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RESUMO
Os avanços recentes da nanotecnologia têm aumentado a utilização de nanomateriais e
nanodispositivos para diagnose, terapias e outros fins tecnológicos. O conhecimento da interação
entre nanomateriais e meios biológicos permite a descoberta de aplicações mais racionais, podendo
ajudar a entender e antever os seus efeitos adversos e citotóxicos. A endocitose é um processo
biológico dependente de energia que está envolvida na internalização de nanopartículas pelas
células, e depende de eventos orquestrados que requerem o funcionamento coordenado dos lipídios
e proteínas da membrana plasmática. Estudos que visam investigar em detalhes a endocitose e o
tráfego intracelular de nanopartículas são indispensáveis para compreensão de mecanismos
celulares ainda inexplorados e permitem projetar novas funções, que consequentemente auxiliam na
escolha de aplicações biomédicas da nanotecnologia. Nesse contexto, esta revisão visa conceituar as
principais vias de endocitose utilizadas no estudo da internalização de nanomateriais em células
eucarióticas. Além disso, alguns destinos intracelulares de nanomateriais serão discutidos para
auxiliar nos estudos do processamento celular de nanopartículas e desenvolvimento de novas
ferramentas terapêuticas.
Palavras-chave: Endocitose, nanopartícula, tráfego intracelular
ABSTRACT
Recent advances in nanotechnology have increased the use of nanomaterials and nanodevices for
diagnostic, therapeutic and other technological applications. The knowledge about the interaction
between nanomaterials and biological media allows the development of more rational applications,
as well understand and anticipate adverse and toxic effects resulting from this interaction.
Endocytosis is an energy-dependent biological process responsible for internalization of
nanoparticles, which depends on orchestrated events that require lipids and plasma membrane
proteins functioning. Studies that aim to investigate in detail the endocytosis and intracellular
trafficking of nanoparticles are essential for understanding cellular mechanisms, which in turn help to
select its biomedical applications. In this context, this review aims to conceptualize the main routes
of endocytosis used to study the internalization of nanomaterials in eukaryotic cells. In addition, we
discuss some intracellular trafficking of nanomaterials to aid in studies of the cellular processing and
development of new therapeutic tools.
Keywords: Endocytosis nanoparticle, intracellular trafficking
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Nano-Cell Interactions Lab., Departamento de Bioquimica, Instituto de Biologia CP 6109, Universidade Esta-
dual de Campinas - UNICAMP, 13083-970, Campinas, SP, Brasil
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A EMC é considerada uma “rota clássica de internalização deve ser evitada quando o alvo
internalização, responsável pela absorção de do tratamento não são os lisossomos, ou
vários nutrientes essenciais à sobrevivência quando o escape dos endossomos não querer a
celular. Esta via endocítica também desempe- acidificação do endossomo.
nha um papel importante na internalização de
complexos de recetores de membrana, Endocitose mediada por Caveolina
transportadores de metais, moléculas de adesão A endocitose mediada por caveolina é outro
e os recetores de sinalização, citocinas, mecanismo que permite a internalização de
neurotransmissores, patógenos, antígenos e nanopartículas. Caveolinas são proteínas de 22-
lipoproteínas19–22. Outras funções da EMC 24 kDa incorporadas na porção citosólica da
incluem a regulação negativa da sinalização membrana plasmática e com porções N- e C-
celular por internalização ou degradação de terminais encontradas voltadas para o
recetores e manutenção da homeostase celular, citoplasma31. Quando que essas proteínas são
por exemplo, por meio de bombas de íons de sintetizadas, são inseridas na membrana do
tráfico intracelular5,19,20,23. O mecanismo de retículo endoplasmático e levadas pela via
formação relacionado com a EMC envolve a secretora do retículo, formam complexos homo
formação de uma vesícula a partir da e heteroligoméricos no complexo de Golgi e são
polimerização de uma proteína citosólica transportadas para a membrana plasmática
chamada clatrina-1, que também requer o como conjuntos de aproximadamente 100-200
auxílio proteínas adaptadoras AP180 e AP-222,24. moléculas de caveolina. É importante ressaltar
A clatrina é uma proteína composta por que essas proteínas não estão funcionais até a
estruturas denominada trisquélions, que sua chegada à membrana plasmática. Ao serem
possuem três cadeias pesadas (~190 kDa) e três depositadas na membrana plasmática, dessem-
cadeias leves (~25 kDa). Os trisquélions penham seu papel biológico relacionado não só
configuram-se para gerar uma estrutura hexa- a endocitose, mas também a sinalização
gonal e pentagonal, que propicia a formação da celular31,32.
curvatura da membrana22–24. A vesícula A caveolina é encontrada em invaginações da
revestida por clatrina possui aproximadamente membrana plasmática em forma de balão com
100-200 nm de diâmetro, sendo formada a tamanho entre 50-100 nm denominada
partir da constrição da membrana invaginada cavéolas33. Encontram-se associadas às
pela GTPase dinamina, que libera a vesícula no cavéolas, microdomínios de membrana enrique-
citoplasma5,24–27. Outro fator importante é a cidas com fosfolipídios, esfingolipídios e coleste-
polimerização de actina e miosina de classe I rol, conhecidos como lipid rafts33,34. As cavéolas
para gerar a invaginação da membrana, estru- são particularmente abundantes em células
turação da vesícula revestida, recrutamento endoteliais, as quais podem constituir 10 a 20%
para o citoplasma e cisão da vesícula. Algumas das proteínas da membrana plasmática. São
proteínas adaptadoras e a proteína miosina VI também encontradas em adipócitos, fibroblas-
também são essenciais para o transporte das tos e células de músculo liso35,36. Por outro lado
vesículas para endossomos precoces10. estão ausentes em neurônios e leucócitos5,37,
A EMC pode influenciar no destino ou ausentes também em algumas linhagens de
degradação lisossômica de nanomateriais. Esse células tumorais, como a linhagem de câncer de
fator é relevante quando se utiliza próstata PC338. A característica marcante da
nanopartículas como carreadores de fármacos cavéola é a presença de uma proteína de
ou genes. No uso de nanopartículas para membrana com estrutura grampo chamada
carreamento de fármacos (drug delivery), a caveolina-1 (Cav1), a qual é indispensável para a
forma pela qual a partícula é endocitada pode formação da cavéola. A Cav1 faz com que a
fazer com que a nanopartícula seja degradada cavéola assuma sua estrutura em forma de
pelas enzimas lisossomais e não chegar ao alvo frasco e possa envolver moléculas que se ligam
destinado. Estabelecer estraté-gias para em sua superfície5. Até 144 moléculas caveolina
promover o escape dos endossomos e evitar a foram apontadas na incorporação de uma única
degradação lisossomal é vital para o sucesso da estrutura caveolar35. Além da Cav1, que está
terapia28–30. Por esse motivo, essa via de presente na maioria das células, há outras
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isoformas como caveolina-2 (Cav2), a qual rial extracelular, e é caracterizada pela movi-
auxilia e facilita a endocitose, porém não é mentação da membrana plasmática induzida
essencial para a formação da cavéola; e a caveo- por uma ativação global do citoesqueleto de
lina-3 (Cav3), que é expressa, especificamente, actina. Essa via envolve a transposição de
nos músculos estriados cardíacos e esquelé- grande quantidade de fluido externo através da
ticos33,35. formação de ondulações na extensão da mem-
Proteínas como cavina, responsáveis pela brana plasmática: as projeções citoplasmáticas
indução da curvatura da membrana, e dina- se fundem a membrana como ondas resultando
mina, que realiza a constrição da membrana em grandes vacúolos endocíticos, heterogêneos
plasmática liberando o endossomo no cito- em tamanho e morfologia, chamados
plasma, são essenciais para a endocitose. macropinossomos49,50. Os macropinossomos
Também têm participação na endocitose oferecem uma rota eficaz para a endocitose de
mediada por caveolina as proteínas de macromoléculas não seletíveis e são fáceis de
membrana associadas à vesícula (VAMP2 - distinguir de outras vesículas formadas durante
vesicle-associated membrane protein) e a pinocitose, uma vez que são estruturas
proteínas associadas ao sinaptossoma (SNAP - substancialmente maiores (0.5-10 µm), não
synapto- some-associated protein), que mediam revestidas e que se encolhem durante a sua
a fusão do endossomo com outras vesículas maturação intracelular51.
intracelulares, além de outras proteínas como Embora a definição de macropinocitose
GTPases39,40. possa dar a impressão de ser um processo
Essa via aparenta ser mais lenta in vitro aleatório, trata-se na verdade de um processo
quando comparada com a via de EMC. Contudo celular muito complexo e bem coordenado49.
o mais importante é que, em alguns casos, essa Sabe-se hoje que macropinocitose é um tipo de
via pode evitar a degradação lisossomal41,42. endocitose regulada por actina que, ao
Além disso, as vesículas de cavéola transportam contrário dos mecanismos de endocitose acima
e se fundem aos caveossomos ou corpos multi- discutidos, não é conduzida diretamente pela
vesiculares (MVBs), que possuem um pH carga ou pelos recetores associados15. O
neutro5. Por essa mesma razão, acredita-se que processo é geralmente iniciado por estímulos
esta via é benéfica para a entrega de proteínas e externos através da ativação transiente de
DNA5. Entretanto, essa visão foi questionada recetores de tirosina quinases (RTKs), que por
após a descoberta de que os caveossomos sua vez ativam proteínas chave da sinalização
possuem um pH ácido, ao contrário do que se celular, como Ras, PLC e PI3 quinase. Essas
acreditava e a discussão sobre a endocitose proteínas coordenam as mudanças em
mediada por caveolina como uma via filamentos de actina, gerando uma agitação na
facilitadora da entrega de ativos permanece em membrana plasmática52,53 e essa perturbação na
aberto43,44. membrana se projeta sobre os fluidos no meio
Há relatos na literatura de diversos nanoma- extracelular. Além disso, membros da família
teriais internalizados pela via da caveolina. Essa Rho e seus efetores também são requeridos
via tem atraído grande atenção na nanomedi- para ativação da maquinaria de polimerização
cina por ter sido sugerida como via de escape à de actina e ondulação da membrana
degradação lisossomal5,36,45. Além disso, a plasmática50.
endocitose mediada por caveolina é a via fisio- A macropinocitose tem um papel impor-
lógica para transcitose. Dessa forma, ela pode tante para a motilidade celular e obtenção de
ser empregada para entrega trans-vascular de nutrientes, consequentemente, é bastante estu-
nanomateriais, por exemplo para a entrega de dada no contexto da progressão e metástase de
ativos no sistema nervoso central, onde há a câncer54–57. É importante também para células
necessidade de atravessar barreira hematoen- diferenciadas, tais como os fagócitos profissio-
cefálica32,46–48. nais que desempenham papéis significativos no
sistema imunológico, como a endocitose de
Macropinocitose antígenos e a liberação de corpos apoptóticos e
Macropinocitose pode ser definida como a células necróticas. Além disso, tem sido suge-
internalização de grandes quantidades de mate- rida como uma via endocítica eficaz para a inter-
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Figura 1. Principais vias de endocitose de nanopartículas em células eucarióticas. A etapa inicial representa
principais vias de endocitose usadas para o estudo da internalização de partículas, que tem como consequência
a formação de vesículas intracelulares - fagocitose, macropinocitose, endocitose mediada por clatrina,
endocitose mediada por caveolina e endocitose clatrina e caveolina independentes (flotilina e Glic-Glec). A
segunda etapa representa a via clássica de tráfego intracelular que envolve o processamento das
nanopartículas a partir do amadurecimento do endossomo precoce, com destino à degradação lisossomal do
material endocitado.
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e a via de reciclagem dependente de ARF6 11,106, vesículas iniciais, que são mediadas primaria-
através da qual grande parte das proteínas mente por carreadores ou proteínas que auxi-
endocitadas podem voltar à membrana plasmá- liam na sua formação26. Essas curvaturas/
tica99. vesículas se fundem, então, formando um
Nesse caso, o modo de formação vesicular compartimento endossomal enriquecido com
proposto é similar ao descrito para CLIC/GEEC. domínios lipídicos e os recetores. Após isso, a
Arf6 ativa a enzima fosfatidilinositol 4-fosfato 5- proteína RhoA sinaliza para a modificação do
quinase que é responsável por gerar mais citoesqueleto, gerando a invaginação na
fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato. Então, Arf6, se membrana plasmática. As invaginações depen-
liga ao Fosfaditilinositol 4, 5-bifosfato produ- dentes de RhoA se mostram uniformes e com
zido, modificando a estrutura da membrana99, e tamanhos entre 50-100 nm26. Até o presente
recruta proteínas membranares para o sítio em momento, a dinamina aparenta ser necessária
questão. Arf6 também se liga e ativa fosfo- para a cisão de invaginação, transformando-a
lipase D, enzima que hidrolisa fosfatidilcolinas numa vesícula endossômica11,111–113.
em ácido fosfatídico, provocando perturbações Iversen et al. (2012)60 demonstrou que a
na membrana plasmática99,107–110. Todas essas internalização de quantum dots associados com
modificações facilitam a formação da invagina- ricina acontece de forma independente de
ção e das vesículas99. Por último, Arf6 modula e RhoA60 e dependente de CAM114,115. Isso ressalta
modifica as fibras de actina, formando a que ainda são necessários novos estudos para
invaginação e a vesícula endocitária99. Apesar elucidar não só o mecanismo de operação da via
da vasta gama de produtos internalizados por dependente de RhoA, assim como outras
essa via e a sua importância celular, ainda é proteínas correlatas26, o que pode auxiliar na
necessário identificar as proteínas diretamente aplicação desta via como forma de interna-
ligadas com a Arf6 e auxiliam na modulação da lização de nanomateriais.
via99. Até o momento, não foi encontrado
relatos de internalização de nano-materiais O QUE ACONTECE COM OS NANOMATERIAIS
através esta via. DEPOIS QUE ENTRAM NAS CÉLULAS?
Como discutido anteriormente, o material
Endocitose mediada por RhoA endocitado encontra-se confinado em uma
A função da proteína RhoA está atrelada à vesícula lipoproteica no citoplasma. Portanto,
reorganização do citoesqueleto e polimerização essa vesícula é constituída de uma porção da
de actina111. Encontra-se associada com a membrana plasmática, bem como consti-
regulação e controle de vesículas revestidas de tuintes do meio externo confinados em uma
clatrina em células HeLa, inibindo a internali- vesícula intracelular (Figura 1). Através de uma
zação quando ativadas, assim como a estimula- série de eventos de fusão e fissão, seu conteúdo
ção e perturbações na membrana plasmática112 passa por um processo de maturação que
e está intimamente ligada com a internalização envolve a diminuição do pH no lúmen da
de recetores de interleucina-2113. vesícula e a fusão com endossomos tardios até,
O mecanismo da via é semelhante ao da por fim, chegar aos lisossomos, onde ocorre a
Cdc42 (CLIC/GEEC) explicitado anteriormente, degradação do material endocitado. É impor-
porém já foi demonstrado que são mecanismos tante ressaltar que diferentes modelos foram
distintos, pois algumas proteínas chaves desta propostos para explicar como o material endoci-
via, como a própria RhoA, a dinamina e os tado passa de endossomo a lisossomo. Há pelo
recetores de Interleucina-2(sem as quais esta menos quatro teorias, i. maturação, ii. vesicular,
via é inibida), não estão presentes para a via transferência de conteúdo (kiss-and-run) e
Cdc4211,27,67,89,91,109,111. modelo híbrido, que podem explicar esse
Essa via, quando ativa, provoca o recruta- processo, a discussão a fundo dessas teorias
mento de recetores de interleucinas-2 através foge do escopo desta revisão (para maiores
da formação de microdomínios lipídicos 113. detalhes ver116–118). Entretanto, essa é uma área
Neste ponto, a retirada de esfingolipídios e em pleno desenvolvimento e os conhecimentos
colesterol interrompe a internalização11,68,111. gerados por ela terão impactos significativos no
Inicialmente, há curvatura da membrana ou transporte intracelular de nanomateriais. A rota
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do endolisossomo, pode levar a uma desor- complexo de Golgi, Calnexina para retículo
ganização momentânea da membrana endos- endoplasmático e Lamp1 e Lamp2 para lisos-
somal e consequente liberação do conteúdo do somos. Geralmente são empregadas técnicas de
endossomo125,126. Outra estratégia para escapar microscopia (de fluorescência, eletrônica, de
do endossomo inclui a conjugação de nano- força atômica), principalmente microscopia
partículas com proteínas fusogênicas como a confocal, para a colocalização de organelas e
melitina, que propicia a fusão de lipídios de nanomateriais, para assim traçar o caminho
membrana entre duas vesículas opostas, aproxi- percorrido nas células.
mando proteínas e lipídeos de membrana e leva
a uma fusão do conteúdo luminal sem lise28,127. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Outra estratégia interessante é a utilização A produção de nanomateriais vem se
de moléculas fotossensíveis, pois a radiação tornando cada vez mais expressiva, portanto,
eletromagnética pode provocar a libertação concomitantemente há uma crescente preocu-
dessas moléculas endocitadas para o citoplasma pação a respeito do uso, manipulação e elimina-
e contidas nas vesículas. Nesse processo, as ção desses materiais. Muitas interações funda-
membranas endossomais são altamente danifi- mentais entre nanomateriais e o meio biológico
cadas pela utilização fotossensibilizadores anfi- ainda não são completamente compreendidas.
fílicos e o resultado é a subsequente libertação Em grande parte dos estudos sobre a aplicação
das nanopartículas aprisionadas para o citosol, de nanomateriais, há lacunas sobre os mecanis-
como observado para a liberação de LDL intra- mos moleculares envolvidos. O conhecimento
celular de nanopartículas lipoproteicas128. da endocitose e os destinos intracelulares de
Após o escape lisossômico, muitas estraté- nanopartículas são indispensáveis para projetar
gias também são utilizadas para determinar o aplicações terapêuticas, além de ser útil na
destino final de um nanopartícula. As nanopar- avaliação citotóxica desses materiais. O estudo
tículas podem se direcionar para diversas orga- do tráfego celular tem grande importância no
nelas e isso dependerá de sua estabilidade desenvolvimento de nanocarreadores, pois
frente a degradação lisossomal10,129, caracterís- quando definido o alvo intracelular, é possível
ticas físico-químicas119, tempo de internali- aprimorar a aplicação terapêutica, consequen-
zação130 e afinidade nanopartícula-organela28. O temente, fornecer tratamentos médicos mais
destino intracelular de uma nanopartícula pode eficazes.
ser de modo específico (nanopartícula-organela A endocitose é um processo fisiológico que
alvo), ou então de modo inespecífico para diver- foi moldado pelo processo evolutivo para
sas organelas simultaneamente, por exemplo o desempenhar um papel biológico diferente em
núcleo, complexo de Golgi, retículos endoplas- cada tipo celular, que está diretamente ligado a
máticos, mitocôndria, entre outros28,130. Os função que aquela célula realiza em seu tecido
estudos que visam investigar o tráfico intrace- de origem. Por isso é altamente esperado que
lular de nanopartículas são essenciais para esse processo seja dependente do tipo celular.
determinar a promoção de suas aplicações131. O Na maioria das vezes, as nanopartículas são
conhecimento do destino intracelular de internalizadas por mais de uma via (por ex.
nanopartículas é muito importante na avaliação clatrina e caveolina) o que pode resultar em
do efeito citotóxico, ou então, para o respostas biológicas distintas, uma vez que uma
diagnóstico e terapia de diversas enfermidades. via pode levar a uma degradação mais eficiente.
Para estudar esse processo de tráfego intrace- Esses fatores devem ser levados em conside-
lular ou mesmo o destino intracelular de um ração no estudo da interação das nanopartículas
nanomaterial, diversos marcadores de orga- com o ambiente celular. Essa é uma área multi-
nelas ou estruturas vem sendo desenvolvidas. A disciplinar que apesar de não ser completa-
Figura 2 resume os alvos desses marcadores. mente compreendida atualmente está em pleno
Essas estratégias utilizam-se de proteínas resi- desenvolvimento, bem como as técnicas e ferra-
dentes ou marcadores de organelas, como mentas utilizadas nessa área, da qual espera-se
Rab4, Rab5, e EEA1 para endossomos precoces; no futuro próximo grandes descobertas e uma
Rab7 para endossomos tardios; Rab11 para importante contribuição para uma aplicação
endossomos de reciclagem; CD63 e Hsc70 para segura e eficiente de nanomateriais.
exossomos; Giantina, GM130 e TGN38 para
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