford, com média de 24 meses de
idade. As fêmeas foram submetidas a um protocolo de IATF que consistiu na aplicação de um
pessário intravaginal, impregnado com 250 mg de acetato de medróxi progesterona, e aplicação
de 2 mg de Benzoato de estradiol no D0. Após oito dias, os pessários foram retirados seguidos da
aplicação de Ciosin® (250 ìg de cloprostenol sódico). A IATF ocorreu 54 horas após a remoção
dos pessários, sendo que cada animal recebeu 50 mcg de Fertigen® (acetato de fertirelina) no
momento da inseminação. Após a inseminação, as novilhas foram divididas em dois grupos:
Gcontrole (n=20) e GAINE (n=23). As novilhas do GAINE receberam 1,1 mg/Kg de Banamine®
14 dias após a IATF. Os resultados foram analisados pelo teste do qui-quadrado no programa
Statistix (1998). Não foi verificado diferença (p=0,30) na taxa de prenhez entre os grupos
experimentais, sendo que as taxas de prenhez foram de 25% (5/20) e 39% (9/23), para o GControle
e GAINE, respectivamente. A partir dos resultados obtidos neste experimento, o uso de Banamine®
pós-IATF não demonstrou ser eficiente na redução da mortalidade embrionária. Apesar de não
ter sido verificado diferença na taxa de prenhez entre os grupos, o que pode ter ocorrido devido
ao baixo número de animais utilizados, este experimento deve ser refeito com um número maior
de animais.
Agradecimentos: Schering-Plough Veterinária e CAPES.
s396
INFLUÊNCIA DA APLICAÇÃO DE FLUNIXIN MEGLUMINE (BANAMINE®)

UMA HORA ANTES DA INSEMINAÇÃO SOBRE TAXA
DE PRENHEZ EM OVINOS
Pfeifer, L.F.M.1; Meneghelo, L.2; Wilson Neto, J.2; Schneider, A.2; Castilho, E.M.2;
Dionello, N.J.L.3; Severo, N.C.4; Rabassa, V.R.5; Corrêa, M.N.6
1
Médico Veterinário, MSc., Programa de pós-graduação em Zootecnia, UFPel. 2Estagiário,
NUPEEC, departamento de Clínicas Veterinária, UFPel. 3Prof. Dr. Departamento de
Zootecnia, Faculdade de Agronomia, UFPel. 4Médico Veterinário, ABS Pecplan. 5Médico
Veterinário, PPG – Faculdade de Veterinária, UFPel. 6Prof. Dr. Departamento de Clínicas
Veterinária, Faculdade de Veterinária, UFPel. lpfeifer@ufpel.tche.br
A disponibilidade de um processo de inseminação artificial (IA) com sêmen congelado eficiente

em ovinos é a chave para que possa ocorrer a disseminação da IA em programas de reprodução
animal (Donovan, Sheep Series, 11). Porém, em ovinos, um melhor entendimento das razões
pelas quais as taxas de concepção após a deposição cervical de sêmen congelado são baixas,
continua sendo um importante objetivo para o estabelecimento de um procedimento barato e
aplicável de IA buscando níveis aceitáveis de taxa de prenhez (Fair, Theriogenology, 63, 1995–
2005). O processo de inseminação transcervical em ovinos requer pinçamento de cérvix, um
procedimento que pode causar lesões localizadas, além de extensa manipulação uterina, o que
pode levar a uma síntese exagerada de prostaglandina pelo endométrio. Desta forma, alterando o
ambiente uterino no momento da concepção. No intuito de aumentar as taxas de prenhez na IA
com sêmen congelado, um experimento foi delineado utilizando um antiinflamatório não esteróide
(Banamine®) uma hora antes da IA com o objetivo de reduzir esta resposta inflamatória
endometrial. Foram inseminadas 70 ovelhas mestiças (Corriedale x Texel), entre dois e quatro
anos, multíparas, durante 5 dias, de um total de 300, que estavam sendo rufiadas para identificação
do cio. Antes da IA as ovelhas eram separadas em dois grupos: GControle (n=33) e GAINE
(n=37). As ovelhas do GAINE receberam 1,1 mg/Kg de Banamine®, 1 hora antes da IA. Os
resultados foram analisados pelo teste do qui-quadrado no programa Statistix (1998). Não houve
diferença (p>0,05) na taxa de prenhez entre os grupos, sendo de 64% (21/33) e 65% (24/37) para
os GControle e GAINE, respectivamente. Portanto, não houve influência do Banamine® na taxa
de prenhez de ovelhas inseminadas com sêmen congelado.
Agradecimentos: Schering-Plough Veterinária e CAPES
s397
AVALIAÇÃO ULTRA-SONOGRÁFICA E DOSAGEM DE ESTRADIOL EM VACAS

LEITEIRAS SUBMETIDAS AO PROTOCOLO OVSYNCH UTILIZANDO ACETATO
DE FERTIRELINA COMO ANÁLOGO AO GnRH.
Gioso, M.M.1,2; Fernandes, C.A.C.1,2,3; Oba, E.1; Carvalho, M.A.P.4;

Vasconcelos, T.D.3; Oliveira, E.R.3
1
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – FMVZ/UNESP, Botucatu-
SP, 18618-000, Brasil. 2 Universidade de Alfenas, UNIFENAS, Alfenas-MG, Brasil, 3 Biotran
LTDA– Alfenas-MG, Brasil. 4 Medico Veterinário. mmgioso@yahoo.com.br
O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência de doses distintas de Acetato de Fertirelina,
análogo ao GnRH, para sincronização de onda folicular e indução da ovulação em vacas leiteiras,
através da avaliação ultra-sonográfica e dosagem sérica de estradiol (E2). Utilizou-se 77 vacas,
entre 60-120 dias pós-parto e escore corporal entre 2,5-4,0. Os animais foram avaliados
previamente por ultra-sonografia, e introduzidos no experimento àqueles que apresentavam
população folicular e corpo lúteo (CL) ou ausência de CL, porém presença de um folículo com
diâmetro e”10mm. As fêmeas foram distribuídas aleatoriamente em quatro tratamentos: Grupo 1
(n=21)- 100μg (dose integral) de Fertirelina (Fertigen®, Shering Plough, Brasil) no dia 0, 500μg
de PGF2á (Ciosin®, Shering Plough, Brasil) dia 8 e 100μg de Fertirelina dia 10. Grupo 2 (n=21)-
100μg de Fertirelina no dia 0, 500μg de PGF2á dia 8 e 50μg de Fertirelina dia 10. Grupo 3
(n=19)- 50μg de Fertirelina no dia 0, 500μg de PGF2á dia 8 e 100μg de Fertirelina dia 10. Grupo
4 (n=16)- 50μg de Fertirelina no dia 0, 500μg de PGF2á dia 8 e 50μg de Fertirelina dia 10.
Avaliações ultra-sonográficas e colheitas de sangue para análise do E2 foram realizadas nos dias
-1; 0; 2; 8; 10 e 12. As dosagens hormonais foram executadas por radioimunoensaio utilizando-
se kits comerciais (DPC Medlab®) segundo metodologia descrita por Fernandes (2000; Botucatu:
Unesp, Faculdade de Med Vet. e Zootec.,2000, 142p. Tese, Doutorado). A taxa de indução de
nova onda folicular após a primeira aplicação de Fertirelina, e a taxa de ovulação após a segunda
dose foram comparadas pelo teste 2. Para comparar os efeitos dos tratamentos nos diferentes
dias, sobre os diâmetros foliculares e para as concentrações de estradiol, utilizou-se análise de
variância e teste de Duncan. A taxa de sincronização média da primeira onda folicular e taxa de
ovulação ao final dos tratamentos foram de 70,0% e 66,2%, respectivamente não apresentando
diferença entre os grupos (P>0,05). Não houve diferenças nos valores dos diâmetros foliculares
entre os quatro tratamentos (P>0,05), com médias de 1,53±0,05mm no dia 8 e 1,70±0,05mm no
dia 10. Dados semelhantes foram relatados por Yamada et al. (2002, Anim. Reprod. Sci., v.74,
p.27-34). Os valores médios de estradiol nos dias 0 (3,21±2,40pg/ml), 2 (2,98±2,01pg/ml), 8
(3,38±1,45pg/ml), 10 (4,05±2,30pg/ml) e 12 (2,79±1,39pg/ml) também foram similares entre os
tratamentos (P<0,05), mas diferiram entre os dias de análise, isto é, as concentrações de estradiol
referentes ao dia 10 foram superiores em relação aos outros dias do exame (P<0,05). Estes dados
demonstram que a Fertirelina, seja em qualquer dose acima utilizada, foi capaz de promover um
desenvolvimento folicular competente com formação de um folículo dominante (dia 10) bem
como promover a ovulação constatada não só pela ultra-sonografia, mas também pela redução
substancial das concentrações de estradiol no dia 12. Em conclusão, a Fertirelina foi eficiente em
provocar a emergência de nova onda folicular, bem como induzir a ovulação ao final dos
tratamentos, seja na dose de 50 ou 100μg.
Agradecimentos: À Schering Plough pelo auxilio e fornecimento dos medicamentos para a
realização deste trabalho.
s398
EFICIENCIA DO ACETATO DE FERTIRELINA NA SINCRONIZAÇÃO DA

ONDA FOLICULAR, OVULAÇÃO E TAXAS DE GESTAÇÃO EM VACAS
LEITEIRAS SUBMETIDAS AO PROTOCOLO OVSYNCH
Gioso, M.M.1, 2; Fernandes, C.A.C.1,2,3; Oba, E.1; Carvalho, M.A.P.4;

Vasconcelos, T.D.3; Oliveira, E.R.3
1
SP, 18618-000, Brasil. 2 Universidade de Alfenas, UNIFENAS, Alfenas-MG, Brasil, 3 Biotran
LTDA– Alfenas-MG, Brasil. 4 Medico Veterinário. mmgioso@yahoo.com.br
O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência de duas doses de Acetato de Fertirelina,
análogo ao GnRH, para sincronização da onda de crescimento folicular e ovulação, bem como
posterior taxa de gestação em vacas leiteiras submetidas ao programa Ovsynch. Utilizou-se 77
vacas, a partir dos 60 dias pós-parto, escore corporal entre 2,5-4,0 e produção média de 30kg
leite/dia. Os animais apresentavam população folicular e corpo lúteo (CL) característico (Classe
1) ou ausência de CL, porém presença de pelo menos um folículo com diâmetro e”10mm (Classe
2). As fêmeas foram distribuídas aleatoriamente em quatro tratamentos: (1)- 100μg (dose
recomendada) de Fertirelina (Fertigen®, Schering Plough, Brasil) no dia 0, 500μg de PGF2α
(Ciosin®, Schering Plough, Brasil) dia 8 e 100μg de Fertirelina dia 10. (2)- 100μg de Fertirelina
dia 0, 500μg de PGF2α dia 8 e 50μg de Fertirelina dia 10. (3)- 50μg de Fertirelina dia 0, 500μg
de PGF2α dia 8 e 100μg de Fertirelina dia 10. (4)- 50μg de Fertirelina dia 0, 500μg de PGF2α
dia 8 e 50μg de Fertirelina dia 10. Avaliações ultra-sonográficas foram realizadas nos dias -1; 0;
2; 8; 10 e 12. Todos os animais foram inseminados as 16-20 horas após última aplicação da
Fertirelina. Os diagnósticos de gestação foram realizados por palpação transretal aos 60 dias
após inseminação artificial (IA). As taxas de indução de uma nova onda folicular, da ovulação e
gestação foram comparadas por χ2. As taxas de sincronização da emergência da onda folicular
foram semelhantes entre os tratamentos (P>0,05) com taxas de 53,8%; 76,9%; 75,0% e 75,0%,
para os grupos 1,2,3 e 4, respectivamente com média geral de 70,0% e entre as classes, com
taxas de 70,37% para a classe 1 e 69,56% para a classe 2 (P>0,05). As taxas ovulação ao final
dos protocolos também foram semelhantes (P>0,05) entre os tratamentos (66,6%; 52,3%; 63,2%;
87,5%, respectivamente) com média geral de 66,2%, e entre as classes foram de 69,44% para os
animais da classe 1 e 63,41% para os animais da classe 2 (P>0,05). Sobre os diâmetros dos
folículos pré-ovulatorios no Dia 10, não houve diferenças entre os tratamentos (1,64±0,09mm
1,70±0,12 mm, 1,63±0,11 mm, 1,82±0,10 mm, respectivamente, P>0,05), porém foram diferentes
em relação às classes 1 e 2 (1,63±0,06 mm versus 1,84±0,09 mm, P<0,05). As taxas de prenhez,
entre os tratamentos foram de 20,00%; 30,00%; 22,22%; 43,75%, respectivamente (P>0,05) e
entre as classes 1 e 2 foram de 30,56% e 26,31% ( P>0,05) com media geral de 28,37%. Em
conclusão, as taxas de sincronização, ovulação e gestação demonstram que Fertirelina foi eficiente
em provocar a emergência da onda e induzir a ovulação, nas doses de 50 ou 100μg, sugerindo
que doses de 50μg de Fertirelina podem ser indicadas sem comprometimento nos resultados
finais do programa. Palavras-chave: Fertirelina, vacas leiteiras, sincronização, onda folicular,
ovulação, taxas de gestação.
Agradecimentos: À Schering Plough pelo auxilio e fornecimento dos medicamentos para a
realização deste trabalho.
s399
EFEITO DO TEMPO DE PERMANÊNCIA DO IMPLANTE AURICULAR DE

NORGESTOMET ASSOCIADO AO VALERATO DE ESTRADIOL NA TAXA DE
PRENHEZ DE VACAS NELORE INSEMINADAS EM TEMPO FIXO
Marques, M.O.3; Silva, R.C.P.3; Ayres, H.2; Souza, A.H.2; Baruselli, P.S.2
1
FIRMASA IATF, Campo Grande-MS, Brasil. 2Depart. de Reprodução Animal, FMVZ-USP,
São Paulo-SP, Brasil. 3GERAEMBRYO, Cornélio Procópio-PR, Brasil. barusell@usp.br
Com o uso crescente da inseminação artificial em tempo fixo (IATF) observa-se a necessidade
de otimizar o manejo para maximizar a mão-de-obra e reduzir os custos da implantação dessa
biotecnologia. O protocolo que emprega o implante auricular de Norgestomet tem indicação de
ser utilizado por um período de 9 dias, quando associado ao Valerato de estradiol no dia de sua
inserção. Com base nestes dados foi realizado um estudo para flexibilizar a permanência do
implante auricular em vacas Nelore lactantes no protocolo para IATF a base de Norgestomet e
Valerato de estradiol, avaliando a possibilidade de utilização por um período de 10 dias. Essa
flexibilização maximizaria o manejo, facilitaria a programação e reduziria o custo do prtocolo
para IATF. Em dia aleatório do ciclo estral (D0), 567 vacas Nelore lactantes, com período pós-
parto entre 40 a 60 dias, receberam um implante auricular de Norgestomet (Crestar®, Intervet,
Brasil) associado a adminstração de 3 mg de Nogestomet e 5 mg de Valerato de estradiol (i.m.).
A partir deste momento os animais foram divididos em dois grupos: no Grupo 9 (n=258) o
implante auricular foi removido com 9 dias. No momento da remoção os animais receberam 300
UI de eCG (Folligon®, Intervet, Brasil). No Grupo 10 (n=309) o implante auricular foi removido
com 10 dias. Na remoção foram administradas 300 UI de eCG. Todos os animais foram
inseminados entre 52 e 56h após a retirada do implante. O diagnóstico de gestação foi realizado
via ultra-sonografia 55 dias após a IATF. As taxas de prenhezes foram analisadas pelo teste de
Qui-quadrado. Os resultados foram: Grupo 9, 57,7% (149/258) e Grupo P10 56,3% (174/309;
p>0,05). Os resultados são indicativos de que os protocolos que empregam 9 ou 10 dias de
permanência do implante auricular de Norgestomet não apresentam diferenças na taxa de prenhez
à inseminação artificial em tempo fixo, possibilitando a utilização do implante auricular por um
período de 9 ou 10 dias.
s400
TAXA DE CONCEPÇÃO DE VACAS NELORE LACTANTES SINCRONIZADAS

COM DISPOSITIVO INTRAVAGINAL DE PROGESTERONA ASSOCIADO AO
BENZOATO OU AO CIPIONATO DE ESTRADIOL
Penteado, L.1; Ayres, H.2; Torres-Júnior, J.R.S.2; Souza, A.H.2; Baruselli, P.S.2
1
FIRMASA IATF, Campo Grande-MS, 2 Departamento de Reprodução Animal, FMVZ/USP,
São Paulo-SP. luciano@grupomassa.com.br ou barusell@usp.br
Nos protocolos tradicionais de IATF verifica-se a necessidade de se trazer os animais diversas

vezes ao curral para a aplicação dos fármacos que sincronizam a onda de crescimento folicular e
a ovulação. Com base nesta informação o presente estudo objetivou avaliar a possibilidade de
reduzir o número de aplicações, com a substituição do Benzoato de estradiol (BE) no dia 9 pelo
Cipionato de estradiol no dia 8 (momento da retirada do dispositivo). Procurou-se, também,
verificar a dose mais apropriada de Cipionato de estradiol como indutor de ovulação (0,5 ou
1,0mg). Foram utilizadas 501 vacas Nelores (Bos indicus) lactantes (60-75 dias pós-parto),
divididas em duas réplicas. Em dia aleatório do ciclo estral (Dia 0), todos os animais receberam
um CIDR (CIDR®, Pfizer, Brasil) associado a 2mg de BE, i.m.(Estrogin®, Farmavet, Brasil). No
Dia 8, realizou-se a remoção do CIDR e a administração de uma dose de 10mg de Dinoprost
(PGF2α, Lutalyse®, Pfizer, Brasil). A partir deste momento os animais foram divididos
homogeneamente de acordo com o escore de condição corporal e o período pós-parto em três
grupos: Grupo 1mgBE (n=169), os animais receberam 1 mg de BE, i.m., 24 horas após a remoção
do dispositivo intravaginal; Grupo 0,5mgCE (n=166) e Grupo 1mgCE (n=166) os animais
receberam, respectivamente, 0,5 e 1mg de CE, (ECP®, Pfizer, Brasil) i.m. no momento da retirada
do CIDR. As fêmeas foram inseminadas em tempo fixo (IATF) 54 a 58 horas após a remoção do
CIDR, dividindo homogeneamente as partidas de sêmen nos grupos. O diagnóstico de gestação
foi realizado por ultra-sonografia aos 30 dias após a IATF. Os dados foram analisados pelo teste
Anova no programa estatístico SAS e Qui-quadrado. Foram observadas as seguintes taxas de
concepção: Grupo 1mgCE 49,4% (82/166)b, Grupo 0,5mgCE 39,2% (65/166)a e 1mgBE 41,4%
(70/169)ab. A administração de 1mg de CE no momento da retirada do dispositivo intravaginal
de P4 proporcionou semelhantes taxas de concepção quando comparado ao tratamento com 1mg
de BE no dia 9. No entanto, apresentou maiores taxas que o tratamento com 0,5 mg de CE no dia
8. Conclui-se que o tratamento com Cipionato de estradiol na dose de 1mg como indutor de
ovulação no momento da retirada do CIDR em programas de IATF possibilita a redução do
número de vezes que os animais necessitam ser manejados e também facilita a sua administração
pelo maior volume de fármaco utilizado (0,5ml), sem comprometer a eficiência do tratamento de
sincronização.
Agradecimento: Pfizer
s401
TAXA DE PRENHEZ EM VACAS NELORE INSEMINADAS EM TEMPO FIXO EM

DIFERENTES PERÍODOS PÓS PARTO
Penteado, L.1; Marques, M.O.3; Silva, R.C.P.3; Ayres, H.2; Souza, A.H.2; Baruselli, P.S.2
1
São Paulo-SP, Brasil.3GERAEMBRYO, Cornélio Procópio-PR, Brasil. barusell@usp.br
A técnica de sincronização da ovulação para IATF tem apresentado resultados satisfatórios quanto
à taxa de prenhez e à eficiência reprodutiva de rebanhos que adotam essa tecnologia. Estudos
têm demonstrado que é possível obter intervalos entre partos próximos a 12 meses em rebanhos
submetidos à IATF no período pós-parto precoce, principalmente devido a indução da ovulação
e ao restabelecimento da ciclicidade pelo tratamento de sincronização. Com base em experimentos
anteriores que empregaram eCG para induzir o crescimento folicular em vacas em anestro, para
desta forma antecipar o tratamento de IATF no período pós-parto, foi realizado um estudo
retrospectivo para avaliar o efeito de diferentes períodos pós-parto (PPP) na taxa de concepção
de vacas Nelore (Bos indicus) lactantes insemindas em tempo fixo. Utilizou-se 2489 vacas Nelore
lactantes, localizadas nos municípios de Brasilândia e Ribas do Rio Parto – MS que foram
submetidas a IATF entre 40 a 100 dias após o parto. Em dia aleatório do ciclo estral (D0), todos
os animais receberam 2 mg de Benzoato de Estradiol (BE, Estrogin, Farmavet, Brasil) IM
associados a um implante auricular contendo 3 mg de Norgestomet (CRESTAR®, Intervet, Brasil).
No D8, o implante foi removido e todos os animais receberam 300 UI de eCG (Folligon®, Intervet,
Brasil) e 0,150 mg de D-Cloprostenol (Preloban®, Intervet, Brasil). Os animais foram inseminados
entre 54 e 58h após a retirada do implante. Para analise do efeito do PPP na taxa de prenhez, os
animais foram divididos em 5 grupos: Grupo P40-49 (n=142) os animais foram inseminados
entre 40 a 49 dias; Grupo P50-59 (n=759) entre 50 a 59 dias; Grupo P60-69 (n=263) entre 60 a
69 dias; Grupo P70-79 (n=684) entre 60 a 69 dias e Grupo P>80 (n=641) acima de 80 dias após
o parto. O diagnóstico de gestação foi realizado por ultra-sonografia 55 dias após a IATF. A taxa
de prenhez foi analisada pelo teste de Qui-quadrado. Verificou-se os seguintes resultados: Grupo
P40-49, 52,82% (75/142); Grupo P50-59, 55,20% (419/759); Grupo P60-69, 52,09% (137/263);
Grupo P70-79, 56,29 (361/684) e Grupo P>80, 52,11 (334/641; p>0,05). Não se verificou efeito
do período pós-parto na taxa de concepção à IATF. Os resultados indicaram que é possível realizar
a IATF precocemente no período pós parto quanto se utiliza o tratamento de sincronização
associado ao eCG no momento da retirada do implante Esse resultado possibilita otimizar a
eficiência reprodutiva de rebanhos de corte que empregam a técnica de sincronização da ovulação
para IATF.
s402
EFEITO DA INDUÇÃO DE CICLICIDADE COM DISPOSITIVO INTRAVAGINAL

DE PROGESTERONA NA TAXA DE CONCEPÇÃO A INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL
EM TEMPO FIXO EM NOVILHAS NELORE
Sá Filho, M.F.1; Ayres, H.1; Rezende, L.F.C.3; Penteado, L.2; Nasser, L.F.2;
Souza, A.H.1; Baruselli, P.S.1
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ/USP, São Paulo-SP, Brasil, barusell@usp.br 2
FIRMASA-IATF, Campo Grande, MS 3 Mestrando em Ciência Animal – UFMS, Campo
Grande-MS.
Um total de 308 novilhas Nelore foram selecionadas de acordo com a ausência de corpo lúteo
(CL) e presença de um folículo com diâmetro superior a 8 mm no início do tratamento (Dia 0). O
trabalho foi realizado em três propriedades em Cascavel, PR, no mês de novembro de 2005. As
novilhas foram homogeneamente subdivididas em três grupos de acordo com o uso ou não de
um dispositivo intravaginal de progesterona (P4;CIDR®, Pfizer, Brasil) e o uso ou não de benzoato
de estradiol no inicio do tratamento. No Dia -30, os animais foram divididos em três grupos
experimentais. O Grupo Controle (n=108) não recebeu nenhum tratamento. O Grupo CIDR
(n=104) recebeu um dispositivo de P4 previamente utilizado por 24 dias, o qual foi retirado no
Dia -22. No dia -20 foi administrado 1 mg de benzoato de estradiol (BE; Estrogin®, Farmavet,
Brasil). O Grupo CIDR+BE (n=96) recebeu o mesmo tratamento do Grupo CIDR, no entanto foi
administrado 2 mg de BE no momento da inserção do P4 (dia -30). No Dia 0, todos animais
receberam um implante auricular de Norgestomet (Crestar®, Intervet, Brasil) e 2 mg de BE
(Estrogin®, Farmavet, Brasil). No Dia 8, removeram-se os implantes e administrou-se 0,150mg
de D-Cloprostenol (PGF2α, Preloban®, Intervet,Brasil) e 300 UI de eCG (Folligon®, Intervet,
Brasil). No Dia 9, administrou-se 1mg de BE. As fêmeas foram inseminadas em tempo fixo
(IATF) 52 a 56 horas após a remoção do Crestar, dividindo homogeneamente as partidas de
sêmen nos grupos. O diagnóstico de gestação foi realizado por ultra-sonografia 30 dias após a
IATF. Os dados foram analisados pelo teste Anova e Qui-quadrado no programa estatístico SAS.
Os resultados para os Grupos Controle, CIDR e CIDR+BE foram, respectivamente: taxas de
indução de ciclicidade [63,0% (68/108)b; 83,3% (86/104)a; 78,1% (75/96)a; P=0,01], taxa de
concepção à IATF [50,0% (54/108); 58,7% (61/104); 54,2% (52/96); P > 0,05], taxa de concepção
à IATF dos animais que não responderam ao tratamento de indução (sem a presença de CL)
[40,0% (16/40)b; 52,9% (9/17)ab; 61,9% (13/21)a; p=0,05] e taxa de concepção a IATF dos animais
que responderam ao tratamento de indução (presença de CL) [55,9% (38/68); 60,0% (51/85);
52,0% (39/75); P > 0,05]. A taxa de concepção a IATF apresentou efeito de fazenda, sendo as
taxas para a Fazenda 1, 2 e 3, respectivamente, 40,2% (51/127)a, 63,5% (61/96)b e 64,7% (55/
85b; p=0,001). Os dados são sugestivos de que é possível induzir ciclicidade em novilhas Nelore
com o uso de dispositivo intravaginal de progesterona previamente utilizado por 24 dias associado
ao benzoato de estradiol 24h após a retirada (dia 9). Não se verificou efeito positivo da
administração de BE no início do tratamento (dia 0) de indução de ciclicidade
s403
EFEITO DO eCG E DO CIPIONATO DE ESTRADIOL EM PROTOCOLOS PARA

INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO EM VACAS HOLANDESAS DE
ALTA PRODUÇÃO
Souza, A.H.1; Martins, C.M.1; Torres-Júnior 1, J.R.S.; Ayres, H.1; Baruselli, P.S.1
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ/ USP, São Paulo/SP, Brasil. ahsouza@usp.br
O presente estudo teve como objetivo comparar a dinâmica folicular e a taxa de concepção de
vacas Holandesas de alta produção submetidas a protocolos de sincronização da ovulação para
inseminação em tempo fixo associados à gonadotrofina coriônica equina (eCG) e ao Cipionato
de estradiol (ECP) Esse estudo foi delineado para testar a hipótese de que o tratamento com eCG
e/ou ECP aumentam a taxa de prenhez em protocolos de inseminação em tempo fixo Os animais
foram sincronizados e inseminados em tempo fixo nos meses de Dezembro/2005 e Janeiro/
2006. Todos os animais receberam 2 mg de Benzoato de estradiol (Estrogin, Farmavet, Brasil) e
um dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR, Pfizer, Brasil) por 8 dias. No D8, no momento
da retirada do dispositivo e da aplicação de um luteolítico (Lutalyse, Pfizer, Brasil), os animais
foram homogeneamente divididos em 4 grupos: G1) eCG (400 UI; Folligon, Intervet, Brasil) +
ECP (1 mg) no Dia 8; G2) eCG (400 UI) no Dia 8 + GnRH (Fertagyl, Intervet, Brasil) no Dia 10;
G3) ECP (1 mg) no Dia 8; G4) GnRH no Dia 10. Na primeira fase (n=45), os animais foram
examinados por ultra-sonografia para acompanhar a dinâmica folicular durante os tratamentos
hormonais e no ciclo estral subseqüente Na segunda fase, foi realizado um teste de campo (n=400)
com os mesmos tratamentos. Os animais foram inseminados em tempo fixo 54 a 58h após a
retirada do dispositivo de progesterona O diagnóstico de prenhez foi realizado por meio de ultra-
sonografia 30 dias após a IATF. Os dados foram analisados pelo PROC FREQ e ANOVA do
SAS. A taxa de prenhez foi similar entre os grupos experimentais (G1=25,8%, G2=32,3%,
G3=28,1%, G4=29,2%). O ECP antecipou e aumentou a variação do momento da ovulação
(71.3±2.9ax vs. 78.0±1.9by), porém não afetou a taxa de prenhez à campo (com ECP=26,9% vs.
sem ECP=30,8%). O eCG aumentou o diâmetro do folículo ovulatório (14.± 0.06 vs.
12.2±0.06mm) e o volume do CL (6775±37.4 vs. 5704±40.4 mm3), porém somente animais de
baixa condição corporal (d” 2.5) apresentaram aumento na taxa de prenhez (27.8%a; n = 54 vs.
13.7%b; n = 51). Os resultados são sugestivos de que o eCG pode melhorar a taxa de prenhez em
vacas de leite de alta produção com baixa condição corporal O estresse térmico durante o período
experimental pode ter inibido os possíveis efeitos benéficos do ECP na fertilização e/ou do eCG
na taxa de concepção.
(Agradecimentos: Pfizer, Nutricell)
s404
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM OVELHAS PELA VIA TRANS-CERVICAL

COM SÊMEN CONGELADO
Isobe, F.R.1; Silva, B.J.C.2; Severo, N.3; Baptista, A.L.4; Santos, I.C.C.5; Oliveira, R.2;
Schneider, C.2; Traldi, A.S.1
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ, USP – 13 630-000, Pirassununga, SP
2
Embryolife - 3ABS Pecplan - 4AC Agromercantil - 5Tecnopec - astraldi@usp.br
A sinuosidade da cérvix dificulta a inseminação via cervical nos ovinos, fato que, somado aos
baixos resultados de fertilidade com sêmen congelado nessa espécie, restringe o uso da
inseminação trans-cervical. Este estudo teve como objetivo otimizar uma técnica de inseminação
artificial trans-cervical em ovinos com sêmen congelado. Foram utilizadas 180 ovelhas divididas
em dois tratamentos hormonais para indução do estro, sendo o Grupo1 (G1, n=120) tratado com
pessários vaginais com 60 mg de Medroxiprogesterona (Progespon®) durante 11 dias e aplicação
de 300 UI de eCG (Novormon®) no momento da retirada do pessário e o Grupo2 (G2; n=60)
tratado com o mesmo pessário durante 9 dias, recebendo 300 UI de eCG e 100 mg de d-cloprostenol
(Prolise®) 48h antes do final do tratamento. As inseminações foram realizadas 12 a 18 horas após
detecção do estro por rufiões. Com o auxílio de um espéculo humano médio de 15 cm e uma
fonte de luz, a cérvix foi localizada e tracionada com uma pinça de Posy e uma Allis, permitindo
sua exteriorização e manipulação durante a introdução de aplicador metálico, com ponta romba
de 2mm e corpo de 1mm de diâmetro e 5 cm de comprimento, que favorece a transposição dos
anéis cervicais. Na impossibilidade de transpassar o primeiro anel cervical, a inseminação não
foi realizada. Foi utilizado sêmen congelado em palhetas de 0,25 ml com concentrações de 100
e 150 milhões de espermatozóides, distribuídas entre tratamentos. O diagnóstico de gestação foi
efetuado por ultra-sonografia trans-retal, 40 dias após as inseminações. Os resultados foram
analisados pelo teste do Qui-quadrado ou Anova. No G1, 110 manifestaram estro (90,8%), das
quais 49 foram inseminadas com 100 milhões (48,5%) e 52 com 150 milhões de espermatozóides
(51,5%). No G2, 43 manifestaram estro (71,7%), das quais 42 foram inseminadas (97,7%), 18
com 100 milhões (42,9%) e 24 com 150 milhões de espermatozóides (57,1%). O intervalo entre
o momento de retirada dos pessários e início do estro foi de 43,0±11,5h para o grupo G1 e
37,6±8,1h para o G2, sem diferença entre tratamentos (p³0,05). O percentual de animais em estro
foi superior no G1 (p = 0,0008). A taxa de gestação do G1 (8,9% - 9/101) não diferiu (p>0,1) do
G2 (7,1% -3/42), com uma taxa de parição total de 8,4% (12/143), das quais 58,3% (7/12)
oriundas de inseminações intra-uterinas, 25,0% (3/12) de inseminações cervicais profundas e
16,7% (2/12) cervicais médias. Não houve diferença significativa quanto à dose inseminante
entre grupos ou tratamentos (p>0,1). Os resultados obtidos mostraram a baixa eficiência da
técnica utilizando-se sêmen congelado em ovelhas inseminadas 12 a 18 horas após observação
de estro pelo método de tração cervical.
Financiado pela TECNOPEC®
s405
VIABILIDADE DE DUAS LAVAGENS UTERINAS, NO SÉTIMO E OITAVO DIA,

APÓS IA EM VACAS NELORE
Wünsche Jr., A.G.1; Barreiros, T.R.R.2; Bezerra, G.A.3; Azevedo, J.R.3;

Oliveira, A.C.S.4; Seneda, M.M.5
1
Pós-graduando REMAPRO, Universidade Estadual de Londrina, 2Doutorando do programa
de pós-graduação em Ciência Animal, Universidade Estadual de Londrina, 3Mestrandos do
programa de Pós-Graduação do Departamento de Zootecnia da Universidade Estadual de
Maringá 4Graduanda do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Londrina,
5
Departamento de Clínicas Veterinárias, CCA, UEL, PR, 86051-990
annakarolla@hotmail.com
Com o objetivo de estudar a viabilidade do uso de duas lavagens uterinas como protocolo para a
coleta de embriões, desenvolveu-se um experimento que consistiu em superovular as doadoras e
fazer uma lavagem complementar no oitavo dia, 24 h depois da primeira lavagem realizada no
sétimo dia após a inseminação artificial. Foram utilizadas neste experimento vacas Nelores (n =
16), em regime de campo. Os animais foram considerados aptos após os exames ginecológicos e
ultra-sonográfico. O protocolo de superovulação consistiu na inserção de um dispositivo
intravaginal de progesterona 1,9 g (CIDR; Pfizer, Hamilton, Nova Zelândia) pela manhã. Vinte
e quatro horas após, administrou-se 2,5 mg de benzoato de Estradiol (Estrogin; Farmavet, São
Paulo, SP, Brasil) IM. No período entre o quinto e oitavo dia após o início do tratamento, os
animais receberam 250 UI de FSH (Pluset; Calier, Osasco, SP, Brasil) IM em doses decrescentes.
Quarenta e oito e sessenta horas após a primeira aplicação de FSH, foram administradas 25 mg
de dinoprost IM (Lutalyse; Pharmacia, Paulínia, SP, Brasil). Os dispositivos de progesterona
foram retirados, junto com a última aplicação de dinaprost. As vacas foram inseminadas 12 e 24
horas após o início das manifestações estrais. Para os procedimentos das lavagens uterinas (n =
32) foram utilizadas sondas de Foley de duas vias, posicionadas na porção caudal à bifurcação
do útero. Em cada lavagem, foram usados 1.000 ml de DMPBS (Embriocare; Cultilab, Campinas,
SP, Brasil). Após o término da lavagem no sétimo dia, a sonda era retirada e um segundo
procedimento era realizado 24 horas após o primeiro. Todas as lavagens uterinas foram realizadas
pelo mesmo profissional. Obtêve-se um total de 169 estruturas sendo 91,1% (154/169) no sétimo
dia. Na lavagem complementar no oitavo dia 8,9% (15/169) estruturas foram obtidas. Concluímos
que a lavagem complementar permitiu a recuperação de um número muito reduzido de embriões
e a validade deste procedimento fica restrita a embriões cujo valor justifique o procedimento.
Este experimento recebeu o apoio da Pfizer, por meio da doação de medicamentos.
s406
UTILIZAÇÃO DO TESTE HIPOSMÓTICO PARA AVALIAÇÃO DO SÊMEN IN

NATURA DE CAPRINOS DA RAÇA BÖER
Alves, S.G.G.; Chalhoub, M.; Bittencourt, R.F.; Biscarde, C.E.A.; Almeida, A.K.;
Portela, A.P.M.; Vasconcelos, M.F.; Freitas, D.S.; Ribeiro Filho, A. de L.
Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, Brasil. alvessgg@yahoo.com.br
As técnicas de avaliação seminal, utilizadas rotineiramente nos exames andrológicos, ainda são
limitadas quanto à determinação do potencial fertilizante do espermatozóide, pois as variáveis
espermáticas do ejaculado (motilidade, concentração e morfologia), são insuficientes num
diagnóstico de infertilidade, a não ser que alguma delas seja extremamente inferior aos valores
preconizados para a espécie em questão. Dentre os aspectos morfológicos estruturais dos
espermatozóides, a integridade da membrana plasmática é crucial para o funcionamento da célula
espermática, por isso, a grande importância do estudo da sua funcionalidade. O teste hiposmótico
ou “hypoosmotic swelling test” (HOST), desenvolvido por Jeyendren et al. (J. Reprod. Fert.,
v.70, p.219-228), teve como finalidade avaliar a integridade funcional da membrana plasmática
do espermatozóide. Este teste baseou-se no transporte de fluidos que ocorre através da membrana
plasmática, quando intacta. Assim, o objetivo deste experimento foi determinar o teste hiposmótico
adequado para a espécie caprina, especificamente machos da raça Böer, e sua variabilidade intra-
ensaio. Para tal utilizou-se 24 ejaculados, divididos em três etapas, provenientes de cinco
reprodutores. Foram utilizadas como soluções hiposmóticas a água destilada (0mOsmol/Kg),
duas soluções de açúcar (frutose e sacarose), duas de eletrólitos (citrato de sódio e cloreto de
sódio) e uma associação de açúcar-eletrólito (frutose-citrato de sódio), estas cinco últimas, em
quatro diferentes osmolaridades: 50, 100, 150 e 200mOsmol/Kg H2O. As análises comparativas
foram realizadas por meio do SPSS versão 12.0. Embora as média gerais das reações hiposmóticas,
tenham se mostrado semelhantes estatisticamente (P>0,05), entre as osmolaridade de 50mOsmol/
Kg H2O (78,12%), quando comparada às médias das osmolaridades de 100 e 150mOsmol/Kg
H2O, que foram de 78,08% e 77,5%, respectivamente, escolheu-se a osmolaridade de 100mOsmol/
Kg H2O pela maior facilidade em observar as alterações de cauda geral na microscopia de contraste
de fase, mesmo em aumentos menores (400x), pela menor incidência de alterações de peça
terminal, estas de difícil observação em aumentos menores que 1.000 vezes e por ter apresentado
o menor coeficiente de variação entre as osmolaridades estudadas (CV=15,02%). A ausência de
diferença (P>0,05), no presente experimento, entre os tempos de incubação, dentro da solução,
indicou a incubação por 15 minutos como satisfatória à reação hiposmótica do sêmen caprino in
natura. O percentual de espermatozóides reativos ao HOST aos 15 minutos de incubação, variou
entre 74,90 a 82,30%, independente do soluto utilizado. Tendo, a solução de citrato de sódio
apresentado o maior percentual numérico de reação hiposmótica (82,30%), dentre as soluções
estudas. Assim, baseado nos resultados encontrados neste experimento, a solução indicada para
se realizar o HOST no sêmen in natura de caprinos da raça Böer foi a de citrato de sódio a
100mOsmol/Kg H2O, incubada por 15 minutos, com uma variação inter-ensaio média de
4,26%±1,68, indicando alta repetibilidade, possibilitando assim, uma margem de segurança, na
comparação entre os resultados observados por diferentes pesquisadores.
s407
EFEITO DO MOMENTO DA INSEMINAÇÃO E DO TRATAMENTO COM GnRH

NA IATF SOBRE A TAXA DE CONCEPÇÃO DE VACAS DE CORTE LACTATNES
SINCRONIZADAS COM NORGESTOMET E VALERATO DE ESTRADIOL
Ayres, H.2; Torres-Júnior, J.R.S.2; Penteado, L.1; Souza, A.H.2; Baruselli, P.S.2
1
FIRMASA-IATF, MS; 2Departamento de Reprodução Animal, FMVZ -USP, São Paulo - SP,
Brasil.
A técnica de sincronização da ovulação para inseminação artificial em tempo fixo (IATF) tem
apresentado resultados satisfatórios quanto à taxa de prenhez e à eficiência reprodutiva,
possibilitando o uso da inseminação artificial em larga escala. Porém os protocolos preconizam
a IATF somente dentro de um período de 4 horas (de 54 a 58h após a retirada do implante). Na
tentativa de melhorar o manejo do emprego dessa tecnologia, objetivou-se neste estudo verificar
o efeito do momento da inseminação artificial e do tratamento com GnRH na IATF em vacas de
corte. Foram utilizadas 274 vacas lactantes (Bos indicus e Bos indicus x Bos taurus) com período
pós-parto entre 40 e 65 dias, divididas em duas réplicas. No Dia 0, os animais receberam 5 mg de
Valerato de estradiol (i.m.) e um implante auricular de norgestomet (CRESTAR®, Intervet, Brasil).
No Dia 9, o implante foi removido e foram administradas 400 UI de eCG (Folligon®, Intervet,
Brasil, i.m.). A partir deste momento, os animais foram divididos homogeneamente em quatro
grupos. O Grupo G-IA48h (n=71) foi inseminado 48 horas após a remoção do implante; o Grupo
G-IA48h+GnRH (n=71) recebeu o mesmo tratamento do G-IA48h, acrescido da administração
de 0,1 mg de Gonadorelina (GnRH, Fertagyl®, Intervet, Brasil) no momento de inseminação; o
Grupo G-IA54h (n=66) foi inseminado 54 horas após a remoção do implante e o Grupo G-
IA54h+GnRH (n=66) recebeu o mesmo tratamento do G-IA54h acrescido da administração de
GnRH no momento de inseminação. O diagnóstico de gestação foi realizado por ultra-sonografia
30 dias após a IATF. As taxas de concepção foram analisadas pelo teste de Qui-quadrado, com
nível de significância de P<0,05. As possíveis interações foram avaliadas pelo teste de ANOVA
do SAS for Windows e não foram verificados efeitos de réplica, raça e tratamentos. As taxas de
concepção foram: G-IA48h: 67,6% (48/71), G-IA48h+GnRH: 67,6% (48/71), G-IA54h: 63,6%
(42/66) e G-IA54h+GnRH: 72,7% (48/66). Não foi verificado efeito do tratamento com GnRH
(com GnRH: 66,7%, 90/137; vs sem GnRH: 70,1%, 96/137) e do momento da inseminação
(48h: 67,6%, 96/142; vs 54h: 68,2%, 90/130). Os resultados são indicativos de que tanto a
inseminação artificial 48 quanto 54h da retirada do implante apresentam semelhantes taxas de
concepção à IATF em protocolos com Norgestomet associado ao valerato de estradiol no dia 0 e
ao eCG no momento da retirada do implante em vacas de corte lactantes.
Agradecimento: INTERVET e Agropecuária Café no Bule
s408
EFEITO DO MOMENTO DA INSEMINAÇÃO E DO TRATAMENTO COM GnRH

NA IATF SOBRE A TAXA DE CONCEPÇÃO DE VACAS DE CORTE LACTATNES
SINCRONIZADAS COM NORGESTOMET E BENZOATO DE ESTRADIOL
Ayres, H.2; Torres-Júnior, J.R.S.2; Penteado, L.1; Souza, A.H.2; Baruselli, P.S.2
1
FIRMASA-IATF, MS; 2Departamento de Reprodução Animal, FMVZ -USP, São Paulo - SP,
Brasil.
A técnica de sincronização da ovulação para inseminação artificial em tempo fixo (IATF) tem
apresentado resultados satisfatórios quanto à taxa de prenhez e à eficiência reprodutiva,
possibilitando o uso da inseminação artificial em larga escala. Porém, os protocolos preconizam
a IATF somente dentro de um período de 4 horas (de 54 a 58h após a retirada do implante). Na
tentativa de melhorar o manejo do emprego dessa tecnologia, objetivou-se neste estudo verificar
o efeito do momento da inseminação artificial e do tratamento com GnRH na IATF em vacas de
corte. Foram utilizadas 277 vacas lactantes (Bos indicus e Bos indicus x Bos taurus) com período
pós-parto entre 40 e 65 dias, divididas em duas réplicas. No Dia 0, os animais receberam 2 mg de
Benzoato de estradiol (Estrogin®, Farmavet, Brasil, i.m.) e um implante auricular de norgestomet
(Crestar®, Intervet, Brasil), previamente utilizado por 9 dias. No Dia 8, o implante foi removido
e foram administradas 400 UI de eCG (Folligon®, Intervet, Brasil, i.m.), 1,0 mg de Cipionato de
Estradiol (ECP®, Pfizer, Brasil, i.m.) e 0,150mg de D-Cloprostenol (PGF2α, Preloban®, Intervet,
Brasil, i.m.). A partir deste momento, os animais foram divididos homogeneamente em quatro
grupos. O Grupo G-IA48h (n=67) foi inseminado 48 horas após a remoção do implante; o Grupo
G-IA48h+GnRH (n=69) recebeu o mesmo tratamento do G-IA48h, acrescido da administração
de 0,1 mg de Gonadorelina (GnRH, Fertagyl®, Intervet, Brasil) no momento de inseminação; o
Grupo G-IA54h (n=72) foi inseminado 54 horas após a remoção do implante e o Grupo G-
IA54h+GnRH (n=69) recebeu o mesmo tratamento do G-IA54h acrescido da administração de
GnRH no momento de inseminação. O diagnóstico de gestação foi realizado por ultra-sonografia
30 dias após a IATF. As taxas de concepção foram analisadas pelo teste de Qui-quadrado, com
nível de significância de P<0,05. As interações foram verificadas pelo teste de ANOVA do SAS
for Windows e não foram verificados efeitos de réplica, raça e tratamentos. As taxas de concepção
foram: G-IA48h 67,16% (45/67), G-IA48h+GnRH 68,11% (47/69), G-IA54h 69,44% (50/72) e
G-IA54h+GnRH 55,07% (38/69). Não foi verificado efeito do tratamento com GnRH (com
GnRH: 61,59%, 85/138; vs sem GnRH: 68,38%, 95/138) e do momento da inseminação (48h:
67,65%, 92/136; vs 54h: 62,41%, 88/141). Os resultados são indicativos de que tanto a
inseminação artificial 48 quanto 54 h da retirada do implante apresentam semelhantes taxas de
concepção à IATF em protocolos com Norgestomet associado ao benzoato de estradiol no dia 0
e ao eCG e ao cipionato de estradiol no momento da retirada do implante em vacas de corte
lactantes.
Agradecimento: INTERVET
s409

COM IMPLATE AURICULAR DE PROGESTÁGENO ASSOCIADO AO BENZOATO
OU AO CIPIONATO DE ESTRADIOL
Ayres, H.2; Penteado, L.1; Torres-Júnior. J.R.S.2; Souza, A.H.2; Baruselli, P.S.2
1
FIRMASA IATF, Campo Grande-MS, 2 Departamento de Reprodução Animal, FMVZ/USP,
CEP 05508-000, São Paulo-SP, Brasil. luciano@grupomassa.com.br ou barusell@usp.br
Com o objetivo de diminuir o número de vezes que os animais são manejados nos protocolos
tradicionais de sincronização da onda de crescimento folicular para inseminação artificial em
tempo fixo (IATF) realizou-se o estudo para avaliar a taxa de concepção de vacas Nelore (Bos
indicus) tratadas com implante auricular de progestágeno (CRESTAR®, Intervet, Brasil)
associando ao Cipionato de Estradiol no momento da retirada (dia 8). Um total de 361 fêmeas
paridas (60-75 dias pós-parto) receberam no início do tratamento (Dia 0) um CRESTAR
previamente utilizado associado a 2mg de (BE, Estrogin®, Farmavet, Brasil), i.m. No Dia 8,
realizou-se a remoção do CRESTAR e a administração de 0,150mg de D-Cloprostenol (PGF2α,
Preloban®, Intervet,Brasil). A partir deste momento, as fêmeas foram distribuídas homogeneamente
de acordo com o escore de condição corporal e o período pós-parto em três grupos: Grupo
1mgBE (n=122), 1 mg de BE, i.m., 24 horas após a remoção do CRESTAR, Grupo 0,5mgCE
(n=120) ou Grupo 1mgCE (n=119), 0,5 ou 1mg de CE, (ECP®, Pfizer, Brasil) i.m. no momento
da retirada do CRESTAR, respectivamente. As fêmeas foram inseminadas em tempo fixo (IATF)
52 a 56 horas após a remoção do CRESTAR, dividindo homogeneamente as partidas de sêmen,
nos grupos. O diagnóstico de gestação foi realizado por ultra-sonografia aos 30 dias após a IATF.
Os resultados foram analisados pelo teste de Qui-quadrado. As taxas de concepção foram de
47,1% (56/119) para o Grupo 1mgCE, de 36,7%, (44/120) para o Grupo 0,5mgCE e de 46,7%
(57/22) para o Grupo 1mgBE (P < 0,05??). A administração de 1mg de CE no momento da
retirada do CRESTAR proporcionou taxas de concepção semelhantes entre 0,5mg CE, no dia 8
ou 1mg de BE no dia 9. Este resultado mostra que o Cipionato de estradiol na dose de 1mg pode
ser utilizado como indutor de ovulação em programas de IATF e possibilita a redução do número
de vezes no quais os animais necessitam serem manejados e também facilita a sua administração
pelo maior volume de produto utilizado, sem comprometer a eficiência do tratamento de
sincronização.
(Agradecimento: Intervet)
s410
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO (IATF) UTILIZANDO

PROTOCOLOS HORMONAIS COM OU SEM FONTE EXÓGENA DE
PROGESTERONA, ASSOCIADO OU NÃO À REMOÇÃO TEMPORÁRIA DO
BEZERRO (RTB)
Souza, A.F.1a; Pinheiro, V.G.1a; Ereno, R.L.2; Trinca, L.A.3; Barros, C.M.1
1
Departamento de Farmacologia e 3Departamento de Bioestatística, IB, 2Departamento de
Reprodução Animal, FMVZ, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, São Paulo.
cmbarros@ibb.unesp.br
No presente experimento, testou-se a eficiência de protocolos hormonais com ou sem fonte

exógena de progesterona, associados ou não a remoção temporária do bezerro (RTB). Vacas
Nelore lactantes (40 a 70 dias pós-parto, n=247) foram divididas, aleatoriamente, em 3 grupos:
PEPE/eCG (grupo controle), GPE/eCG e RTB/GPE/eCG. Em dia aleatório do ciclo estral, as
vacas do grupo PEPE/eCG receberam um dispositivo intravaginal contendo progesterona (1,0 g,
DIB®, D0) e BE (2,5 mg, via IM, Estrogin®). Oito dias mais tarde (D8) foram administradas
gonadotrofina coriônica eqüina (eGC, 300 UI, via IM, Novormon®) e PGF2α (150 μg de dl-
cloprostenol sódico, via IM, Ciosin®), e removeu-se o DIB. Vinte e quatro horas após a remoção
do DIB as vacas foram tratadas com BE (1,0 mg, via IM) e 30 a 36 h depois os animais foram
inseminados (IATF). Os animais do Grupo GPE/eCG foram tratados com GnRH (50 µg de
acetato de fertirelina via IM, Fertigen®, D0) e sete dias mais tarde (D7) receberam uma aplicação
de PGF2α (150 μg de dl-cloprostenol sódico, via IM) e outra de eCG (300 UI, Novormon®). No
D8, administrou-se BE (1mg) e 30 a 36h mais tarde os animais foram inseminados (IATF). Nas
vacas submetidas ao protocolo RTB/GPE/eCG, procedeu-se a remoção temporária do bezerro
(durante 48h) antes do início dos tratamentos. Em todos os animais foi realizado exame ultra-
sonográfico (Aloka SSD 500, probe de 7,5 MHZ) dos ovários, dez dias antes e no dia do início
dos tratamentos hormonais ou RTB, com a finalidade de determinar a presença de corpo lúteo
(CL), e 45 dias após a IATF para diagnóstico de gestação. Os dados foram analisados por meio
de regressão logística. Foram consideradas no modelo e não interferiram na taxa de prenhez as
variáveis: ano, escore corporal, ausência ou presença de CL, inseminadores e sêmen. Os animais
submetidos ao protocolo PEPE/eCG apresentaram taxa de prenhez superior aos tratados com o
protocolo GPE/eCG [37/71 (52,1%) vs 24/76 (31,5%), respectivamente, p<0,04]. Entretanto,
não houve diferença significativa na taxa de prenhez das vacas tratadas com os protocolos PEPE/
eCG e RTB/GPE/eCG [37/71(52.1%) vs 38/100 (38%), respectivamente, p>0,10]. Além disso, a
associação da RTB ao protocolo GPE (RTB/GPE/eCG) não melhorou significativamente as taxas
de prenhez [38/100 (38%) vs 24/76 (31,5%), respectivamente, RTB/GPE/eCG vs GPE/eCG,
p>0,10]. Os resultados indicam que o protocolo com fonte exógena de progesterona é melhor
que os tratamento sem progesterona e sem remoção temporária do bezerro, resultando em taxas
de prenhez mais elevadas. aBolsista CNPq. Apoio FAPESP e Shering Plough.
s411
FATORES RELACIONADOS AO EMBRIÃO E A RECEPTORA QUE

INFLUENCIAM O SUCESSO DAS TRANSFERÊNCIAS DE EMBRIÕES DE
COLETA CONVENCIONAL OU DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO
Dias, C.C.1; Alvin, M.T.T.2; Saliba, W.P.2; Vasconcelos, J.L.M.1
1
Departamento de Produção Animal – FMVZ-UNESP, Botucatu, SP, 18618-000, Brasil;
2
Cenatte Embriões, Caixa Postal 64, Pedro Leopoldo, MG, 33600-000, Brasil;
vasconcelos@fca.unesp.br
Diversos fatores interferem nas taxas de concepção das transferências de embriões dentre eles
fatores relacionados ao próprio embrião como sua classificação quanto ao estágio de
desenvolvimento (Mo, Bi, Bl, Bx, Be - IETS) e a qualidade (grau 1, 2 - IETS) e fatores relacionados
às receptoras tais como a sincronia embrião-receptora (-2, -1, 0, +1) e a qualidade do corpo lúteo
à palpação retal, classificado quanto ao nível de exteriorização do CL no ovário (1,2,3 e incluso).
O objetivo deste trabalho foi avaliar quais destas variáveis e possíveis interações entre elas,
podem influenciar as taxas de concepção, e sua importância para os embriões de diferentes
procedências (coleta convencional e fertilização in vitro), visando nortear a escolha das receptoras
de embriões no momento das transferências ou mesmo facilitar a realização de orçamentos de
custo para a obtenção de fêmeas aptas a receber embriões nos dois diferentes programas. O
presente trabalho avaliou os resultados de 932 transferências de embriões de coleta convencional
e 3201 transferências de embriões obtidos por fertilização in vitro realizadas pela Cenatte
Embriões, durante o ano de 2005. Os dados foram analisados por regressão logística, sendo
incluídas no modelo as variáveis: procedência do embrião (FIV e TE), estágio de desenvolvimento
e qualidade embrionários, sincronia embrião-receptora e classificação do CL por palpação retal.
A taxa de concepção foi influenciada (P<0,05) por procedência dos embriões (TE convencional:
63,7%; FIV: 51,6%), pela sincronia embrião-receptora (-2: 33,9%; -1: 56,8%; 0: 57,1% e +1:
56,7%) e pela qualidade embrionária (grau 1: 54,3% e grau 2: 52,5%). Foi detectada interação
(P<0,05) de procedência do embrião (TE ou FIV) e sincronia nas taxas de concepção (TE : -2:
48,9%; -1: 69,4%; 0: 60,4% e +1: 66,5% e FIV: -2: 32,3%; -1: 53,0%; 0: 56,0% e +1: 54,0%).
Conclui-se que a sincronia e a qualidade do embrião são os parâmetros mais importante na
seleção das receptoras e dos embriões.
s412
FATORES QUE INFLUENCIAM A TAXA DE CONCEPÇÃO DE RECEPTORAS

HOLANDESAS LACTANTES
Jardina, D.T.G.1; Saoncella, C.1; Rodrigues, C.A.2; Vasconcelos, J.L.M.1
1
Departamento de Produção Animal – FMVZ/UNESP, Botucatu-SP, Brasil 18618-000
2
Clínica Veterinária, Samvet, São Carlos, SP, Brasil. vasconcelos@fca.unesp.br
Este trabalho avaliou os resultados de 873 transferências de embriões, realizadas na Fazenda

Santa Rita, Descalvado, SP, durante o período de janeiro de 2005 a janeiro de 2006. As receptoras,
vacas Holandesas eram ordenhadas 3 vezes ao dia e alimentadas com ração total devidamente
balanceada. Os embriões utilizados foram obtidos do tratamento superovulatório usando 2
implantes auriculares de 3mg de Norgestomet(Crestar®) associada à aplicação de 3 mg benzoato
de estradiol (BE, Index, Brasil) em dia aleatório do ciclo estral. O início do tratamento da
superovulação foi no quarto dia com aplicação de 500 UI de FSH (Pluset®, Calier, Brasil) diluídos
em 200 ml de solução fisiológica, divididos em oito doses decrescentes, com 12 h de intervalo
entre elas. No sétimo dia, realizou-se a aplicação de uma dose de PGF2α (Ciosin® Coopers, 2ml).
No oitavo dia, os implantes auriculares de Norgestomet foram removidos. A ovulação foi
sincronizada com uma aplicação de 0,25 mg de GnRH (Fertagyl®, Intervet, Brasil) na manhã do
nono dia do protocolo, seguidas de duas inseminações 12 e 24 horas após. As coletas foram
realizadas 6,5 dias após a primeira inseminação. As receptoras receberam uma aplicação de
PGF2α (Ciosin®Coopers, 2ml) na sexta-feira e foram observadas em estro domingo, segunda e
terça-feira. Nas vacas que apresentaram estro foi realizada a avaliação do CL por palpação retal
e as transferências realizadas pelo método não-cirúrgico 6 a 8 dias após o estro. O diagnóstico de
gestação foi realizado por ultra-som aos 25 e 39 dias. A presença de gestação no 25ˆ dia e
ausência no 39ˆ foi considerada morte embrionária tardia. Os dados foram analisados por
regressão logística, sendo incluídas no modelo as variáveis: condição da doadora (em lactação
ou seca), classificação do CL da receptora (1<2<3), sincronia doadora-receptora (-1, 0, +1),
embrião fresco ou congelado, estágio de desenvolvimento embrionário (Mo, Bi, Bl, Bx - IETS)
e qualidade do embrião (grau 1, 2, 3 - IETS). A taxa de concepção no dia 25 foi influenciada pela
sincronia doadora-receptora (-1: 37,7%; 0: 46,9%; +1: 45,6%; P=0,053). Não foi detectado efeito
de estágio de desenvolvimento embrionário (Mo: 45,6%; Bi: 41,8%; Bl: 46,9%; Bx: 43,8%),
qualidade do embrião (Grau 1: 44,2%; Grau 2: 47,4 %; Grau 3: 42,3 %), classificação do CL (CL
1: 47,9%; CL 2: 43,5% e CL 3: 30,0%), condição do embrião (fresco: 45,8% e congelado: 43,1%)
e das doadoras (em lactação: 45,5% e seca: 47,08%). A taxa de concepção no dia 39 foi influenciada
somente pela sincronia doadora-receptora (-1: 29,9%; 0: 34,9%; +1: 38,2%; P=0,021). A taxa de
perda embrionária foi influenciada pela condição da doadora (em lactação: 16,6% e seca: 24,0%).
Estes dados sugerem que em receptoras Holandesas, a sincronia é o parâmetro mais importante
na seleção das que deverão ser inovuladas.
s413
TAXA DE CONCEPÇÃO APÓS A TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM VACAS

LACTANTES APÓS A DETECÇÃO DO CIO OU SINCRONIZAÇÃO DA
OVULAÇÃO
Jardina, D.T.G.1; Santos, R.M.1; Demétrio, D.G.B.1; Rodrigues, C.A.2; Vasconcelos, J.L.M.1
1
FMVZ-UNESP, Botucatu, SP; 2Clinica Veterinária Samvet, São Carlos, SP;
O objetivo desse estudo foi avaliar a taxa de concepção após a transferência de embriões em
vacas lactantes após a detecção do cio ou sincronização da ovulação. O experimento foi conduzido
em uma fazenda localizada em Descalvado, SP, Brasil em setembro de 2005. As vacas eram
ordenhadas 3 vezes ao dia e alimentadas com ração total devidamente balanceada. Vacas ciclando,
produzindo 32,4 ± 9,5 kg de leite por dia com 215 ± 160 dias em lactação foram divididas
aleatoriamente em dois grupos: Grupo 1 (n = 43): vacas tratadas com uma aplicação de PGF2α
(Ciosin®Coopers, 2ml), observadas em cio(41,8%; 18/43) e inovuladas 6 a 8 dias após o cio,
após a avaliação da presença do corpo lúteo (66,7%; 12/18). Grupo 2 (n = 49): vacas tratadas
com o protocolo HEATSYNCH [dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR® 1,9mg Pfizer
Animal Health, Brazil) + aplicação de GnRH (1ml Fertagyl® Intervet) - 7 dias - remoção do
CIDR + aplicação de PGF2α (5ml Lutalyse® Pfizer Animal Health, Brazil) - 1 dia - aplicação de
of Cipionato de estradiol (0,5ml ECP® Pfizer Animal Health, Brazil)]. O estro também foi
detectado no grupo 2 (57,1%, 28/49). Todas as vacas do grupo 2 foram examinadas para detecção
da presença do corpo lúteo 9 dias após a aplicação de ECP, e as vacas com CL foram inovuladas
(79,6%, 39/49). Todas as vacas receberam embriões frescos (grau I ou II) de vacas Holandesas
lactantes e não lactantes produzidos in vivo, transferidos por um técnico treinado. O diagnóstico
de gestação foi realizado aos 25 e 39 dias por ultra-sonografia. Os dados foram analisados por
Qui-quadrado. A taxa de concepção foi de 50,0% (6/12) e 53,9% (21/39) e a taxa de prenhez de
14,0% (6/43) e 42,9% (21/49) para os grupos 1 e 2, respectivamente. O grupo 2 (Protocolo
HEATSYNCH) apresentou a mesma taxa de concepção, mas apresentou maior (P<0,01) taxa de
prenhez que o Grupo 1 (PGF2α + detecção de cio). Vacas detectadas em cio após o protocolo
HEATSYNCH tiveram a mesma concepção das vacas não detectadas em cio (56,3 vs. 52,2%,
respectivamente). A transferência de embriões frescos pode ser realizada após o protocolo
HEATSYNCH, pois os dados mostraram que a taxa de concepção foi mantida e a taxa de prenhez
aumentou.
Palavras-chave: transferência de embriões; taxa de concepção, vaca de leite
s414
EFICIÊNCIA REPRODUTIVA DE VACAS NELORE SUBMETIDAS A DIFERENTES

TIPOS DE MANEJO NA REGIÃO AGRESTE DO RIO GRANDE DO NORTE
Rocha, J.M. ; Rabelo, M.C. ; Santos, M.H.B.; Moraes, E.P.B.X.; Chiamenti, A.; Falcão, D.P.1;
Lima, P.F.; Oliveira, M.A.L.
Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Medicina Veterinária - UFRPE, Av. Dom

Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, 52171 900 Recife-PE maloufrpe@uol.com.br;
Objetivando avaliar diferentes estratégias de manejo reprodutivo em vacas Nelore na Região

Agreste do Estado do Rio Grande do Norte, 945 vacas com cria ao pé submetidas às mesmas
condições de solo, clima e alimentação, constituíram três grupos experimentais. No G1, as fêmeas
(n = 320) permaneceram durante todo o ano com reprodutores previamente examinados
andrologicamente, na proporção de um touro para cada 50 vacas, sendo as mesmas avaliadas por
palpação retal a cada 90 dias, no período de janeiro a dezembro de 2004, no G2 (n = 282) as
fêmeas foram submetidas à estação de monta por um período de 120 dias durante o período do
ano de maior disponibilidade de forragens, entre os meses de maio a agosto de 2004, e no G3 (n
= 343) as vacas foram submetidas a EM de 120 dias no mesmo período do G2, com a utilização
de inseminação artificial baseada na observação de estro nos dois primeiros meses, inseminação
artificial em tempo fixo no terceiro mês e repasse com reprodutores durante o quarto mês da EM.
Os dados foram estatisticamente avaliados pelo teste Qui-quadrado com 5% de significâcia. Os
índices de prenhez obtidos foram de 44,68% no G1, 64,89% no G2 e de 80,46% no G3, ocorrendo
diferença estatística entre os grupos Os resultados permitem concluir que o estabelecimento de
uma estação de monta associando-se inseminação artificial, com observação de estro e inseminação
artificial em tempo fixo, com repasse de reprodutores é providencial na região onde este trabalho
foi executado, principalmente em decorrência do curto período chuvoso ofertar maior quantidade
e melhor qualidade das condições de pastagem.
Palavras-chave: IA, IATF, monta natural.
s415
IATF EM VACAS NELORE: AVALIAÇÃO DE DUAS DOSES DE ECG E

REUTILIZAÇÃO DE IMPLANTES INTRA-VAGINAIS DE PROGESTERONA
Rocha, J.M.1; Rabelo, M.C.1; Santos, M.H.B.1; Falcão, D.P.1; Moraes, E.P.B.X.1;
Bartolomeu, C.C.2; Lima, P.F.1; Oliveira, M.A.L.1
1
Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Medicina Veterinária - UFRPE, Av. D.
Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, 52171 900 Recife-PE maloufrpe@uol.com.br; ;
2
Laboratório de Anatomia e Fisiologia Animal da Unidade Acadêmica de Garanhuns –
UFRPE, Garanhuns -PE
Avaliou-se, em dois experimentos (EI e EII), a eficiência de diferentes doses de eCG e a reutilização
de implantes intra-vaginais de progesterona (P4) nos protocolos de Inseminação Artificial em
Tempo Fixo (IATF) para vacas Nelore com cria ao pé, na Região Agreste do Estado do Rio
Grande do Norte, no período de Maio a Agosto de 2004. Foram utilizadas 263 fêmeas com
escore de condição corporal variando de 2,0 a 3,0 numa escala de 1 a 5 e condição ovariana 2, na
escala de 1 a 3 segundo Madureira (2004), que haviam parido entre 60 e 110 dias. No EI, com o
objetivo de testar duas doses de eCG utilizando o seguinte protocolo de IATF: D0 colocação dos
Implantes de P4 e aplicação de 2mg de benzoato de estradiol, D8 retirada dos implantes e aplicação
de 300 ou 200UI de eCG, D9 aplicação de 1mg de benzoato de estradiol e inseminação artificial
no D10, aproximadamente 56 hs após a remoção dos implantes As fêmeas foram aleatoriamente
distribuídas em três grupos (G1, G2, G3). No G1 (n = 54), as fêmeas não receberam tratamento
com eCG (controle), no G2 (n = 38) receberam 200 UI de eCG e no G3 (n = 50) foram tratadas
com 300 UI da mesma gonadotrofina. No EII, com o intuito de avaliar a eficiência da reutilização
dos implantes intra-vaginais de P4, as fêmeas foram aleatoriamente distribuídas em quatro grupos
experimentais (G1, G2, G3, G4), sendo que no G1 (n = 31), os dispositivos não haviam sido
utilizados, no G2 (n = 46), foi à segunda utilização, no G3 (n = 25) a terceira e no G4 (n = 19) à
quarta utilização. Dez dias após a realização da IATF, as vacas foram colocadas nos piquetes
juntamente com os reprodutores durante 30 dias. Para avaliar o índice de fertilidade da IATF, o
diagnóstico de gestação, por palpação retal, foi realizado no 45º dia após as inseminações e o
índice de fertilidade da monta natural foi avaliado no 45º dia após a remoção dos reprodutores.
Os dados foram estatisticamente avaliados pelo teste Qui-quadrado com 5% de significâcia. No
EI, os índices de prenhez da IATF e do repasse com os reprodutores foram, respectivamente, de
22,2% e 55,5% (G1), 42,1% e 78,9% (G2) e 44,0% e 88,0% (G3), registrando-se que os valores
do G1 foram menores (P < 0,05) do que os do G2 e G3, não existindo diferença (P > 0,05) entre
G2 e G3. No EII, as taxas de prenhez da IATF e da monta natural foram, respectivamente, de
50,06 e 86,87% (G1), 56,52 e 86,95% (G2), de 52,0 e 88,0% (G3) e de 31,57 e 73,68% (G4), não
sendo constatada diferença entre os valores obtidos com a IATF, bem como entre os da monta
natural. Os resultados permitem recomendar a utilização de 200 UI de eCG e até a quarta utilização
dos implantes intra-vaginais de P4 nos protocolos de IATF em bovinos de corte. Palavras-
chave: Bos indicus, estro, sincronização
s416
EFEITO DO TRATAMENTO COM CIDR, BENZOATO DE ESTRADIOL E FSH

SOBRE A PROPORÇÃO DE EMBRIÕES PRODUZIDOS IN VITRO EM VACAS
NELORE COM BAIXA RECUPERAÇÃO OOCITÁRIA
Borsato, E.A.1; Silva, D.R.M.1; Barreiros, T.R.R.2; Blaschi, W.2; Seneda, M.M.3
1
Embriogem, Campo Mourão/PR; 2Doutorando Programa de Pós-Graduação em Ciência
Animal, UEL; 3Departamento de Clínicas Veterinárias, CCA, UEL, PR, 86051- 990
thalesrigo@yahoo.combr
O uso da aspiração folicular guiada pela ultra-sonografia (OPU) em vacas da raça Nelore tem
proporcionado a obtenção de um número considerável de oócitos. Entretanto, algumas doadoras
não apresentam resultados aceitáveis, despertando o interesse no desenvolvimento de estratégias
que visam otimizar o número de embriões produzidos in vitro. O objetivo deste experimento foi
avaliar o efeito do tratamento com CIDR, benzoato de estradiol e FSH prévio à OPU em vacas
com baixa recuperação de oócitos sobre a produção in vitro de embriões Este experimento foi
conduzido na região de Campo Mourão, Estado do Paraná, durante o período de dezembro de
2004 a fevereiro de 2006. Foram utilizadas seis vacas da raça Nelore, que foram submetidas a
dois tratamentos com duas a três repetições. No grupo controle (G-CON, n=17), foram conduzidas
dezessete sessões de OPU em momentos aleatórios do ciclo estral. No grupo FSH (G-FSH,
n=18), as vacas receberam em estágio aleatório do ciclo estral, um dispositivo intravaginal
contendo 1,9 g de progesterona (CIDR®, Pfizer, Brasil) e uma aplicação de 2 mg de benzoato de
estradiol (Estrogin®, Farmavet, Brasil) por via IM;. No quarto dia, os dispositivos foram retirados
e os animais receberam 30 UI de FSH (Pluset, Calier, Espanha) por via IM e foram submetidos
à OPU dezesseis horas depois Os resultados foram analisados pelos testes T e Qui-quadrado.
Nas sessões de OPU obteve-se a média de 15,2 e 16,8 oócitos totais e 11,9 e 13,8 oócitos viáveis
(P>0,05), respectivamente para os grupos G-CON e G-FSH. Houve aumento significativo
(P=0,028) na proporção de embriões obtidos, resultando em 39,9% (81/203) para o grupo G-
CON e 51,6% (92/178) para o grupo G-FSH. A partir destes resultados, destaca-se o aumento na
proporção de embriões viáveis produzidos in vitro quando as vacas foram tratadas com CIDR,
benzoato de estradiol e FSH. Estratégias adicionais devem ser pesquisadas com o intuito de
aumentar a eficiência dos procedimentos de OPU em vacas com baixa recuperação de oócitos.
s417
PADRÃO FOLICULAR DE VACAS REPETIDORAS DE SERVIÇO

SUBMETIDAS A SINCRONIZAÇÃO DA OVULAÇÃO COM NORGESTOMET
E BENZOATO DE ESTRADIOL
Barreiros, T.R.R.1; Blaschi, W.1; Antoniazzi, A.Q.2; Bassani, C.A.2; Seneda, M.M.3
1
Doutorando Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, UEL; 2Docentes da Faculdade
Integrado de Campo Mourão, PR 4Departamento de Clínicas Veterinárias, CCA, UEL, PR,
86051- 990. thalesrigo@yahoo.com.br
O objetivo deste experimento foi avaliar a dinâmica folicular de vacas repetidoras de serviço
submetidas a protocolos de inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Foram utilizadas 21
vacas Nelore solteiras, cíclicas, com condição corporal variando entre 3,0 a 4,5 (escala 1 a 5) e
mantidas a pasto na região de Cianorte, Estado do Paraná. As vacas foram avaliadas por palpação
retal e ultra-sonografia transretal (Aloka SSD 500, 5 MHz) de modo que todas apresentaram o
trato reprodutivo morfologicamente normal. Estes animais foram divididos em dois grupos,
constituindo o grupo controle (G-CON, n=11) e o grupo repetidoras de serviço (G-RS, n=10),
respectivamente por vacas sem histórico de infertilidade e por vacas com no mínimo três repetições
de serviço de inseminação artificial. Todas as vacas foram submetidas ao mesmo protocolo de
sincronização da ovulação. Os animais receberam um dispositivo auricular de 3 mg de norgestomet
(Crestar, Intervet, Holanda) pela manhã e uma aplicação de 2 mg de benzoato de estradiol (BE);
(RIC-BE, Syntex, Argentina) por via intramuscular (IM). No oitavo dia os dispositivos foram
retirados pela manhã e os animais receberam uma dose de 500 μg de Cloprostenol (Ciosin,
Coopers, Brasil) por via IM. Após vinte e quatro horas todos os animais receberam uma aplicação
de 1 mg de BE, por via IM. As avaliações ultra-sonográficas foram realizadas a cada vinte e
quatro horas, para mensuração dos diâmetros foliculares da retirada dos dispositivos até a
ocorrência da ovulação. Os resultados foram analisados pelo teste Anova Não houve diferença
significativa no diâmetro folicular no momento da retirada dos dispositivos (G-CON=7,5±0,22mm
vs G-RS=7,5±0,3mm; P>0,05). O diâmetro médio dos folículos pré-ovulatórios não diferiram
significativamente, resultando em 11,2±0,75 e 10,7±0,67 mm (P>0,05), respectivamente para os
grupos G-CON e G-RS A partir destes resultados, conclui-se que as vacas repetidoras de serviço
apresentaram diâmetros foliculares semelhante ao grupo controle, após a retirada dos dispositivos
de norgestomet. Outros experimentos devem ser conduzidos para avaliação das taxas de concepção
na IATF de vacas repetidoras de serviço com o uso deste tratamento.
s418
INFLUÊNCIA DA DENSIDADE NUTRICIONAL DA DIETA NA TAXA DE

CONCEPÇÃO DE VACAS NELORE
Losi, T.L.1; Meneghetti, M.1; Vilela, E.R.1; Santos, R.M.2; Reis, A.M.3; Vasconcelos, J.L.M.2
1
Lageado Consultoria Agropecuária, Mineiros-GO, Brasil, 2DPA-FMVZ-UNESP, 18618-000,
Botucatu-SP, Brasil, vasconcelos@fca.unesp.br 3Agropecuária Água Preta,
Cocalinho-MT, Brasil.
O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de dietas com diferentes densidades nutricionais na
taxa de concepção (TC) de fêmeas bovinas. O trabalho foi realizado na Agropecuária Água
Preta, Cocalinho, MT. Foram utilizadas 220 fêmeas Nelores vazias, mantidas em confinamento
a céu aberto, com escore de condição corporal (ECC) médio de 2,79, divididas aleatoriamente
em dois currais. Todos os animais receberam dieta de adaptação (DA) por 15 dias (50,1% de
FDN e 28,8% de CNE). No dia 0 a dieta do Tratamento A foi alterada (TA = dieta com maior
densidade nutricional - 43,9% de FDN e 35,5% de CNE) e o Tratamento B continuou a receber
a DA (TB = dieta com menor densidade nutricional). A dieta total, composta por: silagem de
sorgo, sorgo integral triturado, arroz integral triturado, caroço de algodão e núcleo mineral, foi
oferecida 4 vezes ao dia aos animais. No dia 0 iniciou o período de monta (PM), no qual 4 touros
nelores e 4 touros cruzados foram colocados junto às fêmeas em cada curral, permanecendo por
22 dias. No dia 21 os touros foram retirados de ambos os tratamentos. Os animais foram observados
durante o PM, e somente as fêmeas que receberam monta efetiva foram mantidas no experimento.
O diagnóstico de gestação (DG) foi realizado por ultra-sonografia 27 dias após a retirada dos
touros. A TC foi analisada por regressão logística, por meio dos procedimentos LOGISTIC do
SAS. Foram incluídos no modelo os efeitos das variáveis: tratamento, fase (fase 1, do dia 0 ao
dia 10 e a fase 2, do dia 11 ao dia 21) e interação fase x tratamento, e das co-variáveis ganho de
peso médio diário (GMD) e ECC. Foi detectada tendência (P=0,077) de efeito de tratamento na
TC (TA=65,7 vs TB=76,1%). Não houve efeito de fase e da interação fase x tratamento. O GMD
não foi diferente entre TA e TB, porém foi detectado efeito linear (P<0,05) de GMD na TC. Não
foi detectado efeito de ECC (P>0,10) na TC. Em conclusão, dieta com maior densidade nutricional
influenciou negativamente a concepção.
Palavras-chave: ingestão de matéria seca, taxa de concepção, progesterona, fêmea bovina.
s419
TAXAS DE PRENHEZ EM VACAS DE CORTE TRATADAS COM DISPOSITIVO

INTRAVAGINAL DE PROGESTERONA (CIDR)
Valarelli, R.L.1; Barbarini, O.1; Vasconcelos, J.L.M.2
1
Laboratórios Pfizer, São Paulo-SP, Brasil, 2 DPA–FMVZ-UNESP, 18618-000, Botucatu-SP,
Brasil. vasconcelos@fca.unesp.br
Em 2005 foi desenvolvido um protocolo para sincronização de ovulação de vacas de corte

(Meneghetti et al. 2005. A Hora Veterinária 147: 25-27). Esse protocolo proporcionou taxa de
concepção de 50,6% na inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e consistia em: D0 – inserção
de um dispositivo intravaginal de P4 (CIDR, Pfizer) associado à aplicação de 2 mg de benzoato
de estradiol (2 mL, IM, Estrogin, Farmavet). No D7 foi administrado 12,5 mg de dinoprost
trometamina (2,5 mL, IM, Lutalyse, Pfizer). Quarenta e oito horas após, no D9, o CIDR foi
retirado, foi aplicado 0,5 mg de cipionato de estradiol (0,25 mL, IM, ECP, Pfizer) e os bezerros
foram separados das mães até o término da IATF, que foi realizada 48 horas após a retirada do
CIDR. Esse estudo teve como objetivo validar o protocolo supracitado. Os dados de 7527 vacas
de corte, sincronizadas com esse protocolo durante a estação de monta 2005/2006, foram
analisados por regressão logística. A taxa de concepção na IATF foi de 48,9% (3681/7527) e foi
influenciada (P<0,001) pelas variáveis categoria, raça e escore de condição corporal (ECC). A
taxa de concepção diferiu entre vacas secas, primíparas e multíparas, sendo de 39,4% (137/348),
46,3% (937/2022) e 50,5% (2607/5157), respectivamente. Vacas cruzadas (½Bos taurus / ½Bos
indicus) apresentaram maior taxa de concepção quando comparado a vacas Bos taurus e vacas
Nelore [62,3% (964/1547), 53,0% (150/283) e 45,1% (2567/5697)]. Vacas com menor ECC
mostraram menor taxa de concepção na IATF [ECC 2,5: 41,9% (687/1638); ECC 2,75: 50,3%
(831/1653); ECC 3,0: 49,4% (1006/2035); ECC 3,25: 49,2% (386/785); ECC 3,5: 54,5% (771/
1416)]. O número de vezes que o dispositivo CIDR havia sido utilizado anteriormente (0 vs 1 vs
2) não afetou a taxa de concepção na IATF. Esses resultados validam o protocolo para sincronização
de ovulação em vacas de corte e fatores como categoria, raça e ECC devem ser levados em
consideração antes de se implementar um programa de IATF em vacas de corte.
s420
COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE

SÊMEN FRESCO DE JUMENTO (Equus asinus) PARA INSEMINAÇÃO
ARTIFICIAL DE JUMENTAS
Oliveira, J.V.1; Papa, F.O.2; Alvarenga, M.A.2; Carmo, M.T.2; Araújo, G.H.M.2; Santos,J.F.1
1
Pólo Regional de Desenvolvimento Tecnológico da Alta Mogiana - Colina (SP)
2
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária–FMVZ/UNESP, Botucatu-SP
victor@colina.com.br
O uso de sêmen para inseminação artificial (IA) em éguas foi de grande impacto na indústria
eqüina. Um número entre 100x106 até 1x109 de células espermáticas viáveis tem sido sugerido
para uso na espécie eqüina. No entanto não há relatos sobre estudos da concentração ideal de
espermatozóides para a IA de jumentos. Assim este ensaio visou avaliar o efeito da dose
inseminante de sêmen de jumento sobre a fertilidade de jumentas e éguas onde foram comparadas
as seguintes doses inseminantes; 500x106 e 1x109 de espermatozóides viáveis em jumentas e
500x106 em éguas. Todos os animais envolvidos neste ensaio pertencem ao plantel do Pólo
Regional da Alta Mogiana - Colina (SP). Foram utilizadas, 15 éguas (G1= 15 ciclos estrais), das
raças Mangalarga, Brasileiro de Hipismo e Bretã inseminadas com 500x106 de espermatozóides
(sptz) de jumento viáveis, o mesmo asinino foi utilizado em 14 jumentas da raça Brasileiro. As
jumentas foram distribuídas em 2 grupos (G2 e G3 = 15 ciclos estrais cada) inseminadas
respectivamente com 1x109 e 500x106 de sptz viáveis. As idades variaram entre 6 e 18 anos e
todos os animais possuíam fertilidade comprovada. O sêmen foi colhido, a cada 48 horas, e as
amostras obtidas de cada colheita tiveram os seguintes valores. Volume: 77 ± 25 mL; motilidade
total e progressiva 75,4 ± 4,9 e 34,3 ± 7,3 % respectivamente; para vigor 4,3 ± 0,6; concentração
espermática 214 ± 64x106 /mL e integridade da membrana plasmática (choque hipo-osmótico)
82,7± 3,9 %. Após a colheita, o sêmen era processado para que cada dose inseminante contivesse
500x106 ou 1x109 de espermatozóides viáveis em um volume de 15 mL contendo diluente Botu-
Sêmen®. Quando um folículo de 33 mm de diâmetro era detectado por exames diários (palpação
e ultra-sonografia transretal) as fêmeas eram inseminadas no corpo uterino com as doses
correspondentes aos seus grupos, a cada 48 horas até ovulação. Os diagnósticos de gestação
foram realizados com ultra-som a partir dos 14 dias após a ovulação. Aplicou-se o teste exato de
Fisher para evidenciar diferenças estatísticas entre as taxas de gestação dos diferentes grupos ao
nível de significância de 0,05. A análise dos dados demonstrou que o índice de fertilidade de
éguas inseminadas com 500 milhões de sptz de jumento (G1- 14/15-93%) não diferiu (p>0,05)
dos índices obtidos em jumentas inseminadas com 1 bilhão de sptz do mesmo reprodutor (G2 -
11/15-73%). Contudo foi observada uma tendência (p=0.08) de decréscimo de fertilidade (G3 -
6/15-40%), em jumentas inseminadas com 500 milhões de sptz quando comparado com a dose
inseminante de 1 bilhão de sptz . A análise dos dados demonstram que a concentração espermática
usada para inseminação com sêmen fresco de asinino em jumentas, necessita ser maior que a
usada em éguas para se alcançar taxa de prenhez semelhante entre as duas espécies, sugerindo
existir alguma particularidade na jumenta que necessita ser melhor estudada.
s421
SINCRONIZAÇÃO DA OVULAÇÃO DE BÚFALAS MURRAH TRATADAS COM

DISPOSITIVO INTRAVAGINAL (CRONIPRESS) ASSOCIADO OU NÃO AO eCG
EM DUAS ESTAÇÕES REPRODUTIVAS DISTINTAS
Del Rei, A.J.1; Bartolomeu, C.C.2; Neves, A.L.A.1; Balbino, S.C.1;

Oliveira, L.C.1; Álvares, C.T.3
1
Centro Biotecnológico de Reprodução Animal, CBRA, DTRA, UESB, Itapetinga-BA, 45
700-000, Brasil delrei@uesb.br, 2 UFRPE/UAG – Garanhuns-PE, 3 UESC – Ilhéus – BA.
O objetivo do presente estudo foi verificar a eficiência de um protocolo de progesterona

(Cronipress Biogenesis, Paraná, Brasil) associado ou não ao eCG para sincronização da ovulação
em búfalas Murrah em duas estações reprodutivas distintas (outono-inverno e primavera-verão)
empregando-se a técnica da inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Para tanto, utilizou-se
84 búfalas com idade media de 8,2 ± 1,3, pesando 490,8 ± 6,4 kg e escore de condição corporal
(BCS) acima de 3,5 escala de 1 a 5 (1 = magra e 5 = gorda) e pós-parto entre 50 e 90 dias. As
búfalas foram distribuídas aleatoriamente nos grupos. O experimento 1 foi realizado durante a
estação reprodutiva favorável (março a abril de 2005; n = 42) enquanto o experimento 2 foi
realizado fora da estação reprodutiva favorável (setembro a dezembro de 2005; n = 42). No
experimento 1 em dia aleatório do ciclo estral os animais foram divididos em dois grupos (G1, n
= 21 e G2; n = 21). Todos os animais foram tratados com dispositivo intravaginal contendo 1g de
progesterona (Cronipress) e 2mg de benzoato de estradiol (BE; Estrogin, Farmavet – SP, Brazil)
via intramuscular (IM). Após oito dias (D8), por via IM, foram administradas 500μg de
cloprostenol sódico (Ciosin, Shering Plough – Coopers, SP – Brasil) e foi removido o dispositivo
intravaginal. Vinte e quatro horas após a remoção do dispositivo, os animais foram tratados com
0,75mg de BE intramuscular e 30 a 36 hora mais tarde, todos os animais foram inseminados
artificialmente em tempo fixo. No grupo G2 foi adicionado ao protocolo 500 UI de eCG
intramuscular (Novormon – Syntex, Argentina) no momento da remoção do dispositivo vaginal.
O experimento 2 composto por dois grupos (G3; n =21 e G4; n = 21) foi empregada a mesma
metodologia do experimento 1. No experimento 1 a taxa de concepção no G2 foi de 47,6% (10/
21) e no G1 42,9% (9/21; P > 0,05; Qui-Quadrado). No experimento 2, a taxa de concepção do
G4 foi maior que no G3 57.1% (12/21) e 14.3% (3/21), respectivamente (P< 0.05; Qui-Quadrado).
Como pode ser observado, as búfalas apresentaram uma resposta satisfatória à sincronização da
ovulação para IATF durante a estação reprodutiva favorável. Entretanto, quando a sincronização
da ovulação foi realizada na estação reprodutiva desfavorável foi obtida baixa taxa de concepção
quando não empregado o eCG no protocolo hormonal.
Palavras Chave: IATF, Sincronização, Búfalas.
s422
EFEITO DE DIFERENTES PROTOCOLOS SOBRE A TAXA DE PRENHEZ DE

VACAS NELORE INSEMINADAS EM TEMPO FIXO
Câmara, D.R.1; Figueira, R.F.1; Mendonça, L.B.R.2; Pinto, L.C.3;

Mello, M.M.C.3; Paiva, D.S.2
1
Curso de Medicina Veterinária CESMAC – Maceió, AL. 2Médico Veterinário Autônomo.
3
Acadêmicos de Medicina Veterinária CESMAC – Maceió, AL.
diogocamara1979@hotmail.com
Diversos protocolos hormonais vêm sendo utilizados visando minimizar os prejuízos causados
por falhas de detecção do estro nos rebanhos bovinos. Para tal, procedimentos que permitam a
inseminação artificial em tempo fixo (IATF) apresentam-se como forma patente de contornar
esse entrave. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de diferentes protocolos hormonais
sobre a taxa de prenhez de vacas Nelore, submetidas a apenas uma inseminação em tempo fixo,
independente da manifestação de sinais clínicos de estro. Foram utilizadas 40 vacas, com condição
corporal entre 2,5 e 3 (1-5), entre 60 e 120 dias após o parto. As vacas incluídas no experimento,
foram previamente avaliadas por ultra-sonografia (Scanner 450, Pie Medical, Brasil), e apenas
aquelas que apresentaram corpo lúteo (CL) ou, quando na ausência do mesmo, ao menos um
folículo ≥ 10 mm de diâmetro. Os animais foram divididos por amostragem não probabilística
por conveniência, de forma que a condição corporal média de cada grupo fosse equivalente, nos
seguintes tratamentos: Grupo 1 (n=15) - 530µg de PGF2α (Ciosin®, Schering Plough, Brasil) dia
0, 530µg de PGF2α dia 11 e 50µg de Fertirelina (Fertigen®, Schering Plough, Brasil) dia 13.
Grupo 2 (n=12) - 275µg de PGF2α dia 0, 275µg de PGF2α dia 11 e 25µg de Fertirelina dia 13.
Grupo 3 (n=13) - 275µg de PGF2α dia 0, 275µg de PGF2α dia 11 e 50µg de Fertirelina dia 13.
Imediatamente antes da última aplicação de Fertirelina foi mensurado por ultra-sonografia o
diâmetro do maior folículo. Todas as fêmeas foram inseminadas pelo mesmo técnico ao longo de
todo o experimento entre 12 e 16 horas após a administração da última dose de Fertirelina. O
diagnóstico de gestação foi realizado por ultra-sonografia entre 45 e 60 dias pós-inseminação. O
diâmetro do maior folículo (média±DP) para os Grupos 1 (1,22±0,23), 2 (1,02±0,37) e 3
(1,09±0,33), quando submetidos à análise de variância não diferiram estatisticamente (p>0,05).
As taxas de prenhez foram de 40% (6/15); 50% (6/12) e 30,7% (4/13) para os Grupos 1, 2 e 3,
respectivamente, também não apresentando diferença estatística após análise de proporção
(p>0,05). A avaliação do diâmetro médio dos folículos permite confirmar a capacidade de todos
os protocolos de induzir ao crescimento de um folículo apto à ovulação, passível de ser
influenciado pela Fertirelina, quando da utilização de vacas cíclicas. Entretanto, estudos devem
ser realizados com a utilização de maior número de animas, de forma a minimizar a margem de
erro quando da redução das concentrações hormonais administradas.
AGRADECIMENTOS: Schering Plough, Brasil.
s423
EFEITO DE DIFERENTES DOSES DE FERTIRELINA PARA A INDUÇÃO DA

OVULAÇÃO EM PROTOCOLOS PARA A INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL A TEMPO
FIXO DE VACAS CORTE COM CRIA AO PÉ
Oliveira, G.R.; Ogando, P.P.; Bacchin, A.B.; Borges, J.B.S.
Unidade de Reprodução de Bovinos, Faculdade de Veterinária, UFRGS, Porto Alegre-RS,

Brasil. joao.borges@ufrgs.br
O uso de protocolos de indução, sincronização de estros e ovulações para a inseminação artificial

a tempo fixo (IATF) em vacas de corte com cria ao pé permite intensificar os programas de
melhoramento genético de rebanhos de corte graças à concentração do manejo e a eliminação da
necessidade de detecção de estros. Nos protocolos que utilizam o Benzoato de estradiol (BE)
para indução da ovulação após o tratamento com dispositivos intravaginais contendo Progesterona,
é necessário manejar as vacas em quatro ocasiões no centro de manejo, o que representa estresse
para os animais e mais tempo para execução do programa. A aplicação de um agonista do GnRH,
como a Fertirelina, no momento da IATF permite sincronizar a ovulação das vacas tratadas,
reduzindo um manejo neste programa. Este experimento teve como objetivos avaliar as doses de
50 e 100mcg de Acetato de Fertirelina (Fertigen, Schering-Plough-Coopers, Brasil) IM, no
momento da IATF, para indução da ovulação e comparar as taxas de prenhez após a IATF. Foram
utilizadas 78 vacas Aberdeen Angus, entre 50 e 90 dias pós-parto, com escore de condição corporal
de 2,7±0,1 (escala de 1 a 5), mantidas em campos naturais na região da Campanha do Rio Grande
do Sul. No dia 0, todas vacas receberam uma injeção de 2mg de Benzoato de Estradiol (Estrogin,
Farmavet, Brasil) IM, e um dispositivo intravaginal (DIB, Syntex, Argentina) com 1g de
Progesterona por 7 dias. No dia 7, os dispositivos foram retirados e aplicou-se 250 mcg de
Cloprostenol Sódico (Ciosin, Schering-Plough-Coopers, Brasil) IM, e os terneiros foram separados
das vacas até a IATF 52 a 56 horas depois. No momento da IATF, as vacas receberam 50mcg
(G50, n= 39) ou 100mcg (G100, n= 39) de Acetato de Fertirelina IM. As vacas foram inseminadas
com sêmen de qualidade previamente avaliada de um touro Aberdeen Angus. O crescimento
folicular e a taxa de ovulação (G50 n= 10 e G100 n= 10) foram determinados por meio de ultra-
sonografia (Aloka SSD 210, 5MHz, Japão,) com intervalos de 12 horas entre a retirada do
dispositivo intravaginal até 24 horas após a IATF. O diagnóstico de prenhez foi realizado 45 dias
após a IATF por ultra-sonografia. Os diâmetros foliculares no momento da IATF foram comparados
por análise de variância e as taxas de ovulação e de prenhez por qui-quadrado. Os diâmetros dos
folículos pré-ovulatórios (12,5±0,1mm e 11,5±0,1mm) e as taxas de ovulação (90% e 80%) não
diferiram (p>0,05) entre os grupos C50 e C100, respectivamente. As taxas de prenhez foram de
53,8% (21/39) para G50 e de 46,1% (18/39) para G100, não apresentando diferença estatística
(p>0,05). De acordo com os resultados, é possível utilizar uma dose de 50mcg de Fertirelina no
momento da IATF para indução da ovulação em vacas de corte tratadas com BE e Progesterona,
reduzindo o manejo dos animais sem comprometer a taxa de prenhez .
Agradecimentos: Schering-Plough-Coopers
s424
AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OSMÓTICO EM ESPERMATOZÓIDES DE

GARANHÕES EXPOSTOS A SOLUÇÕES HIPERTÔNICAS DE DIFERENTES
CRIOPROTETORES
Medeiros, A.S.L.; Papa, F.O.; Araujo, G.H.M.; Freitas, C.P.; Alvarenga, M.A.

SP, 18618-000, Brasil. malvarenga@fmvz.unesp.br
O estresse osmótico induzido aos espermatozóides durante o processo de criopreservação é um

dos principais fatores que comprometem a viabilidade espermática.Os agentes crioprotetores
desempenham um importante papel na indução do dano osmótico que é dependente de sua
permeabilidade celular. Trabalhos recentes evidenciaram efeitos nocivos do glicerol em função
da sua baixa permeabilidade em espermatozóides de garanhões (Ball e Vo; Journal of Andrology,
v.22, p.1061-69, 2001).O presente estudo objetivou avaliar a viabilidade dos espermatozóides
de garanhões submetidos ao estresse osmótico com soluções hipertônicas dos crioprotetores a
base de amidas Dimetilacetamida (DA), Metilformamida (MF), Dimetilformamida (DF) e Glicerol
(GL) na concentração de 1 Molar. Utilizou-se 10 garanhões (2 ejaculados). O sêmen foi
centrifugado (600xg/10 minutos), os pellets ressuspendidos nas soluções de crioprotetores e
incubados por 10 minutos, em seguida realizou-se uma rediluição de 6:1 para retorno a
osmolaridade normal (isoosmolaridade). Avaliações da Motilidade total computadorizada (CASA)
e integridade de Membrana foram realizadas antes da indução do estresse osmótico (controle),
após a incubação nas soluções de crioprotetores e após a rediluição na solução de 300 mOsm.
(condição de isoosmolaridade). Durante o período de incubação nas soluções hipertônicas
observou-se uma queda na Motilidade Total (12,93±15,22d; 61,53±16,17b; 44,67±22,68c;
41,73±24,28c, DA, MF, DF e GL respectivamente) em relação ao controle (81,4±9,15a) sendo
esta queda mais evidente na solução de DA (p<0,0001). Para o parâmetro integridade de membrana
observou-se uma queda nas soluções de DA, MF, DF e GL (48,47±9,49bc, 49,20±8,47bc,
53,07±12,04b, 42,33±12,15c respectivamente) em relação ao controle (61,87±13,62a), sendo mais
acentuada para o tratamento GL (p<0,0001). Quando expostos a condição de isoosmolaridade
(300 mOsm) os espermatozóides previamente incubados com os crioprotetores á base de amidas
apresentaram uma Motilidade Total superior (p<0,0001) ao glicerol (66,33±15,03b, 72,8±11,43b,
66,73±13,44b, 43,33±24,56c DA, MF, DF e GL respectivamente). Em relação à integridade de
membrana também se observou uma superioridade dos tratamentos amidas (p<0,0001) em relação
ao glicerol (37,67±9,47 b, 40,47±8,47 b, 38,13±1,65 b, 22±13,49 c DA, MF, DF e GL
respectivamente).Os resultados deste experimento nos permite concluir que sob estresse osmótico
os crioprotetores a base de amidas foram superiores ao glicerol em preservar a motilidade e a
integridade de membrana dos espermatozóides de garanhões. Pode mos hipotetizar que a menor
viscosidade dos crioprotetores a base de amidas associado ao menor peso molecular, quando
comparado ao glicerol, permiten uma melhor permeabilidade destes através da membrana
plasmática induzindo conseqüentemente a um menor dano osmótico.
Agradecimento: FAPESP
s425
EFEITO DO MÊS DE PARIÇÃO NA TAXA DE PRENHEZ DE VACAS DE CORTE

INSEMINADAS EM TEMPO FIXO
Penteado, L.1; Marques, M.O.3; Silva, R.C.P.3; Ayres, H.2; Souza, A.H.2; Baruselli, P.S.2
1
São Paulo-SP, Brasil. 3GERAEMBRYO, Cornélio Procópio-PR, Brasil.
luciano@grupomassa.com.br ou barusell@usp.br
No Brasil, as propriedades de gado de corte tem como objetivo concentrar os nascimentos no

início do período de parição (julho/agosto), uma vez que os animais apresentam maior desempenho
reprodutivo (menores intervalos entre partos, maiores taxa de concepção, maior taxa de ciclicidade,
entre outros) além de proporcionar bezerros com maior peso à desmama. Com base nestes dados
foi realizado um estudo retrospectivo para avaliar o efeito do mês do parto na taxa de concepção
de vacas vacas (Bos indicus e Bos indicus x Bos taurus) lactantes. Neste estudo foram utilizadas
7.879 vacas lactantes com período pós-parto entre 50 e 70 dias localizadas em propriedades no
município de Brasilândia e de Ribas do Rio Pardo (MS). Em dia aleatório do ciclo estral (D0)
todos os animais receberam um implante auricular de Norgestomet (Crestar®, Intervet, Brasil),
previamente utilizado por 9 dias, associado a 2 mg de Benzoato de estradiol, IM. Após 8 dias
(D8), o implante auricular foi removido e administrado 300 UI de eCG (Folligon®, Intervet,
Brasil) e 0,15mg de D-Cloprostenol (PGF2α, Preloban®, Intervet,Brasil). Todos os animais foram
inseminados entre 54 e 58h após a retirada do implante. O diagnóstico de gestação foi realizado
por ultra-sonografia 55 dias após a IATF. Os animais foram divididos de acordo com o mês em
que ocorreu o parto. No Grupo 7-9 (n=1.840) as vacas pariram entre os meses de julho e setembro,
no Grupo 10 (n=1.586) no mês de outubro, no Grupo 11 (n=2.302) no mês de novembro e no
Grupo 12 (n=2.151) entre os meses de dezembro de 2005 e janeiro de 2006. As possíveis interações
foram avaliadas pelo teste de ANOVA do SAS for Windows e não foram verificados efeitos de
local e raça. As taxas de prenhez foram analisadas pelo teste de Qui-quadrado. Os resultados
foram: Grupo 7-9, 58,26% (1072/1840)a, Grupo 10, 54,16% (859/1586)b, Grupo 11, 51,61%
(1188/2302)b, Grupo 12, 46,95 (1010/2151c, p<0,05). Os resultados são indicativos de que os
animais que parem antecipadamente apresentaram maiores taxa de concepção à IATF.
s426

COM DISPOSITIVO INTRAVAGINAL DE PROGESTERONA ASSOCIADO A
DIFERENTES MOMENTOS DE APLICAÇÃO DO BENZOATO DE ESTRADIOL E
DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO
Martins, C.M.1; Mello, J.E.1; Dominguez, J.H.1; Ayres, H.1; Souza, A.H.1; Baruselli, P.S.1
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ/USP, CEP 05508-000, São Paulo-SP, Brasil.
cmmartins@usp.br ; barusell@usp.br
Objetivou-se avaliar a taxa de concepção de vacas Nelore (Bos indicus) lactantes tratadas com
dispositivo intravaginal de progesterona (P4; DIB, Syntex, Brasil), associado à diferentes
momentos de administração do benzoato de estradiol (BE; Dia 8 vs Dia 9) e da inseminação
artificial em tempo fixo (IATF; 48 vs 54h da retirada do dispositivo). Um total de 504 fêmeas
paridas (60-90 dias pós-parto) pertencente a duas propriedades no estado do Mato Grosso do Sul
receberam no Dia 0 um dispositivo vaginal de P4 associado a 2mg de BE, i.m.(RIC-BE, Syntex,
Argentina). No Dia 8, realizou-se a remoção do DIB, a administração de uma dose de PGF2α
(Prolise, Syntex, Argentina) e 400UI de eCG (Novormon, Syntex, Argentina). As fêmeas foram
distribuídas homogeneamente de acordo com o escore de condição corporal e o período pós-
parto em quatro grupos: o Grupo BE8IATF48 (n=119) recebeu 1 mg de BE (i.m), no momento
da retirada do dispositivo de P4 e foram inseminadas 48 horas após; o Grupo BE8IATF54 (n=134)
recebeu 1 mg de BE (i.m), no momento da retirada do dispositivo de P4 e foram inseminadas 54
horas após; Grupo BE9IATF48 (n=126) recebeu 1 mg de BE (i.m) 24 horas após a retirada do
dispositivo de P4 e foram inseminadas 48 horas após; o Grupo BE9IATF54 (n=125) recebeu 1
mg de BE (i.m) 24 horas após a retirada da P4 e foram inseminadas 54 horas após. O diagnóstico
de gestação foi realizado por ultra-sonografia aos 30 dias após a IATF. Foi verificado que não
houve interação entre as propriedades e os resultados foram analisados pelo teste de Qui-quadrado.
Foram observadas as seguintes taxas de concepção: Grupo BE8IATF48, 58,8% (70/119ª); Grupo
BE8IATF54, 34,3%, (46/134b); Grupo BE9IATF48, 58,7%, (74/126ª) e Grupo BE9IATF54,
63,2%, (79/125ª; a‘“b, p<0,05). O tratamento com Benzoato de estradiol como indutor de ovulação
24 horas após a retirada do DIB, possibilita a realização da inseminação artificial entre 48 e 56
horas da retirada do dispositivo, permitindo com que a IA seja realizada durante todo o dia
racionalizando o manejo para o emprego dessa biotecnologia.
Agradecimento: Tecnopec
s427
PROTOCOLOS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO PARA VACAS

MESTIÇAS LEITEIRAS
Cardoso, B.L.; Pescara, J.B.; Vasconcelos, J.L.M.
DPA – FMVZ - UNESP, Botucatu-SP, Brasil 18618-000

Diferentes protocolos de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) têm sido utilizados em
vacas mestiças leiteiras mantidas a pasto. Em primíparas e nas multíparas em anestro tem sido
indicado o protocolo Ovsynch com dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR®) e nas
multíparas ciclando o HeatSynch com CIDR® (Garcia, 2003; Dissertação – FMVZ, UNESP).
Protocolos que iniciam com aplicação de benzoato de estradiol (BE) e CIDR® têm alcançado
boas taxas de prenhez em rebanhos zebuínos (Meneghetti, Acta Scientiae Veterinariae, v.33,
p.256). A utilização do cipionato de estradiol (ECP) para sincronizar a emergência de nova onda
folicular pode ser uma opção ao BE e foi utilizada com sucesso em novilhas holandesas e vacas
Nelore paridas. O objetivo deste experimento foi avaliar a concepção em vacas mestiças a pasto
tratadas com diferentes protocolos de IATF. Foram utilizados dados de 2354 inseminações
realizadas no ano de 2005, de vacas mestiças Holandês-Zebu, da Faz São Pedro, Fernandópolis,
São Paulo. Os tratamentos foram: G1 (n=1134): IA 12hs após detecção do estro; G2 (n=46):
aplicação de PGF2á (Lutalyse®, 25mg) e IA 12hs após detecção do estro; G3: (n=411) todas as
primíparas e as multíparas sem presença de CL no dia 0: GnRH (Fertagyl®, 100mcg) mais
dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR®, 1,9g), após seis dias foi feita a remoção do
dispositivo junto com a aplicação de PGF2á (Lutalyse®, 25mg). Após quarenta e oito horas foi
realizada nova aplicação de GnRH (Fertagyl®, 100mcg), e IATF realizada doze horas após a
segunda aplicação de GnRH; G4: (n= 390) multíparas com presença de CL no dia 0: GnRH
(Fertagyl®,100 mcg) e dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR®), seis dias depois houve
remoção do CIDR junto com a aplicação de PGF2á (Lutalyse®, 25mg). Vinte e quatro horas
depois os animais foram tratados com cipionato de estradiol (E.C.P. ®, 1,0mg) e 48 horas após
aplicação de E.C.P.® as vacas que não apresentaram cio foram submetidas à IATF. As vacas que
apresentaram cio foram inseminadas 12h após a detecção do cio; G5 (n=373) vacas com e sem
presença de CL: D0 – inserção de um dispositivo intravaginal de P4 (CIDR®, Pfizer) associado
à aplicação de cipionato de estradiol (E.C.P.®, 2 mg). No D7 foi administrado PGF2á (Lutalyse®,
25mg). Quarenta e oito horas após, no D9, o CIDR® foi retirado e foi aplicado cipionato de
estradiol (ECP®, 1,0mg). A IATF foi realizada 48 horas após a retirada do CIDR®. A presença de
CL no inicio do protocolo e o diagnóstico de gestação aos 30 dias após a IATF foram determinados
por ultra-sonografia. As taxas de concepção foram de 41,2% (467/1134), 37,0% (17/46), 29,4%
(121/411); 32,1% (125/390) e 35,7% (133/373), respectivamente. A concepção dos animais em
sem e com CL no dia 0 do G5 foi de 36,8% (70/190) e 34,4% (63/183), respectivamente.A
relação da concepção dos animais sincronizados em relação a concepção do grupo controle (IA
pós cio) foi de 89,6% (36,96/41,18) no G2, de 71,5% (29,44/41,18) no G3, de 77,8% (32,05/
41,18) no G4 e de 86,6% (35,67/41,18) no G5. Estes resultados mostram que a técnica de IATF
permite manter uma boa relação com a concepção normal da fazenda, em animais ciclando, de
75 a 85% e de animais em anestro, de 70 a 85%.
s428
EFICIENCIA NA RE-UTILIZAÇÃO DO IMPLANTE DE NORGESTOMET

(CRESTAR®) EM UM PROGRAMA DE IATF EM VACAS DE CORTE.
Oliveira, E.R.1; Fernandes, C.A.C.1,2; Paiva, F.M.3; Gioso, M.M.2; Vasconcelos, T.D.1
1
Biotran Ass. e Consult. em Reprod. Animal LTDA. Rua Tatuin 93 Res. Teixeira 37130-000.
2
Unifenas, Alfenas – MG. 3 Intervet do Brasil. eduardo@biotran.com.br
A inseminação artificial em tempo fixo (IATF) visa eliminar os trabalhos de observação de estro
durante o protocolo, concentrar as atividades nas propriedades e facilitar o manejo reprodutivo
em rebanhos de corte e leite. Outra vantagem seria a indução de ciclicidade ovariana em animais
pré-puberes e pós-parto diminuindo, assim, o período de serviço e por conseqüência o intervalo
de partos (IEP), melhorando a eficiência reprodutiva. Um dos problemas relacionados aos
protocolos é o elevado custo dos produtos utilizados para esta finalidade. O objetivo deste
trabalho foi analisar a eficiência da reutilização do implante auricular a base de Norgestomet
sobre as taxa de gestação pós Inseminação em Tempo Fixo (IATF). Foram utilizadas 174 vacas
multíparas sendo 122 animais da raça Nelore e 52 da raça ½ Angus ½ Nelore, com media de 69
dias pós-parto e escore corporal 2,5 – 3,0 (escala de 1 – 5). Os animais foram aleatoriamente
distribuídos em dois protocolos: Tratamento 1 (n=66): no dia zero aplicação do implante auricular
com Norgestomet (Crestar® - Intervet - Brasil) e administração intramuscular de 2ml de Valerato
de Estradiol e Norgestomet (fração injetável do Crestar®); no dia nove houve a retirada do implante
e a aplicação de 400 UI de eCG (Folligon® - Intervet - Brasil); dia 11 aplicação de análogo ao
GnRH (Gonadorelina, Fertagil® – Intervet - Brasil) e 12 horas após esta última administração foi
realizada a IA. Tratamento 2 (n=108): dia zero aplicação do implante auricular re-utilzado (uma
vez) com Norgestomet (Crestar® - Intervet – Brasil) e 2ml de Benzoato de Estradiol (Estrogin®);
dia 8 retirou-se o implante, administrou 400 UI de eCG (Folligon® - Intervet – Brasil) e 2ml de
um análogo a PGF2á (Prelobam® - Intervet – Brasil); dia 9, administrou-se 1 ml de Benzoato de
Estradiol (Estrogin®) e a IA foi realizada às 24 horas após a ultima aplicação hormonal. Os
animais foram encaminhados a piquetes específicos até que fosse realizada a avaliação ultra-
sonográfica para diagnostico de gestação aos 30 dias após a IATF. Os dados das taxas de gestação
no primeiro e segundo tratamentos foram submetidos ao teste de qui-quadrado. A média geral de
taxa de gestação foi de 71,26% e não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos (68,18% e
73,15% para os tratamentos 1 e 2, respectivamente). Em conclusão, estes dados demonstraram a
eficiência da re-utilização do implante de Norgestomet (Crestar® - Intervet – Brasil), não
apresentando comprometimento nos resultados finais dos programas de IATF reduzindo, assim,
o custo final deste protocolo.
s429
s430
Resumos:
Produção in vitro de Embriões
s431
s432
BLOQUEIO DO POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL EM EMBRIÕES

BOVINOS IN VITRO
Mesquita, L.G.; Cortezzi, S.S.; Ripamonte, P.; De Bem, T.H.C.; Porciuncula, P.M.;
Merighe, G.K.F; Balieiro, J.C.C.; Leal, C.L.V.; Meirelles, F.V.
Departamento de Ciências Básicas, Universidade de São Paulo, Pirassununga, São Paulo,

Brasil, 13635-900. ligiagmesquita@yahoo.com.br
A mitocôndria tem papel fundamental no processo de morte celular programada (MCP) mediante
liberação do citocromo C e fator indutor de apoptose (AIF), que ativam pró-caspases 2, 3 e 9. A
diferença de potencial da membrana mitocondrial interna (Ømm) é um parâmetro de controle
central da respiração mitocondrial, síntese de ATP, acúmulo de cálcio e geração de espécies
reativas de oxigênio. Acredita-se que o Ømm possa estar ligado ao aparecimento da fragmentação
nuclear, já que ambos processos têm início no mesmo período, embora ainda não se possa
determinar se mudanças no Ømm são causa ou a conseqüência do processo de fragmentação. O
presente trabalho objetivou estudar o efeito da antimicina A, agente inibidor do 3° complexo
respiratório, sobre o Ømm e fragmentação do DNA. Oócitos foram coletados de ovários de
vacas abatidas e submetidos a maturação em meio TCM 199 suplementado com sais de Earles
com 10% SFB, piruvato, FSH, LH e 17â estradiol por 22h. Após a maturação, os oócitos foram
fertilizados em meio TALP suplementado com heparina, piruvato, BSA e solução de PHE por 18
horas e cultivados em meio SOF suplementado com 10% SFB à 20% de O2. Decorridas 48 horas
pós inseminação (hpi), foi realizado o feeding dos embriões com antimicina A na concentração
de 500çM. Após 80hpi, os embriões com 8 células foram submetidos a coloração de JC-1 (1mg/
ml) durante 50 minutos, a fim de avaliar o Ømm utilizando microscópio de fluorescência. Neste
mesmo momento, os embriões foram fixados e submetidos à técnica de TUNEL para detecção
da fragmentação do DNA. Para nossa surpresa, a antimicina A (500çM) não foi capaz de reduzir
Ømm mas aumentou o número de blastômeros JC-1 positivos (100% dos embriões foram positivos
para a técnica de JC-1 quando comparados a 84,58% do grupo não tratado-controle). Entretanto,
o grupo tratado apresentou maior fragmentação em relação ao controle (28,24 e 5,77%
respectivamente, p<0,05). Estes resultados sugerem que a antimicina A apresenta singularidades
em seu modo de ação em embriões bovinos possivelmente por competir com o receptor de BcL-
xL, ativando assim, o processo de morte celular programada.
Apoio Financeiro: FAPESP-Brasil
s433
MATURAÇÃO IN VITRO DE OVÓCITOS OBTIDOS DE VACAS NELORE (Bos

taurus indicus) COM E SEM FOLÍCULO DOMINANTE – RESULTADOS PARCIAIS
Leal, L.S.1; Fernandes, C.B.1; Melo, D.S.1; Assaf, S.S.1; Oba, E.1; Landim-Alvarenga, F.C.1
1
SP, 18618-000, Brasil. lu_s_leal@yahoo.com.br
Um melhor aproveitamento do potencial reprodutivo de uma fêmea requer a compreensão mais

ampla dos mecanismos que controlam o crescimento e o desenvolvimento folicular. Diversos
pesquisadores têm realizado estudos para determinar a função de eventos e fatores envolvidos na
maturação nuclear e citoplasmática dos ovócitos. O objetivo deste trabalho foi comparar os
resultados da maturação in vitro dos ovócitos entre dois grupos de vacas Nelore (Bos taurus
indicus): com e sem folículo dominante, para avaliar se a presença do folículo dominante interferiu
na maturação in vitro dos ovócitos subordinados. Para isto, foram colhidos ovários de vacas
Nelore no matadouro-frigorífico Frigol, Lençóis Paulista – SP. Os ovários foram transportados
em solução salina (NaCL 0,9%) a 36ºC até o laboratório de Fertilização In Vitro (FMVZ - UNESP
– Botucatu). Estes foram avaliados por meio de ultra-sonografia (transdutor de 5 MHz - Aloka
500, Japão) para determinar a presença e o tamanho do folículo dominante. Folículos e” 6,5 mm
foram considerados dominantes. Os ovócitos foram obtidos por meio da aspiração dos folículos
com diâmetro entre 2 e 6 mm e somente os ovócitos grau I foram adicionados ao meio de maturação
(199 e 203 ovócitos grau I para os grupos sem e com folículo dominante, respectivamente). O
meio de maturação utilizado foi composto de TCM 199 suplementado com 10% de soro fetal
bovino, 2,2 mg/mL de piruvato de sódio, 1 µg/mL de LH, 500 ng/mL de FSH, 1 µg/mL de E2
(estradiol) e 25 µg/mL de gentamicina. Os ovócitos foram maturados a 38,5ºC em atmosfera
com 5% de CO2 em ar, durante 24 horas. Para a avaliação da maturação nuclear, os ovócitos
foram retirados do meio de cultivo, após o período de maturação, e colocados em meio TCM
199 acrescido de 2 mg/mL de Hialuronidase tipo V onde foram extraídas as células da granulosa
com auxílio de micropipeta de vidro. Os ovócitos desnudos foram transferidos para 10 μL de
Hoescht 33342 em lâmina histológica, cobertos com lamínula e avaliados quanto à configuração
cromossômica em microscópio de fluorescência (Leica DMIRB). Os ovócitos foram classificados
segundo o estágio da meiose em: VG (vesícula germinativa), QVG (quebra da vesícula
germinativa), MI (metáfase I), MII (metáfase II) e DEG (degenerado). Os dados foram submetidos
ao Teste do Qui-quadrado e foram consideradas diferenças significativas quando p<0,05. As
taxas obtidas para o grupo sem folículo dominante foram: 3,52% (VG), 4,52% (QVG), 37,19%
(MI), 31,66% (MII) e 23,11% (DEG) e para o grupo com folículo dominante: 0,49% (VG),
3,45% (QVG), 31,03% (MI), 46,80% (MII) e 18,23% (DEG). Baseado nos resultados iniciais
deste experimento pode-se verificar que, para as condições do laboratório de Fertilização In
Vitro (FMVZ – UNESP – Botucatu), o grupo com folículo dominante apresentou melhor taxa de
maturação (MII) quando comparado ao grupo sem folículo dominante (p=0,002).
s434
EFEITO DE DIFERENTES AGENTES DE CAPACITAÇÃO NA PRODUÇÃO IN

VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS COM SÊMEN SEXADO
Accorsi, M.F.1,2; José, A.A.F.B.V.2;Watanabe, M.R.1; Joaquim, D.C.1;

Meirelles, F.V.2; Watanabe, Y.F.1,2
1
Vitrogen® Pesquisa e Desenvolvimento em Biotecnologia da Reprodução, Cravinhos–SP,
Brasil. 2Depto de Ciências Básicas da FZEA-USP, Pirassununga-SP, Brasil.
monica@vitrogenbr.com
A bovinocultura nacional tem demonstrado, no cenário atual, importantes avanços tanto na

produção de carne quanto de leite. A PIV e a utilização de sêmen sexado podem dar uma
contribuição extra. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da cafeína como agente de
capacitação associada a heparina, no sêmen sexado bovino, para utilização no processo de
fecundação in vitro (Experimento 1). Foram também testadas duas doses de heparina na
capacitação (5 e 10 μg/mL) (Experimento 2). Ao todo, foram utilizadas 12 doses de sêmen
sexado de 1 mesmo touro, totalizando 940 oócitos para testar o efeito da inclusão da cafeína,
para o experimento 1. Os oócitos foram maturados em meio TCM 199 acrescidos de FSH, LH,
Estradiol e 10% de soro fetal bovino durante 24 horas a 38,8°C e 5% de CO2 em ar. As doses
utilizadas foram descongeladas a 35°C e o sêmen depositado em tubo com gradiente de Percoll
(45% e 90%) para separação dos espermatozóides móveis. Posteriormente, foi centrifugado a
1000 g durante 15 minutos e, em seguida, o pellet ressuspendido com 500µL de meio FIV, e
centrifugado por mais 5 minutos. A viabilidade dos espermatozóides foi analisada mediante
motilidade espermática. A dose inseminante foi de 1x106 espermatozóides/mL e o co-cultivo
(espermatozóide e oócito) realizado em microgotas de meio FIV (TALP + PHE + tratamentos: 1)
heparina + cafeína e 2) heparina), incubados a 38,8°C e 5% de CO2 em ar por um período de 18
à 22 horas. Os prováveis zigotos foram cultivados em meio CR2 acrescido de 5% de SFB nas
mesmas condições de temperatura e atmosfera gasosa. Posteriormente, finalizada e avaliada a
primeira fase experimental, utilizou-se 927 oócitos e seis touros para testar o efeito de duas
doses de heparina (5 e 10 μg/mL), mantendo-se todo o procedimento descrito anteriormente. Os
dados foram analisados utilizando-se metodologia de Modelos Lineares Generalizados,
pressupondo distribuição binomial e função de ligação logística, por meio do programa SAS®(SAS,
1995). O modelo adotado contemplou, como parte sistemática, as doses de heparina e as
porcentagens de blastocistos. A taxa média de blastocisto avaliada no 7º e 8º dia de cultivo foi
semelhante (30 e 32%) nos grupos tratados com heparina + cafeína e heparina respectivamente
(P>0,10). Não houve diferença em relação às duas doses de heparina testadas nos touros testados
(16 e 18%, para as doses de 5 e 10 µg/mL, respectivamente; P>0,10). Entretanto, no experimento
2, foi observada uma variação entre os touros testados de 38% a 9%, independentemente da
dose. Conclui-se, portanto, que não existe variação na taxa de blastocistos com a utilização da
cafeína em associação com a heparina. O protocolo com heparina 10 μg/mL na capacitação de
sêmen, utilizado como rotina na FIV pode ser também aplicado ao sêmen sexado.
s435
DISTRIBUIÇÃO DE GRÂNULOS CORTICAIS EM OÓCITOS BOVINOS

MATURADOS IN VITRO COM INIBIDORES DA MATURAÇÃO NUCLEAR E
ANTIOXIDANTES
Barretto, L.S.S.1; Gonçalves, F.S.1; Perri, S.H.V.2; Mingoti, G.Z.2
1
DMVPRA, FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil. 2 DAPSA, FMVA-UNESP, Araçatuba-SP,
Brasil. leticiabarretto@ig.com.br
Grânulos corticais (GC) são grânulos secretores que promovem o endurecimento da zona pelúcida
para impedir a polispermia. A maturação citoplasmática pode ser avaliada pela distribuição dos
GC. A inclusão de antioxidantes em meios de cultivo protege as células do estresse oxidativo.
Objetivamos avaliar o efeito do bloqueio da maturação nuclear (com inibidores butirolactona I e
roscovitina associados a antioxidantes) na migração dos GC de oócitos bovinos submetidos à
maturação in vitro. Oócitos (n=729) foram maturados a 38,7oC em atmosfera de 5% CO2 em ar
em meio TCM-199 suplementado com 0,6% BSA, 0,5 μg FSH, 100 UI hCG e 1 μg estradiol/ml
(controle - C), adicionado dos antioxidantes 50 µM de cisteamina (CC) ou 50 µM de β-
mercaptoetanol (CM). O grupo padrão do laboratório (S) foi suplementado com 10% de SFB
como fonte protéica. Os oócitos em meio suplementado com butirolactona I e roscovitina foram
pré-maturados por 24 horas em meio TCM-199 suplementado com 0,3% BSA, antibiótico e
piruvato, de acordo com os grupos: 100 µM de butirolactona I (B), 100 µM de butirolactona I +
50 µM de cisteamina (BC), 100 µM de butirolactona I + 50 µM de β-mercaptoetanol (BM), 25
µM de roscovitina (R), 25 µM de roscovitina + 50 µM de cisteamina (RC) e 25 µM de roscovitina
+ 50 µM de β-mercaptoetanol (RM). Após o cultivo de pré-maturação, foram transferidos para
gotas com meio controle para maturação por mais 24 horas. Ao final do cultivo de maturação, os
oócitos foram corados com 10 μg/mL de Lens culinaris aglutinina conjugado à isocianato de
fluoresceína (FITC-LCA) para avaliação da maturação citoplasmática pela distribuição dos GC.
Os dados foram analisados por ANOVA (P<0,05). Com 24 horas de maturação, os oócitos
apresentaram-se maturos com GC dispersos na periferia dos oócitos em 52,07%c (S), 65,90%abc
(C), 60,32%bc (CC), 64,60%bc (CM), 66,17%abc (B), 55,44%bc (BC), 56,89%bc (BM), 82,92%a
(R), 80,73%ab (RC) e 78,52%ab (RM). Os oócitos pré-maturados com butirolactona I e roscovitina
encontraram-se maturos ao final das 24 horas e o grupo S teve a menor porcentagem de oócitos
maturos em 24 horas de cultivo. Os antioxidantes parecem não ter influência na maturação
citoplasmática avaliada pela distribuição dos GC. Após reversão do bloqueio meiótico com
roscovitina, a distribuição dos grânulos corticais foi melhor do que aquela do grupo controle.
s436
CONCENTRAÇÃO INTRACELULAR DE GLUTATIONA EM OÓCITOS BOVINOS

MATURADOS IN VITRO COM INIBIDORES DA MATURAÇÃO NUCLEAR E
ANTIOXIDANTES
Barretto, L.S.S.1; Tetzner, T.A.D.1; Gonçalves, F.S.1; Mingoti, G.Z.2
1
DMVPRA, FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil. 2 DAPSA, FMVA-UNESP, Araçatuba-SP,
Brasil. leticiabarretto@ig.com.br
A glutationa (GSH) é um tripeptídeo fundamental para a proteção da célula contra o estresse

oxidativo e participa nos processos de maturação oocitária. Objetivamos avaliar a concentração
intracelular de GSH em oócitos bovinos maturados in vitro com inibidores da maturação nuclear
(butirolactona I e roscovitina) e/ou antioxidantes (cisteamina e β-mercaptoetanol). Oócitos
(n=1500) foram maturados a 38,7oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199
suplementado com 0,6% BSA, 0,5 μg FSH, 100 UI hCG e 1 μg estradiol/ml (controle - C),
adicionado de 50 µM de cisteamina (CC) ou 50 µM de β-mercaptoetanol (CM). O grupo padrão
do laboratório (S) foi suplementado com 10% de SFB como fonte protéica. Os oócitos em meio
suplementado com butirolactona I e roscovitina foram pré-maturados por 24 horas em meio
TCM-199 suplementado com 0,3% BSA, antibiótico e piruvato, de acordo com os grupos: 100
µM de butirolactona I (B), 100 µM de butirolactona I + 50 µM de cisteamina (BC), 100 µM de
butirolactona I + 50 µM de β-mercaptoetanol (BM), 25 µM de roscovitina (R), 25 µM de
roscovitina + 50 µM de cisteamina (RC) e 25 µM de roscovitina + 50 µM de β-mercaptoetanol
(RM). Após o cultivo de pré-maturação, foram transferidos para gotas com meio controle para
maturação por mais 24 horas. Ao final do cultivo de maturação, a concentração de GSH foi
mensurada de acordo com o protocolo de Browne e Armstrong (Methods in molecular biology,
v.108, p.347-353, 1998) com adaptações. Brevemente, 30 oócitos de cada grupo tiveram as células
do cumulus removidas com tripsina (0,1%) e foram depositados em microtubos com 100 µL de
solução de extração de ácido meta-fosfórico (SEAM). O conteúdo foi homogeneizado com agulha
(29G ½) para lise. As amostras foram centrifugadas (1500RPM) e o sobrenadante (100 µL)
transferido para um tubo de ensaio com 2 mL de solução tampão de GSH (TG), ao qual foram
adicionados 100 µL do reagente o-phthaldialdehyde (OPT). A leitura foi realizada, após incubação
por 15 min no escuro, em espectrofluorímetro (Hitachi – F-2500, Tókio, Japão) ajustado para
emissão em 420 nm e excitação em 350 nm. Os dados foram analisados por ANOVA (P<0,05).
Com 24 horas de maturação, os oócitos apresentaram concentração intracelular de GSH de 3,66
ñmola (S), 3,20 ñmolab (C), 2,91 ñmolab (CC), 3,02 ñmolab (CM), 2,18 ñmolb (B), 2,61 ñmolab
(BC), 2,12 ñmolb (BM), 2,14 ñmolb (R), 2,78 ñmolab (RC) e 2,00 ñmolb (RM). Os oócitos dos
grupos B, R, BM e RM apresentaram a menor concentração intracelular de GSH por oócito. Pelo
fato dos oócitos dos grupos BM e RM terem sido maturados com β-mercaptoetanol esperava-se
que estes grupos também tivessem maior concentração intracelular de GSH. Parece que os
inibidores butirolactona I e roscovitina podem interferir na ação antioxidante do β-Mercaptoetanol,
ou ainda que a cisteamina seja mais eficiente que o β-Mercaptoetanol, impedindo a queda de
GSH durante o cultivo de maturação.
s437
USO DE GLUTAMAX™-I EM SUBSTITUIÇÃO A L-GLUTAMINA EM MEIO DE

CULTIVO DE EMBRIÕES BOVINOS: RESULTADOS PRELIMINARES.
Elias, F.P.1; Vila, R.A.1; Galerani, M.A.V.1; Fernandes, M.B.1; Lôbo, R.B.1
1
Departamento de Genética/BlocoC – FMRP/USP, Ribeirão Preto – SP, Av. Bandeirantes,
3900, 14040-030, Brasil. fpelias@genbov.fmrp.usp.br
A Glutamina é um nutriente essencial utilizado em meios de cultivos de embriões bovinos, pois

é necessária para a produção de energia bem como para as sínteses protéicas e de ácidos nucléicos.
O consumo de glutamina gera amônia como um de seus produtos a qual é tóxica para as células.
(Hassel et al, In: Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 30, pp 30-41 1991). Uma alternativa
para minimizar a produção de amônia é a substituição da L-glutamina por dipeptídeos de L-
glutamina, GlutaMAX™I. Este trabalho apresenta resultados preliminares no uso de
GlutaMAX™-I como substituto da L-glutamina em meios de cultivo de embrião bovino. Para
tanto, 661 oócitos de ovários oriundos de matadouro foram maturados em meio TCM 199 +
10% SFB + 0,5μg FSH/ml + 0,5μl LH/ml + 1 μg estradiol/ml, por 24h a 38, 5°C, 5% CO2 em
atmosfera. Obtiveram-se espermatozóides viáveis por centrifugação em gradiente de Percoll (45
e 90%) e foram utilizados para Fecundação in vitro numa concentração de 2 milhões de sptz/ml
em meio TALP + 10μg de Heparina/ml. Após 12h, um primeiro grupo com 300 supostos zigotos
foi co-cultivado em meio de cultivo CR2 + 10% SFB com células do cumulus contendo L-
glutamina e o segundo grupo, com 361 supostos zigotos foi co-cultivado em meio CR2 acrescido
de GlutaMAX™-I na mesma concentração molar utilizada para a L-Glutamina. No 4° dia de
cultivo, realizou-se a remoção do excesso de células do cumulus e dos embriões com número de
células inferiores a 16 e acréscimo de meio de cultivo nas microgotas. Após 163h da fertilização,
116 embriões viáveis foram encontrados no primeiro grupo e 166 no segundo grupo. Os resultados
mostram que GlutaMAXTM-I pode ser utilizado em meio de cultivo CR2 em substituição à L-
glutamina, pois apresentou resultados similares ao obtido pelo grupo controle.
Agradecimentos: PRONEX; CNPq; ANCP e INVITROGEN BRASIL.
s438
ASSOCIAÇÃO DA MOTILIDADE E VIABILIDADE ESPERMÁTICA COM A

PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
Dias, N.B.1; Camargo, L.S.A.2,6; Serapião, R.V.3; Folhadela, I.4; Ramos, A.A.5;
Polisseni, J.2; Viana, J.H.M.2; Sá, W.F.2; Ferreira, A.M.2
1
CES-JF, Campus Arnaldo Janssen, Juiz de Fora, MG; 2Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora,
MG; 3UENF, Campos de Goytacazes, RJ; 4 UFMG, Belo Horizonte, MG; 5Epamig, Juiz de
Fora, MG; 6 camargo@cnpgl.embrapa.br
Sêmen de diferentes touros e/ou partidas podem resultar em variações na produção de embriões
clivados e de blastocistos. Desta forma, a identificação de parâmetros espermáticos associados a
essas variações pode ser útil para estimar o potencial de produção da amostra na fecundação in
vitro (FIV). O objetivo do presente trabalho foi associar dois parâmetros espermáticos (motilidade
e viabilidade) do sêmen descongelado com a produção embriões clivados e blastocistos pelo seu
uso na FIV. Motilidade e viabilidade de 22 amostras congeladas de sêmen, obtidas de oito touros
das raças Gir ou Holandês, foram avaliadas em diversas etapas da FIV (pós-descongelação, pós-
swim up e pós-fecundação in vitro) e associadas com a taxa de clivagem, a produção de embriões
com oito células e a produção de blastocistos. A motilidade foi avaliada em microscópio óptico
e a viabilidade após coloração com eosina-nigrosina. Após descongelação, espermatozóides foram
separados do diluente por swim-up, centrifugados e diluídos em concentração de 2,0 a 2,5 x 106
células/mL para a fecundação de oócitos maturados in vitro. Após 20-22h da fecundação in vitro,
zigotos foram co-cultivados com células do cumulus em meio CR2aa adicionado de 10% de soro
fetal bovino e albumina sérica bovina. As taxas de clivagem e de embriões com oito células
foram avaliados com 72h após fecundação in vitro, e a de blastocistos no oitavo dia. Associações
da motilidade e viabilidade pós-descongelação (MotPD e ViaPD, respectivamente), motilidade
e viabilidade pós-swin up (MotPSw e ViaPSw, respectivamente) e viabilidade pós-fecundação
(ViaPFec) com as taxas de clivagem, embriões com oito células e blastocistos foram realizadas
por análise de regressão linear. A variação entre as amostras nas taxas de clivagem e de blastocistos
foi de 37,9% a 87,5% e 0,0 a 44,3%, respectivamente. A motilidade e viabilidade pós-
descongelação variaram de 40,0% a 85,0% e 21,3% a 85,3% respectivamente. MotPD apresentou
associação (P<0,01) com a taxa de clivagem (R2=0,49) e com a taxa de embriões com oito
células (R2=0,39) enquanto a ViaPD apresentou associação (P<0,05) apenas com a taxa de
clivagem (R2=0,24). O coeficiente de determinação entre MotPD e taxa de blastocistos foi de
R2=0,16 (P=0,059). Demais parâmetros espermáticos (MotPSw, ViaPSw e ViaPFec) não
apresentaram associações significativas (P>0,05) com as taxas embrionárias. Conclui-se que
MotPD possui associação moderada com a taxa de clivagem e de embriões com oito células,
podendo ser útil como parâmetro adicional para se avaliar o potencial de uma amostra de sêmen
na fecundação in vitro antes do swim up. Os resultados também sugerem que viabilidade
espermática, avaliada pela eosina-nigrosina no pós-swim up e na pós-fecundação in vitro, não é
um bom indicador para se estimar taxas de desenvolvimento embrionário.
s439
APLICAÇÃO COMERCIAL EM LARGA ESCALA DA SEXAGEM DE EMBRIÕES

PRODUZIDOS IN VITRO POR ANÁLISE DE DNA.
Alonso, R.V.1; Hellú, J.A.A.1; Ardais, D.B.2; Visintin, J.A.3; Garcia, J.F.4
1
TRANSFIX – Transplante de Embriões Ltda., Patrocínio Paulista – SP, Brasil; 2
VITROGEN – Pesquisa e Desenvolvimento em Biotecnologia da Reprodução Ltda., Uberaba/
MG, Brasil; 3 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – Campus
Araçatuba; 4 Universidade de São Paulo – FMVZ – Departamento de Reprodução Animal;
transfix@terra.com.br
O Brasil tem se destacado como um dos países que mais aplica comercialmente e em larga escala
as diversas biotecnologias utilizadas na reprodução animal. A sexagem de embriões por análise
de DNA, agregada à produção in vitro, constituem ferramentas importantes que permitem
intensificar e acelerar o melhoramento genético de animais de alto valor zootécnico. Através
destas tecnologias o criador pode escolher o sexo desejado ainda na fase embrionária, reduzindo
custos com receptoras, tratamentos hormonais para sincronização, manejo e locação de espaço
na propriedade. O objetivo deste trabalho foi de apresentar os resultados de rotinas de sexagem
de embriões produzidos in vitro, realizadas pela TRANSFIX - Patrocínio Paulista - Brasil, no
período de abril/2005 a maio/2006. O trabalho foi realizado em seis laboratórios de fecundação
in vitro distintos, compreendendo material biológico originado de 41 criadores de bovinos de
elite. Os embriões foram biopsiados no sexto e/ou sétimo dias de cultivo, utilizando
micromanipuladores mecânicos e micropipetas de vidro (holding e microaspiração) fabricadas
pela TRANSFIX. As células biopsiadas foram submetidas à PCR (sistema CENARGEN -
EMBRAPA), sendo seu resultado visualizado por eletroforese em gel de agarose (2%) corado
com brometo de etídeo. Foram micromanipulados para a retirada de biópsia o total 2984 embriões
bovinos de diversas raças (Nelore, Brahman, Gir, Guzerá, Girolando e Simental), resultando na
identificação de 1436 embriões macho (48,1%), 1378 embriões fêmea (46,2%) e 170 indefinidos
(5,7%). Após a micromanipulação, os embriões foram retornados ao cultivo em estufa de CO2
no mesmo meio empregado até então, porém em gotas isoladas e identificadas de forma a garantir
a identificação individual de cada embrião. Todos os embriões foram reavaliados antes do
envasamento para a inovulação (4-12 horas após a micromanipulação), sendo descartados aqueles
que se apresentaram degenerados segundo critérios da IETS. A taxa de mortalidade embrionária
após a micromanipulação correspondeu a 11,3% (338), sendo implantados 909 embriões sexados,
que resultaram em 273 prenhezes (30,0%) confirmadas aos 60 dias de gestação. Todos os fetos
tiveram o sexo confirmado por ultrassonografia, verificando-se 249 acertos (91,2%) e 24 erros
(8,8%). Sessenta e sete bezerras saudáveis nasceram até a presente data, comprovando a
exeqüibilidade técnica e econômica do emprego da sexagem de embriões produzidos in vitro por
análise de DNA em larga escala e sua importância para os criadores de bovinos de elite no Brasil.
Palavras - Chave: Embrião, Sexagem, Micromanipulação, FIV, PCR.
s440
AÇÃO DO ÁCIDO ASCÓRBICO NO CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES

BOVINOS
Silva, C; Calegari, R.S.; Martins Jr., A.
Departamento de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal, Curso de Medicina Veterinária,

UNESP, Araçatuba-SP, 16050-680, Brasil. mila.ata@ig.com.br
Foi investigado o efeito da adição de ácido ascórbico ao meio de cultura para testar a hipótese de
que esse composto poderia incrementar o desenvolvimento embrionário in vitro. Ovários de
vacas foram obtidos em frigorífico e mantidos em solução salina a 31-33°C até a chegada ao
laboratório. Folículos antrais (2 a 7 mm de diâmetro) foram aspirados utilizando-se agulha calibre
18 G e seringa de 10 mL. Oócitos com no mínimo 3-4 camadas de células do cumulus e citoplasma
homogêneo foram lavados três vezes em meio de maturação base (MM-b), constituído de Meio
199 (M-3769, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA), com 2,2 mg/mL de bicarbonato de sódio,
0,05 mg/mL de piruvato de sódio, 0,05 mg/mL de sulfato de gentamicina e 1 mg/mL de álcool
polivinílico (PVA). Grupos de 15 a 25 oócitos foram maturados em gotas de 0,1 mL de MM-b
acrescido de 1.000 ng/mL de FSH (Vetrepharm Inc., Belleville, Canadá) e 10% de SFB (Nutricell,
Campinas, Brasil), sem PVA, por 24 h. O meio definido, modificado (m-DM) foi utilizado tanto
para o “swim-up” quanto para a fertilização in vitro, com heparina (20 µg/mL) para a capacitação
espermática. Oócitos foram co-incubados com espermatozóides por um período de 5 horas. A
seguir, as células do cumulus foram removidas, mediante sucessivas pipetagens, e grupos de 10
a 15 prováveis zigotos foram distribuídos, aleatoriamente para gotas de 50 μL de meio de cultura
(BARC; “Beltsville Agriculture Research Center”), suplementado com ácido ascórbico, de acordo
com o seguinte delineamento experimental: grupo I (controle - 0 μg/mL), II (0,1 μg/mL), III (1
μg/mL) e IV (10 μg/mL), durante as primeiras 67 horas de cultivo. Às 72 e 144 horas pós-
inseminação (h pi) os embriões foram transferidos para gotas de meio BARC, fresco, sem ácido
ascórbico. Oócitos e embriões foram incubados em estufa de CO2 a 5%, em atmosfera úmida, a
38,5°C. O desenvolvimento embrionário foi avaliado através da percentagem de oócitos maturados
que fertilizaram e atingiram os estágios de mórula (Mo), blastocisto (Bl) e blastocisto expandido
(Bx), às 72, 144, 168 e 192 h pi, respectivamente. ANOVA foi utilizada para avaliar diferenças
estatísticas e o teste t, de Bonferroni, para determinar diferenças entre os grupos, com p<0,05,
como significativo. O ácido ascórbico, na concentração de 10 μg/mL, produziu significativamente
maior (p<0,05) percentagem de oócitos clivados (77,0%), mórula (60,6%), blastocistos (44,3%)
e blastocistos expandidos (29,5%) do que os grupos I, II e III. Não houve diferença estatística
significativa (p>0,05) entre os grupos I, II e III, cujos valores de fertilização variaram de 63,5 a
68,2%, 47,6 a 51,6%, 30,1 a 34,9% e 19,0 a 22,2%, respectivamente, para Mo, Bl a Bx. A adição
de ácido ascórbico ao meio BARC, durante as primeiras 67 h de cultura, incrementou o
desenvolvimento embrionário, evidenciado pela maior proporção de embriões produzidos sob
essas condições experimentais, provavelmente devido à sua função de prevenir ou diminuir os
danos causados pela oxidação. (Agradecimentos: FAPESP; Central VR, Araçatuba, SP, Brasil).
s441
DESENVOLVIMENTO DO ALANTÓIDE BOVINO EM GESTAÇÕES ORIUNDAS

DE EMBRIÕES PRODUZIDOS IN VITRO
Assis Neto, A.C.1; Verechia, F.T.V.1; Ambrósio, C.E.2; Meirelles, F.V.3; Miglino, M.A2.
1
Faculdade de Zootecnia -Dracena /UNESP, Dracena-SP, 17900-000, Brasil. 2 Departamento
de Cirurgia – FMVZ/USP, São Paulo-SP, Brasil. 3FZEA/USP, Pirassununga-SP, Brasil.
4
antonioassis@dracena.unesp.br
O objetivo deste estudo foi caracterizar morfologicamente o desenvolvimento inicial do alantóide

em gestação bovina originadas de embriões produzidos in vitro com 35 dias. Para tanto, foram
utilizados sete conceptos obtidos pela técnica de FIV. Após as colheitas, os conceptos foram
dissecados, mensurados macroscopicamente e fotodocumentados. As membranas alantodianas
foram cortadas em fragmentos de 5 cm2, e, em seguida fixadas em paraformoldeído 4%, para
análise por microscopia de luz, e glutaraldeído 2,5%, para utilização em microscopia eletrônica
de varredura e transmissão. O aparecimento macroscópico da vascularização do alantóide, sua
tentativa de se fundir com o cório, o aparecimento efetivo dos primeiros cotilédones em
desenvolvimento e a proximidade com o saco vitelino foram observados nesta fase. O alantóide
apresentou epitélio simples, constituído por células globosas a cilíndricas, com projeções apicais
de membrana. As células epiteliais mostravam-se fortemente marcadas pela reação de PAS.
Analisar o alantóide sob a microscopia eletrônica de varredura, algumas células apareceram com
irregularidades de superfície delimitadas por fileiras densas de microvilos e projetadas
apicalmentes. Outras se mostraram planas e com curtos microvilos centrais delimitados por uma
fileira mais densa. O exame ao microscópico eletrônico de transmissão, mostrou que as células
do alantóide apresentavam uma grande quantidade de grânulos escuros preenchendo os espaços
citoplasmáticos. Os núcleos apresentaram-se ovóides e cromatina evidente. As células estavam
conectadas por interdigitações citoplasmáticas e desmossomos. O epitélio alantoidiano apresentou
um dimorfismo celular, porém, mostrou-se imaturo. Apesar disso, os resultados sugeriram a
existência de uma placenta coriovitelínica e alantovitelínica transitórias, ativas e importantes
para os mecanismos de trocas materno fetal antes da placentação cório-alantóide definitiva.
Apoio: FAPESP, CAPES
s442
MATURAÇÃO NUCLEAR IN VITRO DE OVÓCITOS EQUINOS DE ACORDO COM

A COMPACTAÇÃO DAS CÉLULAS DO CUMULUS E DA GRANULOSA
Fernandes, C.B.1; Lima-Neto, J.F.1; Martins, L.R.1; Bonesi, G.L.2; Tsuribe, P.M.1;
Melo, C.M.1; Leal, L.S.1; Dores, C.B.1; Blanco, I.D.P.1; Derussi, A.A.P.1;
Pavão, G.D.1; Martin, I.1; DeVitto, L.G 1; Landim-Alvarenga, F.C.1
1
SP, 18618-000, Brasil, 2Fiscal Federal Agropecuário do Ministério de Agricultura Pecuária e
Abastecimento, PR, Brasil. fernandescb@yahoo.com.br
Uma das barreiras ao sucesso das técnicas de reprodução assistida na espécie eqüina é a baixa
competência meiótica de ovócitos que apresentam as células do cumulus compactas. O objetivo
deste trabalho foi comparar as taxas de maturação nuclear de ovócitos eqüinos classificados
quanto ao estágio de compactação das células murais da granulosa (CMG). Ovários eqüinos
foram obtidos em matadouro e os ovócitos recuperados pela técnica de dissecação e curetagem
individual de folículos com 10 a 30 mm de diâmetro. Foram selecionados para o uso somente
ovócitos que apresentaram ao menos uma camada de células do cumulus (CC), citoplasma
homogêneo e aspecto esférico. Os ovócitos selecionados foram classificados quanto à presença
ou não de grupos de células murais da granulosa expandidas e divididos em dois grupos: Compacto
= ovócitos obtidos de folículos onde tanto as CMG quanto as CC não apresentavam sinais de
expansão e Expandido = onde CMG ou CC apresentavam sinais de expansão. Foram realizadas
cinco repetições com 22 ovócitos cultivados em meio de maturação: HTF:BME (1:1), BSA
0,3%, 0,32mM Piruvato, 1mM L-Glutamina, 0,4mM Cisteína, 0,1mM Taurina, 0,4mM Glicina,
3,3mM Lactato de Sódio, 100ng/ml IGF-1, 50ng/ml EGF, 100ng/ml eGH, 5μg/ml eFSH, 500ng/
ml Estradiol e Gentamicina, a 39oC em atmosfera com 5% de CO2 em ar por 36 horas. Para a
avaliação da maturação nuclear os ovócitos foram retirados do meio de cultivo após o período de
maturação in vitro, e colocados em meio MEM hepes acrescido de 5mg/ml de Hialuronidase
tipo V aonde foram extraídas as células da granulosa com auxílio de micropipeta de vidro. Os
ovócitos desnudos foram transferidos para 10mg/ml de Hoechst 33342 em lâmina histológica,
cobertos com lamínula e avaliados quanto à configuração cromossômica em microscópio de
fluorescência. Em média a cada rotina de maturação in vitro 35% dos ovócitos foram classificados
como compactos e 65% como expandidos. Quando foram realizadas as avaliações da configuração
cromossômica, no grupo compacto 21% e 27 % dos ovócitos estavam em Metáfase I (MI) e II
(MII) respectivamente, enquanto nos ovócitos do grupo expandido 37% encontrava-se em MI e
38% em MII. Além disso, o grupo compacto apresentou 50% de ovócitos degenerados, enquanto
o grupo expandido apresentou 21,4%. Baseado nestes resultados confirmou-se a maior
competência meiótica observada em ovócitos classificados como expandidos quando comparado
aos compactos, sendo que estes últimos tendem mais à degeneração nas condições de cultivo in
vitro. Esta avaliação se torna cada vez mais importante, visto que a utilização destes ovócitos
com baixa competência meiótica pode afetar consideravelmente as taxas de sucesso das
biotecnologias da reprodução na espécie eqüina.
Agradecimento: FAPESP processo nº 04/00822-1.
s443
OPU DE BÚFALAS TRATADAS COM SOMATOTROPINA RECOMBINANTE

BOVINA DURANTE O PERÍODO DE ANESTRO ESTACIONAL
Miranda, M.S.1,3; Almeida, A.B.1,2; Chiaratti, M.R.1; Balieiro, J.C.C.1; Baruselli, P.S.2;
Meirelles, F.V.1; Ohashi, O.M.3
1
ZAB-FZEA-USP, Pirassununga-SP, Brasil, 2VRA-FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil, 3Lab.
FIV-UFPA, Belém-PA, Brasil. moyses_m@yahoo.com
Caracterizados pela rusticidade, adequada a ambientes quentes e úmidos, os búfalos representam

uma importante alternativa para a produção de carne e leite. A produção in vitro (PIV) de embriões
de búfalos, a partir de oócitos aspirados por via transvaginal (OPU), é uma técnica bastante
interessante, já que a transferência de embriões (TE) não é eficiente nesta espécie. Assim, o
objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da aplicação de somatotropina recombinante bovina
(rBST) sobre o número de folículos aspirados, a quantidade e qualidade dos complexos cumulus
oophorus (COCs) recuperados por OPU de búfalas, durante o período de anestro estacional. O
experimento foi realizado do mês de setembro até o mês de dezembro de 2005. Seis búfalas
(Bubalus bubbalis) com 7 a 12 anos de idade, as quais nunca haviam sido submetidas à OPU
foram divididas em dois tratamentos: rBST e controle (C), resultando em três unidades
experimentais/tratamento. Meia dose de rBST, via subcutânea (Boostin®-1 ml), foi administrada
quinzenalmente apenas no grupo rBST. Todos os animais foram aspirados semanalmente,
totalizando três aplicações de rBST e seis sessões de OPU. Considerando o dia de aplicação de
rBST como dia 0 (D0), os animais de ambos os grupos foram submetidos à OPU no D4 e no
D11. Para realização da OPU utilizou-se um transdutor transvaginal setorial de 5 MHz, um
ultra-som Aloka® SSD-500, agulhas estéreis de 19G, com 60 cm de comprimento e uma bomba
de vácuo (pressão constante de 15 ml/min). O número de folículos aspirados e de COCs
recuperados por animal foram contados, enquanto os COCs viáveis (oócitos com pelo menos
uma camada de células do cumulus recobrindo-os, total ou parcialmente e citoplasma homogêneo)
foram analisados em relação ao número total de COCs. A análise estatística foi realizada por
meio do procedimento MIXED (programa SAS, V8, 2001), considerando medidas repetidas no
tempo dentro de cada unidade experimental. O modelo da análise contemplou os efeitos de
quinzena de aspiração, tratamento (rBST vs C), dia da aspiração (D4 vs. D11) e dia dentro de
cada tratamento avaliado. Foram recuperados 107 COCs (29% viáveis) de 114 folículos, o que
representa um índice de recuperação de 94%. Não foi verificado qualquer efeito significativo do
tratamento com rBST (p>0,05) sobre o número médio de folículos aspirados tanto no D4 (C =
3,52 ± 0,664 vs rBST = 4,23 ± 0,664) quanto no D11 (C = 4,40 ± 0,826 vs. rBST = 3,02 ± 0,826),
sobre o número médio de COCs recuperados tanto no D4 (C = 2,77 ± 0,862 vs. rBST = 4,48 ±
0,862) quanto no D11 (C = 2,74 ± 0,858 vs. rBST = 1,84 ± 0,858) e sobre a média de COCs
viáveis tanto no D4 (C = 0,13 ± 0,098 vs. rBST = 0,20 ± 0,098) quanto no D11 (C = 0,26 ± 0,097
vs. rBST = 0,26 ± 0,097). Conclui-se que, apesar de nenhum efeito ter sido detectado segundo
nossa análise, observamos aumento do número de COCs recuperados, por animal, 4 dias após a
aplicação de meia dose de rBST.
s444
INIBIÇÃO E REVERSIBILIDADE DA MATURAÇÃO NUCLEAR DE OÓCITOS

BOVINOS
Sandri, L.R.; Bohrer, R.C.; Ferreira, R.; Gonçalves, P.B.D.; Oliveira, J.F.C.
Universidade Federal de Santa Maria, Departamento de Clínica de Grandes Animais,

Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal - BioRep, Santa Maria, RS, Brasil.
joaofco@biorep.ufsm.br.
A produção in vitro (PIV) de embriões tem como um dos principais problemas a baixa taxa de
produção e qualidade dos blastocistos. Com o objetivo de quebrar parte dessa barreira, foi testada
a possibilidade de retardar a maturação nuclear do oócito bovino fora do folículo, inibindo a
tradução do RNAm, usando Cordycepin (CY), um inibidor da poli(A) polimerase, para uma
melhor maturação citoplasmática, e avaliar sua reversibilidade. No primeiro experimento, para
estimar o melhor tempo de cultivo em CY, os oócitos foram divididos em seis grupos: 12 horas
de cultivo em meio com CY (12C); 24 horas no CY (24C); 12 horas no CY mais 12 horas de
cultivo sem CY (12C+12M); 24 horas com CY seguido 24 horas de cultivo em meio sem CY
(24C+24M); 12 horas em CY seguindo de 24 horas em meio de maturação (12C+24M) e controle.
Foram avaliados os parâmetros maturação nuclear (oócitos em anáfase/telófase - A/T e metáfase
II - MII) e oócitos imaturos (em vesícula germintativa - VG, ruptura da vesícual germinativa -
RVG e metáfase I - MI). Os oócitos do grupo 12C não alcançaram MI e, dos do grupo 24C,
27,5% atingiram os estádios de A/T/MII. Os oócitos do grupo 12C+12M tiveram 60,0% de
maturação e os do 24C+24M 39,0% de maturação. Nos grupos 12C+24M e controle, 90,0% dos
oócitos atingiram o estádio de MII. Baseado nos dados do primeiro experimento, foi avaliado o
melhor tempo de cultivo dos oócitos após permanência por 12 horas no CY. Para isso, os oócitos
foram divididos em três grupos. Os dois primeiros permaneceram no meio com CY por 12 horas
e em seguida transferidos para o meio de maturação sem CY por 18 ou 24 horas. Os resultados
dos experimentos foram analisados pelo teste de ANOVA em um modelo estatístico para dados
categóricos, utilizando o PROC CATMOD/SAS. Quando foram detectadas diferenças estatísticas,
as variáveis independentes foram comparadas pelo teste de contraste. Os percentuais de maturação
foram 77,0% para o grupo 18h, 66,0% para o grupo 24 horas e 94% para o grupo controle. Os
dados obtidos com esse estudo permitem concluir que o cultivo de oócitos por 12h na presença
do Cordycepin bloqueia o reinicio da meiose. Pode-se concluir também que o efeito inibitório do
CY é reversível e que a presença dos oócitos em meio de maturação na ausência de inibidores
por 18h é suficiente para estes atingirem o estádio de MII. Trabalho realizado com apoio do
CNPq e FAPERGS.
s445
EFEITO DA INIBIÇÃO DO ÓXIDO NÍTRICO NO DESENVOLVIMENTO IN VITRO

DE EMBRIÕES BOVINOS: RESULTADOS PARCIAIS.
Schwarz, K.L.1; Pires, P.R.L.2; Adona, P.R.1; Leal, C.L.V.1
1
Departamento de Ciências Básicas – FZEA/USP, Pirassununga – SP, Brasil. 2 Centro
Universitário Hermínio Ometto - UNIARARAS, Araras-SP. licaka@terra.com.br
O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico detectado em vários tipos celulares como células
endoteliais, neurônios e macrófagos, desempenhando também funções variadas como
vasodilatação, neurotransmissão e indução de morte celular. O NO é gerado pela atividade da
enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos, inclusive no sistema
reprodutor. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição de N-omega-nitro-l-
arginina metil ester (L-NAME), um inibidor de NOS, sobre a maturação nuclear e citoplasmática
in vitro de oócitos bovinos. Para isso, ovários foram coletados em abatedouros e os folículos de
2-6mm de diâmetro foram aspirados para a obtenção dos complexos cúmulus-oócitos (COCs).
Foram utilizados somente COCs com ooplasma claro, homogênio e com o mínimo de três camadas
de células do cumulus. Os oócitos foram maturados in vitro por 22h com concentrações crescentes
de L-NAME (0, 10-7, 10-5, 10-4, 10-3) adicionadas ao meio de maturação in vitro (MIV: TCM-
199, suplementado com 10% SFB, 0,5µg/mL de FSH, 5,0 µg/mL de LH, 0,2 mM de piruvato e
10 mg/mL de gentamicina). Para a fecundação in vitro (FIV) foi utilizado sêmen congelado
preparado segundo a técnica de gradiente Percoll. Os espermatozóides foram adicionados na
gota de fecundação a uma concentração final de 2 x 106 espermatozóides/mL. A fecundação foi
realizada em TALP-FIV suplementado com 2 µM penicilamina, 1 µM hipotaurina, 250 µM
epinefrina e 20 µg/mL heparina. Após 20h fecundação, os ovócitos foram parcialmente desnudados
e transferidos para o meio de cultivo in vitro (CIV: TCM-199, suplementado com 10% de SFB,
2,0 mM de piruvato e 10 mg/mL de gentamicina). A taxa de clivagem foi avaliada com 48 h de
CIV e no quinto dia de cultivo foi feito feeding (40%) do meio. A maturação nuclear foi avaliada
por coloração com iodeto de propidio (10µg/ml) após 22h de MIV. A maturação citoplasmática
foi avaliada pela taxa de blastocistos e contagem de células totais e com fragmentação do DNA
nos mesmos, através da técnica de TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein-Roche)
no sétimo dia de cultivo (D7). Foram feitas três repetições para cada avaliação. A taxa de maturação
nuclear foi 89, 82, 71, 82 e 100% para os grupos 0 (controle), 10-7, 10-5, 10-4 e 10-3 M,
respectivamente. Os percentuais de blastocistos foram de 26,4% (controle), 20,2% (10-7 M),
24,5% (10-5 M), 24,1% (10-4 M) e 37% (10-3M). O número de células totais e TUNEL positivos
dos blastocistos foram, respectivamente, 141,8 e 2,0 (controle), 123,1 e 8,0 (10-7 M), 99,7 e 4,7
(10-5 M), 108,2 e 8,8 (10-4M) e 120,7 e 4,8 (10-3M). Os resultados parciais obtidos até o momento,
não apresentaram diferenças na maturação nuclear e citoplasmática, com as concentrações de L-
NAME utilizadas, sendo necessário o desenvolvimento de maior números de repetições.
Apoio financeiro – FAPESP
s446
CINÉTICA DA CROMATINA NUCLEAR DURANTE A MATURAÇÃO EM

OVÓCITOS BOVINOS MANTIDOS EM MEIO DE TRANSPORTE - MIV-T
Leme, L.O.1,2; Rumpf, R.1; Dode, M.A.N.1
1
Embrapa/CENARGEN, PqEB s/n, W5 Norte Final, Caixa postal 02372, CEP 70770-900;
2
UnB, Faculdade de Agronomia e Veterinária, Pós-graduação em Ciência Agrárias, Caixa
postal 04508, CEP 70910-970 – Brasília/DF. ligileme@yahoo.co.uk
Um sistema de transporte adequado para ovócitos bovinos tem sido um dos requisitos básicos
para o sucesso comercial da produção in vitro de embriões (PIV) Os ovócitos aspirados dos
folículos ovarianos iniciam a meiose espontaneamente, e as primeiras horas de maturação,
conseqüentemente, ocorrem durante o transporte entre as fazendas de produção e o laboratório
de PIV. Nosso laboratório tem utilizado como rotina meio de transporte composto por TCM 199
com sais de Hank’s suplementados igualmente com hormônios e antibióticos (MIV-t), à
temperatura de 34-36ºC, com intervalo entre a aspiração e a chegada ao laboratório de no máximo
8h. Para avaliar o efeito do MIV-t e a temperatura de transporte no nosso atual sistema PIV,
conduziu-se este estudo objetivando analisar a cinética da cromatina nuclear durante a MIV. Foi
utilizado um total de 618 ovócitos oriundos de abatedouro, que após a recuperação e seleção
foram colocados em tubo de 1,5ml, contendo 1ml de meio de maturação coberto com uma camada
de 250µl de óleo mineral. No grupo controle (G1), os ovócitos foram maturados em meio TCM
199 com sais de Earl’s suplementado com hormônios e antibiótico (meio MIV), em tubo aberto
na estufa convencional com 5% de CO2 em ar, a 39°C. Os ovócitos do grupo de transporte (G2),
foram maturados no MIV-t, em banho-maria a 36°C por todo o período. Em ambos tratamentos
os ovócitos foram retirados com 8h, 12h, 22h e 24h após o início da maturação, fixados em
solução de ácido acético e etanol, corados com Lacmóide e avaliados quanto à fase da meiose em
microscopia de contraste de fase. Para a avaliação microscópica foram considerados os seguintes
estágios: Vesícula Germinativa (VG), final de Prófase I (fPI), Metáfase I (MI), Anáfase I (AI),
Telófase I (TI) e Metáfase II (MII). Os resultados foram comparados pelo teste de Chi-quadrado.
Às 8h de maturação a percentagem de ovócitos em estágio de VG foi menor e de MI maior
(P<0,05) no G1 (40,3% e 47,8%) do que no G2 (73,2% e 23,2%). Às 12 horas de cultivo apenas
3,6% dos ovócitos do G1 apresentavam VG comparado com 29,5% do G2. Com 22 h a maioria
dos ovócitos do G1 encontravam-se em MII (83,6%), enquanto no G2 a porcentagem de ovócitos
em MII (60,2%) foi menor (P<0,05) e a percentagem em TI (23,2%) foi maior (P<0,05). Essa
mesma diferença se manteve até 24 horas de maturação, em que o G1 apresentou maior
percentagem de ovócitos em MII (96,3%) e menor percentagem em TI (3,7%) do que o G2
(77,7% e 14,3%). Os resultados obtidos mostraram que a permanência dos ovócitos em MIV-t
atrasa a maturação nuclear, podendo justificar-se pela composição do meio e/ou menor temperatura
de transporte utilizada. Estudos adicionais são necessários para avaliar se ovócitos mantidos em
condições de transporte e posteriormente transferidos para incubadora de CO2 deveriam
permanecer mais tempo em maturação e serem fecundados mais tarde do que o preconizado.
Fonte Financiadora: Embrapa – Macro-programa II.
s447
EFEITO DAS GONADOTROFINAS DURANTE A MATURAÇÃO IN VITRO NA

PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS
Leme, L.O.1,2; Driessen, K.1,2; Rumpf, R.1; Dode, M.A.N.1
1
2
UnB, Faculdade de Agronomia e Veterinária, Pós-graduação em Ciências Agrárias, Caixa
postal 04508, CEP 70910-970 – Brasília/DF. ligileme@yahoo.co.uk
A suplementação do meio de maturação com gonadotrofinas é utilizada rotineiramente na maioria

dos protocolos de produção in vitro (PIV) de embriões. Entretanto, estudos recentes têm sugerido
que o FSH é o hormônio crítico durante a maturação in vitro, sendo necessário somente nas
primeiras horas de cultivo Portanto, o presente estudo objetivou avaliar o efeito da presença das
gonadotrofinas durante a maturação in vitro na produção de embriões bovinos. Foram utilizados
566 ovócitos oriundos de ovários de abatedouro, distribuídos aleatoriamente em cinco tratamentos,
quatro réplicas, com média de 28 ovócitos por tratamento. Em todos os grupos, imediatamente
após a recuperação e seleção, os ovócitos foram maturados por 22 horas em gotas de 200ìl de
meio TCM 199 com sais de Earl’s suplementado com antibiótico (meio MIV), em placas cobertas
com óleo mineral, mantidas em estufa com 5% de CO2 em ar, a 39°C. Os tratamentos consistiram
de: meio MIV (T1), meio MIV suplementado com FSH nas primeiras 6 horas e posteriormente
transferidos para o MIV (T2), meio MIV suplementado com FSH (T3), meio MIV suplementado
com LH (T4) e meio MIV suplementado com FSH e LH (T5). As concentrações de LH (de
pituitária eqüina, Sigma, L-9773) e FSH (Sigma, F-8001) utilizadas em todos os grupos foram
24UI/ml e 10μg/ml, respectivamente. Após o período de maturação, os ovócitos foram transferidos
para o meio de fecundação e inseminados in vitro (D0). Ovócitos e espermatozóides foram co-
incubados por 18-20h, quando então foram transferidos para meio SOFaaci e cultivados até D8.
A taxa de clivagem foi avaliada 48h pós-fecundação (pi) e a taxa de blastocistos em D6, D7 e D8
(pi). Os dados foram analisados pelo teste de Chi-quadrado. A taxa de clivagem foi inferior
(P<0,05) no T1 (43%) quando comparado aos demais que não diferiram entre si (P>0,05), sendo
65%, 70%, 66% e 77% para T2, T3, T4 e T5, respectivamente. Da mesma forma, as taxas de
blastocisto em D6, D7 e D8 não foram diferentes (P>0.05) no T2 (23%, 45%, 49%), T3 (23%,
38% e 39%) T4 (24%, 41% e 44%) e T5 (29%, 45% e 46%), mas foram menores (P>0,05) no T1
(12%, 20% e 23%). Os resultados sugerem que nas condições em que foi realizado o presente
estudo, a presença do LH e FSH individual ou em combinação durante a maturação in vitro, é
crítica para o desenvolvimento embrionário posterior. Além disso, a presença de gonadotrofinas
pode ser necessária somente durante as primeiras 6 horas de maturação. É possível que, in vitro,
o LH tenha ação similar ao FSH em desencadear a cascata de eventos que ocorrem no início da
maturação; por outro lado, a presença de SFB em nosso sistema de maturação pode ter mascarado
os resultados. Portanto, mais estudos são necessários para avaliar o papel desses hormônios
durante a maturação in vitro de ovócitos bovinos, tal como a avaliação da taxa de gestação.
s448
EFEITO DO USO DE BENZOATO DE ESTRADIOL E PROGESTERONA PARA

SINCRONIZAR A ONDA FOLICULAR VISANDO OBTENÇÃO IN VIVO DE
OVÓCITOS. RESULTADOS PRELIMINARES.
Ramos, A.F.1,2; Sartori, R.2; Siqueira Filho, E.R.2; Mollo, M.R.2; Driessen, K.2; Pivato, I.3;
Marques Jr., A.P.1; Rumpf, R.2
1
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil; 2Embrapa - Recursos
Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF, Brasil; 3Cidasc, Indaial, SC, Brasil.
aleframos@hotmail.com
Com objetivo de alcançar o momento ideal da aspiração folicular para a produção in vitro de
embriões (PIVE) em novilhas mestiças ½ Nelore X ½ Simental, aumentando com isso o número
e qualidade dos ovócitos recuperados, este experimento investigou o efeito da sincronização da
emergência da onda folicular com benzoato de estradiol (BE) administrado em diferentes horas
antes da aspiração folicular. Quinze novilhas mestiças foram divididas aleatoriamente em três
grupos, com três réplicas cada. As novilhas foram sincronizadas com 2mg de BE e implante
transvaginal de progesterona (DIB) por sete dias, seguido de administração de PGF2á. No dia
quatro do ciclo estral subseqüente, as novilhas receberam DIB e tiveram todos os folículos maiores
que 3mm de diâmetro aspirados, seguido da administração de PGF2á no dia sete. As novilhas do
grupo 0h-BE (n=4), -12h-BE (n=6) e -24h-BE (n=5) receberam 2mg de BE imediatamente após
a aspiração, doze e vinte e quatro horas antes, respectivamente. Todas as novilhas foram aspiradas
com intervalo de sete dias. O sêmen, meios utilizados e as condições de cultivo foram iguais
para todos os grupos. O número de folículos maior que 3mm e o tamanho do maior folículo
foram avaliados por ultra-sonografia no momento da aspiração folicular. Todos os ovócitos
aspirados foram maturados e fecundados in vitro (D0), com a taxa de clivagem e a taxa de
blastocisto avaliadas no D2 e D7, respectivamente. As comparações de médias foram realizadas
por análise de variância e os dados com distribuição binomial foram analisados por qui-quadrado.
Os resultados estão apresentados por porcentagem ou média±erro padrão. Não houve diferença
(P>0,05) no tamanho do maior folículo (11,4±1,3mm vs 11,9±0,6mm vs 13,0±0,6), número de
folículos observados (14,2±2,2 vs 14,3±1,5 vs 15,1±2,3), número de folículos aspirados (12,0±2,5
vs. 12,4±1,5 vs. 11,7±2,2) e número de ovócitos recuperados (8,9±2,4 vs 8,7±1,7 vs 7,9±1,9),
para os grupos 0h-BE, -12h-BE e -24h-BE, respectivamente. A taxa de clivagem foi similar entre
os grupos [56,3% (58/103) para 0h-BE vs 51,9% (81/156) para -12h-BE e 63,6% (75/118) para
-24h-BE]. As novilhas do grupo 0h-BE tiveram maior (P<0,05) taxa de blastocisto [34,9% (36/
103)] que as do grupo -12h-BE [21,8% (34/156)], enquanto as do grupo -24h-BE [24,6% (29/
118)] tiveram resultado intermediário e não diferiram das outras. O uso de BE associado a um
dispositivo de progesterona, simultâneo, 12h ou 24h antes da aspiração folicular, não alterou o
padrão de crescimento folicular e não aumentou o número e a qualidade dos ovócitos recuperados,
bem como prejudicou a produção de embriões in vitro, em um programa de aspiração com
intervalo de sete dias entre sessões.
Primeiro autor é bolsista do CNPq, Brasil (Processo 141077/2004-2).
Apoio Financeiro: Embrapa–Macroprograma II e Tecnopec.
s449
ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA EM EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN

VITRO A PARTIR DE OVÓCITOS COLETADOS DE VACAS SUBMETIDAS A
DIFERENTES NÍVEIS DE INGESTÃO ALIMENTAR
Martins, A.C.1,2; Mundim, T.C.D.1,3; Melo, E.O.1; Dode, M.A.N.1; Rumpf, R.1;
Franco, M.M.1; Sartori, R.1
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 70770-900, Brasília-DF, Brasil, 2FMVZ-
UNESP, 186018-000, Botucatu-SP, Brasil, 3FAV-UnB, 70910-970, Brasília-DF, Brasil.
sartori@cenargen.embrapa.br, mfranco@cenargen.embrapa.br
As técnicas de reprodução animal têm sido constantemente otimizadas com o objetivo de

intensificar a multiplicação de animais de reconhecido mérito genético e de animais de raças em
risco de extinção. A qualidade nutricional e a condição corporal são aspectos determinantes para
uma satisfatória resposta reprodutiva, tanto quantitativa quanto qualitativamente. Aspectos
sanitários e nutricionais dos animais podem ser considerados fatores limitantes. Com relação à
manipulação de células e embriões, trabalhos são conduzidos, buscando novos protocolos que
aperfeiçoem as técnicas e reduzam os custos. Além dos parâmetros hoje avaliados, como
uniformidade de citoplasma, expansão e número de camadas de células do cumulus, número de
células e nível de desenvolvimento embrionário, a biologia molecular, na tentativa de identificar
marcadores moleculares e mecanismos envolvidos na expressão diferencial de genes, surge como
uma poderosa ferramenta de monitoramento e avaliação de sistemas de produção in vitro (PIV)
de embriões. O objetivo do trabalho foi avaliar a expressão de oito genes (CATALASE, BAX,
GPX-4, MnSOD, INTERFERON τ, IGF2R, GRB10, FSHR) em embriões D7 produzidos in
vitro oriundos de dois grupos de animais e em dois estágios de desenvolvimento, blastocisto (Bl)
e blastocisto expandido (Bx). Os animais foram divididos em dois grupos, sendo um com alta
ingestão alimentar (180% da dieta de manutenção) e outro com baixa ingestão alimentar (70%
da dieta de manutenção). Para a quantificação relativa foram usados dois genes constitutivos,
ACTINA e PABP. Foram utilizados 2 pools de embriões para cada estágio (Bl e Bx) e para cada
tratamento (alta e baixa ingestão), variando entre 9 a 28 embriões em cada pool. Para a extração
do RNA total foi utilizado Trizol Reagent - Invitrogen® seguindo recomendações do fabricante,
mas com modificações. As amostras de RNA foram tratadas com DNAse seguindo para a síntese
de cDNA com primers Oligo dT, sendo posteriormente amplificadas por PCR (RT-PCR
semiquantitativa). Todos os genes avaliados foram expressos nas amostras analisadas. Os genes
MnSOD, GPX-4 e INTERFERON tiveram expressão mais alta em relação aos outros genes
estudados. O gene do FSHR foi detectado, apresentando menor expressão no grupo de restrição,
principalmente em Bl. A presença constante de outros fragmentos amplificados de diferentes
tamanhos sugere a possibilidade de splicing alternativo nessa região do gene. Para o gene BAX
observou-se uma grande variação de expressão entre pools de embriões, com maior expressão,
tanto para Bl quanto para Bx, no grupo de restrição. A taxa de ingestão alimentar influenciou a
expressão de alguns genes analisados, sendo estes possíveis candidatos a marcadores moleculares
para qualidade embrionária influenciada pelo efeito da nutrição. Além disso, esses genes podem
vir a ser utilizados para o monitoramento dos sistemas de produção de embriões e para estudos
básicos, servindo com fonte de informações sobre o controle da expressão gênica influenciada
por fatores ambientais.
s450
LEVANTAMENTO DA OCORRÊNCIA DA SÍNDROME DO BEZERRO GRANDE

(SBG) NA REGIÃO NORTE DO PARANÁ.
Ruza, R.G.1; Baudraz, J.A.1; Santos, E.S.1; Melo Sterza, F.A.1
1
UNOPAR - Campus de Arapongas - CEP 86702-000 - Cx. P. 560 - Arapongas – PR.
fabiana.sterza@unopar.br
A produção in vitro de embriões bovinos (PIV) está sendo amplamente empregada no Brasil.
Apesar de todo o sucesso comercial da técnica, sabe-se da necessidade de maiores esclarecimentos,
especialmente no que diz respeito aos produtos da mesma. Em decorrência da falta de trabalhos
relatando o verdadeiro impacto da Síndrome do Bezerro Grande (SBG), o objetivo desse trabalho
foi verificar a ocorrência da SBG em animais produtos de PIV da raça Nelore na região norte do
Paraná. O registro da ocorrência da síndrome foi realizado no período de setembro de 2004 a
setembro de 2005. Para tanto foram avaliadas três propriedades localizadas no município de
Nova Fátima – PR, onde os seguintes dados foram coletados: peso ao nascimento e taxa de
mortalidade perinatal dos produtos de PIV. Os fetos abortados ou natimortos produtos de PIV,
deveriam ser enviados ao laboratório de anatomia patológica da UNOPAR, para que anormalidades
fossem identificadas e correlacionadas com a SBG. Os embriões foram produzidos em dois
laboratórios de PIV altamente conceituados no Brasil, sendo que ambos utilizavam soro fetal
bovino no meio de cultivo embrionário. Foram analisados 107 neonatos da raça Nelore. Apenas
1 animal nasceu com o peso acima do normal para a raça, ou seja acima de 35 Kg. Tratava-se de
uma fêmea, a qual pesou 62 kg ao nascimento, necessitando de assistência ao parto. Nos primeiros
meses de vida deste animal, em que seu desenvolvimento foi acompanhado não foi observada
nenhuma alteração. Apenas 2 mortes foram registradas nesse período, porém nenhum dos animais
apresentava peso acima da média. À necrópsia nenhuma alteração pode ser correlacionada com
a síndrome. Os resultados desse trabalho demonstraram uma baixa incidência, 0,93%, da SBG
em animais da raça Nelore na região norte do Paraná. Tais resultados foram compatíveis com os
observados por KRUIP e DEEN DASS (1997), os quais relataram que a natureza esporádica da
síndrome impede o exato entendimento dos agentes causais e seus mecanismos. Considerando
que o número de neonatos avaliados neste estudo foi reduzido, recomenda-se que novos
levantamentos em diferentes raças e regiões sejam realizados para que esses dados possam ser
confirmados.
s451
UTILIZAÇÃO DE PROGESTERONA EXÓGENA EM PROTOCOLOS DE OPU DE

VACAS NELORE – RESULTADOS PRELIMINARES
Nonato Jr., I.1; Pontes, J.H.F.1; Ereno Jr., J.C.1; Gimenes, L.U.G.2;
Torres-Júnior, J.R.S.2; Baruselli, P.S.2
1
In Vitro Brasil, Mogi Mirim – SP, 13800-970, Brasil; 2Departamento de Reprodução Animal,
FMVZ – USP, SP, Brasil. ismael@invitrobrasil.com.br
O emprego de biotécnicas da reprodução que proporcionam a multiplicação do potencial

reprodutivo de fêmeas Nelore tem se mostrado promissor, e desta maneira consideremos ser
essencial que se desenvolvam protocolos com a finalidade de incrementar a taxa de recuperação
de oócitos, a qualidade e a produção embrionária. A associação de progesterona ao tratamento de
superovulação favorece estes índices (Nasser, 2006, Tese de Doutorado, FMVZ/USP). O presente
estudo teve como objetivo avaliar o desempenho da OPU em vacas Nelore, determinando-se a
taxa de obtenção de oócitos, a proporção de oócitos viáveis, e as taxas de produção in vitro de
embriões e de prenhez das receptoras Foram realizadas 51 sessões de aspiração em 8 doadoras
Nelore, distribuídas ao acaso em quatro grupos: Grupo CONTR (Controle; n=23; aspiração em
dia aleatório do ciclo estral); Grupo ASPFD (Aspiração do folículo dominante 3 dias antes da
aspiração; n=9); Grupo NORG [Inserção de implante auricular contendo Norgestomet (Crestar®,
Intervet, Brasil) associado à administração de 2mg de benzoato de estradiol IM (BE; RIC-BE®,
Syntex, Argentina) e a 50mg de progesterona injetável IM (P4; Progesterona inyectable, Syntex,
Argentina), cinco dias antes da aspiração; n=8)] e Grupo BE+P4 (administração de 2mg de BE
IM e 50mg de P4, cinco dias antes da aspiração; n=11). A análise estatística foi realizada por
ANOVA e Qui-quadrado. Para os grupos CONTR, ASPFD, NORG e BE+P4, foram obtidos os
seguintes resultados, respectivamente: número de oócitos recuperados [(21,0±2,0b; 17,3±3,2b;
32,8±3,5a e 22,6±2,7ab; P<0,01)]; taxa de oócitos viáveis [72,7% (352/484)ab; 70,5% (110/156)b;
79,0% (207/262)a e 77,5% (193/249)ab; P<0,05]; número de embriões produzidos (8,7±1,1;
6,9±1,7; 12,0±2,6; 6,1±1,0), taxa de produção embrionária [56,8% (200/352)a; 56,4% (62/110)
ab
; 46,4% (96/207)b e 34,7% (67/193)c; P<005], taxa de prenhez [33,5% (67/200); 43,5% (27/
62); 38,5% (37/96) e 29,8% (20/67); Pe”0,1] e número de prenhezes por aspiração (2,9±0,4ab;
3,0±0,8ab; 4,6±1,3ª; 1,8±0,5b). Conclui-se que, no presente experimento, a inserção de implante
à base de progestágenos associado ao tratamento com BE+P4 i.m. previamente à aspiração folicular
aumenta o número de oócitos recuperados e o número de prenhezes por aspiração. .
s452
CINÉTICA DA MATURAÇÃO NUCLEAR EM OVÓCITOS BOVINOS APÓS O

BLOQUEIO DA MEIOSE IN VITRO COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE
BUTIROLACTONA I.
Quetglas, M.D.2; Adona, P.R.1,2; Leal, C.L.V.2;
1
Laboratório de Reprodução Animal – LMGA/UENF. 2Depto de Ciências Básicas – FZEA/
USP –quetglas@netsite.com.br
Nos procedimentos de maturação in vitro (MIV) uma parte considerável dos ovócitos é
incompetente para o desenvolvimento. Ao remover os ovócitos dos folículos, os mesmos deixam
de ter o estímulo inibitório que mantém o bloqueio meiótico (BM) e reiniciam espontaneamente
a meiose. Este reinício é por vezes precoce, ou seja, o ovócito ainda não estaria apto para a MIV
e, conseqüentemente, para fecundar e desenvolver. Manter os ovócitos por mais tempo em BM
poderia ser benéfico para que tenham um tempo adicional para adquirir a competência. O objetivo
do presente estudo foi de avaliar a cinética da maturação nuclear após o BM in vitro com diferentes
concentrações de butirolactona I (BLI). Ovócitos bovinos foram aspirados de folículos de 2-
6mm de ovários coletados em frigorífico. Aqueles classificados como graus I e II foram
selecionados e submetidos ao BM por 24h nos tratamentos: B100 = 100μM BLI em TCM-
199+3mg/ml BSA; B10 = 10μM BLI em TCM-199. Após o BM, os ovócitos foram submetidos
à MIV (TCM-199+10% SFB, 5,0µg/ml LH, 0,5µg/ml FSH e antibióticos). Para avaliação da
cinética da maturação nuclear, ovócitos foram retirados do cultivo às 0, 6, 12, 18, e 24 h de MIV
e foram fixados e corados com lacmóide para determinação dos estádios da meiose. Um grupo
controle (C) foi avaliado igualmente, mas submetido somente à MIV. As comparações entre os
grupos foram feitas pelo teste de Chi-quadrado a 5% de significância. Foram avaliados 46 a 56
ovócitos por tratamento e por horário de avaliação, distribuídos em três repetições. À 0h de MIV
100% dos ovócitos estavam em vesícula germinativa (VG) em B100 e C (P>0,05), enquanto
B10 teve 95,7% (P<0,05). Uma pequena parcela (4,3%) dos ovócitos nesse grupo “escapou” do
bloqueio, pois já se encontrava em metáfase II (MII). Às 6h de MIV, ainda havia 83% de VG no
controle, mas uma redução nos grupos tratados (62%, P<0,05). Após 12h de MIV a maioria dos
ovócitos (87 e 92% para C e B10, respectivamente, P0<0,05) estava em estádios intermediários
da meiose (metáfase, anáfase e telófase da meiose I). O mesmo foi observado para B100 (95,7%),
mas este foi superior ao grupo C (P<0,05). Com 18h de MIV a maioria dos ovócitos dos três
grupos já estava em MII (68,0; 71,1 e 71,7%, para C, B10 e B100, respectivamente; P>0,05). Às
24h de MIV observou-se o mesmo, mas as taxas de MII dos grupos tratados (~97%) foram
superiores ao controle (89,3%, P<0,05). A cinética da maturação nuclear é acelerada de forma
similar após o bloqueio meiótico com alta ou baixa concentração de BLI.
Apoio financeiro: Fapesp processo 03/01479-6
s453
COMPETÊNCIA PARA O DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO DE OÓCITOS

BOVINOS MATURADOS EM MEIO QUIMICAMENTE DEFINIDO
SUPLEMENTADO COM MACROMOLÉCULAS SINTÉTICAS
Vireque, A.A.1; Ferreira, E.M.1; Ferriani, R.A.1; Navarro, P.A.A.S.1;

Rosa e Silva, A.A.M.2; Watanabe, Y.F.3
1
Departmento de Ginecologia e Obstetrícia – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo 14049-900, Ribeirão Preto-SP, Brasil. 2Departamento de Ciências
Fisiológicas – Universidade de Brasília 70910-900, Brasília-DF, Brasil, 3Vitrogen, 14140-000,
Cravinhos-SP. vireque@usp.br
O desenvolvimento embrionário é fortemente influenciado por eventos que ocorrem durante a

maturação oocitária. Meios quimicamente definidos têm sido utilizados para avaliar os efeitos
da suplementação hormonal e proteica na maturação oocitária e no desenvolvimento embrionário
subseqüente. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do sistema de maturação
quimicamente definido, utilizando o meio á-MEM suplementado com IGF-I, Insulina e as
macromoléculas sintéticas álcool polivinílico (PVA) e polivinilpirrolidona (PVP-40), na maturação
in vitro e taxas de produção de blastocistos. Complexos cumulus-oócitos imaturos (COCs n=
1171) de vacas abatidas em matadouro foram maturados por 24 horas em á-MEM ou TCM-199.
Três tratamentos foram testados: 1) á-MEM + IGF-I + Insulina + 0,1% de PVA; 2) á-MEM +
IGF-I + Insulina + 0,1% de PVP-40 e 3) controle: TCM + FSH + 10% de soro de vaca em estro
(SVE). A fertilização in vitro foi realizada em gotas de Fert-Talp. Vinte e duas horas após a
fertilização, os zigotos foram cultivados em CR2aa suplementado com 10% de soro fetal bovino
sob óleo mineral em atmosfera úmida de 95%, 5% de CO2 a 38,5ºC. As taxas de produção de
embriões foram determinadas no D7-D10 da embriogênese. Dados de 12 replicatas foram
analisados pelo teste de Fisher. A produção de blastocistos (40,24%; 45,14% e 44,88%) e taxas
blastocistos eclodidos (41,95%; 41,46% e 48,34%) não foram estatisticamente diferentes entre
os tratamentos 1, 2 e 3, respectivamente (p<0,05). Os resultados indicam que oócitos bovinos
maturados em sistemas de MIV quimicamente definidos, sem SVE e FSH, alcançaram o mesmo
potencial para o desenvolvimento embrionário de oócitos maturados em TCM-199. Entretanto,
avaliações posteriores da qualidade embrionária devem ser realizadas para o uso destes sistemas
em protocolos de PIV de embriões bovinos.
Suporte financeiro: FAPESP/FAEPA-HCFMRP/USP/VITROGEN
s454
FECUNDAÇÃO IN VITRO EM BOVINOS COM CISTEAMINA, 2-

MERCAPTOETANOL E HEPARINA
Gonçalves, F.S.1; Barretto, L.S.S.1; Perri, S.H.V.2; Mingoti, G.Z.2
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, 14884-900, Jaboticabal-SP, Brasil, 2 DAPSA-FMVA-UNESP,
16050-680, Araçatuba-SP, Brasil. ferilha@hotmail.com
No processo fisiológico de metabolismo do embrião ocorre a formação de espécies reativas de

oxigênio (ROS). In vivo, oócitos e embriões parecem estar protegidos contra o estresse oxidativo
pela ação de substâncias presentes no fluido folicular e fluidos do oviduto, as quais eliminam ou
amenizam o efeito das ROS. Porém, in vitro, já foram relatados danos à estas estruturas, resultantes
de uma baixa produção e /ou decréscimo de mecanismos que combatem as ROS. O objetivo
desse experimento foi avaliar o efeito dos antioxidantes (cisteamina e 2-mercaptoetanol) e da
heparina no meio de fecundação sobre o desenvolvimento embrionário. Os oócitos foram
maturados in vitro (MIV) em meio TCM-199 suplementado com 10% SFB, 0,5 μg FSH, 100 UI
hCG e 1 μg estradiol/ml por 24h, a 38,5ºC, com 5% de CO2 em ar atmosférico. O meio de
fecundação foi o TALP suplementado ou não com 10 ìg de heparina e 160 ìL da solução de PHE
(denominados respectivamente de TALP-FIV/Hep+PHE ou TALP-FIV) que, dependendo do
grupo experimental, foi ainda suplementado com 50 µM de 2-Mercaptoetanol (2-ME), ou 50
µM de Cisteamina (Cist) ou 5 mM de DL-Buthionine-Sulfoximine (BSO) ou não receberam
suplementação (Controle). Os zigotos foram cultivados em meio SOFaa + 0,5%BSA +2,5%SFB.
Foi analisada a taxa de blastocistos (168 e 192 horas pós-inseminação - hpi) e de eclosão (192hpi).
Os dados foram analisados por ANOVA (P<0,05) considerando-se um experimento fatorial (4
grupos x 2 [com ou sem heparina]). A adição de cisteamina ao meio de fecundação influenciou
negativamente (P<0,05) o desenvolvimento embrionário nas fases de blastocisto à 168hpi (8.9%b)
e à 192 hpi (11.0%b) entre os grupos Contr, 2-ME e BSO: 23,8%a, 21,2%a e 22,4%a; 32,9%a
28,5%a 28,6%a, respectivamente nas mesmas fases. Este efeito também foi observado nos meios
TALP-FIV, apresentando 16,7%A e 1,2 %B à 168hpi; e 19,9%A e 2,2%B à 192 hpi, com e sem
heparina, respectivamente. O uso da cisteamina revelou uma taxa de eclosão (192 hpi) (3,2%b)
menor (P<0,05) que o 2-ME (12,9%a). Quando o meio FIV foi suplementado com 2-ME na
presença de heparina (21,1%A versus 4,7%B sem/hep.), houve efeito benéfico (P<0,05) sobre a
taxa de eclosão (Bl 192hpi). A cisteamina promoveu uma queda nas taxas de blastocistos (168 e
192 hpi) e de eclosão (192 hpi). Já a heparina incrementou a produção de blastocistos e teve
efeito benéfico sobre a taxa de eclosão, quando o meio TALP-FIV foi suplementado com
antioxidante 2-ME.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
s455
EFEITO DE ANTIOXIDANTES NO MEIO DE FECUNDAÇÃO IN VITRO SOBRE A

QUALIDADE EMBRIONÁRIA EM BOVINOS
Gonçalves, F.S.1; Barretto, L.S.S.1; Perri, S.H.V.2; Mingoti, G.Z.2
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, 14884-900, Jaboticabal-SP, Brasil; 2 DAPSA-FMVA-UNESP,
16050-680, Araçatuba-SP, Brasil. ferilha@hotmail.com
A presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) pode afetar negativamente o desenvolvimento

e qualidade dos embriões bovinos durante o cultivo. A qualidade embrionária pode ser avaliada
pela quantificação das células da massa celular interna (MCI) e trofectoderma (TF), uma vez
que, o número de células do embrião determina o desenvolvimento fetal normal. O objetivo
desta pesquisa foi avaliar o efeito da suplementação de antioxidantes cisteamina (Cist) e 2-
mercaptoetanol (2-ME) ao meio de fecundação in vitro sobre a qualidade embrionária. Os oócitos,
obtidos de abatedouro, foram maturados in vitro (MIV) por 24h, em temperatura de 38,5ºC, com
5% de CO2 em ar atmosférico, em meio TCM-199 suplementado com 10% SFB, 0,5 μg FSH,
100 UI hCG e 1 μg estradiol/ml. O meio de fecundação TALP foi suplementado com 10 ìg de
heparina e 160 ìL da solução de PHE (denominado de TALP-FIV/Hep+PHE) que, dependendo
do grupo experimental, foi suplementado com 50 µM de 2-Mercaptoetanol (2-ME), ou 50 µM
de Cisteamina (Cist) ou 5 mM de DL-Buthionine-Sulfoximine (BSO) ou não recebeu
suplementação (Controle). Os zigotos foram cultivados em meio SOFaa + 0,5%BSA +2,5%SFB.
No sétimo dia de cultivo (CIV) foi efetuada a coloração diferencial dos blastocistos por
fluorocromo, (IWASAKI et al., J.Reprod. Fertil., 90, 279-285, 1990). Os blastocistos foram
tratados com Pronase (0,5% em PBS) a 37ºC por 5 minutos, para a remoção da zona pelúcida
sendo, posteriormente, lavados três vezes em meio TCM-199/Hepes com 10% de SFB e duas
vezes em TCM-199/Hepes sem SFB. Imediatamente após, os blastocistos foram incubados em
gelo durante 10 minutos, em solução de ácido pícrico (10mM) e polivinil-pirrolidona (PVP)
(3mg/mL) em PBS. A seguir, foram lavados em meio TCM-199 Hepes, incubados a 38,5ºC por
20 minutos em soro de coelho anti-bovino na proporção de 1:10 em meio TCM-199 Bicarbonato.
Na seqüência, os embriões foram lavados em meio TCM-199 com 10% de SFB, incubados a
38,5ºC por 30 minutos em complemento de cobaia na proporção de 1:10 em meio TCM-199
Hepes acrescido de 10µg/mL de iodeto de propídio (PI; cora o trofectoderma) e 10µg/mL de
Hoechst 33342 (cora a massa celular interna). Finalizando, os blastocistos foram lavados em
PBS com 0,3% de BSA, fixados em lâminas com glicerol, e avaliados em microscopia de
epifluorescência para verificação da qualidade proporcional do número de células da massa celular
interna (MCI), trofectoderma (TF). Dos 191 embriões destinados a coloração diferencial, 93
foram analisados, considerando uma perda de 51,3% durante o processo de coloração. Aplicou-
se a Análise de Variância (ANOVA; P<0,05) considerando-se um experimento fatorial para
verificação de diferenças entre tratamentos (suplemento do meio de fecundação). A cisteamina
(MCI=31,8%a e TF=68,2%a) e o 2-ME (MCI=32,08%a e TF=67,92%a) não afetaram (P>0,05) o
percentual de MCI e TF quando comparadas ao grupo controle (MCI=24,12%a e TF=67,92%a).
A adição de antioxidantes ao meio de fecundação in vitro não afetou a qualidade embrionária,
não influenciando o número de células da MCI, TF.
Apoio Financeiro: FAPESP and CNPq
s456
EFEITO DE ANTIOXIDANTES SOBRE A MEMBRANA ESPERMÁTICA BOVINA

DURANTE A FIV: AVALIAÇÃO POR ASSOCIAÇÃO DE SONDAS
FLUORESCENTES
Gonçalves, F.S.1; Barretto, L.S.S.1; Arruda, R.P.2; Perri, S.H.V.3; Mingoti, G.Z.3
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, 14884-900, Jaboticabal-SP, Brasil; 2 DRA-FMVZ-USP, São
Paulo-SP, Brasil; 3DAPSA-FMVA-UNESP, 16050-680, Araçatuba-SP, Brasil.
ferilha@hotmail.com
Atualmente, muitas de pesquisas estão voltadas para os efeitos protetores dos antioxidantes na
criopreservação do espermatozóide, no entanto poucos estudos têm avaliado seus efeitos sobre a
interação da célula espermática com oócito durante a fecundação in vitro (FIV). Sendo assim, o
objetivo desse experimento foi avaliar os efeitos protetores contra as ROS dos antioxidantes
cisteamina (Cist) e 2-mercaptoetanol (2-ME) adicionados ao meio de fecundação sobre a
integridade das membranas espermáticas (plasmática, acrossomal e mitocondrial) pelo uso das
sondas fluorescentes (ARRUDA, Acta Scientiae Veterinariae, v. 31, Suplemento, p. 230-231,
2003; CELEGHINI, Tese (Doutorado em Reprodução Animal) – Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade do estado de São Paulo, Pirassununga, 2005). Oócitos
foram maturados in vitro (MIV) por 24h, a 38,5ºC, com 5% de CO2 em ar atmosférico, em meio
TCM-199 suplementado com 10% SFB, 0,5 μg FSH, 100 UI hCG e 1 μg estradiol/ml. O meio de
fecundação foi o TALP suplementado com 10 ìg de heparina e 160 ìL da solução de PHE
(denominado de TALP-FIV/Hep+PHE) que, dependendo do grupo experimental, foi suplementado
com 50 µM de 2-Mercaptoetanol (2-ME), ou 50 µM de Cisteamina (Cist) ou 5 mM de DL-
Buthionine-Sulfoximine (BSO) ou não recebeu suplementação (CONTROLE). Durante a FIV,
nos tempos 0 e 4 horas, foi coletada uma alíquota (500µL) de meio FIV de cada grupo, diretamente
dos “poços” da placa de cultivo, sendo imediatamente transferidas para microtubos que foram
submetidos a centrifugação 750g durante 5 minutos. Uma amostra (30µL) do sedimento formado
de cada grupo foi retirado e transferido a um microtubo ao qual foi adicionado 2 μL de iodeto de
propídeo (PI) (0,2 mg/mL), 1,6 μL de JC-1(0,5 mg/mL - cora diferentes potenciais mitocondriais)
e 10 μL de lecitina de Pisum sativum (FITC-PSA (100 μg/mL – cora acrossoma lesado).
Preparações úmidas foram realizadas para leitura sob microscopia de epifluorescência. Os dados
fora analisados pela ANOVA (P<0,05) considerando-se um experimento fatorial para verificação
de diferenças entre tratamentos (suplemento do meio de fecundação) e o tempo (0 e 4 horas após
FIV). Houve queda (P<0,05) nas médias de espermatozóides que preservaram a integridade de
membrana plasmática durante o tempo (30,4%A e 10,6%B respectivamente, 0 e 4 horas durante a
FIV). Um efeito significativo sobre as porcentagens de espermatozóides com acrossomo íntegro,
não foi constatado (P>0,05) entre os grupos: Contr-0h 52.4%aA, Contr-4h 58.3%aA, Cist-0h
58.0%aA, Cist-4h 58.0%aA, 2-ME-0h 57.7%aA, 2-ME-4h 49.8%aA, BSO-0h 54.5%aA e BSO-4h
56.0%aA. No mesmo intervalo de tempo, não foi observado efeito significativo (P>0,05) sobre as
porcentagens de espermatozóides com alto potencial mitocondrial, entre os grupos: Contr 4.5%a,
Cist 8.5%a, 2-ME 8.7%a e BSO 5.9%a. Não houve efeito dos antioxidantes em preservar a
integridade das membranas plasmática e função mitocondrial durante o tempo. Os espermatozóides
mantiveram o acrossomo íntegro durante o tempo, no entanto esse padrão não foi influenciado
pela presença de antioxidantes (Cist e 2-ME) no meio TALP-FIV.
s457
EFEITO DO TRATAMENTO GONADOTRÓFICO SOBRE A EFICIÊNCIA DA

COLHEITA DE OÓCITOS POR LAPAROSCOPIA EM CAPRINOS: RESULTADOS
PRELIMINARES
Magalhães, D.M.; Pereira, A.F.; Andrade, M.L.L; Cajazeiras, J.B.;

Lopes Júnior, E.S; Freitas, V.J.F
Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução (LFCR), Universidade Estadual do Ceará,

60740-000, Fortaleza-CE, Brasil. vjff@uece.br
A fim de testar o efeito de dois tratamentos gonadotróficos sobre a colheita de oócitos por
laparoscopia em caprinos, quatro cabras mestiças foram distribuídas em dois grupos, de acordo
com o estímulo gonadotrópico a ser testado (simples ou múltiplo). As fêmeas foram submetidas
a um tratamento de sincronização do estro utilizando uma esponja intravaginal com 60 mg de
acetato de medroxiprogesterona (Progespon, Buenos Aires, Argentina), inserida por 11 dias.
Quarenta e oito horas antes da remoção da esponja (RE), as cabras do primeiro grupo (estímulo
simples-ES) receberam 75 µg de d-cloprostenol e, 12 h depois, 8 UA de pFSH (Universidade de
Liège, Bélgica) associado a 300 UI de eCG (Novormon, Buenos Aires, Argentina),
intramuscularmente. As cabras do outro grupo (estímulo múltiplo-EM) receberam o mesmo tipo
e dose de luteolítico, porém 72 h antes da RE. O tratamento gonadotrófico do grupo EM foi
iniciado no oitavo dia do tratamento progestágeno e realizado pela administração de 16 UA de
pFSH em cinco doses decrescentes intramusculares (4/4, 3/3 e 2 UA), a intervalos de 12 h. A
colheita de oócitos foi realizada no grupo ES, logo após a RE, enquanto no grupo EM, este
procedimento foi realizado 24 h após a RE. Para isso, as cabras passaram por um jejum hídrico-
alimentar, 24 h antes da colheita e por um plano anestésico, pouco antes do procedimento. Com
relação à colheita, foi utilizada uma agulha 18 g longa (25 cm) (BIOCORE II®, Villa Raffo,
Argentina), conectada a um tubo de colheita por uma cânula de plástico e a uma bomba de vácuo
(Pioneer Pro-Pump, Quebec, Canadá). A pressão de vácuo foi ajustada para 15 mL por minuto. O
meio de colheita foi TCM199 suplementado com heparina e gentamicina e o volume colhido foi
vertido em uma placa de Petri e observado sob estereomicroscópio (SMZ-IB, Tóquio, Japão).
Foi mensurada a taxa de recuperação oocitária (oócitos recuperados/folículos aspirados) e realizada
a qualificação dos oócitos em Graus: I (apresentando três ou mais camadas de células do cumulus),
II (apresentando 1-2 camadas de células do cumulus), III (não apresentando células do cumulus)
e IV (apresentando oócito degenerado ou ruptura de zona pelúcida). Os dados são apresentados
de uma forma descritiva e expressos como média ± e.p. ou em percentagem. Considerando a
punção folicular, 9,5 ± 6,5 e 12,5 ± 1,5 folículos foram puncionados nos grupos ES e EM,
respectivamente. Com relação à colheita oocitária, os grupos ES e EM apresentaram taxas de
recuperação de 47,4% e 28,0%, respectivamente. Além disso, o grupo ES apresentou 55,6%,
11,1%, 33,3% e 0%, enquanto o grupo EM mostrou 14,3%, 71,4%, 0% e 14,3% de oócitos
classificados como grau I, II, III e IV, respectivamente. Em conclusão, os dois protocolos
produziram uma boa resposta ovariana, porém sessões adicionais serão necessárias a fim de
melhorar a taxa de recuperação e identificar possíveis diferenças entre tratamentos.
s458
MATURAÇÃO NUCLEAR DE OÓCITOS EQÜINOS COM CUMULUS COMPACTO

E EXPANDIDO, EM ATMOSFERA COM MISTURA DE GÁS
Curcio, B.R.1; Leite, D.S.P.1; Boff, A.L.N.2; Velho, J.2; Rambo, G.1;
1
Centro de Biotecnologia (CENBIOT)/UFPel; 2 Dep. Clínicas Veterinárias/FV/UFPel, Campus
Universitário s/n°-Caixa Postal 354 CEP 96010-900, Pelotas/RS.
enderlebr@terra.com.br
Em oócitos eqüinos a expansão das células do cumulus está relacionada a estágios iniciais de
atresia folicular que parecem estimular a competência dos oócitos ao desenvolvimento in vitro.
O objetivo do presente estudo foi comparar o índice de maturação nuclear de oócitos eqüinos
com cumulus compacto (CP) e cumulus expandido (EX), em atmosfera com mistura de gás.
Foram utilizados oócitos eqüinos, provenientes de ovários de abatedouro, coletados por curetagem
da parede de folículos entre 10 e 35mm de diâmetro. Imediatamente após a coleta, os complexos
cumulus oophorus foram classificados de acordo com as características das células do cumulus
em CP (n=82) e EX (n=79). A maturação foi realizada em “bags”, no meio TCM199 com adição
de 400 ng/ml eGH + 200 ng/ml IGF-I, suplementado com 0,1% BSA, 100 UI/ml de penicilina e
50 μg/ml de estreptomicina, a temperatura de 39°C, sob atmosfera contendo 5% CO2, 5% O2 e
90% N2 (mistura de gás). Após a maturação de 40h, houve a retirada das células do cumulus por
cuidadosa pipetagem em hialuronidase (80 UI/ml). Os oócitos foram avaliados em microscópio
invertido e após encubados por 15 min em Hoechst 33342 (10μg/ml) para análise do estágio de
maturação nuclear por microscopia de epifluorescência. A análise estatística foi realizada pela
comparação dos índices de maturação através do Teste de Chi-quadrado (χ2). Os índices de
maturação nuclear (metáfase II) foram de 29,3% nos oócitos CP e de 53,2% nos EX, sendo
encontrada diferença estatística entre os grupos (p<0,05). Estudos anteriores comprovaram que,
sob atmosfera de 5% de CO2, oócitos eqüinos EX com ooplasma de coloração irregular obtêm
maior índice de maturação do que oócitos CP, os quais possuem ooplasma homogêneo. No
presente estudo, constatou-se competência meiótica superior em oócitos EX em relação à oócitos
CP, em atmosfera com mistura de gás. Com base nos dados apresentados, pode-se concluir que
oócitos eqüinos com cumulus expandido demonstram maior índice de maturação do que oócitos
com cumulus compacto quando cultivados sob atmosfera contendo 5% CO2, 5% O2 e 90% N2.
s459
EFEITO DO MEIO DE FECUNDAÇÃO E DO PERÍODO DE INCUBAÇÃO

ESPERMATOZÓIDE/OÓCITO NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES
SUÍNOS.
Marques, M. G.; Goissis, M.D; Nascimento, A.B.; Peres, M.A.; Gonçalves, J.S.A.;
Feitosa, W.B.; Assumpção, M.E.O.A.; Visintin, J.A.
Departamento de Reprodução Animal – FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil. mgroke@usp.br
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de dois meios de fecundação in vitro (FIV): TCM199
e mTBM e dois períodos de incubação de espermatozóides/oócitos: 6 horas e 30 minutos. Os
oócitos de ovários de matadouro foram maturados no meio TCM199 suplementado com 3,05mM
glicose, 0,91mM piruvato de sódio, 10% fluido folicular suíno, 0,57mM cisteína, 10ng EGF/ml,
10UI eCG/ml e 10UI hCG/ml por 22 horas, seguido de incubação por 22 horas em meio sem
hormônios. Após a maturação in vitro, os oócitos foram fecundados nos meios TCM199
suplementado com 3,05mM glicose, 0,91mM piruvato de sódio, 0,57mM cisteína, 1mg/ml de
BSA, 3,06mM/ml de Cafeína e mTBM suplementado com 5mM/ml de piruvato de sódio, 0,57mM
cisteína, 1mg/ml de BSA, 2mM/ml de Cafeína. O sêmen de três cachaços foi misturado, diluído
e armazenado por 24 horas em meio BTS, quando foi centrifugado e o sedimento dividido em
duas partes e resuspendidas nos meios de FIV onde permaneceram por duas horas para capacitação.
Os oócitos tiveram as células do cumulus oophurus removidas, lavados nos meios de fecundação
e adicionados dos espermatozóides pré-capacitados na concentração de 6x105 sptz/ml em
microgotas de 90μl. Após 30 minutos, metade dos oócitos de cada grupo foi delicadamente
lavada 1 vez nos respectivos meios FIV e retornou para o meio sem espermatozóides por mais 5
horas e meia (grupo 30 minutos) e a outra metade permaneceu por 6 horas com os espermatozóides
(grupo 6 horas). Decorridas às 6 horas de FIV, os oócitos foram lavados e cultivados no meio
PZM3 por 7 dias. Ao compararmos os índices de clivagem no terceiro dia de desenvolvimento
observa-se que não houve diferença entre os grupos TCM6h, mTBM30m e mTBM6h (36,96%;
36,25%; 43,53%, respectivamente), porém houve diferença entre os grupos TCM30m (24,49%)
e mTBM6h. Quando avaliou-se os índices de blastocisto (D7) e de eclosão (D9), não houve
diferença entre os grupos fecundados no mTBM (Blastocistos: 37,93%; 40,54% e Eclosão: 27,27%
e 46,67%, respectivamente, para 30m e 6h), já em relação ao TCM199 não houve produção de
blastocistos. Conclui-se que o meio de fecundação in vitro mTBM foi mais eficiente do que o
TCM199 em relação à produção de embriões e que a retirada do excesso de espermatozóides
após 30 minutos da FIV não interfere nos índices de clivagem, blastocisto e de eclosão.
Suporte financeiro FAPESP 05/01420-7
s460
INCREMENTO DA OBTENÇÃO DE OÓCITOS EM VACAS NELORE COM

UTILIZAÇÃO DE UM PROTOCOLO HORMONAL COM PROGESTERONA
INJETÁVEL
Bacelar, D.1; Padilha, L.C.2; Baruselli, P.S.3; Seneda, M.M.4
1
Pós-graduação da Universidade Estadual de Londrina (UEL), 2Graduanda do Curso de
Medicina Veterinária da UEL, 3Universidade de São Paulo (USP), 4Departamento de Clínicas
Veterinárias, CCA, UEL, PR, 86051- 990. danilobacelar@msn.com
O objetivo deste estudo foi testar um protocolo pré-aspiração folicular sem o uso de implante de
progesterona, quanto ao diâmetro folicular e à recuperação dos oócitos. Novilhas Nelore não
gestantes foram divididas em grupos 1 (G1; n=7) e 2 (G2; n=8) e submetidas a dois protocolos
pré-aspiração folicular, em um esquema fatorial 4 X 2. O Protocolo Aspiração Folicular (PAF)
consistiu na aspiração de todos os folículos visíveis apenas para controle de onda, sem
aproveitamento dos oócitos, em um dia qualquer do ciclo (D0) seguida pela aplicação IM de 0,5
mg, de um análogo de PGF2á (Sincrocio, Ourofino, Brasil). No dia 3, procedeu-se à nova
aspiração folicular para obtenção de oócitos e avaliou-se a presença de corpo lúteo (CL). O
Protocolo Controle Hormonal (PCH), consistiu em aplicar no D0 2 mg de Benzoato de Estradiol
(Estrogin, Farmavet), 0,5 mg, de um análogo de PGF2á (Sincrocio, Ourofino, Brasil) e 50 mg
de progesterona sintética injetável, todos via IM. Após 6 dias, procedeu-se à aspiração folicular
para obtenção dos oócitos, e avaliação da presença de CL. Os dados foram analisados pelo
ANOVA. Foram realizadas 60 aspirações (30 em cada tratamento) sendo aspirados 508 folículos,
201 após o PAF e 307 folículos após o PCH (P < 0,05). Obtêve-se 388 oócitos, sendo 162 após
o PAF e 226 após o PCH. As médias de folículos / oócitos por animal no PAF e PCH, foram,
respectivamente, 7,2 / 5,4 e 11 / 7,3 (P<0,05). Nos 60 procedimentos realizados, apenas 12 CL´s
foram encontrados, sendo 10 após PAF e 2 após PCH (P<0,05). Conclui-se que o protocolo de
aspiração folicular com controle hormonal foi mais eficiente do que o protocolo sem controle
hormonal quanto a obtenção de oócitos, facilidade de aspiração devido à ausência de CLs, além
da sua praticidade sem a necessidade da utilização do implante de progesterona.
Palavras-chaves: Nelore, aspiração folicular, progesterona, implante.
s461
TÉCNICA ALTERNATIVA PARA OBTENÇÃO DE OÓCITOS POR

LAPAROSCOPIA EM CABRITAS
Cordeiro, M.F.; Di Filippo, P.A.; Dória, R.G.S.; Dias, D.P.M.; Beretta, C.A.G.;
Oliveira, M.E.F.; Oliveira Jr., E.G.; Ribeiro, G.; Alves, A.E.;
Duarte, A.L.L.; Vicente, W.R.R.
DMVPRA-FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, 14884-900, Brasil. cordeiro@fcav.unesp.br
Dentre as técnicas cirúrgicas, a laparoscopia tem ganhado destaque por ser menos invasiva e ter
um menor tempo de execução, reduzindo portanto o estresse sofrido pelo animal. Técnicas para
a obtenção de oócitos in vivo não têm se desenvolvido com a mesma velocidade que outras
biotécnicas. Este trabalho teve como objetivo avaliar uma técnica alternativa para aspiração
folicular por laparoscopia em cabritas. Oito fêmeas caprinas com idades variando de 4 a 6 meses
de idade foram submetidas a seis sessões para colheita de oócitos cada, totalizando 48
laparoscopias. Através de duas punções no abdome (região cranial ao úbere) foram introduzidos
trocateres para a colocação do endoscópio e da pinça de manipulação atraumática. O abdome foi
insuflado com CO2, utilizando-se uma pressão total de 5mmHg. Para a aspiração folicular foi
utilizado um cateter de acesso venoso periférico (BD Angiocath®) com 16G de diâmetro. Este
era conectado a um sistema de aspiração ligado a uma bomba a vácuo. O ovário era seguro pela
pinça atraumática, encostado na parede abdominal ipsilateral e o cateter era inserido na cavidade,
próximo ao ovário a ser puncionado. Ao final da sessão, os ovários eram banhados com solução
de PBS heparinizado a fim de evitar futuras aderências. O líquido aspirado foi levado ao
estereomicrocópio e os oócitos encontrados foram classificados de acordo com a qualidade. O
número total de oócitos recuperados foi em média de 23/cabrita. A taxa de colheita foi considerada
baixa (3,88 oócitos/cabrita/sessão), o que pode ter sido atribuído ao número de folículos
puncionados (458) que foi inferior ao número de folículos observados (615), bem como ao calibre
da agulha (16G) que prejudicou a aspiração de folículos menores que 5mm. A pressão utilizada
no vácuo, embora tenha causado desnudamento de alguns oócitos, não comprometeu a qualidade
total destes (12,37% grau I; 36,56% grau II; 24,19% grau III e 26,88% grau IV). Não foi observada
formação de aderências entre as estruturas do sistema genital e destas com outros órgãos na
grande maioria das fêmeas. O uso do cateter permitiu o acesso aos ovários sem apresentar o risco
de lesão de órgãos adjacentes, ficando este restrito à parte superior da cavidade. Além disso, a
bainha plástica protegia a ponta da agulha enquanto o ovário era manipulado, sendo exposta
apenas no momento de aspirar o folículo. As punções na pele cicatrizavam já no terceiro dia pós-
operatório. O tempo das laparoscopias foi em média de 35 minutos. Esta técnica de laparoscopia
para aspiração folicular mostrou ser simples e segura, podendo ser utilizada diversas vezes na
mesma fêmea. No entanto, ajustes na técnica devem ser feitos para melhorar a taxa de colheita e
a qualidade dos oócitos recuperados.
s462
EFEITO DO TOURO NAS TAXAS DE PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES,

PRENHEZ E MORTE EMBRIONÁRIA: RESULTADOS PRELIMINARES.
Pontes, J.H.F.1; Spegiorin, M.R.2; Silva, K.C.F.2; Seneda, M.M.2.
1
In Vitro Brasil Ltda, 13800-970, Mogi Mirim-SP, Brasil; 2 Departamento de Clínicas
Verterinárias, Universidade Estadual de Londrina, 86051-990, Londrina-PR, Brasil.
michele_spg@yahoo.com.br
O efeito do touro é um dos principais obstáculos à obtenção de melhores índices de eficiência na

produção in vitro de embriões (PIVE). Para avaliar o impacto disso, quatro touros Nelore foram
avaliados quanto às taxas de produção de embriões, prenhez e morte embrionária (ME). Os
dados foram obtidos na empresa In Vitro Brasil Ltda, Mogi Mirim – SP. Os oócitos foram obtidos
por aspiração folicular (OPU), de vacas Nelore. Utilizou-se sêmen congelado, obtido de centrais
de colheita de sêmen. Os oócitos foram selecionados e, em seguida, maturados in vitro (MIV),
por 24 horas, em meio TCM 199 Bicarbonato, acrescido de piruvato/LH/FSH +10% de SFB, a
38,8ºC, em 5% CO2 em ar. Após MIV os oócitos seguiram para gotas de meio FIV (meio Tyrodes
acrescido de BSA, piruvato, gentamicina e heparina, esta numa concentração de 10µg/mL), onde
receberam o sêmen diluído a 1x106 espermatozóides vivos/mL, preparado em gradiente Percoll
(45-90%). Em seguida à fecundação in vitro (FIV), os zigotos e as células do cumulus foram
transferidos para gotas de cultivo in vitro (CIV) contendo meio de cultura de embriões (fluido de
oviduto sintético modificado SOFaa BSA). Os embriões viáveis no D7 (considerando D0 como
dia da FIV) foram transferidos para novilhas receptoras sincronizadas, por meio de inovulação
transcervical. O diagnóstico de gestação foi realizado com auxílio da ultra-sonografia. A morte
embrionária foi calculada pela diferença de percentual entre as taxas de gestação com 30 e 60
dias. A comparação entre os touros foi realizada pelo método do qui-quadrado. Dos 14.270
oócitos, coletados nas 946 sessões de OPU, obteve-se um índice de 33,5% (4.781/14.270) de
embriões produzidos, sendo de 33,2% (4.736/14.270) o índice de embriões considerados viáveis
para transferência. A taxa de prenhez considerou apenas os embriões com transferência confirmada,
sendo, então, de 32,0% (1.467/4.586). A taxa de morte embrionária total foi de 12,7 % (187/
1.467). Os resultados de cada touro, quanto à variável embriões produzidos, foram os seguintes:
Touro A 23,3% (1.112/4.764), Touro B 37,6% (1.183/3.148), Touro C 34,5% (962/2.785) e Touro
D 42,7% (1.524/3.573). Todos os touros mostraram-se significativamente diferentes nesse aspecto
(P<0,05). No aspecto taxa de prenhez, o Touro A obteve 29,2% (301/1.031), o Touro B 31,8%
(365/1.147), o Touro C 33,6% (307/915) e o Touro D 33,1% (494/1.493); apenas o touro A
mostrou-se significativamente diferente dos demais (p<0,05). No que se refere à morte
embrionária, o Touro A obteve 14,0% (42/301), o Touro B 9,9% (36/365), o Touro C 12,4% (38/
307) e o Touro D 14,4% (71/494), não havendo, neste caso, diferença significativa entre eles.
Desse modo, a partir da constatação da importância do efeito do touro, modificações nos protocolos
de processamento do sêmen estão em andamento, a fim de incrementar os índices dos touros que
obtiveram os piores resultados.
s463
EMBRIÕES BOVINOS CULTIVADOS EM MEIO LIVRE DE SORO EM

DIFERENTES CONDIÇÕES ATMOSFÉRICAS
Serapião, R.V.1,4; Ramos, A.A.2; Polisseni, J.1; Folhadella, I.M.1,3; Dias. N.B.1;
Camargo, L.S.A.1; Viana, J.H.M.1; Ferreira, A.M.1; Sá, W.F.1; Fonseca, F.A.4
1
Embrapa Gado de Leite - Juiz de Fora - MG; 2Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas
Gerais - Epamig – Belo Horizonte - MG; 3Escola de Veterinária – UFMG – Belo Horizonte –
MG; 4Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF – Campos dos
Goytacazes – RJ. rserapis@yahoo.com.br
A utilização de sistemas quimicamente definidos na produção in vitro de embriões evitaria os

efeitos da variabilidade de condições, bem como os riscos de contaminação. Uma vez que o soro
fetal bovino (SFB) tem sido associado a várias alterações em embriões bovinos gerados in vitro,
este estudo teve como objetivo avaliar o efeito do Knockout™ SR (KSR; Gibco Labs., Grand
Island, NY) e da atmosfera de O2 no desenvolvimento de embriões bovinos fertilizados in vitro.
Oócitos obtidos a partir de ovários de fêmeas bovinas abatidas em matadouro foram maturados
e fecundados in vitro. Posteriormente, os possíveis zigotos foram distribuídos aleatoriamente
em quatro tratamentos, sendo T1 (n= 53): CR2aa + 10% KSR em 20% O2; T2 (n=85): CR2aa +
10% KSR em 5% O2; T3 (n=129): CR2aa + 10% SFB + 1mg/ml BSA em 20% O2, e T4 (n=88):
CR2aa + 10% SFB + 1mg/ml BSA em 5% O2. As estruturas submetidas à atmosfera de 5%O2
não foram co-cultivadas com células do cumulus. Os cultivos foram realizados em gotas de 50μl
cobertas com óleo mineral, em estufa incubadora a 38,5 °C, 95% de umidade e 5% CO2. A taxa
de clivagem foi determinada 72 horas pós-fertilização (hpf). Foram avaliadas as taxas de
blastocistos no sétimo e oitavo dias pós-fertilização, em relação ao número total de oócitos
(BLD7 e BLD8) e em relação ao número de oócitos clivados (D7/CLIV e D8/CLIV). O número
total de células embrionárias foi determinado no oitavo dia pós- fertilização apenas do T1, T2 e
T3. As taxas de clivagem e blastocistos foram analisadas pelo teste Qui-quadrado e o número
total de células por análise de variância. Não houve diferença (P>0,05) entre T1, T2, T3 e T4 em
relação à taxa de clivagem (75,5%, 77,6%, 76,0% e 71,6%), BLD7 (15,1%, 17,6%, 19,4% e
15,9%) e D7/CLIV (20,0%, 22,7%, 25,5% e 22,2%). As taxas de blastocisto do oitavo dia diferiram
(P<0,05) apenas entre T3 e T4 (27,1% e 14,8%), sendo o mesmo observado na taxa de blastocistos
calculada em relação ao número total de estruturas clivadas (35,7% e 20,6%). O número total de
células foi semelhante (P>0,05) em T1, T2 e T3 (117,3±10,7; 122,9±17,3 e 121,1±18,1). A
quantidade e qualidade de blastocistos cultivados em meio suplementado com KSR ou SFB foi
satisfatória, independente do controle de atmosfera ou presença de co-cultura. Desta forma o
KSR mostrou ser uma alternativa para produção in vitro de embriões bovinos.
s464
EFEITO DA QUALIDADE MORFOLÓGICA DOS OÓCITOS SOBRE O

DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO IN VITRO
De Bem, T.H.C.1; Biase, F.H.2; Bortolotti, G.M.F.1; Adona, P.R.2;

Meirelles, F.V.2; Leal, C.L.V.2
1
Centro Universitário Hermínio Ometto – UNIARARAS, Araras-SP. 2 Departamento de
Ciências Básicas, Universidade de São Paulo, Pirassununga, São Paulo, Brasil, 13635-900
tiagodebem@yahoo.com.br
O presente estudo teve por objetivo avaliar diferentes categorias morfológicas de oócitos bovinos
e seu efeito sobre o desenvolvimento embrionário. Os ovários foram coletados em abatedouro e
os folículos de 2-6mm de diâmetro foram aspirados para a obtenção dos oócitos. Os oócitos
selecionados foram divididos em 4 grupos morfológicos: grupo I (GI) oócitos contendo mais de
3 camadas de células do cumulus compactas e citoplasma homogêneo; grupo II (GII) oócitos
contendo entre 2 e 3 camadas de células do cumulus compactas e citoplasma homogêneo; grupo
III (GIII) oócitos contendo 1 camada de células do cumulus compacta e citoplasma homogêneo
e no grupo IV (GIV) oócitos contendo cumulus parcialmente expandido e citoplasma homogêneo.
A maturação dos oócitos foi realizada por um período de 22h em TCM-199 com 10% SFB,
0,5µg/mL de FSH, 5,0µg/mL de LH, 2,0mM de piruvato e 10mg/mL de gentamicina. O cultivo
foi feito em estufa de CO2 a 38,5ºC em atmosfera de 5% de CO2 em ar. Para a fecundação in vitro
foi utilizado sêmen congelado, o qual foi preparado segundo a técnica de gradiente Percoll. Os
espermatozóides foram adicionados na gota de fecundação a uma concentração final de 2 x 106
espermatozóides/mL. A fecundação foi realizada em TALP-FIV suplementado com 2µM
penicilamina, 1µM hipotaurina, 250µM epinefrina e 20µg/mL heparina. Após 20h de fecundação,
os oócitos foram parcialmente desnudados e transferidos para o meio de cultivo in vitro (CIV,
TCM-199 suplementado com 10% de SFB, 2,0mM de piruvato e 10mg/mL de gentamicina). A
taxa de clivagem foi avaliada com 48h de CIV e no quinto dia de cultivo foi feito feeding (40%)
do meio. As avaliações das taxas de formação de blastocisto foram feitas nos dias 7 e 8 do CIV.
A analise estatística foi realizada pelo programa BIOESTATS 2.0 e o teste aplicado foi Qui-
Quadrado (x2) adotando o nível de 5% de significância. O número de oócitos avaliados em
quatro réplicas foi de 92 (GI), 91 (GII), 89 (GIII) e 89 (GIV), apresentando uma taxa média de
clivagem de 75,25% (P > 0,05). Com relação à percentagem de blastocistos no D7 do CIV, o
grupo GIV (n=42, 47,2%) diferiu (P < 0,05) dos demais grupos de oócitos. Os grupos GI (n=34,
37%), GII (n=26, 28,6%) e GIII (n=26, 29,2%) não diferiram (P > 0,05) entre si. A taxa de
embriões com oito dias de cultivo foi similar entre o GI (n=36, 39,1%), GII (n=27, 29,7%) e GIII
(n=29, 32,6%), que diferiram do GIV (n=48, 54%). Estes resultados sugerem que os oócitos do
grupo GIV possuem uma maior capacidade na produção de blastocistos em relação aos demais
grupos, e possivelmente essa capacidade está relacionada com a característica folícular de onde
esses oócitos são provenientes.
s465
EFEITO DO BLOQUEIO DA MEIOSE SOBRE O DESENVOLVIMENTO

EMBRIONÁRIO IN VITRO
Adona, P.R.; De Bem, T.H.C.; Balieiro, J.C.C.; Leal, C.L.V.
Depto de Ciências Básicas – FZEA/USP, Pirassununga – SP, Brasil.

paulo_adona@yahoo.com.br
Uma das alternativas que vários pesquisadores vêm analisando para estudar a competência de
desenvolvimento dos ovócitos in vitro é o bloqueio da retomada da meiose antes da maturação.
O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito do uso da butirolactona I (BL I) no
desenvolvimento embrionário in vitro. Ovários bovinos foram coletados em frigoríficos e os
folículos de 2-6 mm de diâmetro foram aspirados para a obtenção dos ovócitos. Para o bloqueio
da meiose os ovócitos foram cultivados por 24 h em meio TCM-199 com 100 (B100) e 10 μM
BL I (B10) suplementado ou não com BSA (3 mg/mL), respectivamente. Após o período de
bloqueio, os ovócitos foram transferidos para o meio de maturação in vitro (MIV: TCM-199
suplementado com 10% de SFB, 5,0 µg/mL de LH, 0,5 µg/mL de FSH, 0,2 mM de piruvato e 10
μg/mL de gentamicina) por 21 h. Como controle (C), um grupo de ovócitos foi submetido à
maturação sem sofrer cultivo prévio de bloqueio. Para a fecundação in vitro (FIV) foi utilizado
sêmen congelado, cuja separação espermática foi preparada com a técnica de gradiente Percoll.
Os espermatozóides foram adicionados ao meio de fecundação com concentração final de 2 x
106 espermatozóides/mL. A FIV foi feita em TALP-FIV suplementado com 2 µM penicilamina,
1 µM hipotaurina, 250 µM epinefrina e 20 µg/mL heparina (181 UI/mg). Após 18 h de FIV, os
ovócitos foram parcialmente desnudados com auxílio de um micropipetador e transferidos para
o meio de cultivo in vitro (CIV) SOF (fluido de oviduto sintético). Com 48 h de CIV foi avaliada
a taxa de clivagem. Os ovócitos clivados permaneceram no meio de CIV e os demais foram
descartados. No quinto dia de CIV foi feita a troca (feeding) parcial (40%) do meio de cultivo e
a partir do sétimo (D7) e do oitavo dia (D8) foi feita a avaliação das taxas de formação de
blastocisto (D7) e de eclosão (D8) e a contagem do número de células dos embriões eclodidos
(D8). A MIV, a FIV e a CIV foram conduzidas em estufa de CO2 a 38,5ºC em atmosfera de 5% de
CO2 em ar. O número total (n) de ovócitos avaliados em quatro repetições foi de 120 (C), 113
(B10) e 109 (B100), apresentando uma taxa média de clivagem de 84,5% que não diferiu (P >
0,05) entre os grupos. Com relação à percentagem de blastocisto no D7, os grupos C (n=46,
38,3%) e B10 (n=47, 41,6%) não diferiram entre si, mas ambos foram superiores (P < 0,05) ao
grupo B100 (n=36, 33,0%). A taxa de blastocisto eclodido foi similar (P > 0,05) entre os grupos
C (n=23, 19,2%), B10 (n=20, 17,7%) e B100 (n=12, 11,0%) no D8. Também não foi observada
variação (P > 0,05) no número médio de células dos blastocistos no D8, entre o C (138), B10
(136) e B100 (150). A pré-maturação com BL I não aumentou os índices de desenvolvimento,
porém também não comprometeu (B10) o desenvolvimento embrionário, sugerindo a
possibilidade de sua aplicação em biotécnicas de PIV de embriões e de clonagem.
Apoio financeiro: Capes e FAPESP
s466
FRAGMENTAÇÃO DE DNA EM EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO

DE OÓCITOS DE DIFERENTES QUALIDADES MORFOLÓGICAS
De Bem, T.H.C.1; Mesquita, L.G.2; Miranda, M.S.2; Adona, P.R.2;

Meirelles, F.V.2; Leal, C.L.V.2
1
Centro Universitário Hermínio Ometto – UNIARARAS, Araras-SP
2
Departamento de Ciências Básicas, Universidade de São Paulo, Pirassununga,
São Paulo, Brasil, 13635-900. tiagodebem@yahoo.com.br
O presente estudo teve por objetivo analisar a fragmentação de DNA em embriões bovinos
produzidos in vitro de oócitos de diferentes qualidades morfológicas. Os oócitos foram aspirados
de folículos com 2-6mm de diâmetro, obtidos de ovários provenientes de abatedouro. Os oócitos
selecionados foram divididos em 4 grupos morfológicos: grupo I (GI) oócitos contendo mais de
3 camadas de células do cumulus compactas e citoplasma homogêneo; grupo II (GII) oócitos
contendo entre 2 e 3 camadas de células do Cumulus oophorus compactas e citoplasma
homogêneo; grupo III (GIII) oócitos contendo 1 camada de células do cumulus compacta e
citoplasma homogêneo e no grupo IV (GIV) oócitos contendo cumulus parcialmente expandido
e citoplasma homogêneo. A maturação dos oócitos foi realizada por um período de 22h em
TCM-199 com 10% SFB, 0,5µg/mL de FSH, 5,0µg/mL de LH, 2,0mM de piruvato e 10mg/mL
de gentamicina. Para a fecundação in vitro (FIV) os espermatozóides foram adicionados ao meio
de fecundação com concentração final de 2x106 espermatozóides/mL. A fecundação foi realizada
em TALP-FIV suplementado com 2µM penicilamina, 1µM hipotaurina, 250µM epinefrina e
20µg/mL heparina. Após 20h de fecundação, os oócitos foram parcialmente desnudados e
transferidos para o meio de cultivo in vitro (TCM-199 com 10% de SFB, 2,0mM de piruvato e
10mg/mL de gentamicina) e incubados em estufa de cultivo celular com atmosfera de 5% de
CO2 em ar, a 38,5ºC. No nono dia de cultivo (D9) os embriões eclodidos foram fixados por 1h
(PBS com 3% paraformaldeído), permeabilizados por 1h (PBS com 0,5% de Triton X-100, 0,1%
de citrato de sódio e 0,1% PVA) e submetidos à avaliação da fragmentação do DNA pela técnica
de TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit-Roche). As avaliações do número de células e de
fragmentação do DNA dos embriões foram realizadas no microscópio de fluorescência e a análise
estatística foi realizada pelo programa BIOESTATS 2.0 usando o teste de Qui-Quadrado (x2)
adotando o nível de 5% de significância. O número de oócitos destinado à produção de embriões
em quatro réplicas foi de 92 (GI), 91 (GII), 89 (GIII) e 89 (GIV). A taxa de embriões eclodidos no
D9 não diferiu (P>0,05) entre os grupos GI (n=31, 33,7%), GII (n=22, 24,2%), GIII (n=21,
23,6%) e GIV (n=37, 41,5%). O número médio de núcleos avaliados nos embriões eclodidos foi
de 411 (GI), 324 (GII), 341 (GIII) e 377 (GIV) e não foi observada variação (P>0,05) entre os
tratamentos. Com relação ao percentual de núcleos TUNEL positivo (fragmentação do DNA) foi
observada diferença (P<0,05) entre o grupo GI (0,15%) quando comparado ao GII (0,40%), GIII
(0,39%) e GIV (0,57%). Os grupos GII, GIII e GIV não diferiram entre si com relação à
fragmentação do DNA. Os resultados sugerem que a taxa de eclosão e a quantidade de células
dos embriões não está relacionada com a qualidade morfológica dos oócitos, mas a fragmentação
do DNA foi inferior nos embriões produzidos com oócitos de grau I.
s467
TRANSPORTE DE OVÓCITOS IMATUROS E SEU EFEITO NA PRODUÇÃO IN

VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
Leme, L.O.1,2; Marinheiro, G.O.3; Sousa, R.V.1,2; Dode, M.A.N.1; Rumpf, R.1
1
2
UnB, Faculdade de Agronomia e Veterinária, Pós-graduação em Ciências Agrárias; 3UnB,
FAV, Caixa postal 04508, CEP 70910-970 – Brasília/DF. ligileme@yahoo.co.uk
Com o avanço da tecnologia da produção in vitro (PIV) de embriões associado à técnica de

aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-som, novas ferramentas estão disponíveis para
otimizar o uso de fêmeas com alto potencial genético. Ao serem removidos dos folículos, os
ovócitos retomam a meiose espontaneamente e as primeiras horas de maturação são extremamente
importantes para o desenvolvimento subseqüente. Considerando que, em geral, as fazendas de
produção situam-se a grandes distâncias dos laboratórios de PIV, há necessidade de um sistema
eficiente para o transporte desses gametas. Este estudo objetivou avaliar o efeito de diferentes
sistemas de transporte de ovócitos na produção de embriões. Foram utilizados 688 ovócitos
oriundos de ovários de abatedouro, sendo realizadas 5 repetições com 30 ovócitos em média
para cada tratamento. Em todos os sistemas, imediatamente após a recuperação e seleção, os
ovócitos foram colocados em tubo de 2ml, contendo 1ml de meio de maturação coberto com
uma camada de 250µl de óleo mineral. No grupo controle (T1), os ovócitos foram maturados por
22-24h em meio TCM 199 com sais de Earl’s suplementado com hormônios (LH e FSH) e
antibiótico (meio MIV), em tubo aberto na estufa convencional com 5% de CO2 em ar, a 39°C e
alta umidade. Nos tratamentos T2 e T3, a maturação foi realizada em meio MIV em tubo com
tampa de membrana porosa que permite troca gasosa (Eppendorf® LidBac – Eppendorf) em uma
estufa portátil de mistura carbogênica (5% CO2, 20% O2 e N2 balanceado) TK-FIV (TK –
Tecnologia em Congelação Ltda.), a 39°C e alta umidade, programada para injeção gasosa
automática a cada 4h; no grupo T2, após 12h os ovócitos foram transferidos para a estufa
convencional até completarem a maturação, enquanto no T3 os ovócitos permaneceram as 22-24
horas na estufa portátil. Nos grupos T4 e T5, os ovócitos foram maturados em meio de transporte
composto por TCM 199 com sais de Hank’s suplementados igualmente com hormônios e
antibióticos (MIV-t) durante 12h e 22-24h, respectivamente, em banho-maria a 36°C; os ovócitos
do grupo T4 após 12 horas de incubação foram transferidos para meio MIV, permanecendo em
estufa convencional até completarem 22-24h. Após a maturação todos os ovócitos foram
transferidos para o meio de fecundação e inseminados in vitro (D0); após 20h foram transferidos
para meio SOFaaci e cultivados até D7. A taxa de clivagem foi avaliada 48h pós-fecundação e a
taxa de blastocistos em D6 e D7. Os dados foram analisados pelo teste de chi-quadrado A taxa de
clivagem foi menor (P<0,05) para o grupo T5 (67%) em relação ao T1 (80%), mas não diferiu
(P>0,05) do T2 (73%), T3 e T4 (75%). As taxas de blastocisto em D6 foram semelhantes (P<0,05)
para T1(31%), T2 (31%), T3 (33%), e T4 (31%), mas inferior (P<0,05) para T5 (21%). Em D7,
todos os grupos apresentaram porcentagem de blastocisto semelhantes, sendo 43%, 39%, 40%,
36% e 36% para T1, T2, T3, T4 e T5, respectivamente. Os resultados mostraram que é possível
transportar ovócitos a longas distâncias para o laboratório, utilizando tanto a estufa portátil como
o MIV-t durante todo o período de maturação, embora os horários 12h e 24h no MIV-t tenha
demonstrado uma tendência a produzir menos embriões.
s468
PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS CULTIVADOS SOB ALTA E BAIXA

TENSÃO DE O2
Correa, G.A.1,2; Dode, M.A.N.1; Franco, M.M.1; Rumpf, R.1
1
2
UnB, Faculdade de Agronomia e Veterinária, Pós-graduação em Ciências Agrárias; 3UnB,
FAV, Caixa postal 04508, CEP 70910-970 – Brasília/DF. georgia_bio@yahoo.com.br
Apesar dos avanços obtidos nos últimos anos nas técnicas de maturação, fecundação e cultivo in
vitro de embriões bovinos, a qualidade dos embriões produzidos in vitro ainda é inferior a dos in
vivo. O ambiente de cultivo após a fecundação é considerado responsável pela qualidade dos
embriões. Dentre os fatores que podem influenciar o ambiente de cultivo, o estresse oxidativo
causado pela alta tensão de O2 tem recebido especial atenção. Atualmente, a maioria dos sistemas
de cultivo utilizada para a PIV usa o meio SOFaa com atmosfera de 5% de O2. Esse sistema
elimina a necessidade de co-cultivo com células somáticas, mas por outro lado eleva o custo de
produção, além de aumentar a manipulação dos zigotos após a fecundação devido à retirada das
células do cumulus. Portanto, o presente estudo teve por objetivo comparar a produção de embriões
em sistema de cultivo com alta e baixa tensão de O2. Um total de 1118 ovócitos obtidos de
ovários de abatedouro foram maturados e fecundados in vitro. Dezoito horas após a inseminação
(pi) os zigotos foram separados em 2 grupos. No primeiro grupo (T1) os zigotos foram lavados
e transferidos para o meio de cultivo SOFaa e cultivados por 7 dias em atmosfera de 5% CO2 em
ar, à 39°C. No outro grupo (T2), os zigotos foram desnudados por pipetagens sucessivas, e
transferidos para o meio SOFaa, onde foram cultivados em atmosfera de 5% CO2 e 5% de O2, à
39°C. As taxas de clivagem foram avaliadas 48 horas pi e as de blastocisto em D6 e D7 pi. De
ambos os grupos, um total de 94 embriões no estágio de blastocisto expandido em D7 foram
fixados e corados com aceto-orceína para contagem do número de células. Os dados relativos à
taxa de clivagem e blastocisto foram analisados pelo teste do Chi-quadrado e os de número de
células pela analise de variância. A taxa de clivagem foi semelhante (P>0,05) para os grupos
sendo 77,4% para o T1 e 79,9% para o T2. A taxa de blastocisto em D6 foi maior (P<0,05) no
grupo cultivado em baixa tensão de O2 (40,7%) do que no de alta tensão (33,8%). Entretanto, a
taxa de blastocisto em D7 foi similar (P>0,05) para os dois grupos, sendo 44,7% e 47,1% para
T1 e T2, respectivamente. O número total de células (T1= 175,6±54,1; T2= 160,6±41,8) dos
embriões, não variou (P>0,05) entre os dois sistemas de cultivo. Esses resultados sugerem que o
cultivo de embriões bovinos em meio SOFaa sob alta tensão de O2 na presença de células do
cumulus não afeta a quantidade e qualidade dos embriões produzidos in vitro. É possível que as
células do cumulus tenham um papel importante na retirada de substâncias indesejáveis
minimizando o estresse oxidativo causado pela alta tensão de O2.
s469
EFEITO DO BENZOATO DE ESTRADIOL, PROGESTÁGENOS E DA ASPIRAÇÃO

FOLICULAR NA SINCRONIZAÇÃO DA ONDA FOLICULAR E CONCENTRAÇÃO
SÉRICA DE FSH EM NOVILHAS DOADORAS DE OVÓCITOS
Ramos, A.F.1,*; Rumpf, R.2; Mollo, M.R.2,3; Pivato, I.2,4; Nogueira, G.P.5;
Marques Jr, A.P.1; Sartori, R.2
1
UFMG, 30123-970, Belo Horizonte-MG, Brasil, 2Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, 70770-900, Brasília-DF, Brasil, 3FAV-UnB, 70910-970, Brasília-DF, Brasil,
4
Cidasc, 89130-000, Indaial-SC, Brasil, 5DAPSA-FOA-UNESP, 16015-050, Araçatuba-SP,
Brasil. aleframos@hotmail.com
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de benzoato de estradiol (BE) e progesterona/
norgestomet sobre a dinâmica folicular de novilhas aspiradas a cada sete dias, sincronizando a
emergência da onda folicular para aumentar o número de folículos e qualidade dos ovócitos. Em
dois experimentos, 12 novilhas meio sangue Simental x Nelore foram divididas aleatoriamente
em três grupos, com todos os animais participando de todos os grupos. As novilhas foram
sincronizadas com implante de progesterona/progestágeno por 7 d seguido da administração im
de 150 µg de d-Cloprostenol (Prolise, ARSA S.L.R., Argentina) e aspiração de todos os folículos
maiores que 3mm de diâmetro. No experimento 1, os folículos das novilhas do grupo 2X foram
aspirados duas vezes por semana, com intervalo de 3 e 4 d, e os das novilhas do grupo 1X e 1X-
BE uma vez por semana. As novilhas do grupo 1X-BE receberam 2mg de BE im (Ric-Be, Syntex
S.A., Argentina) após a aspiração. No experimento 2, todas as novilhas foram aspiradas com
intervalo de 7 d. As do grupo 0BE não receberam BE, e as dos grupos 2BE e 5BE receberam 2mg
e 5mg após a aspiração. Durante o experimento 1 as novilhas permaneceram com implante
auricular de norgestomet (Crestar, Intervet, São Paulo, Brasil) e no experimento 2 com implante
intravaginal de progesterona (DIB, Syntex S.A., Argentina), que foram substituídos a cada 14 d.
Durante a segunda semana de cada experimento, foi realizada, diariamente, a mensuração do
tamanho do maior folículo, por ultra-sonografia, e coletado sangue para a quantificação da
concentração de FSH. Somente os resultados referentes ao dia seguinte à aspiração dos três
grupos (D1), ao dia seguinte à segunda aspiração do grupo 2X (D5) e ao momento que antecedeu
a próxima aspiração dos três grupos (D7) estão apresentados, para ambos experimentos, na forma
de média±erro padrão. A análise estatística foi realizada por ANOVA e teste de Duncan. No
experimento 1, o tamanho do maior folículo (mm) nos grupos 2X, 1X, 1X-BE foi: D1 4,5±0,8,
4,8±0,6 e 3,6±0,3; D5 5,0±0,4, 9,7±0,3 e 9,4±1,0; D7 9,0±0,0, 13,8±0,7 e 11,8±1,3. Somente em
D5 detectou-se um menor (P<0,05) tamanho folicular nas novilhas do grupo 2X em relação aos
outros grupos. No mesmo experimento, a concentração sérica de FSH (ng/ml) foi: D1 0,7±0,2,
0,7±0,1 e 0,7±0,1; D5 0,8±0,1, 0,3±0,0 e 0,5±0,0; D7 0,5±0,1, 0,4±0,1 e 0,5±0,1, diferindo
(P<0,05) entre todos os grupos no D5. No experimento 2, o tamanho do maior folículo (mm)
para os grupos 0BE, 2BE e 5BE foi: D1 4,5±0,3, 3,8±0,2 e 3,5±0,2; D5 9,1±0,3, 7,3±0,4 e
6,9±0,6; D7 12,0±0,2, 10,5±0,7 e 9,3±0,6. Em todos os momentos, observou-se um maior folículo
no grupo 0BE em relação aos outros grupos, que não diferiram entre si. Embora o uso de BE
associado a progestágeno tenha alterado o padrão de crescimento folicular e a concentração de
FSH em D5, não foi capaz de sincronizar eficientemente a emergência da onda folicular em D5
e o desvio folicular em D7, mesmo alterando a fonte de progestágeno ou aumentando a dose de
BE.
*Bolsista 141077/2004-2 (CNPq). Apoio financeiro: Embrapa-Macroprograma II e Tecnopec.
s470
AVALIAÇÃO DA SOLUÇÃO DE ÁGUA DE COCO NA MANUTEÇÃO DE OÓCITOS

BOVINOS IMATUROS PARA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES
Cordeiro, M.S.; Silva, E.H.S.; Biondi, F.C.; Miranda, M.S.; Andreoti, M.; Carvalho, C.M.F.;
Silva, T.V.G.; Costa, N.N.; Santos, S.S.D.; Ohashi, O.M.
Laboratório de Fertilização in vitro - CCB/UFPA, Belém-PA, Brasil. marcela@ufpa.br
O estresse causado ao oócito pelas condições de transporte até o laboratório é um dos fatores
limitantes na prática comercial da produção in vitro de embriões (PIVE). Por este motivo, a
utilização de um meio de manutenção que forneça maior viabilidade aos complexos cumulus-
oócito (COCs) durante longos períodos de transporte é fundamental. O objetivo desse trabalho
foi avaliar uma solução à base de água de coco como meio de manutenção de COCs bovinos
imaturos. Para simular o transporte, os COCs foram distribuídos aleatoriamente entre: Grupo
Controle - submetido a MIV imediatamente após a seleção; Grupos H6, H9 e H12 - mantidos em
TCM 199-Hepes acrescido de 10% de SFB, antibióticos e piruvato, durante 6, 9 e 12 h,
respectivamente; e Grupos C6, C9 e C12 - oócitos mantidos em solução de água de coco (75%
de água de coco + 25% de água ultrapura) com 25 mM de Hepes, 10% SFB, antibióticos e
piruvato, durante 6, 9 e 12 h, respectivamente. Todos os grupos, exceto o Grupo Controle, foram
mantidos a 30ºC e protegidos da luz. A MIV foi realizada segundo MIRANDA (2004). A FIV foi
realizada em meio TALP-FERT segundo PARRISH et al.(1988). O cultivo in vitro (CIV) foi
realizado em meio CR2 (RONSEKRANS, 1991). As taxas de metáfase II (MII), clivagem,
blastocisto (BL) e BL eclodido foram submetidas à ANOVA. Experimento 1: para avaliar a
capacidade dos COCs, após 6, 9 e 12 h em meio de manutenção, de sofrer maturação nuclear in
vitro, foram submetidos a MIV por 18* e 24 h, independente do tempo de manutenção. As taxas
de MII dos Grupos H9, C9, H12 e C12 com 24 h de MIV foram inferiores (p<0,05) as dos
Grupos H6, C6 com 24 h de MIV e H9*, C9*, H12*, C12* com 18* h de MIV (85,96 ± 8,5,
88,39 ± 6,4, 87,85 ± 5,8, 87,16 ± 3,5 vs. 97,12 ± 2,9, 95,73 ± 3,4, 97,73 ± 3,7, 100 ± 0,0, 94,83
± 1,0, 95,24 ± 4,1%, respectivamente). Entretanto, não houve diferença (p>0,05) dos grupos H9,
C9, H12 e C12 com 24 h de MIV com relação o Grupo Controle (89,29 ± 2,9%). Experimento 2:
Os COCs, após 6, 9 e 12 h de manutenção e 18, 15 e 12 h de MIV foram fecundados e cultivados
in vitro para análise do desenvolvimento embrionário. Houve redução significativa (p<0,05),
apenas nas taxas de BLs dos Grupos H9, C9, H12 e C12 quando comparadas com o Grupo
Controle e os Grupos H6 e C6 (33,9 ± 8,7, 35,9 ± 8,9, 34,2 ± 6,0, 35,6 ± 5,6 vs. 50,9 ± 8,7, 49,7
± 7,3, 49,4 ± 4,1%, respectivamente). Portanto, a solução de água de coco pode ser usada como
meio de manutenção para o transporte de COCs sem redução da viabilidade por um período de
até 6 h. Novos estudos com a suplementação da solução de água de coco com hormônios e
fatores de crescimento podem fornecer melhores resultados e garantir uma redução significativa
no custo do meio de manutenção.
Palavra-chave: Produção in vitro de embriões, manutenção de oócito, água de coco.
Suporte Financeiro: CAPES e Central Genética Campo de Boi.
s471
EFEITO DA PRESENÇA DO CORPO LÚTEO NO MOMENTO DA ASPIRAÇÃO

FOLICULAR SOBRE A RECUPERAÇÃO E COMPETÊNCIA IN VITRO DE
OÓCITOS Bos indicus
Torres-Júnior, J.R.S.1; Pires, M.F.Á.2; Sá, W.F.2; Ferreira, A.M. 2; Viana, J.H.M. 2;
Clemente, C.A.A.2; Sá Filho, M.F.1; Souza, A.H.1; Baruselli, P.S.1
1
Foram realizadas 232 sessões de Aspiração Folicular (OPU) com auxílio de ultra-som (Scanner
200s) equipado com transdutor setorial intravaginal de 7,5 MHz,em 10 vacas da raça Gir (Bos
indicus). No momento de cada sessão de OPU (1x semana) foram aferidas a população folicular,
o diâmetro (Ø) dos dois maiores folículos e a presença ou não de corpo lúteo (CL). Em seguida,
todos os folículos com Ø ≥ 3mm foram puncionados e os oócitos obtidos foram avaliados
morfologicamente, maturados em meio TCM-199 + 10% de soro de vaca em estro e FSH, por 24
horas a 38°C, com 5% de CO2 e 95% de umidade. Os oócitos maturados foram fertilizados por
espermatozóides selecionados pelo método de swin up. A fecundação foi realizada com 2,0 x 106
sptz/mL por 22 horas em meio FERT-TALP + 10 μL/mL de heparina.. Os possíveis zigotos
foram co-cultivados com células da granulosa, em meio CR2aa + 10% de SFB. Para análise dos
dados, as sessões de OPU foram distribuídas de acordo com a presença de corpo lúteo no ovário
(Com/CL vs. Sem/CL). Os dados foram analisados quanto à normalidade dos resíduos, sendo
transformados quando necessário. As variáveis foram analisadas por ANOVA e pelo teste de
Qui-quadrado, com nível de significância de 5%. Das 232 aspirações, foram obtidos 2195 oócitos
(9,6±0,4 oócitos/vaca/sessão). Não houve interação entre presença de CL e sessão de OPU. O
número de sessões de OPU (n) correspondente aos grupos Com/CL vs. Sem/CL foi,
respectivamente, 90 vs. 142. As médias para os grupos Com/CL vs. Sem/CL foram,
respectivamente: População folicular (16,5±0,6b vs. 20,4±0,8a); Folículos <6mm (14,8±0,6b vs.
18,7±0,8a); Folículos de 6-9mm (0,5±0,1 vs. 0,5±0,0); folículos >9mm (1,2±0,1 vs. 1,2±0,1); Ø
maior folículo (12,2±0,3 vs. 12,8±0,4); Ø 2° maior folículo (7,1±1,2 vs. 9,7±1,8); Número de
oócitos recuperados por vaca/sessão (9,6±0,6 vs. 9,6±0,6); Taxa de recuperação (oócitos
recuperados/ folículos aspirados) [842/1307 (64,4%)a vs. 1353/2553 (53,0%)b]; Número de oócitos
Grau 1 por vaca/sessão (2,1±0,2a vs. 1,4±0,1b); Taxa de oócitos Grau 1 [(126/842 (15,0%)b vs.
289/1353 (21,3%)a]; Número de oócitos viáveis por vaca/sessão (5,9±0,4 vs 5,8±0,5); Taxa de
oócitos viáveis [504/842 (59,8%) vs. 814/1353 (60,2%)]; Taxa de clivagem [286/411 (69,6%)
vs. 373/522 (71,5%)]; Número de embriões produzidos por vaca/sessão (0,8±0,2 vs. 0,70,2) e
Taxa de Blastocisto [63/306 (21,9%)b vs. 122/416 (29,3%)a]. Os resultados demonstram que a
presença de corpo lúteo no momento da aspiração folicular, embora tenha diminuído o número
de folículos visíveis, manteve similaridade no total de estruturas recuperadas devido ao aumento
na taxa de recuperação, possivelmente ocasionado pela aspiração de folículos não visíveis à
ultra-sonografia (< 3mm). Não foi observado efeito significativo do corpo lúteo sobre a produção
de blastocistos.
Apoio financeiro: FAPESP (processo 04/06096-0)
s472
EFEITO DA CODOMINÂNCIA DE FOLÍCULOS NO MOMENTO DA ASPIRAÇÃO

FOLICULAR SOBRE A RECUPERAÇÃO E COMPETÊNCIA IN VITRO DE
OÓCITOS Bos indicus
Torres-Júnior, J.R.S.1; Pires, M.F.Á.2; Sá, W.F. 2; Ferreira, A.M.2; Viana, J.H.M.2;
Clemente, C.A.A.2; Sá Filho, M.F.1; Souza, A.H.1; Baruselli, P.S.1
1
Foram realizadas 232 sessões de Aspiração Folicular (OPU) com auxílio de ultra-som (Scanner
200s) equipado com transdutor setorial intravaginal de 7,5 MHz,em 10 vacas da raça Gir (Bos
indicus). Em seguida, foram aferidas a população folicular e o diâmetro (Ø) dos dois maiores
folículos. Em seguida, todos os folículos com Ø ≥ 3mm foram puncionados e os oócitos obtidos
foram avaliados morfologicamente, maturados por 24 horas em meio TCM-199 com sais de
Earle (Gibco Labs. Grand Island, NY) acrescido de 10% de soro de vaca em cio (SVC) e FSH,
por 24 horas em estufa incubadora a 38°C, com 5% de CO2 em ar atmosférico e 95% de umidade.
Os oócitos maturados foram fertilizados por espermatozóides selecionados pelo método de swin
up. Após 22 horas de fecundação em meio FERT-TALP acrescido de de 10 μL/mL de heparina,
com uma dose inseminante de 2,0 x 106 sptz/mL, os possíveis zigotos foram co-cultivados com
células da granulosa, em meio CR2aa acrescido de 10% de SFB. Para análise dos dados, foi
caracterizada como Codominância, a observação de dois ou mais folículos com Ø > 9mm em
apenas um ou em ambos os ovários de uma mesma doadora. As sessões de OPU foram distribuídas
em dois grupos: Com/COD vs. Sem/COD. Os dados foram analisados quanto à normalidade dos
resíduos, sendo transformados quando necessário. As variáveis foram analisadas por ANOVA e
teste de Qui-quadrado, ao nível de significância de 5%. Das 232 aspirações, foram obtidos 2195
oócitos (9,6±0,4 oócitos/vaca/sessão). Não houve interação entre codominância folicular e sessão
de OPU. O número de sessões de OPU (n) correspondente aos grupos Com/COD vs. Sem/COD
foi respectivamente 61 vs. 161. Dentre as variáveis estudadas, as respostas observadas para os
grupos Com/COD vs. Sem/COD foram respectivamente: População folicular (17,21,0b vs.
19,5±0,7a); Folículos < 6mm (14,6±1,0b vs. 18,1±0,7a); Folículos de 6 a 9mm (0,4±0,1 vs. 0,5±0,0);
folículos > 9mm (2,2±0,1a vs. 0,9±0,4b); Ø maior folículo (16,10,5a vs. 11,2±0,2b); Ø 2° maior
folículo (13,2±0,8a vs. 5,4±0,2b); Número de oócitos recuperados (7,9±0,7b vs. 10,2±0,6a); Taxa
de recuperação [477/1047 (45,5%)b vs. 1718/3339 (51,4%)a]; Número de oócitos Grau 1 por
vaca/sessão (1,20,2b vs. 2,0±0,2a); Taxa de oócitos Grau 1 [74/477 (15,5%)b vs. 341/1718 (19,84)a];
Número de oócitos viáveis por vaca/sessão (4,6±0,6b vs. 6,3±0,4a); Taxa de oócitos viáveis [278/
477 (58,3%) vs. 1040/1718 (60,5%)]; Taxa de clivagem [128/171 (74,8%) vs. 531/762 (69,7%)];
Número de embriões produzidos por vaca/sessão (0,6±0,2 vs. 0,9±0,1) e Taxa de Blastocisto
[34/128 (26,5%) vs. 155/579 (26,8%)]. Os resultados demonstram que a codominância de folículos
no momento da aspiração folicular diminui significativamente o número de folículos visualizados,
oócitos recuperados e oócitos viáveis, gerando perdas no número final de embriões produzidos
por doadora/coleta.
Apoio financeiro: FAPESP (processo 04/06096-0)
s473
EFICÁCIA DA MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS DE GATAS DOMÉSTICAS

APÓS 30 E 36 HORAS
Martins, L.R.; Fernandes, C.B.; Landim-Alvarenga, F.C.; Lopes, M.D.
DRARV - FMVZ - UNESP, 18618-000, Botucatu-SP, Brasil. lirigatto@yahoo.com.br
A produção de embriões felinos permite que o gato doméstico seja utilizado como modelo genético
e no desenvolvimento da pesquisa biológica. A produção in vitro de embriões é dependente de
um processo de maturação in vitro eficiente onde busca-se a obtenção de porcentagens elevadas
de oócitos em metáfase II. Neste experimento, comparou-se a eficácia do processo de maturação
nuclear de oócitos de gato doméstico cultivados por 30 ou 36 horas visando à obtenção de um
alto número de metáfase II. Todos os produtos utilizados pertencem à Sigma, St. Louis, EUA, a
menos que diferentemente citado. Seis gatas adultas foram anestesiadas e submetidas à
ovariohisterectomia. Os ovários foram fatiados em solução de DPBS acrescida de estreptomicina,
gentamicina e anfotericina B para liberação dos complexos cumulus ooforus (COC). Foram
selecionados para o experimento os COCs com coloração uniforme do ooplasma e que possuíam
cumulus compacto com pelo menos 4 camadas de células. Os COC Grau I foram lavados três
vezes em Hepes-buffered minimum essential medium (H-MEM; Gibco, Grand Island, EUA)
suplementado com 3 mg/mL de BSA, 2,0 mM de glutamina, 1,0 mM de piruvato de sódio, 0,13
mM de cisteína, 100 mg/mL de estreptomicina e 100 UI/mL de penicilina. Os oócitos foram
maturados em grupos de 20 a 30 em 400 µL de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium -
DMEM, Gibco®, Grand Island, EUA) suplementado com 10µg/mL de FSH bovino, 1µg/mL de
LH, 1µg/mL de estradiol, 20 ng/mL de IGF-I (insulin-like growth factor I) e 10 ng/mL de bFGF
(basic fibroblast growth factor) sob óleo mineral por 30 ou 36 horas a 38 °C em atmosfera de 5%
de O2, 5% CO2 e 90% N2 . Após 30 ou 36 horas, as células do cumulus foram removidas
mecanicamente. Após serem totalmente desnudos, os COC foram corados com Hoechst 33342 e
examinados em microscópio (Leica®, Wetzlar, Alemanha) equipado com luz ultra-violeta. De
acordo com a configuração nuclear foram classificados em vesícula germinativa (VG), quebra
de vesícula germinativa (QVG), metáfase I (MI), metáfase II (MII) e degenerados ou não
identificados (D/NI). Foram maturados 67 oócitos por 30 horas e 78 por 36 horas. Foram obtidos,
nos períodos de 30 e 36 horas respectivamente, as seguintes configurações nucleares: 03 (4,48%)
e 02 (2,6%) em VG; 14 (20,90%) e 11 (14,10%) de QVG; 12 (17,91%) e 20 (25,64%) de MI; 29
(43,28%) e 37 (47,43%) de MII e 09 (13,43%) e 08 (10,25%) de D/NI. Não foram observadas
diferenças estatísticas entre a proporção de oócitos que se encontra em metáfase II entre 30 e 36
horas de maturação. Foi possível concluir que a maturação in vitro de oocitos de gatas por 30
horas é o suficiente para a conclusão da maturação nuclear.
Financiamento: FAPESP.
Agradecimento: Royal Canin® pelo fornecimento de ração comercial.
s474
COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES MEIOS UTILIZADOS NA SELEÇÃO DE

ESPERMATOZÓIDES PROVENIENTES DA CAUDA DO EPIDÍDIMO E DUCTO
DEFERENTE DE GATOS DOMÉSTICOS NORMOSPÉRMICOS (Felis catus)
Martins, L.R.1; Villaverde, A.I.S.B.1; Carnicelli, P.1; Taconeli, C.A.2;

Landim-Alvarenga, F.C.1; Lopes, M.D.1
1
DRARV - FMVZ - UNESP, 18618-000, Botucatu-SP, Brasil. 2DE - IBB - UNESP, Botucatu-
SP, Brasil. lirigatto@yahoo.com.br
O gato doméstico é considerado um valioso modelo experimental no estudo de felídeos selvagens.

A obtenção, seleção e conservação de material genético de animais selvagens é ferramenta
indispensável à biotecnologia. Dessa forma, o swim-up - procedimento de seleção espermática,
no qual os espermatozóides de melhor qualidade migram em direção à superfície de determinado
meio - foi avaliado. Objetivou-se comparar a eficácia de dois meios - Ham’s F-10 e Hepes-
Tyrode albumina lactato piruvato (TALP) - suplementados ou não com cafeína para a realização
de swim-up e sua influência sobre motilidade, morfologia e integridade de membrana de
espermatozóides obtidos da cauda do epidídimo e ducto deferente de gatos domésticos. Todos os
reagentes utilizados pertencem à Sigma, St. Louis, EUA. Onze (11) gatos adultos foram
anestesiados e submetidos à orquiectomia. Os testículos foram transportados até o laboratório
em solução salina 0,9% a 37°C. O ducto deferente e cauda do epidídimo foram isolados e
dissecados. O sêmen foi liberado por compressão em uma placa de Petri contendo 250 µL de
Ham’s F-10 ou 250 µL de TALP suplementados com piruvato de sódio, gentamicina e BSA. Em
seguida, foram transferidos para dois tubos e examinados quanto à motilidade progressiva, vigor,
concentração, morfologia espermática e integridade de membrana plasmática através do uso de
sondas fluorescentes. Posteriormente, 50 µL desse material foi transferido lentamente no fundo
de quatro tubos que continham 250 µl de Ham’s F-10, 250 µl de Ham’s F-10 + cafeína, 250 µl de
TALP e 250 µl de TALP + cafeína e colocado em banho-maria a 35°C por 30 minutos. Depois,
250 µL do sobrenadante de cada tubo era removido, centrifugados a 300xg durante quatro minutos.
Em seguida, o sobrenadante foi removido e avaliou-se o pellet. Utilizou-se o teste paramétrico
de análise de variância para o delineamento em blocos (Montgomery) para todos os parâmetros,
exceto o vigor que foi avaliado através do teste não paramétrico de Wilcoxon, para amostras
pareadas. Não houve influência do meio utilizado sobre os parâmetros avaliados antes da realização
do swim-up. Dentre os quatro tratamentos utilizados para a realização do swim-up também não
foi observada diferença estatística nos parâmetros acima citados. Houve diferença estatística (p
<0,05) quando foram comparadas as porcentagens de patologia espermática antes e após o swim-
up. Os valores de patologia espermática foram superiores nas amostras avaliadas previamente ao
swim-up. Ambos os meios utilizados foram igualmente eficazes na preservação de características
espermáticas desejáveis e na seleção de amostras com baixo índice de patologia. Observou-se
ainda que a suplementação de cafeína não influenciou a motilidade progressiva, embora, um
estado de hiperativação, necessário ao processo de fertilização tenha sido verificado.
Financiamento: FAPESP.
Agradecimento: Royal Canin® pelo fornecimento de ração comercial.
s475
INFLUÊNCIA DO ESTRESSE TÉRMICO CALÓRICO NA TAXA DE APOPTOSE DE

EMBRIÕES BOVINOS (indicus vs taurus) PRODUZIDOS IN VITRO E NA
CAPACIDADE DOS MESMOS ORIGINAREM GESTAÇÕES
Sartorelli, E.S.1a; Satrapa, R.A.1a; Barcelos, A.C.Z.2b; Potiens, J.R.3; Barros, C.M.2
1
Deptartamento de Reprodução Animal, FMVZ , 2Departamento de Farmacologia, IB-
UNESP, Botucatu-SP, 3Fazenda Angus Bela Vista, Pardinho-SP, Brasil.
cmbarros@ibb.unesp.br
Existem evidências de que os efeitos deletérios do estresse térmico calórico (ETC) sobre a
fertilidade são menos pronunciados em raças tolerantes ao calor devido primariamente às
diferenças na capacidade de regulação térmica. No presente trabalho, a resistência ao ETC de
embriões de uma raça adaptada (Nelore; Bos t. indicus) foi comparada aos de uma não adaptada
a temperaturas elevadas (Angus; Bos t. taurus). Ovócitos de vacas Nelore ou Angus, obtidos a
partir de aspiração folicular, foram maturados (TCM-199), fertilizados e cultivados (SOFaaci)
in vitro. No experimento 1, noventa e seis horas pós-inseminação (96 hpi), os embriões com
mais de 16 células, de acordo com a raça, foram separados ao acaso em quatro grupos: Nelore
controle, Nelore ETC, Angus controle e Angus ETC. Os embriões dos grupos controle foram
cultivados a 39oC continuamente e dos grupos ETC expostos a 41oC por 12 h, retornando a
seguir para 39oC. As taxas de formação de blastocistos foram determinadas no sétimo dia de
cultivo e, a seguir, os embriões foram transferidos para recipientes mestiças. As taxas de
blastocistos dos grupos controle vs ETC, para as raças Nelore e Angus foram de 41,80% (51/
122) vs 31,40% (38/121) e 59,57% (28/47) vs 35,00% (14/40), respectivamente. Houve interação
significativa entre tratamento (controle vs ETC) nas duas raças (p<0,02). As taxas de prenhez
foram de 29,41% (15/51) vs 28,95% (11/38) e 21,43% (6/28) vs 7,14% (1/14), respectivamente.
Apesar da diminuição numérica nas taxas de prenhez para a raça Angus, não houve interação
significativa entre tratamento, raça e tratamento x raça. O experimento 2 foi realizado sob as
mesmas condições do primeiro, exceto que doze horas após o ETC (120 hpi) a taxa de apoptose
celular foi avaliada pelo método do TUNEL. Às 120 hpi, o número total de células dos embriões
das raças Nelore foi superior aos da Angus (23,72± 0,005 vs 21,72 ± 0,006, respectivamente,
p<0,05). A porcentagem de células apoptóticas dos embriões dos grupos controle e ETC, para as
raças Nelore e Angus foi de 3,75% ± 0,006 vs 4,25% ± 0,016 e 5,17% ± 0,001 vs 6,22% ± 0,018,
respectivamente [houve interação entre raça (p<0,01) e tratamento (p<0,02)]. Estes resultados
corroboram a hipótese de que embriões de uma raça adaptada ao calor (Nelore) são mais eficientes
em resistir ao ETC, nos estágios iniciais de desenvolvimento, do que embriões de uma raça não
adaptada (Angus). Bolsistas da aFAPESP e bCAPES.
s476
ASPIRAÇÃO FOLICULAR EM VACAS NELORE: EFEITOS DA IDADE DA

DOADORA E ÉPOCA DO ANO SOBRE A PRODUÇÃO E QUALIDADE DOS
OÓCITOS
Calegari, R.S.1; Paschoal, D.M.2; Martins Jr., A.2
1
Departamento de Reprodução Animal, USP, 05508-000, São Paulo-SP, Brasil, 2Departamento
de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal, UNESP, 16050-680, Araçatuba-SP, Brasil.
renatacalegari@uol.com.br
Em trabalho anterior (Calegari et al. Biol. Reprod., 2006, no prelo), demonstramos que a linhagem
da doadora tem papel importante no número e na qualidade de oócitos aspirados de vacas da raça
Nelore. A finalidade deste estudo foi investigar se a produção e a qualidade dos oócitos podem
ser afetadas pela idade da doadora e estação do ano. Aspirações foliculares, guiadas por ultra-
som, foram realizadas a cada 15 dias, durante o ano, em 45 vacas da raça Nelore, com10, 11, 11
e 13 animais, respectivamente, paras as faixas etárias A (3-5,9), B (6-9,9), C (10-13,9) e D (14-
18 anos). Os animais foram mantidos em pastagem de gramínea (Panicum maximum), recebendo
silagem de milho e ração comercial na época da seca. Antes de cada sessão de aspiração, as vacas
foram submetidas à anestesia epidural (5 mL de lidocaína a 2%) para prevenir contração abdominal
e promover relaxamento retal. Folículos visíveis foram puncionados com agulha calibre 17,
empregando-se um transdutor curvilíneo de 5 MHz e ultra-som Aloka SSD-500. A agulha e o
transdutor foram conectados à guia de biópsia, a qual por sua vez foi acoplada a uma bomba de
vácuo, com pressão (70 mm Hg) ajustada para uma adequada obtenção do líquido folicular e
oócitos. Os complexos cumulus-oócitos aspirados (um total de 1680) foram examinados,
morfologicamente, mediante lupa estereoscópica e classificados em quatro categorias (I, II, III e
IV), de acordo com número de camadas do cumulus e aspecto do citoplasma. ANOVA e teste de
Tukey foram utilizados para as análises estatísticas, com P<0,05 aceito como significativo. O
número de oócitos aspirados, considerando-se a categoria dos mesmos, foi similar dentro de
cada estação, com os valores variando de 7,57 ± 9,78, 4,91 ± 5,5, 2,76 ± 3,3, e 0,61 ± 1,18,
respectivamente, para as categorias I, II, III e IV. Entretanto, no verão e inverno, mais oócitos
(P<0,05) de melhor qualidade foram obtidos em comparação com a primavera e o outono. Não
houve diferença (P>0,05) no número de oócitos colhidos durante o ano para cada faixa etária,
mas quando as estações do ano foram analisadas, em separado, maior número (P<0,05) de oócitos
aspirados foi encontrado durante a estação fria (inverno e outono) comparado com a estação
quente (primavera e verão). Finalmente, evidência estatística da influência da idade sobre a
categoria do oócito foi observada, com mais oócitos (P<0,05) de melhor qualidade (I e II) sendo
obtidos de doadoras jovens (A e B) do que velhas (C e D). Conclui-se que, a idade da doadora e
a estação do ano podem afetar o número e a qualidade dos oócitos aspirados, em vacas Nelore,
sob as condições experimentais adotadas.
s477
COMPARAÇÃO DE DOIS PROTOCOLOS PARA VITRIFICAÇÃO DE EMBRIÕES

BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO
Oliveira, R.S.1; Dias, A.J.B.1; Sá, W.F.2; Camargo, L.S.A.2; Viana, J.H.M.2; Moraes, G.A.3
1
LMGA-CCTA-UENF, 28013-602,Campos dos Goytacazes-RJ, Brasil. 2Embrapa Gado de
Leite, 36038-330, Juiz de Fora-MG, Brasil. 3LBCT-CBB-UENF,28013-602, Campos dos
Goytacazes-RJ, Brasil. aburla@uenf.br
A produção in vitro de embriões bovinos associados às técnicas de criopreservação que sejam

simples e rápidas tem grande potencial para proporcionar uma maior multiplicação e disseminação
de animais de elevado mérito genético. O objetivo deste trabalho foi comparar dois protocolos
de vitrificação, avaliando a taxa de eclosão e alterações ultra-estruturais de embriões bovinos
produzidos in vitro. Complexos cumulus-ovócito foram aspirados de ovários de vacas abatidas,
sendo maturados em TCM 199 por 24 horas e fertilizados por 22 horas. Os zigotos foram cultivados
em meio CR2aa, por sete dias, a 5% de CO2 e 38,5°C. Blastocistos graus I e II foram distribuídos
aleatoriamente nos seguintes tratamentos: T1) Não vitrificados (n=35); T2) vitrificados pelo
método OPS em solução de vitrificação contendo dimetilsufóxido 20% + etilenoglicol 20%
(n=37); T3) vitrificados pelo método OPS em glicerol 25% + etilenoglicol 25% (n=43). Embriões
de T2 foram desvitrificados a 39ºC e rehidratados em soluções com diferentes concentrações de
sacarose (0,25M; 0,15M ). Embriões de T3 foram desvitrificados à temperatura ambiente e
rehidratados em soluções de sacarose (1M; 0,5M;0,25M). Em seguida os embriões foram
cultivados em TCM 199, por 72 horas, para avaliação da taxa de eclosão. Outros embriões foram
fixados após duas horas do início do cultivo in vitro e processados para a microscopia eletrônica
de transmissão. Os dados da taxa de eclosão, foram avalidos pela análise de variância (ANOVA)
sendo usado o teste Scott-Knott para comparação das médias. A taxa de eclosão não diferiu
significativamente (P>0,05), entre embriões de T1 e T2 (83,6% x 67,4%, respectivamente).
Diferença significativa (P>0,05) foi encontrada entre esses tratamentos e T3 (29,72%). A análise
ultra-estrutural preliminar de blastocistos de T2 (n=2) e T3 (n=2) mostrou muitas alterações em
embriões de ambos os tratamentos A região mais externa da zona pelúcida apresentou-se mais
porosa e o espaço perivitelino bastante aumentado, contendo muitos debris celulares. As células
do trofoblasto mostraram microvilosidades esparsas e curtas, com muitas mitocôndrias
apresentando extração da matriz e poucas cristas.Essas células também apresentaram grande
número de vacúolos intracitoplasmáticos. Debris celulares foram encontrados no interior da
blastocele, a qual apresentou volume bastante reduzido. Espaços intercelulares aumentados foram
encontrados entre as células da massa celular interna (MCI), nas quais foram visualizados um
grande número de vacúolos intracelulares. Em ambos os tratamentos as células da MCI mostraram
uma melhor preservação ultraestrutural que as células trofoblásticas. A membrana plasmática e
junções celulares das células trofoblásticas dos embriões de T2 se mostraram mais íntegros que
dos embriões de T3, que apresentaram algumas rupturas de membrana. No entanto, embriões de
T2 apresentaram vacúolos intracitoplasmáticos de maior tamanho que os de T3. Os núcleos das
células trofoblásticas e da MCI de embriões de ambos os tratamentos apresentaram membrana
íntegra e não foram observadas formas características de apoptose. Além disso os embriões
possuíam poucas gotas lipídicas. Diante dos resultados apresentados conclui-se que a solução de
vitrificação com DMSO + etilenoglicol (T2) se mostrou mais adequada para a criopreservação
de embriões produzidos in vitro.
s478
EFEITO DO FLUIDO FOLICULAR E DO dbcAMP NA PRODUÇÃO IN VITRO DE

EMBRIÕES SUÍNOS
Nascimento, A.B.1,2; Marques, M.G.1; Gerger, R.P.C.1; Yamada, C.1; Peres, M.A.1;
Assumpção, M.E.O.A.1; Visintin, J.A.1; Bordignon, V.2
1
Departamento de Reprodução Animal – Universidade de São Paulo – Brasil
2
Animal Science Department – McGill University – Canada
Durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos suínos é observada variação na morfologia nuclear
do estágio de vesícula germinativa devido a grande heterogeneidade dos folículos. Por isso,
alguns oócitos podem iniciar a retomada da meiose precocemente. Uma alternativa para inibir
esta retomada de maneira reversível é a utilização do dibutiril cAMP (dbcAMP) no início da
MIV, mantendo os oócitos em vesícula germinativa, promovendo a sincronização dos oócitos, o
que contribui para a melhora na maturação nuclear e citoplasmática, favorecendo o posterior
desenvolvimento embrionário. Assim, este estudo teve como objetivo investigar o efeito do
dbcAMP e do fluido folicular (PFF) na MIV de oócitos suínos sobre os índices de desenvolvimento
e o número de células de embriões produzidos por ativação partenogênica. Oócitos de fêmeas
pré-púberes foram selecionados e divididos em 4 grupos por 42-46 horas (MIV) em T1 (controle):
TCM199 suplementado com PVA (0,1%), FSH (0,5μg/ml), LH (0,5μg/ml), EGF (10ng/ml),
piruvato (0,9mM), D-glicose (3,05mM), cisteína (0,1mg/ml) e gentamicina (50μg/ml); em T2:
T1 + 25% de PFF; em T3: T1 + 1mM de dbcAMP ou em T4: T2 + T3. Os hormônios FSH e LH,
assim como o dbcAMP, foram utilizados apenas nas primeiras 22 horas da MIV. Após a maturação,
as células do cumulus foram removidas e os oócitos com o primeiro corpúsculo polar foram
selecionados para a ativação partenogênica. Os oócitos foram expostos por 5 minutos à 15µM de
ionomicina, incubados por 4 horas em PZM-3 com cloreto de estrôncio (Sr2+) sem Ca2+
suplementado com citocalasina B (CB) e cicloheximide (CHX). Após este período, foram
transferidos para o meio PZM-3 com Ca2+ contendo CB e CHX por 2 horas e cultivados no
PZM-3 até o dia 7. Os blastocistos foram fixados e corados com 1% de orceína em 45% de ácido
acético para contagem do número médio de células em lâminas cobertas por lamínulas fixadas
com vaselina nas bordas e avaliados sob microscópio de contraste de fase (160 e 400 x). Os
índices de maturação nuclear e de clivagem não diferiram (p>0,05) entre os grupos. Já o índice
de blastocisto em T4 (46%) foi superior ao T3 (22,2%), mas não em relação ao T1 (31,1%) e ao
T2 (34,2%). Não houve diferença significante (p<0,05) em relação à média do número de células
dos blastocistos entre T1 (43,4), T2 (53,7), T3 (45,9) e T4 (58,7). Estes resultados permitem
concluir que a maturação de oócitos em TCM199 acrescido de dbcAMP e PFF melhora o
desenvolvimento de embriões suínos produzidos in vitro.
Suporte financeiro: FAPESP Nº 04/01141-8
s479
O SORO FETAL BOVINO AUMENTA A QUALIDADE DOS EMBRIÕES

ORIUNDOS DE OÓCITOS MATUROS EM TCM199 ACRESCIDO DE
dbcAMP E DE FLUIDO FOLICULAR SUÍNO?
Nascimento, A.B.1,2; Nicacio, A.C.1; Marques, M.G.1; Tavares, M.N.1; Gonçalves, J.S.A.1;
1
Departamento de Reprodução Animal – Universidade de São Paulo – Brasil
2
Department of Animal Science – McGill University – Canadá
Este trabalho objetivou estudar os efeitos do soro fetal bovino (SFB) no cultivo in vitro de
embriões suínos maturados em TCM199 acrescido de dbcAMP e de fluido folicular suíno (PFF),
submetidos à ativação partenogênica. Oócitos de fêmeas pré-púberes foram maturados in vitro
(MIV) por 42-46 horas em T1 (controle): TCM199 suplementado com PVA (0,1%), FSH (0,5μg/
ml), LH (0,5μg/ml), EGF (10ng/ml), piruvato (0,9mM), D-glicose (3,05mM), cisteína (0,1mg/
ml) e gentamicina (50μg/ml) e em T2: T1 + 25% de fluido folicular suíno (PFF) + 1mM de
dbcAMP. Os hormônios FSH e LH, assim como o dbcAMP, foram utilizados apenas nas primeiras
22 horas da maturação. Após a MIV, as células do cumulus foram removidas e os oócitos que
apresentaram o primeiro corpúsculo polar foram selecionados para a ativação partenogênica. Os
oócitos foram então expostos por 5 minutos à 15µM de ionomicina, incubados por 4 horas em
PZM-3 com cloreto de estrôncio (Sr2+) sem Ca2+ suplementado com citocalasina B (CB) e
cicloheximide (CHX). Após este período, foram transferidos para o meio PZM-3 com Ca2+
contendo CB e CHX por 2 horas e depois cultivados em meio PZM-3 até o dia 7. No quinto dia
foi acrescentado 10% de SFB em metade dos embriões de cada grupo (T1, T1+10%SFB, T2 e
T2+10%SFB) e cultivados até o dia 7. Os blastocistos foram fixados e corados com 1% de
orceína em 45% de ácido acético para contagem do número médio de células em lâminas cobertas
por lamínulas fixadas com vaselina nas bordas e avaliados sob microscópio de contraste de fase
(160 e 400 x). Não houve diferença (p>0,05) entre os índices de maturação dos oócitos, de
clivagem após 48 horas de cultivo e de blastocisto, tanto nos grupos só com TCM199, quanto
nos grupos com o TCM199 acrescido de dbcAMP e PFF. O número de células por blastocisto no
T2+10%SFB foi de 78,6±6,3, sendo superior (p<0,05) aos grupos T1 (41±2,9), T1+10%SFB
(56,4±3,6) e T2 (43±4,1). Estes resultados permitem concluir que a adição de 10% de SFB ao
TCM199 acrescido de dbcAMP e PFF, a partir do quinto dia de cultivo, melhora a qualidade dos
embriões suínos produzidos in vitro.
s480
USO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SORO FETAL BOVINO

E FLUIDO FOLICULAR SUÍNO NO CULTIVO DE EMBRIÕES SUÍNOS
PRODUZIDOS IN VITRO
Nascimento, A.B.1,2; Goissis, M.D.1; Marques, M.G.1; Gonçalves, J.S.A.1; Tavares, M.N.1;
1
Departamento de Reprodução Animal – Universidade de São Paulo - Brasil
2
Animal Science Department – McGill University – Canadá
O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do uso de diferentes concentrações de fluido
folicular suíno (PFF) e soro fetal bovino (SFB) no cultivo in vitro (CIV) de embriões suínos
produzidos por ativação partenogênica. Oócitos de fêmeas pré-púberes foram maturados in vitro
(MIV) por 42-46 horas em TCM199 suplementado com PVA (0,1%), FSH (0,5μg/ml), LH (0,5μg/
ml), EGF (10ng/ml), piruvato (0,9mM), D-glicose (3,05mM), cisteína (0,1mg/ml), gentamicina
(50μg/ml), 25% de PFF e 1mM de dbcAMP. Os hormônios FSH e LH, assim como o dbcAMP,
foram utilizados apenas nas primeiras 22 horas da MIV, para a sincronização da retomada da
meiose. Após a MIV, as células do cumulus foram removidas e os oócitos que apresentaram o
primeiro corpúsculo polar foram selecionados para ativação partenogênica. Os oócitos foram
expostos por 5 minutos à 15µM de ionomicina, incubados por 4 horas no PZM-3 com cloreto de
estrôncio (Sr2+) sem Ca2+ suplementado com citocalasina B (CB) e cicloheximide (CHX). Após
este período, os oócitos foram transferidos para o meio PZM-3 com Ca2+ contendo CB e CHX
por 2 horas e cultivados em PZM-3 até o dia 7. No quinto dia, os embriões foram divididos em
quatro grupos, T1: 1% de PFF, T2: 10% de PFF, T3: 1% de SFB e T4: 10% de SFB. No dia 7, os
blastocistos foram corados com 1% de orceína em 45% de ácido acético para visualização do
material genético, montados em lâminas cobertas por lamínulas fixadas com vaselina nas bordas
e avaliados sob microscópio de contraste de fase (160 e 400 x). Os índices de blastocistos não
foram diferentes entre os grupos (p>0,05). Em relação ao número de células por blastocisto o
grupo T4 (58,7±5.1) foi superior a T1 (43,4±2.9), T2 (53,7±9.5), T3 (46±5.6). Estes resultados
permitem concluir que embriões cultivados em PZM-3 suplementado com 10% de SFB possibilita
boas condições de suporte e desenvolvimento de embriões suínos produzidos in vitro.
s481
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS COM SUPLEMENTO

ANTIOXIDANTE SIGMA®
Sudano, M.J.; Mattos M.C.C.; Fernandes C.B.; Lima Neto J.F.; Landim-Alvarenga, F.C.
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – FMVZ/UNESP, Botucatu-SP,

18618-000, Brasil. mateusjsudano@yahoo.com.br
O objetivo deste trabalho foi estudar a adição do suplemento antioxidante da Sigma (A-1345),
ao meio de cultivo de embriões bovinos em sistema com alta e baixa concentração de O2. Oócitos
obtidos de ovários de abatedouros foram maturados por 22 a 24 horas em TCM 199 com sais de
Earle e L-glutamina + 6% BSA, piruvato de sódio, estradiol 17β, hCG, FSH, e gentamicina.
Decorridas às 18 horas de FIV, em meio FIV-TALP, os possíveis zigotos foram desnudos e
transferidos para as placas de cultivo, divididos em grupos: Grupo 1: HTF: BME acrescido de
6% de BSA, 10% SFB, mioinositol, gentamicina e 1μl/ml de suplemento antioxidante. Os
embriões foram cultivados em atmosfera com 5% de CO2 em ar (20% de O2). Grupo 2: HTF:
BME acrescido de 6% de BSA, 10% SFB, mioinositol, gentamicina e 1μl/ml de suplemento
antioxidante. O cultivo foi realizado em atmosfera com 5% de O2, 5% de CO2 e 90% de N2 (5%
de O2). Grupo controle: HTF: BME acrescido de 6% de BSA, 10% SFB, mioinositol e
gentamicina. Foi utilizado atmosfera com 5% de CO2 em ar (20% de O2). Os embriões foram
cultivados por sete dias, em estufa a 38, 5oC. A taxa de produção de blastocistos foi calculada no
dia 7, a partir do número total de ovócitos. Uma amostra dos embriões obtidos em cada uma das
5 rotinas foi corada com 30μl de Iodeto de Propídio (1mg/ml) e 30μl de Hoechst 33342 (10mg/
ml) para contagem do número de células vivas e mortas. Para análise estatística foi utilizada a
ANOVA. Os resultados demonstram que a adição do suplemento antioxidante foi benéfica para
a produção de um maior índice de blastocistos independente da concentração de O2 utilizada. O
índice de formação de blastocistos foi maior no Grupo 2 - 5% O2 (35.6%; P<0.05) quando
comparado ao Grupo Controle (29.5%; P<0.05). A adição do antioxidante Sigma® parece ter
sido particularmente benéfica para os embriões do Grupo 1 cultivados em 20% O2 (34.1%; P<0.05),
resultando em índices de produção de blastocistos significativamente maiores que os do Grupo
Controle e similares aos do Grupo G2. O número médio de células contadas nos blastocistos e
nas mórulas foi de 87 e 37 respectivamente. Não foram observadas diferenças entre os grupos
com relação à porcentagem de células mortas, as quais apareceram em baixo número, não
ultrapassando os 10%. Pode-se concluir que a utilização de uma atmosfera com baixa concentração
de O2 associada à adição de antioxidantes ao meio de cultivo se mostrou benéfica à produção de
embriões bovinos in vitro. No entanto, a simples adição do suplemento oxidante parece ser
suficiente para a melhora das condições de cultivo, mesmo em situações com alta concentração
de O2.
Agradecimento: FAPESP - 04/13056-5
s482
PROTOCOLO DE UTILIZAÇÃO DE SÊMEN SEXADO NA FERTILIZAÇÃO

IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS
Ponchirolli, C.B.1; Fonseca, E.J.2; Teobaldo-Filho, O.1; Moreno, J.F.3
1
Sexing Technologies Brasil, 14174-000, Sertãozinho-SP, Brasil, 2 Lagoa da Serra Ltda.,
14174-000, Sertãozinho-SP, Brasil, 3 Sexing Technologies, Navasota-TX, EUA.
carla@lagoa.com.br
A técnica de PIV (produção in vitro de embriões) é uma excelente ferramenta na utilização do

sêmen sexado, já que requer uma menor concentração de espermatozóides comparada à T.E. ou
I.A. A utilização de sêmen sexado proporciona a expectativa de 85% de embriões do sexo desejado,
dispensando a sexagem embrionária e evitando o descarte de embriões do sexo indesejado (Wilson,
R.D., J Dairy Sci, 88:776-82, 2005). Estudos têm revisado a viabilidade de sua utilização na PIV
(Wheeler, M.B., Theriogenology, 65:219-27, 2006). Esse trabalho teve como objetivo desenvolver
um protocolo de fertilização in vitro utilizando doses de sêmen sexado comercializadas pela
Lagoa da Serra Ltda. Material e métodos: Oócitos de ovários de matadouro foram selecionados
e maturados in vitro em meio TCM 199 (Sigma®, St Louis, USA) acrescido de 10% de soro fetal
bovino (SFB), LH (0,01 UI/ml) e FHS (0,01UI/ml). Após 22-24 horas de maturação a 38,5ºC,
5% CO2 e umidade absoluta, os oócitos foram transferidos para gotas de 70 µl de meio de
fertilização Fert Talp +10 µg/ml de heparina para a fertilização in vitro (FIV). Doses de sêmen
sexado (fêmea) de 6 touros foram utilizadas pelo menos em 2 repetições e a seleção dos
espermatozóides foi realizada através de microcentrifugação em Gradiente Percoll, utilizando-
se 400 µl de dois gradientes de densidades diferentes (90 e 45%- Percoll Nutricell®, Campinas-
BR). Após a descongelação do sêmen sexado (35°C por 20s), o volume total da palheta foi
depositado sobre as camadas de gradiente Percoll em tubos de microcentrifugação e submetido
a centrifugação por 5 min, força de 9000 x g. Após a centrifugação, 100µl do pellet foram diluídos
em 400 µl de meio de fertilização e centrifugados por 2-3 min sob mesma força, obtendo-se um
pellet de 100 µl. A motilidade e concentração após centrifugação foram determinadas para cálculo
do volume inseminante, ajustado para uma concentração final de 1x106 espermatozóides/ ml. As
gotas contendo os oócitos foram inseminadas e estes permaneceram na incubadora por 18-22
horas a 38,5ºC, 5% CO2 e umidade absoluta. Após a FIV os embriões foram cultivados por sete
dias na presença de células do cumulus em meio CR2 (Sexing Technologies, Navasota- USA),
acrescido de 5% de SFB. A taxa de embriões produzidos foi calculada a partir do número total de
oócitos maturados. Resultados por touro testado em relação ao nº de oócitos/clivagem (%)/
blastocistos (%), respectivamente: Touro 1: 617/523 (85%)/193 (31%); Touro 2: 1059/777 (73%)/
267 (25%); Touro 3: 1225/920 (82%)/374 (33%); Touro 4:197/141 (72%)/58 (30%); Touro 5:
407/349 (86%)/114 (28%); Touro 6:480/365 (76%)/120 (25%). Média de produção (Touros 1 a
6): 3985/ 3075 (77%)/ 1126(28%).Com os resultados obtidos podemos concluir que o protocolo
proposto para FIV, utilizando sêmen sexado, leva à uma boa taxa de produção embrionária (média
de 28%), tornando sua aplicação na PIV comercialmente viável.
s483
USO DE MEIO COMERCIAL HUMANO PARA O DESENVOLVIMENTO DE

EMBRIÕES BOVINOS IN VITRO: RESULTADOS PRELIMINARES
Lima, T.N.1; Benedetti, E.R.1; Prado, R.B.1; Atique-Netto, H.1
1
FERTVITRO-UNIRP, 15025-300, São José do Rio Preto-SP, Brasil.
fertvitro@unirpnet.com.br
Meios comercialmente oferecidos para a Produção in vitro de embriões poderiam reduzir a mão
de obra, riscos de contaminações, erros e variações nas formulações de soluções preparadas no
laboratório. (Zerbini, Acta Scientiae Veterinariae, v 33, p 423, 2005) Um teste preliminar avaliou
a eficiência de um meio comercial, de uso rotineiro para o desenvolvimento de embriões humanos
in vitro - MULTIBLAST ® - (IRVINE – Co – Santa Ana, CA, EUA.), foi aplicado ao
desenvolvimento de embriões bovinos. Um sistema de cultivo seqüencial foi proposto porque o
meio testado possuía concentração de glicose indesejável para os primeiros dias de
desenvolvimento de embriões bovinos (Gardner, Theriogenology, v.49, p.83-102). Oócitos
colhidos de ovários de matadouro foram maturados em meio B-199 adicionado de 10% de Soro
Fetal Bovino; 10 UI/ml de FSH; 10 UI/ ml de LH, 1µg/ml de 17â estradiol durante 24 horas em
incubadora a 38,5ºC, umidade máxima e 5% CO2. A Fetilização in vitro foi realizada em meio
TALP adicionado de 10 µg/ml de heparina e 0.06 g/ml de BSA-FAF, com sêmen selecionado em
solução de Percoll 45:90 com concentração final de 2 milhões de espermatozóides por ml. O
cultivo de zigotos iniciou-se às 15 horas após a FIV. A avaliação do desenvolvimento embrionário
conforme os grupos tratados, levou em consideração a proporção dos três estágios embrionários
(BI: Blastocisto Inicial; BL: Blastocisto; BX: Blastocisto Expandido) às 163 horas após a FIV. O
meio CR2aa formulado no laboratório serviu como suporte até a substituição pelo meio testado
no quarto dia do cultivo. A amostra foi dividida em dois grupos, sendo o primeiro CR2aa+CR2aa
(235 oócitos), onde 11,03% BI, 30,15% BL e 58,82% BX, com resultado de 57,80% de
Blastocistos. O segundo CR2aa+MULT (247 oócitos), com 25,20% BI, 25,20% BL e 49,59%
BX com resultado de 49,70% de Blastocistos. Comparações entre proporções foram feitas pelo
teste ÷2 com nível de significância de 5%. Diferença significativa foi constatada na proporção de
Blastocistos Iniciais entre os grupos testados (p<0,05). Embora as taxas de desenvolvimento
embrionário não sejam significativamente diferentes entre os grupos tratados, não recomenda -
se o uso do meio comercial em associação com o CR2aa para o desenvolvimento de embriões,
por gerar maior proporção de Blastocistos Iniciais. Este estágio embrionário é o menos desejável
para a transferência embrionária. Maior amostragem deve ser considerada em experimentos
posteriores.
Agradecimentos: Centro Universitário de Rio Preto – UNIRP/FERTVITRO
s484
SOF vs TCM 199: INFLUÊNCIA SOBRE O DESENVOLVIMENTO IN VITRO

DE EMBRIÕES BOVINOS APÓS CRIOPRESERVAÇÃO.
Nicacio, A.C.; Simões, R.; Nascimento, A.B.; Milazzotto, M.P.; Delboni, C.C.;
Goissis, M.D.; Assumpção, M.E.O.A.; Visintin, J.A.
Departamento de Reprodução Animal - FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil

anicacio@usp.br
A produção in vitro de embriões bovinos vem sendo intensamente aplicada na área comercial no
Brasil. Entretanto, a dificuldade em criopreservar esses embriões impede a expansão desta
biotecnologia. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência dos meios de cultivo sobre a
sobrevivência embrionária após a criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro.
Oócitos oriundos de ovários de matadouro foram maturados, fecundados e cultivados in vitro.
295 blastocistos expandidos (entre os dias 7 e 9 de cultivo) foram criopreservados pelos métodos
controlado (1,2oC por minuto) e rápido (vapor de nitrogênio). Para o método controlado (grupo
controlado), os embriões foram expostos por 10 minutos à solução de 10% de Etileno glicol
(EG) e criopreservados à velocidade de resfriamento de 1,2oC por minuto. Para o método rápido
(grupo rápido), os embriões foram expostos à solução de 10% de EG por 10 minutos e, em
seguida, à solução de 20% de EG e 20% de Glicerol (Gli) por 30 segundos, incluindo o envase.
As palhetas foram mantidas a 0,8cm da superfície do nitrogênio líquido por 2 minutos e imersos
em nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 10 segundos no ar e 20 segundos
em banho-maria a 25oC. Para a rehidratação, os embriões foram lavados em solução de PBS +
0,2% de BSA + 0,3M de Sacarose e em PBS + 0,2% de BSA, ambas por 3 minutos. Para avaliar
a sobrevivência, os embriões, após a descongelação, foram cultivados em monocamada de células
da granulosa com TCM 199 ou em SOF por 4 dias. Os embriões do grupo controlado apresentaram
índices de re-expansão de 59,0% (49/83) e 32,8% (23/70), respectivamente, em TCM 199 e
SOF. O grupo rápido apresentou índice de re-expansão de 8,2% (6/73) e 10,1% (7/69),
respectivamente, em TCM 199 e SOF. O grupo controlado apresentou taxas de eclosão de 54,2%
(45/83) e 15,7% (11/70), respectivamente, em TCM 199 e SOF, enquanto o grupo rápido não
apresentou eclosão em nenhum dos meios de cultivo. Os resultados foram analisados pelo Teste
de Qui-quadrado, com nível de significância de 5%. O meio influenciou as taxas de re-expansão
e eclosão, enquanto que o grupo rápido não apresentou diferença estatística entre os meios de
cultivo tanto para re-expansão quanto para eclosão. Assim, concluímos que o meio de cultivo
influencia a sobrevivência embrionária após a descongelação, sendo o meio TCM 199 mais
adequado do que o meio SOF.
Projeto financiado pela FAPESP (04/05335-1).
s485
EFEITO DE DIFERENTES CRIOPROTETORES SOBRE A VIABILIDADE DE

EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO
Delboni, C.C.; Nicacio, A.C.; Feitosa, W.B.; Nascimento, A.B.; Simões, R.;
Milazzotto, M.P.; Assumpção, M.E.O.A.; Visintin, J.A.
Departamento de Reprodução Animal - FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil

anicacio@usp.br
Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da exposição ao Etileno glicol e do Glicerol
sobre a viabilidade de embriões bovinos produzidos in vitro. Oócitos oriundos de matadouro
foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. Blastocistos expandidos (n=273) entre 7 e 9
dias de cultivo (D0=fecundação) foram divididos em 3 grupos, sendo um exposto à solução
crioprotetora de 10% de Etileno glicol (grupo EG) por 10 minutos, um exposto à solução
crioprotetora de 10% de EG por 10 minutos e depois à solução crioprotetora de 20% de EG e
20% de Glicerol (grupo EG/Gli) por 30 segundos e um controle. Os embriões foram rehidratados
na solução de PBS + 0,2% de BSA + 0,3M de Sacarose e na solução de PBS + 0,2% de BSA,
ambas por 3 minutos, e colocados em cultivo para avaliar o índice de eclosão. Para o grupo
controle, os embriões foram cultivados sem exposição à solução crioprotetora. Os índices de
eclosão foram de 59,72% (43/72) para o grupo controle, 62,4 % (63/101) para o grupo EG e
69,0% (69/100) para o grupo EG/Gli. Os resultados foram analisados pelo Teste de Qui-quadrado,
com nível de significância de 5%, não havendo diferença entre os grupos. Concluiu-se que as
concentrações e tempos de exposição avaliados não foram deletérios ao desenvolvimento in
vitro dos embriões, viabilizando sua aplicação na criopreservação de embriões bovinos produzidos
in vitro.
Projeto financiado pelo CNPq.
s486
COMPARAÇÃO DE DOIS INDUTORES DE CAPACITAÇÃO ESPERMÁTICA NA

PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES OVINOS A PARTIR DE OÓCITOS
ASPIRADOS POR LAPAROSCOPIA DE DOADORAS SANTA INÊS
Panattoni, J.F.1; Oliveira, P.C.1; Figueiredo, C.L.2; Pontes, J.H.F.3; Alves Jr, S.S.4;
Sala, R.V.4; Jorge, R.S.4
1
Professor do Curso de Medicina Veterinária – UNIFEOB - São João da Boa Vista – SP, Brasil
– CEP 13874-159 - coordvet@feob.br; 2 Residente de Reprodução Animal - HOVET –
UNIFEOB - São João da Boa Vista – SP; 3 In Vitro Brasil Ltda – Mogi Mirim – SP - Brasil 4
Graduandos do Curso de Medicina Veterinária – UNIFEOB - São João da Boa Vista - SP
A utilização da biotecnologia envolvendo a produção e comercialização de embriões produzidos

em laboratório a partir de doadoras vivas, já é realidade na bovinocultura nacional, demonstrando
a tendência de uma rápida evolução dos sistemas de produção animal. Entretanto, a potencialidade
desta tecnologia aplicada na produção de pequenos ruminantes ainda não foi devidamente
explorada no Brasil. Foram comparadas taxas de clivagem e produção in vitro de embriões ovinos
a partir de oócitos aspirados por laparoscopia (LOPU) de doadoras da raça Santa Inês submetidas
à estimulação ovariana, empregando-se na FIV dois tipos de indutores de capacitação espermática:
o meio TALP enriquecido com 10μg/mL de heparina (Grupo FIV heparina) tradicionalmente
utilizado na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos e meio TALP enriquecido com 20% de
soro inativado de estro de ovelha (Grupo FIV soro). Para tanto 16 fêmeas adultas foram
sincronizadas com esponjas intra-vaginais com 60 mg de acetato de medroxiprogesterona
(Progespon®) inseridas no D0 e submetidas a estimulação ovariana no D8, através da associação
de FSH (80 mg NIH de FSH-S1), eCG (300 UI) e PGF 2 alfa (d-cloprostenol) (0,5 mL de Prolise®),
administrados ao mesmo momento, 36hs. antes da LOPU. As doadoras foram posicionadas em
decúbito dorsal em maca inclinada 60º, com a cabeça voltada para o lado inferior, utilizando-se
laparoscópio e trocáteres de 0,5mm e bomba de vácuo calibrada em 40mmHg para o procedimento
de aspiração folicular. As esponjas intra-vaginais foram retiradas no momento do ato cirúrgico.
Os oócitos foram coletados em um tubo Falcon de 50 mL contendo 10 mL de meio TCM199,
suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), heparina (0,05mg/mL) e sulfato de
gentamicina (0,05mg/mL), mantidos a 39º C em banho-maria. Foram aspirados 149 folículos
ovarianos (9,31 folículos/animal) recuperando-se o total de 142 oócitos (8,88 oócitos/animal),
que foram lavados 3x em meio TCM199-Hepes suplementado com 10% SFB, e incubados em
gotas de 90μL de meio TCM199-Hepes, enriquecido com 10% de SFB, FSH (5ìg/mL), LH
(5ìg/mL), estradiol (1ìg/mL), piruvato de sódio (0,3 mM) e Cisteamina (100 ìM), em temperatura
de 39º C e 5% CO2 em ar e máxima umidade, durante 24 à 26hs, atingindo 97,89% de taxa de
maturação. Os 139 oócitos maturados foram submetidos a FIV por 18hs utilizando-se o sêmen
congelado do carneiro Tingui 655 (Alta Genetics®), destinando-se 78 oócitos para o Grupo FIV
heparina e 61 oócitos para o Grupo FIV soro. O grupo FIV heparina resultou na clivagem de 6
estruturas (7,41%) e apenas 1 embrião viável no D7 (1,23%), demonstrando a ineficiência do
protocolo utilizado na espécie bovina, para a obtenção de embriões da espécie ovina, ao passo
que no grupo FIV soro foram constatados 14,75% de clivagem, resultando 9 embriões viáveis no
D7 (14,75%). Embora os resultados aqui apresentados indiquem a necessidade de melhoria dos
índices obtidos, percebe-se que a produção in vitro de embriões ovinos da raça Santa Inês, é uma
atividade viável que requer aprimoramento para tornar-se uma ferramenta comercialmente
promissora.
s487
QUANTIFICAÇÃO DA APOPTOSE E NECROSE EM EMBRIÕES ZEBUÍNOS

PRODUZIDOS IN VITRO E VITRIFICADOS EM SOLUÇÕES CONTENDO
DIFERENTES CARBOIDRATOS
Machado, V.C.1; Dias, A.J.B.1; DaMatta, R.A.2; Paes de Carvalho, C.S.1; Thiebaut, J.T.L.3
1
Setor de Reprodução Animal, LMGA/CCTA/UENF, 2LBCT/CBB/UENF, 3LEAG/CCTA/
UENF, Campos dos Goytacazes-RJ, 28013-600, Brasil. aburla@uenf.br
Métodos de criopreservação de embriões bovinos têm sido melhorados nos últimos anos. No
entanto a grande maioria deles tem sido desenvolvida para embriões Bos taurus, não existindo
uma metodologia específica para crioestocagem de embriões Bos indicus, sub-espécie que
representa mais de 80% do rebanho brasileiro, incluindo seus cruzamentos. As diferenças
morfofisiológicas existentes entre embriões Bos taurus e Bos indicus têm sido apontadas como
uma das causas da diferença na criotolerância desses embriões. O objetivo desse trabalho foi
avaliar a influência das soluções de vitrificação testadas sobre o índice apoptótico e necrótico de
embriões zebuínos produzidos in vitro e vitrificados. Blastocistos zebuínos de grau I e II produzidos
in vitro foram vitrificados pelo método de OPS (VAJTA, 1998) e distribuídos em cinco diferentes
soluções de vitrificação: T1) DMSO 20% + glicerol 20% (n=16); T2) DMSO 20% + etilenoglicol
20% (n=15); T3) DMSO 20% + glicerol 20% + trealose 0,3M (n=11); T4) DMSO 20% +
etilenoglicol 20% + sucrose 0,5M (n =15); T5) DMSO 20% + etilenoglicol 20% +trealose 0,3M
(n=20). Todas as soluções foram feitas em meio TCM 199 HEPES (SIGMA). Após a
desvitrificação os embriões foram cultivados em meio199 + 10% SFB por 6 horas. A determinação
do grau de apoptose e necrose dos embriões foi realizada por meio de marcação dupla com
anexina V-FITC (1µg/ml) + iodeto de propídeo (2µg/mL). Os embriões foram postos entre lâmina
e lamínula e analisados com auxílio de um microscópio de fluorescência Eclipse TE 300 (Nikon).
Células com emissão de cor verde foram consideradas positivas para apoptose e células com
emissão vermelha, ou verde e vermelha foram consideradas necróticas. A análise dos dados foi
realizada considerando o método de amostragem simples em proporção ou porcentagem ao nível
de significância de 5% de probabilidade. Os resultados foram expressos em porcentagem e seus
respectivos intervalos de confiança. Embriões do grupo não vitrificado (controle) apresentaram
uma média de 140 células, com índice apoptótico, necrótico e total de células lesadas de
0,15±0,06%, 0,10±0,05% e 0,25±0,08%, respectivamente. Embriões de T1, T2, T3, T4 e T5
apresentaram índice apoptótico de 20±1%a, 11,0±1,0%b, 9,0±1,0%bc, 10,0±1,0%bc, 8,0±1,0%c,
respectivamente; índice necrótico de 23,0±1,0%a, 20,0±1,0%b, 18,0±1,0%b, 9,0±1,0%c, 6,0±1,0%d,
respectivamente e total de células lesadas de 44,0±1,0%a, 31,0±1,0%b, 28,0±2,0%b, 19,0±1,0%c,
15,0±2,0%d, respectivamente. Valores com diferentes sobrescritos diferem em P < 0,05. Embriões
vitrificados em soluções sem carboidratos, apresentaram maior número de células lesadas. O
maior índice apoptótico e necrótico foi observado em blastocistos de T1, enquanto embriões de
T5 apresentaram o menor índice apoptótico e necrótico. Embriões de T2 apresentaram baixo
índice apoptótico, mas a porcentagem de células necróticas se manteve elevada. A utilização da
trealose nas soluções de vitrificação contendo glicerol promoveu uma redução no índice
apoptótico. No entanto a utilização da trealose ou sacarose nas soluções contendo etilenoglicol
não alterou o índice apoptótico, porém reduziu significativamente o número de células necróticas.
Os resultados apresentados demonstram que a utilização de soluções contendo etilenoglicol e
carboidratos como a sacarose e a trealose são mais adequadas para a vitrificação de embriões
zebuínos, que soluções contendo glicerol.
s488
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES UTILIZANDO SÊMEN SEXADO
Avelino, K.B.1; Basso, A.C.1; Rossetto, M.R.1; Maraia, A.C.1;

Landim Jr., L.P.1; Garcia, J.M.1,2
1
TECGENE - Tecnologia e Genética Animal, 15090-250, S. J. Rio Preto, SP, Brasil.
2
DMVPRA-FCAV-UNESP, 14884-900, Jaboticabal-SP. labriopreto@tecgene.com.br
A utilização da citometria de fluxo na separação de espermatozóides x e y possibilita a

maximização de biotécnicas reprodutivas. Sabendo-se que o Brasil ocupa um papel de destaque
no cenário mundial da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos e que esta técnica pode
afetar a viabilidade espermática, este trabalho teve por objetivo avaliar a eficácia da PIV de
embriões a partir de espermatozóides sexados. Os oócitos foram obtidos por aspiração folicular
guiada por ultrassom (OPU) de matrizes de alto valor genético, maturados em TCM-199 com
10% SFB, piruvato (2,2 μg/mL), FSH (0,5 g/mL), hCG (100 UI/mL), estradiol (1,0 μg/mL) e
antibiótico, incubados à 38,5ºC e 5% de CO2 em ar. A fecundação in vitro ocorreu 24 horas após
o início da maturação. O sêmen comercial previamente sexado para fêmea foi descongelado a
35ºC por 30 segundos e processado em gradiente de Percoll (45 e 90%), por 5 minutos e 1900g.
Em seguida, o sêmen foi re-diluído em 300 μL de meio de fecundação e centrifugado por 5
minutos e 900g. Após 18 horas, os zigotos foram transferidos para o desenvolvimento em meio
SOF a 38,5ºC e 5% de CO2 em ar. A clivagem foi avaliada 40 horas após a fecundação e a
produção de embriões, no 6° dia de cultivo. Foi utilizado sêmen de diferentes touros e raças
(Nelore, Brahman e Gir Leiteiro), totalizando 68 doses, sendo 41 da raça Nelore (12 touros), 23
da Gir Leiteiro (8 touros) e 4 da Brahman (2 touros). Dentre os 3535 oócitos maturados, foram
fecundados 2663 (65,1%) e produzidos 878 (21,7%) de embriões viáveis. O percentual de clivados
e embriões viáveis produzidos nas diferentes raças foram de 78,9% e 30% para a Nelore, 65,4%
e 21,5% para a Brahman e 86,6% e 23,5% para Gir Leiteiro, respectivamente. Os resultados
demonstram que o sêmen sexado pode ser utilizado comercialmente na produção in vitro de
embriões bovinos, obtendo-se resultados satisfatórios. Por outro lado, acredita-se que estes
resultados possam ser otimizados pelo uso técnicas específicas para o sêmen sexado.
s489
EFICIÊNCIA DE DUAS TÉCNICAS DE PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES

UTILIZANDO SÊMEN SEXADO
Basso, A.C.1; Avelino, K.B.1; Rossetto, M.R.1; Maraia, A.C.1;

Landim Jr., L.P.1; Garcia, J.M.1,2
1
TECGENE- Tecnologia e Genética Animal, 15090-250, S. J. Rio Preto, SP, Brasil.
2
DMVPRA-FCAV-UNESP, 14884-900, Jaboticabal-SP. labriopreto@tecgene.com.br
Diante do maior interesse na produção de fêmeas bovinas, os sistemas comerciais de produção

in vitro de embriões têm dado grande ênfase na utilização de sêmen previamente sexado por
citometria de fluxo. Devido à baixa qualidade do sêmen recuperado após a descongelação, foi
necessária a modificação da técnica usualmente utilizada, com o objetivo de melhorar a eficiência
da fecundação e a subseqüente produção de embriões. Os oócitos foram obtidos de matrizes de
alto valor genético (aspiração folicular guiada por ultrassom - OPU) e maturados em meio TCM-
199 com 10% SFB, piruvato (2,2 μg/mL), FSH (0,5 μg/mL), hCG (100 UI/mL), estradiol (1,0
μg/mL) e antibiótico à 38,5ºC e 5% de CO2 em ar. A fecundação in vitro ocorreu 24 horas após o
início da maturação. O sêmen comercial previamente sexado para fêmea foi descongelado a
35ºC por 30 segundos e processado pela técnica convencional (1), em gradiente de Percoll 45 e
90% em Eppendorf, por 5 minutos e 1900g. A técnica modificada (2) consiste na utilização do
gradiente de Percoll 45 e 90% em Epperdorf com posterior lavagem dos espermatozóides em
300 μL de meio de fecundação, por 5 minutos e 900g, para retirada do excesso de Percoll. Após
18 horas, os zigotos foram transferidos para o desenvolvimento em meio SOF, acrescido de
0,5% de BSA e 2,5 % de SFB, a 38,5ºC e 5% de CO2 em ar. A percentagem de clivados foi
avaliada às 40 horas após fecundação (CL) e a percentagem de produção de embriões, no 6° dia
de cultivo (BL). Na técnica 1 foram utilizados 2098 oócitos maturados, resultando em 1603
clivados (77,2%) e 517 embriões viáveis (25,7%). Por outro lado, na técnica modificada (2), 445
oócitos maturados resultaram em 372 clivados (83,6%) e 172 embriões viáveis (38,7%). Os
resultados foram submetidos a uma Análise de Variância (SAS-System) e as médias ajustadas
para os seus quadrados mínimos. Concluímos por esses resultados que houve uma melhora
significativa, tanto da taxa de fecundação (p>0,05), como na percentagem de embriões produzidos
(p>0,05), quando se utilizou a técnica modificada (2) para a recuperação de espermatozóides
sexados.
s490
EFEITOS GENÉTICOS E AMBIENTAIS NA PRODUÇÃO IN VITRO DE

EMBRIÕES UTILIZANDO SÊMEN DE TOUROS JOVENS
SELECIONADOS PARA TESTE DE PROGÊNIE
Gavio, D.; Vozzi, P.A.; Fernandez, M.B.; Elias, F.P.; Vila, R.A.;
Galerani, M.A.V.; Lôbo, R.B.
FMRP-USP, 14049-900, Ribeirão Preto-SP, Brasil. dgavio@genbov.fmrp.usp.br
Sêmen criopreservado de 100 touros jovens, procedentes de seis centrais de Inseminação Artificial
e selecionados para teste de progênie, foram avaliados pela motilidade, origem do DNA
mitocondrial e capacidade de desenvolvimento embrionário in vitro. Os procedimentos GLM e
MIXED foram utilizados para identificar as possíveis fontes de variação: reprodutor, tipo de
DNA mitocondrial, procedência do sêmen (Central de Inseminação Artificial), motilidade e vigor
espermático, ano e réplica do experimento. Foi observado efeito significativo na produção de
blastocistos para procedência, motilidade espermática e efeito aninhado da interação Touro-
Central-Motilidade. A origem mitocondrial não apresentou efeito significativo (p>0,05),
provavelmente devido ao tamanho e à proporção de animais indicus (9,37%) na amostra estudada.
Todavia, na genealogia materna se observam diferenças significativas (P<0,05) favorecendo
animais com origem taurina para todos os valores de médias nas Diferença Esperada na Progênie
(DEP) para características reprodutivas, de crescimento e habilidade materna. Foi constatado
efeito materno importante na Produção in vitro (PIV), existindo correlações positivas e
significativas (P<0,05) para características de habilidade materna e para Perímetro Escrotal no
primeiro ano de idade (DDPE365), embora de baixa magnitude (r=0,20 , P<0,05). Finalmente,
foram realizadas análises de pedigree nos touros jovens a partir da probabilidade de origem de
um gene e foi observada participação predominante de dois ancestrais principais nos touros
pertencentes ao grupo de maior produção de embriões in vitro.
s491
s492
Resumos:
Transferência de Embriões
s493
EFICIÊNCIA DE DETECÇÃO DE ESTROS EM RECEPTORAS DE EMBRIÃO

SINCRONIZADAS COM CLOPROSTENOL
Fernandes, C.A.C.1,2; Figueiredo, A.C.S.1; Oliveira, E.R.2; Vasconcelos, T.D.2;

Alves, B.F.L.2; Gioso, M.M.1; Viana, J.H.M.3; Oba, E.4
1
Unifenas, Rod. MG 179,Km 0, 37130-000 Alfenas MG;. 2Biotran Ass. e Consult. em Reprod.
Animal Ltda. R. Tatuin, 93, Res. Teixeira, 37130-000 Alfenas MG; 3Embrapa Gado de
Leite,36038-330 Juiz de Fora, MG; 4FMVZ-U nesp,18618-000 Botucatu, SP;
cacf@biotran.com.br
A correta observação de estros é de fundamental importância em qualquer sistema de criação de

bovinos. Em programas de Transferência de Embriões (TE), sua importância é ainda maior visto
que as atividades relacionadas às doadoras e receptoras estão sempre de alguma forma ligadas a
manifestação de estros por estes animais. A acuidade na detecção de estros de receptoras de
embrião está diretamente relacionada à eficiência econômica da TE, pois esta eficiência determina
o número necessário destes animais no programa, cuja manutenção é o principal ônus do processo.
Vários trabalhos têm sido publicados indicando baixas taxas de detecção de estros, principalmente
quando os animais são sincronizados. Estes trabalhos, contudo, não definem se o problema foi a
eficiência da indução da luteólise ou da observação de estro. Os objetivos deste trabalho foram
avaliar a eficiência de detecção de estros em receptoras sincronizadas com Cloprostenol (Ciosin®),
monitorando-se a queda de progesterona (P4) sérica como indicador de luteólise. Foram utilizadas
240 fêmeas bovinas cruzadas, que estavam entre os dias 6 a 17 do ciclo estral no dia da aplicação
do luteolítico. Para avaliar a eficiência da luteólise e possibilidade de manifestação de estro, foi
colhida uma amostra de sangue imediatamente antes da aplicação do cloprostenol e outra 24 a 30
horas mais tarde. Os animais foram mantidos em piquetes de capim Brachiária, na presença de
um rufião cruzado para cada 30 fêmeas. A observação visual de estros foi feita duas vezes ao dia,
por 30 minutos. Considerou-se o reflexo de imobilidade como sinal de estro. Dos 240 animais
que receberam o luteolítico, 229 apresentaram luteólise, uma eficiência de 95,4%. Destes 229
animais que sofreram luteólise, 199 foram detectados em estro até 96 horas após a aplicação,
resultando em uma eficiência de detecção de 86,9%. Apenas 1 animal indicado como em estro
não apresentou queda na P4 (falso positivo). Os resultados mostram que quando o processo de
sincronização é eficiente e a detecção de estro é feita de forma correta, pode-se obter alta eficiência
neste processo.
Palavras chave: Bovino, Detecção de estros, Luteólise
s494
ÁREA DE TECIDO LUTEAL EM RECEPTORAS DE EMBRIÃO SINCRONIZADAS

E COM OVULAÇÃO ESPONTÂNEA OU INDUZIDA POR BENZOATO DE
ESTRADIOL
Siqueira, L.G.B.1; Viana, J.H.M.2; Diniz, E.S.2; Camargo, L.S.2; Oliveira, A.P.3;
Fernandes, C.A.C.4; Torres, C.A.A.1
1
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG 36571-000; 2Embrapa Gado de Leite, Juiz de
Fora, MG 36038-330; 3Epamig, Juiz de Fora, MG 36038-330; 4Biotran Ass. e Consult.
Reprodução Animal Ltda, Alfenas, MG 37130-000; E-mail: luizvet10@hotmail.com
A necessidade de sincronia entre o estádio do ciclo de doadoras e receptoras de embrião torna

imprescindível o uso de protocolos de sincronização de estro nestes animais. A baixa eficiência
dos métodos baseados apenas na aplicação de prostaglandinas ou análogos levou ao
desenvolvimento de protocolos de sincronização cada vez mais elaborados, com a associação de
progesterona ou progestágenos, eCG, prostaglandinas e GnRH ou benzoato de estradiol. Objetivou-
se, no presente trabalho, caracterizar a qualidade dos corpos lúteos formados após o uso de um
protocolo de sincronização em animais nos quais a ovulação foi espontânea ou induzida pelo
benzoato de estradiol (BE). Novilhas mestiças Holandês-Zebu (N=30) foram submetidas ao
protocolo Heatsynch sendo que o BE somente foi aplicado ao final do tratamento naquelas em
que o estro não foi observado até 30h após a retirada do implante de progesterona. No momento
da inovulação (D7) os animais foram submetidos à exame ultra-sonográfico para identificação e
mensuração do corpo lúteo, utilizando-se um aparelho portátil equipado com um transdutor
linear retal de 5 MHz. Não houve diferença no percentual de animais apresentando corpos
lúteos no momento da transferência entre os animais com ovulação espontânea ou induzida pelo
BE (14/15, 93,3% vs. 13/15, 86,6%, respectivamente, p>0,05). A área total do corpo lúteo e a
área de tecido luteal (corrigida para a presença de cavidades), contudo, foram maiores nos animais
com ovulação espontânea que naqueles tratados com BE (3,68±0,33cm2 e 3,38±0,32cm2 vs.
2,18±0,15cm2 e 2,09±0,14cm2, respectivamente; p<0,01). A baixa taxa de gestação obtida após
a transferência de embriões produzidos in vitro em ambos os grupos (25,0% e 20,0%,
respectivamente) não permite concluir sobre o efeito da diferença observada nos corpos lúteos.
Considerando-se os critérios convencionais de seleção de receptoras por tamanho de área luteal,
os animais com manifestação de estro e ovulação espontânea após o protocolo formam um grupo
de receptoras com melhores características. De fato, a manifestação de estro só ocorre quando
folículos atingem um estádio de maturação associado a um maior diâmetro e, consequentemente,
associados a um maior tamanho luteal. Contudo, apesar da indução da ovulação pelo BE resultar
na formação de corpos lúteos menores, um número maior de animais pode ser utilizado como
receptoras, minimizando o descarte de embriões ou os inconvenientes da criopreservação,
particularmente para embriões produzidos in vitro.
s495
CURVA DE DENSIDADE DE PROBABILIDADE DO NÚMERO DE EMBRIÕES

VIÁVEIS COLETADOS EM VACAS NELORE SUPEROVULADAS
Beltrame, R.T.1; Quirino, C.R.;1 Barioni, L.G.2
1
LMGA-CCTA-UENF, Av. Alberto Lamego, 2000 - Campos dos Goytacazes – RJ, CEP: 28013-
600, Brasil. 2 Embrapa Cerrados. Rod. Brasília Fortaleza BR 020 Km 18 Planaltina - DF - Brasil
CEP: 73301-970; rtbeltrame@terra.com.br; rtbeltrame@yahoo.com.br
Em uma coleta de embriões de uma doadora qualquer, é impossível prever com exatidão o número
de embriões viáveis que serão gerados. Inúmeras decisões pertinentes a programas de transferência
de embriões são dependentes desta informação (numero de receptoras à sincronizar, número de
embriões a congelar, material a ser utilizado, tempo, etc). Neste sentido, em algumas biotécnicas
da reprodução animal, é necessário fazer previsões a respeito do valor futuro de certas variáveis,
tomando por base dados históricos. Para transferência de embriões, existe a necessidade de um
estudo mais apurado do comportamento da variável aleatória número de embriões viáveis por
coleta. Alguns estudos têm demonstrado que o uso de estimativas deterministas como a média,
não se considerando a variabilidade da geração de embriões, pode subestimar projeções de custo
e resultados da atividade. Ainda, em toda a literatura consultada, inexistem trabalhos similares.
Neste estudo, foi determinada a curva de densidade de probabilidade do número de embriões
gerados por doadoras da raça Nelore. Para tal, utilizou-se de dados da Associação Brasileira dos
Criadores de Zebu e da Controlmax Acessória de Sistemas LTDA para determinar-se a freqüência
observada desta variável em uma situação real. Analisaram-se informações provenientes de 26.767
doadoras, 61.928 coletas e 451.322 embriões no período de 1991 a 2005. Buscou-se identificar
através de comparação gráfica e análise numérica, uma distribuição de freqüência consagrada,
que representasse da melhor maneira possível a variabilidade da variável aleatória estudada.
Análises foram realizadas no software Microsoft Excel 2003. Os dados foram aproximados à
distribuição exponencial negativa e à distribuição Gama. Foi utilizado o método da “máxima
verossimilhança” para estimar os parâmetros da distribuição. Estatisticamente procedeu-se o
teste F e o cálculo do coeficiente de determinação para avaliação dos ajustes. Verificou-se que
que tanto a distribuição exponencial quanto a distribuição Gama permitem representar
adequadamente a variabilidade do número de embriões gerados por doadoras da raça Nelore.
Resultados mostraram que existe grande proximidade de comportamento entre as distribuições
testadas e bom ajuste de ambas aos dados observados. Tanto o ajuste da distribuição Gama
quanto o da distribuição exponencial apresentaram-se altamente significativos (P<0,0001). O
coeficiente de determinação também pode ser considerado alto para ambos os modelos (R2 =
0,96 para as distribuições Exponencial e Gama), demonstrando que as distribuições foram capazes
de explicar grande parte da variância amostral. O erro padrão da regressão foi de 0,0072 e 0,0071
para as distribuições Exponencial e Gama, respectivamente. Os parâmetros de ajuste e média
encontrados foram respectivamente de K= 0,156 e ì = 6,4 para a distribuição exponencial negativa
e K= 0,947, ë= 6,775 e ì = 7,2 para a distribuição gama. Quanto aos dados observados a média
encontrada foi de 6,3 embriões por coleta Assim, na projeção da variável número de embriões,
sugere-se sempre que possível, a utilização de simulação e da função exponencial devido ao
menor número de parâmetros a serem ajustados.
s496
PRODUÇÃO IN VIVO DE EMBRIÕES CAPRINOS DA RAÇA MOXOTÓ

PARTICIPANDO DE UM PROGRAMA DE PRESERVAÇÃO
Almeida, A.P.1; Lima, I.M.T.1; Paula, N.R.O.1; Souza, A.L.1; Andrade, M.L.L.1;
Lopes Jr., E.S.1; Andrioli, A.2; Rondina, D.1; Freitas, V.J.F.1
1
Ceará, 60.740-000, Fortaleza-CE, Brasil; 2EMBRAPA Caprinos, 62.011-970, Sobral-CE,
Brasil. anderson_almeida@click21.com.br
Caprinos da raça Moxotó estão em risco de extinção devido ao cruzamento indiscriminado com
raças especializadas em produção de carne ou leite. Desta forma, este trabalho teve por objetivo
utilizar um tratamento padrão de superovulação para a produção de embriões da raça Moxotó,
produzindo um banco de embriões e auxiliando na preservação da raça. O experimento foi
conduzido nas instalações do Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução, da Universidade
Estadual do Ceará (UECE) em Fortaleza-CE. Para este estudo foram utilizadas 17 fêmeas caprinas
da raça Moxotó, adultas (3,3 ± 0,7 anos) e de peso homogêneo (26,6 ± 4,1 kg), mantidas em um
sistema de manejo semi-intensivo. Os animais receberam feno de tifton (Cynodon dactylon) e
concentrado contendo 19% de proteína bruta. O estro dos animais foi sincronizado com esponjas
vaginais contendo 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (Progespon, Buenos Aires, Argentina)
por 11 dias, com aplicação de 50g de cloprostenol (Ciosin, Cotia, Brasil) por via intramuscular
quarenta e oito horas antes da retirada do progestágeno. No mesmo momento foi iniciado o
tratamento superovulatório, que consistiu de seis aplicações de pFSH (Folltropin, Ontario,
Canadá), em doses decrescentes, com intervalos de 12 h, perfazendo uma dose total de 120 mg
(30/30, 15/15 e 15/15 mg). As esponjas foram removidas no momento da quinta dose de pFSH.
A detecção do início do estro foi realizada a cada quatro horas e iniciadas a partir das 12 horas
após a retirada das esponjas. As coberturas foram realizadas por um reprodutor da raça Moxotó
de fertilidade comprovada, sendo a primeira no momento do estro e a segunda 24 horas após.
Sete a oito dias após primeira monta, as cabras foram submetidas aos procedimentos de
laparoscopia e laparotomia para determinação do número de ovulações e colheita de embriões,
respectivamente. Foram consideradas responsivas ao tratamento superovulatório as fêmeas que
apresentaram pelo menos cinco corpos lúteos. Os embriões recuperados foram avaliados em
estereomicroscópio (SMZ-1B, Tóquio, Japão) e avaliados segundo o seu estádio de
desenvolvimento e qualidade de acordo com os critérios estabelecidos pela IETS. Os dados são
apresentados como porcentagem ou média (± d.p.). Após remoção das esponjas, 64,7% (11/17)
dos animais apresentaram estro às 29,5 ± 7,0 h. Do total de animais tratados, 64,7% (11/17)
foram considerados responsivos ao tratamento superovulatório, com uma taxa de ovulação de
11,9 ± 8,0. Foram recuperadas 145 estruturas, sendo destas, 128 embriões, 10 estruturas não
fertilizadas e 7 zonas pelúcidas. Do total de embriões, 70,3% (90/128) eram mórulas e 29,7%
(38/128) blastocistos. Quanto à qualidade dos embriões recuperados, 68,8% (88/128) eram de
grau I, 14,1% (18/128) de grau II, 6,3% (8/128) de grau III e 10,8% (14/128) de grau IV. Em
conclusão, cabras da raça Moxotó respondem bem ao tratamento padrão de superovulação, o
qual torna-se uma alternativa viável para a produção in vivo de embriões desta raça, auxiliando a
preservação da mesma.
s497
AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE PROTOCOLOS DE SINCRONIZAÇÃO DE

RECEPTORAS DE EMBRIÕES BOVINOS PARA TETF UTILIZANDO BENZOATO
DE ESTRADIOL OU CIPIONATO DE ESTRADIOL
De Quadros, F.A.1; Melo Sterza, F.A.1; Santos, E.S.1; Fonseca, A.1; Baudraz, J.A.1;
Marques, V.T.1; Ferri, F.1; Marques, M.O.2; Silva, R.C.P.2; Baruselli, P.S.3
1
2
Geraembryo - Assessoria Pecuária Ltda. - CEP: 86300-000 – Cornélio Procópio – PR
3
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP, CEP 05508-000, São Paulo-SP
O presente experimento teve como objetivo verificar o efeito da administração de benzoato de

estradiol (BE) ou cipionato de estardiol (CE) como indutores de ovulação em quatro protocolos
destintos para transferência de embriões em tempo fixo. Foram utilizadas 168 novilhas mestiças
(Bos Indicus x Bos taurus) mantidas a pasto com escore corporal médio de 3,5 (1-5) pertencentes
à Fazenda Experimental da Unopar em Tamarana, Paraná. Os animais foram divididos em quatro
grupos homogêneos (fatorial 2x2) de acordo com os protocolos utilizados. O experimento foi
realizado em duas etapas, a primeira em agosto de 2005 e a segunda etapa em março de 2006,
sendo sincronizadas 96 e 72 animais respectivamente, todas com implante intravaginal impregnado
com 1,9g de progesterona (P4) natural (CIDR®, Pfizer, Brasil) e 2 mg de benzoato de estradiol
(Estrogin®,Farmavet, Brasil) no dia 0. No D8 retirou-se o implante e foi aplicado 0,15mg de D-
cloprostenol (Preloban®, Intervet, Brasil) via intramuscular (IM). Os grupos BE e CE receberam
1mg de BE e 0,5mg de CE IM respectivamente no D8. Os grupos BE24 e CE24 receberam 1mg
de BE e 0,5mg de CE (ECP®, Pfizer, Brasil) IM 24 horas após a retirada do implante (D9). Após
17 dias da inserção do implante fez-se a avaliação das receptoras por ultra-sonografia transretal
(ALOKA 500 SSD, Transdutor linear 5 Mhz). As que apresentaram corpo lúteo com diâmetro
acima de 18mm receberam embrião em tempo fixo. Foram transferidos nas duas etapas do
experimento um total de 132 embriões (frescos, descongelados e de PIV), os quais foram
distribuídos homogeneamente entre os grupos. O diagnóstico precoce de gestação foi realizado
30 dias após a inovulação. A taxa média de aproveitamento das receptoras foi a seguinte: BE
=73%, CE = 76%, BE24 = 85% e CE24 = 78% (P> 0,05, teste de qui-quadrado). A taxa média de
prenhez dos grupos BE, CE, BE24 e CE24 foi respectivamente de 23%, 41%, 33% e 39%, não
havendo diferença significativa entre os grupos (p>0,05). O uso de BE e CE no dia da retirada do
implante intravaginal de P4 e 24 h após a sua retirada mostraram-se eficientes na taxa de
sincronização de fêmeas receptoras de embriões. O uso dos indutores de ovulação no dia da
retirada do implante representa uma boa alternativa, pois reduz o número de manejos dos animais
em sincronização. Por outro lado, apesar de não ter sido observada diferença significativa na
taxa de prenhez entre os grupos, novos experimentos devem ser realizados para confirmar esses
dados.
s498
TAXA DE GESTAÇÃO APÓS TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EQUINOS

MANTIDOS POR DIFERENTES PERÍODOS ENTRE 15 E 18º C EM MEIO DE
MANUTENÇÃO VIGRO
Alonso, M.A.1; Fleury, P.D.C.1; Neves Neto, J.R.1; Squires, E.L.2
1
Fleury Reprodução Eqüina – São José do Rio Pardo- SP, 13720-000, Brasil.
perlafleury@hotmail.com
O transporte de embriões eqüinos refrigerados contribui para a viabilização da técnica de

transferência de embriões, uma vez que o custo de manutenção de um plantel de receptoras é
oneroso para muitos proprietários. Alem disso, este transporte também possibilita que centrais
de reprodução prestem serviços para outros veterinários que não possuem receptoras. Este
experimento foi delineado com o intuito de comparar o efeito de diferentes períodos de manutenção
de embriões em meio Vigro (Bioniche Animal Health, Athens, GA), refrigerados entre 15 e 18º
C. Foram comparadas as taxas de gestação após a transferência não cirúrgica de embriões que
foram mantidos por 0 a 6hs, 6 a 12 hs e entre 12 e 24hs. As doadoras eram de diferentes raças,
com idade entre 3 e 24 anos, mantidas em diferentes haras e na central Fleury Reprodução Eqüina.
Os embriões foram coletados de forma não cirúrgica 7 ou 8 dias após a ovulação. Após a
identificação do embrião, seu tamanho, desenvolvimento e qualidade eram avaliados. Apenas
embriões de grau I foram utilizados no experimento. Os embriões eram lavados, transferindo-os
seqüencialmente entre, no minimo, 6 gotas de 1 ml de meio de manutenção em uma placa de
Petri. Os embriões do Grupo 1 (0 a 6hs) poderiam ser transferidos imediatamente ou, assim
como no Grupo 2 (6 a 12hs) e Grupo 3 (12 a 24hs), eram colocados em um tubo de transporte
contendo 4 ml do mesmo meio utilizado para posterior refrigeração. Os tubos eram então
colocados no Botutainer® (Biotech – Botucatu) com apenas um gelo para que a temperatura
ficasse entre 15 e 18º C. A transferência dos embriões foi realizada em receptoras sincronizadas,
entre 3 e 8 dias após a ovulação. As receptoras eram de diferentes raças, entre 3 e 14 anos. Todas
estavam na central Fleury Reprodução Eqüina. A ultrassonografia foi utilizada pra detectar a
gestação entre 14 e 16 dias após a ovulação da égua doadora Os dados foram analisados usando
o teste Qui-Quadrado. As taxas de gestação foram similares para os embriões do Grupo 1 (58/80,
72,5%), Grupo 2 (61/80, 76,25%) e Grupo 3 (58/80, 73,75%). Concluindo, a manutenção em
meio Vigro a temperatura de 15 a 18ºC não compromete a taxa de gestação de embriões mantidos
por até 24hs.
s499
â-CAROTENO E TOCOFEROL NA PRODUÇÃO E QUALIDADE DE EMBRIÕES

BOVINOS
1
Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG, Cep:37 200-000,
Cx Postal 37, Brasil. znlogan@yahoo.com.br
Trabalhos anteriores demonstraram que a utilização de â-caroteno e vitamina E melhoram a

eficiência reprodutiva de várias espécies animais. No entanto, os efeitos destes antioxidantes
ainda não foram relacionados com a qualidade de embriões em programas de transferência. O
objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da injeção (i.m.) de â-caroteno e vitamina E na qualidade
de embriões coletados de doadoras da raça holandesa. Vacas (n=22) e novilhas (n=50) holandesas
foram sincronizadas utilizando Crestar® (Intervet International B.V., Boxmeer, Holanda) que
consiste na aplicação de implante auricular subcutâneo de 3 mg de Norgestomet, associado à
aplicação intramuscular de 6 mg de Norgestomet e 10 mg de valerato de estradiol (D1), no sexto
dia iniciou o protocolo superovulatório com 8 aplicações decrescentes de FSH/LHp (Pluset®,
Calier S.A., Barcelona, Espanha) em intervalos de 12 horas. No oitavo dia aplicou-se intramuscular
0,5 mg de cloprostenol sódico (Sincrosin®,Vallée S.A., Montes Claros, Brasil) e procedeu-se a
retirada do implante no nono dia. Os animais foram inseminados 12 e 24 horas após a observação
do cio e a coleta foi realizada sete dias após a 1ª inseminação. Após a coleta, os embriões foram
avaliados segundo o padrão adotado pela IETS. Um índice de qualidade embrionária (IQE) foi
proposto baseado nesta classificação (IQE = (Excelente*1 + Bons*2 + Regulares*3 + Pobres*4
+ Degenerados*5) / total de embriões colhidos). Valores absolutos mais próximos de 1,00 indicam
melhor qualidade. Os animais foram alocados para um de três tratamentos de forma aleatória,
sendo que no tratamento 1 receberam somente veículo (n=24), no tratamento 2, 800 mg de â-
caroteno e 500 mg vitamina E, (n=20) e no tratamento 3, 1200 mg de â-caroteno e 750 mg de
vitamina E, (n=28). Os tratamentos foram aplicados no dia do implante (D1) e no início do
protocolo superovulatório (D6). O IQE foi analisado PROCGLM e o total de estruturas e de
viáveis pelo PROCGENMOD do Sistema de Análises Estatísticas (SAS). Para o IQE houve
efeito (P=0,0058) da interação tipo de animal vs tratamento, onde a qualidade embrionária foi
melhorada em vacas, e não em novilhas. Os IQEs para vacas e novilhas nos tratamentos T1, T2
e T3 foram, 3.13±0,48 e 2,32±0,26; 2,57±0,51 e 2,23±0,27; 1,29±0,51 e 2,50±0,25,
respectivamente. Não houve diferença entre os tratamentos no total de estruturas coletadas e de
embriões viáveis. Concluímos que a aplicação intramuscular de â-caroteno e tocoferol melhorou
a qualidade dos embriões coletados de vacas da raça holandesa e não teve efeito sobre os embriões
de novilhas. O número de embriões viáveis e o total de estruturas coletadas não diferiram entre
os tratamentos. Nas condições do presente experimento, demonstrou-se que a aplicação de
antioxidantes foi uma alternativa para melhorar a qualidade de embriões de vacas superovuladas.
s500
TRATAMENTO INTRA-UTERINO DE INFECÇÕES EM VACAS
Canella Filho, C.C.1; Fernandes, C.A.C.2,3; Viana, J.H.M.4; Figueiredo, A.C.S.2,3;

Gioso, M.M.2; Ludgero, B.F.A.3; Oliveira, E.R.3; Vasconcelos, T.D.3
1
Mestrando Ciência Animal–Unifenas – Rod MG 179 km 0 - 37130-000 Alfenas MG; 2Prof.
Unifenas – 3Biotran LTDA,. Rua Tatuin, 93, Resid. Teixeira. 37130-000-Alfenas MG –
cacf@biotran.com.br. 4Embrapa-Gado de Leite
O custo de manutenção e o elevado valor agregado das receptoras de embrião têm aumentado a
utilização das mesmas por mais de uma vez, ou seja o re-aproveitamento como receptoras de
vacas que já pariram um produto de transferência de embriões (TE). Esta prática traz vantagens
econômicas, mas cuidados adicionais devem ser tomados. Em relação á utilização de vacas. Esta
categoria de fêmeas esta mais sujeitas à problemas que podem reduzir sua fertilidade. Dentre
estas a principal são as infecções uterinas. O objetivo desse trabalho foi verificar a incidência de
infecção uterina e a eficiência da aplicação de uma combinação de produtos para tratamento
local de infecção uterina pós-puerperal, comparando o efeito de diferente número de tratamentos
em diferentes classes de infecção. Foram examinadas 498 vacas da mestiças, a partir de trinta
dias pós-parto. A alteração no aspecto da secreção uterina avaliada por vaginoscopia, foi
considerada para determinação de infecção. O tipo foi determinado conforme aspecto da exudação
uterina presente em Graus 1, 2 ou 3. O tratamento foi: 2g de Cloridrato de oxitetraciclina + 30mg
de cloridrato de bromexina, diluídos em soro fisiológico estéril (qsp 50 ml). Esta combinação foi
administrada via local, via infusão uterina. Os animais tratados foram reavaliados após uma
semana. Aqueles com alguma alteração a cada reavaliação receberam uma nova aplicação. A
eficiência do número de tratamentos de acordo com o grau de infecção foi comparada pelo teste
de χ2. Foi observada uma ocorrência total de 11,45% de infecção uterina. A eficiência de um
tratamento foi de 41,94a; 0,00b e 0,00b%, de dois tratamentos foi de 58,06a; 9,52b; 0,00%c e de
três tratamentos 100,00a; 100,00a e 69,23b% (P<0,05) para infecções de graus 1, 2 e 3. Os resultados
demonstram que a infecção uterina é de grande ocorrência. A combinação de produtos é eficiente
apenas após três tratamentos (P<0,05). Mesmo em infecções mais brandas, resultados satisfatórios
somente ocorreram com a terceira aplicação.
s501
AVALIAÇÃO DA ÉGUA RECEPTORA: EFEITO DE CARACTERÍSTICAS

UTERINAS E TEMPO DE OVULAÇÃO
Fleury, P.D.C.1; Alonso, M.A.1; Balieiro, J.C.C.2
1
Fleury Reprodução Eqüina – São José do Rio Pardo/SP, 13720-000, Brasil. 2 Departamento
de Ciências Básicas- FZEA-USP-Pirassununga/SP, 13.630-970, Brasil. fleury@rantac.com.br
A escolha da égua receptora no momento da transferência do embrião (TE) é de grande

importância, tendo influencia direta sobre a taxa de prenhez. Entretanto esta escolha é, muitas
vezes, feita de forma subjetiva pelo fato de cada veterinário possuir um método próprio de
avaliação. Alem disso, poucos estudos foram realizados com o intuito de verificar-se a influência
dos diferentes parâmetros de seleção de éguas receptoras na taxa de gestação. Este trabalho
analisou algumas características uterinas e o tempo de ovulação da receptora, correlacionando-
as com a taxa de prenhez. Foram utilizados dados colhidos nos últimos 4 anos na central Fleury
Reprodução Eqüina (São José do Rio Pardo-SP). Para a característica tempo de ovulação, foram
avaliados dados de 737 TE utilizando-se embriões de grau I e II, os quais foram transferidos
para receptoras entre 3 a 8 dias pós-ovulação (d3 a d8). A avaliação das características uterina
foi realizada por somente dois técnicos no dia da TE em 497 receptoras, que receberam embriões
de grau I e II. Essas características foram: tônus uterina, determinado por palpação retal, recebendo
escore de 1 (tônus máximo) a 4 (tônus mínimo); ecogenicidade uterina, visualizada por
ultrassonografia, e classificada com escores de 1(imagem homogênea e maior ecogenicidade) a
4 (imagem heterogênea e menor ecogenicidade). As taxas de gestação observadas foram avaliadas
utilizando-se metodologia de Modelos Lineares Generalizados, por meio do programa SAS®
(SAS, 1995). O modelo adotado contemplou, como parte sistemática, os efeitos dos diferentes
dias avaliados, da ecogenicidade e tensão. Foram realizados ainda análises de correlação Momento
Produto de Pearson entre as variáveis ecogenicidade e tensão. Os resultados de taxa de prenhez,
referentes ao tempo de ovulação da receptora foram os seguintes: d3 (n=66; 66,7%); d4 (n=148;
70,3%); d5 (n=181; 70,2%); d6 (n=135; 71,1%); d7 (n=133; 75,9%) e d8 (n=74; 65%). Não
houve diferença estatística significativa entre os grupos. Quando relacionamos tônus uterino
(T1, T2, T3 e T4) e taxa de gestação, obtivemos os seguintes resultados: T1 (n=90; 92%a); T2
(n=209; 88% a); T3 (n=198; 42% b); T4 (éguas com este tônus não receberam embriões, portanto,
não há taxa de prenhez). Avaliando ecogenicidade uterina (E1, E2, E3, E4), obtivemos: E1 (n=44;
90% a); E2 (n=299; 80% a); E3 (n=134; 52% b); E4 (n=20, 10%c). Observando estes resultados,
notamos que éguas que apresentaram T1 e T2 tiveram maior taxa de prenhez do que as éguas que
apresentaram T3 (p<0,05). Assim como as taxas de prenhez de éguas com E1 e E2 foram superiores
ao das éguas classificadas como E3 e E4. E de E3 foi superior a E4 (p<0,05). Foi detectada ainda
uma alta correlação positiva entre tônus uterino e prenhez (r=0,7) e uma correlação positiva,
porem fraca, entre tônus e ecogenicidade uterina (r=0,3). Baseado na relação encontrada entre
estes parâmetros de avaliação e a taxa de prenhez, concluímos que para a escolha da receptora,
não devemos nos ater somente ao tempo de ovulação (desde que seja entre d3 e d8), mas sim
priorizar a ecogenicidade e o tônus uterino.
s502
TAXA DE PRENHEZ E CONCENTRAÇÕES DE PROGESTERONA EM

RECEPTORAS INOVULADAS COM EMBRIÕES PRODUZIDOS IN VITRO (PIV) E
SUPLEMENTADAS COM BETACAROTENO ASSOCIADO AO TOCOFEROL
Sales, J.N.S.1; Souza, J.C.1; Dias, L.M.K.1; Franci, C.R.2; Rocha, A.A.3; Cardoso, G.G.C.4
1
DZO, Universidade Federal de Lavras, 37200-000, Lavras-MG, Brasil. 2Depto de Fisiologia,
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP,14049-900, Ribeirão Preto-SP, Brasil. 3Depto
de Ciências Básicas da Faculdade de Ciências Agrárias, UFVJM, 39100-000, Diamantina-MG,
Brasil. Paraíso Embriões, 13870-590, São João da Boa Vista-SP, Brasil.
znlogan@yahoo.com.br
Avaliou-se o efeito da injeção intramuscular (IM) de betacaroteno associado ao tocoferol na

resposta ao protocolo de sincronização, taxa de prenhez e na produção de progesterona de
receptoras (n=222, novilhas nulíparas cruzadas) inovuladas com embriões produzidos in vitro
(PIV). Um protocolo de sincronização em tempo fixo foi utilizado, onde um dispositivo
intravaginal de progesterona (1g; DIB®, Syntex S.A., Buenos Aires, Argentina) foi inserido no
dia 0 (D0) associado à administração de benzoato de estradiol (2mg, IM, RIC-BE®, Syntex S.A.,
Buenos Aires, Argentina). Após cinco dias (D5) foi aplicado eCG (400 UI, IM, Novormon®,
Syntex S.A., Buenos Aires, Argentina). No D8 as receptoras foram tratadas com D-cloprostenol
(150ìg, IM, Prolise®, ARSA S.RL., Buenos Aires, Argentina) e o implante de progesterona retirado.
No D9 foi administrado benzoato de estradiol (1mg, IM, RIC-BE®). Oito dias (D17) depois
foram realizadas as inovulações. Foram utilizados no experimento embriões provenientes de
FIV, sendo realizadas inovulações em cinco dias diferentes, por técnico experiente. Os animais
foram alocados aleatoriamente para um de três tratamentos: 1) Óleo mineral (controle), 2) 800mg
de â-caroteno e 500mg vitamina E (T800) e 3) 1.200mg de â-caroteno e 750mg de vitamina E
(T1200). Injeções intramusculares (controle, T800 e T1200) foram aplicadas no início do protocolo
sincronização (D0). Uma amostra de sangue foi coletada no dia da inovulação por venopunção
de vasos coccígeos para determinar a concentração plasmática de progesterona. A concentração
de progesterona no plasma foi analisada por radioimunoensaio utilizando o Kit progesterone
MAIA® (ADALTIS Itália S.p.A., Casalecchio di Reno, Itália). Os coeficientes de variação intra-
ensaio alto e baixo foram de 3,10% e 1,64%, respectivamente. Resposta ao protocolo de
sincronização foi definida pela presença de corpo lúteo por palpação retal no dia da inovulação
dos embriões. A resposta ao protocolo de sincronização e a taxa de gestação foram analisados
pelo teste de qui-quadrado. Do total de animais tratados no controle (n=72), T800 (n=72) e
T1200 (n=78), 72,2%, 73,6% e 73,1% responderam ao protocolo de sincronização,
respectivamente. Assim, não houve efeito de tratamento para número de animais que responderam
ao protocolo, ou seja, animais que apresentaram corpos lúteos compatíveis com a inovulação
(P<0,98). Não houve diferença entre os tratamentos (controle; T800 e T1200) nas taxas de prenhez
(30,7%; 17,0% e 28,1%) e nas concentrações de progesterona (8,88±0,57 ng/ml; 7,48±0.64 ng/
ml e 5,90±1,33 ng/ml). Concluiu-se que a suplementação com betacaroteno associado ao tocoferol
não melhorou o número de animais que responderam ao protocolo, a taxa de gestação e a produção
de progesterona de receptoras inovuladas com embriões provenientes de PIV, não sendo indicada
em programa de transferência de embriões com características semelhantes às do presente
experimento.
s503
RELAÇÃO ENTRE AS CONCENTRAÇÕES DE PROGESTERONA NOS PERÍODOS

PRÉ E PÓS-SUPEROVULATÓRIO E A PRODUÇÃO E QUALIDADE DE
EMBRIOES DE NOVILHAS HOLANDESAS
1
Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Lavras, 37200-000, Lavras-MG, Brasil.
znlogan@yahoo.com.br
O objetivo deste trabalho foi relacionar as concentrações séricas de progesterona pré e pós- superovulação
com a produção e qualidade de embriões coletados de novilhas holandesas (n=43) sincronizadas (Crestar®,
Intervet, São Paulo-SP, Brasil) e superovuladas com 8 aplicações decrescentes de FSH/LHp (Pluset®;
I.F. Serono, Rome, Italy) em intervalos de 12 horas. Os animais foram inseminados 12 e 24 horas após
a observação do cio e a coleta de embriões realizada sete dias após a primeira inseminação. Os embriões
foram classificados segundo o padrão proposto por Lindner e Wright (1983), por dois avaliadores
experientes. Amostras de sangue foram coletadas por venopunção de vasos coccígeos para determinar a
concentração sérica de progesterona. Foram realizadas cinco coletas de sangue, nos dias 1, 6, 10, 13 e 17
do período experimental, sendo 1 o dia do implante de norgestomet (D1), 6 o dia do início da superovulação
(D6), 10 o dia do início do estro (D10), 13 o terceiro dia após o estro (D13) e 17 o dia da coleta de
embriões (D17). A concentração sérica de progesterona foi analisada em duplicatas por radioimunoensaio
utilizando o kit Coat-A-Count Progesterone® (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, EUA).
Os coeficientes de variação intra-ensaio alto e baixo foram de 2,60% e 1,96%, respectivamente. As
concentrações séricas de progesterona foram agrupadas mantendo-se um número equilibrado de amostras
por grupo, além de concentrações diferentes com base no ciclo estral normal e de animais superovulados.
Para D1 foram estipulados três grupos: (D1a) <1,0ng/ml, (D1b) entre 1,0 e 4,5ng/ml e (D1c) >4,5ng/ml.
Para D6, dois grupos: (D6a) <1,0ng/ml e (D6b) >1,0ng/ml. Para D13, dois grupos concentrações: (D13a)
<4,5ng/ml e (D13b) >4,5ng/ml. Para D17, três grupos: (D17a) <10,0ng/ml, (D17b) entre 10,0 e 20,0ng/
ml e (D17c) >20,0ng/ml. Um índice de qualidade embrionária ou IQE (Excelentes*1 + Bons*2 +
Regulares*3 + Pobres*4 + Degenerados*5 + Não-Fertilizados*5)/total de embriões colhidos foi proposto
para a avaliação dos embriões, com o objetivo de unir as classificações de todas as classes de
desenvolvimento embrionário em um único número simplificando a interpretação das análises estatísticas
e possivelmente minimizar a subjetividade. A taxa de fecundação foi analisada PROCGLM e o IQE, o
total de estruturas e de embriões viáveis pelo PROCGENMOD (SAS). Não houve diferença significativa
para o IQE, taxa de fecundação, total de estruturas, óvulos fecundados e embriões viáveis nas diferentes
concentrações séricas de progesterona durante o período de pré-superovulação. O número médio total
de embriões viáveis (P=0,018), de óvulos fecundados (P=0,011) e de estruturas (P=0,006) no D13,
foram superiores no grupo de doadoras com maior concentração de progesterona (D13b). O número
médio total de embriões viáveis, de óvulos fecundados e estruturas nas classes de concentrações de
progesterona D13a e D13b foram 3,77±1,05 e 6,85±0,85; 4,41±1,19 e 8,77±0,96; 4,88±1,38 e 10,81±1,11,
respectivamente. Não houve diferença significativa para taxa de fecundação, total de estruturas e de
embriões viáveis nas diferentes concentrações de progesterona no D17, porém, para IQE, houve diferença
significativa (P=0,045), onde o grupo de doadoras com menor concentração de progesterona apresentou
melhor qualidade embrionária. Os IQEs para D17 nas diferentes concentrações de progesterona (D17a,
D17b e D17c) foram 1,78±0,28; 2,58±0,29 e 2,74±0,26. Conclui-se que concentrações séricas de
progesterona no período pré-superovulatório não foram úteis para predizer qualidade e produção
embrionária. No entanto, concentrações de progesterona no período pós-superovulatório foram
correlacionadas com produção e qualidade de embriões, onde doadoras na classe de maior concentração
de progesterona três dias após o estro apresentaram maior número médio de embriões viáveis, ovócitos
fecundados e estruturas recuperadas. Embriões coletados de doadoras com altas concentrações de
progesterona (>20ng/ml) no dia da coleta de embriões apresentam-se com qualidade inferior, podendo
ser um indicativo de um limiar ótimo de atuação deste hormônio.
s504
COMPARAÇÃO ENTRE DOIS PROTOCOLOS DE SINCRONIZAÇÃO DA

OVULAÇÃO EM RECEPTORAS DE EMBRIÃO BOVINO
Mollo, M.R.1,2; Ramos, A.F.1,3; Siqueira Filho, E.R.1; Pivato, I.1; Saueressig, M.G.4;
Rumpf, R1; Sartori, R.1
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 70770-900, Brasília-DF, Brasil, 2FAV-UnB,
70910-970, Brasília-DF, Brasil, 3UFMG, 30123-970, Belo Horizonte-MG, Brasil, 4Embrapa
Cerrados, 73310-970, Planaltina-DF, Brasil. marcosmollo@hotmail.com,
O presente estudo teve como objetivo comparar dois protocolos de sincronização de cio/ovulação
em receptoras de embrião. Um dos protocolos implica na manipulação dos animais durante
cinco vezes, enquanto que o outro requer somente três. Trinta vacas foram divididas em dois
grupos. No grupo 5X, as vacas receberam um implante intravaginal de progesterona (DIB, Syntex
S.A., Argentina) e uma injeção im de 2,0 mg de benzoato de estradiol (BE; Ric-Be, Syntex S.A.,
Argentina) no D0; 0,150 mg im de cloprostenol (Prolise, ARSA S.L.R., Argentina) e 300 UI im
de gonadotrofina coriônica eqüina (eCG; Novormon 5000, Syntex S.A., Argentina) no D5; retirada
do implante no D8 e injeção im de 1,0 mg de BE no D9. No grupo 3X, as vacas receberam o DIB,
2 mg de BE e 0,075 mg de cloprostenol no D0; retirada do implante no D8, juntamente com
injeção im de 0,075 mg de cloprostenol, 300 UI de eCG e 0,50 mg de cipionato de estradiol
(ECP, Pfizer, São Paulo, Brasil). No D17, todas as vacas receberam embriões produzidos in
vitro. Exames ultra-sonográficos foram realizados nos dias 10, 11 e 12 para mensuração do
folículo ovulatório, no D17 para mensuração do corpo lúteo, e 36 d após a inovulação para
diagnóstico de gestação. Na comparação entre os grupos, utilizou-se o teste-t para variáveis
contínuas e o qui-quadrado para variáveis binomiais. No grupo 5X todas as vacas (100,0%)
ovularam 3 d após a retirada do DIB, enquanto que no grupo 3X, apenas oito vacas (53,3%)
ovularam nessa data (P < 0,05). As demais vacas ovularam 2 d (n = 2), 4 d (n = 3) ou não
ovularam até 5 d (n = 2) após a retirada do implante. Não houve diferença significativa no
diâmetro máximo do folículo ovulatório (11,9 ± 0,5 e 12,5 ± 1,0 mm) ou no volume luteal
(2784,2 ± 368,8 e 2524,1 ± 311,7 mm³) entre os grupos 5X e 3X, respectivamente. (P > 0,10). A
taxa de prenhez no grupo 5X foi de 66,7% (10/15) versus 33,3% (5/15) no grupo 3X (P = 0,07).
Conclui-se que o protocolo 3X não se mostrou vantajoso em relação ao protocolo 5X devido ao
fato de ter promovido um menor grau de sincronia de ovulação, além de uma possível queda na
taxa de prenhez.
s505
IDENTIFICAÇÃO DO SEXO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VIVO

UTILIZANDO A TÉCNICA DE PCR A CAMPO
Sousa, RV.1,2; Cardoso, C.R.S.3; Butzke, G.3; Franco, M.M.1; Rumpf, R.1
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 70770-900, Brasília-DF, Brasil; 2FAV – UnB,
Brasília-DF, Brasil; 3Guilberth Serviços Veterinários S/C LTDA – CEP:13026-121, Campinas-
SP, Brasil, regiv@cenargen.embrapa.br
Com o aprimoramento das técnicas reprodutivas, a produção de embriões in vivo e in vitro, tem
crescido consideravelmente, aumentando a demanda por metodologia eficaz de identificação do
sexo dos embriões, visando diminuir o uso de embriões sem interesse comercial, adequando o
sistema de produção animal. Este trabalho teve por objetivo testar metodologia otimizada na
EMBRAPA para a identificação do sexo de embriões bovinos utilizando a técnica de PCR (Reação
em Cadeia da Polimerase) em condições de campo. Os embriões (n=545) foram coletados de
animais da raça holandesa, nos estádios de mórula compacta (MC), blastocisto inicial (BI),
blastocisto (BL) e blastocisto expandido (BX), no sétimo dia (D-7) após a inseminação e divididos
em dois grupos. Os embriões do grupo G-1 (n=333) foram submetidos à micromanipulação por
secção para retirada da biópsia, preferencialmente de células do trofoblasto Os embriões biopsiados
foram mantidos em solução de manutenção até o final do processo de identificação do sexo e
então transferidos para receptoras síncronas. Os embriões do grupo G-2 (n=212) foram transferidos
íntegros (controle) para receptoras síncronas. Todas as receptoras foram submetidas à
ultrasonografia aos 35 e 60 dias após as inovulações, para diagnóstico de gestação e confirmação
do sexo, respectivamente. Para a identificação do sexo dos embriões biopsiados, suas respectivas
biópsias foram submetidas à técnica de PCR e eletroforese em gel de agarose. Na reação, foram
utilizados 2 pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers), sendo o primeiro específico para o
cromossomo Y e o segundo para gene autossômico (controle da reação capaz de amplificar
seqüência de DNA específica em qualquer amostra bovina). Após a micromanipulação para a
retirada, cada biópsia foi introduzida em microtubo plástico individualizado contendo 8 uL de
solução de lise celular e Proteinase K (Invitrogen© - Germany), que foi mantido à 55ºC por 5
minutos, seguido de 5 minutos à 95ºC. Após essa etapa, foram adicionados aos tubos contendo
as biópsias, 20 ul de solução composta por: primers, dNTPs, tampão de reação e a enzima Taq
DNA polimerase (Kit EMBRAPA). As amostras foram transferidas para termociclador e
submetidas a 40 ciclos de variação de temperatura para a amplificação do DNA. Após a
amplificação por PCR, 20ul de cada amostra foram aplicados em gel de agarose a 2 % e submetidos
a eletroforese (100v, 40 mA) por cerca de 35 minutos. As bandas foram visualizadas sobre
transiluminador de luz de ultravioleta. A comparação das taxas de gestação entre os grupos
indicaram não haver diferenças significativas na avaliação pelo teste do qui-quadrado, com G-
1=188/333 (56,4%) e G-2= 123/212 (58%). Do total de 95 gestações confirmadas do grupo G-1
e avaliadas por ultrassonografia aos 60 dias após as inovulações, 85 (91,6%) tiveram sexo
coincidente com aquele atestado pela PCR. O resultado deste trabalho indicou que o procedimento
de retirada de biópsia de embriões produzidos in vivo não interfere na viabilidade dos mesmos
aferida pelas taxas de gestação observadas e que a metodologia utilizada para identificação do
sexo dos embriões a campo é viável.
Fonte financiadora: Guilberth Serviços Veterinários S/C LTDA, Campinas-SP, e Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF, Brasil.
s506
AVALIAÇÃO ECONÔMICA DA BIPARTIÇÃO DE EMBRIÕES EM BOVINOS
Fernandes, C.A.C.1,4; Oba, E.2; Viana, J.H.M.3; Figueiredo, A.C.S.4; Oliveira, E.R.4;
Vasconcelos, T.D.4; Gioso, M.M.1
1
Unifenas, Rod. MG 179,Km 0, 37130-000 Alfenas MG . 2FMVZ-Unesp,18618-000 Botucatu,
SP; 3Embrapa Gado de Leite,36038-330 Juiz de Fora, MG; 4Biotran Ass. e Consult. em
Reprod. Animal Ltda. R. Tatuin, 93, Res. Teixeira, 37130-000 Alfenas MG
cacf@biotran.com.br
A relação custo benefício é a principal variável que condiciona a introdução e a aplicação de

qualquer nova tecnologia nos processos produtivos. O presente trabalho foi conduzido no sentido
de se avaliar a viabilidade técnica e econômica da bipartição em um programa comercial de
Transferência de Embriões (TE) em bovinos. Foram bipartidos embriões no estádio de mórula
compacta a blastocisto, com avaliação morfológica variando de excelente a bom (grau 1 ou 2).
Os embriões foram obtidos pelo métodos convencionais. Utilizou-se um estereomicroscópio
(Carton SCZ-T4) acoplado a dispositivo de micro-manipulação mecânico (Leitz) e lâmina metálica
de micro-cirurgia (Ultra-sharp splittting blades, AB Technology). Os embriões, bipartidos (T1:
n=25 e 50 inovulações) ou intactos (T2: n=50 e 50 inovulações), foram transferidos pela mesma
técnica, por um mesmo profissional. Foram comparados entre os grupos: custo médio de cada
gestação e o custo médio de cada produto nascido viável (teste de ‘t’). O custo de cada gestação
nos diferentes grupos foi calculado considerando o custo médio de manutenção das receptoras
em função do tempo de permanência em cada grupo, até o período de diagnóstico de gestação,
descontando o ganho de peso no período, além dos valores referentes à produção dos embriões
(R$ 172,76/embrião). O custo médio de cada produto foi calculado dividindo-se o valor de
manutenção das receptoras e o total de embriões gastos em cada grupo pelo total de produtos
nascidos em cada grupo. A taxa de gestação por embrião original viável foi de 70,37%a e 51,92a%
e o custo médio de cada gestação aos 60 dias foi de R$278,85a e R$358,91b para T1 e T2,
respectivamente. O valor médio de cada produto nascido viável foi de R$361,02a para o grupo
originado de embriões bipartidos e de R$442,74b para aqueles vindos de embriões intactos. O
trabalho mostra que técnica de bipartição de embriões em programas comerciais de transferência
de embriões em bovinos nas condições do estudo é viável tanto do ponto de vista operacional
quanto econômico. Palavras chave: Bipartição, bovino, embrião
s507
ESTUDO COMPARATIVO DA TAXA DE GESTAÇÃO E INCIDÊNCIA DE MORTE

EMBRIONÁRIA EM ÉGUAS RECEPTORAS DE EMBRIÃO CÍCLICAS E
ACÍCLICAS TRATADAS COM PROGESTERONA DE LONGA DURAÇÃO.
Pinna, A.E.1; Queiroz, F.J.R.2; Greco, G.M.2; Cavalcanti, A.S.1; Boité, M.C.1; Brandão, F.Z.1;
Pinho, T.G.1; Nogueira, L.A.G.1; Almeida, N.K.O.1
1
Faculdade de Veterinária da UFF, 24230-340, Niterói, RJ, Brasil, alineemerim@ig.com.br;
2
Clínica Equus de Itaboraí
A utilização de éguas em anestro como receptoras de embrião permite um início mais precoce e
um final mais tardio dos programas de TE em eqüinos, pois normalmente as receptoras entram
em anestro mais precocemente e reiniciam a atividade ovariana mais tardiamente que as éguas
doadoras (Testa, et al. Acta Scientiae Veterinariae, 33, supl.1, 198, 2005.). O presente trabalho
objetivou comparar as taxas de gestações e mortalidade embrionária em receptoras cíclicas e
acíclicas tratadas com progesterona de longa duração. Durante o período de julho de 2005 a
janeiro de 2006 foram transferidos 189 embriões para receptoras cíclicas (n=123) e para receptoras
acíclicas, sendo estas tratadas com P4 LA (progesterona de longa ação, n=66). Sendo estes animais
pertencentes a um programa de TE comercial. Tanto as doadoras como as receptoras eram mantidas
no mesmo local, recebendo desta forma o mesmo manejo nutricional. As receptoras foram
classificadas como estando em fase de inatividade ovariana, após avaliação dos ovários através
da ultra-sonografia. As receptoras acíclicas foram inicialmente tratadas uma vez ao dia, com
doses decrescentes (5, 3 e 2 mg) de cipionato de estradiol (ECP – Pharmacia e Upjohn Co.,
Kalamazoo, Michigan, USA, IM) durante três dias consecutivos. No dia posterior a última
aplicação do estrógeno, somente nas receptoras que apresentaram na avaliação ultra-sonográfica
um bom edema de útero foi dado início ao tratamento com 1.500 mg de P4 LA (P4 LA –
B.E.T.Laboratories, Lexington, USA, IM). Embriões de 6, 7 e 8 dias de desenvolvimento foram
transferidos entre 2° e 9° dias após a primeira aplicação da P4 LA. Uma nova dose de P4 LA foi
administrada nas receptoras sete dias após a primeira administração. Todas as receptoras acíclicas
tratadas, com gestação confirmada aos 12 dias de idade, repetia-se a cada sete dias o tratamento
com 1.500 mg de P4 LA, até que a gestação completasse 100 dias. Observou-se uma taxa de
concepção de 58,5% (72/123) para as receptoras cíclicas e de 60,6% (40/66) para as receptoras
tratadas com a P4 LA, não havendo diferença entre os tratamentos (Qui-Quadrado - P>0,05).
Quanto a mortalidade embrionária até 100 dias de gestação, também não observou-se diferenças
entre os tratamentos (Qui-Quadrado - P>0,05), onde fêmeas cíclicas apresentaram taxa de
mortalidade de 13,8% (10/72) e fêmeas acíclicas de 17,5% (7/40). Rocha Filho, et al. Animal
Reproduction, 1,1, 91-95, (2004) trabalhando com a mesma progesterona obtiveram resultado
semelhante ao presente trabalho quanto à taxa de gestação e mortalidade embrionária. Concluímos
que o uso de P4 LA em receptoras acíclicas permite resultados de fertilidade e de mortalidade
embrionária semelhantes a receptoras cíclicas.
s508
SUPEROVULAÇÃO DE CABRAS UTILIZANDO A PRIMEIRA ONDA FOLICULAR

DO CICLO ESTRAL
Fonseca, J.F.1; Bruschi, J.H.2; Zambrini, F.N.2; Viana, J.H.M.2;

Amorim, L.S.2; Camargo, L.S.O.2
1
Embrapa Caprinos, CP D10, Cep 62.011-000, Sobral-CE, Brasil, jeferson@cnpc.embrapa.br.
2
Embrapa Gado de Leite, Rodovia MG 133, Km 42, 36.155-000, Cel Pacheco-MG, Brasil.
A superestimulação da primeira onda folicular ovariana do ciclo estral foi testada em cabras em
anestro estacional. Dez cabras lactantes (2 Saanen e 8 Toggenburg) foram testadas dois tratamentos
(T1 e T2). Em ambos tratamentos, foram utilizadas 250 UI FSH em seis doses decrescentes (25,
25, 15, 15, 10 e 10%, respectivamente), intervaladas de 12 horas. Em T1 (n=5), as cabras receberam
37,5 μg d-cloprostenol (dia 0 manhã), CIDR por três dias (dias 2 a 5), FSH (dias 2 a 4), 37,5 μg
d-cloprostenol (dia 5 manhã) e 500 UI hCG (dia 7 tarde). Em T2, as cabras receberam duas doses
de 37,5 μg d-cloprostenol intervaladas de sete dias (dias 0 e 7 manhã), FSH (dia 9 tarde a dia 12
manhã), 37,5 μg d-cloprostenol (dia 12 manhã) e 500 UI hCG (dia 14 tarde). Em ambos
tratamentos, os animais não apresentaram folículos maiores que 4 mm diâmetro no início das
aplicações de FSH. As cabras foram cobertas por machos férteis e receberam 37,5 μg d-
cloprostenol 12 horas antes da colheita de embriões, que foi realizada pela via transcervical, seis
a sete dias após o início do estro. O percentual de animais em estro após as aplicações de FSH foi
de 100 e 80 % em T1 e T2, respectivamente. O intervalo para o estro após a segunda (T1) ou
terceira dose de cloprostenol (T 2) e a duração do estro foram de 28,8 ± 6,6 h e 36,0 ± 8,5 h (T1)
e 27,0 ± 6,0 h e 30,0 ± 12,0 h (T2). O número médio de estruturas recuperadas foi de 9,4 ± 3,8
(T1) e 10,5 ± 7,6 (T2). O número médio de embriões viáveis recuperados foi de 8,2 ± 3,5 (T1) e
4,0 ± 7,3 (T2). Ambos protocolos mostraram-se promissores para a superovulação de cabras em
anestro estacional. Adicionalmente, ressalta-se a possibilidade de obter embriões em protocolo
de curta duração (14 dias, T1) ou protocolo sem uso de progesterona ou progestágeno, mesmo na
estação de anestro estacional.
s509
INFLUÊNCIA DOS NÍVEIS PLASMÁTICOS DE PROGESTERONA SOBRE A

RESPOSTA OVARIANA E PRODUÇÃO EMBRIONÁRIA DE OVELHAS MORADA
NOVA (VARIEDADE BRANCA)
Lopes Júnior, E.S.1; Maia, E.L.M.M.1; Almeida, K.C.1; Paula, N.R.O.1; Teixeira, D.I.A.1;
Rondina, D.1; Selaive-Villaroel, A.B.2; Freitas, V.J.F.1
1
Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução - FAVET/UECE, 60740-000, Fortaleza-
CE, Brasil. 2 Centro de Ciências Agrárias - FZ/UFC, 60455-760, Fortaleza-CE, Brasil.
vjff@uece.br
A fim de avaliar o perfil de progesterona como um indicador da resposta superovulatória e da

produção embrionária em ovelhas Morada Nova (variedade branca), 25 ovelhas cíclicas foram
utilizadas como doadoras de embriões. O estro foi sincronizado, utilizando esponjas intravaginais
impregnadas com 60 mg de MAP, por 14 dias. Quarenta e oito horas antes da retirada da esponja,
foi iniciado o tratamento superovulatório utilizando 200 UI de pFSH (Pluset®, Barcelona,
Espanha), a intervalos de 12 horas (50/50, 25/25 e 25/25 UI). As ovelhas foram fecundadas por
monta natural no início do estro e 24 h após. Seis dias após a primeira monta, as ovelhas foram
submetidas a uma laparoscopia para avaliação ovariana, seguida pela colheita de embriões por
laparotomia. Neste momento, as ovelhas foram distribuídas em três grupos (A, B e C), de acordo
com o número de corpos lúteos (CLs) e correspondendo a respostas ovarianas mínima (0-4
CLs), moderada (5-9 CLs) ou alta (> 9 CLs) (adaptado de Amiridis G.S., Theriogenology, v. 57,
p. 1143). Os embriões recuperados foram avaliados sob estereomicroscópio (SMZ-1B, Tóquio,
Japão). Para determinação da concentração plasmática de progesterona, amostras sangüíneas
foram colhidas por venopunção jugular em tubos heparinizados, pouco antes da recuperação
embrionária. As amostras foram centrifugadas e o plasma obtido foi armazenado a – 20°C para
posterior análise por Imunoensaio Enzimático Quimioluminescente Competitivo Convencional
(Immulite 2000 Progesterone; Diagnostic Products Corporation, EUA). As concentrações
plasmáticas de progesterona foram comparadas entre grupos (A, B e C) por ANOVA one-way e
pelo teste de Duncan. Os dados expressos em percentagem foram comparados entre grupos pelo
teste do Qui-quadrado. Dentre as ovelhas submetidas ao tratamento superovulatório com, pelo
menos, uma ovulação, 25% (6/24) apresentaram regressão pré-matura de corpo lúteo e foram
excluídas das demais análises. Com relação ao número de animais em cada grupo, nenhuma
diferença significativa foi observada entre grupos, mas a taxa de ovulação e a concentração
plasmática de progesterona foram significativamente menores no grupo A (3,2 ± 0,4 e 4,4 ± 0,6
ng/mL, respectivamente). Embora diferença significativa tenha sido observada entre os grupos
B e C, considerando a taxa de ovulação (7,0 ± 0,7 vs. 12,0 ± 0,9; P < 0,05), o mesmo não foi
observado com relação à concentração plasmática de progesterona (11,2 ± 2,4 vs. 12,5 ± 1,9; P >
0,05). Considerando a produção embrionária, não foi observada diferença significativa entre
grupos, considerando as taxa de recuperação (A: 58,3%; B: 77,5%; C: 71,4%) e de fertilização
(A: 87,5%; B: 93,4%; C: 100,0%). Contudo, o grupo C apresentou um maior (P < 0,05) número
de embriões viáveis (6,9 ± 1,3 embriões) do que o grupo A (2,3 ± 0,5 embriões). Com relação à
qualidade embrionária, os embriões de grau I e II foram significativamente predominantes tanto
considerando todas as ovelhas (61,0%; P < 0,05) quanto entre grupos (grupo A: 100%; grupo B:
94,9%; grupo C: 100%; P < 0,05). Os dados permitem concluir que o perfil de progesterona é um
bom indicativo da resposta superovulatória e da produção embrionária em ovelhas Morada Nova
(variedade branca).
s510
AVALIAÇÃO DE DIFERENTES MÉTODOS DE COLHEITA DE EMBRIÕES

BOVINOS *
Pinto-Neto, A.1; Demczuk, E.2; Previato, P.F.G.3; Mota, M.F.4; Acco, A.5; Fonseca, J.F.6
1
Professora do Curso de Mestrado em Ciência Animal - UNIPAR. Umuarama-PR. E.mail:
adalgiza@unipar.br; 2Estro Forte Fertilidade Animal Ltda. Umuarama-PR.; 3Méd. Veterinária.
Especialista em Clínica e Cirurgia de Pequenos Animais – UNIPAR; 4Professor do Curso de
Medicina Veterinária-UNIPAR; 5Professora da UFPR – Curitiba-PR; 6Pesquisador CNPC-
EMBRAPA – Coronel Pacheco-MG*Suporte Financeiro: IPEAC-UNIPAR (Protocolo: 217/01
e 1214/02)
A colheita de embriões bovinos transcervical é feita pela maioria dos médicos veterinários,
utilizando-se um cateter de Foley introduzido, posicionado e fixado em um dos cornos uterinos,
permitindo sua lavagem e colheita dos embriões. Após essa etapa, o cateter é retirado e fixado no
corno contra lateral, para repetição do procedimento anterior. No entanto, o re-posicionamento
do cateter no outro corno pode ser dificultado ou comprometido, pela irritação da mucosa do
reto ou pelo estresse do próprio animal, diminuindo assim, o número total de embriões colhidos.
Diante desses relatos, objetivou-se com esse estudo, propor uma simplificação do método de
colheita de embriões bovinos, através da fixação do cateter no corpo do útero, e lavagem simultânea
dos cornos uterinos. Para tanto, realizaram-se 46 colheitas de embriões em vacas doadoras, das
raças Blonde (2,17% - 1/46), Simental (8,70% - 4/46), Red Angus (10,87% - 05/46), Limousin
(15,22% - 7/46), Pardo Suíça (17,39% - 8/46) e Marchigiana (45,65% - 21/46), através de lavagem
uterina, utilizando-se 500 mL de solução de PBS (Nutricell, Campinas, Brasil), seguindo dois
protocolos. No primeiro protocolo, o cateter de Foley foi fixado no corpo do útero para lavagens
simultâneas dos dois cornos uterinos. O lavado uterino foi filtrado, colocado em placa de Petri
descartável, identificadas por doadora e protocolo, e observadas ao microscópio estereoscópico,
a fim de se identificar e selecionar os embriões. No segundo protocolo, o mesmo cateter foi
fixado em um dos cornos uterinos, do animal submetido ao protocolo anterior. Após a lavagem
desse corno, o cateter foi removido e fixado no corno contra lateral para que o processo fosse
repetido. Foram realizadas de duas a três lavagens por protocolo. O conteúdo dos cornos uterinos
seguiu as mesmas etapas do protocolo anterior. A média de embriões obtidos por colheita, quando
o cateter foi fixado no corpo do útero, foi de 6,54 + 5,66 embriões. Ao repetir o processo de
lavagem uterina no mesmo animal, fixando o cateter nos cornos, a média de embriões obtidos
por colheita foi aumentada em 6,11 + 3,36 embriões, aos resultados da técnica anterior Esses
resultados indicam que o protocolo de fixação do cateter de Foley no corpo do útero, para colheita
de embriões bovinos, em vacas doadoras das raças citadas, não é eficiente, visto o número de
embriões colhidos após repetição das lavagens nos cornos uterinos
Palavras-chave: bovinos, embriões, coleta.
s511
RECUPERAÇÃO DE CATETERES PARA COLHEITA DE EMBRIÕES EM

EQUINOS COMO FERRAMENTA PARA REDUÇÃO DE CUSTOS
Gusmão, A.L.1; Feitosa, T.A.L.2; Silveira, L.L.3; Freitas, M.V.V.3;

Resende, J.1; Andrade Moura, J.C.1
1
Escola de Méd. Veterinária /UFBA, Salvador-BA, 40170110, Brasil.2 Acadêmico de Méd.
Veterinária –UFBA, 3 Veterinário Autônomo. gusmao@ufba.br
A transferência de embrião vem se tornando uma prática cada vez mais difundida, na indústria
eqüina, entretanto, em virtude do fato de que a maioria das éguas ovulam apenas um oócito
espontaneamente e as colheitas resultam em uma taxa de recuperação embrionária de apenas
50%, a popularização da técnica de TE tem se transformado em um verdadeiro desafio, uma vez
que estes fatores tendem a elevar significativamente o custo de operação desta atividade. Outro
fator que de certa forma contribui para a elevação dos custos é o material utilizado na execução
da colheita não cirúrgica de embriões em éguas, principalmente o cateter, que atinge preços no
mercado que variam de R$350,00 a R$450,00 reais. Levando-se em consideração que esse
equipamento é bastante frágil e que a simples perfuração do balão pode inutiliza-lo, objetivamos
com este experimento recuperar a um custo baixo, diferentes modelos de cateteres destinados a
colheita de embriões de éguas,com balão danificado, sem alterar a eficiência do mesmo. Foram
formados dois grupos ao acaso, sendo o grupo I (GI), o controle, composto por 10 éguas submetidas
a colheita não cirúrgica, utilizando-se um cateter com balão original e um grupoII(GII), composto
por 20 éguas, submetidas a colheita com cateter recuperado. Das dez éguas lavadas no GI, foi
recuperado um total de 6 embriões (60%) e das 20 éguas do GII, 11 (55%). O cateter recuperado
foi utilizado por três colheitas consecutivas, sendo submetidos a lavagem, secagem em estufa a
40oC, e posteriormente esterilizados em óxido de etileno. Foi possível injetar até 60 ml de ar no
balão recuperado, sem ocorrer explosão. De posse desses achados, e considerando-se o custo do
material destinado a recuperar o cateter(R$30,00), além da durabilidade pós-recuperação, podemos
afirmar que a reparação do balão de cateteres para colheita de embriões em éguas, pode contribuir
para reduzir significativamente o custo da aplicação da TE na espécie, sem comprometer a taxa
de recuperação embrionária.
s512
ESTAÇÃO DO ANO E FASE DA DOADORA NA PRODUÇÃO DE EMBRIÕES DE

DOADORAS HOLANDESAS
Jardina, D.T.G.1; Rodrigues, C.A.2; Guerreiro, V.J.1; Vasconcelos, J.L.M.1
1
Departamento de Produção Animal – FMVZ/UNESP, Botucatu-SP, Brasil 18618-000;
2
Clínica Veterinária, Samvet, São Carlos-SP, Brasil; vasconcelos@fca.unesp.br
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da fase da doadora (lactantes ou não-lactantes) e da
estação do ano na produção de embriões em vacas Holandesas (n=51). Foram avaliados os
resultados de 195 coletas de embriões (94 coletas em vacas lactantes e 101 coletas em vacas não-
lactantes), realizadas na Fazenda Santa Rita, Descalvado, SP, no ano de 2005. O protocolo de
superovulação consistiu na inserção de 2 implantes auriculares de 3mg de Norgestomet (Crestar®)
associada à aplicação de 3 mg benzoato de estradiol (BE, Index, Brasil) em dia aleatório do ciclo
estral (dia 0). No quarto dia iniciou-se a aplicação de 500 UI de FSH (Pluset®, Calier, Brasil)
diluídos em 200 ml de solução fisiológica, divididos em oito doses decrescentes, com 12 h de
intervalo entre elas. Junto com a sétima aplicação de FSH aplicou-se uma dose de PGF2α (Ciosin®
Coopers, 2ml). Junto com a oitava aplicação de FSH os implantes auriculares de Norgestomet
foram removidos. A ovulação foi sincronizada com uma aplicação de 0,25 mg de GnRH (Fertagyl®,
Intervet, Brasil) 12 hs após a remoção do implante, e a IA realizada 12 e 24 horas após. As
coletas foram realizadas 6,5 dias após a primeira inseminação. As variáveis número total de
estruturas obtidas, de embriões viáveis e de não viáveis foram analisados por General Linear
Model (GLM), sendo incluídas no modelo os efeitos de: doadoras, touros, estação do ano (1:
janeiro, fevereiro e março, n=56; 2: abril, maio e junho n=37; 3: julho, agosto e setembro n=50;
4: outubro, novembro e dezembro n=52), e interações. A variável touro e a interação estação do
ano com fase da doadora foram retiradas do modelo, pois não apresentaram efeito significativo.
Foi detectado efeito de doadora em todas as variáveis (P<0,01), mostrando a importância da
seleção das doadoras. Foi detectado efeito de estação do ano no número de estruturas coletadas
(1: 10,2 ± 1,2; 2: 6,6 ± 1,0; 3: 10,0 ± 1,1; 4: 11,2 ± 1,2; P=0,016), e no número de embriões
viáveis (1: 3,7 ± 0,5; 2: 2,4 ± 0,5; 3: 5,9 ± 0,9; 4: 4,4 ± 0,7; P=0,001). Fase da doadora influenciou
o número de estruturas coletadas (lactantes: 10,9 ± 0,9 e não-lactantes: 8,7 ± 0,7; P<0,001), e de
embriões não viáveis (lactantes: 6,7 ± 0,8 e não-lactantes: 4,4 ± 0,5; P<0,01), porém não foi
detectado efeito da fase da doadora no número de estruturas viáveis (lactantes: 4,14 ± 0,5 e não-
lactantes: 4,29 ± 0,5). Conclui-se que o número de embriões viáveis é influenciado por estação
do ano e doadora, não sendo influenciado por fase da doadora (lactante ou não-lactante).
s513
PROTOCOLO SUPERESTIMULATÓRIO P-36 NA RAÇA BONSMARA: USO DE

eCG E ATRASO NA INDUÇÃO DA OVULAÇÃO COM LH
Barcelos, A.C.Z.1a; Satrapa, R.A.2b; Nogueira, M.F.G.2b; Barros, C.M.1
1
Departamento de Farmacologia - Instituto de Biociências, 2Departamento de Reprodução
Animal – FMVZ, UNESP, Botucatu-SP, Brasil. cmbarros@ibb.unesp.br
No presente trabalho modificações do protocolo superovulatório denominado P36 (Embryo

Transfer Newsletter 23, 2:5-9, 2005) foram testadas, em vacas da raça Bonsmara (]! Africâner e
\! Hereford e Shorthorn), com o objetivo de verificar se o atraso de 12 h na indução da ovulação
(Grupo P36/LH60) ou a substituição do pFSH por eCG no último dia do tratamento
superestimulatório (Grupo P36/LH48/eCG), melhoraria a produção de embriões Bonsmara. Doze
vacas foram divididas ao acaso em três grupos: P36/LH48, P36/LH60 e P36/LH48/eCG, sendo
que cada fêmea recebeu os três protocolos (Cross-over). Em dia aleatório do ciclo estral (D0), os
animais receberam um dispositivo intravaginal contendo progesterona (CIDR-B®, 1,9 g
progesterona, InterAg, Hamilton, New Zealand) e benzoato de estradiol (BE, Estrogin® , 3,0 mg
IM; Farmavet, São Paulo, Brasil). Os animais foram superestimulados com pFSH(Folltropin-
V®, IM, Vetrepharm, Ontário, Canadá), 2 vezes ao dia em doses decrescentes de 45, 35, 25 e
15mg do Dia 5 ao 8, respectivamente; exceto o grupo P36/LH48/eCG em que as duas últimas
aplicações de FSH foram substituídas pela aplicação de gonadotrofina coriônica eqüina (eCG,
Novormon®,200 UI IM, Syntex, Buenos Aires, Argentina). Todas as vacas foram tratadas com d-
cloprostenol ( Veteglan®, 150µg IM, Calier, Barcelona, Espanha) no Dia 7, e o CIDR-B foi
retirado 36 h após a administração da PGF2á. No Dia 9, a ovulação foi induzida pela administração
de LH (Lutropin-V®, 12,5mg IM, Bioniche Animal Health, Belleville, Ontário, Canada) às 7:00
h (P36/LH48 e P36/LH48/eCG) ou às 19:00 h (P36/LH60). Todas as vacas foram inseminadas
12 e 24 h após a administração de LH. As colheitas dos embriões foram realizadas no Dia 16 ou
17. Os dados foram analisados por meio da ANOVA (Proc GLM do SAS). Os resultados para os
grupos P36/LH48, P36/LH60 e P36/LH48/eCG foram, respectivamente: números de estruturas
colhidas (7,17±1,85, 11,42±3,45 e 9,75±2,01; p>0,05), embriões viáveis (4,58±1,53, 8,42±2,44
e 6,58±1,32; p>0,05), e números totais de embriões classificados como excelente (30, 54, 34),
bom (11, 24, 24), regular (3, 8, 16) e pobre (11, 15 ,5) de acordo com suas características
morfológicas. Apesar de não haver diferença estatisticamente significativa entre os protocolos,
a média de embriões viáveis, obtidos nos animais tratados com o protocolo P36/LH60 quando
comparado P36/LH48, indica que um atraso de 12 h na aplicação de LH, pode ser benéfico para
doadoras da raça Bonsmara. Entretanto, novos experimentos devem ser realizados para confirmar
ou não estes achados. aBolsista do CAPES. bBolsista da FAPESP.
s514
SUPEROVULAÇÃO DE FÊMEAS EUROPEIAS DE CORTE COM DIFERENTES

DOSES DE FOLLTROPIN®
Fernandes, C.A.C.1,2; Figueiredo, A.C.S.1; Oliveira, E.R.2; Vasconcelos, T.D.2;

Alves, B.F.L.2; Gioso, M.M.1; Viana, J.H.M.3
1
Unifenas, Rod. MG 179,Km 0, 37130-000 Alfenas MG; 2Biotran Ass. e Consult. em Reprod.
Animal Ltda. R. Tatuin, 93, Res. Teixeira, 37130-000 Alfenas MG; 3Embrapa Gado de
Leite,36038-330 Juiz de Fora, M cacf@biotran.com.br
Nos últimos anos a pecuária de corte brasileira apresentou notável crescimento. A situação atual
da pecuária de corte no Brasil coloca nosso País em destaque neste setor no contexto mundial.
Além de possuir o maior rebanho comercial de bovinos do mundo, alcançamos recentemente a
posição de maior exportador mundial de carne. A variação dos resultados da superovulação é o
principal fator limitante à grande contribuição que a técnica de transferência de embriões (TE)
pode proporcionar ao melhoramento genético. Trata-se de um elemento chave que, passados
mais de 40 anos do nascimento do primeiro bovino oriundo da técnica de TE, poucas mudanças
significativas ocorreram nos protocolos de superovulação especificamente Nos últimos 6 anos,
pesquisas em dinâmica folicular têm contribuído muito para a adequação dos protocolos de T.E.,
nos quais, atualmente, todo o procedimento pode ser realizado a tempo fixo. No entanto, ainda
faltam informações relevantes a serem pesquisadas, tais como a determinação da sensibilidade a
hormônios superovulatórios nas diferentes raças bovinas economicamente importantes, pois sabe-
se que o excesso desse hormônio é um dos fatores responsáveis pelas variações de resposta em
embriões viáveis. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes doses do FSHp para
superovulação (Folltropin-V®) em vacas européias de corte em condições tropicais, no intuito de
encontrar a dose mais adequada para produção da melhor relação entre estruturas totais e
quantidade de embriões viáveis Foram utilizadas 12 vacas adultas (entre 48 e 98 meses), das
raças Simental e Angus. Etas vacas estavam secas, ciclando regularmente, escore corporal entre
3 e 4 (escala 1-5), Todos estes animais passaram por todos os grupos e foram superovulados
utilizando o seguinte protocolo. D0: Colocação de implante vaginal (DIB®); D1: Aplicação de 3
mg de Benzoato de estradiol (Ric-Be®); D5 a D8: FSH (Folltropin®,em 8 doses decrescentes);
D7 à tarde: 150μg de D-cloprostenol (Prolise®); D8 à tarde, remoção do implante (protocolo
P36); D9 à tarde: 25mg de LH (Lutropin®), D10: 2 IA 12/12h As doses totais de Folltropin®
utilizadas em cada animal foram 130, 160 e 200mg, sempre diluídos em 20mL de solução salina
0,9% Para cada doadora utilizou-se o mesmo sêmen, nas três coletas. Todas as coletas foram
feitas por um mesmo técnico. Não foram observadas diferenças entre as raças. O total estruturas
foi de 6,92±3,92, 10,08±4,06 e 9,67±3,51 e o número médio de embriões viáveis foi de 5,42±2,28,
6,92±2,11 e 5,08±2,87, para as doses de 130, 160 e 200mg, respectivamente. Não foram observadas
diferenças entre as doses de Folltropin® (200mg) quanto ao número de embriões ou de estruturas
viáveis (P>0,05 – Teste de Tuckey). No presente estudo a dose de 130mg por ser de menor custo,
deve ser utilizada como dose inicial para vacas desta mesma categoria
Palavras chave: Bovino, Folltropin, Superovulação
Patrocínio : TECNOPEC®
s515
RESPOSTA OVARIANA E PRODUÇÃO DE EMBRIÕES DE VACAS

SUPEROVULADAS COM PLUSET OU FOLLTROPIN EM DOSE ÚNICA
SUBCUTÂNEA*
Alvarez, R.H.; Pires, R.M.L.; Martinez, A.C.
Centro de P&D Genética e Reprodução Animal, Instituto de Zootecnia-APTA, Nova Odessa-

SP, 13460-000, Brasil. herrera@iz.sp.gov.br
As preparações hormonais Folltropin V® e Pluset® são amplamente utilizadas para induzir

superovulação em bovinos. Tem sido relatado que o uso desses produtos provoca respostas
diferentes na produção de embriões de boa qualidade quando aplicados em dose única, por via sc
(Kelly et al. Anim. Reprod. Sci. v. 46, p.1-14, 1997), porém, observações preliminares realizadas
por nosso grupo não evidenciaram essa diferença. Considerando que o tratamento de
superovulação com dose única sc apresenta vantagens operacionais extremamente interessantes,
o presente estudo objetivou avaliar a resposta ovariana e produção de embriões de vacas
superovuladas com dose única de Pluset® e Folltropin V® administrada por via sc. Foram utilizadas
72 vacas Caracu distribuídas em dois grupos de 36 animais cada, de acordo com a condição
corporal, presença do bezerro e data do parto. Os dois grupos foram tratados com um dispositivo
intravaginal contendo progesterona (CIDR-B), juntamente com uma injeção intramuscular (im)
de 2,5 mg de benzoato de estradiol. Quatro dias após, os animais receberam, por via subcutânea
(sc), dose única de 400 UI de Pluset® (Grupo 1) ou 300 mg de Folltropin V® (Grupo 2) aplicada
na região da paleta e no dia 7 (manhã), todos os animais receberam uma dose luteolítica (150
mcg) de D(+) cloprostenol. Os animais foram inseminados sistematicamente quarenta e oito e
62 horas após a injeção do cloprostenol. A coleta de embriões foi realizada por via cervical sete
dias após a inseminação e os embriões recuperados foram classificados como viáveis, degenerados
e não fecundados. As diferenças entre os grupos no número de corpos lúteos (CL), número total
de embriões e número de embriões viáveis foram analisadas por ANOVA. As diferenças entre
grupos no número de animais com fraca resposta (<3 CL) foram analisadas pelo teste de Qui
quadrado. Dos 72 animais utilizados, 16 (22,2%) não responderam (< 3 CL) à superovulação,
sendo 7 (19,4%) do grupo 1 e 9 (25,0%) do Grupo 2 (P>0,05). Não houve diferença significativa
no número de ovulações (CL) entre os dois grupos. Com exceção de três animais do Grupo 1,
todos os animais que apresentaram boa resposta manifestaram cio no momento da inseminação.
Em média foram recuperados 5,6 ± 0,9 (Grupo 1) e 9,0 ± 0,8 (Grupo 2) embriões (P>0,05). Não
houve diferença significativa no número de estruturas, embriões viáveis, embriões degenerados
ou oócitos não fecundados entre os dois grupos estudados. Conclui-se que o uso de Pluset® ou
Folltropin V® em dose única sc não afeta de forma diferenciada a resposta ovariana nem a
qualidade de embriões de vacas em boa condição corporal.
*Apoio: FAPESP
s516
AUMENTO DE RECUPERAÇÃO EMBRIONÁRIA USANDO LAVAGEM UTERINA

DUPLA EM BOVINOS, CORROBORANDO DADOS DE UM ESTUDO ANTERIOR
Mollo, M.R.1,2; Ramos, A.F.1,3; Pivato, I.1,4; Guimarães Neto, A.G.1; Franco, M.M.1;
Rumpf, R.1; Sartori, R.1
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 70770-900, Brasília-DF, Brasil, 2FAV-UnB,
70910-970, Brasília-DF, Brasil, 3UFMG, 30123-970, Belo Horizonte-MG, Brasil, 4CIDASC,
89130-000, Indaial-SC, Brasil, marcosmollo@hotmail.com, sartori@cenargen.embrapa.br
Em bovinos superovulados, a taxa de recuperação de embriões raramente excede 75% (Sartori,

Acta Scientiae Veterinariae 2004;32:35-50). As razões para falha na recuperação são
provavelmente devido aos ovócitos/embriões não atingirem o útero e/ou técnicas de coleta
inapropriadas (Sartori et al., Theriogenology 2003;60:1319-1330). Castro Neto et al.
(Theriogenology 2005;15:1249-1255), demonstraram que a lavagem uterina dupla aumentou o
número de embriões totais e viáveis coletados por vaca, quando comparado à coleta simples
convencional de corpo de útero. O objetivo deste relato é corroborar os resultados descritos no
estudo de Castro Neto et al. (2005). Trinta fêmeas (vacas e novilhas Nelore e novilhas mestiças
Nelore x Simental) foram superovuladas usando o seguinte protocolo: D0: colocação de um
implante intravaginal de progesterona (DIB, Syntex S.A., Argentina) e injeção de 2,0 mg im de
benzoato de estradiol (Ric-Be, Syntex S.A., Argentina); D4 a D7: superestimulação com oito
injeções im de FSH (Pluset, 200-300 UI, Calier, Barcelona, Espanha, ou Folltropin-V, 133 mg,
Bioniche, Ontário, Canadá); D6: 0,150 mg im de cloprostenol (Prolise, ARSA S.L.R., Argentina);
D6,5: remoção do implante; D8,5 e D9: IA; D15: coleta de embrião. A lavagem uterina foi
realizada posicionando-se o balão do catéter de Foley no corpo uterino justaposto ao último anel
cervical, usando-se em média 1000 ml de DPBS por animal. Ao final deste lavado, o útero foi
preenchido com DPBS, o catéter mantido no local e sua abertura lacrada com uma presilha de
filtro de coleta. As vacas ou novilhas eram então soltas para retornar ao tronco 20 a 30 minutos
após para a realização de um segundo lavado com um volume extra de 500 ml de DPBS. Pelo
menos um ovócito/embrião foi coletado no segundo lavado em 80% (24/30) dos animais. De
todos os ovócitos/embriões coletados, 27,5% (94/342) foram recuperados no segundo lavado.
Em média, foram recuperados 11,4 ovócitos/embriões por vaca, sendo 8,3 ovócitos/embriões
recuperados no primeiro lavado e 3,1 recuperados no segundo lavado. Em conclusão, este estudo
demonstrou um aumento na taxa de recuperação de embriões por vaca ou novilha de 57,0% para
77,6%, e confirmou a importância do método de lavagem uterina dupla previamente descrito por
Castro Neto et al. (2005). Além disso, considerando que em 80% dos animais foram coletados
embriões no segundo lavado, acreditamos que este método deva ser empregado rotineiramente,
especialmente porque não aumenta muito o trabalho nem os custos.
s517
FATORES QUE AFETAM A TAXA DE PRENHEZ EM PROGRAMAS DE

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM TEMPO FIXO
Peres, L.C.1,2; Pincinato, D.1,2; Tríbulo, R.2; Cutaia, L.2; Bó, G.A.1,2
1
Universidad Nacional de Córdoba, Argentina, 2Instituto de Reproducción Animal Córdoba
(IRAC), Jerónimo Luis de Cabrera 106, X5000GVD, Córdoba, Argentina.
gabrielbo@iracbiogen.com.ar
O objetivo desse estudo foi avaliar alguns fatores que afetam as taxas de prenhezes em programas
de transferência de embriões em tempo fixo (TETF). As receptoras foram vacas de um mesmo
estabelecimento, secas, cíclicas, cruza zebu e com uma condição corporal (CC) entre 2,5 a 4,0
(escala 1-5). Todas as receptoras foram sincronizadas com 2 mg de benzoato de estradiol IM
(EB, Syntex SA, Argentina) e um DIB (Syntex SA) novo no Dia 0, 150 μg de D(+) cloprostenol
IM (Ciclase, Syntex) e 400 UI de Novormon IM no Dia 5; se retirou o DIB no Dia 8 e se injetou
1 mg de EB no Dia 9. Aquelas receptoras com um corpo lúteo (CL) com uma área >76mm2
(determinada por ultra-sonografia) no Dia 16, receberam no Dia 17 um embrião congelado e
descongelado por transferência direta. Todos os embriões (n=506, Bonsmara) foram grau 1 e
congelados em 1.5 M de etilenoglicol pelo mesmo Centro de Produção (EmbryoPlus, Brits -
África do Sul) e foram descongelados em banho-maria a 30ºC por 30 segundos. As taxas de
prenhezes foram determinadas por ultra-sonografia aos 35 dias da TETF As variáveis analisadas
(regressão logística) foram: estado do embrião, CC da receptora, história reprodutiva da receptora
(vazia a uma TETF prévia ou utilizada pela primeira vez sem história reprodutiva), área do CL
(A: d” 201,06 mm2, B: > 201,06 y <254,5 mm2 y C: e”254,5 mm2), detecção do cio ou não prévia
a TETF (Dias 8 a 11 do tratamento), técnico que realizou a TE, lugar de deposição do embrião
(proximal ao ovário, na curvatura ou na bifurcação) e classificação subjetiva do técnico sobre a
transferência (boa, regular ou má). As variáveis CC, detecção do cio ou não, lugar de deposição
do embrião, classificação da transferência e área do CL não afetaram as taxas de prenhezes
Entretanto, as variáveis foram significativas (P<0,05), como: técnico (A: 133/219, 60,7% vs. B:
148/287, 51,6%); história reprodutiva (vazia na TETF prévia: 24/66, 36,3% vs. sem história:
254/440, 57,7%) e estado do embrião (mórula: 93/142, 65,5% vs. blastocisto inicial 115/207,
55,5% vs. blastocisto: 71/157, 45,2%). Os dados sugerem que a habilidade do técnico, estado do
embrião e a história reprodutiva da receptora são variáveis significativas que devem ter em conta
em programas de TETF.
s518
AVALIAÇÃO DOS TRATAMENTOS COM TRYPSINA E ANTIBIÓTICO NA

INATIVAÇÃO DA LEPTOSPIRA SPP EM BLASTOCISTOS BOVINOS
DESCONGELADOS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE
D’Angelo, M.1; Galuppo, A.G.1; Picolomini, M.1; Athayde, C.S.1; Santos, M.1; Pavão, D.L.1;
Genovez, M.E.1; Castro, V.1; Garcia, J.M.2
1
Centro de Pesquisa e Desenvolvimento em Sanidade Animal, Instituto Biológico, Av
Conselheiro Rodrigues Alves, 1252, São Paulo, SP, Brasil; 2Departamento de Medicina
Veterinária Preventiva e Reprodução Animal da FCAV/UNESP-Jaboticabal
andreagalupo@yahoo.com.br
A infecção crônica por Leptospira spp pode levar à problemas reprodutivos como aborto e
infertilidade. Existe pouca informação sobre a possibilidade de infecção de oócitos e embriões
de animais cronicamente infectados. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência dos
tratamentos com trypsina e antibióticos na inativação de Leptospira spp em blastocistos
descongelados infectados in vitro. Os blastocistos foram descongelados com o kit de soluções de
descongelamento (Cultilab) e mantidos em solução Holding (Cultilab). Eles foram expostos a
10μl da suspensão de bactérias (106 bacterias/mL) por 24h. A suspenção de bactérias foi preparada
com 1mL das amostras cultivada em meio Fletcher (Difco) contendo 10% de soro inativado de
coelho enriquecido com 3% L-asparagina, 1% CaCl2-MgCl2, 1% piruvato de sódio, extrato de
carne e peptona. As amostras também foram cultivadas em meio adicionado de 5-Fluorouracil e
Ácido Nalidixico, usado como meio seletivo. As culturas foram incubadas em aerobiose a 30ºC
por 60 dias. Os blastocistos infectados com 10μl da suspensão de Leptospira spp e os do grupo
controle foram divididos em dois grupos: um submetido ao tratamento com antibiótico e o outro
tratado com trypsina de acordo com protocolo padronizado pela International Embryo Trasnfer
Society (IETS). Os blastocistos infectados após as lavagens foram analisados por cultura de
bactérias e reação em cadeia pela polimerase (PCR). A última gota de lavagem de cada grupo
também foi testada. A cultura de bactéria foi realizada como já descrito acima. A extração do
DNA foi realizada segundo Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual . New
York: Cold Spring Harbor Press, 1989) e para a Reação de polimerase em Cadeia (PCR) empregou-
se o protocolo de Merien et al.( J. Clin. Microbiol., 30: 2219-2224, 1992). Os resultados mostraram
que tanto a cultura de bactérias quanto o PCR apresentaram resultados negativos para o isolamento
da Leptospira spp em todos os grupos experimentais. O mesmo resultado foi encontrado para a
amostra das últimas gotas de lavagem. Nossos resultados mostraram que tanto o tratamento com
trypsina, quanto com antibióticos foram eficientes em inativar/eliminar a Leptospira spp dos
blastocistos. Esses resultados são importantes para auxiliar no desenvolvimento de métodos
mais eficientes de controle de disseminação de patógenos via biotécnicas de reprodução animal
Financial support: CULTILAB
s519
IDENTIFICAÇÃO DO SEXO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VIVO

UTILIZANDO A TÉCNICA DE PCR A CAMPO
Sousa, R.V.1,2; Cardoso, C.R.S.3; Butzke, G.3; Franco, M.M.1; Rumpf, R.1
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 70770-900, Brasília-DF, Brasil; 2FAV – UnB,
Brasília-DF, Brasil; 3Guilberth Serviços Veterinários S/C LTDA – CEP:13026-121, Campinas-
SP, Brasil, regiv@cenargen.embrapa.br
Com o aprimoramento das técnicas reprodutivas, a produção de embriões in vivo e in vitro, tem
crescido consideravelmente, aumentando a demanda por metodologia eficaz de identificação do
sexo dos embriões, visando diminuir o uso de embriões sem interesse comercial, adequando o
sistema de produção animal. Este trabalho teve por objetivo testar metodologia otimizada na
EMBRAPA para a identificação do sexo de embriões bovinos utilizando a técnica de PCR (Reação
em Cadeia da Polimerase) em condições de campo. Os embriões (n=545) foram coletados de
animais da raça holandesa, nos estádios de mórula compacta (MC), blastocisto inicial (BI),
blastocisto (BL) e blastocisto expandido (BX), no sétimo dia (D-7) após a inseminação e divididos
em dois grupos. Os embriões do grupo G-1 (n=333) foram submetidos à micromanipulação por
secção para retirada da biópsia, preferencialmente de células do trofoblasto Os embriões biopsiados
foram mantidos em solução de manutenção até o final do processo de identificação do sexo e
então transferidos para receptoras síncronas. Os embriões do grupo G-2 (n=212) foram transferidos
íntegros (controle) para receptoras síncronas. Todas as receptoras foram submetidas à
ultrasonografia aos 35 e 60 dias após as inovulações, para diagnóstico de gestação e confirmação
do sexo, respectivamente. Para a identificação do sexo dos embriões biopsiados, suas respectivas
biópsias foram submetidas à técnica de PCR e eletroforese em gel de agarose. Na reação, foram
utilizados 2 pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers), sendo o primeiro específico para o
cromossomo Y e o segundo para gene autossômico (controle da reação capaz de amplificar
seqüência de DNA específica em qualquer amostra bovina). Após a micromanipulação para a
retirada, cada biópsia foi introduzida em microtubo plástico individualizado contendo 8 µL de
solução de lise celular e Proteinase K (Invitrogen© - Germany), que foi mantido à 55ºC por 5
minutos, seguido de 5 minutos à 95ºC. Após essa etapa, foram adicionados aos tubos contendo
as biópsias, 20 µl de solução composta por: primers, dNTPs, tampão de reação e a enzima Taq
DNA polimerase (Kit EMBRAPA). As amostras foram transferidas para termociclador e
submetidas a 40 ciclos de variação de temperatura para a amplificação do DNA. Após a
amplificação por PCR, 20 µl de cada amostra foram aplicados em gel de agarose a 2 % e
submetidos a eletroforese (100v, 40 mA) por cerca de 35 minutos. As bandas foram visualizadas
sobre transiluminador de luz de ultravioleta. A comparação das taxas de gestação entre os grupos
indicaram não haver diferenças significativas na avaliação pelo teste do qui-quadrado, com G-
1=188/333 (56,4%) e G-2= 123/212 (58%). Do total de 95 gestações confirmadas do grupo G-1
e avaliadas por ultrassonografia aos 60 dias após as inovulações, 85 (91,6%) tiveram sexo
coincidente com aquele atestado pela PCR. O resultado deste trabalho indicou que o procedimento
de retirada de biópsia de embriões produzidos in vivo não interfere na viabilidade dos mesmos
aferida pelas taxas de gestação observadas e que a metodologia utilizada para identificação do
sexo dos embriões a campo é viável.
Fonte financiadora: Guilberth Serviços Veterinários S/C LTDA, Campinas-SP, e Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF, Brasil
s520
INFLUÊNCIA DO MOMENTO DO INÍCIO DO TRATAMENTO

SUPERESTIMULATÓRIO (SOV) NA PRODUÇÃO IN VIVO DE EMBRIÕES EM
VACAS NELORE (Bos indicus)
Moino, L.L.¹; Porto, L.P.C.¹; Moraes, F.L.Z.¹; Carvalho, L.M.; Neto, J.D.S.²;
Spegiorin, M.R.; Silva, K.C.; David, F.L.²
¹Matriz - Reprodução Animal- Bauru-SP, Brasil, ² JDSN Veterinária- Avaré- SP, Brasil
llmmedvet@hotmail.com
Diferentes associações de drogas têm sido utilizadas para o controle do desenvolvimento folicular
e da ovulação. Este trabalho tem como objetivo analisar o efeito do momento do início do
tratamento superovulatório (D4 ou D5) na produção de embriões in vivo em vacas Nelore
submetidas ao protocolo P-24. O estudo foi conduzido em uma única propriedade localizada no
município de Andradina, São Paulo, Brasil, durante um período de oito meses (10/2004 a 5/
2005). Duzentas vacas Nelore mantidas a pasto, suplementadas com mineral e escore corporal
variando entre 2,5 e 4,5 (escala 1-5) foram submetidas a 204 sessões de coletas de embriões. O
protocolo (P-24) consiste na colocação de um dispositivo intravaginal contendo P4 (CIDR®; 1,9
g) associada à administração IM de benzoato de estradiol (Estrogin®; 2,5 mg). O início do
tratamento superestimulatório (SOV) variou entre quatro (D4) e cinco (D5) dias após a colocação
do CIDR, com pFSH (Folltropin-V®, dose total = 133 mg IM), administrado em doses decrescentes
(26,6; 19,95; 13,3 e 6,65 mg) duas vezes ao dia (manhã e tarde) durante quatro dias. Nos D6 e
D7, respectivamente, (8:00 h) administra-se PGF2á (Ciosin®; 0,15 mg d-cloprostenol IM) e a
retirada do implante é feita 24 horas mais tarde (D7 e D8). A indução da ovulação é realizada
mediante a aplicação de LH (Lutropin®; 25,0 mg IM) nos D8 e D9. Os animais são inseminados
em tempo pré-fixado, isto é, sem a observação do cio, 12 e 24 horas após a aplicação do LH. As
coletas dos embriões são realizadas 7 dias após a primeira IA. Em cento e três coletas de embriões
(grupo 1- G1) a SOV foi iniciada no D4 do protocolo, foram recuperadas 1477 estruturas totais,
sendo das quais 69,26% (1023/1477) viáveis, 11,50% (170/1477) degeneradas e 19,22% (284/
1477) não fecundadas. Em outras cento e uma coletas (grupo 2- G2) a SOV foi iniciada no D5 do
protocolo produzindo 1310 estruturas totais, sendo 71,22% (933/1310) viáveis, 10,99% (144/
1310) degeneradas e 17,78% (233/1310) não fecundadas. A comparação entre os dois tratamentos
(G1 e G2) foi realizada através do método do ÷². Não houve diferença significativa entre os
tratamentos, ou seja, a antecipação de um dia no início das aplicações de FSH no protocolo de
SOV não alterou as taxas de estruturas viáveis, degeneradas e não fecundadas. Os resultados
sugerem que o momento do início do tratamento superestimulatório não tem efeito sobre a
produção de embriões in vivo em vacas Nelore (Bos indicus) submetidas ao protocolo P-24.
s521
EFEITO DA SINCRONIZAÇÃO DA OVULAÇÃO NA PRODUÇÃO IN VIVO DE

EMBRIÕES EM VACAS NELORE (Bos indicus) SUPERESTIMULADAS
Moino, L.L.1; Porto, L.P.C.1; Moraes, F.L.Z.1; Carvalho, L.M.;

Neto, J.D.S.2; Spegiorin, M.R.; David, F.L.2
1
Matriz - Reprodução Animal- Bauru-SP, Brasil, ² JDSN Veterinária- Avaré- SP, Brasil.
llmmedvet@hotmail.com
A sincronização do crescimento folicular e do momento da ovulação através do emprego de

hormônios têm facilitado o manejo de doadoras de embriões. Este trabalho tem como objetivo
analisar o efeito da sincronização da ovulação na produção de embriões in vivo em vacas Nelore.
Duzentos e sessenta e nove animais foram submetidos a 423 sessões de coletas de embriões.
Destas, trezentas e vinte e duas (grupo 1- G1) foram realizadas após sincronização da emergência
da onda de crescimento folicular, através da colocação de dispositivos intravaginais de P4 (CIDR®;
1,9 g) associada à administração IM de benzoato de estradiol (Estrogin®; 2,5 mg). Cinco dias
mais tarde (D5) iniciou-se o tratamento superovulatório (SOV) com pFSH (Folltropin-V®, dose
total = 100 mg IM). No D7 (8:00 h) administrou-se PGF2á (Ciosin®; 0,15 mg d-cloprostenol
IM) e a retirada do implante foi feita 24 horas mais tarde (D8). As doadoras foram inseminadas
artificialmente (IA) 12 e 24 horas após a detecção de cio. Outras cento e uma (grupo 2- G2)
coletas de embriões foram realizadas em animais submetidos ao protocolo P-24, uma variação
do protocolo P-36 (Zanenga et al., 2003). Este protocolo consiste na colocação de um dispositivo
intravaginal contendo P4 (CIDR®; 1,9 g) associada à administração IM de benzoato de estradiol
(Estrogin®; 2,5 mg). Cinco dias mais tarde (D5) inicia-se a SOV com pFSH (Folltropin-V®, dose
total = 133 mg IM). No D7 (8:00 h) administra-se PGF2á (Ciosin®; 0,15 mg d-cloprostenol IM)
e a retirada do implante é feita 24 horas mais tarde (D8). Neste grupo a indução da ovulação foi
realizada através da aplicação de LH (Lutropin®; 25,0 mg IM) no D9 as 8:00 h. Os animais foram
inseminados em tempo pré-fixado, sem a observação de cio, 12 e 24 h após a aplicação de LH.
As coletas de embriões foram realizadas 7 dias após a primeira IA. Foram analisadas as taxas de
produção de estruturas viáveis (EV), estruturas degeneradas (ED) e estruturas não fecundadas
(NF) para cada grupo. As taxas obtidas nos grupos 1 e 2 foram, respectivamente, EV (65,02%-
1878/2888 vs. 71,22%- 933/1310), ED (13,60%- 393/2888 vs. 10,99%- 144/1310) e NF (21,36%-
617/2888 vs. 17,78- 233/1310). A comparação entre os dois tratamentos foi realizada através do
método do ÷², havendo diferença significativa ao nível de 1% entre os tratamentos, ou seja, a
administração de LH (G2), como indutor da ovulação em animais superestimulados, diminuiu
significativamente (p<0,01) a taxa de embriões degenerados e não fecundados, e, aumentou,
também significativamente (p<0,01), a taxa de embriões viáveis. Os resultados sugerem que a
sincronização da ovulação, através da aplicação de LH no protocolo de superovulação aumentou
a eficiência na produção in vivo de embriões em vacas Nelore (Bos indicus).
s522
ESTUDO DE FATORES QUE INFLUENCIAM OS RESULTADOS EM PROGRAMA

DE TRANSFERENCIA DE EMBRIOES EM CAPRINOS - DOADORAS
Portela, A.P.M.1; Ribeiro Filho, A. de L.1; Chalhoub, M.1; Alves, S.G.G.1;

Silva, A.A.B.1; Santana, R.C.M.1; Gusmão, A.L.1
1
Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, Brasil - paulamev@gmail.com
A seleção e reprodução dos caprinos foi resultado do uso de métodos convencionais de cobertura
e inseminação artificial durante muitos anos, no entanto, a exploração de caprinos vem tomando
proporções cada vez mais importantes, pois a demanda do mercado interno e externo é crescente.
Em sintonia com as novas tendências, tem-se dado ênfase especial às biotecnologias da reprodução,
com a finalidade de proporcionar um incremento na produtividade e um rápido crescimento na
qualidade genética do rebanho. Nas doadoras, além do tratamento de sincronização do estro, a
colheita de embriões é usualmente precedida pela superovulação. Diferentes gonadotrofinas são
utilizadas para a superovulação em caprinos, contudo a resposta superovulatória está sujeita a
grande variação. A imprevisibilidade da resposta ovariana a superovulação, a incerteza do número
de embriões produzidos, qualidade destes, sincronia das receptoras, qualidade e quantidade de
corpos lúteos são, entre outros, aspectos limitantes da contribuição que a transferência de embriões
pode trazer ao melhoramento genético caprino. Resultados de 43 ovulações múltiplas foram
submetidos à análise para estudo da relação entre algumas variáveis envolvidas no processo.
Foram utilizadas doadoras da raça Bôer e o estímulo à superovulação foi realizado mediante
tratamentos diários durante período de 3 dias (D11 a D13) com fontes de hormônio folículo
estimulante Folltropin (Bioniche Animal Health - Canadá) ou Pluset (Calier - IF Serono - Itália).
No grupo que foi utilizado o Folltropin, trabalhou-se com a dosagem de 250 UI, fracionadas em
seis doses decrescentes, administradas a cada 12 horas, por via IM. As doadoras também receberam
duas doses de 1mg de PGF2á (Ciosin - Schering-Plough Coopers - Brasil) cada, por via SBIV,
após 60 e 72h do início da superovulação. No vigésimo primeiro dia após o início do protocolo,
procedeu-se a colheita dos embriões. No grupo que foi utilizado o Pluset, foi realizado o mesmo
protocolo, diferindo a dosagem hormonal utilizada, que foi de 300 UI por doadora. Os embriões
foram colhidos 21 dias após o início do protocolo, através do método transcervical, utilizando o
sistema. Os embriões foram avaliados ao estereomicroscópio com aumento de 40x com auxílio
de micropipeta e classificados quanto ao estágio de desenvolvimento em que se encontravam e à
sua qualidade. Os tratamentos foram comparados através de um delineamento inteiramente
casualizado, onde os grupos experimentais (Folltropin e Pluset) foram considerados tratamentos
e as superovulações as repetições. Para as análises estatísticas das variáveis avaliadas, foi
empregado o pacote estatístico Statistical Analisys System (SAS) – versão 6 (1996). As análises
indicaram que o hormônio superovulatório não influenciou o número de estruturas, de embriões
viáveis, de embriões degenerados, de estruturas não fertilizadas, e a qualidade dos embriões
recuperados. Não houve influência do lado da ovulação em relação à quantidade de corpos lúteos,
do número de coberturas sobre a quantidade de embriões recuperados e da duração da colheita
em relação ao meio residual ou número de estruturas recuperadas, assim como do meio residual
e o número de estruturas recuperadas.
s523
FATORES QUE INFLUENCIAM OS RESULTADOS EM PROGRAMA DE

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM CAPRINOS – RECEPTORAS
Ribeiro Filho, A. de L.1; Portela, A.P.M.1; Chalhoub, M.1; Silva, A.A.B.1;

Santana, R.C.M.1; Freitas, D.S.1; Gusmão, A.L.1
1
Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, Brasil – alisboa@ufba.br
A transferência de embriões (TE) é um método de reprodução melhorada que associa diversas

biotecnologias e possibilita a multiplicação acelerada de indivíduos geneticamente superiores.
Sendo solução para diferentes objetivos de ordem genética, comercial, sanitária e de conservação
de espécies e embora, consideráveis progressos tenham sido alcançados, alguns aspectos ainda
necessitam ser estudados. Para a utilização da técnica de transferência de embriões em caprinos,
é de fundamental importância o perfeito sincronismo do estro entre doadora e receptora. O controle
e a sincronização do ciclo estral possibilitaram um aprimoramento no uso dessa biotecnologia
(Oliveira e Gonzales, Simpósio Nordestino sobre caprinos e ovinos deslanados, v.1, p.21-31).
Desta forma, este estudo objetivou verificar a influência de diferentes aspectos relacionados à
receptora sobre os resultados da transferência de embriões em caprinos, contribuindo na
disseminação desta biotécnica para o incremento da caprinocultura. O experimento envolveu 43
superovulações em cabras Boer e inovulações em animais mestiços. Duzentas e quinze
sincronizações foram realizadas mediante o uso de esponjas vaginais impregnadas com 60mg de
acetato de medroxiprogesterona (Progespon – Syntex – Argentina). As inovulações foram
realizadas sete dias após o início do estro através da laparoscopia. A avaliação dos embriões foi
realizada seguindo as normas da IETS. Para determinar a continuidade da gestação foi realizada
uma ultrasonografia transabdominal de 52 a 60 dias após a TE. Para as análises estatísticas das
características avaliadas, foi empregado o pacote estatístico Statistical Analysis System (SAS) -
versão 5 (1996). Dentre as variáveis estudadas, não houve influencia do lado da ovulação em
relação à quantidade de corpos lúteos, da quantidade ou qualidade dos corpos lúteos sobre a taxa
de prenhez e da quantidade de embriões inovulados sobre a taxa de prenhez. No entanto, houve
influência do lado da ovulação em relação à qualidade do corpo lúteo; do estágio do embrião a
inovulação sobre a taxa de prenhez (P>0,05), apresentando melhores resultados os embriões em
estágio de blastocisto inicial ou superior; e do lado da inovulação sobre a taxa de prenhez, o
corno direito apresentou melhores resultados, com 80,96% de prenhez, diferindo estatisticamente
do corno esquerdo, com 48,39%. Os resultados obtidos permitem concluir que a classificação
embrionária tem papel fundamental no resultado de prenhez, sendo o estágio do embrião
importante fator para o sucesso da técnica, sendo assim, é de grande importância que o técnico
veterinário tenha domínio dos aspectos da fisiologia da reprodução, classificação embrionária e
seleção de receptoras. Valendo-se desse conhecimento, este profissional determina o emprego
de um programa de transferência de embriões mais adequado, eficiente e viável para uma
propriedade.
s524
EFEITO DO NÚMERO DE INSEMINAÇÕES NA PRODUÇÃO DE

EMBRIÕES EM VACAS NELORE (Bos indicus) SUPEROVULADAS E
Martins, C.M.1; Sá Filho, M.F.1; Souza, A.H.1; Baruselli, P.S.1
1
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ/USP, São Paulo/ SP, CEP 05508-000, Brasil.
Dez vacas Nelore paridas a 60±12 dias foram divididas homogeneamente em dois grupos: G-
1IATF e G-2IATF. Adotou-se o delineamento experimental cross-over para evitar variação
individual nos resultados. Os animais receberam um dispositivo intravaginal de progesterona
(P4; DIB®, Syntex, Argentina) associado a 2 mg de benzoato de estradiol (BE; Ric BE®, Syntex,
Argentina) no Dia 0. A superestimulação folicular com FSHp (133mg, Folltropin®, Bioniche,
Canadá) teve início no Dia 4 (8 doses decrescentes de 12/12 horas). No dia 6, administrou-se
uma dose de PGF2á (Prolise®, Syntex, Argentina). Os dispositivos de P4 foram removidos 36
horas após a aplicação de PGF2á e o LH (25 mg de LH, Lutropin-V®, Bioniche, Canadá) foi
aplicado 48 horas após a PGF2á (12h após o último FSH). No G-2IATF as vacas receberam 2
inseminações 12 e 24 horas após o tratamento com LH. As vacas do G-1IATF receberam apenas
1 inseminação 16 horas após a aplicação do LH. Todas as vacas do experimento foram inseminadas
com uma única partida de sêmen. Foram realizados exames ultra-sonográficos (PIE MEDICAL
SCANER 200, Netherlands) com intervalos de 12 horas a partir do momento da administração
do LH até 72 horas após, com intuito de avaliar o número de folículos aptos à ovulação (> 8
mm), a taxa de ovulação e o momento das ovulações. As variáveis foram analisadas por ANOVA,
a homogeneidade das variâncias (dispersão do momento das ovulações), pelo teste de Bartlett e
a comparação das proporções pelo teste de Qui-quadrado. Adotou-se nível de significância de
5%. Não foram observadas interações, sendo os efeitos dos tratamentos G-1IATF e G-2IATF,
respectivamente: número de folículos >8mm no momento do LH (16.2±1.4 e 14.8±1.2; P >
0,05), taxa de ovulação (63.8±3.8% e 64.2±4.3%; P > 0,05), intervalo entre a primeira e a última
ovulação (32.4±1.8 e 33.6±1.6h; P > 0,05), estruturas totais (8,2±0,9 e 7,2±0,8; P > 0,05), embriões
Grau 1 (2,0±0,5 e 2,3±0,4; P > 0,05), embriões transferíveis (4,3±0,7 e 4,2±0,6; P > 0,05),
embriões congeláveis (2,9±0,6 e 2,8±0,4; P > 0,05), estruturas não fertilizadas (0,6±0,2 e 0,8±0,2;
P > 0,05), embriões degenerados (3,3±0,9 e 2,2 ±0,3; P > 0,05). De acordo com os resultados
obtidos pode-se observar que não houve diferença significativa na produção de embriões viáveis
quando se utilizou 1 ou 2 inseminações em doadoras Nelore superovuladas e inseminadas em
tempo fixo.
Agradecimentos: Tecnopec
s525
EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE PROGESTERONA INJETÁVEL NO

MOMENTO DA INSERÇÃO DO DISPOSITIVO INTRAVAGINAL DE
PROGESTERONA EM VACAS NELORE (Bos indicus) SUPEROVULADAS E
Martins, C.M.1; Torres-Júnior, J.R.S.1; Souza, A.H.1; Baruselli, P.S.1
1
cmmartins@usp.br; barusell@usp.br
Dez vacas da raça Nelore (Bos indicus) foram divididas em dois grupos: Grupo Benzoato de
estradiol mais Progesterona injetável (G-BE+P4) ou Grupo Benzoato de estradiol (G-BE).
Adotou-se delineamento experimental cross-over para evitar variação individual nos resultados.
Os animais do G-BE+P4 receberam no Dia 0 um dispositivo intravaginal de progesterona (1 g
P4; DIB®, Syntex, Argentina), 2 mg de Benzoato de estradiol (BE; RIC BE®, Syntex, Argentina)
e 50 mg de progesterona injetável (Syntex, Argentina). As vacas do G-BE receberam um
dispositivo intravaginal de P4 associado a 2 mg de BE. A superestimulação folicular foi induzida
com FSH-p (133mg de Folltropin-V®,Bioniche, Canadá) em 8 doses decrescentes de 12/12 horas,
a partir do Dia 4. No Dia 6, administrou-se 150µg de PGF2 (D-cloprostenol; Prolise® Syntex,
Argentina). Os dispositivos de P4 foram retirados 36 horas após a administração de PGF2α, e o
LH (25mg de LH, Lutropin-V®, Bioniche, Canadá) aplicado 48 horas após a PGF2α (12 h após
o último FSH). Foram realizadas duas inseminações artificiais 12 e 24 horas após o LH. A colheita
dos embriões foi realizada no Dia 15. Foram realizados exames ultra-sonográficos (SCANER
200, Pie Medical, Holanda) com intervalos de 12 horas a partir do momento da inserção do
dispositivo até a emergência da nova onda de crescimento folicular. Também, foram realizados
exames ultra-sonográficos com intervalos de 12 horas a partir do momento da administração do
indutor de ovulação até 72 horas após, com intuito de avaliar o número de folículos aptos à
ovulação (> 8 mm), taxa de ovulação e momento das ovulações. As variáveis foram analisadas
por ANOVA, a homogeneidade das variâncias (dispersão do momento das ovulações), pelo teste
de Bartlett e a comparação das proporções pelo teste de Qui-quadrado. Não foram observadas
interações entre as réplicas, sendo os efeitos dos tratamentos BE+P4 e BE, respectivamente:
emergência da onda folicular (3,6±0,2 e 4,0±0,1dias; P > 0,05), variação do dia de emergência
folicular 2,5 a 4,5 vs 3,5 a 4,5 dias; P = 0,08], número de folículos > 8mm no momento do LH
(16,2±1,4 e 18,5±1,1; P > 0,05) taxa de ovulação (69,1±3,6 e 68,1±4,7%; P > 0,05), intervalo
entre a primeira e a última ovulação (32,4±1,8 e 33,6±1,6 horas; P > 0,05), estruturas totais
(7,7±0,8 e 9,2±1,2; P > 0,05), embriões degenerados (0,6±0,2 e 0,8±0,2; P > 0,05), embriões
transferíveis (6,2±0.6 e 7,2±1,1; P>0,05) e embriões congeláveis (5,1±0,7 e 6,3±1,0; P > 0,05).
Os resultados deste experimento são indicativos de que, embora o tratamento com progesterona
injetável tenha sincronizado a emergência da onda folicular, não foi observado efeito do tratamento
na quantidade e na qualidade embrionária em vacas Nelore superovuladas e inseminadas em
tempo fixo.
Agradecimentos: Tecnopec.
s526
SUPEROVULAÇÃO COM eCG OU FSH EM DOADORAS NELORE (Bos indicus)

Martins, C.M.1; Torres-Júnior, J.R.S.1; Gimenes, L.U.1; Souza, A.H.1; Baruselli, P.S.1
1
Um total de 12 vacas da raça Nelore (Bos indicus) foram divididas aleatóriamente em três grupos
de acordo com o tratamento superestimulatório: eCG (2500UI ou 2000UI) e FSH-100mg (cross-
over). Em dia aleatório do ciclo estral (D0), os animais receberam um dispositivo intravaginal de
progesterona (1 g P4; DIB®, Syntex, Argentina) associado a 2 mg de Benzoato de estradiol (BE;
RIC BE®, Syntex, Argentina). Nos tratamentos com eCG, a superestimulação foi realizada com
a administração de 2500 ou 2000 UI de Novormon®, (Syntex, Argentina) em dose única no Dia
4. No tratamento com FSH, administrou-se 100mg de Folltropin-V® (Bioniche, Canadá) em 8
doses decrescentes de 12/12 horas, a partir do Dia 4. No Dia 6, administrou-se 150 µg de PGF2α
(D-cloprostenol; PROLISE® Syntex, Argentina). Os dispositivos de P4 foram retirados 36 horas
após a administração de PGF2α, e o LH (25mg de LH, Lutropin-V®, Bioniche, Canadá) foi
aplicado 48 horas após a PGF2α. Foi realizada uma única inseminação artificial 16 horas após
a administarção do LH. Foi utilizada a mesma partida de um único touro para cada vaca em todas
as réplica. A colheita dos embriões foi realizada no Dia 15. Para avaliação do número de folículos
aptos à ovulação no momento da aplicação do LH, a taxa de ovulação e o momento das ovulações
foram realizados exames ultra-sonográficos (ALOKA SSD 900, Japan) com intervalos de 12
horas a partir do momento da administração do LH até 72 horas após. As variáveis foram analisadas
por ANOVA, a homogeneidade das variâncias (dispersão do momento das ovulações), pelo teste
de Bartlett e a comparação das proporções pelo teste de Qui-quadrado. Adotou-se nível de
significância de 5%. Não foram observadas interações entre as réplicas, sendo os efeitos dos
tratamentos eCG-2500UI; eCG-2000UI e FSH-100mg, respectivamente, para: número de
folículos >8mm no momento do LH (24,4±3,9a; 18,4±2,9ab e 11,2±2,7b), taxa de ovulação [97/
293 (33,1%)b; 129/221 (58,4%)a e 89/135 (65,9%)a], momento da ovulação (43,0±11,3ªx;
39,8±10,2abxy e 39,0±8,9by horas; x ‘“ y, teste de Bartlett], taxa de recuperação [71/97 (73,2%);
91/129 (70,5%) e 69/89 (77,5%)], estruturas totais (5,9±1,0; 7,6±1,0 e 5,7±1,4), embriões Grau
1 (3,4±0,7; 5,8±0,9 e 3,5±0,7), embriões degenerados (0,4±0,2; 0,0±0,00 e 0,4±0,2), embriões
transferíveis (4,4±0,7; 6,9±1,0 e 4,6±0,9) e embriões congeláveis (3,8±0,7b; 6,7±1,0a e 4,2±0,8ab).
Os resultados são sugestivos de que a eCG pode ser efetiva para produção de embriões em vacas
Nelore. Entretanto, verificou-se efeito dose/dependente para o número de folículos que
responderam a superestimulação e para a taxa de ovulação. O tratamento com 2000UI de eCG
produziu número semelhante de embriões transferíveis e congeláveis comparado ao grupo tratado
com FSH, mostrando ser uma alternativa viável para programas de TE com inseminação artificial
em tempo fixo em zebuínos.
s527
RESPOSTA SUPEROVULATÓRIA E PRODUÇÃO DE EMBRIÕES DE DOADORAS

NELORE (Bos indicus) SUBMETIDAS À INDUÇÃO DA OVULAÇÃO COM GnRH
OU LH PARA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO
1
Vacas da raça Nelore (Bos indicus), n=10, foram submetidas a manejo extensivo, sendo divididas
em dois grupos de acordo com o indutor de ovulação: Grupo LH, ou Grupo GnRH (cross-
over). A hipótese do presente experimento é de que o GnRH apresenta eficiência semelhante ao
LH em protocolos de superovulação com IATF. Os animais receberam um dispositivo intravaginal
de progesterona (1 g P4; DIB®, Syntex, Argentina) associado a 2 mg de Benzoato de estradiol
(BE; RIC BE®, Syntex, Argentina) no Dia 0. No dia 4, iniciou-se a superestimulação folicular
com 133mg de Folltropin-V® (Bioniche, Canadá) em 8 doses decrescentes de 12/12 horas. No
Dia 6, administrou-se 150 µg de PGF2α (D-cloprostenol; PROLISE® Syntex, Argentina). Os
dispositivos de P4 foram removidos 24 horas após a administração de PGF2α, e os indutores de
ovulação, LH (25mg de LH, Lutropin-V®, Bioniche, Canadá) ou GnRH (1mg Lecirelina,
GESTRAN® Syntex, Argentina), aplicados 48 horas depois da PGF2α. Foram realizadas duas
inseminações 12 hs e 24 horas após a aplicação do indutor de ovulação, sendo utilizada mesma
partida de um único touro para cada vaca/réplica. A colheita dos embriões foi realizada no Dia
15. Foram realizados exames ultra-sonográficos (PIE MEDICAL SCANER 200, Netherlands)
com intervalos de 12 horas a partir do momento da administração do indutor de ovulação até 72
horas após, com intuito de avaliar o número de folículos aptos à ovulação (> 8 mm), a taxa de
ovulação e o momento das ovulações. As variáveis foram analisadas por ANOVA, a comparação
de médias pelos testes de Tukey e Qui-quadrado e, a homogeneidade das variâncias (dispersão
do momento das ovulações), pelo teste de Bartlett, com nível de significância de 5%. Não foram
observadas interações, sendo os efeitos dos tratamentos Grupo LH e Grupo GnRH,
respectivamente: folículos > 8mm no momento da administração do indutor de ovulação (10,9±0,5
e 10,4±0,8; P > 0,05) taxa de ovulação [73,1% (76/104) e 77,1% (84/109); P > 0,05], intervalo
entre administração do indutor e ovulação (28,8±2,0 e 32,4±1,8h; P > 0,05), estruturas totais
(5,9±0,3 e 6,0±0,5;P > 0,05), embriões Grau 1 (5,0±0,4 e 3,9±0,5; P = 0,06), embriões degenerados
(0,4±0,2 e 0,1 ±0,1; P > 0,05), embriões transferíveis (5,5±0,3 e 5,2±0,3; P > 0,05), embriões
congeláveis (5,4±0,3 e 4,8±0,4; P > 0,05) e estruturas não fertilizadas (0.0 ± 0.0 e 0.7 ± 0.3;
P=0,02). O Grupo LH apresentou numericamente (tendência estatística) maior número de embriões
grau 1 e menor número de estruturas não fertilizadas, apesar de não se verificar diferenças na
quantidade de embriões congeláveis (grau 1 e 2) e transferíveis (grau 1,2 e 3, IETS, 1998). De
acordo com os resultados não houve diferença significativa na produção de embriões congeláveis
e transferíveis quando se empregou GnRH ou LH como indutores de ovulação para doadoras
Nelore (Bos indicus) em protocolos de superovulação com inseminação artificial em tempo fixo.
No entanto, o tratamento com LH proporcionou menor número de estruturas não fertilizadas e
maior número de embriões grau 1.
Agradecimentos: Tecnopec.
s528
EFEITO DO MOMENTO DA APLICAÇÃO DO LH NA RESPOSTA

SUPEROVULATÓRIA E NA PRODUÇÃO EMBRIONÁRIA EM VACAS NELORE
(Bos indicus) INSEMINADAS ARTIFICIALMENTE EM TEMPO FIXO
1
Vacas da raça Nelore (Bos indicus; n=20) foram divididas em dois grupos de acordo com o
momento da aplicação do LH [48 horas (G-LH48) ou 60 horas (G-LH60) após a administração
de prostaglandina]. Adotou-se o delineamento experimental cross-over para evitar a influência
individual dos animais sobre os resultados. As vacas receberam, em dia aleatório do ciclo estral,
um dispositivo intravaginal de progesterona (1 g P4; DIB®, Syntex, Argentina) associado a 2 mg
de Benzoato de estradiol (BE; RIC BE®, Syntex, Argentina) no Dia 0. A superovulação foi induzida
com FSH-p (100mg de Folltropin-V®, Bioniche, Canadá) em 8 doses decrescentes de 12/12
horas, a partir do Dia 4. No Dia 6, administrou-se 150 µg de PGF2α (D-cloprostenol; Prolise®
Syntex, Argentina). Os dispositivos de P4 foram retirados 36 horas após a administração da
PGF2α, e a aplicação do LH (25mg de LH, Lutropin-V®, Bioniche, Canadá) foi realizada 48 (G-
LH48) ou 60 (G-LH60) horas após a PGF2α. Foram realizadas duas inseminações 12 hs e 24
horas após a aplicação do LH. Foi utilizada a mesma partida de um único touro para cada vaca/
réplica. A colheita dos embriões foi realizada no D15. Foram realizados exames ultra-sonográficos
(PIE MEDICAL SCANER 200, Netherlands) com intervalos de 12 horas a partir do momento da
administração do LH até 72 horas após para avaliar o número de folículos aptos à ovulação no
momento da aplicação do LH, taxa de ovulação e momento das ovulações. . As variáveis foram
analisadas por ANOVA, a homogeneidade das variâncias (dispersão do momento das ovulações),
pelo teste de Bartlett e a comparação das proporções pelo teste de Qui-quadrado. Adotou-se o
nível de significância de 5%. Não foi observada diferença estatística (P > 0,05) nas seguintes
variáveis analisadas para LH48 e LH60 respectivamente: número de folículos >8mm no momento
do LH (12.5±1.5 e 9.4±1.0), e taxa de ovulação (71.0±4.2 % e 64.6±4.0%). No entanto, para as
seguintes variáveis verificou-se diferença estatisticamente significativa (P < 0,05). Intervalo entre
a primeira e a última ovulação (15,0±2,1a e 21,0±1,7b h) ,estruturas totais (7,5±1,0a e 5,1±0,5b),
embriões degenerados (0,6±0,3a e 1,5±0,3b), embriões transferíveis (6,2±1,0a e 3,1±0,5b) e
embriões congeláveis (5,9±0,9a e 2,5±0,5b). De acordo com os resultados pode-se observar que
o atraso de 12 horas na aplicação do LH em protocolos de superovulação com inseminação
artificial em tempo fixo reduziu a produção e a qualidade dos embriões em doadoras Nelore.
(Agradecimentos: Tecnopec
s529
ADEQUAÇÃO DA DOSE DE FSH OVINO EM PROTOCOLOS DE

SUPEROVULAÇÃO COM INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO PARA
DOADORAS DA RAÇA NELORE (Bos indicus).
1
cmmartins@usp.br
Um total de 12 vacas Nelore paridas (> 90 dias), mantidas em sistema de pastejo foram divididas
em três grupos : 4,5 mg; 6,0 mg e 9,0 mg de FSH ovino (FSH; Ovagen®, ICPbio, New Zealand),
adotando-se o delineamento cross-over. Os animais receberam dispositivo intravaginal de
progesterona (P4; DIB®, Syntex, Argentina) mais 2 mg de benzoato de estradiol (BE; Ric BE®,
Syntex, Argentina). A superestimulação teve início do dia 4 do protocolo, com o FSH sendo
administrado em 8 doses decrescentes de 12/12 horas. No dia 6, administrou-se uma dose de
PGF2á (Prolise®, Syntex, Argentina). Em relação a prostaglandina, os dispositivos de P4 foram
removidos 36 horas após e o LH (25 mg de LH, Lutropin-V®, Bioniche, Canadá) 48 horas após.
As inseminações foram realizadas 12 e 24 horas após o LH utilizando mesma partida de um
único touro. A colheita dos embriões foi relizada no dia 15. As variáveis foram analisadas por
ANOVA, a comparação de médias pelos testes de Tukey e Qui-quadrado e, a homogeneidade das
variâncias (dispersão do momento das ovulações), pelo teste de Bartlett, ao nível de significância
de 5%. Não foram observadas interações, sendo os efeitos dos tratamentos 4,5 mg; 6,0 mg e 9,0
mg, respectivamente: taxa de ovulação (69.2±6.8); (68.9±5.2) e (73.6±4.6), estruturas totais
(3.8±0.9 b); (7.7±1.5 a) e (9.6±1.5 a), embriões Grau 1 (1.9±0.5 b), (4.7±1.2 a) e (4.7±1.4 a),
embriões degenerados (0.8±0.3), (0.5±0.3) e (0.5±0.2), embriões transferíveis (3.1±0.8 b),
(6.7±1.4a) e (7.9±1.3 a) e embriões congeláveis (2.8±0.7 b), (6.1±1.3 a) e (7.1±1.4a). De acordo
com os resultados obtidos, a dose de 4,5 mg de FSH ovino proporcionou decrécimo na produção
de embriões transferíveis, não foi observado diferença significativa com relação a produção
embrionária entre os grupos 6 mg e 9 mg de FSH ovino, mostrando que a utilização de dois
terços da dose recomendada é uma alternativa viável para programas de TE com inseminação
artificial em tempo fixo em zebuínos.
s530
EFEITO DE DIFERENTES MOMENTOS DE APLICAÇÃO DO LH EM

PROTOCOLOS DE SUPEROVULAÇÃO COM INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM
TEMPO FIXO EM VACAS MESTIÇAS (HOLANDÊS X GIR)
Silva, H.S.1; Martins, C.M.2; Ayres, H.2; Torres-Júnior, J.R.S.2;

Souza, A.H.2; Baruselli, P.S.2
1
Médico Veterinário Autônomo, Resende/ RJ; 2Departamento de Reprodução Animal, FMVZ/
USP, São Paulo/ SP, CEP 05508-000, Brasil. herbertvet@bol.com.br, barusell@usp.br
Um total de 9 vacas Girolando (1/2 sangue Bos taurus, 1/2 sangue Bos indicus) paridas, foram
divididas em dois grupos: Grupo LH48 e Grupo LH60 (cross-over). Os animais receberam
dispositivo intravaginal de progesterona (P4; DIB®, Syntex, Argentina) e 2 mg de benzoato de
estradiol (BE; Estrogin®, Farmavet, Brasil) no Dia 0. A superestimulação folicular foi realizada
com 500 UI de FSH (Pluset®, Calier, Espanha) em 8 doses decrescentes de 12/12 horas, a partir
do Dia 4. No Dia 6, administrou-se uma dose de PGF2α (Prolise®, Syntex, Argentina). Os
dispositivos de P4 foram retirados 36 horas após a administração da prostaglandina e o LH (25mg
de LH, Lutropin-V®, Bioniche, Canadá) foi administrado 48 (LH48) ou 60 (LH60) horas após a
PGF2α. As inseminações foram realizadas 12 e 24 horas após o LH utilizando mesma partida de
um único touro. A colheita dos embriões foi realizada no Dia 15. Para a análise utilizaram-se os
testes de Anova e Qui-quadrado. Não houve interação entre as variáveis, sendo os efeitos principais
para os tratamentos LH48 vs LH60, respectivamente: estruturas totais (6,1±1,5 vs 7,3±2,1;
p>0,05), embriões Grau 1 (1,3±0,6 vs 1,1±0,6; p>0,05), embriões transferíveis (2,7±0,9 vs 4,4±1,2;
p>0,05), embriões congeláveis (2,1±0,7 vs 1,8±0,8; p>0,05), estruturas não fertilizadas (1,0±0,4
vs 0,250,25; p>0,05) e embriões degenerados (2,7±1,7 vs 2,3±0,9; p>0,05). Não houve efeito
do momento da administração de LH (LH60) sobre o número embriões Grau 1, transferíveis e
congeláveis. Os resultados são sugestivos de que a administração de LH 60 horas após a PGF2α
não interfere na produção de embriões de vacas mestiças em lactação superovuladas e inseminadas
artificialmente em tempo fixo.
s531
EFEITO DA FREQUÊNCIA DO TRATAMENTO COM BAIXA DOSE DE EXTRATO

DE PITUITÁRIA EQUINA NA INDUÇÃO DE MÚLTIPLAS OVULAÇÕES EM
ÉGUAS
Alonso, M.A.1; Fleury, P.D.C.1; Alvarenga, M.A.2
1
Fleury Reprodução Equina – São Jose do Rio Pardo- SP, 13720-000, Brasil.2 Departamento
de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária - UNESP-Botucatu/SP, 18618-000-Brasil
gutalonso@gmail.com
A ocorrência de múltiplas ovulações em éguas aumenta a probabilidade de recuperação de um

embrião em uma colheita, melhorando assim a eficiência da técnica da transferência de embrião.
Normalmente, os protocolos superovulatórios com EPE preconizam sua aplicação duas vezes ao
dia, por terem sido obtidos melhores resultados do que a aplicação uma vez ao dia. Em protocolos
de indução de ovulações múltiplas com baixa dose de EPE, a freqüência de aplicação ainda não
foi avaliada. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da freqüência de administração de
baixa dose de extrato de pituitária eqüina (EPE) na taxa de ovulação e recuperação embrionária.
Foram utilizadas 26 éguas doadoras de embrião das raças Mangalarga Marchador, Mangalarga
Paulista, Puro Sangue Inglês de Pólo e Árabe., com idades entre 3 e 20 anos.O experimento foi
realizado entre os meses de novembro e fevereiro. O ciclo anterior de cada égua foi utilizado
como seu controle, onde foi utilizado o mesmo garanhão do ciclo tratado. Após a colheita do
ciclo controle no dia 8 pós-ovulação, dinoprost (7,5mg/IM; Lutalyse, Pharmacia, Brasil) foi
aplicado e os animais submetidos aleatoriamente a um dos grupos experimentais: G1(EPE, 6mg/
2x dia, n=13) e G2 (EPE, 12mg/1x dia, n=13), quando foram iniciados os tratamentos. A
avaliação ultrassonográfica foi feita diariamente desde o primeiro dia de tratamento ate a detecção
da(s) ovulação(ões). O tratamento era interrompido quando a maioria dos folículos maiores
atingissem o diâmetro ≥35mm, então hCG era administrado (2500UI/IV; Vetecor, Lab. Calier,
Brasil) para indução da ovulação. No dia seguinte a indução, as éguas forma inseminadas com 1
bilhão de espermatozóides viáveis. As colheitas de embrião foram realizadas no 8º dia após a
detecção da primeira ovulação. A taxa de ovulação e numero de embriões por égua foi comparado
utilizando-se o teste t pareado entre ciclos dentro do mesmo grupo o teste t não pareado entre
grupos diferentes. Os resultados foram os seguintes: no G1, o numero de ovulações por égua
em relação ao seu controle não apresentou diferença estatística, entretanto o numero de embriões
por égua aumentou significativamente. Para G2, tanto o numero de ovulações quanto de embriões
por égua foi aumentado significativamente em relação ao seu grupo controle. Quando comparamos
os dois grupos entre si, o numero de ovulações por égua de G2 foi significativamente maior do
que G1, entretanto a taxa de recuperação embrionária não diferiu estatisticamente. Portanto os
dois tratamentos foram efetivos em aumentar a recuperação embrionária, porém a aplicação uma
vez ao dia foi superior, aumentando a taxa de ovulação. Conclui-se então que este protocolo com
uma aplicação de 12mg de EPE por dia é fácil e mais eficiente.
s532
TAXAS DE PRENHEZ EM RECEPTORAS APÓS SUPLEMENTAÇÃO

COM GnRH E hCG
Machado, R.1; da Silva, J.C.B.2,3; Barbosa, R.T.1; Niemeyer, C.4; Binelli, M.4
1
Embrapa Pecuária Sudeste, 13560-970, São Carlos, SP, 2 Fazenda Cardinal, Mococa, SP,
3
Embryolife, Ouro Fino, MG, 4CBRA-VRA-FMVZ-USP, 13635-900, Pirassununga, SP.
binelli@usp.br
Em bovinos, ocorre de 15 a 40% de mortalidade embrionária (ME) decorrentes de disfunções

luteínicas e distúrbios do reconhecimento materno da prenhez (RMP). Estes fenômenos associam-
se à liberação uterina de prostaglandina F2α, que ocorre na presença de um folículo dominante
(DOM) esteroidogenicamente ativo durante o período crítico (PC) do RMP. Este estudo testou
uma estratégia hormonal para otimizar a função luteínica e prevenir a ação do DOM no PC.
Antecipava-se que os hormônios reprogramariam a função ovariana para haver CLs acessórios e
não existir DOM no PC, resultando em atraso do estímulo luteolítico e aumento da produção de
progesterona. 183 receptoras, mestiças ½ nelore ½ europeu, ciclando foram sincronizadas e
submetidas a TETF com embriões FIV da raça Brahman transferidos a fresco. As receptoras
eram da fazenda Cardinal em Mococa, SP de clima tropical com inverno seco e verão úmido e
quente. As vacas receberam implante auricular de 3mg norgestomet (Crestar®, Intervet) e uma
injeção de 2mg Benzoato de Estradiol (IM). Após 9 dias o implante foi removido e aplicadas,
IM, 400 UI da eCG (Folligon®, Intervet). Os animais foram distribuídos segundo: peso vivo,
condição corporal e histórico reprodutivo nos grupos: Controleseca (n=37): inovuladas no final do
período da seca (outubro/2005) e sem tratamento adicional; GnRH/hCGseca (n=36) inovuladas
no mesmo período e receberam, IM, 100 μg gonadorelina (GnRH) 09 dias depois da retirada do
implante (D4 pós-ovulação) e 2500 UI da hCG, IM, oito dias depois (D12 pós-ovulação);
Controleáguas (n=57): inovuladas nas águas (março/2005) e sem tratamento adicional e GnRH/
hCGáguas (n=53) inovuladas nas águas e idem ao GnRH/hCGseca. As taxas de prenhez (TP) foram
obtidas por ultra-sonografia aos 30 e 60 dias e os resultados analisados pelo teste do Qui-quadrado.
AS TP aos 30 dias foram de: 40,5%, 50,0%, 59,6% e 60,4%, respectivamente para Controleseca
(15/37), GnRH/hCGseca (18/36), Controleáguas (34/57) e GnRH/hCGáguas (32/53). Não houve
diferença (P>0,05) entre tratamentos dentro do período da seca (χ2=0,66), dentro das águas
(χ2=0,01) e nem quando os resultados foram combinados (χ2=0,30). Não houve diferença entre
épocas da inovulação (χ2=0,30) embora a porcentagem de prenhez das vacas inovuladas nas
águas (60,0%) tenha sido maior que da seca (45,2%). Entretanto, a TP tendeu (0,05<P<0,10,
χ2=3,44) a ser menor para Controleseca (40,5%) comparado ao GnRH/hCGáguas (60,4%). Houve
mais (embora P>0,05, χ2=1,08) ME, entre 30 e 60 dias de gestação, nos Controles (17,6%) que
nos GnRH/hCG (6,2%) e maior número de CLs aos 30 dias (P<0,05) nas vacas tratadas (1,64±0,12)
comparadas às controle (0,78±0,08). Conjectura-se o efeito benéfico da combinação GnRH/
hCG sobre a retenção de prenhez das receptoras inovuladas num período menos favorável do
ano.
Farmacotécnico, INTERVET e Fazenda Cardinal.
s533
PROTOCOLO PARA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES FIV
Dias, C.C.1; Alvin, M.T.T.2; Saliba, W.P.2; Vasconcelos, J.L.M.1
1
Departamento de Produção Animal – FMVZ-UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil.
2
Cenatte Embriões, Caixa Postal 64, Pedro Leopoldo-MG, 33600-000, Brasil.
O objetivo deste experimento foi avaliar as taxas de demonstração de estro, sincronização e de

concepção e a concentração de progesterona no dia 6 após o estro em novilhas submetidas a
protocolo para transferência de embriões FIV. O presente trabalho foi realizado em Pedro
Leopoldo, MG, no Cenatte Embriões e foram utilizadas 325 novilhas ciclando (ciclicidade avaliada
pela presença de CL em pelo menos uma de duas avaliações por US com intervalo de 7 dias)
divididas em dois grupos: grupo controle (n = 221) – D0: PGF2 (Ciosin®- 0,26 mg), D2 à 5:
observação de estro, D8 à 11: avaliação da presença de CL por US dos animais que apresentaram
cio e coleta de sangue dos animais com CL, D9 à 13: inovulação dos animais; grupo sincronizado
com CIDR® (n = 104), D-9: CIDR® + BE (Estrogin®- 2 mg), D-2: PGF2α (Lutalyse® – 12,5 mg),
D0: retirada CIDR® + ECP® (0,5 mg), D1 e 2: observação de estro, D7 e 8: avaliação da taxa de
sincronização (animais com CL / total de animais) e coleta de sangue dos animais com CL, D9:
inovulação dos animais. Nos dois grupos somente foram inovuladas novilhas que apresentaram
comportamento de estro e CL à palpação retal de acordo com padrão de avaliação do Cenatte
(CL ausente: 0, CL presente: 1<2<3 de acordo com a exteriorização e sem exteriorização: incluso).
As taxas de demonstração de estro, sincronização e concepção foram analisadas por regressão
logística e a concentração de progesterona no dia 6 após o estro por análise de variância (GLM).
Animais que receberam o protocolo com CIDR® apresentaram maior (p<0,05) taxa de
demonstração de estro e presença de CL ao ultra-som no dia 6 do que animais controle, 62,5%
(65/104) e 76,9% (80/104) vs. 41,2% (91/221) e 36,7% (81/221), respectivamente e 11,0% (10/
91) das novilhas do grupo controle e 12,3% (8/65) do grupo CIDR® demonstraram cio mas não
apresentaram CL ao US. Nos animais dos grupos controle e com CIDR® que apresentaram cio,
não foi detectado efeito de tratamento na presença de CL por US no dia 6: 89,0% (81/91) vs.
89,7% (57/65), no número de animais inovulados: 86,4% (70/81) vs. 84,2% (48/57), na taxa de
concepção: 67,1% (47/70) vs. 56,3% (27/48), e na concentração de progesterona: 3,04±0,28 ng/
ml (n=33) vs. 2,74±0,28 ng/ml (n=33), respectivamente. No grupo com CIDR® 22,1% (23/104)
das novilhas apresentaram CL ao US, porém não foram inovuladas, pois não foram detectadas
em estro. Nestes animais a concentração de progesterona foi de 3,08±0,54 ng/ml (n=9) e não
diferiu da concentração de progesterona dos animais inovulados. A concentração de progesterona
não diferiu entre os animais que demonstraram (2,82±0,19 ng/ml; n=71) ou não (2,55±0,41 ng/
ml; n=16) cio. Estes dados sugerem que a utilização deste protocolo com CIDR® em animais
ciclando não altera a concepção dos animais que apresentaram cio. Pode-se maximizar a utilização
de receptoras, independente de ter ou não apresentado cio, pois a concentração de progesterona
no dia 6 não foi alterada.
Agradecimentos: Cenatte Embriões e Pfizer Saúde Animal
s534
Resumos:
Transferência Nuclear e Transgênese
s535
s536
EXPRESSÃO DOS GENES IMPRINTED H19, IGF2 E IGF2r EM PLACENTAS DE

CLONES BOVINOS
Yamazaki, W.1; Perecin, F.1; Braga, F.C.2; Méo, S.C.3; Biase, F.H.4; Tarouco, A.K.5;
Ferreira C.R.1; Merighe, G.K.F.5; Meirelles, F.V.5; Garcia, J.M.1
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil. 2FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil.
3
CPDGRA-IZ, APTA/SAA, Nova Odessa-SP, Brasil. 4RGE-FMRP-USP, Ribeirão Preto-SP,
Brasil. 5ZAB-FZEA-USP, Pirassununga-SP, Brasil. wyamazaki@yahoo.com
Os principais entraves à aplicação em larga escala da transferência nuclear (TN) são a baixa
eficiência da técnica e a elevada incidência de alterações durante o desenvolvimento pré e pós-
natal dos animais clonados. Além disso, o índice de sucesso é cerca de 123% superior na TN de
machos. Como a intensa manipulação de oócitos e embriões durante os procedimentos de TN,
maturação e cultivo in vitro pode afetar o imprinting genômico (Young e Fairburn, Theriogenology,
53:627, 2000), o presente trabalho teve por objetivo estimar a freqüência dos transcritos dos
genes imprinted IGF2 (expressão paterna), H19 e IGF2r (expressão materna) em placentônios
(carúncula e cotilédone) de animais clonados e animais controle (monta natural), que se
desenvolveram a termo. Placentônios de 15 animais clonados (6 machos e 9 fêmeas) e de 3
animais controle foram coletados logo após o nascimento (cesariana) e armazenados em nitrogênio
líquido. A extração de RNA foi realizada com Trizol, segundo protocolo do fabricante. Para a
transcrição reversa utilizou-se 1μg de RNA total em reação de 20μL (42ºC/50min, 70ºC/15min)
contendo tampão 1X RT (Invitrogen), oligo(dT) (5mmol/L), dNTPs (1,25mmol/L), RNAse OUT
(40UI – Invitrogen) e Superscript II (200UI - Invitrogen). As amplificações dos genes IGF2,
H19, IGF2r e GAPDH (controle endógeno) foram realizadas em duplicata utilizando equipamento
de PCR em tempo real (ABI Prism 7500 System) em reação de 20μL (50ºC/2min, 95ºC/10min,
45 ciclos 95ºC/30s + 60ºC/1min) contendo 40ng de cDNA, 1X Power SYBR Green PCR Master
Mix (Applied Biosystems) e oligonucleotídeos iniciadores (0,2μM IGF2; 0,25μM H19; 0,5μM
IGF2r e 0,6μM GAPDH). As eficiências de cada reação foram determinadas a partir da regressão
linear do logaritmo da fluorescência por ciclo durante a fase exponencial de amplificação e as
eficiências médias de cada gene foram utilizadas para calcular sua expressão relativa, de acordo
com Pfaffl et al. (Nucleic Acids Res., 30:e36, 2002). Correlações entre os níveis de expressão
relativa das amostras foram calculadas. Em relação ao controle, as placentas de animais clonados
apresentaram redução de 42,9% na expressão relativa para o IGF2 (P<0,055) e 41,5% para o
H19 (P<0,039). A correlação H19-IGF2 foi de 0,96 (P<0,001), IGF2r-H19, 0,63 (P<0,01) e
IGF2r-IGF2, 0,62 (P<0,012). Quando comparadas aos clones machos, as placentas dos clones
fêmeas apresentaram redução de 72,6% na freqüência dos transcritos de H19 (P<0,001). Nossos
resultados indicam que mesmo em animais clonados com desenvolvimento a termo, ocorre
reprogramação nuclear incompleta de genes imprinted IGF2 e H19 na placenta, as quais podem
influenciar a mortalidade pós-natal. A menor taxa de expressão relativa do gene H19 nas placentas
das fêmeas clonadas sugere que a reprogramação de alguns genes possa ser influenciada pelo
sexo.
Suporte financeiro: FAPESP Proc. nº03/12352-7 e 02/03033-2
s537
EFEITO DO DNA EXÓGENO E DO TEMPO DE INCUBAÇÃO NA INDUÇÃO DE

APOPTOSE DE NECROSE EM ESPERMATOZÓIDES BOVINOS
Feitosa, W.B.; Rocha, A.M.; Mendes, C.M.; Goissis, M.D.; Nicacio, A.C.;
Gonçalves, J.S.A.; Visintin, J.A.; Assumpção, M.E.O.A.
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ – USP, São Paulo, SP, Brasil, wfeitosa@usp.br
A cinética da interação dos espermatozóides com o DNA exógeno tem sido um dos mecanismos
estudados para melhor compreensão e aplicação da transferência gênica mediada por
espermatozóides. A quantidade de DNA associada ao espermatozóide é proporcional ao tempo
de incubação. Contudo, grande quantidade de DNA exógeno, associado ou internalizado, pode
ativar as endonucleases, provocando degradação do DNA exógeno e/ ou endógeno por um processo
semelhante à apoptose. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tempo de incubação dos
espermatozóides com moléculas de DNA exógeno na indução da apoptose, necrose ou necrose
inicial e/ou apoptose tardia. Foram incubados 5 x 106 espermatozóides/ml por 60, 90 e 120
minutos com ou sem 500ng de DNA exógeno (pEYFP-Nuc - Clontech). Após a incubação, o
sêmen foi lavado com 3 ml de PBS sem cálcio e magnésio e centrifugado a 200g por 5 minutos.
Foram diluídos 1 x 106 espermatozóides em 1ml de PBS sem cálcio e magnésio e adicionados
2ì l de Yo-pro (100ì M), sendo incubados por 20 minutos a temperatura ambiente. Após este
período, foram adicionados 10ì l de IP (6ì M) e incubados a temperatura ambiente por 10 minutos.
Ao término da incubação, as amostras foram imediatamente analisadas no citômetro de fluxo.
Os dados foram analisados pelo MINITAB Realease, 14, Statistical Software (Pennsylvania,
EUA). Após verificação da homogeneidade dos resíduos e distribuição das variáveis, os dados
foram submetidos à análise de variância e comparados pelo teste Tukey (p<0,05). Em relação à
média de espermatozóides vivos, com ou sem DNA exógeno, não foram observados efeitos da
adição de DNA e do tempo de incubação aos 60 (68,5±6,5 e 68,8±4,9), 90 (57,5±10,3 e 59,57±8,1)
e 120 (46,4±8,3 e 51,9±2) minutos. O mesmo foi observado nos índices de espermatozóides em
apoptose, incubados com ou sem DNA exógeno, aos 60 (11,7±2 e 10,1±2,2), 90 (11,5±2,1 e
10,7±2,5) e 120 (17,9±4,5 e 18,8±6) minutos e em necrose aos 60 (2,9±1,7 e 4,1±1,4), 90 (3,5±1,4
e 4±0,7) e 120 (2,5±1,7 e 5,3±3,2) minutos. Entretanto, com relação aos índices de espermatozóides
em necrose inicial e/ou apoptose tardia, embora não tenha sido observado efeito da adição do
DNA exógeno, foi observado efeito do tempo de incubação aos 60 (16,9±2,9 e 16,9±2,9), 90
(27,5±7 e 25,7±6) e 120 (33,3±3,9 e 23,9±7,2). Conclui-se que a adição de DNA exógeno não
afeta a média de espermatozóides vivos, em apoptose, em necrose e em necrose inicial e/ou
apoptose tardia, mas o tempo de incubação induz necrose inicial e/ou apotose tardia nos
espermatozóides.
Suporte FAPESP Processos nº 03/07456-8 e 03/10234-7
s538
EFEITO DO TEMPO DE INCUBAÇÃO SOBRE O ÍNDICE DE TRANSFECÇÃO DE

ESPERMATOZÓIDES BOVINOS
Feitosa, W.B.; Avanzo, J.L.; Mendes, C.M.; Goissis, M.D.; Nicacio, A.C.;
Delboni, C.C.; Visintin, J.A.; Assumpção, M.E.O.A.
Departamento de Reprodução Animal, FMVZ – USP, São Paulo, SP, Brasil, wfeitosa@usp.br
Os relatos da literatura referentes à cinética da interação do DNA exógeno com células espermáticas
são contraditórios. Enquanto alguns autores observaram aumento na quantidade de DNA exógeno
associado aos espermatozóides ao longo da incubação, outros autores relataram que este aumento
ocorreu rapidamente no início da incubação, seguido de uma fase platô. Deste modo, o objetivo
deste trabalho foi avaliar o efeito do tempo de incubação dos espermatozóides com moléculas de
DNA exógeno sobre o índice de transfecção. Para tal, 5 x 106 espermatozóides/ml foram incubados
com 500ng do plasmídeo pEYFP-Nuc (Clontech) por 60, 90 e 120 minutos. Após a incubação,
os espermatozóides foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2,5% em tampão TBE 1x
à 100V, para separar os espermatozóides das moléculas de DNA exógeno livres, evitando falsos
positivos. Após a eletroforese, os espermatozóides foram centrifugados a 200g por 5 minutos em
PBS sem cálcio e magnésio e o DNA extraído pelo método fenol clorofórmio. Para quantificar
os plasmídeos associados às células espermáticas foi efetuada a PCR quantitativa em tempo real
(Real time PCR) (ABIPrism® 7000 Sequence Detection System - Applied Biosystems, Darmstad,
Alemanha), utilizando o Platinum® SYBR® Green qPCR supermix – UDG com ROX (Invitrogen,
Califórnia, EUA). Em cada reação foram adicionados 12,5μl de Platinum® SYBR® Green; 0,5μl
de ROX; 5,6μl de H2O ultrapura livre de DNase; 5μl de amostra (1ug); 0,7μl do primer senso
(5’-ATGGCCGACAAGCAGAAGAAC-3’) e 0,7μl do primer anti-senso (5’-
TGCCGTCCTCGATGTTGTG-3’) na concentração de 500nM cada. A amplificação foi realizada
com 40 ciclos a 95°C por 15 segundos e 64°C por 1 minuto. Para análise da curva padrão e
confecção da equação da reta com a qual as amostras foram comparadas, a mesma reação foi
realizada com o plasmídeo pEYFP-Nuc nas concentração de 25; 2,5; 0,25; 0,025 e 0,0025ng. Os
dados foram analisados pelo programa MINITAB Realease, 14, Statistical Software (Pennsylvania,
EUA). Previamente foram verificados a homogeneidade e a distribuição dos dados. Após
atenderem estas premissas estatísticas, os dados foram submetidos à análise de variância e
comparados pelo teste Fisher´s (p<0,05). A equação da reta formada pela amplificação do pEYFP-
Nuc nas concentrações de 25; 2,5; 0,25; 0,025 e 0,0025 apresentou eficiência de R2 = 0,9987,
onde R2 igual a 1 significa 100% de eficiência. A quantidade de DNA exógeno associado aos
espermatozóides variou durante a incubação. Aos 120 minutos de incubação observou-se maior
quantidade de DNA exógeno associado aos espermatozóides (0,0092ng), diferindo dos 90
(0,0054ng) e 60 minutos (0,0066ng). Conclui-se que o aumento no tempo de incubação aumenta
a quantidade de DNA exógeno associado aos espermatozóides.
Suporte FAPESP Processos nº 03/07456-8 e 03/10234-7
s539
USO DE ESPERMATOZÓIDES BOVINOS COMO VETORES DE DNA EXÓGENO

NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES TRANSGÊNICOS
Simões, R.; Binelli, M.; Milazzotto, M.P.; Feitosa, W.B.; Nicacio, A.C.;
Mendes, C.M.; Visintin, J.A.; Assumpção, M.E.O.A.
Departamento de Reprodução Animal - FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil, resimoes@usp.br
A introdução de DNA exógeno nas células de animais domésticos e a sua integração nas células
germinativas são de grande valia para a agropecuária e para as indústrias de xenotransplantes,
biorreatores e farmacêutica. Existem diversos métodos para produzir animais transgênicos,
entretanto, quando se trata de bovinos, estes métodos oferecem baixa repetibilidade, alto custo e
baixa eficiência de integração do transgene. Para contornar estas dificuldades, espermatozóides
podem ser utilizados como vetores de DNA exógeno (TGME). Esta tecnologia permite carrear
DNA exógeno para o oócito no momento da fecundação, uma vez que existe uma ligação
espontânea entre espermatozóide e DNA exógeno, não necessitando de equipamentos caros e
nem de mão de obra especializada. O objetivo deste estudo foi comparar a eficiência de quatro
métodos de TGME (eletroporação, lipofecção, capacitação espermática induzida pelo cálcio
ionóforo - CaI e incubação espermática) na PIV de embriões bovinos transgênicos, para estabelecer
o melhor protocolo de incorporação do DNA exógeno no espermatozóide. Oócitos provenientes
de vacas de abatedouro foram maturados in vitro no meio TCM199 + 10%SFB + FSH + hCG +
E2 + piruvato e gentamicina à 39oC, 5%CO2 em ar e alta umidade, por 24hs. Após a separação
por gradiente Percoll (45/90%) a 600g por 30min, os espermatozóides foram lavados no meio
Talp sêmen (200g/5min). Do sedimento, 5X106 espermatozóides foram destinados aos grupos
experimentais: eletroporação (500V), lipofecção (Lipofectene®, Qiagen, Canadá), capacitação
espermática (250nM de CaI por 5 minutos e incubação com o DNA exógeno por 1 hora) ou
incubação espermática (1 hora). O DNA exógeno utilizado foi o EYFP (Clonetech, USA), na
concentração de 500ng/ml. Oócitos inseminados com espermatozóides não tratados foram usados
como grupo controle. Para a fecundação in vitro, microgotas contendo 20 oócitos maturos foram
inseminadas com 100.000 espermatozóides por 18hs. Os presumíveis zigotos foram co-cultivados
em meio SOFaa em monocamada de células da granulosa a 39oC, 5% CO2 em ar e alta umidade.
Os índices de blastocisto foram analisados por ANOVA. Os embriões dos grupos experimentais
e do controle foram destinados à PCR para detecção do EYFP internalizado, utilizando par de
primers desenhado especificamente para este DNA exógeno, sendo positivo os embriões que
após eletroforese apresentaram fragmento de 440pb. Os fragmentos de 440pb dos embriões
positivos foram seqüenciados para comprovar se correspondiam ao EYFP. Os tratamentos por
eletroporação (17,95%) e capacitação espermática (15,12%) mostraram ser mais eficiente na
produção de embriões positivos para o EYFP quando comparados à lipofecção (6,25%). A
incubação espermática (12,5%) não apresentou diferença significante em relação aos demais
grupos. O sequenciamento dos produtos de PCR positivos para o EYFP demonstrou 100% de
homologia com os nucleotídeos do EYFP depositados no GenBank. Em conclusão, é possível
utilizar espermatozóides como vetores de DNA exógeno para produção in vitro de embriões
bovinos transgênicos.
Suporte financeiro: FAPESP 03/08542-5 e 03/07456
s540
USO DE VETOR LENTIVIRAL CARREANDO shRNA PARA KNOCKDOWN DO

GENE DA MIOSTATINA NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
Milazzotto, M.P.1; Feitosa, W.B.1; Strauss, B.E.2; Bajgelman, M.C.2; Simões, R.1;
Martins, L.F.1; Assumpção, M.E.O.A.1; Visintin, J.A.1
1
Departmento de Reprodução Animal–Universidade de São Paulo/Brasil. 2Instituto do
Coração-Hospital das Clínicas-São Paulo/Brasil. mazamila@hotmail.com
A miostatina é uma proteína que atua como regulador negativo do crescimento do músculo
esquelético. Durante a embriogênese, é expressa pelas células musculares esqueléticas em
desenvolvimento e regula o número final de fibras musculares, tornando-se importante alvo para
estudo do desenvolvimento de animais de produção. O knockdown da miostatina durante a
embriogênese pode representar importante ferramenta no controle do desenvolvimento muscular
em bovinos da raça Nelore. Os small interfering RNAs (siRNAs) são pequenas moléculas de
RNA que se ligam ao RNAm com seqüência complementar para sua degradação via processo
denominado interferência de RNA, sendo nova opção para essa manipulação genética. Estas
moléculas têm sido utilizadas para geração de animais transgênicos apresentando knockdown de
genes de interesse. No entanto, siRNAs precisam ser constantemente carreados ou produzidos
nas células. Neste trabalho, foi sintetizado um oligonucleotídeo codificando uma estrutura em
forma de grampo (shRNA). Este shRNA possui um sinalizador poli(T) no final, uma seqüência
em forma de alça no meio e uma estrutura principal de 19 nucleotídeos derivada do RNAm da
miostatina. Este oligonucleotídeo foi inserido num vetor de expressão lentiviral cuja expressão
foi dirigida pelo promotor U6 de camundongo seguido pelo promotor da ubiquitina C,
direcionando a expressão do gene da GFP. Oócitos oriundos de abatedouro foram maturados in
vitro e após a remoção das células do cumulus, foram microinjetados no espaço perivitelínico
lentivirus carreando este vetor de expressão (2.5x106UI/mL). Oócitos maturos não microinjetados
foram utilizados como controle. Após a microinjeção, os oócitos foram fecundados in vitro por
18hs e cultivados em meio SOFaa com monocamada de células da granulosa por 9 dias a 38º.C
e 5%CO2 em ar. Após 4 dias de cultivo, os embriões foram avaliados por microscopia de
epifluorescência, sendo considerados positivos os que emitiram fluorescência verde quando
expostos ao filtro apropriado. Dos 65 oócitos microinjetados, 95,38% clivaram (62), 78,41%
(51) emitiram fluorescência verde, e 44,61% atingiram o estádio de blastocisto. Após a eclosão,
somente 3,07% (2) continuaram emitindo fluorescência. Com relação ao grupo controle, 93,84%
(61/65) clivaram, 38,46% (25/65) atingiram o estádio de blastocisto e nenhum emitiu
fluorescência. Os resultados demonstraram que vetores lentivirais carreando shRNA para
knockdown do gene da miostatina é uma opção nova e eficiente para produção de embriões
transgênicos, visando aumento da massa muscular.
Suporte financeiro: FAPESP projeto 03/00156-9
s541
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E MORFOLÓGICA DE FIBROBLASTOS

FETAIS BOVINOS EM DIFERENTES PASSAGENS EXPRESSANDO O GENE PARA
A PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE (GFP)
Bressan, F.F.1; Braga, F.C.2; De Bem, T.H.C.3; Merigue, G.K.3; Miranda, M.3;
Mesquita, L.G.3; Meirelles, F.V.3
1
Departamento de Reprodução Animal – FMVZ/USP, Pirassununga-SP, Brasil. 2Departamento
de Cirurgia e Anatomia – FMVZ/USP, São Paulo-SP. 3Departamento de Ciências Básicas –
FZEA/USP – Pirassununga-SP, Brasil. fabianabressan@usp.br
Linhagens celulares geneticamente modificadas podem ser utilizadas para a produção de animais
transgênicos. A produção de tais linhagens, porém, demanda além de manipulação, um tempo de
cultivo adicional em relação àquele dispendido com as linhagens celulares não-transgênicas.
Pretendeu-se neste trabalho caracterizar aspectos moleculares e fisiológicos do crescimento das
células modificadas geneticamente durante seu cultivo, comparando-os com células controle.
Foi testada a hipótese de a introdução do material genético estranho ao genoma celular alterar a
fisiologia do crescimento da célula e o potencial de manutenção da viabilidade celular ao longo
das passagens in vitro. Para tal, utilizou-se a técnica citogenética de cariotipagem para a análise
da anormalidade numérica cromossomal, o Ensaio Cometa para a verificação da fragmentação
nuclear, análise da proporção de transcritos dos genes Bax e Bcl2 e da intensidade de potencial de
membrana mitocondrial para a detecção da apoptose. Células expressando GFP foram
descongeladas na 11ª passagem (11ª p) e mantidas em cultivo até a 20ª p. Já as células controle
foram cultivadas desde sua 4ª p até a 20ª p, para o acompanhamento das fases iniciais de cultivo.
Considerou-se baixas passagens aquelas compreendendo até a 9ª p, e portanto foi somente avaliado
nas células controle; médias passagens entre a 14ª e 16ª e altas passagens entre 19ª e 21ª. Para a
análise da cariotipagem analisou-se 30 metáfases de células controle em altas e em baixas
passagens e de células transgênicas em altas passagens. Não houve diferença na porcentagem de
células apresentando anormalidade cromossomal (P>0,05). Quanto à fragmentação de DNA, os
grupos GFP em alta passagem e controle em baixa passagem não apresentaram diferença,
entretanto o grupo controle em alta passagem apresentou maior taxa de fragmentação (P<0,05).
O potencial de membrana mitocondrial foi investigado através da coloração com o reagente
MitoTracker RedTM. Cincos grupos foram comparados (baixa, média e alta passagem relativas às
células controle e média e alta passagem relativas às células expressando GFP) e não foi observada
diferença (P=1). A expressão dos genes Bax e Bcl2 nas células controle apresentou uma tendência
à diminuição da apoptose ao longo das primeiras passagens (4ªp à 12ªp), possivelmente explicado
pela adaptação das células ao ambiente in vitro. Considerando a evolução do cultivo, entre as
passagens médias e altas houve uma tendência ao aumento da resposta pró-apoptótica. Entretanto,
tais tendências não foram explicitamente observadas nas células GFP, que apresentaram um
aumento na razão Bax/Bcl2 nas passagens médias, seguido de uma pequena diminuição em altas
passagens. O tempo de cultivo in vitro pode ter influenciado estes resultados, uma vez que durante
o experimento o grupo controle permaneceu em cultivo por 17 passagens e as células transgênicas
por 10 passagens. Conclui-se que há diferenças no comportamento do cultivo quando comparadas
células controle e GFP e também quando comparadas diferentes passagens. Tais diferenças não
são relacionadas com anormalidades no cariótipo ou com a intensidade do potencial de membrana
mitocondrial, mas sim com a fragmentação de DNA e a relação de expressão de genes pró-
apoptóticos e anti-apoptóticos. Suporte financeiro: FAPESP, processo no. 05/00800-0.
s542
REAÇÃO ACROSSOMAL EM ESPERMATOZÓIDES BOVINOS INCUBADOS COM

OU SEM DNA EXÓGENO
Feitosa, W.B.; Martins, L.F.; Rovegno, M.; Simões, R.; Delboni, C.C.; Marques, M.G.;
Visintin, J.A.; Assumpção, M.E.O.A.
Departamento de Reprodução Animal – FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil; wfeitosa@usp.br
Células espermáticas de várias espécies têm sido utilizadas como vetores de DNA exógeno durante
a fecundação, produzindo animais transgênicos. Horan et al. (Archives of Andrology. v. 26, p.
83-92, 1991) observaram que não houve diferença na porcentagem de DNA exógeno associado
aos espermatozóides com ou sem reação acrossomal. Entretanto, não se sabe qual o efeito da
adição do DNA exógeno na integridade da membrana acrossomal dos espermatozóides. O objetivo
deste trabalho foi avaliar o efeito da adição do DNA exógeno e do tempo de incubação na indução
da reação acrossomal de espermatozóides bovinos. O sêmen foi descongelado e separado em
gradiente Percoll (45/90%) a 600g por 30 minutos, sendo o sedimento lavado no meio TALP-
Sêmen a 200g por 5 minutos. Os espermatozóides foram ressuspensos no meio de fecundação
(sem heparina) na concentração de 5 x 106/ml e incubados a 39°C e 5% CO2 em ar com (grupo
DNA) ou sem (controle) 500ng/ml do plasmídeo pEYFP-Nuc (Clonetech, BD, Biosciences) por
4 horas. A reação acrossomal foi avaliada às 0, 1, 2, 3 e 4 horas de incubação, utilizando a sonda
fluorescente FITC-PSA (Molecular Probes), que cora em verde a região acrossomal dos
espermatozóides com reação acrossômica. Para a avaliação da reação acrossômica, 150μl de
meio FIV contendo 5 x 106sptz/ml foram incubados com 50μl de FITC-PSA à temperatura
ambiente por 15 minutos. Foram avaliadas 200 células espermáticas em Microscópio de
Epifluorescência (Zeiss). Para análise estatística foi utilizado o aplicativo MINITAB realease,
14, Statistical Software, empregando o teste Tukey com p<0,05. Não foi observado efeito da
adição do DNA exógeno na indução da reação acrossomal (85,6%, 78,1%, 67,5%, 69,9% e
61,0%) quando comparado ao grupo controle (85,6%, 75,3%, 76,2%, 67,3% e 68,25%)
respectivamente às 0; 1; 2; 3 e 4 horas de incubação. Contudo, houve aumento da porcentagem
de reação acrossomal ao longo das 4 horas de incubação. Conclui-se que não houve influência
do DNA sobre a reação acrossomal, entretanto, o tempo de incubação apresentou efeito na
integridade acrossomal dos espermatozóides.
s543
INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDES

BOVINOS INCUBADOS COM OU SEM DNA EXÓGENO
Feitosa, W.B.; Rovegno, M.; Milazzotto, M.P.; Simões, R.; Gonçalves, J.S.A.;
Nicacio, A.C.; Visintin, J.A.; Assumpção, M.E.O.A.
Departamento de Reprodução Animal – FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil; wfeitosa@usp.br
A membrana plasmática apresenta importante papel na interação do DNA exógeno com

espermatozóides. Atikinson et al. (Molecular Reproduction Development, v. 29, p. 1-5, 1991)
não observaram diferença na porcentagem de espermatozóides íntegros associados às moléculas
de DNA exógeno em comparação aos espermatozóides com lesão da membrana plasmática.
Entretanto, observaram diferença no padrão de localização da ligação do DNA exógeno, o que
pode influenciar a eficiência da transferência gênica mediada por espermatozóides. Embora a
integridade da membrana plasmática influencia na ligação do DNA exógeno com os
espermatozóides, não se sabe se a adição de DNA exógeno altera a integridade da membrana
plasmática. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do DNA exógeno na
integridade da membrana plasmática de espermatozóides bovinos. O sêmen foi descongelado e
separado em gradiente Percoll (45/90%) a 600g por 30 minutos, sendo o sedimento lavado no
meio TALP-sêmen a 200g por 5 minutos. Os espermatozóides foram ressuspensos no meio de
fecundação (sem heparina) na concentração de 5 x 106/ml e incubados a 39°C, 5% CO2 em ar e
alta umidade com (grupo DNA) ou sem (controle) 500ng/ml do plasmídeo pEYFP-Nuc
(Clonetech, BD, Biosciences) por 4 horas. A integridade da membrana plasmática foi avaliada às
0, 1, 2, 3 e 4 horas de incubação, utilizando as sondas fluorescentes Iodeto de Propídeo e Hoechst
33342 (Sigma). Os espermatozóides com a membrana plasmática íntegra fluorescem apenas em
azul, enquanto que os espermatozóides com lesão da membrana plasmática fluorescem em azul
e vermelho. Para a avaliação da integridade da membrana plasmática, 150l de meio FIV contendo
5 x 106sptz/ml foram incubados com 2μl de Hoechst e 3μl de Iodeto de propídeo à temperatura
ambiente por 15 minutos. Foram avaliadas 200 células espermáticas em Microscópio
Epifluorescente (Zeiss). Para análise estatística foi utilizado o aplicativo MINITAB realease, 14,
Statistical Software (Pennsylvania, EUA), empregando o teste Tukey com p<0,05. Não foi
observado efeito da adição do DNA exógeno na integridade de membrana plasmática (68,6%,
45,9%, 28,0%, 21,2% e 13,2%) quando comparado com o grupo controle (68,6%, 47,8%, 31,5%,
22,5% e 15,6%) respectivamente às 0; 1; 2; 3 e 4 horas de incubação. Entretanto, houve diminuição
da integridade da membrana plasmática ao longo das 4 horas de incubação. Conclui-se que a
adição do DNA não altera a integridade da membrana plasmática, entretanto, a membrana
plasmática dos espermatozóides sofre efeito do tempo de incubação.
s544
EXPRESSÃO QUALITATIVA DO RNAm DO FGF8 NA PLACENTA DE BOVINOS

CLONADOS E DE MONTA NATURAL
Artoni, L.P.1; Garbelotti, F.1; Castilho, A.C.2; Machado, M.F.2; Price, C.3;
Papa, P.C.1; Buratini Jr., J.2
1
Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil; 2 Departamento de Fisiologia do Instituto de
Biociências da Universidade Estadual Paulista, Botucatu, Brasil; 3 Centro de Pesquisa em
Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Montreal, St-
Hyacinthe, Canadá; artoni@usp.br.
O FGF8 foi inicialmente identificado como um fator de crescimento induzido por andrógeno
(AIGF) encontrado na linhagem celular SC-3 de carcinoma mamário andrógeno-dependente
(Tanaka et al., 1992). A família dos FGFs parece desempenhar importantes papéis na angiogênese
e no desenvolvimento, de maneira que a depleção particular de alguns FGFs pode acarretar em
severas anormalidades (Xu et al., 1998). A mutação FGF8-/- é potencialmente letal para embriões
(Powers et al., 2000). Segundo a literatura o FGF8 ativa preferencialmente os receptores FGFR4
e FGFR3c (Ornitz et al., 1996) e sugere-se a sua participação na modulação da proliferação
celular no embrião em desenvolvimento (Heikinheimo et al., 1994; Crossley, Martin, 1995).
Outro receptor que se liga ao FGF8, mas em menor intensidade é o FGFR2c (Ornitz et al., 1996).
Cruzamento entre dois camundongos heterozigotos FGFR2c que tiveram depleção de exons, foi
observado que os indivíduos homozigotos recessivos apresentaram morte embrionária, o que
sugere falha na formação da placenta (Xu et al., 1998). Entretanto a expressão do FGF8 na
placenta bovina ainda não foi investigada, de maneira que para este propósito, amostras de placenta
bovina de gestações obtidas por monta natural foram coletadas aos dias 90, 150, 210 e 270 e
amostras obtidas de gestação a partir de transferência nuclear foram coletadas aos 270 dias, após
cesariana. As amostras foram rapidamente congeladas em nitrogênio líquido e o RNAm extraído
seguindo o protocolo de Trizol (Invitrogen, USA) e o cDNA transcrito usando a enzima Superscript
III® (Invitrogen, USA). Através da técnica de RT-PCR, um total de 40 ciclos foi utilizado para a
amplificação e avaliação da expressão qualitativa do RNAm do FGF8, FGFR4 e FGFR3c, os
quais foram normalizados com GAPDH. A expressão do RNAm do FGF8 foi observada aos 150
dias, 270 dias e aos 270 dias de gestações obtidas após tranferência nuclear. O RNAm do FGFR4
foi observado em gestações de 90 e 150 dias. Não houve expressão do RNAm do FGFR3c não
foi observado nas placentas bovinas estudadas. Técnicas mais específicas e mais sensíveis são
necessárias para a quantificação relativa deste fator de crescimento e de seus receptores, uma vez
que sua expressão é bastante baixa na placenta bovina. A partir dos resultados obtidos, sugere-se
modulação do desenvolvimento placentário na metade e ao final da gestação, enquanto que o
FGFR4 pode estar associado à modulação do desenvolvimento placentário aos 90 dias de gestação,
ativado por outro membro da família FGF: FGF1, FGF2 ou FGF4 (Bacczyk et al., 2005; Ornitz
et al., 1996; Reuss, Bohlen, 2003).
s545
USO DE LENTIVIRUS NA PRODUÇÃO DE FIBROBLASTOS FETAIS BOVINOS

EXPRESSANDO O GENE PARA A PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE (GFP)
Bressan, F.F.1; Bajgelman, M.C.2; Krieger, J.E.2; Strauss, B.E.2; Meirelles, F.V.3
1
Departamento de Reprodução Animal – FMVZ/USP, Pirassununga-SP, Brasil. 2INCOR/HC/
FMUSP – São Paulo-SP, Brasil. 3Departamento de Ciências Básicas – FZEA/USP –
Pirassununga-SP, Brasil. fabianabressan@usp.br
O uso da transferência de genes na produção animal exibe diversas aplicações em potencial,

como a criação de modelos para estudos, aumento nos índices zootécnicos dos animais e o uso
destes como biorreatores da indústria farmacêutica. O mecanismo lentiviral de transgênese
apresenta um grande número de vantagens em relação aos outros métodos, como uma alta
capacidade intrínseca de integração no genoma, uma transdução eficiente, estável e duradoura
em uma grande variedade de tipos celulares in vitro e in vivo, inserção de genes específicos em
cromossomos de células-alvo em divisão ou não, além do que, o “silenciamento” de genes inseridos
ainda não foi observado quando lentivírus foram utilizados na transgênese. Pretendeu-se no
presente trabalho produzir fibroblastos fetais bovinos que contenham uma construção gênica da
Proteína Fluorescente Verde (GFP). Tais células serão, em experimentos futuros, utilizadas nas
etapas iniciais da produção de animais geneticamente modificados. O lentivírus utilizado apresenta,
além da região codificadora da GFP, um promotor da ubiquitina. Não apresenta regiões de
replicação, proporcionando a segurança necessária para sua manipulação. A transdução foi
realizada mediante incubação das células em meio de cultivo acrescido do lentivírus, cuja titulação
viral foi previamente estabelecida. Foram realizadas neste trabalho transduções em nove poços
de cultivo de uma placa de 96 poços. Deste modo, foi possível a realização em triplicata da
transdução de três confluências celulares diferentes (50, 70 e 90%) e três concentrações virais
diferentes (1, 0,5 ou 0,25 partículas virais por célula). Todos os poços receberam 8ug/ml de
polibreno. Após 2 horas de incubação acrescentou-se novo meio de cultivo, trocado após 24
horas. Sete poços apresentaram células viáveis 24h após a infecção e a possibilidade da continuação
do cultivo. As células tiveram sua fluorescência analisada por citometria de fluxo, e a positividade
relativa à fluorescência variou entre 2,95% e 9,54%. Os grupos submetidos à confluência de
50% apresentaram 6,05% de células positivas, os grupos com 70% apresentaram 6,83% e os
grupos com 90% apresentaram 5,97%. Os cultivos submetidos à concentração de 1:1 apresentaram
9,54%, os grupos com 1:0,5 apresentaram 7,78% e os grupos com 1:0,25 apresentaram 3,89% de
células positivas. Quando comparados os resultados entre as confluências celulares
independentemente da concentração viral, não foi observado efeito na positividade de fluorescência
celular (P>0,05). Quando comparados os resultados entre as diferentes concentrações virais,
houve diferença entre os grupos (P<0,05), sendo que o grupo que recebeu menor quantidade de
partículas virais apresentou menor número de células positivas comparado aos dois outros grupos.
Os sete cultivos celulares foram posteriormente submetidos ao procedimento de separação quanto
à intensidade de fluorescência mediante citometria de fluxo resultando em linhagens expressando
a GFP em praticamente 100% das células de maneira estável por pelo menos 21 passagens. Em
conclusão, o estabelecimento de uma linhagem viável transgênica para o gene da Proteína
Fluorescente Verde mediante mecanismo de transdução lentiviral foi possível e eficaz, e sua
produção foi independente da confluência celular apresentada neste trabalho e dependente da
concentração viral utilizada.
s546
EFEITO DA ADIÇÃO DE DNA EXÓGENO NA MOTILIDADE DE

ESPERMATOZÓIDES EM BOVINOS
Feitosa, W.B.; Milazzotto, M.P.; Simões, R.; Goissis, M.D.; Peres, M.A.;
Golçalves, J.S.A.; Visintin, J.A.; Assumpção, M.E.O.A.
Departamento de Reprodução Animal – FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil, wfeitosa@usp.br
A motilidade média dos espermatozóides possui um papel importante na transfecção de células

espermáticas. Segundo Horan et al. (Archives of Andrology, v. 26, p. 83-92, 1991) espermatozóides
com boa motilidade possuem maior habilidade de ligação com moléculas de DNA exógeno,
quando comparados aos espermatozóides sem motilidade. Embora a motilidade apresente efeito
na interação do DNA exógeno com as células espermáticas, ainda não se sabe o efeito da adição
do DNA exógeno sobre a motilidade dos espermatozóides. Assim, o objetivo deste trabalho foi
avaliar o efeito do DNA exógeno e do tempo de incubação sobre a motilidade média dos
espermatozóides bovinos. O sêmen foi descongelado e separado em gradiente Percoll (45/90%)
a 600g por 30 minutos, sendo o sedimento lavado no meio TALP-Sêmen a 200g por 5 minutos.
Os espermatozóides foram ressuspensos no meio de fecundação (sem heparina) na concentração
de 5 x 106/ml e incubados a 39°C, 5% CO2 em ar e alta umidade, com (grupo DNA) ou sem
(controle) 500ng/ml do plasmídeo pEYFP-Nuc (Clonetech, BD, Biosciences) por 4 horas. A
motilidade espermática foi avaliada às 0, 1, 2, 3 e 4 horas de incubação em microscopia óptico.
Para análise estatística foi utilizado o aplicativo MINITAB realease, 14, Statistical Software
(Pennsylvania, EUA), empregando o teste Tukey com p<0,05. Não houve efeito da adição do
DNA exógeno na média da motilidade espermática, respectivamente, nos grupos sem e com
DNA à 0 hora (79,5% e 79,5%), à 1 hora (58,0% e 57,5%), às 2 horas (35,0% e 34,5%), às 3
horas (15,5% e 15,0%) e às 4 horas (4,5% e 4,5%) de incubação. Porém, tanto no grupo controle
quanto no grupo com DNA, a motilidade média reduziu significativamente ao longo das 4 horas
de incubação. Conclui-se que a adição do DNA não altera a motilidade espermática, entretanto,
a motilidade dos espermatozóides sofre efeito do tempo de incubação.
s547
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E MORFOLÓGICA DE FIBROBLASTOS

FETAIS BOVINOS EM DIFERENTES PASSAGENS EXPRESSANDO O GENE PARA
A PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE (GFP)
Bressan, F.F.1; Braga, F.C.2; De Bem, T.H.C.3; Merigue, G.K.3; Miranda, M.3;
Mesquita, L.G.3; Meirelles, F.V.3
1
Departamento de Reprodução Animal – FMVZ/USP, Pirassununga-SP, Brasil. 2Departamento
de Cirurgia e Anatomia – FMVZ/USP, São Paulo-SP. 3Departamento de Ciências Básicas –
FZEA/USP – Pirassununga-SP, Brasil. fabianabressan@usp.br
Linhagens celulares geneticamente modificadas podem ser utilizadas para a produção de animais
transgênicos. A produção de tais linhagens, porém, demanda além de manipulação, um tempo de
cultivo adicional em relação àquele dispendido com as linhagens celulares não-transgênicas.
Pretendeu-se neste trabalho caracterizar aspectos moleculares e fisiológicos do crescimento das
células modificadas geneticamente durante seu cultivo, comparando-os com células controle.
Foi testada a hipótese de a introdução do material genético estranho ao genoma celular alterar a
fisiologia do crescimento da célula e o potencial de manutenção da viabilidade celular ao longo
das passagens in vitro. Para tal, utilizou-se a técnica citogenética de cariotipagem para a análise
da anormalidade numérica cromossomal, o Ensaio Cometa para a verificação da fragmentação
nuclear, análise da proporção de transcritos dos genes Bax e Bcl2 e da intensidade de potencial de
membrana mitocondrial para a detecção da apoptose. Células expressando GFP foram
descongeladas na 11ª passagem (11ª p) e mantidas em cultivo até a 20ª p. Já as células controle
foram cultivadas desde sua 4ª p até a 20ª p, para o acompanhamento das fases iniciais de cultivo.
Considerou-se baixas passagens aquelas compreendendo até a 9ª p, e portanto foi somente avaliado
nas células controle; médias passagens entre a 14ª e 16ª e altas passagens entre 19ª e 21ª. Para a
análise da cariotipagem analisou-se 30 metáfases de células controle em altas e em baixas
passagens e de células transgênicas em altas passagens. Não houve diferença na porcentagem de
células apresentando anormalidade cromossomal (P>0,05). Quanto à fragmentação de DNA, os
grupos GFP em alta passagem e controle em baixa passagem não apresentaram diferença,
entretanto o grupo controle em alta passagem apresentou maior taxa de fragmentação (P<0,05).
O potencial de membrana mitocondrial foi investigado através da coloração com o reagente
MitoTracker RedTM. Cincos grupos foram comparados (baixa, média e alta passagem relativas às
células controle e média e alta passagem relativas às células expressando GFP) e não foi observada
diferença (P=1). A expressão dos genes Bax e Bcl2 nas células controle apresentou uma tendência
à diminuição da apoptose ao longo das primeiras passagens (4ªp à 12ªp), possivelmente explicado
pela adaptação das células ao ambiente in vitro. Considerando a evolução do cultivo, entre as
passagens médias e altas houve uma tendência ao aumento da resposta pró-apoptótica. Entretanto,
tais tendências não foram explicitamente observadas nas células GFP, que apresentaram um
aumento na razão Bax/Bcl2 nas passagens médias, seguido de uma pequena diminuição em altas
passagens. O tempo de cultivo in vitro pode ter influenciado estes resultados, uma vez que durante
o experimento o grupo controle permaneceu em cultivo por 17 passagens e as células transgênicas
por 10 passagens. Conclui-se que há diferenças no comportamento do cultivo quando comparadas
células controle e GFP e também quando comparadas diferentes passagens. Tais diferenças não
são relacionadas com anormalidades no cariótipo ou com a intensidade do potencial de membrana
mitocondrial, mas sim com a fragmentação de DNA e a relação de expressão de genes pró-
apoptóticos e anti-apoptóticos. Suporte financeiro: FAPESP, processo no 05/00800-0.
s548
TRANSFERÊNCIA NUCLEAR EM SUÍNOS: AVALIAÇÃO DA MATURAÇÃO IN

VITRO DE OÓCITOS PARA PRODUÇÃO DE CITOPLASMAS RECEPTORES
Gerger, R.P.C.; Marques M.G.; Nascimento, A.B.; Mendes, C.M.; Nicacio, A.C.;
Brandão, A.C.; Assumpção, M.E.O.A.; Visintin, J.A.
Departamento de Reprodução Animal – FMVZ/USP, São Paulo – SP, 05508-900, Brasil.

renatogerger@yahoo.com.br
O objetivo deste estudo foi avaliar o tempo de maturação de oócitos suínos em 3 períodos (36,
40 e 44 horas) para produção de citoplasmas receptores em Metáfase II, estabelecendo o melhor
momento para enucleação. Oócitos de grau 1 (IETS) provenientes de ovários de matadouro
foram maturados em TCM 199, suplementado com 3,05mM glicose, 0,91mM piruvato de sódio,
10% fluido folicular suíno, 0,57mM cisteína, 10ng EGF/ml, 10UI eCG/ml e 10UI hCG/ml por
22 horas, seguido por mais 14 (grupo de 36h), 18 (grupo de 40h) ou 22 horas (grupo de 44h) em
meio sem hormônio. Ao final de cada período de maturação, os oócitos tiveram as células do
cumulus oophorus removidas completamente por exposição à solução de hialuronidase (5mg/
ml) e corados com 5μg/ml de Hoechst 33342 em microgotas de TCM199 e avaliados quanto à
maturação em microscópio de epifluorescência (Zeiss). O período de maturação em que a placa
metafásica e o 1º corpúsculo polar estavam em posição adjacente foi considerado apropriado
para enucleação dos oócitos. Os resultados foram analisados pelo teste do Qui-Quadrado (χ2)
com nível de significância de 5%. Houve aumento da porcentagem de oócitos maturos no decorrer
dos períodos de maturação (7% - 7/100; 59% – 59/100; 75% - 77/102, respectivamente, para
36h; 40h e 44h). Quanto à posição de adjacência da placa metafásica e do 1º corpúsculo polar
(4% - 4/100; 36% – 36/100; 47% - 48/102, respectivamente, para 36h; 40h e 44h), não havendo
diferença entre os grupos de 40 e 44 horas. Sendo assim, o grupo de 44 horas de maturação, por
ter maior número de oócitos em Metáfase II, é o recomendado para enucleação e produção de
citoplasmas receptores.
Suporte financeiro FAPESP 03/00403-6
s549
ASSOCIAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DO GENE OCT-4 E A PRODUÇÃO DE

EMBRIÕES BOVINOS POR TRANSFERÊNCIA NUCLEAR
Camargo, L.S.A.1,3; Viana, J.H.M.1; Ramos, A.A.2; Sá, W.F.1; Ferreira, A.M.1
1
Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG; 2Epamig, Juiz de Fora, MG;
3
camargo@cnpgl.embrapa.br
Oct-4 é um transcrito expresso em embriões em estádio de pré-implantação e está associado à

totipotência celular, sendo usado como marcador para células tronco. A reprogramação apropriada
do núcleo somático parece ser importante para embriões clones alcançarem a totipotencia e
desenvolverem nos estádios subseqüentes. O presente trabalho objetivou avaliar a relação entre
os níveis de expressão do gene Oct-4 em embriões com oito células, produzidos por fecundação
in vitro ou transferência nuclear, com a taxa de produção de blastocistos. Embriões bovinos com
oito células foram produzidos por fecundação in vitro (FIV) ou transferência nuclear com células
somáticas (TNCS) obtidas de tecido muscular fetal. Embriões FIV e TNCS foram cultivados em
meio G1.1 adicionado de BSA por 72h a 38,5ºC em 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2. Após
72h, os embriões foram transferidos para o meio G1.2 e cultivados até o oitavo dia da fecundação
no mesmo ambiente atmosférico. Alguns embriões em estádios de oito células foram congelados
e armazenados em N2 líquido, até extração do RNA, para avaliação da expressão do gene Oct-4.
O mRNA foi extraído de embriões individuais e a quantificação do cDNA realizada em PCR em
tempo real e normalizada com a expressão do gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH),
usado como gene de referência endógeno. A análise dos resultados do PCR quantitativo foi
realizada usando-se o método 2-ΔΔCT, sendo os resultados expressos em relação ao menor valor
encontrado nos embriões fecundados in vitro (embrião referência). Quantificou-se a expressão
de embriões com oito células de seis baterias de fecundação in vitro (n=22 embriões) e de
transferência nuclear (n=24 embriões). As taxas de blastocistos nas baterias foram calculadas
em relação ao número de embriões com oito células. Resultados de taxa de blastocistos e expressão
relativa do gene Oct-4 (média±EPM) foram submetidos à análise de variância e a associação
entre a expressão do Oct-4 nos embriões de oito células (média por embrião em cada bateria )
com a taxa de blastocistos foi analisada pelo método da correlação de Pearson. Apesar de
apresentar valores menores, a expressão relativa do gene Oct-4 nos embriões de oito células
produzidos por fecundação in vitro não diferiu (P>0,05) dos produzidos por TNCS (9,87±2,43
vs. 13,02±2,89, respectivamente), bem como não diferiu (P>0,05) a taxa de blastocistos
(51,4±8,9% vs. 40,5±2,7%, respectivamente). Contudo, a expressão relativa do Oct-4 nos embriões
de TNCS com oito células apresentou alta correlação (R=0,90; P=0,012) com a taxa de produção
de blastocistos, enquanto nos embriões fecundados in vitro a correlação foi menor (R=0,32) e
não significativa (P>0,05). Esses resultados sugerem que, embora não exista diferença na expressão
relativa do Oct-4 entre embriões de oito células produzidos por fecundação in vitro ou TNCS, a
expressão deste gene neste estádio pode ser mais crítica para o desenvolvimento até blastocistos
para os embriões de TNCS, podendo ser uma conseqüência de reprogramação e ativação do gene
antes da transição materno-zigótica nesses embriões.
s550
Resumos:
OUTROS
s551
s552
PROPORÇÃO SEXUAL NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

UTILIZANDO ESPERMATOZÓIDES “X” SEXADOS POR CENTRIFUGAÇÃO EM
GRADIENTE DE DENSIDADE: RESULTADOS PRELIMINARES
Resende, M.V.1; Perini, A.P.1; Lucio, A.C.2; Tetzner, T.A.D.1;

Vantini, R.1; Hossepian de Lima, V.F.M.1
1
DMVPRA-FCAV-UNESP, 14.884-900, Jaboticabal-SP, Brasil, 2DZ-FCAV-UNESP, 14.884-
900, Jaboticabal-SP, Brasil. mvresende@yahoo.com.br
O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma técnica de centrifugação em gradiente de densidade
para separação de espermatozóides X e Y provenientes de sêmen bovino congelado e verificar o
desvio da proporção sexual dos embriões produzidos in vitro pela Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR). O preparo das soluções para formação do gradiente foi realizado diluindo-se o Iodixanol
(OptiPrepTM) em DMEM + 0.3% de BSA Fração V em camadas de 2,0mL com 20, 21 e 22%. As
camadas do gradiente foram dispostas da maior concentração (fundo do tubo) para a menor em
tubos cônicos de 15mL. As doses de sêmen foram descongeladas em água e o diluidor foi removido
com auxílio de duas lavagens por centrifugação a 36xg por 5min. Foram depositados, em cada
tubo do gradiente de densidade, cerca de 1mL do sêmen lavado contendo aproximadamente
40x106 espermatozóides. Os tubos foram centrifugados a 500xg por 15min a 22ºC. Decorrida a
centrifugação, os sobrenadantes foram descartados, os sedimentos recuperados e a motilidade e
o vigor dos espermatozóides avaliados. Os espermatozóides centrifugados recuperados foram
utilizados para fecundação in vitro de oócitos provenientes de abatedouro que foram maturados
in vitro durante 24h em meio TCM 199. Após 20h da inseminação, os prováveis zigotos foram
transferidos para placas de 4 poços, contendo 500ìL de meio SOF + 5mg/mL de BSA sem adição
de soro fetal bovino e mantidos em atmosfera úmida de 5% de CO2, 5% de O2 em ar, a uma
temperatura de 38,5ºC durante 7 a 8 dias. Embriões no estádio de blastocisto foram congelados
individualmente em microtubos contendo 10ìL de água ultra-pura e armazenados a -20°C até o
momento da PCR. Para a PCR, os embriões foram tratados com 5ìg de Proteinase K e cada
embrião foi dividido em duas reações distintas, uma primeira contendo uma seqüência do genoma
bovino - autossômica (280pb) e uma Y-específica (250pb), e uma segunda reação composta por
outra seqüência Y-específica (196pb). A reação foi composta de 1U de Taq DNA Polimerase,
2mM dNTPs, tampão para PCR, 2mM MgCl2, 5pmol/ìL de cada primer, sendo que as
amplificações foram realizadas em termociclador. Obteve-se uma recuperação média de 21% do
total de espermatozóides depositados sobre o gradiente de densidade, com motilidade progressiva
de 60% e vigor 3. No grupo sexado a taxa de clivagem foi de 71,8%, e para o grupo controle,
73,2%. A taxa de blastocisto foi de 35% para o grupo sexado e 33,4% para o grupo controle. De
um total de 87 embriões, a proporção sexual obtida foi 57,5% de fêmeas e 42,5% de machos.Os
resultados preliminares demostraram que houve uma pequena diferença numérica no desvio da
proporção sexual para fêmeas, apesar de não haver diferença entre o grupo sexado e grupo controle
(n=104, 55,8% de fêmeas e 44,2% de machos), após análise estatítica (p=0,81). Apesar disto,
podemos observar que, aliando-se o sistema de cultivo diferenciado, somado com a sexagem de
espermatozóides, é possível alterar a proporção sexual de embriões produzidos in vitro para
fêmeas.
Apoio financeiro: FAPESP 04/06044-0 e 05/53174-0, 02/09785-6.
s553
AUSÊNCIA DE “IMPRINTING” DOS GENES IGF2 E XIST EM FETO BOVINO

PARTENOGENÉTICO RECUPERADO AOS 35 DIAS DE GESTAÇÃO
Méo, S.C.1,2; Ferreira, C.R.2; Perecin, F.2; Yamazaki, W.2; Landim Junior, L.P.2;
Saraiva, N.Z.2; Tetzner, T.A.D.2; Leal, C.L.V.3; Meirelles, F.V.3; Garcia, J.M.2
1
CPDGRA-IZ-APTA/SAA, Nova Odessa-SP, Brasil, 2DMVPRA-FCAV-UNESP, Jaboticabal-
SP, Brasil, 3ZAB-FZEA - USP, Pirassununga-SP, Brasil. simone@iz.sp.gov.br
Embriões partenogenéticos possuem alelos de origem exclusivamente materna e,

conseqüentemente, apresentam padrão alterado da expressão de genes “imprinted”, principalmente
daqueles de expressão paterna. Uma vez que os genes “imprinted” regulam o crescimento e o
desenvolvimento durante o período embrionário e fetal, falhas em sua expressão acarretam em
distúrbios, como os relatados em animais clonados e nascidos a partir de embriões produzidos in
vitro. Neste trabalho, foram estudados os genes IGF2 e XIST com o objetivo de avaliar genes de
“imprinting” materno e, portanto, de expressão paterna. Assim, oócitos bovinos maturados in
vitro (TCM199 com SFB, hormônios, piruvato e antibiótico, por 24h) foram fecundados (FIV;
TALP com heparina, PHE e BSA, por 22-24h) ou ativados com ionomicina (5μM por 5min)
seguida de 6-DMAP (ID; 2mM por 4h). Os embriões, cultivados por 7 dias (SOF com SFB e
BSA) foram inovulados em grupos de 6 blastocistos, em 4 fêmeas receptoras previamente
sincronizadas com PGF-2α. As receptoras foram abatidas aos 35 dias de gestação e os fetos FIV
(n=3) e ID (n=2) submetidos à extração de RNA com Trizol e transcrição reversa com Superscript
II. Os genes IGF2 e XIST foram amplificados por PCR específica e analisados no Kodak Digital
Science 1D, após eletroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídeo. A quantidade
relativa do RNAm de interesse foi calculada pela divisão da intensidade da banda de cada gene-
alvo pela intensidade da banda do gene de expressão constitutiva GAPDH, na mesma amostra.
Os resultados foram submetidos à ANOVA e teste de Tukey, no SAS (P=0,05). No total, em duas
repetições, foram recuperados 10 fetos FIV e 3 ID e a taxa de gestação em FIV (41,7%) foi
superior (P<0,05) a ID (12,5%). Quando comparados aos fetos FIV, os fetos ID apresentaram
tamanho reduzido, mas aparência normal tanto dos fetos quanto das membranas fetais. Acredita-
se que esta seja a primeira descrição de fetos bovinos partenogenéticos recuperados aos 35 dias
de gestação. Quanto à expressão gênica, IGF2 e XIST não foram detectados no feto ID1, mas
apresentaram, respectivamente, expressão média (±desvio padrão) semelhante (P>0,05) entre
FIV1 (2,10±0,27 e 1,18±0,21), FIV2 (1,51±0,44 e 1,46±0,06), FIV3 (2,09±0,52 e 1,31±0,55) e
ID2 (1,15±0,26 e 1,49±0,20). A ausência de expressão de IGF2 e XIST no feto partenogenético
ID1 é condizente com o padrão materno de “imprinting” desses genes. Entretanto, a expressão
de IGF2 e XIST em ID2 indica a ausência de “imprinting” e a aquisição de expressão materna.
Essas alterações podem refletir um mecanismo de adaptação do embrião partenogenético visando
aumentar suas chances de sobrevivência. Assim, fetos partenogenéticos bovinos podem se
desenvolver até os 35 dias de gestação e apresentar ausência do “imprinting” materno dos genes
IGF2 e XIST.
Apoio financeiro: FAPESP 02/00971-1 e 03/12352-7.
s554
CICLO CELULAR E VIABILIDADE DE FIBROBLASTOS EQÜINOS CULTIVADOS

ATÉ CONFLUÊNCIA PRÉ E PÓS CONGELAÇÃO
Lima-Neto, J.F.1; Fernandes, C.B.1; Dores, C.B.1; Golim, M.A.2;

Silva, V.A.2; Landim-Alvarenga, F.C.1
1
SP, 18618-000, Brasil, 2 Hemocentro – FM/UNESP, Botucatu, SP, 18618-000, Brasil.
fernanda@fmvz.unesp.br
O cultivo até a confluência tem se mostrado como um eficiente método de sincronização do

ciclo celular de fibroblastos, não afetando a viabilidade celular. A utilização de células doadoras
de núcleo de boa qualidade pode resultar em menores taxas de perda embrionária após a
transferência nuclear. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi comparar a viabilidade e o
estágio do ciclo celular de fibroblastos eqüinos cultivados até a confluência antes e após a
criopreservação. Fragmentos de pele de fêmeas eqüinas foram cultivados seguindo a metodologia
adotada pelo Laboratório de PIV da FMVZ, UNESP, Botucatu (Fernandes et al., Acta Scientiae
Veterinariae, supl. 33, 2005. p: 435). Duas passagens foram realizadas antes da congelação. Para
a congelação, as células foram ressuspedidas na concentração de 2x106 células/ml em meio de
congelação refrigerado (DMEN, 20% SFB, 10% DMSO). Em seguida, foram distribuídas em
criotubos que foram acondicionados em um tubo especialmente desenvolvido para troca lenta de
calor permanecendo 24 horas em freezer -80ºC, quando foram transferidos diretamente ao N2
líquido. Para a descongelação, os criotubos foram retirados do N2 líquido e colocados em água à
37ºC/1 minuto. Para a remoção do crioprotetor, o conteúdo do criotubo foi transferido para um
tubo de centrífuga de 15ml onde adicionou lentamente 10ml de meio DMEN, 20% SFB e
centrifugou a 2000 rpm/5 minutos. O sedimento foi resuspendido em 5ml de meio DMEN, 20%
SFB e a concentração ajustada para 5x 105 células/ml em cada garrafa de cultivo celular. Para as
análises foram produzidas duas garrafas de cultivo pré e pós congelação para a avaliação da
viabilidade e do ciclo celular no período em que o tapete celular atingisse a confluência. Na
análise da viabilidade, o tapete celular foi corado com 30l de Hoescht 33342 (10mg/ml) por 30
minutos e 30μl de Iodeto de Propídeo (1mg/ml) por 5 minutos. A análise foi realizada em
microscopia de fluorescência, onde células coradas de azul (Hoescht) representavam as vivas,
enquanto que as coradas de vermelho (Iodeto de Propídeo) representavam as mortas. Foram
observados 10 campos/ garrafa. A análise do ciclo celular foi realizada pelo Citômetro de Fluxo
FACS Calibur BD® de acordo com o protocolo descrito por Yu et al. (Theriogenology, 59: 1277-
1289. 2003), verificando a porcentagem de células em estágio G0-G1 do ciclo celular. Os
resultados dos grupos pré e pós congelação foram respectivamente, 91 e 77%, para as taxas de
sincronização do ciclo celular em G0-G1 e 78% e 63% para as taxas de viabilidade. Estes resultados
demonstram que o cultivo até a confluência é um método eficiente para sicronização dos
fibroblastos eqüinos em G0-G1. Entretanto, o processo de criopreservação parece causar injurias
celulares que provocam perda de viabilidade.
Agradecimentos: CNPq, FAPESP (04/00822-1)
s555
ESTIMATIVA DA IDADE GESTACIONAL E DO PESO DO RECÉM-NASCIDO

OVINO, ATRAVÉS DE MENSURAÇÕES OBTIDAS EM DIFERENTES PERÍODOS
DE GESTAÇÃO PELA ULTRA-SONOGRAFIA
Chiamenti, A.1; Santos, M.H.B.1; Moraes, E.P.B.X.1; Chaves, R.M.1; Gonzalez, C.I.M.2;
Torreão, J.N.C.3; Reichenbach, H.-D.4; Lima, P.F.1; Oliveira, M.A.L.1
1
Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, 52171 900 Recife-PE (maloufrpe@uol.com.br;
malo@ufrpe.br; malo@cnpq.pesquisador.br); 2Laboratório de Nutrição Animal da
Universidade Federal de Campina Grande – São João do Cariri – PB; 2Laboratório de
Reprodução Animal da Fazenda Pendência, EMEPA, Soledade – PB; 3Bayerische
Landesanstalt für Landwirtschaft/LfL, Poing-OT/Grub, Germany
O objetivo deste estudo foi estimar a idade de gestação (IG) e o peso de recém-nascidos ovinos
(PC), através de mensurações do comprimento céfalo-coccígeo (CCC), da área do perímetro e
do volume dos conceptos (AE-PE-VE) e da área, do perímetro e do volume da vesícula embrionária
(AV-PV-VV) no 30º e 45º dia de gestação. Foram utilizadas 98 ovelhas, sendo 30 da raça Damara,
36 da raça Dorper e 32 da raça Morada Nova, com idades entre 2 e 5 anos, boa condição corporal
e prenhes por monta natural. Os exames foram realizados por via transretal com transdutor linear
de dupla freqüência (6,0 e 8,0 MHz), com a fêmea em posição de estação. Foram monitorados
164 conceptos, dos quais 34 da raça Damara, 66 da raça Dorper e 64 da raça Morada Nova. Os
dados foram avaliados através de correlações simples entre todas as variáveis e posteriormente
foi aplicado um modelo de regressão linear simples para àquelas variáveis que apresentaram
nível de significância a 5%, segundo SNEDECOR & COCHRAN (1974). As associações no
30º dia de gestação entre as medidas dos conceptos e o peso dos recém-nascidos (PC) mostraram
na raça Morada Nova os maiores valores para as variáveis CCC (R²= 0,1930), PV (R²= 0,1459),
PE (R²= 0,1458), VV (R²= 0,1397) e AV (R²= 0,1145) e na raça Dorper para as variáveis VV
(R²= 0,2156), AV (R²= 0,1541) e PV (R²= 0,1011). As associações realizadas no 45º dia de
gestação entre as medidas dos conceptos e a idade gestacional (IG) mostraram correlação somente
na raça Morada Nova com maior valor para a variável AE (R²= 0,0765), seguida pela variável
PV (R²= 0,0744). A associação de duas medidas apresentou coeficientes de determinação
semelhantes àqueles das medidas individuais. Os resultados permitem concluir que as mensurações
do CCC e do perímetro área e volume do embrião e da vesícula, realizadas no 30º e 45º dia de
gestação, através do exame ultra-sonográfico por via transretal, apresentam baixa eficiência para
estimar a idade de gestação e o peso de recém-nascidos ovinos.
s556
AVALIAÇÃO ULTRA–SONOGRÁFICA DO DESENVOLVIMENTO

EMBRIONÁRIO-FETAL DE OVINOS DA RAÇA SANTA INÊS
Moraes, E.P.B.X.1; Santos, M.H.B.1; Firmino, A.P.1; Messias, J.B.2; Caraciolo, M.C.M.3; Lima,
P.F.1; Oliveira, M.A.L.1
1
Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Medicina Veterinária/UFRPE, Av. D.
Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171 900 Recife – PE (maloufrpe@uol.com.br;
malo@ufrpe.br; malo@cnpq.pesquisador.br); 2Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade de Pernambuco, Recife – PE; 3Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães –
FIOCRUZ, Recife - PE
Teve-se o objetivo de avaliar ultra-sonograficamente o desenvolvimento embrionário-fetal de

ovinos da raça Santa Inês, identificando a data da primeira visualização dos principais parâmetros
da gestação. As avaliações ultra-sonográficas foram realizadas com transdutor linear de dupla
freqüência (6 e 8 MHz) por via transretal, utilizando-se 60 ovelhas gestantes, entre o 15º e o 45º
dia de gestação. Foram calculados a média, o desvio padrão e o coeficiente de variação dos
dados da primeira visualização de cada estrutura avaliada. A identificação mais precoce e mais
tardia dos parâmetros avaliados ocorreu entre o 15º e o 19º (16,7 ± 1,3) dia de gestação para
líquido intra-uterino, entre o 16º e o 22º (18,6 ± 1,4) dia para vesícula embrionária, entre o 18º e
o 26º (22,8 ± 1,9) dia para embrião, entre o 20º e o 29º (25,1 ± 2,0) dia para placentomas, entre
o 24º e o 29º (25,9 ± 1,4) dia para batimento cardíaco, entre o 24º e o 32º (27,4 ± 1,8) dia para
membrana amniótica, entre o 30º e o 37º dia (33,4 ± 2,2) para diferenciação entre cabeça e
tronco, entre o 30º e o 38º (34,2 ± 2,0) dia para movimento do feto, entre o 32º e o 39º (35,1 ±
1,5) dia para cordão umbilical, entre o 34º e o 39º (36,7 ± 1,5) dia para botão dos membros
anteriores e posteriores e entre o 39º e o 43º (40,9 ± 1,2) dia para globo ocular. Os resultados
permitem concluir que é possível identificar os primeiros sinais de gestação já no 15º dia, todavia,
é prudente que o diagnóstico de gestação somente seja emitido a partir do 24º dia, quando é
possível visualizar o embrião e seus batimentos cardíacos.
Palavras-chaves: embrião, feto, gestação.
s557
DETERMINAÇÃO DO PERÍODO DE MIGRAÇÃO DO TUBÉRCULO GENITAL

PARA SEXAR PRECOCEMENTE FETOS OVINOS DAS RAÇAS DAMARA, SANTA
INÊS E 3/4 DAMARA-SANTA INÊS
Santos, M.H.B.1; Moraes, E.P.B.X.1; Chiamenti, A.1; Rocha, J.M.1; Paula, N.R.O.2;
Silva, G.A.3; Lima, P.F.1; Oliveira, M.A.L.1
1
malo@ufrpe.br; malo@cnpq.pesquisador.br); 2Laboratório de Fisiologia e Controle da
Reprodução - Universidade Estadual do Ceará-CE; 3Laboratório de Reprodução da Fazenda
Pendência, EMEPA, Soledade - PB
Teve-se o objetivo de determinar, pela ultra-sonografia, o período de migração do tubérculo

genital (TG) para estabelecer o momento ideal de sexar fetos das raças Damara, Santa Inês e 3/
4 Damara-Santa Inês (¾ D-SI). Os exames foram realizados do 30º ao 60º dia de gestação em
intervalos de 24 horas por via transretal, utilizando-se transdutor linear de dupla freqüência (6,0
e 8,0 MHz). Os dados foram estatisticamente avaliados através do teste de Qui-quadrado e do
teste “F”, com significância de 5%. A migração do TG variou de 38 a 51 dias nos fetos da raça
Damara, 37 a 46 dias naqueles da raça Santa Inês e de 36 a 45 dias nos fetos ¾ SI-D, perfazendo
uma média de 45,0 ± 3,0 dias nos da raça Damara, de 42,0 ± 2,0 dias nos da Santa Inês e de 39,2
± 2,3 dias nos fetos ¾ D-SI. O valor médio da migração do TG é mais precoce (P < 0,05) nos
fetos ¾ D-SI do que nos das raças Damara e Santa Inês e mais tardia (P < 0,05) nos da raça
Damara do que nos da raça Santa Inês. A acurácia da sexagem fetal nas gestações simples (100%)
foi maior (P < 0,05) do que nas gestações duplas (88,5%). Os resultados permitem concluir que
a migração do TG é diferente entre os fetos das raças Damara, Santa Inês e ¾ D-SI, que o período
ideal de sexar os fetos dessas raças é a partir do 50º dia de gestação e que gestações duplas
comprometem a acurácia do exame ultra-sonográfico. Palavras chave: prepúcio, bolsa escrotal,
tetas, vulva.
s558
SEXAGEM FETAL DE CAPRINOS DA RAÇA BOER PELA ULTRA-SONOGRAFIA
Santos, M.H.B.1; Chiamenti, A.1; Moraes, E.P.B.X.1; Loureiro, B.1; Soares, A.T.2;
Silva, G.A.2; Reichenbach, H.-D.3; Lima, P.F.1, 4; Oliveira, M.A.L.1, 4
1
Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Medicina Veterinária-UFRPE, Av. D.
malo@ufrpe.br; malo@cnpq.pesquisador.br); 2Laboratório de Reprodução Animal da Fazenda
Tacima, EMEPA, Tacima – PB; 3Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft/LfL, Poing-OT/
Grub, Germany.
Neste trabalho, dividido em dois experimentos (EI e EII), objetivou-se estabelecer o período
ideal de sexagem fetal em caprinos da raça Boer pela ultra-sonografia transretal. O EI foi
desenvolvido com a finalidade de estabelecer o período de migração do TG nos primeiros 60
dias de gestação através de exames seriados e o EII com o intuito de avaliar a acurácia da sexagem
fetal, através de exame único, realizada também nos primeiros 60 dias de gestação. Os exames
foram realizados por via transretal com transdutor linear de dupla freqüência (6,0 e 8,0 MHz).
Os dados foram estatisticamente avaliados pelo teste Qui-quadrado com 5% de significâcia. No
EI, os 61 fetos das 31 fêmeas foram monitorados em intervalos de 24 horas, do 40º ao 60º dia de
gestação e no EII, os 47 fetos das 32 fêmeas, entre o 45º e o 60º dia de gestação foram examinados
somente uma vez. A acurácia da sexagem fetal no EI foi de 100% (8/8) nas gestações simples,
96,9% (31/32) nas duplas e 100% (21/21) nas tríplices. No EII, a acurácia foi de 94,4% (17/18)
nas gestações simples, 80,8% (21/26) nas duplas e de 100% (3/3) nas tríplices. Tanto no EI
quanto no EII não foi registrada diferença (P > 0,05) na acurácia entre os diferentes tipos de
gestação, bem como entre a acurácia total do EI (98,3%) e do EII (87,2%). A migração do TG
ocorreu entre o 43º e o 54º dia de gestação, perfazendo uma média de 47,4 ± 6,5 dias. Os resultados
permitem concluir que a ultra-sonografia em tempo real é um método eficiente para sexar fetos
caprinos nos primeiros 60 dias da gestação, tanto pela localização do TG quanto pela identificação
das estruturas da genitália externa. É também possível concluir que exames repetidos em curtos
intervalos não devem ser implementados na rotina de trabalho porque não conferem maior acurácia
ao exame ultra-sonográfico.
Palavras chave: pênis, prepúcio, bolsa escrotal, tetas, vulva, clitóris.
s559
SEXAGEM DE FETOS OVINOS DA RAÇA DORPER ORIGINADOS DE MONTA

NATURAL E DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES PELA ULTRA-SONOGRAFIA
Santos, M.H.B.1; Moraes, E.P.B.X.1; Gonzalez, C.I.M.2; Gondim, F.Q.B.1; Guido, S.I.1;
Reichenbach, H.-D.3; Lima, P.F.1; Oliveira, M.A.L.1
1
malo@ufrpe.br; malo@cnpq.pesquisador.br); 2Laboratório de Reprodução da Fazenda
Pendência, EMEPA, Gurjão – PB; 3Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft/LfL, Poing-
OT/Grub, Germany
Visando aumentar a eficiência da sexagem em ovelhas da raça Dorper, os objetivos deste trabalho
foram determinar, pela ultra-sonografia, o dia da migração do tubérculo genital (TG) de fetos
ovinos da raça Dorper (n = 51), originados de monta natural e de transferência de embriões
congelados, e comparar a acurácia de exames repetidos em curtos intervalos com aquela de
exame único para estabelecer o período ideal de sexagem precoce. Nos experimentos EI e EII, a
sexagem foi efetuada com base na localização do TG e no EIII, na identificação das estruturas
anatômicas da genitália externa. Os exames foram realizados por via transretal com transdutor
linear de dupla freqüência (6,0 e 8,0 MHz). No EI (n = 23) e EII (n = 18), os fetos foram
monitorados em intervalos de 48 horas, do 30º ao 60º dia de gestação. No EIII (n = 10), os fetos
foram examinados apenas no 65º dia de gestação. Os dados foram estatisticamente avaliados
através do teste de Qui-quadrado e do teste “F”, com significância de 5%. A acurácia da sexagem
fetal foi de 91,3% (21 sexados/23 quantificados) no EI, de 88,9% (16 sexados/18 quantificados)
no EII e de 100% (10 sexados/10 quantificados) no EIII, não havendo diferença (P > 0,05) entre
os experimentos. Nos fetos originados de monta natural, a migração do TG (43,0 ± 2,8 dias) foi
mais precoce (P < 0,05) do que nos fetos de transferência de embriões (46,1 ± 4,7 dias). Os
resultados permitem concluir que a ultra-sonografia em tempo real é um método eficiente para
identificar previamente o sexo do feto e determinar o dia da migração do TG, que a migração do
TG de fetos provenientes de embriões descongelados é mais tardia do que a de fetos originados
de monta natural e que os exames ultra-sonográficos repetidos não maximizam a acurácia da
sexagem fetal.
Palavras chave: prepúcio, bolsa escrotal, tetas, vulva .
s560
EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ÁCIDO 3-INDOL-ACÉTICO NA

ATIVAÇÃO E CRESCIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS
BOVINOS DA RAÇA NELORE.
Blaschi, W.1; Andrade, E.R.2; Delboni, M.I.1; Padilha, L.C.1; Oliveira, A.C.S.1;
Alfieri, A.A.1; Figueiredo, J.R.2; Seneda, M.M.1.
1
Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, 86051-990, Brasil.; 2Faculdade de
Medicina Veterinária, PPGCV, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza-CE, 60740-000,
Brasil., wanessablaschi@yahoo.com.br
Avaliou-se o desenvolvimento de folículos pré-antrais bovinos da raça Nelore, após o cultivo in

vitro do córtex ovariano em várias concentrações de ácido 3-indol acético (VETEC®) (IAA). O
córtex ovariano foi dividido em fragmentos de aproximadamente 5x5mm. Dois fragmentos foram
imediatamente fixados em Carnoy (fragmentos não-cultivados) e os demais destinados
individualmente ao cultivo em placas com 24 orfícios (NUNCLON®) contendo meio essencial
mínimo suplementado (MEM+) (GIBCO®) acrescido de 10, 40, 100, 500 ou 1000 ng/mL de
IAA. O período de cultivo foi de dois e seis dias a 39°C e 5% de CO2 em ar. Após o cultivo in
vitro, observou-se redução significativa de folículos primordiais e aumento de folículos em
desenvolvimento (P<0,05), para o MEM+ acrescido de 10 ng/mL de IAA. Em relação aos folículos
dos fragmentos não-cultivados, houve redução de folículos primordiais histologicamente normais
no cultivo por dois e seis dias (P<0,05). Após dois dias de cultivo, a redução de folículos normais
em desenvolvimento foi observada nos folículos suplementados com 1000 ng/mL de IAA. Após
seis dias de cultivo, a redução de folículos normais em desenvolvimento foi observada apenas
nos folículos suplementados com 100 ng/mL e 500 ng/mL de IAA. Conclui-se que, folículos
pré-antrais bovinos da raça Nelore podem ser ativados in vitro após seis dias de cultivo em
MEM+ suplementado com 10 ng/mL de IAA.
s561
INFLUÊNCIA DO SWIM-UP NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

UTILIZANDO ESPERMATOZÓIDES “X” SEXADOS POR CENTRIFUGAÇÃO EM
GRADIENTE DE DENSIDADE: DADOS PRELIMINARES
Lucio, A.C.1; Fazano, F.A.T.3; Perini, A.P.2; Resende, M.V.2; Tetzner, T.A.D.2; Vantini, R.2;
Hossepian de Lima, V.F.M.2
1
DZ-FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, 2DMVPRA-FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil,
3
Laboratório de Reprodução Humana-CAISM-UNICAMP, Campinas-SP,
alinelucio@hotmail.com
O objetivo deste trabalho foi associar o método do Swim-up modificado para seleção de
espermatozóides viáveis a uma técnica de centrifugação em gradiente de densidade para separação
de espermatozóides X e Y provenientes de sêmen bovino congelado e verificar o desvio da
proporção sexual dos embriões produzidos in vitro pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
O preparo das soluções para formação do gradiente foi realizado diluindo-se o Iodixanol
(OptiPrep™) em DMEM + 0.3% de BSA Fração V em camadas de 2,0mL com 20, 21 e 22%. As
camadas do gradiente foram dispostas da maior concentração (fundo do tubo) para a menor em
tubos cônicos de 15mL. As doses de sêmen foram descongeladas e depositadas abaixo de 1mL
de meio TALP sem HEPES + 0,3% de BSA, em tubo cônico de 15mL, permanecendo em estufa
de CO2 por 1h. Após este período, 1,5mL do sobrenadante (Swim-up modificado) contendo
cerca de aproximadamente 30x106 espermatozóides foi retirado e depositado em cada tubo do
gradiente de densidade. Os tubos foram centrifugados a 500xg por 15min a 22ºC. Decorrida a
centrifugação, os sobrenadantes foram descartados, os sedimentos recuperados e a motilidade e
o vigor dos espermatozóides avaliados. Estes espermatozóides centrifugados recuperados foram
utilizados para fecundação in vitro de oócitos provenientes de abatedouro que foram maturados
durante 24-26h. Após 20h de fecundação os prováveis zigotos foram transferidos para placas de
4 poços, contendo 500ìL de meio SOF + 5mg/mL de BSA e mantidos em atmosfera de 5% de
CO2, 5% de O2 em ar, a uma temperatura de 38,5ºC durante 7 a 8 dias. Embriões no estádio de
blastocisto foram congelados individualmente em microtubos contendo 10ìL de água ultra-pura
e armazenados a -20°C até o momento da PCR. Para a PCR, os embriões foram tratados com
5ìg de Proteinase K e cada embrião foi submetido a duas reações distintas, uma primeira contendo
uma seqüência de autossômica (280pb) e uma Y-específica (250pb), e uma segunda reação
composta por outra seqüência Y-específica (196pb), sendo que as amplificações foram realizadas
em termociclador. Foram recuperados em torno de 21% do total de espermatozóides colocados
sobre o gradiente de densidade, com motilidade progressiva de 50% e vigor 3. No grupo sexado
a taxa de clivagem foi de 65,73%, e para o grupo controle foi de 73,2%. A taxa de blastocisto foi
de 22,14% para o grupo sexado e 33,4% para o grupo controle. De um total de 50 embriões, a
proporção sexual obtida foi 60% de fêmeas e 40%de machos. Os resultados preliminares
demostraram que houve uma pequena diferença numérica no desvio da proporção sexual para
fêmeas, apesar de não haver diferença entre o grupo sexado e grupo controle (104 embriões,
55,8% de fêmeas e 44,2% de machos), após análise estatítica (p=0,54). Associando-se o método
de Swim-up modificado e o método de sexagem de espermatozóides por centrifugação em
gradiente de densidade aliado a um sistema de cultivo diferenciado, é possível alterar a proporção
sexual de embriões produzidos in vitro para fêmeas. Apoio financeiro: FAPESP 05/53174-0, 04/
06044-0 e 02/09785-6.8).
s562
COMPARAÇÃO ENTRE DOIS MEIOS DE REFRIGERAÇÃO POR 24 HORAS A 5ºC

PREVIAMENTE A CONGELAÇÃO DE SÊMEN EQÜINO
Papa, F.O.1; Melo, C.M.1; Alvarenga, M.A.1; Trinque, C.L.A.2; Dell’Aqua Jr., J.A.1;
Felício, G.B.1; Villaverde, A.I.S.B.1
1
DRARV- FMVZ- Unesp, Botucatu-SP, Brasil, 2Haras Agromen, papa@fmvz.unesp.br
A utilização de sêmen congelado na espécie eqüina tem como fatores limitantes: o alto custo
com equipamentos, necessidade de mão de obra especializada, assim como locais apropriados
nos haras para manipulação do sêmen. Com o intuito de minimizar estes problemas, estudos tem
buscado desenvolver uma metodologia de congelação de sêmen eqüino refrigerado (Backman et
al, J Anim Sci, v.82, p. 690-694, 2004; Melo et al., Anim Reprod Sci, v.89, p.250-252, 2005).
Melo et al (2005) compararam a técnica de congelação convencional (Papa et al., v.26, p.184-
187, Rev Bras Reprod Anim, 2002) com a metodologia inédita, em que amostras foram
refrigeradas por 24 horas em Equitanier®, previamente a congelação e observaram resultados
semelhantes dos parâmetros espermáticos e fertilidade. O presente estudo objetivou comparar a
eficiência de dois diluidores de refrigeração na manutenção da viabilidade de sêmen eqüino
refrigerado por 24 horas e então congelado. Foi colhido 01 ejaculado de 09 garanhões os quais
foram divididos em duas partes: uma diluída com Botu-Semen® e o restante com Kenney. Para a
congelação as amostras foram centrifugadas a 600xg/10 minutos, e os sedimentos ressuspendidos
com Botu-Crio®, na concentração de 200x106 espermatozóides viáveis/mL. O sêmen foi envasado
em palhetas de 0,5mL e estabilizado à 5ºC por 20 minutos, posteriormente submetidas ao vapor
de nitrogênio por 20 minutos à 6 cm do nível de nitrogênio, imersas e armazenadas em botijões
com nitrogênio líquido. Para análise das amostras, as mesmas foram descongeladas em banho-
maria a 46ºC por 20 segundos. Após a descongelação foram analisados os parâmetros espermáticos
pelo CASA e integridade da membrana plasmática pelo uso das sondas fluorescentes. O diluente
Botu-Semen foi superior ao Kenney suplementado com Amicacina para todos os parâmetros
espermáticos avaliados, sendo estes: motilidade total (68,9 vs 57,1), motilidade progressiva (28,7
vs 20,4) e integridade da membrana plasmática (49,1 vs 37,4). Com base nos resultados
encontrados podemos afirmar que o diluente Botu-Semen demonstrou ser mais efetivo na proteção
da viabilidade espermática quando comparado com o diluente Kenney modificado (substituição
da gentamicina pela amicacina). Provavelmente, esta melhora se deve a composição do diluente
Botu-Semen, enriquecido com vários aminoácidos, conferindo maior proteção dos
espermatozóides ao longo do processo de criopreservação, em relação à formulação padrão do
Kenney, uma vez que esses diluentes após a centrifugação contribuem com 5% do volume final.
Este novo diluente se apresenta como uma nova opção para melhora nos resultados de manipulação
biotecnológica do sêmen eqüino. Os resultados deste experimento confirmam os achados de
Melo et al.(2005), mostrando que a técnica de refrigeração por 24 horas, previamente a congelação,
se mostra altamente viável, para a criopreservação de sêmen eqüino, sem a necessidade de
locomoção para colher e manipular o sêmen em haras e fazendas, bem como o transporte para as
centrais de congelação.
Apoio: FAPESP
Agradecimentos: Purina
s563
UTILIZAÇÃO DE SÊMEN CONGELADO DE JUMENTOS
Oliveira, J.V.; Alvarenga, M.A.; Melo, C.M.; Macedo, L.M.;

Dell’Aqua Jr., J.A.; Papa, F.O.
DRARV- FMVZ- Unesp, Botucatu-SP, Brasil papa@fmvz.unesp.br
A utilização de sêmen congelado possibilita a maximização do uso de reprodutores, derruba

barreiras geográficas, elimina ou diminui a propagação de doenças sexualmente transmissíveis e
possibilita o uso de animais já mortos. Sendo assim, a criopreservação de sêmen de jumentos é
uma ferramenta importante na manutenção de exemplares desta espécie. No entanto, poucos
estudos avaliaram a qualidade espermática do sêmen de jumentos ou fizeram uso do teste de
fertilidade. O presente estudo teve como objetivo avaliar fertilidade de sêmen congelado de
jumentos em jumentas e éguas. O ejaculado foi diluído de 1:1 utilizando-se o extensor Botu-
Semen e centrifugado 600xg por 10’. O sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspendido
com o diluente MP50 acrescido de 3% de glicerol e 2% de dimetilformamida (Papa et. al., Rev
Bras Reprod Anim, v.26, n.3, p.184-187, 2002). As amostras foram envasadas em palhetas de
0,5mL e mantidas a 5ºC, por 1 hora e posteriormente mantidas no vapor de nitrogênio (6cm
acima do nível líquido) durante 20 minutos e então imersas. As palhetas foram descongeladas à
46ºC/20’’ e analisadas através da análise computadorizada para os parâmetros motilidade total e
progressiva e a integridade da membrana plasmática através do uso de sondas fluorescentes.
Para o teste de fertilidade foram realizadas 53 inseminações em jumentas, no corpo uterino com
a dose inseminante de 800x106 pré e pós-ovulação, a qual foi induzida com 2500 UI de hCG. A
média das amostras de sêmen utilizadas no teste de fertilidade foram motilidade total (61,8 ±
11,7), motilidade progressiva (40,0 ± 9,0) e integridade da membrana plasmática (41,1 ± 11,6).
Com relação à fertilidade os índices para jumenta e éguas foram respectivamente, zero e 40%.
Entretanto, esses mesmos resultados satisfatórios obtidos com as análises laboratoriais não
proporcionaram nenhuma prenhes com o sêmen congelado, mostrando a necessidade de manter
as pesquisas com esta espécie e otimizar os resultados de fertilidade, semelhante aos resultados
obtidos em éguas.
Apoio: FAPESP
Agradecimentos: Purina, Shering (Ciosin®)
s564
COMPARAÇÃO ENTRE DOIS SISTEMAS DE TRANSPORTE NA VIABILIDADE

DE SÊMEN EQUINO REFRIGERADO POR 24 HORAS ANTES DA
CONGELAÇÃO
Melo, C.M.; Alvarenga, M.A.; Zahn, F.S.; Martin, I.; Felício, G.B.;
Dell’Aqua Jr., J.A.; Papa, F.O.
DRARV- FMVZ- Unesp, Botucatu-SP, Brasil, papa@fmvz.unesp.br
A biotecnologia de sêmen congelado possibilita o uso de garanhões de qualquer parte do mundo,

sem que haja custos com transporte da égua ou do garanhão, bem como aumenta o número de
animais a serem acasalados com um determinado reprodutor. Entretanto, esta biotecnologia
apresenta limitações como a variabilidade na qualidade do sêmen entre os garanhões e o transporte
do reprodutor a um centro especializado. Sendo assim, o desenvolvimento de uma metodologia
de congelação de sêmen transportado são uma alternativa para solucionar estes problemas. O
presente estudo teve por objetivo comparar dois sistemas de transporte na refrigeração de sêmen
eqüino por 24 horas previamente à congelação. Utilizou-se 1 ejaculado de 12 garanhões, os
quais foram diluídos com Botu-Semen®, divididos em duas partes: uma armazenada em
Equitainer® e outra no sistema Max-Semen Express®. Após 24 horas as amostras foram
centrifugadas à 600xg por 10 minutos, o sobrenadante desprezado e os sedimentos ressuspendidos
com Botu-Crio. As amostras de sêmen foram envasadas em palhetas de 0,5mL, refrigeradas à
5ºC durante 20 minutos e posteriormente mantidas a 6cm do nível de nitrogênio líquido por 20
minutos. As amostras foram descongeladas (46ºC/20") e avaliadas através da análise
computadorizada da motilidade e a integridade da membrana plasmática pelo uso de sondas
fluorescentes. Em relação aos parâmetros avaliados o Equitainer® demonstrou-se mais eficiente
em relação ao Max-Semen Express® na manutenção da viabilidade espermática de acordo com
os parâmetros avaliados, sendo estes: motilidade total (62,2±10,42A vs 58,10±11,52B), bem como
para a motilidade progressiva (26,7±9,50A vs 22,6±7,90B). Entretanto, não houve diferença na
integridade da membrana plasmática (50,4±7,20A vs 48,3±8,38A). Os melhores resultados de
motilidade no Equitainer® demonstraram que este sistema de refrigeração mantém a isotermia e
que após 24 horas a temperatura permanece em torno de 6ºC, enquanto que o sistema Max-
Semen Express® após o mesmo período manteve-se à 16ºC. Estas diferenças significativas de
temperaturas pode ter induzido um aumento do metabolismo antecipado no sistema Max-Semen
Express® em relação ao Equitainer®, refletindo nos resultados alcançados.
Apoio: FAPESP
s565
UTILIZAÇÃO DE DIFERENTES DILUENTES DE CENTRIFUGAÇÃO E

CRIOPROTETORES NA FERTILIDADE DE SÊMEN CONGELADO EQÜINO
Melo, C.M.; Alvarenga, M.A.; Dell’Aqua Jr., J.A.; Felício, G.B.;

Villaverde, A.I.S.B.; Papa, F.O.
Diversos fatores influenciam a viabilidade do sêmen congelado eqüino, tais como: a colheita,
diluição, centrifugação, extensores e crioprotetores utilizados. Sendo assim, tem sido constante
a busca de alternativas para melhorar a congelabilidade e fertilidade de sêmen congelado na
espécie eqüina, como a utilização de novos diluentes de centrifugação de congelação bem como
de crioprotetores. A utilização de crioprotetores alternativos pode minimizar os efeitos deletérios
que ocorrem na célula espermática inerentes a congelação e descongelação, possibilitando dessa
maneira, melhorar a viabilidade espermática e conseqüentemente a fertilidade (Rossi et. al, Rev
Bras Reprod Anim, v.27, n.3, p.350-352, 2003). O presente trabalho teve por objetivo averiguar
o efeito de diferentes diluentes de centrifugação, bem como a utilização de diferentes
crioprotetores. Foram colhidos 30 ejaculados de 6 garanhões de diferentes raças. Após a colheita,
o sêmen foi submetido à análise computadorizada da motilidade (CASA), e integridade de
membrana. O sêmen foi então dividido em 05 alíquotas, diluídas com extensores a base de leite,
açúcares e acrescidos ou não de 1% álcool polivinil (PVA): KN (Kenney,1975), Botu-Semen®,
Botu-Semen® + PVA, SN (Sacarose), S1% (Sacarose+PVA), e centrifugadas a 600xg/10’. O
sobrenadante foi desprezado e o sedimento ressuspendido em meio Botu-Crio® acrescido de 4%
de dimetilacetamida (DA) ou 4% de dimetilformamida (DF). Após envasadas, as amostras foram
congeladas de acordo com protocolo descrito por Papa et al. (Rev Bras Reprod Anim, v.26, n.3,
p.184-187, 2002). As doses foram descongeladas à 46ºC/20’’ e avaliadas novamente pela
motilidade (CASA) e a integridade de membrana. Em relação ao teste de fertilidade, foram
realizadas 15 inseminações por grupo (dimetilacetamida vs dimetilformamida), com 400x106
espermatozóides pré e pós-ovulação. As amostras foram centrifugadas com Botu-Semen, o qual
demonstrou-se mais eficiente na manutenção da qualidade de movimento espermático, embora
não tenha sido observada diferença estatística significativa. Os parâmetros espermáticos e a
fertilidade foram avaliados utilizando-se ANOVA (GLM procedure of SAS, SAS, Institute, Inc.,
Cary, NC, USA) e Qui-quadrado, com significância de 5%. Não houve influencia dos diluentes
de centrifugação nos parâmetros analisados (p>0,05). Entretanto, quando comparados os
crioprotetores, a dimetilacetamida demonstrou-se superior a dimetilformamida (p<0,05) tanto
na motilidade total (66,0±6,00 vs 63,33±2,90) como na motilidade progressiva (18,0±3,46 vs
23,3±0,94). Não houve diferença ao teste de fertilidade entre os crioprotetores, sendo:
dimetilformamida (73,3%) e dimetilformamida (60,0%). Com base nos resultados encontrados,
podemos concluir que a formulação dos diluentes a base de leite foram eficazes e semelhantes na
viabilidade espermática durante o processo de centrifugação. Quanto aos crioprotetores, apesar
das amidas utilizadas apresentarem estruturas químicas semelhantes, a dimetilacetamida mostrou-
se superior na proteção espermática durante o processo em relação à dimetilformamida. Apoio:
FAPESP
s566
UTILIZAÇÃO DE DIFERENTES DILUENTES NA REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN

EQÜINO À DIFERENTES TEMPERATURAS
Farrás, M.C.; Avanzi, B.R.; Melo, C.M.; Alvarenga, M.A.; Dell’Aqua Jr., J.A.;
Medeiros, A.S.L.; Araújo, G.H.M.; Papa, F.O.
O Brasil apresenta-se hoje como o segundo país em volume de transporte de sêmen refrigerado
eqüino no mundo. A amplitude e importância da utilização desta biotecnologia do sêmen têm
proporcionado inúmeras inovações na técnica, alcançando índices de fertilidade semelhantes ou
superiores à monta natural, que é a forma mais antiga de reprodução eqüina. A possibilidade de
transportar o sêmen até as éguas, ao invés de transportá-las até o garanhão oferece inúmeras
vantagens, eliminando os altos gastos com o envio de animais, com ou sem potro a uma
propriedade distante onde os custos de hospedagem podem também ser altos. Além disso, reduz
o estresse do animal durante o transporte assim como os riscos de possíveis acidentes e de
adquirir alguma doença como resultado da exposição do animal a patógenos do novo ambiente.
Quanto mais tempo o sêmen eqüino possa ser estocado mantendo a fertilidade, maior flexibilidade
terá o proprietário do garanhão em colher e enviar o sêmen. O diluidor mundialmente utilizado
para refrigeração composto de leite em pó desnatado, açúcar e antibiótico. O presente experimento
teve como objetivo avaliar diferentes meios de refrigeração em dois sistemas de transporte de
sêmen refrigerado, mantidos a temperatura ambiente de 24ºC. Foram utilizados 3 ejaculados de
quatro garanhões os quais foram submetidos a análise computadorizada da motilidade total (MT),
motilidade progressiva (MP) e da integridade de membrana plasmática (IMP). Após análise, os
ejaculados foram diluídos com os seguintes diluentes: Botusemen® (M1); Botuturbo® (M2);
INRA96® (M3), em uma proporção de 3:1 (diluidor:sêmen) ou na concentração de 50x106
espermatozóides/mL e armazenados em dois sistemas de refrigeração: Botutainer® (sistema com
refrigeração até 5°C) e Botu-Box® (sistema com refrigeração até 15°C), sendo estes mantidos a
temperatura ambiente de 24°C. Os resultados foram avaliados por ANOVA, com significância
de 5%. Em relação aos resultados, não foi observada diferença estatística significativa tanto
entre os diluentes, como entre os sistemas de transporte. Dentre os valores obtidos para os diluentes
utilizados: Botu-Semen, Botu-Turbo e INRA 96 foram respectivamente: MT (82.25 ± 6.19, 79.83
± 7.17 e 77.25 ± 6.22), MP (37.25 ± 8.73, 37.50 ± 9.37 e 30.50 ± 9.65) e IMP (65.17 ± 10.03,
61.33 ± 12.30 e 60.67 ± 14.99) quando o sistema utilizado foi o Botubox e MT (81.83 ± 6.82,
81.25 ± 5.31 e 77.92 ± 5.93), MP (36.42 ± 13.51, 39.92 ± 11.03 e 32.25 ± 10.16) e IMP (63.58 ±
10.71, 62.58 ± 16.25 e 60,33±15,39) e para o sistema Botutainer. Sendo assim, baseado nos
resultados obtidos, podemos concluir que tanto os sistemas de transporte, como os diluentes
utilizados foram eficientes na manutenção da viabilidade espermática durante o período de 24
horas e permite o transporte de amostras de sêmen de garanhões para as diferentes regiões do
Brasil em condições de segurança e eficiência reprodutiva.
Apoio: FAPESP
Agradecimentos: Purina, Biotech e IVP do Brasil.
s567
ESTIMATIVA DA IDADE GESTACIONAL E DO PESO DO RECÉM-NASCIDO

CAPRINO POR MEIO DE MENSURAÇÕES OBTIDAS EM DIFERENTES
PERÍODOS DE GESTAÇÃO PELA ULTRA-SONOGRAFIA
Chiamenti, A.1; Santos, M.H.B.1; Moraes, E.P.B.X.1; Chaves, R.M.1; Soares, A.T.2;
Silva, G.A.2; Reichenbach, H.-D.3; Lima, P.F.1; Oliveira, M.A.L.1
1
malo@ufrpe.br; malo@cnpq.pesquisador.br); 2Laboratório de Reprodução Animal da Fazenda
Tacima, EMEPA, Tacima – PB; 3Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft/LfL, Poing-OT/
Grub, Germany
O objetivo deste estudo foi estimar a idade de gestação (IG) e o peso dos recém-nascidos caprinos
(PC), por meio de mensurações do comprimento céfalo-coccígeo (CCC), da área, do perímetro e
do volume dos conceptos (AE-PE-VE) e da área, do perímetro e do volume da vesícula embrionária
(AV-PV-VV) no 30º e 45º dia de gestação. Foram utilizadas 48 cabras da raça Boer, com idades
entre 2 e 5 anos, boa condição corporal e prenhes por monta natural. Os exames foram realizados
por via transretal com transdutor linear de dupla freqüência (6,0 e 8,0 MHz), com a fêmea em
posição de estação, sendo monitorados 96 conceptos. Os dados foram avaliados por correlações
simples entre todas as variáveis e posteriormente foi aplicado um modelo de regressão linear
simples para aquelas variáveis que apresentaram nível de significância a 5%, segundo SNEDECOR
& COCHRAN (1974). Os resultados no 45º de gestação mostraram correlação somente entre a
variável VV e o PC (R2= 0,0672). A associação de duas medidas apresentou coeficientes de
determinação semelhantes àqueles das medidas individuais. Os resultados permitem concluir
que as mensurações do CCC e do perímetro, da área e volume do embrião e da vesícula, realizadas
no 30º e 45º dia de gestação, através do exame ultrassonográfico por via transretal, apresentam
baixa eficiência para estimar a idade gestacional e o peso de recém-nascidos caprinos.
s568
AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DE OÓCITOS DE FÊMEAS BUBALINAS

EXPOSTOS EXPERIMENTALMENTE AO BoHV-1
D’Angelo, M.; Galuppo, A.G.; Souza, R.J.; Picolomini, M.; Santos, M.; Pavão, D.L.;
Athayde, C.S.; Fontenele, A.D.
Laboratório de Biologia Celular, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal,

Instituto Biológico, Av Conselheiro Rodrigues Alves, 1252, São Paulo, SP
andreagalupo@yahoo.com.br
A rinotraqueíte infecciosa bovina tem como agente etiológico o herpesvírus bovino tipo-1 (BoHV-
1), que pode estar presente em ovários, ovidutos, e em líquidos foliculares de animais
aparentemente sadios, o que pode facilitar o risco de sua transmissão por biotécnicas de reprodução
animal. O objetivo deste trabalho foi avaliar morfologicamente oócitos de fêmeas bubalinas
expostos experimentalmente ao BoHV-1 (amostra Colorado). Complexos oócitos cumulus (COCs)
(n=64) foram coletados de ovários de fêmeas bubalinas provenientes de abatedouro. Após a
punção os COC’s foram mantidos em gotas de meio de maturação in vitro cobertas com óleo
mineral. Os COCs selecionados foram divididos em: grupo controle (n=20) e exposto a 10 (n=21)
e 30ml (n=23) da suspensão de BoHV-1 (Colorado, 107.1 TCID 50/ml) durante o período de
maturação in vitro (24h). Após esse período os COCs foram analisados sob microscópio óptico
(100x) para análise da morfologia. Na avaliação morfológica apenas no grupo exposto ao vírus
foi verificado arredondamento e degeneração das células do cumulus, com perda de células em
locais isolados. Sendo assim, esses resultados mostram que, aparentemente, as células do cumulus
são sensíveis a infecção pelo BHV-1, podendo possivelmente auxiliar na transmissão desse agente
para o interior do oócito, aumentando o risco de disseminação da doença. Dessa forma, torna-se
relevante à avaliação da infectividade e os efeitos do BoHV-1 sobre os COCs, durante o período
de maturação in vitro.
Suporte financeiro: CultilabÒ
s569
EMBRIÕES PARTENOGENÉTICOS PODEM AUXILIAR NO RECONHECIMENTO

MATERNO DA GESTAÇÃO EM BOVINOS?(RESULTADOS PRELIMINARES)
Almeida, A.B.1,2; Madureira, E.H.1; Merighe, G.K.F.2; Braga, F.C.2,3; Marques, V.B.1,3;
Pimentel, J.R.V1; Meirelles, F.V.2
1
Departamento de Reprodução Animal – FMVZ-USP - Pirassununga, SP, Brasil -
2
Departamento de Ciências Básicas – FZEA-USP- Pirassununga, SP Brasil - 3Departamento de
Cirurgia – FMVZ -USP - São Paulo, SP, Brasil. alexbar@usp.br
Comparou-se o desenvolvimento de embriões partenogenéticos ou fecundados in vitro entre os

dias 21° e 40° da gestação em bovinos. A partir da hipótese que embriões partenogenéticos
podem auxiliar no reconhecimento materno da gestação em bovinos, o objetivo deste trabalho
foi avaliar e comparar a taxa de prenhez após transferência de embriões fecundados in vitro;
partenogenéticos e o conjunto dos dois embriões. Embriões tanto fecundados (dizigóticos) quanto
partenogenéticos produzidos a partir de oócitos recuperados de vacas abatidas ou através da
aspiração folicular in vivo guiada por ultra-sonografia, foram transferidos para fêmeas nulíparas
em três grupos distintos: G1) transferência de 1 embrião fecundado (n=12), G2) transferência de
2 embriões partenogenéticos (n=11); e G3) transferência de 1 embrião partenogenético associado
a 1 embrião fecundado (n=13). Foram realizadas observações ultra-sonográficas uterinas nas
receptoras no 28º dia e no período entre 34º-40º dias da gestação. No 28º dia, em 3 animais do
G1 evidenciou-se a presença de uma vesícula embrionária (3/12), no G2 e G3 notou-se a presença
de duas vesículas embrionárias (2/11, 3/13 respectivamente). Entre os dias 34º ao 40º, monitorou-
se a sobrevivência embrionária das estruturas presentes. No G1 foi registrada a manutenção da
prenhez, caracterizada pela presença de batimento cardíaco, em dois animais (16,6%), no G2 as
vesículas embrionárias não estavam presentes (0,0%), e no G3 manteve-se a prenhez em três
animais (23,0%), notou-se neste grupo, a presença de apenas uma vesícula embrionária por
animal. Comparou-se as taxas de prenhez para embriões fecundados ou partenogenéticos aos 28
dias de gestação sendo de 25,0% e 23,0% respectivamente. No período de 34-40 dias, a taxa de
gestação foi de 20% para embriões fecundados e 0,0% para embriões partenogenéticos. Das
gestações observadas nos dias 34-40, embora tenha havido perda das vesículas partenogenéticas
em todos os casos, tal fato não prejudicou o desenvolvimento da gestação. Os resultados obtidos
até o momento não permitem concluir que os embriões partenogenéticos podem auxiliar no
reconhecimento materno da gestação em bovinos.
s570
EFEITO DE DIFERENTES CURVAS DE RESFRIAMENTO E DILUENTES NA

CONSERVAÇÃO DO SEMEN CAPRINO#
Bispo, C.A.S.1; Palhão, M.P.1; Fürst, R.1; Rovay, H.1; Carvalho, G.R.2; Bispo, M.S.3
1
Médico Veterinário,estudante Pós-graduação DZO/UFV, Viçosa-MG; 2 Prof. Adjunto DZO/
UFV, Viçosa-MG; 3 Médico Veterinário,estudante Pós-graduação DMV/UFRPE, Recife-PE.
charles_bispo@yahoo.com
A inseminação artificial (IA) tem um importante papel no melhoramento da espécie caprina,

especialmente em sistemas intensivos de produção, por auxiliar no controle reprodutivo e no
aumento da produção de leite, pele e carne. O sucesso do programa da IA depende do manejo e
da coleta, armazenamento e uso adequado do sêmen. A conservação do sêmen a baixas
temperaturas causa danos estruturais, bioquímicos e funcionais a membrana plasmática do
espermatozóide, resultando na redução da motilidade, viabilidade e fertilidade do mesmo. O uso
de uma curva de resfriamento e de um diluente apropriados são essências na prevenção dos
danos causados pelo resfriamento (de 18 a 6 °C), choque térmico, nas características estruturais
e biofísicas das membranas mantidas a 5 °C. O objetivo deste estudo foi o de avaliar o efeito de
duas diferentes taxas de resfriamento (de 22 até 5 °C) e diluente na conservação do sêmen caprino
conservado a 5 °C durante 48 horas. Um total de 20 ejaculados, de animais da raça Saanen (n=2)
e Alpina (n=2), foram coletados, divididos e diluídos (100x106/mL) nos meios a base de Leite
Desnatado (BLD) e gema de ovo (BGO). Alíquotas de sêmen foram então resfriadas a taxa de -
0,033°C /minuto (CR1) ou -0,5°C /minuto (CR2) até a temperatura de conservação (5°C). O
sêmen foi avaliado quanto a sua motilidade total, vigor, resposta ao teste hiposmótico (HOST),
onde se observa por meio do dobramento da cauda, os espermatozóides com membrana funcional
(íntegra), e a coloração supra-vital (eosina/nigrosina) a cada 8 horas, durante um período de 48
horas. Todas as características avaliadas foram influenciadas pelo tempo de conservação, o
aumento nesse, diminuiu a porcentagem de células viáveis (P<0,05). Após 48 horas, o sêmen
conservado no diluente BLD associado a CR2 teve uma melhor motilidade total (36,5 x 9%),
vigor (2,25 x 0,75), coloração supra-vital (30,15 x 11%) e HOST (22,05 x 5,75%) do que na CR1
(P<0,05). Não houve diferença (P>0,05) para motilidade total (46,75 x 55,0%), vigor (2,3 x
2,47), coloração supra-vital (12,9 x 11,84%) e HOST (46,3 x 43,23%) entre CR1 e CR2 no
diluente BGO, respectivamente. Em conclusão, a maior taxa de resfriamento (-0,5C /minuto)
proveu uma melhor preservação da viabilidade espermática do sêmen caprino conservado a 5 °C
durante 48 horas.
s571
EXPRESSÃO GÊNICA DO FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO 13 (FGF-

13) EM FOLÍCULOS ANTRAIS BOVINOS
Costa, I.B.1; Castilho, A.C.S.1; Machado, M.F.1; Teixeira, N.A.1;

Price, C.A.2; Buratini Jr., J.1
1
Departamento de Fisiologia – IB/UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil. 2Center of
Research in Animal Reproduction, Faculty of Veterinary, Montreal, Canadá.
isabelabazzo@ig.com.br
Estudos recentes tem sugerido um papel parácrino dos fatores de crescimento fibroblásticos
(FGFs) na regulação do desenvolvimento folicular ovariano. O FGF-13 induz a proliferação e a
diferenciação celular em uma variedade de processos fisiológicos e patológicos através da ativação
do FGFR-3c e FGFR-4. Nós temos reportado recentemente a expressão gênica do FGFR-3c e
FGFR-4 nas células da teca e do FGFR-3c nas células da granulosa de folículos antrais bovinos.
O objetivo do presente estudo foi determinar o padrão da expressão do RNAm do FGF-13 em
folículos antrais bovinos. Ovários bovinos foram obtidos em abatedouro e folículos maiores que
5mm de diâmetro foram dissecados e mensurados. As células da granulosa (CG) e as células da
teca (CT) separadas, e o RNA total extraído. As concentrações de estradiol e progesterona foram
mensuradas no fluido folicular por RIA. Folículos com níveis de progesterona acima de 100ng/
ml foram considerados atrésicos e excluídos da análise. Os folículos restantes foram agrupados
de acordo com a concentração de estradiol no fluido folicular da seguinte maneira: (a) <5ng/ml;
(b) 5-20; (c) 20-100; (d) >100ng/ml. Em adição, os folículos foram divididos em três grupos de
acordo com o tamanho: (a) 5-7mm; (b) 8-10mm; e (c) >10mm. A expressão gênica do FGF-13
foi examinada por RT-PCR semiquantitativo usando oligonucleotídeos iniciadores bovino-
específicos e GAPDH como controle interno. RT-PCR semiquantitativo foi validado pela escolha
do número de ciclos de PCR e quantidade de RNA dentro da fase linear da curva de amplificação.
As intensidades das bandas foram analisadas por densitometria computadorizada. Os efeitos da
concentração de estradiol e diâmetro folicular foram testados por ANOVA (teste de Kruskal-
Wallis foi usado quando a variância não foi homogênea). A expressão gênica do FGF-13 foi
detectada em células da teca e da granulosa de folículos antrais bovinos. A expressão gênica não
mudou nem com a concentração de estradiol ou diâmetro folicular nas células da granulosa. A
expressão tecal de FGF-13 não foi afetada pela concentração de estradiol, mas aumentou com o
tamanho folicular (P<0.005). A expressão do FGF-13 foi maior em folículos >10mm (57,3 ±
10,4) do que em folículos de 5-7mm (21,7 ± 5,7) e foi intermediária em folículos de 8-10mm
(41,2 ± 10,2). Em conclusão, os presentes dados concordam com um papel para o FGF-13 no
controle do desenvolvimento folicular antral e sugere que a expressão gênica do FGF-13 é regulada
no desenvolvimento das células da teca de folículos antrais bovinos.
Financiado pela FAPESP, Brasil e NSERC, Canadá.
s572
DETERMINAÇÃO DO PERÍODO DE MIGRAÇÃO DO TUBÉRCULO GENITAL EM

FETOS OVINOS DA RAÇA MORADA NOVA PELA ULTRA-SONOGRAFIA
Santos, M.H.B.1; Rabelo, M.C.1; Guido, S.I.1; Torreão, J.N.C.2; Lopes Júnior, E.S.3;
Freitas, V.J.F.3; Lima, P.F.1,4; Oliveira, M.A.L.1,4

Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, 52171 900 Recife-PE maloufrpe@uol.com.br; ;
2
Laboratório de Nutrição Animal da Universidade Federal de Campina Grande – São João do
Cariri-PB; 3Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução - Universidade Estadual do
Ceará, Fortaleza - CE
O objetivo deste estudo foi determinar, pela ultra-sonografia, o período de migração do tubérculo
genital (TG) de fetos ovinos da raça Morada Nova (n = 117), originados de monta natural
controlada (MN) e de transferência de embriões congelados (TE), para estabelecer o momento
ideal de sexar precocemente. Os exames foram realizados do 30º ao 54º dia de gestação a intervalos
de 48 horas por via transretal, utilizando-se transdutor linear de dupla freqüência (6,0 e 8,0
MHz). Os dados foram estatisticamente avaliados pelo do teste de Qui-quadrado e do teste “F”,
com significância de 5%. No grupo de fetos da MN, a acurácia da sexagem fetal nas gestações
tríplices (77,8%) foi significativamente inferior (P < 0,05) àquelas das gestações simples (100%)
e duplas (92,9%). No grupo de fetos da TE não houve diferença (P > 0,05) entre as acurácias das
gestações simples (92,3%) e duplas (50,0%). O período médio de migração do TG de fetos da
MN foi de 39,5 ± 2,9 dias e no da TE foi de 48,5 ± 3,3 dias, registrando-se diferença (P < 0,05)
entre ambos. Os resultados permitem concluir que o período de migração do TG difere entre
fetos originados de MN e de TE, que o momento adequado para sexar fetos dessa raça é a partir
do 50º e do 55º dia de gestação, respectivamente, nos fetos provenientes de MN e de TE, que o
TG de fetos de TE na gestação múltipla pode migrar com diferença superior a 96 horas, mesmo
sendo do mesmo sexo, e que as gestações tríplices comprometem a acurácia do exame ultra-
sonográfico.
s573
DIAGNÓSTICO DE GESTAÇÃO EM OVELHAS DA RAÇA SANTA INÊS PELA

ULTRA-SONOGRAFIA TRANSRETAL E TRANSVAGINAL
Moraes, E.P.B.X.1; Santos, M.H.B.1; Aguiar Filho, C.R.1; Firmino, A.P.1; Paula, N.R.O.2;
Lima, P.F.1; Oliveira, M.A.L.1
1
Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Medicina Veterinária - UFRPE, Av. D
2
Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução - Universidade Estadual do Ceará,
Fortaleza – CE
Este estudo foi conduzido com o objetivo de comparar a eficiência do diagnóstico de gestação
em ovelhas (n= 145) pelas vias transretal e transvaginal utilizando, respectivamente, os
transdutores linear (6,0 e 8,0 MHz) e micro-convexo (5,0 e 7,5 MHz). Os exames ultra-
sonográficos, conduzidos sempre pelo mesmo operador e com a fêmea contida em posição de
estação, foram realizados em diferentes períodos da gestação. No Grupo I, as fêmeas (n = 30)
encontravam-se entre o 15º e o 29º dia de gestação, no Grupo II (n= 28) entre o 30º e o 59º dia, no
GIII (n= 35) entre o 60º e o 89º dia, no GIV (n= 32) entre o 90º e o 139º e o GV (n= 20) foi
formado por fêmeas vazias. Os dados foram estatisticamente avaliados pelo Teste-F com 5% de
significância. O tempo médio, em segundos, dispensado para a realização do diagnóstico de
gestação, respectivamente, pelas vias transretal e transvaginal foi de 9,02±5,57 e 11,74±7,06 no
GI, 13,90±16,49 e 11,37±12,19 no GII, 56,07±41,21 e 128,33±66,23 no GIII, 5,37±3,40 e
2,69±1,90 no GIV e 14,27±17,60 e 20,35±18,17 no GV. Foi registrado que o exame transretal foi
mais rápido no GI, no GIII e no GV, mais lento no GIV e igual no GII. Os resultados permitem
concluir que o diagnóstico de gestação em ovelhas pela ultra-sonografia, apesar da possibilidade
de ser realizado pela via transvaginal, a via transretal é mais recomendável em conseqüência da
rapidez do exame.
s574
CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS UILIZANDO

SUBSTÂNCIAS ANTIOXIDANTES (αα-TOCOFEROL E TERNATINA)
Lima-Verde, I.B.1; Bruno, J.B.2; Martins, F.S.2; Matos, M.H.T.2; Maia Jr, J.E.2;
Silva-Filho, F.J.M.2; Báo, S.N.3; Silveira, E.4; Santos, R.R.2; Silva, J.R.V.2;
Lima, P.F.1; Figueiredo, J.R.2; Rodrigues, A.P.R.2
1
Faculdade de Medicina Veterinária, PPGCV, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil; 2
Faculdade de Medicina Veterinária, PPGCV, LAMOFOPA, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE,
Brasil; 3Laboratório de Microscopia Eletrônica, Departamento de Biologia Celular, Universidade de Brasília,
Brasília, DF, Brasil; 4Universidade Federal do Ceará, CENAUREMN, Fortaleza, CE, Brasil.
isabel_limaverde@yahoo.com.br
O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos do α-tocoferol e da ternatina sobre
morfologia, ativação e crescimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro. O córtex
ovariano foi dividido em pequenos fragmentos, sendo um deles imediatamente fixado (controle).
Os fragmentos restantes foram cultivados por 1 ou 5 dias, a 39°C e 5% de CO2, em Meio Essencial
Mínimo (MEM) suplementado com insulina, transferrina e selênio (ITS), piruvato, glutamina,
hipoxantina, BSA, penicilina, estreptomicina e fungizona e na presença ou ausência de 5, 10 ou
15 μM de α-tocoferol ou ternatina. No controle e após cada período de cultivo, em cada tratamento,
os fragmentos ovarianos foram fixados em formol 10% ou em paraformaldeído 2% e glutaraldeído
2,5% para avaliação histológica e ultra-estrutural, respectivamente. Os folículos pré-antrais foram
classificados em primordiais ou em desenvolvimento e ainda em normais ou degenerados. Todos
os tratamentos foram analisados através de ANOVA (efeito do meio e da concentração). Os
dados foram comparados utilizando o Teste de Bonferroni. A comparação do percentual de
folículos morfologicamente normais em todos os tratamentos foi realizada através de Qui-quadrado
(P < 0,05). Em relação ao controle, o cultivo in vitro levou a uma redução do percentual de
folículos morfologicamente normais (P < 0,05) em todos os tratamentos com α-tocoferol e
ternatina após 5 dias de cultivo. Exceto para o cultivo in vitro realizado somente com MEM,
uma redução mínima e máxima do percentual de folículos normais foi observada nos tratamentos
com 5 μM de ternatina e 15 μM de α-tocoferol, respectivamente em todos os períodos de cultivo.
Para ambas as substâncias, a concentração menos tóxica foi de 5 μM após 1 ou 5 dias de cultivo.
Quando comparado ao controle, o cultivo de córtex ovariano por 5 dias aumentou o percentual
de folículos pré-antrais ativados em todos os tratamentos (P < 0,05). Em comparação ao MEM
sozinho, a adição de á-tocoferol ou ternatina não afetou os percentuais de ativação folicular (P >
0,05), exceto no dia 1, quando as concentrações de 5 e 15 μM foram utilizadas, respectivamente
e mostraram um aumento significativo nesse parâmetro, em comparação com os demais
tratamentos. Após 5 dias de cultivo, ternatina 10 μM e MEM sozinho tiveram resultados
semelhantes. Com relação ao diâmetro folicular não foi observada diferença significativa entre
os tratamentos e períodos de cultivo, exceto para o cultivo feito com 15 μM de á-tocoferol após
1 dia, que mostrou uma redução neste parâmetro (P < 0,05). Embora a análise histológica tenha
mostrado folículos morfologicamente normais, a análise ultra-estrutural mostrou que folículos
cultivados por 5 dias em meio contendo antioxidantes mostraram-se degenerados. Por outro
lado, folículos presentes no tecido ovariano não cultivado ou cultivado somente na presença de
MEM por 5 dias, mantiveram sua ultra estrutura normal. Em conclusão, este estudo demonstrou
que á-tocoferol e ternatina podem atuar promovendo a ativação folicular, embora a integridade
morfológica da grande maioria dos folículos pré-antrais não seja mantida por até 5 dias de cultivo
in vitro nas condições de utilização dessas substâncias testadas neste experimento.
s575
ULTRA-ESTRUTURA DE COMPLEXOS CUMULUS-OOPHORUS COMPACTO DE

EQÜINOS
Boff, A.L.N.1; Curcio, B.R.1; Lins, L.2; Velho, J.2; Larvada, A.2; Albuquerque, L.P.2;
1
Centro de Biotecnologia (CENBIOT)/UFPel; 2 Dep. Clínicas Veterinárias/FV/UFPel, Campus
Universitário s/n°-Caixa Postal 354 CEP 96010-900, Pelotas/RS. alnboff@yahoo.com.br
O objetivo deste estudo foi descrever características ultra-estruturais de complexos cumulus-

oophorus (CCO) da espécie eqüina. Os oócitos utilizados foram coletados de ovários provenientes
de abatedouro, pelo método de curetagem da parede de folículos entre 10 e 30 mm de diâmetro.
CCO compactos (n=10) foram imediatamente fixados em glutaraldeido e paraformaldeído a
2%, por 1h à temperatura de 4°C. Posteriormente, os mesmos sofreram 3 lavagens de15 min em
solução tampão de cacodilato de sódio 0,1M e sacarose 0,2M. Os CCO foram transferidos para
tetróxido de ósmio a 1%, à temperatura de 4°C por 2h. Após a fixação ósmica, foram lavados
em água destilada, desidratados em concentrações crescentes de etanol (30, 50, 70, 90 e 100%)
e incluídos em blocos de resina. A polimerização foi realizada em estufa por 24h à 80°C. Os
blocos foram submetidos a cortes ultrafinos de 50-70 nm, transferidos para grades de cobre de
200 mesh e contrastados por acetato de uranila e citrato de chumbo. Esses cortes foram observados
e fotografados em microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss-EM109). Dois oócitos (20%)
apresentaram células do cumulus dispersas, sinais de apoptose, tumefação na matriz mitocondrial
e nas cisternas do complexo de Golgi. As estruturas desses dois CCO sugerem a ocorrência de
degeneração celular. O restante dos CCO (80%) estavam com as organelas citoplasmáticas
íntegras. As mitocôndrias apresentaram-se distribuídas por todo citoplasma, com tendência a
formação de grupos, demonstraram formato oval ou alongado e as criptas mitocondriais evidentes.
Foram identificados poucos grânulos corticais nos oócitos, os quais estavam dispersos no
ooplasma, caracterizando oócito imaturo. Em oócitos maturos os grânulos corticais apresentam-
se esféricos, densos, com tamanho e forma homogêneos, formando monocamada sob a membrana
citoplasmática. O complexo de Golgi dos oócitos apresentou-se formado por duas ou três cisternas
e circundado por numerosas vesículas esféricas. Foi observada zona pelúcida com estrutura
fibrilar, rica em junções que unem as microvilosidades do oócito às projeções das células do
cumulus. Observaram-se gotas lipídicas (GL) esféricas, sem membrana delimitante,
medianamente eletrodensas e, algumas vezes, circundadas por halo eletrolúcido. A presença
desse halo pode significar que as GL são compostas, em sua maioria, por ácidos graxos insaturados
ou que os lipídios que as compõem já iniciaram a metabolização. A distribuição e conformação
das organelas citoplasmáticas sugerem que CCO compactos eqüinos, recuperados de folículos
entre 10 e 30 mm de diâmetro, encontram-se imaturos no momento da coleta.
s576
QUANTIFICAÇÃO E MORFOMETRIA DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS DE FETOS

BUBALINOS
Santos, S. S.D.1; Ferreira, M.A.P.1; Silva, M.S.1; Cordeiro, M.S.2;

Biondi, F.C.2; Ohashi, O.M.2
1
Departamento de Histologia e Embriologia - CCB/UFPA, Belém-PA, Brasil; 2 Laboratório
de Fertilização in vitro - CCB/UFPA, Belém-PA, Brasil; damasc@ufpa.br
As técnicas de isolamento e de cultivo de folículos pré-antrais têm sido aplicadas na espécie

bubalina (GUPTA et al., Veterinary Record, 148, 543-544, 2001; SANTOS, Isolamento,
quantificação e cultivo de folículos pré-antrais de fetos bubalinos. Tese de Doutorado, Curso de
Pós-graduação em Ciências Biológicas, UFPA, 2002). A foliculogênese foi estudada em fetos
(EL-GHANNAM et al., Zbl. Vet. Med. Association, 22, 248-255, 1975) e em animais adultos
(DANELL, Oestrus behaviour, ovarian morphology and cyclical variation in follicular system
and endocrine pattern in water buffalo heifers. Tese de Doutorado, Universidade de Uppsala,
Suécia, 1987; SMITH et al., III World Buffalo Congress – Proceedings, 86, 1991; LE VAN TY et
al., Animal Reproduction Science, 19, 171-178, 1989; KUMAR et al., Animal Reproduction
Science, 47, 189-195, 1997). Tendo em vista a escassez de trabalhos referentes à foliculogênese
inicial em bubalinos, os objetivos do presente trabalho foram quantificar e descrever as
características morfométricas de folículos pré-antrais de fetos bubalinos. Ovários de quinze
fetos bubalinos entre 3 e 7 meses de idade, determinada segundo ABDEL-RAOUF & EL-NAGGAR
(UAR J. Vet. Sci., 5, 37-43, 1968), foram coletados em abatedouro e fixados em formol a 10% e
Karnovsky para processamento histológico de rotina e microscopia eletrônica de varredura e
transmissão. Para estimar o diâmetro oocitário e folicular utilizou-se uma ocular micrométrica acoplada
ao microscópio de luz com análise na objetiva de 40 x, fazendo-se também a contagem do número de
células da granulosa que circundam oócito. A quantificação folicular foi feita utilizando-se a
metodologia utilizada por GOUGEON & CHAINY (J. Reprod. Fertil., 81, 433-442, 1987).
Respectivamente para fetos com idade de 3, 4, 5, 6 e 7 meses, o número médio de folículos pré-
antrais por ovário observado foi de: folículos primordiais- 31.661,7 (± 3.173,5) , 56.363,8 (±
29.635,4) , 56.396,1 (± 5.219,4) , 31.028,3 (± 10.208,3) e 21.757,5 (± 28.231,4); folículos primários-
13.858,6 (± 6.334,6), 13.571,4 (± 10.834,9), 25.831,6 (± 11.755,7), 24.811,6 (± 23.612,9) e 12.692,05
(± 16.414,6); folículos secundários 592,1 (± 698,1), 636,6 (± 609,8), 1.129,4 (± 923,3), 1.453,5(±
1.760,7) e 829,2 (± 1.086,5). Os diâmetros folicular e oocitário e o número de células foliculares
foram de 28,9 ( ±3,4), 21,7 (± 2,8) e 7,1 (±1,4); 34,7 (± 5,9), 24,3 (± 3,4) e 12,0 (± 2,4); 59,4 (± 12,6),
33,0 (± 7,7) e 13,8 (± 2,4) para folículos primordial, primário e secundário, respectivamente.
Observou-se que a foliculogênese está estabelecida aos 3 meses, com a presença de folículos
primordiais e folículos em desenvolvimento.
s577
DEFINIÇÃO DE ÁREA MÍNIMA REPRESENTATIVA PARA ANÁLISE DE

IMAGENS ULTRA-SONOGRÁFICAS DE CORPOS LÚTEOS BOVINOS
Viana, J.H.M.1; Siqueira, L.G.B.2; Diniz, E.S.1; Camargo, L.S.1; Oliveira, E.R.4;
Fonseca, J.F.3; Fernandes, C.A.C.4
1
Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG 36038-330; 2Universidade Federal de Viçosa,
Viçosa, MG 36571-000; 3Embrapa Caprinos, Sobral, CE 62011-970; 4Biotran Ass. e Consult.
Repr. Anim. Ltda, Alfenas, MG 37130-000; jhmviana@cnpgl.embrapa.br
A ultra-sonografia é uma técnica segura, não-invasiva, de execução simples e de resultados

imediatos, que possibilita o estudo de órgãos internos pela geração de imagens bi ou
tridimensionais correspondentes aos cortes e/ou superfícies em estudo. Seu advento possibilitou
um significativo avanço no estudo da função reprodutiva, tanto na medicina humana como
veterinária, particularmente em áreas como dinâmica do crescimento folicular na fase antral,
ovulação, função luteal e gestação inicial. Paradoxalmente, grande parte dos estudos com emprego
de ultra-sonografia limita-se a identificação da presença e mensuração de diâmetro ou área das
estruturas, e apenas recentemente começou-se a usar diferenças de ecogenicidade (um dos
princípios de formação da imagem ultra-sonográfica) como parâmetro de avaliação. No caso
específico do corpo lúteo, estas diferenças refletem variações na vascularização e na proporção
de células luteais e, consequentemente, na capacidade esteroidogênica do tecido. Entretanto,
ainda não foi estabelecida uma metodologia padrão para o emprego da análise de ecogenicidade
em tecido luteal. Objetivou-se, no presente trabalho, estabelecer a área mínima representativa
(AMR) de imagem para análise de ecogenicidade luteal. Imagens ultra-sonográficas de corpos
lúteos foram obtidas de animais no 10º dia do ciclo, utilizando-se um aparelho portátil (Aloka
SSD 500, Aloka Co.) equipado com um transdutor linear retal de 5MHz. As imagens foram
gravadas em vídeo e posteriormente digitalizadas em formato TIF, resolução de 1500x1125, por
meio de uma placa de captura de vídeo (Pinnacle DC10, Pinnacle Systems). Utilizando-se um
software específico, 10 áreas delimitadas e decrescentes foram analisadas quanto à densidade,
sendo que cada ponto da imagem (pixel) recebeu um valor numérico variando de 0 (preto) a 256
(branco). Foi utilizado o critério proposto por Van den Bygaart & Protz (1999), sendo definida
como AMR a área na qual o valor do parâmetro (ecogenicidade) não varia em mais que ±5% em
relação à maior medida. A análise partiu de uma área de 10x10mm (10.404 pixels, A1), sendo
reduzida para 7,5x7,5 (5.929 pixels, A2), 5x5 (2.704 pixels, A3), 2,5x2,5 (729 pixels, A4) e
1,25x1,25mm (187 pixels, A5). O valor médio da ecogenicidade de corpos lúteos de vacas no
10º dia do ciclo foi de 76,67±16,06. A variação média absoluta na ecogenicidade em relação a
primeira medida (A1) foi de 2,83% para A2, 4,25% para A3, 8,58% para A4 e 13,44% para A5.
Não houve uma tendência de variação positiva ou negativa entre os animais. Desta forma, a
AMR foi estabelecida em 25mm2, equivalente a 2.704 pixels, para análise de tecido luteal. Esta
área, contudo, deve ser reavaliada quando empregados transdutores com outras freqüências ou
haja variação no formato de captura.
s578
MONITORAMENTO ULTRA-SONOGRÁFICO DA GESTAÇÃO DE OVELHAS

SANTA INÊS PARA DETERMINAR A MORTALIDADE E IDENTIFICAR O SEXO
DOS CONCEPTOS
Moraes, E.P.B.X.; Santos, M.H.B.; Chiamenti, A.; Rocha, J.M.; Falcão, D.P.;
Albuquerque Filho, P.P.; Firmino, A.P.; Lima, P.F.; Oliveira, M.A.L.
Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Medicina Veterinária - UFRPE, Av. Dom

Este estudo foi conduzido com o objetivo de monitorar ultra-sonograficamente a fase inicial da
gestação para determinar as perdas embrionária e fetal, bem como identificar o sexo dos conceptos
de ovelhas da raça Santa Inês. As fêmeas (n= 132), submetidas à monta natural controlada,
foram examinadas no 30º dia após a cobertura para diagnosticar a gestação, no 35º para confirmar
a gestação e observar a viabilidade ou a perda de embriões e no 40º, 50º e 60º dias para avaliar a
perda e identificar o sexo dos fetos, utilizando-se um transdutor linear (6,0 e 8,0 MHz) por via
transretal. O sexo identificado por meio da localização do tubérculo genital ou da visualização
de alguma estrutura da genitália externa. Os dados foram estatisticamente avaliados pelo teste
Qui-quadrado com 5% de significância. Das 118 fêmeas gestantes, 76 (64,4%) apresentaram
gestação simples e 42 (35,6%) múltipla, sendo observado que o número de fêmeas com gestação
simples foi maior (P < 0,05) do que o de gestação múltipla. Dos 160 conceptos monitorados
foram registradas 10,0% (16/160) de perdas, sendo 5,6% (9/160) durante a fase embrionária e
4,4% (7/160) na fase fetal, não havendo diferença (P > 0,05) entre ambas as fases. Nas gestações
simples, a perda de conceptos equivalente a 3,9% (73/76) foi significativamente menor (P <
0,05) do que nas gestações múltiplas, 15,5% (71/84). A acurácia da sexagem fetal no 40º dia da
gestação foi significativamente inferior (P < 0,05) ao do 60º dia, não havendo diferença (P >
0,05) entre o 40º e o 50º dia, bem como entre o 50º e o 60º dia. Os resultados deste estudo
permitem concluir que a técnica da ultra-sonografia é um método eficaz para diagnosticar
precocemente a gestação, monitorar as perdas embrionária e fetal e identificar o sexo de fetos da
raça Santa Inês a partir do 50º dia de gestação.
s579
AVALIAÇÃO DE DOIS MÉTODOS DE COLORAÇÃO PARA ANÁLISE

MORFOLÓGICA E ACROSSOMAL DE ESPERMATOZÓIDES DE GATO
DOMÉSTICO (Felis catus)
Villaverde, A.I.S.B.1; Melo, C.M.1; Corrente, J.E.2; Papa, F.O.1; Lopes, M.D.1
1
Depto de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária- FMVZ-UNESP, 18618-000,
Botucatu-SP, Brasil, 2 Depto de Bioestatística-IB-UNESP, Botucatu-SP, Brasil.
anavillaverde@fmvz.unesp.br
Os testes utilizados para avaliação espermática in vitro são importantes, uma vez que oferecem
indícios sobre a capacidade fertilizante dessas células; dentre esses testes se destacam a morfologia
espermática e, principalmente, a determinação do “status” acrossomal, analisados através de
preparações úmidas, esfregaços corados ou sondas fluorescentes. O objetivo do estudo foi a
validação do método de coloração Karras (KA) (modificado por Papa et al., 1988; Arq. Bras.
Med. Vet. Zoot., 40, 115-123), através de comparação com a coloração Fast Green FCF/ Rosa
Bengala (FR) (Pope et al., 1991; J. Zoo Wild. Med., 22, 87-95), para a avaliação de sêmen de
gato doméstico. Amostras de sêmen foram coletadas quatro vezes, em dias alternados para cada
gato (n=4), através de vagina artificial (n=16). Após a coleta, foram realizados esfregaços com
sêmen in natura e, subseqüentemente, 5µl do material restante foram diluídos em 45µl de
citrato de sódio a 2,9%. Para a coloração de FR, à mistura de sêmen e citrato de sódio foram
adicionados 50µl da solução de coloração (1% Fast Green FCF e 1% rosa bengala) e, após 70
segundos à temperatura ambiente, 5 a 10µl da mistura foram utilizados para realização de
esfregaços em lâminas, as quais foram secas à 37ºC. Para a coloração de KA, as lâminas,
previamente, confeccionadas com sêmen in natura foram fixadas em formol salino, por 5 segundos
e secas à 37ºC. A seguir, as lâminas foram imersas, por 2 minutos em solução de Rosa bengala,
1 minuto em solução de Tanino e 30 segundos em solução de Azul Vitória, sendo realizadas
lavagens em água corrente logo após o término de cada imersão e secagem das mesmas em
temperatura ambiente. Foram avaliadas 200 células, por lâmina, para as duas colorações,
utilizando-se microscópio ao aumento de 1000X. A análise estatística foi realizada utilizando-se
o teste não paramétrico de Wilcoxon, estabelecendo diferença significativa quando p<0,05. A
região acrossomal foi corada em azul escuro (KA) ou azul arroxeado (FR) quando o acrossomo
se encontrava intacto ou rosa claro (FR e KA) na ausência do acrossomo. Para as patologias
espermáticas avaliadas (defeitos de cauda, de peça intermediária e de cabeça, incluindo
acrossomo), não foi encontrada diferença significativa entre as duas colorações. Mesmo não
sendo estatisticamente diferente, devido à variação individual, a freqüência de gota citoplasmática
foi maior na coloração de KA, talvez em conseqüência de diferenças no processo de fixação ou
de coloração. Embora a coloração de KA tenha permitido melhor visualização da gota
citoplasmática, ambos os métodos se mostraram eficientes para a avaliação do sêmen de gato
doméstico, apresentando vantagens, tais como: exeqüibilidade, rapidez, baixo custo e análise da
membrana acrossomal, característica relacionada com a fertilidade do animal.
Agradecimentos: FAPESP, Nestlé/Purina e Merial
s580
ANÁLISE ULTRAESTRUTURAL DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS OVINOS

DESCONGELADOS
Tsuribe, P.M.; Landim-Alvarenga, F.C.
1
SP, 18618-000, Brasil
A criopreservação de tecido ovariano pode ser aplicada no transplante de córtex ovariano para o
restabelecimento da produção cíclica de ovócitos ou no cultivo e maturação in vitro de folículos
primordiais para a obtenção de ovócitos na produção in vitro. Poucos estudos comparam a
utilização de diferentes crioprotetores e seus efeitos tóxicos no tecido ovariano. Sendo assim, o
objetivo deste experimento foi de comparar as características ultraestruturais de folículos pré-
antrais ovinos criopreservados em DMSO, Etilenoglicol (EG) e sua associação. Cinqüenta ovários
de ovelhas com 12 a 24 meses de idade foram transportados até o laboratório em solução fisiológica
a 25 oC e processados.Pequenos fragmentos (0,2-0,3cm) da cortical ovariana foram obtidos e
imersos em Leibovitz L-15 com 10% SFB e 50ug/ml gentamicina por 5 minutos. Os fragmentos
foram então divididos em 4 grupos: controle; EG; DMSO e DMSO/EG (n=50/grupo). Para
congelação os fragmentos foram mantidos em uma solução 1,5M EG/DMSO/DMSO+EG por
10 minutos e então transferidos a uma solução 1,5M EG/DMSO/DMSO+EG + 0,25M sacarose
por mais 10 minutos. Nesta solução os fragmentos foram acondicionados em criotubos e
transferidos a um congelador programado (Freeze Control, Cryologic Pty Ltd, Waverley, Austrália).
A curva de congelação foi de 2,0ºC/min até -9ºC; estabilizando a essa temperatura por 10 minutos
para o procedimento de cristalização; a partir daí a temperatura baixou 0,3ºC/min até -40ºC;
10ºC/min até -140ºC e estocou-se em nitrogênio líquido. Para descongelação os criotubos foram
mantidos a temperatura ambiente por 20min e em banho maria a 37ºC por 25 min. Os fragmentos
foram transferidos ao meio Leibovitz L-15 + 10%SFB + gentamicina + 1M EG/DMSO/
EG+DMSO + 0,5M sacarose por 10 minutos seguindo a outros 10 minutos em solução com
0,5M EG/DMSO/EG+DMSO + 0,5M sacarose. Após a remoção dos crioprotetores os fragmentos
foram transferidos ao meio Leibovitz L-15 com 10% SFB por 20 min e fixados em glutaraldeído
2,5% para a microscopia eletrônica de transmissão. Neste estudo somente a morfologia dos
folículos pré-antrais foi avaliada. Logo após a coleta, os folículos pré antrais apresentavam
ovócito com núcleo intacto e citoplasma contendo grânulos lipídicos heterogêneos e grande
numero de mitocôndrias arredondadas ou alongadas com as cristas mitocondriais paralelas e
intactas. Ocasionalmente estas organelas apareceram associadas ao retículo endoplasmático liso
(REL). Retículo endoplasmático rugoso (RER) raramente foi encontrado. O citoplasma das células
da granulosa continham um grande número de mitocôndrias e RER. Em contraste, os folículos
criopreservados de todos os grupos continham um maior número de vacúolos no citoplasma
ovocitário, sugerindo um processo inicial de degeneração. Além disso, folículos pré-antrais
criopreservados em DMSO e EG+DMSO também apresentaram danos mitocondriais. Nestes
grupos as mitocôndrias dos ovócitos bem como as células da granulosa apresentavam aspecto
escurecido e retraído. A partir dos resultados obtidos neste experimento foi possível concluir que
apesar da criopreservação induzir a danos nos folículos pré-antrais ovinos, o uso de EG resultou
em menores injúrias celulares. Agradecimento: FAPESP - 02/02705-7
s581
VIABILIDADE DE FIBROBLASTOS EQÜINOS COM CICLO CELULAR

SINCRONIZADO POR DOIS MÉTODOS
Lima-Neto, J.F.1; Fernandes, C.B.1; Dores, C.B.1; Golim, M.A.2;

Silva, V.A.2; Landim-Alvarenga, F.C.1
1
SP, 18618-000, Brasil, 2 Hemocentro – FM/UNESP, Botucatu, SP, 18618-000, Brasil
joaoferreiralima@yahoo.com.br
A indução da sincronização do ciclo celular de fibroblastos utilizados para transferência nuclear

normalmente é feita através de privação de soro ou do cultivo das células até a confluência.
Estes métodos suprimem o crescimento das células devido, a privação de fatores de crescimento
presentes no soro ou ao contato intercelular inibitório durante a confluência. O objetivo deste
trabalho foi comparar os dois métodos de sincronização, avaliando a viabilidade e a fase do ciclo
celular. Fragmentos de pele de fêmeas eqüinas foram divididos em pedaços de aproximadamente
1mm3 e acondicionados (10 fragmentos/garrafa) no fundo de duas garrafas de cultivo (25cm2)
umedecidas com 1ml SFB. As garrafas foram inclinadas para a posição vertical e adicionado
5ml de meio DMEM acrescido de 10% SFB. Após 40 minutos em estufa com 5% CO2 em ar, as
garrafas foram viradas para a posição horizontal, para que o meio de cultivo entrasse em contato
com os fragmentos teciduais. Todas as garrafas permaneceram por sete dias em estufa com 5%
CO2 em ar até o início do crescimento celular. Com 70% de confluência, foi realizada a
tripsinização e a primeira passagem. O mesmo procedimento foi repetido para a segunda passagem.
Para os grupos de privação de soro (0.5% de SFB) foram produzidas garrafas de cultivo em
duplicata para a análise da viabilidade e do ciclo celular nos períodos de 24, 48, 72, 96, 120, 144
e 168 horas de cultivo. Para os grupos de confluência foram produzidas duas garrafas de cultivo
para a análise da viabilidade e do ciclo celular no período em que o tapete celular atingisse a
confluência. Na análise da viabilidade as células foram coradas com 30μl de Hoescht 33342
(10mg/ml) por 30 minutos, e 30μl de Iodeto de Propídeo (1mg/ml) por 5 minutos. A análise foi
realizada em microscopia de fluorescência, onde células com núcleo corado em azul representavam
a população de vivas, e as coradas em vermelho representavam as mortas. Foram observados 10
campos/ garrafa. A análise do ciclo celular foi realizada por meio do Citômetro de Fluxo FACS
Calibur BD® de acordo com o protocolo descrito por Yu et al. (Theriogenology, 59: 1277-1289.
2003) verificando a porcentagem de células em estágio G0-G1. Nos grupos confluência e 72
horas de privação de SFB foram obtidas as melhores taxas de sincronização do ciclo celular
(90,95% e 88,76% respectivamente). Períodos maiores de privação de SFB não resultaram em
aumento na porcentagem de células em G0-G1. Observou-se uma redução de 15,5% da viabilidade
celular até 72 horas de privação de SFB, a partir deste período às taxas se mantiveram constantes
dê em média 78%, similar ao encontrado no grupo confluência (76%). Tanto a confluência quanto
a privação de SFB foram eficientes na sincronização do ciclo celular. Embora a manutenção das
células por um maior tempo em cultivo não tenha modificado a viabilidade celular, 72 hs em
condições de privação de SFB já foram suficientes para obtenção de condições satisfatórias de
sincronização e viabilidade.
Agradecimentos: CNPq, FAPESP processo nº 04/00822-1
s582
ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS NOS ÓRGÃOS GENITAIS DE CÃES E GATOS

PROVENIENTES DE VILAS RURAIS DA REGIÃO DE UMUARAMA-PR*
Previato, P.F.G.1; Pinto-Neto, A.2; Werner, P.R.3; Acco, A.4; Mota, M.F.5;
Silva, A.V.2; Fonseca, J.F.6
1
Médica Veterinária. Especialista em Clínica e Cirurgia de Pequenos Animais – UNIPAR.
Umuarama-PR; 2 Professores do Curso de Mestrado em Ciência Animal - UNIPAR.
Umuarama-PR. E.mail: adalgiza@unipar.br; 3 Professor da UTP. Curitiba-PR.; 4Professora da
UFPR. Curitiba-PR.; 5Professor do Curso de Medicina Veterinária – UNIPAR. Umuarama-PR;
6
Pesquisador CNPC-EMBRAPA– Coronel Pacheco-MG.
Enfermidades nos órgãos reprodutivos de cães e gatos têm variados graus de morbidade,
mortalidade e sofrem influências do histórico reprodutivo, de tratamentos farmacológicos prévios
e de condições ambientais, podendo assim haver variações regionais na incidência de determinadas
anormalidades reprodutivas. O objetivo desse estudo foi fazer um levantamento da incidência
das alterações morfológicas nos órgãos genitais de cães e gatos provenientes de Vilas Rurais da
região de Umuarama, associar a freqüência de cada alteração à espécie, sexo, uso de contraceptivo
e número de partos e discutir as principais alterações encontradas. Foram examinados os órgãos
reprodutivos de 208 animais assim distribuídos: 36,06% eram cadelas, 33,65% cães, 14,90%
gatas e 15,38% gatos, todos sem raça definida e idade variando de um mês a dez anos. Dos
animais examinados, 9,13% apresentaram alterações, classificadas como hiperplasia cística do
endométrio (5,29%), endometrite (0,96%), retenção de placenta (0,48%), fibrose endometrial
(0,48%), degeneração testicular (0,96%), hipoplasia testicular (0,48%) e hemangiossarcoma no
pênis (0,48%). Ao se agrupar as alterações não se observou associação entre freqüência de
alterações e espécie (P>0,05), sendo 10,30% e 6,30% para alterações nas espécies canina e felina,
respectivamente. No entanto, observou-se associação (P<0,05) entre freqüência de alterações e
sexo, sendo que 14,15% estavam presentes em fêmeas e 3,90% em machos. Animais senis
apresentaram maior freqüência de alterações nos órgãos genitais (P<0,05) do que animais jovens.
A freqüência de alterações não se associou positivamente ao uso de contraceptivo, à presença de
gestação e ao número de partos, embora tenha se observado maior número de alterações patológicas
em fêmeas que já tinham parido.
*Apoio financeiro: IPEAC-UNIPAR (Protocolo: 1714/01)
s583
QUAL A REAL EFICIÊNCIA DOS PROTOCOLOS DE SUPEROVULAÇÃO PARA A

PRODUÇÃO DE EMBRIÕES EM CAMUNDONGOS DE LINHAGENS INBREED?
Wohlres, S.1; Pinto, I.S.B.1; Batista, R.I.T.1; Faza, A.P.1; Paiva, F.P.3; Maffili, V.V.3;
Camargo, L.S.1,2; Viana, J.H.M.1,2
1
Centro de Ensino Superior de Juiz de Fora, Juiz de Fora, MG 36016-000; 2Embrapa Gado de
Leite, Juiz de Fora, MG 36038-330; 3Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz - Fiocruz, Salvador,
BA 40295-001; binewjf@hotmail.com
O camundongo é um excelente modelo experimental para o estudo de embriologia, em função

da prolificidade, baixo custo de manutenção e rapidez de resposta. Camundongos (Mus musculus)
geram entre 6 e 12 conceptos por ninhada em reprodução natural, dependendo das condições de
manejo e da linhagem utilizada. A obtenção de embriões para fins de pesquisa geralmente é
realizada após a indução da superovulação pela administração intraperitoneal de eCG e hCG
seguida de recuperação das estruturas produzidas pela lavagem da tuba e/ou útero, 48 a 96h após
a cobertura. O eCG apresenta a vantagem de ter uma maior meia vida, possibilitando a execução
do protocolo com uma única aplicação, porém a inconsistência de resultados levou ao seu
abandono como droga de eleição para indução de superovulação em outras espécies. Objetivou-
se neste trabalho avaliar a eficiência de um protocolo convencional de superovulação para
pequenos roedores. Camundongas inbred das linhagens C57Bl/6 (N=69) e Swiss (N=57) foram
superovuladas pela aplicação I.P. de 5U.I. de eCG (Novormon, Syntex S.A.) e, após 48h, de
5U.I. de hCG (Vetecor, Calier), sendo cobertas por machos da mesma linhagem, ou foram liberadas
para reprodução natural (N=80 e 92, respectivamente). A recuperação dos embriões foi realizada
48 a 60 horas após a observação do plug vaginal, utilizando-se DPBS com 0,4% de BSA. As
estruturas identificadas foram classificadas quanto ao estádio de desenvolvimento e qualidade,
conforme critérios convencionais. Os resultados estão apresentados como médias±EPM. Não
houve diferença (P>0,05) no total de estruturas recuperadas (13,65±1,36 vs. 16,63±1,52) ou no
número de embriões viáveis (7,82±1,04 vs. 9,09±1,16) e não fecundados (3,25±0,48 vs. 3,23±0,45)
entre as duas linhagens (C57Bl/6 e Swiss, respectivamente). O número de degenerados na linhagem
C57Bl/6, contudo, foi menor (2,58±0,33 vs. 4,31±0,54; P<0,01). O percentual de embriões viáveis
foi semelhante nas duas linhagens (57,29% e 54,66; P>0,05). A resposta superovulatória em
camundongos inbreed pode ser considerada baixa, considerando-se o número de filhotes gerados
por reprodução natural nestas linhagens (6,28±0,23 e 9,96±0,35 para C57Bl/6 e Swiss,
respectivamente). A inconsistência dos tratamentos superovulatórios, caracterizada pelo elevado
CV ocorreu a despeito do uso de linhagens com alta homozigose e, consequentemente, baixa
variância genética. Estes resultados demonstram a necessidade do aperfeiçoamento dos protocolos
de produção de embriões em experimentos com camundongos.
s584
A PLACENTAÇÃO VITELINICA EM EMBRIÕES BOVINOS NO INÍCIO DE

GESTAÇÃO
Mançanares, C.A.F.1,2; Carvalho, A.F.1; Santos, J.M.2; Alberto M.L.V.2; Assis Neto, A.C.3;
Ambrósio, C.E.2; Martins, D.S.2; Toquetti, R.C.2; Miglino, M.A.2
1
UNIFEOB , São João da Boa Vista, São Paulo, Brasil, 2Universidade de São Paulo, FMVZ,
Departamento de Cirurgia, São Paulo, São Paulo, Brasil, 3Faculdade de Dracena - UNESP,
Dracena, São Paulo, Brasil. celina@feob.br.
O saco vitelínico é a principal fonte de nutrição do embrião durante o período em que a placenta
verdadeira ainda não está completamente formada, e sua importância também está relacionada à
hematopoiese, pois dele se desenvolvem os primórdios das células sanguíneas, bem como parte
do sistema circulatório primitivo do embrião. Essas estruturas estão altamente relacionadas ao
bom desenvolvimento de um embrião, uma vez que delas depende a nutrição, proteção e também
a formação de órgãos fundamentais para a sobrevivência, como o intestino primitivo, que se
desenvolve a partir do saco vitelínico. Aproximadamente 25 a 40% dos embriões de bovinos são
perdidos entre o período de penetração dos espermatozóides no óvulo e o processo final de
implantação. Este trabalho objetivou estudar a área transicional do intestino primitivo do embrião
com o saco vitelino e inferir sobre sua importância na manutenção do concepto até a formação
placentária. Foram coletados 59 estruturas entre embriões e feto de 10 a 50 dias de gestação,
processados e incluídos rotineiramente em parafina e realizadas as mensurações do Crow-Rump
(EVANS, Anat., Histol., Embryol., vol.2, p.11-45). Foram feitos cortes seqüenciais de todos os
embriões para permitir a visualização da estrutura almejada como um todo. Os cortes foram
corados por HE. Nas amostras, podemos observar a presença do saco vitelino com células ativas
e a área de conecção do intestino primitivo na sua porção anterior com o saco vitelino. O intestino
primitivo apresentou epitélio iniciando sua diferenciação com células colunares estratificadas e
bordadura em escova (endoderma) seguida logo abaixo por células mesenquimais indiferenciadas
provenientes do mesoderma. O saco vitelino com 10 a 20 dias de gestação apresentou uma área
centralmente compacta com duas extremidades longas e finas e com 40 dias após a fecundação
estas diminuíram de tamanho. O saco vitelino era composto por inúmeras ilhas vasculares que
correspondem ao local onde os vasos são envolvidos pelas células vitelínicas (endodérmicas) e
células mesenquimais (mesoderma). No interior dos vasos foi possível identificar um grande
número de hemácias nucleadas (hemangioblastos) de origem fetal. A camada que corresponde
ao mesênquima era delgada e com células alongadas caracteristicamente sintetizadoras de
proteoglicanas presentes na matriz. O endoderma da membrana vitelínica era compostos pelas
células endodermais, grandes, uni o bi-nucleadas e muitas vezes com 2 núcleolos. Este arranjo
celular era semelhante a um arranjo glandular devido a sua arquitetura em ilhas vasculares somado
às camadas teciduais (endoderma e mesoderma). A área transicional entre o saco vitelínico e o
intestino primitivo era estreita em relação à luz destas duas estruturas e possuía células de formato
irregular, ora achatadas, ora globosas formando um delicado revestimento na luz desta região.
No interior (lúmen) havia a presença de hemangioblastos e figuras indicando a passagem destas
células para o mesênquima. Entretanto, esse ultimo tipo de tecido apresenta hemangioblastos em
pequenas redes de capilares. Então, qual é a real função do saco vitelino e a nutrição vitelínica é
marcada como a primeira adversidade no ambiente de vida embrionária?
s585
FUSÃO CARUNCULAR EM VACAS PRENHES
Pereira, F.T.V.1; Barreto, R.S.N.1; Miglino, M.A.2; Silva, S.M.1; Burioli, K.C.1
1
UNESP – Dracena, Dracena, SP; 2FMVZ-USP, São Paulo, SP. rsnbarreto@yahoo.com.br
Os primeiros relatos sobre as carúnculas datam de 1834 por BURCKHARDT, e os de fusão

caruncular em 1966 por ZIEGER e ZSCHIESCHE, mas ainda hoje a literatura sobre este assunto
é escassa. Este trabalho caracteriza macro e microscopicamente a fusão caruncular nos diferentes
estágios de gestação natural de bovinos, para posterior comparação com a de bovinos clonados.
Foram coletados em abatedouro 24 úteros prenhes divididos em quatro grupos pelo tempo de
gestação (30 a 90, 102 a 184, 210 a 240 e 241 a 270 dias). O material foi fixado com solução
aquosa de formoldeído a 10% em tampão fosfato 0,1M pH 7,4 ou com paraformoldeído a 4% no
mesmo tampão, embebidos em Histosec® (Merck) ou Historesina® (Leica). Os cortes foram
corados com H&E, tricrômico de Masson, reação histoquímica de PAS contracorada com
Hematoxilina de Harris, Picrosirius, azul de Toluidina, azul de metileno, fucsina básica,
hematoxilina-floxina. As fusões carunculares se encontravam em sua maioria na linha
antimesometrial na região média do corno uterino, variando em tamanho (de 0,8 x 0,7 x 0,4 cm
a 9,2 x 8,3 x 1,9 cm) e em número (um a sete) nas diversas fases de gestação. São facilmente
visíveis macroscopicamente, sendo a fissura fusional visualizada antes da desconexão cotilédone-
carúncula. Não apresenta nenhum indício de fusão cotiledonária, isso pode sugerir que a fusão
caruncular ocorre antes da total fixação do cotilédone no epitélio caruncular. As fissuras podem
ser únicas ou em par, de um lado ao outro ou do centro para periferia, mas sempre se dirigem da
superfície em direção ao pedúnculo caruncular. Os formatos macroscópicos de fusão caruncular
observados foram: lobulados e, mais comumente, ovais. À microscopia, a fissura fusional é
formada por um eixo de estroma endometrial de idêntica constituição histológica do estroma
criptal, porém possui morfologia particular, o que não dificulta a sua identificação, pois a fissura
é mais larga, perpendicular ao pedúnculo, e se estende sem grandes ramificações linearmente da
base ao ápice da carúncula contornando a fissura e apresenta vasos sanguíneos de maior calibre.
A fusão pôde ser classificada microscopicamente em três aspectos de acordo com a sua morfologia,
sendo elas: fusão propriamente dita, onde o eixo contorna a fissura e segue linearmente logo
abaixo da mesma; pseudofusão que possui dois eixos paralelos à fissura e se comunicam entre si
formando um “H” e a falsa fusão onde não se encontra nenhum eixo fusional abaixo da fissura.
O eixo fusional e seus vasos sangüíneos aumentam em comprimento e largura durante o
desenvolvimento da gestação. Células gigantes trofoblásticas binucleadas provenientes de
migração do epitélio fetal (trofoblasto) puderam ser observadas no eixo durante as várias fases
da gestação, assim como em todo o estroma e no epitélio criptal. Em todos os períodos estudados
(75 a 275 dias de gestação) ocorreu fusão de carúnculas vizinhas, possivelmente por um
remodelamento endometrial com conseqüente proliferação celular, para provavelmente aumentar
a superfície de contato entre os epitélios materno e fetal e, com isso, garantir uma maior eficiência
placentária em termos de trocas materno-fetais.
Apoio: FAPESP.
s586
UTILIZAÇÃO DE DIFERENTES DOSES DE eCG PARA A INDUÇÃO DO ESTRO

EM OVELHAS LANADAS EM PERÍODO DE ANESTRO NO NORTE DO PARANÁ
Sartori Jr., G.; Melo Sterza, F.A.; da Cunha Filho, L.F.C.; Rego Grecco, F.C.A.;
Santos, E.S.; Fonseca, A.; Baudraz, J.A.
1
O presente estudo teve por objetivo avaliar dois tipos de protocolos de indução e sincronização
do estro em ovelhas lanadas mestiças Suffolk durante o período de anestro estacional. Ao final
da estação reprodutiva de 2005 foi realizado o diagnóstico de gestação por ultra-sonografia
transretal (PieMedical 100 LC, transdutor linear 5,0 MHz) do rebanho ovino de uma propriedade
localizada em Faxinal-PR. As 42 fêmeas que permaneceram vazias foram divididas em dois
grupos homogêneos segundo a condição corporal e idade. Os grupos 1 (G1) e 2 (G2), ambos
com 21 animais de condição corporal média 2,5, receberam no mesmo período o mesmo tratamento
hormonal, porém com doses diferentes de eCG. No dia 0 (D0) foi implantado o dispositivo
intravaginal (DI) contendo 60 mg de Acetato de Medroxiprogesterona (MAP; Progespon®, Syntex,
Argentina), no D7, G1 recebeu 200 e G2 300 UI de eCG (Novormon®, Syntex, Argentina) e
ambos receberam 30ug de cloprostenol (Prolise®, ARSA S.R.L., Argentina) via IM. No D9 foi
feita à retirada do DI. Após 12 horas da retirada do mesmo os machos foram introduzidos no lote
em uma relação de 1:8 em regime de monta controlada. Até 72 horas após a retirada do DI foram
avaliados a duração do estro e o intervalo entre a retirada do DI e o estro. O diagnóstico de
gestação foi realizado 45 dias após o período de cobertura por ultra-sonografia transretal. 50% e
66,6% (p>0,05, teste de tukey) de G1 e G2 respectivamente apresentaram estro após o tratamento.
Entre 12 e 60 horas após a retirada do DI, foram observados animais entrando em cio, porém a
maioria manifestou estro entre 48 e 60 horas. Um total de 50% dos animais apresentou estro com
duração de 12 horas e 41% entre 24 e 36 horas. A taxa de prenhez de G1 foi de 31% e de G2 de
23%, não apresentando diferença significativa entre si (p>0,05). Os resultados demonstraram
que a indução do estro de ovelhas lanadas em período de anestro, utilizando-se protocolos de
média duração, independendo da dose, 200 ou 300 UI de eCG, possibilita um incremento da taxa
de prenhez do rebanho em até 31%, reduzindo assim o intervalo entre partos e diminuindo o
número de ovelhas falhadas ao término da estação reprodutiva.
s587
DETERMINAÇÃO DO SEXO EM BOVINOS A PARTIR DA AMPLIFICAÇÃO DO

GENE DA AMELOGENINA :OTIMIZAÇÃO DE PROTOCOLO
Leal, S.R.1; Fontes, R.S.1; Souza Filho, G.A.2; Marques, V.C.L.2; Matos, L.F.1
1
Laboratório de Melhoramento Genético Animal; Setor de Reprodução Animal; 2 Núcleo
de Análise Genômica – UENF , Campos dos Goytacazes – RJ , Brasil.
steveenleal@yahoo.com.br
A grande maioria dos protocolos disponíveis atualmente para a sexagem de embriões bovinos
envolvem a co-amplificação de uma seqüência específica do cromossomo Y juntamente com
uma seqüência autossômica (controle interno), através da técnica de PCR. Uma grande
desvantagem da utilização desses protocolos consiste na necessidade de se utilizar mais de um
par de primers em uma mesma reação, o que pode diminuir a eficiência da técnica de PCR. O
gene da amelogenina bovina (bAMEL) possui dois alelos, um presente no cromossomo X (AMELX)
e outro presente no cromossomo Y (AMELY), sendo que esse último alelo apresenta uma série de
deleções em relação ao alelo presente no cromossomo X. Essa diferença de tamanho entre os
dois alelos faz do gene da amelogenina um marcador genético com grande potencial para ser
utilizado na sexagem, com a vantagem de se utilizar apenas um par de primers em cada ensaio.
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência e a precisão de um novo protocolo
para a sexagem de embriões bovinos, através da sua aplicação inicial em ensaios com animais
adultos (com sexo previamente conhecido). O DNA empregado nas reações foi obtido a partir de
amostras de sangue coletadas de 20 bovinos, sendo 10 machos e 10 fêmeas. A extração de DNA
foi realizada com auxílio de um kit de extração (Biotools – B & M Labs, S. A. – Spain). A PCR
foi constituída de água ultrapura autoclavada, tampão para PCR [10 mM Tris-HCl (pH 8,3) e 50
mM KCl], 2 mM de MgCl2, 200 ìM de cada dNTP, 0,5 U de Taq DNA polimerase, e um par de
primers externo específico para a amplificação do gene da amelogenina (20 p/mol cada),
totalizando um volume final de 25 ìl, após a adição do DNA. As amplificações foram realizadas
com as seguintes condições de tempo e temperatura : 5min/94ºC (desnaturação inicial), seguido
por 40 ciclos de 1min/94ºC (desnaturação da dupla fita), 1min/35ºC (anelamento dos primers),
e 2min/72ºC (síntese da nova fita), com um ciclo de extensão final de 7min/72ºC. Alíquotas de
0,2 ìl dos produtos da PCR foram utilizadas como molde para as reações de Nested-PCR Nessa
etapa, foi utilizado um par de primers interno à seqüência amplificada na primeira reação (20 p/
mol cada). A temperatura de anelamento foi de 45ºC, sendo as demais condições as mesmas
utilizadas no primeiro passo. A detecção dos produtos amplificados foi feita através de eletroforese
em gel de agarose (1,8%) contendo brometo de etídio, sendo os géis fotografados sobre
transiluminador de luz ultravioleta e posteriormente analisados. Foram observados 100% de
eficiência e de precisão nas reações. A presença de duas bandas (500 e 625pb) identificou os
machos, e a presença de apenas uma banda (625pb) identificou as fêmeas. Nenhuma banda foi
detectada no controle negativo, o que atesta a ausência de contaminação nos ensaios. Os resultados
alcançados comprovam a precisão do protocolo utilizado, sendo que o próximo passo será testar
a sua eficiência e sensibilidade em ensaios com embriões.
s588
ÍNDICE DE AUTORES
A Assumpção, M.E.O.A. 277; 335; 336; 340; 341; 460;

Abreu, C.O. ............................................................ 307 479; 480; 481; 485; 486; 538; 539; 540; 541; 543;
Acco, A. ..................................................348; 511; 583 544; 547; 549
Accorsi, M.F. .......................................................... 435 Athayde, C.S. ................................................. 519; 569
Adona, P.R. .................... 131; 446; 453; 465; 466; 467 Atique-Netto, H. ..................................................... 484
Aguiar Filho, C.R. .................................................. 574 Avanzi, B.R. ........................................................... 567
Alberti, K. .............................................. 205; 310; 323 Avanzo, J.L. .................................................... 277; 539
Alberto M.L.V. ....................................................... 585 Avelar, S.R.G. ......................................................... 280
Alberton, J. ............................................................. 348 Avelino, K.B. .................................................. 489; 490
Albuquerque Filho, P.P. ......................................... 579 Ayres, H. 31; 333; 334; 368; 369; 400; 401; 402; 403;
Albuquerque, L.P. ................................................... 576 404; 408; 409; 410; 426; 427; 531
Alfieri, A.A. ........................................................... 561 Azevedo, H.C. ........................................................ 379
Almeida, A.B. ........................................ 349; 444; 570 Azevedo, J.R. ......................................................... 406
Almeida, A.K. ................................................. 351; 407
Almeida, A.P. .................................................. 280; 497 B
Almeida, J.L. .......................................................... 308 Bacchin, A.B. ......................................................... 424
Almeida, K.C. ......................................................... 510 Bacelar, D. .............................................................. 461
Almeida, N.K.O. .................................................... 508 Bajgelman, M.C. ............................................ 541; 546
Alonso, M.A. ......................................... 499; 502; 532 Balbino, S.C. .................................................. 389; 422
Alonso, R.V. ........................................................... 440 Balieiro, J.C.C. .............................. 433; 444; 466; 502
Alvarenga, M.A. .... 39; 347; 350; 421; 425; 532; 563; Báo, S.N. ............................................... 265; 266; 575
564; 565; 566; 567 Baptista, A.L. ......................................................... 405;
Álvares, C.T. ................................................... 389; 422 Barbarini, O. .......................................................... 420;
Alvarez, R.H. .......................................................... 516 Barbosa, R.T. ......................................... 343; 344; 533
Alves Jr, S.S. .......................................................... 487 Barcellos, B.P. ........................................................ 324
Alves, A.E. ............................................ 338; 365; 462 Barcelos, A.C.Z. ............................................. 476; 514
Alves, B.F.L. ......................................... 371; 494; 515 Barioni, L.G. .......................................................... 496;
Alves, S.G.G. ................. 319; 320; 321; 351; 407; 523 Barreiros, T.R.R. ................................... 406; 417; 418
Alvin, M.T.T. ......................................... 314; 412; 534 Barreto, K.P. ........................................................... 361
Amaral, V.L.L. ................................................ 312; 313 Barreto, R.S.N. ....................................................... 586
Ambrósio, C.E. ............................................... 442; 585 Barretto, L.S.S. ..................... 436; 437; 455; 456; 457;
Amorim, E.A.M. .................................................... 377 Barros, C.M. ............................ 25; 355; 411; 476; 514
Amorim, L.S. ................................. 281; 359; 377; 509 Barros, S.S. ............................................................. 317
Amorim, R.L. ......................................................... 362 Bartolomeu, C.C. ................................... 389; 416; 422
Andrade Moura, J.C. .............................................. 512 Baruselli, P.S. .. 17; 31; 284; 366; 367; 368; 369; 400;
Andrade, A.F.C. ..................................... 267; 272; 349 401; 402; 403; 404; 408; 409; 410; 426; 427; 444;
Andrade, A.Jr. ....................................................... 308; 452; 461; 472; 473; 498; 525; 526; 527; 528; 529;
Andrade, E.R. ........................................................ 561; 530; 531;
Andrade, M.L.L. .................................... 280; 458; 497 Bassani, C.A. .......................................................... 418
Andreeva, L.E. ....................................................... 280 Basso, A.C. ..................................................... 489; 490
Andreoti, M. ........................................................... 471 Bastos, M.R. ........................................................... 342
Andrioli, A. ............................................................. 497 Batista, R.I.T. .......................................................... 584
Antoniazzi, A.Q. ..................................................... 418 Baudraz, J.A. ......................................... 451; 498; 587
Apparício, M.F. .............................................. 338; 365 Beltrame, R.T. ....................................................... 496;
Araújo Jr., J.P. ........................................................ 205 Beltran, M.P. .......................................... 366; 367; 372
Araújo, G.H.M. .............................. 350; 421; 425; 567 Benedetti, E.R. ....................................................... 484
Araújo, R.R. ........................................................... 316 Beretta, C.A.G. ....................................................... 462
Ardais, D.B. ............................................................ 440 Bergamaschi, M.A.C.M. ....................... 274; 301; 343
Arruda, N.S. ........................................................... 279 Bergfelt, D.R. ......................................................... 278
Arruda, R.P. ........................... 267; 272; 335; 336; 457 Bertan, C.M. .................................. 274; 301; 337; 355
Artoni, L.P. ............................................................. 545 Bertolini, M. ........................................................... 309
Assaf, S.S. .............................................................. 434 Bertolini, M. ........................................................... 322
Assis Neto, A.C. ............................................. 442; 585 Bezerra, G.A. .......................................................... 406
Assis, R.M. ............................................................ 378; Bianconi, L.L. ......................................................... 366
s589
Biase, F.H. ..................................... 300; 303; 465; 537 Cardoso, C.R.S. .............................................. 506; 520
Biase, W.K.F.S. .............................................. 300; 303 Cardoso, G.G.C. ...................................................... 503
Bicudo, S.D. ........................................................... 379 Carmo, M.T. .......................................... 347; 350; 421
Binelli, M. 1; 274; 301; 335; 336; 337; 343; 344; 355; Carneiro, C. .................................................... 282; 370
367; 533; 540 Carnicelli, P. ........................................................... 475
Biondi, F.C. .................................................... 471; 577 Carreira, J.T. ........................................................... 376
Birgel, E. ................................................................. 235 Carrijo, L.H.D. ....................................................... 290
Biscarde, C.E.A. ............................ 319; 320; 321; 407 Carvalho, A. ........................................................... 307
Bisinotto, R.S. ........................... 1; 274; 301; 344; 366 Carvalho, A.F.......................................................... 585
Bispo, C.A.S. ......................................... 316; 357; 571 Carvalho, B.A. ........................................................ 390
Bispo, M.S. ............................................................. 571 Carvalho, B.C. ................................................ 384; 385
Bittencourt, R.F. .................... 319; 320; 321; 351; 407 Carvalho, B.P. ......................................................... 359
Blanco, I.D.P. ........................................................ 443; Carvalho, C.M.F. .................................................... 471
Blaschi, W. ............................................. 417; 418; 561 Carvalho, G.R. ................................................ 357; 571
Blume, H. ............................................................... 275 Carvalho, L.M. ............................................... 521; 522
Bó, G.A. ............................ 17; 31; 386; 387; 388; 518; Carvalho, M.A.P. ............................................ 398; 399
Boelhauve, M. ........................................................ 302 Carvalho, N.A.T. .................................................... 366
Boff, A.L.N. .......................................... 317; 576; 459 Castilho, A.C.S. ..................... 329; 362; 363; 545; 572
Bohrer, R.C. ........................................................... 445 Castilho, E.M. ................................................ 396; 397
Boité, M.C. ..................................................... 385; 508 Castro, V. ................................................................ 519
Bonesi, G.L. ............................................................ 443 Cavada, B.S. ........................................................... 297
Boonkusol, D. ......................................................... 171 Cavalca, L.G. .................................................. 353; 354
Bordignon, V. ........................................ 479; 480; 481 Cavalcanti, A.S. ..................................... 384; 385; 508
Borges, A.M. .......................................................... 348 Celeghini, E.C.C. ................................................... 272
Borges, J.B.S. ......................................................... 424 Celestino, J.J.H. ..................................................... 266
Borges, L.F.K. ........................................................ 361 Cesaro, M.P. .......................................................... 322;
Borsato, E.A. .......................................................... 417 Chalhoub, M. ......................... 319; 351; 407; 523; 524
Bortolotti, G.M.F. ................................................... 465 Chaves, R.M. .................................................. 556; 568
Braga, F.A. ............................................................. 349 Chesta, P. ................................................................ 388
Braga, F.C. ............................. 273; 537; 542; 548; 570 Chiamenti, A. .......... 59; 415; 556; 558; 559; 568; 579
Braga, M.Q. ............................................................ 315 Chiaratti, M.R. ................................................ 276; 444
Brandão, A.C. ........................................ 320; 321; 549 Chiari, J.R. ...................................................... 159; 293
Brandão, A.C.G. ..................................................... 351 Chilliard, Y. ............................................................ 372
Brandão, F.Z. ................................. 324; 384; 385; 508 Cipriano, R.S. ................................................. 360; 390
Brandão, H.M. ........................................................ 345 Clemente, C.A.A. .................................. 284; 472; 473
Bressan, F.F. .................................. 337; 542; 546; 548 Comegno Jr, L.C. ................................................... 342
Bruno, J.B. ..................................................... 352; 575 Cordeiro, M.F. ........................................................ 462
Bruschi, J.H. ................................................... 359; 509 Cordeiro, M.S. ................................................ 471; 577
Bueno da Silva, R. .................................................. 298 Cordini, M. ..................................................... 312; 313
Bueno, L.M. ........................................................... 272 Correa, G.A. ............................................................ 469
Bunn, S. .......................................................... 309; 322 Corrêa, M.N. .................................................. 396; 397
Buratini Jr., J. ........................ 329; 362; 363; 545; 572 Correia, J.C. ........................................................... 352
Burgstaller, J. .......................................................... 276 Corrente, J.E. .......................................................... 580
Burioli, K.C. ........................................................... 586 Corteze, A.A. .......................................................... 307
Butzke, G. ....................................................... 506; 520 Cortezzi, S.S. .......................................................... 433
Price, C.A. .............................................................. 362 Costa, E.P. .............................................................. 359
Costa, F.R. .............................................................. 358
C Costa, I.B. .............................................. 329; 363; 572
Cajazeiras, J.B. ............................................... 280; 458 Costa, M.C. ............................................................ 331
Caldas-Bussiere, M.C. ........................................... 358 Costa, N.N. ............................................................. 471
Calegari, R.S. .........................................311; 441; 477 Covizzi, G.J. ................................................... 338; 365
Câmara, D.R. .......................................................... 423 Crespilho, A.M. ............................. 205; 310; 311; 323
Camara, J.U. ........................................................... 290 Cruz, F.B. ....................................................... 309; 322
Camargo, L.S.A. .. 281; 284; 439; 464; 472; 473; 478; Cunha, R.M.S. ........................................................ 297
495; 509; 550; 578; 584 Curcio, B.R. ........................................... 317; 459; 576
Canella Filho, C.C. ................................................. 501 Cutaia, L. ................................. 17; 386; 387; 388; 518
Caraciolo, M.C.M. ................................................. 557
Cardoso, B.L. ......................................................... 428
s590
D Farrás, M.C. ............................................................ 567

D’Angelo, M. ................................................. 519; 569 Faza, A.P. ................................................................ 584
da Costa, E.P. .......................................................... 282 Fazano, F.A.T. ........................................................ 562
da Cunha Filho, L.F.C. ........................................... 587 Fedozzi, F. ..................................... 274; 301; 335; 336
da Cunha, P.M. ....................................................... 337 Feitosa, T.A.L. ........................................................ 512
da Silva, A.F. .......................................................... 283 Feitosa, W.B. 277; 341; 460; 486; 538; 539; 540; 541;
da Silva, J.C.B. ............................................... 344; 533 543; 544; 547
DaMatta, R.A. ........................................................ 488 Felício, G.B. ........................................... 563; 565; 566
David, F.L. ...................................................... 521; 522 Feltrin, C. ................................................................ 279
De Bem, T.H.C. ............. 433; 465; 466; 467; 542; 548 Fernandes, C.A.C. 281; 371; 398; 399; 429; 494; 495;
de Oliveira, C.A. .................................................... 343 501; 507; 515; 578
de Oliveira, M.M.N.F. ........................... 282; 283; 370 Fernandes, C.B. ............. 434; 443; 474; 482; 555; 582
de Oliveira, R.F.M. ................................................. 283 Fernandes, M.B. ............................................. 438; 491
de Quadros, F.A. .................................................... 498 Ferrão, A.A. ............................................................ 345
de Sá Filho, M.F. ...................................................... 31 Ferreira Jr., N. ........................................................ 395
de Souza Filho, G.A. .............................................. 364 Ferreira, A.M. ................ 284; 439; 464; 472; 473; 550
Del Rei, A.J. ................................................... 389; 422 Ferreira, B.S. .......................................................... 364
Delavaud, C. ........................................................... 372 Ferreira, C.R. ........ 268; 269; 270; 271; 276; 537; 554
Delboni, C.C. ................................. 485; 486; 539; 543 Ferreira, E.M. ......................................................... 454
Delboni, M.I. .................................................. 356; 561 Ferreira, J.C.P. ....................................... 327; 328; 329
Dell’Aqua Jr., J.A. 205; 323; 563; 564; 565; 566; 567 Ferreira, J.G.S. ........................................................ 342
Demczuk, E. ........................................................... 511 Ferreira, M.A.P. ...................................................... 577
Demétrio, C.G.B. .................................................... 293 Ferreira, M.A.R. ..................................................... 324
Demétrio, D.G.B. ........................... 159; 293; 394; 414 Ferreira, R. .............................................. 85; 361; 445
Derussi, A.A.P. ....................................................... 443 Ferri, F. ................................................................... 498
Deschamps, J.C. .................................... 317; 459; 576 Ferriani, R.A. .......................................................... 454
Detoni, A.L. .................................................... 353; 354 Fidelis, A.A.G. ........................................................ 275
DeVitto, L.G. .................................................. 347; 443 Figueira, R.F. .......................................................... 423
Di Filippo, P.A. ...................................................... 462 Figueiredo, A.C.S. ................. 371; 494; 501; 507; 515
Dias, A.J.B. ........................................... 364; 478; 488 Figueiredo, A.S. ..................................................... 205
Dias, C.C. .................................... 286; 395; 412; 534 Figueiredo, C.L. ..................................................... 487
Dias, D.P.M. ........................................................... 462 Figueiredo, J.R. ...... 71; 265; 266; 299; 352; 561; 575
Dias, L.M.K. ........................................................... 503 Figueiredo, R.A. ..................................................... 343
Dias, L.P.B. ............................................................. 280 Filho, J.B. .............................................................. 378;
Dias, M. .................................................................. 370 Firmino, A.P. ......................................... 557; 574; 579
Dias, N.B. ....................................................... 439; 464 Fleury, P.D.C. ........................................ 499; 502; 532
Diniz, E.G. .............................................................. 375 Folhadella, I.M. ..................... 284; 439; 464; 472; 473
Diniz, E.S. ............................................. 281; 495; 578 Fonseca, A. ..................................................... 498; 587
Dinnyes, A. ............................................................. 171 Fonseca, E.J. ........................................................... 483
Dionello, N.J.L. .............................................. 396; 397 Fonseca, F.A. .......................................................... 464
Dode, M.A.N. ....... 115; 308; 447; 448; 450; 468; 469 Fonseca, J.F. .. 65; 281; 348; 357; 359; 377; 384; 385;
Dominguez, J.H. ..................................................... 427 509; 511; 578; 583
Dores, C.B. ............................................ 443; 555; 582 Fontenele, A.D. ...................................................... 569
Dória, R.G.S. .......................................................... 462 Fontes, R.S. ............................................................ 588
Driessen, K. ................................... 290; 342; 448; 449 Forell, F. ................................................................. 279
Duarte, A.L.L. ........................................................ 462 Fortier, A. ............................................................... 243
Dugan, K. ................................................................. 95 Fouladi-Nashta, A.A. ............................................... 95
Frajblat, M. ..................................................... 312; 313
E Franci, C.R. ............................................................ 503
Elias, F.P. ........................................................ 438; 491 Franco, M.M. ........................ 450; 469; 506; 517; 520
Elias, N.Q. .............................................................. 314 Franco, R.V.R. ........................................................ 315
Ereno Jr., J.C. ......................................................... 452 Freire, A.F. ............................................. 272; 335; 336
Ereno, R.L. ..................................................... 355; 411 Freire, S.E. .............................................................. 272
Escocard, R.M. ....................................................... 358 Freitas, C. .............................................. 284; 472; 473
Freitas, C.P. .................................................... 205; 425
F Freitas, D.S. ........................................... 351; 407; 524
Faes, M.R. .............................................................. 358 Freitas, M.V.V. ....................................................... 512
Falcão, D.P. ........................................... 415; 416; 579 Freitas, V.J.F. ........ 280; 291; 297; 458; 497; 510; 573
s591
Fürst, R. .......................................................... 316; 571 Isobe, F.R. ............................................................... 405
G J
Gadelha, C.R.F. ...................................................... 365 Jacomini, J.O. ................................................. 264; 375
Galeli, G. ................................................................. 315 Jardina, D.T.G. ............................... 159; 413; 414; 513
Galerani, M.A.V. ............................................ 438; 491 Joaquim, D.C. ......................................................... 435
Galuppo, A.G. ................................................. 519; 569 Jorge, R.S. .............................................................. 487
Garbelotti, F. ........................................................... 545 José, A.A.F.B.V. ..................................................... 435
Garcia, J.F. ...................................................... 197; 440 Juvenal, J.C. ........................................................... 307
Garcia, J.M. . 268; 269; 270; 271; 276; 298; 360; 489;
490; 519; 537; 554 K
Garcia, P.D. ............................................................ 289 Koivisto, M.B. ........................................................ 376
Garcia, P.H.M. ........................................................ 292 Krieger, J.E. ............................................................ 546
Gasperin, B.G. .......................................................... 85
Gaudêncio Neto, S. ................................................ 309 L
Gavio, D. ................................................................ 491 L.F.C. .............................................................. 333; 334
Gênova, L.G. ........................................................... 356 La Salle, S. ............................................................. 243
Genovez, M.E. ........................................................ 519 Lagares, M.A. ......................................................... 314
Gerger, R.P.C. ................................................. 479; 549 Landim Jr., L.P. ............................. 276; 489; 490; 554
Giassetti, M.I. ........................................................ 343; Landim-Alvarenga, F.C.434; 443; 474; 475; 482; 555;
Gimenes, L.U. ................................. 31; 366; 367; 527 581; 582
Gimenes, L.U.G. ..................................................... 452 Larvada, A. ............................................................. 576
Giometti, I.C. .......................................................... 363 Láufer-Amorim, R. ................................................. 328
Gioso, M.M. . 371; 398; 399; 429; 494; 501; 507; 515 Leal, C.L.V. .. 131; 433; 446; 453; 465; 466; 467; 554
Giuliatti, S. ............................................................. 303 Leal, L.S. ........................................................ 434; 443
Goissis, M.D. ....... 341; 460; 481; 485; 538; 539; 547 Leal, S.R. ................................................................ 588
Golçalves, J.S.A. .................................................... 547 Leite, D.S.P. .................................................... 317; 459
Golim, M.A. ................................................... 555; 582 Leme, L.O. ..................................... 342; 447; 448; 468
Gomes, H.F. ............................................................ 364 Lemos, F.O. ............................................................ 289
Gonçalves, F.S. ...................... 436; 437; 455; 456; 457 Lemos, T.N. ............................................................ 289
Gonçalves, J.S.A. 332; 340; 341; 460; 480; 481; 538; Lima Neto J.F. ........................................................ 482
544 Lima, I.M.T. ........................................................... 497
Gonçalves, P.B.D. ................................... 85; 361; 445 Lima, M.C. ............................................ 335; 336; 337
Gondim, F.Q.B. ...................................................... 560 Lima, P.F.59; 415; 416; 556; 557; 558; 559; 560; 568;
Gonzalez, C.I.M. ............................................ 556; 560 573; 574; 575; 579
Goulart, L.R. .......................................................... 264 Lima, T.N. ............................................................... 484
Granito, A.L. .......................................................... 349 Lima-Neto, J.F. ...................................... 443; 555; 582
Greco, G.M. ............................................................ 508 Lima-Verde, I.B. ........................... 265; 266; 352; 575;
Guardieiro, M.M. ........................................... 264; 375 Lins, L. ........................................................... 317; 576
Guerreiro, V.J. ........................................................ 513 Lôbo, R.B. ..................................................... 491; 438
Guido, S.I. ...................................................... 560; 573 Logrado, M.L. ........................................................ 282
Guimarães Neto, A.G. ............................................ 517 Loguercio, R.S. ...................................................... 361
Guimarães, E.C. ..................................................... 375 Logullo, C. .............................................................. 364
Guimarães, J.D. ...................................................... 377 Lopes C.A.P. ............................................................. 71
Gusmão, A.L. ................................ 351; 512; 523; 524 Lopes Júnior, E.S. ................. 280; 458; 497; 510; 573
Lopes, F.L. ............................................................. 243;
H Lopes, M.D. ................................... 318; 474; 475; 580
Habermann, F. ........................................................ 302 Losi, T.C. ....................................... 285; 383; 391; 392
Hansen, P.J. ............................................................ 145 Losi, T.L. ................................................................ 419
Havt, A. .................................................................. 297 Losinno, L. ....................................................... 39; 245
Hellú, J.A.A. .......................................................... 440 Loureiro, B. ........................................................... 559;
Herrera, C. .............................................................. 245 Lucca Neto, J.A. ..................................................... 312
Hossepian de Lima, V.F.M. ................... 213; 553; 562 Lucca, F.M. ............................................................. 348
Hucke, E.E.T.S. ..................................... 289; 335; 336 Lucci, C.M. ..................................................... 265; 266
Hunter, M.G. ............................................................. 95 Lucifero, D. ............................................................ 243
Lucio, A.C. ............................................ 271; 553; 562
I Lúcio, C.F. .............................................................. 332
Ibiapina, B.T. ............................................. 1; 274; 301 Ludgero, B.F.A. ...................................................... 501
s592
Luque, M.C.A. ............................................... 265; 266 Menchaca, A. .................................................... 51; 251

Mendes, C.M. ........................ 277; 538; 539; 540; 549
M Mendonça, L.B.R. .................................................. 423
Macedo, L.M. ......................................................... 564 Meneghelo, L. ........................................................ 397
Machado, M.F. .............................. 329; 363; 545; 572 Meneghetti, M. .................. 9; 285; 383; 391; 392; 419
Machado, R. .......................................... 343; 344; 533 Meng, Q. ................................................................. 171
Machado, V.C. ........................................................ 488 Méo, S.C. .............. 268; 269; 270; 271; 276; 537; 554
Madureira, E.H. .............................................. 349; 570 Merighe, G.K.F. ... 235; 273; 300; 303; 433; 537; 570;
Maffili, V.V. ............................................................ 584 542; 548
Magalhães, D.M. .................................................... 458 Mesquita, L.G. .............................. 433; 467; 542; 548;
Maia Jr, J.E. .................................................... 266; 575 Messias, J.B. ........................................................... 557
Maia, E.L.M.M. ...................................................... 510 Mezzalira, A. ................................. 191; 309; 313; 322
Maia, S.A. .............................................................. 383 Mezzalira, J.C. ....................................................... 322
Maio, J.R.G. ............................................................ 360 Miglino, M.A. ...... 273; 335; 336; 337; 442; 585; 586
Malard, P.F. ............................................................ 279 Miguez, P.H.P. ........................................................ 337
Mançanares, C.A.F. ................................................ 585 Milazzotto, M.P. .. 277; 332; 340; 341; 485; 486; 540;
Maraia, A.C. ................................................... 489; 490 541; 544; 547
Marangoni, N.R. ..................................................... 390 Mingoti, G.Z. ................. 376; 436; 437; 455; 456; 457
Marinheiro, G.O. .................................................... 468 Miragaya, H.M. ...................................................... 245
Marques Jr., A.P. ............................................ 449; 470 Miranda, G. ............................................................. 386
Marques M.G. ......................................................... 549 Miranda, M. ........................................... 235; 542; 548
Marques, L.F.A. ............................................. 353; 354 Miranda, M.S. ............................... 337; 444; 467; 471
Marques, M.G. ...... 340; 341; 460; 479; 480; 481; 543 Mizubuti, I.Y. ......................................................... 331
Marques, M.O. .............................. 400; 402; 426; 498 Moino, L.L. .................................................... 521; 522
Marques, V.B. ................................................. 337; 570 Mollo, M.R. ................... 290; 342; 449; 470; 505; 517
Marques, V.C.L. ..................................................... 588 Mondadori, R.G. ..................................................... 275
Marques, V.T. ......................................................... 498 Monteiro, C.D. ....................................................... 379
Martelli, L. ...................................................... 300; 303 Moraes, E.P.B.X. ... 59; 415; 416; 556; 557; 558; 559;
Martin, I. ................................ 327; 328; 329; 443; 565 560; 568; 574; 579
Martinez, A.C. ................................................ 307; 516 Moraes, F.L.Z. ................................................ 521; 522
Martinez, M. ........................................................... 388 Moraes, G.A. .......................................................... 478
Martins Jr., A. ........................ 310; 311; 323; 441; 477 Moraes, W. ............................................................. 307
Martins Jr., A.P. .............................................. 285; 391 Moreira, E.M. ......................................................... 289
Martins, A.C. ......................................... 290; 342; 450 Moreira, F.B. .......................................................... 331
Martins, C.M. 31; 284; 368; 404; 427; 525; 526; 527; Moreno, J.F. ............................................................ 483
528; 529; 530; 531 Mota, M.F. .............................................. 348; 511; 583
Martins, D.S. .......................................................... 585 Moura, E.P. ............................................................. 315
Martins, E.A.L. ....................................................... 277 Moura, R.R. ............................................................ 280
Martins, F.S. .................................. 265; 266; 352; 575 Moura, R.T.D. .......................................................... 59
Martins, L.F. .................. 340; 541; 543; 443; 474; 475 Mourão, L.L. .................................................. 283; 370
Martins, L.T. ........................................................... 309 Moya, C.F. .............................................................. 339
Matos, L.F. ............................................................. 588 Mundim, T.C.D. ..................................................... 450
Matos, M.H.T. ............................... 265; 266; 352; 575 Munhoz, J.J. ........................................................... 309
Mattos, M.C.C. ............................................... 327; 482 Nascimento, A.B. 340; 341; 460; 479; 480; 481; 485;
Maziero, R.R.D. ............................................. 327; 342 486; 549
Medeiros, A.S.L. ............................................ 425; 567 Nascimento, V.A. .................................. 282; 283; 370
Meira, C. ......................................................... 278; 375
Meirelles, F.V. ..... 235; 273; 276; 300; 303; 337; 433; N
435; 442; 444; 465; 467; 537; 542; 546; 548; 554; Nasser, L.F. ...................................... 17; 333; 334; 403
570 Navarro, P.A.A.S. ................................................... 454
Mello, J.E. .............................................................. 427 Neto, J.D.S. .................................................... 521; 522
Mello, M.M.C. ....................................................... 423 Neves Neto, J.R. ..................................................... 499
Melo Sterza, F.A. .................................. 451; 498; 587 Neves, A.L.A. ................................................. 389; 422
Melo, C.M. .. 205; 318; 443; 563; 564; 565; 566; 567; Neves, J.P. .............................................................. 308
580 Nicacio, A.C. 480; 485; 486; 538; 539; 540; 544; 549;
Melo, D.S. .............................................................. 434 533;
Melo, E.O. .............................................................. 450 Nishikawa, M.F.A. ................................................. 315
Melo, L.M. ............................................................. 297 Nogueira, C.E.W. .................................. 317; 459; 576
s593
Nogueira, G.P. ...... 278; 330; 360; 365; 366; 367; 372; Perecin, F. .... 268; 269; 270; 271; 276; 298; 360; 537;
390; 470 554
Nogueira, L.A.G. ........................... 324; 384; 385; 508 Pereira, A.F. .................................................... 280; 458
Nogueira, M.F.G. .............................................. 25; 514 Pereira, F.T.V. ......................................................... 586
Nonato Jr., I. ........................................................... 452 Peres, K.R. .............................................................. 267
Novaes, J.L.C. ........................................................ 310 Peres, L. ............................................................ 17; 387
Nunes, L.C. .................................................... 353; 354 Peres, L.C. ............................................. 386; 388; 518
Peres, M.A. ............................................ 460; 479; 547
O Perez, G.C. .............................................................. 394
Oba, E. . 319; 320; 321; 327; 328; 329; 371; 398; 399; Perez, J.O. .............................................................. 378
434; 494; 507 Perini, A.P. ..................................... 271; 338; 553; 562
Ogando, P.P............................................................. 424 Perri, S.H.V. .......................... 376; 436; 455; 456; 457
Ohashi, O.M. ......................................... 444; 471; 577 Pescara, J.B. ........................................................... 428
Oliveira Jr., E.G. ............................................. 298; 462 Pfeifer, L.F.M. ................................................ 396; 397
Oliveira, A.C.S. .............................................. 406; 561 Piagentini, M. ................................................. 339; 355
Oliveira, A.P. .......................................................... 495 Picinato, D. ............................................................... 17
Oliveira, C.H. ......................................................... 314 Picolomini, M. ................................................ 519; 569
Oliveira, D.J.C. ...................................................... 330 Pimentel, J.R.V. ............................. 335; 336; 349; 570
Oliveira, E.R.371; 398; 399; 429; 494; 501; 507; 515; Pincinato, D. .................................. 386; 387; 388; 518
578 Pinheiro, E.S.P. ....................................................... 291
Oliveira, F. .............................................................. 264 Pinheiro, V.G. ................................................. 355; 411
Oliveira, F.A. .................................................. 282; 370 Pinho, T.G. ..................................... 324; 384; 385; 508
Oliveira, G.R. .......................................................... 424 Pinna, A.E. ...................................................... 384; 508
Oliveira, J.F.C. ............................................... 361; 445 Pinto, I.S.B. ............................................................ 584
Oliveira, J.V. .................................. 347; 350; 421; 564 Pinto, L.C. .............................................................. 423
Oliveira, K.M. ........................................................ 315 Pinto, M.G.L. .......................................................... 362
Oliveira, L.C. .................................................. 389; 422 Pinto-Neto, A. ......................................... 348; 511; 583
Oliveira, M.A.L. .... 59; 415; 416; 556; 557; 558; 559; Pires, E. .............................. A. 338;
560; 568; 573; 574; 579 Pires, E.A. ............................................................. 365;
Oliveira, M.E.F. ...................................................... 462 Pires, M.F.Á. ......................................... 284; 472; 473
Oliveira, P.C. .......................................................... 487 Pires, P.R.L. ............................................................ 446
Oliveira, R. ............................................................. 405 Pires, R.M.L. .......................................................... 516
Oliveira, R.S. .......................................................... 478 Pivato, I. ................................ 290; 449; 470; 505; 517
Orlandi, C. ...................................................... 205; 278 Polgar, Z. ................................................................ 171
Ortigari, I. ............................................................... 322 Polidoro, R.F.Q. ..................................................... 275
Polisseni, J. ............................ 284; 439; 464; 472; 473
P Ponchirolli, C.B. ............................................. 205; 483
Padilha, L.C. ................................................... 461; 561 Pontes, E.O. ........................................... 274; 301; 337
Paes de Carvalho, C.S. ................................... 364; 488 Pontes, J.H.F. ......................................... 452; 463; 487
Paiva, D.S. .............................................................. 423 Porciuncula, P.M. ................................................... 433
Paiva, F.M. ............................................................. 429 Portela, A.P.M. ...................................... 407; 523; 524
Paiva, F.P. ............................................................... 584 Portela, V.V.M. ......................................................... 85
Palhão, M.P. .................................. 316; 357; 359; 571 Porto, L.P.C. ................................................... 521; 522
Panattoni, J.F. ......................................................... 487 Porto-Neto, L.R. ..................................................... 197
Papa, F.O. .... 205; 310; 311; 318; 323; 421; 425; 563; Potiens, J.R. ............................................................ 476
564; 565; 566; 567; 580 Prado, R.B. ............................................................. 484
Papa, P.C. ............................................... 337; 363; 545 Prestes, N.C. ........................................................... 339
Pardo, F.D. .............................................................. 349 Previato, P.F.G. ............................................... 511; 583
Paschoal, D.M. ....................................................... 477 Price, C.A. ............................................. 363; 545; 572
Paula, N.R.O. ............................... 497; 510; 558; 574; Providelo, F.D. ....................................................... 235
Paula-Lopes, F.F. .................................................... 302 Puga, R. .................................................................. 303
Paulini, F. ................................................................ 309 Puoli Filho, J.N.P. .................................................. 278
Pavão, D.L. ..................................................... 519; 569
Pavão, G.D. ............................................................. 443 Q
Pedrazzi, C. ............................................................ 322 Queiroz, F.J.R. ........................................................ 508
Peixer, M.A.S. ........................................................ 279 Queiroz, L.M.V. ..................................................... 279
Penteado, L. .......... 401; 402; 403; 408; 409; 410; 426 Quetglas, M.D. ....................................................... 453
Quinn, R.L. ............................................................... 95
s594
Quirino, C.R. .......................................................... 496 Salamone, D.F. ....................................................... 227

Sales, J.N.S. ................................... 346; 500; 503; 504
R Saliba, W.P. ............................................ 314; 412; 534
Rabassa, V.R. .......................................................... 397 Salmazo, R. ............................................................ 331
Rabelo, M.C. ......................................... 415; 416; 573 Salvador, R.A. ........................................................ 313
Rádis-Baptista, G. ................................................... 297 Sandoval, G.A.F. ..................................................... 360
Rambo, G. ............................................................... 459 Sandri, L.R. ............................................................ 445
Ramos, A.A. .................. 284; 439; 464; 472; 473; 550 Santana, G.M. ......................................................... 279
Ramos, A.F. ................... 290; 342; 449; 470; 505; 517 Santana, R.C.M. ............................ 320; 351; 523; 524
Rego Grecco, F.C.A. .............................................. 587 Santo, R.R. ............................................................. 299
Reichenbach, H.-D. ....................... 556; 559; 560; 568 Santos, E.S. ........................................... 451; 498; 587
Reichert, R. ............................................................. 366 Santos, G.M.G. ........................................................ 331
Reis, A.M. .............................................................. 419 Santos, I.C.C. ......................................................... 405
Reis, F.A.C. ............................................................ 315 Santos, J.F. ...................................................... 347; 350
Reis, F.C. ................................................................ 375 Santos, J.F. ............................................................. 421;
Resende, J. .............................................................. 512 Santos, J.M. ............................................................ 585
Resende, M.V. ............................... 270; 271; 553; 562 Santos, K.D.B. ........................................................ 265
Rezende, C.R.L. ............................................. 333; 334 Santos, L.J. ............................................................. 324
Rezende, L.F.C. ..................................... 333; 334; 403 Santos, M. ....................................................... 519; 569
Ribeiro Filho, A.de L. . 319; 320; 321; 351; 407; 523; Santos, M.H.B. ...... 59; 415; 416; 556; 557; 558; 559;
524 560; 568; 573; 574; 579
Ribeiro, A.P.C. ................................................ 338; 365 Santos, R.M. ............. 9; 159; 293; 394; 395; 414; 419
Ribeiro, E.L.A. ....................................................... 331 Santos, R.R. ........................................................ 71; 75
Ribeiro, E.S. ........................................................... 322 Santos, S.S.D. ................................................. 471; 577
Ribeiro, G. .............................................................. 462 Saoncella, C. ........................................................... 413
Rigo, A.G. ............................................................... 331 Saraiva, N.Z. ........ 268; 269; 270; 271; 276; 298; 554
Ripamonte, P. .................................................. 273; 433 Sartorelli, E.S. ........................................................ 476
Rocha, A.A. ............................................................ 503 Sartori Jr., G. ........................................................... 587
Rocha, A.M. ................................................... 277; 538 Sartori, R. ............. 290; 342; 449; 450; 470; 505; 517
Rocha, J.M. ................................... 415; 416; 558; 579 Satrapa, R.A. ......................................... 355; 476; 514
Rocha, M.A. ........................................................... 331 Saueressig, M.G. ..................................................... 505
Rocha, N.S. ............................................................ 339 Schneider, A. .................................................. 396; 397
Rödel, E.U.R. ......................................................... 376 Schneider, C. .......................................................... 405
Rodello, L. .............................................................. 379 Schroeder, R.V. ....................................................... 331
Rodrigues, A.C.O. .................................................. 369 Schwarz, K.L. ......................................................... 446
Rodrigues, A.L. .............................................. 316; 357 Selaive-Villaroel, A.B. ........................................... 510
Rodrigues, A.P.R. ............................ 71; 299; 352; 575 Seneda, M.M. 331; 356; 406; 417; 418; 461; 463; 561
Rodrigues, C.A. ..................... 159; 293; 413; 414; 513 Serapião, R.V. ................................................. 439; 464
Rodrigues, J.L. ....................................................... 279 Serov, O. ................................................................. 280
Rodrigues, L.F. ....................................................... 315 Serova, I.A. ............................................................ 280
Rodrigues, L.H. ...................................................... 376 Severo, N.C. ................................................... 405; 397
Rodrigues, M.M.P. ................................................. 328 Sicherle, C.C. ......................................................... 379
Rodrigues, M.T. ...................................................... 357 Silva Filho, J.M. ..................................................... 377
Rondina, D. ........................................... 291; 497; 510 Silva, A.A.B. ......................................... 319; 523; 524
Rosa e Silva, A.A.M. ............................................. 454 Silva, A.L.S. ................................................... 384; 385
Rossetto, M.R. ................................................ 489; 490 Silva, A.V. ....................................................... 348; 583
Rovay, H. ....................................... 316; 357; 359; 571 Silva, B.J.C. ............................................................ 405
Rovegno, M. ................................................... 543; 544 Silva, C. .................................................................. 441
Rubianes, E. ..................................................... 51; 251 Silva, D.R.M. ......................................................... 417
Rumpf, R. .... 290; 342; 447; 448; 449; 450; 468; 469; Silva, D.S. ............................................................... 279
470; 505; 506; 517; 520 Silva, E.H.S. ........................................................... 471
Ruza, R.G. ............................................................... 451 Silva, G.A. ............................................. 558; 559; 568
Silva, H.S. ............................................................... 531
S Silva, J.D.A. ........................................................... 280
Sá Filho, M.F. ....... 284; 366; 367; 403; 472; 473; 525 Silva, J.R.V. ................................... 266; 299; 352; 575
Sá Filho, O.G. ........................................ 286; 304; 393 Silva, K.C. .............................................................. 521
Sá, W.F. ................. 284; 439; 464; 472; 473; 478; 550 Silva, K.C.F. ................................................... 331; 463
Sala, R.V. ................................................................ 487 Silva, L.C.G. ........................................................... 332
s595
Silva, L.C.L.C. ....................................................... 267 Trasler, J.M. ............................................................ 243

Silva, M.N. ............................................................. 345 Tríbulo, R. .............................................................. 518
Silva, M.S. .............................................................. 577 Trinca, L.A. ............................................................ 411
Silva, R.C.P. .................................. 400; 402; 426; 498 Trinque, C.L.A. ...................................................... 563
Silva, S.M. .............................................................. 586 Tsuribe, P.M. .................................................. 443; 581
Silva, T.V.G. ............................................................ 471
Silva, V.A. ...................................................... 555; 582 V
Silva-Filho, F.J.M. .................................................. 575 Valarelli, R.L. ......................................................... 420
Silveira, E. .............................................................. 575 Valim, J.R. .............................................................. 235
Silveira, L.L. ........................................................... 512 van den Hurk, R. ............................................ 265; 299
Simões, R. .... 341; 485; 486; 540; 541; 543; 544; 547 Vannucchi, C.I. ...................................... 332; 340; 341
Sinowatz, F. ............................................................ 302 Vannucci, F.S. ......................................................... 366
Siqueira Filho, E.R. ....... 205; 310; 323; 342; 449; 505 Vantini, R. ..... 268; 269; 270; 271; 276; 298; 553; 562
Siqueira, A.F.P. ....................................................... 344 Varago, F.C. ............................................................ 314
Siqueira, L.C. ......................................................... 361 Vasconcelos, A.B. .................................................. 314
Siqueira, L.G.B. ............................. 281; 377; 495; 578 Vasconcelos, J.L.M. 9; 159; 285; 286; 292; 293; 304;
Soares, A.T. .................................................... 559; 568 383; 391; 392; 393; 394; 395; 412; 413; 414; 419;
Somfai, T. ............................................................... 171 420; 428; 513; 534
Soria, G.F. ............................................................... 359 Vasconcelos, M.F. ......................... 319; 320; 321; 407
Sousa, F.C. .............................................................. 291 Vasconcelos, T.D. 371; 398; 399; 429; 494; 501; 507;
Sousa, K.R.S. ................................................. 282; 370 515
Sousa, R.V. ............................................ 468; 506; 520 Veiga, G.A.L. .......................................................... 332
Souza Filho, G.A. ................................................... 588 Velho, J. .......................................................... 459; 576
Souza, A.F. ............................................................. 411 Verechia, F.T.V. ...................................................... 442
Souza, A.H. ... 31; 284; 366; 367; 368; 369; 400; 401; Verneck, W.C. ................................................. 353; 354
402; 403; 404; 408; 409; 410; 426; 427; 472; 473; Vetoratto, L.F. ......................................................... 329
525; 526; 527; 528; 529; 530; 531 Viana Silva, J.R. ....................................................... 71
Souza, A.L. ............................................................. 497 Viana, J.H.M.281; 282; 284; 359; 370; 377; 439; 464;
Souza, E.D.F. .......................................................... 360 472; 473; 478; 494; 495; 501; 507; 509; 515; 550;
Souza, J.C. ............................. 346; 378; 500; 503; 504 578; 584
Souza, R.J. .............................................................. 569 Viana, K.S. ............................................................. 358
Spegiorin, M.R. ..................................... 463; 521; 522 Vicente, W.R.R. ..................................... 338; 365; 462
Squires, E.L. ........................................................... 499 Viechnieski, S. ........................................................ 369
Steinborn, R. ........................................................... 276 Vieira, A.D. .................................................... 191; 322
Strauss, B.E. ................................................... 541; 546 Vila, R.A. ........................................................ 438; 491
Sudano, M.J............................................................ 482 Vilela Neto, J.M. ............................................ 392; 285
Vilela, E.R. ............................ 285; 383; 391; 392; 419
T Villaverde, A.I.S.B. ............... 318; 475; 563; 566; 580
Taconeli, C.A. ................................................ 318; 475 Vinholis, M.M.B. ................................................... 345
Tarouco, A.K. ......................................................... 537 Vireque, A.A. .......................................................... 454
Tavares, M. ............................................................. 315 Visintin, J.A. 277; 332; 340; 341; 440; 460; 479; 480;
Tavares, M.N. ................................................. 480; 481 481; 485; 486; 538; 539; 540; 541; 543; 544; 547;
Teixeira, D.I.A. .............................. 280; 291; 297; 510 549
Teixeira, L.B.C. ...................................................... 327 Vozzi, P.A. .............................................................. 491
Teixeira, N.A. ................................................. 363; 572
Teobaldo-Filho, O. ................................................. 483 W
Tetzner, T.A.D. .... 268; 269; 270; 271; 276; 437; 553; Wanderley, L.S. ...................................................... 352
554; 562 Watanabe, M.R. ...................................................... 435
Thiebaut, J.T.L. ...................................................... 488 Watanabe, Y.F. ....................................... 235; 435; 454
Toma, H.S. .............................................................. 379 Webb, R. ................................................................... 95
Toquetti, R.C. ......................................................... 585 Wechsler, F.S. ................................................. 278; 328
Torreão, J.N.C. ............................................... 556; 573 Weingril, R.B. ......................................................... 313
Torres Neto, R. ....................................................... 328 Welter, B.M. ................................................... 264; 375
Torres, C.A.A. ...... 281; 282; 283; 316; 370; 377; 495 Wentz, K.C. ............................................................ 309
Torres-Júnior, J.R.S. .......31; 284; 333; 334; 366; 367; Werner, P.R. ............................................................ 583
368; 401; 404; 408; 409; 410; 452; 472; 473; 526; Wilson Neto, J. ............................................... 396; 397
527; 528; 529; 530; 531; Wohlres, S. ............................................................. 584
Traldi, A.S. ............................................ 235; 345; 405 Wolf, E. ................................................................... 302
s596
Wosniacki, A.M. ..................................................... 368

Wünsche Jr., A.G. ................................................... 406
Y
Yamada, C. ............................................................. 479
Yamazaki, W. ......................................... 276; 537; 554
Z
Zahn, F.S. ............................................................... 565
Zambrini, F.N. ............................... 316; 357; 359; 509
Zilioti, C.R. ............................................................. 304
Zimmermann, M.F. ................................................. 308
Zúccari, C.E.S.N. ........................................... 333; 334
s597

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