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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”


INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO
CLARO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS


MICROBIOLOGIA APLICADA

Avaliação da remoção de cor e toxicidade de azo corantes pelo


emprego de tratamentos microbiológicos, adsortivos e processos
oxidativos avançados

Erica Janaina Rodrigues de Almeida

Tese apresentada ao Instituto de


Biociências do Campus de Rio
Claro, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutora
em Ciências Biológicas
(Microbiologia Aplicada).

Fevereiro - 2018
Avaliação da remoção de cor e toxicidade de azo corantes pelo emprego
de tratamentos microbiológicos, adsortivos e processos oxidativos
avançados

ERICA JANAINA RODRIGUES DE ALMEIDA

Orientador: Prof. Dr. Carlos Renato Corso

Co-orientadora: Profa. Dra. Adalgisa Rodrigues de Andrade

Tese apresentada ao Instituto de


Biociências do Campus de Rio
Claro, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutora
em Ciências Biológicas
(Microbiologia Aplicada).

Rio Claro - SP

Fevereiro - 2018
576 Almeida, Erica Janaina Rodrigues de
A447a Avaliação da remoção de cor e toxicidade de azo corantes têxteis pelo emprego de
tratamentos microbiológicos, adsortivos e processos oxidativos avançados / Erica Janaina
Rodrigues de Almeida. - Rio Claro, 2018
215 f. : il., figs., gráfs., tabs.

Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro


Orientador: Carlos Renato Corso
Coorientador: Adalgisa Rodrigues de Andrade

1. Micro-organismos. 2. Azo corantes têxteis. 3. Tratamentos biológicos. 4. Tratamentos


de oxidação eletroquímica. 5. Aspergillus terreus. 6. Ensaio microssoma/Salmonella. I.
Título.

Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP


Campus de Rio Claro/SP - Ana Paula Santulo C. de Medeiros / CRB 8/7336
1

Dedico aos principais responsáveis por eu ter chegado até aqui,


aqueles que me apoiaram e me deram seu amor incondicional.
Meus PAIS,
FRANCISCO (in memoriam) e ADINALVA
2

AGRADECIMENTOS

A concretização desse trabalho só foi possível porque ao longo desses 10 anos


em que ingressei na vida acadêmica universitária tive a sorte de encontrar pelo
caminho pessoas maravilhosas (algumas nem tanto, mas essas nos ensinam a não
ser como elas) que me ajudaram a tornar a mulher e profissional que hoje sou.Aos
meus pais Francisco (in memoriam - onde estiver, sei que sempre olha por mim) e
Adinalva, pelo amor e apoio incondicional em todos os momentos, tenham sido eles
bons ou ruins. Aos meus irmãos Camila, Gui e minha irmã do coração Tici, obrigada
por iluminar meus dias, me dar motivos para sorrir e encher meu coração de alegria.

Ao Professor Corso, a quem devo a realização desse trabalho, pois sem o


senhor nada disso poderia ter sido concretizado. Obrigada Professor pela confiança,
pela paciência, pelos conselhos, por acreditar em mim e me apoiar. Mestre e amigo
que não faltou comigo em nenhum momento. Quem eu tive o prazer de conhecer e
tenho orgulho de trabalhar.

A Professora Adalgisa Rodrigues de Andrade, co-orientadora desse projeto,


que me abriu as portas de seu laboratório e me ensinou que sempre temos algo para
melhorar, e que nunca devemos desistir não importam quais sejam as adversidades.
Um exemplo de pesquisadora, Gisa foi uma honra trabalhar com você.

Ao Beto que sempre me salvou quando todos os experimentos não


funcionavam. Obrigada Beto, você sempre me mostrou que havia uma luz no fim do
túnel, e que desistir é inadmissível. Obrigada por todos os ensinamentos.

Ao Lab. Multi, que com certeza é o laboratório mais legal da Unesp. Obrigada
a todos os meus companheiros Rubão, Jaque, Bill, Gabi, Marina, Guilherme, Carol,
Chal, Grazy e todos os demais companheiros de departamento pela boa convivência
e por fazer dos momentos de trabalho, momentos mais agradáveis e gostosos de
serem vividos.

Em especial agradeço ao senhor José Rubens (Rubão) por resolver todos os


meus problemas burocráticos enquanto estive fora do Brasil e me ajudar com todas
as dúvidas de informática ao longo desses últimos 4 anos.
3

Agradeço também aos amigos de trabalho no laboratório de Eletrocatálise e


Eletroquímica Ambiental da Faculdade de Química, da USP de Ribeirão Preto Layci,
Tiaguinho, Angelo, Xys, Neto, Vanderlei, Carol, Thamyres, e aos técnicos Tiago
Cavassani e Mercia pela amizade e suporte no desenvolvimento dessa pesquisa.

Agradeço também aos outros técnicos de laboratório Carmem, Fátima, Adriano


e demais colegas de ambos departamentos, que em algum momento também
contribuíram para o desenvolvimento desse trabalho.

Agradeço a Professora Marin por me permitir realizar o teste de Ames em seu


laboratório, me fornecendo toda a estrutura necessária e embasamento teórico para
a realização deste ensaio. E a Dânia e Laís, por me acompanharem durante o teste.
Muito obrigada.

A Professora Dejanira por sempre estar de portas abertas para me receber e


me ajudar, muito obrigada Professora. A senhora e a Professora Marin são exemplos
de mulheres e pesquisadoras para mim.

A toda minha família e amigos, que sempre compreenderam meus esforços e


sempre me apoiaram para chegar até aqui.

Agradeço a FAPESP, Processo nº 2013/25535-4, pela bolsa de estudos e todo


o financiamento desse projeto. A execução desse trabalho seria impossível sem esse
financiamento. Agradeço também pela bolsa Bepe, Processo nº 2016/22464-7, que
me permitiu expandir conhecimentos e aprender novas técnicas para aperfeiçoar
meus estudos com degradação de corantes.
4

Que eu não me iluda com o ânimo e o vigor dos primeiros trechos,


porque chegará o dia em que os pés não terão tanta força
e se ferirão no caminho e se cansarão mais cedo...
Todavia, quando o cansaço houver, que eu não me desespere
e acredite que ainda terei forças para continuar.

Drummond
5

RESUMO

A qualidade da água de ambientes aquáticos e de abastecimento é uma das questões


mais importantes a nível mundial. Atualmente, vários compostos orgânicos e
inorgânicos tóxicos vêm sendo detectados em níveis críticos em águas residuais,
subterrâneas e superficiais. Dentre esses compostos há os corantes sintéticos que
estão constantemente sendo descartados em corpos d’água a partir de efluentes
industriais. Os azo corantes representam uma classe muito importante de corantes
têxteis, e a sua biotransformação por micro-organismos (fungos, bactérias e
leveduras) pode liberar aminas aromáticas, que comprovadamente possuem
propriedades genotóxicas e/ou mutagênicas, podendo induzir danos graves em
organismos aquáticos e humanos. Além disso, o descarte de efluentes têxteis
contendo corantes diretamente nos ambientes aquáticos pode provocar redução da
transparência da água, solubilidade de oxigênio e fotossíntese de plantas aquáticas.
Muitas abordagens são propostas para remover corantes têxteis de águas residuais,
incluindo métodos de coagulação/precipitação química, adsorção física, oxidação
eletroquímica, oxidação química. Recentemente, processos de oxidação avançada
(POAs) são considerados promissores para o tratamento de águas residuais, pois são
capazes de oxidar uma ampla gama de compostos de difícil degradação. As
desvantagens desses processos incluem principalmente alto custo energético. Os
processos biológicos também têm recebido atenção devido às vantagens de baixo
custo operacional, menor produção de lodo, além de serem considerados
ambientalmente sustentáveis em comparação aos métodos químicos ou físicos. A
desvantagem do processo microbiológico é o longo período de tratamento, e para
contornar essa limitação, combinação de tratamentos de POAs para obter degradação
parcial de corante seguida de um tratamento biológico, mostrou em alguns estudos
ter potencial para conseguir descolorir e mineralizar soluções aquosas contendo azo
corantes em período de tempo mais reduzido. Sendo assim, o objetivo principal desse
estudo foi remover os corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B de soluções
aquosas simples e binárias usando tratamentos de descoloração microbiológico e
microbiológico com pré-tratamento de oxidação eletroquímica. Para a realização dos
tratamentos biológicos foram utilizados o fungo Aspergillus terreus e a levedura
Saccharomyces cerevisiae. Intensas alterações moleculares foram detectadas após
6

os tratamentos de descoloração a partir de análises de FTIR e HPLC. A


mutagenicidade foi determinada pelo ensaio Salmonella/microssoma (teste de Ames),
e a toxicidade aguda a partir de testes com sementes de Lactuca sativa. Ao final do
tratamento de descoloração, foram realizados tratamentos adsortivos com argila
branca imobilizada em alginato, para remoção de metabolitos altamente tóxicos,
formados após a degradação das moléculas dos corantes. Após a análise de todos os
sistemas testados, verificou-se que o sistema eletroquímico/biológico/argila foi o que
apresentou maior capacidade de adsorção, degradação e/ou mineralização das
moléculas dos corantes, pois ocorreu redução da toxicidade aguda para sementes de
L. sativa em todas as soluções testadas. Para a solução binária o sistema
eletroquímico/A. terreus/argila foi capaz de transformar uma solução inicialmente
mutagênica em uma solução não mutagênica ao final do tratamento.

Palavras chave: azo corantes têxteis; tratamentos biológicos; tratamentos de


oxidação eletroquímica; Aspergillus terreus; Saccharomyces cerevisiae; teste de
Ames.
7

ABSTRACT

Water quality has deteriorated globally and provision of clean water is one of most
important worldwide issues. Nowadays, various toxic organic and inorganic
compounds have been detected at critical levels in waste water, ground and surface
waters. The intense use of synthetic dyes is an environmental problem, considering
that constantly these compounds are discharged into water bodies by industrial
effluents. Azo dyes represent the by far most important class of textile dyes. Their
biotransformation by microorganisms (fungi, bacteria, yeasts) may release aromatic
amines that have genotoxic and/or carcinogenic properties, and can induce serious
damage in aquatic organisms and humans. In addition, the disposal of azo dyes from
dyestuff textile processing industries directly into the water resources causes a
reduction in water transparency, oxygen solubility and photosynthesis in aquatic
plants. Many approaches have been proposed to remove dyes from textile
wastewaters, including chemical coagulation/precipitation, physical adsorption,
electrochemical oxidation, chemical oxidation. Recently, advanced oxidation
processes (AOPs) have been proposed as promising technique for wastewater
treatment. These techniques as are able to oxidise a wide range of compounds that
are difficult to degrade, disadvantages of these processes include mainly high energy
cost. The biological processes also have received attention because of the advantages
of low operating cost, less sludge and environmental friendliness compared with
chemical or physical methods. Disadvantages the biological process is long treatment
period. To circumvent these limitations, a combination of AOP’s treatments to obtain
partial dye degradation followed by a biological treatment has been shown to have
potential to achieve effective decolorization and mineralization of azo dyes. The main
purpose of this study was to remove the dyes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B in
simple and binary aqueous solutions using biological and electrochemical/biological
decolorization treatments. To perform the biological treatments were used the fungus
Aspergillus terreus and the yeast Saccharomyces cerevisiae. Intense molecular
changes after decolorization treatments were demonstrated by the HPLC and FTIR
analysis. Mutagenicity was determined by the Salmonella/microsome assay (Ames
test), and the acute toxicity by the Lactuca sativa seeds. At the end of the
decolorization treatment were performed adsorption treatment with white clay
8

immobilized in alginate for removal the highly toxic metabolites formed after the
degradation of the dye molecules. After analyzing all the systems tested, we can verify
that the electrochemical/biological/clay system was what presented highest
adsorption, degradation and/or mineralization capacity of the dye molecules, because
occurred reduction of acute toxicity for Lactuca sativa seeds in all solutions tested. For
the binary solution the electrochemical/A. terreus/clay system was able to transform
an initially mutagenic solution into non-mutagenic after treatment.

Keywords: textile azo dyes; biological treatments; electrochemical oxidation


treatments, Aspergillus terreus; Saccharomyces cerevisiae; Ames test.
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LISTA DE FIGURAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 1 – Importações e exportações de corantes, pigmentos e branqueadores


ópticos no Brasil .................................................................................................. 24

Figura 2 – Estrutura molecular do azo corante têxtil Acid Blue 161 .................. 25

Figura 3 – Estrutura molecular do azo corante têxtil Procion Red MX-5B ............ 26

CAPÍTULO I

Figura 1 – Suportes de titânio metálico utilizados na preparação dos eletrodos


(A) caracterização do eletrodo (B) eletrodo de trabalho ....................................... 40

Figura 2 – Esquema representando as etapas de deposição dos óxidos


metálicos no suporte de titânio durante, a preparação dos eletrodos ................... 42

Figura 3 – Configuração do eletrodo utilizado para caracterização do eletrodo


de trabalho ........................................................................................................... 42

Figura 4 – Configuração da célula eletroquímica utilizada nas eletrólises,


composta por (A) placas metálicas de titânio; (B) Placas de Teflon®; (C)
borrachas de vedação; (D) eletrodo auxiliar de aço inoxidável; (E) espaçadores
de borracha; (F) espaçador de Teflon®; (G) eletrodo de trabalho ........................ 46

Figura 5 – Sistema utilizado para a realização das eletrólises (A) célula filtro
prensa, (B) bomba peristáltica, (C) solução a ser tratada e (D) reservatório
composto por tubos de quartzo ............................................................................ 46

Figura 6 – Espectro de absorção UV-Vis do corante Acid Blue 161 .................. 50

Figura 7 – Espectro de absorção UV-Vis do corante Procion Red MX-5B ......... 51

Figura 8 – Espectro de absorção dos corantes (----) Procion Red MX-5B, (----)
Acid Blue 161 em solução simples e (----) solução binária ................................... 51

Figura 9 – Curva de calibração do corante Acid Blue 161 .................................... 53

Figura 10 – Curva de calibração do corante Procion Red MX-5B ........................ 53


10

Figura 11 – Curva de calibração da solução binária ................................................. 54

Figura 12 – Inibição de crescimento das raízes das plântulas de L. sativa, após


120 h de exposição a diferentes concentrações do eletrólito suporte Na2SO4 55

Figura 13 – Voltamogramas cíclicos do eletrodo de composição nominal


Ti/Ru0,3Ti0,7O2 antes e após realização do condicionamento voltamétrico ........... 57

Figura 14 – Voltamogramas cíclicos eletrodo de Ti/Ru0,3Ti0,7O2 na presença do


corante Acid Blue 161 .......................................................................................... 58

Figura 15 – Voltamogramas cíclicos do eletrodo de Ti/Ru0,3Ti0,7O2 na presença


do corante Procion Red MX-5B ........................................................................... 59

Figura 16 – Micrografia do filme de óxido Ti e Ru depositado sobre o titânio


metálico do eletrodo de trabalho .......................................................................... 60

Figura 17 – Espectros de absorção UV-Vis e descoloração da solução de Acid


Blue 161 .............................................................................................................. 61

Figura 18 – Espectros de absorção UV-Vis e descoloração da solução de


Procion Red MX-5B ............................................................................................. 62

Figura 19 – Espectros de absorção UV-Vis e descoloração da solução binária


composta pelos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B ............................ 62

Figura 20 – Comparativo de descoloração das soluções compostas pelos


corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B após o tratamento eletroquímico 63

Figura 21 – Soluções do corante Acid Blue 161 antes e após tratamento


eletroquímico (A) controle; (B) 1 h; (C) 2 h; (D) 3 h; (E) 4 h de tratamento ............ 64

Figura 22 – Soluções do corante Procion Red MX-5B antes e após tratamento


eletroquímico (A) controle; (B) 1 h; (C) 2 h; (D) 3 h; (E) 4 h de tratamento ............ 64

Figura 23 – Soluções binária dos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-
5B antes e após tratamento eletroquímico (A) controle; (B) 1 h; (C) 2 h; (D) 3 h;
(E) 4 h de tratamento ........................................................................................... 65

Figura 24 – Comparativo de descoloração dos corantes Acid Blue 161 e


Procion Red MX-5B em solução binária ............................................................... 66
11

Figura 25 – Comparativo de Remoção de COT nas soluções compostas pelos


corantes Acid Blue 161, Procion Red MX-5B e solução binária ............................ 66

Figura 26 – Espectros de absorção do corante Acid Blue 161, antes e após


tratamento eletroquímico ..................................................................................... 68

Figura 27 – Comparativo de descoloração das soluções do corante Acid Blue


161 em diferentes velocidades de fluxo ............................................................... 69

Figura 28 – Comparativo de Remoção de COT das soluções de Acid Blue 161


em diferentes velocidades de fluxo ...................................................................... 69

Figura 29 – Dados relativos a eficiência de corrente instantânea nas eletrólises


dos corantes Acid Blue 161, Procion Red MX-5B e solução binária ..................... 71

Figura 30 – Dados relativos eficiência de corrente instantânea nas eletrólises


dos corantes Acid Blue 161, com variação de fluxo 10, 25 e 70 mL min -1 ............. 72

CAPÍTULO II

Figura 1 – Estrutura molecular do azo corante têxtil Acid Blue 161 ................... 77

Figura 2 – Estrutura molecular do azo corante têxtil Procion Red MX-5B ......... 78

Figura 3 – (A) Fungo A. terreus (B) Imagem microscópica do fungo A. terreus . 79

Figura 4 – Esquema de produção de biomassa fúngica (pellets miceliais) ......... 82

Figura 5 – (A) Imagem do fermento biológico seco; (B) imagem de microscopia


eletrônica de varredura S. cerevisiae .................................................................. 83

Figura 6 – Esquema geral do teste de biodegradação com o fungo A. terreus e


com a levedura S. cerevisiae ............................................................................... 86

Figura 7 – Esferas de argila branca imobilizada em alginato ............................... 89

Figura 8 – Curva de calibração para quantificação de proteínas totais produzida


pelo fungo A. terreus e pela levedura S. cerevisiae .............................................. 91

Figura 9 – Concentração de proteínas totais produzida (µg mL-1) pelo fungo A.


terreus durante 30 dias de fermentação em meio de solução de sais de Vogel
enriquecido com 2 % de sacarose ....................................................................... 92
12

Figura 10 – Concentração de proteínas totais produzida (µg mL-1) pela levedura


S. cerevisiae durante 30 dias de fermentação em meio de solução de sais de
Vogel enriquecido com 2 % de sacarose ............................................................. 93

Figura 11 – Dados de descoloração corante Acid Blue 161. (A) tratamento


microbiológico; (B) absorbância relativa tratamento microbiológico; (C)
tratamento eletroquímico/microbiológico (D) absorbância relativa tratamento
eletroquímico/microbiológico ............................................................................... 94

Figura 12 – (A) Pellets miceliais do fungo A. terreus e (B) esferas de levedura


S. cerevisiae imobilizadas em alginato, após interação com o corante Acid Blue
161 ...................................................................................................................... 96

Figura 13 – Espectros de FTIR das soluções (A) controle do corante Acid Blue
161, (B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F)
288 h de tratamento microbiológico com o fungo A. terreus com e sem pré-
tratamento eletroquímico ..................................................................................... 98

Figura 14 – Espectros de FTIR das soluções (A) controle do corante Acid Blue
161, (B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F)
288 h de tratamento microbiológico com a levedura S. cerevisiae com e sem
pré-tratamento eletroquímico ............................................................................. 100

Figura 15 – Cromatogramas de HPLC-Vis das soluções de Acid Blue 161 antes


e após os tratamentos (A) microbiológico com A. terreus e (B) eletroquímico/A.
terreus ................................................................................................................. 102

Figura 16 – Cromatogramas de HPLC-Vis das soluções de Acid Blue 161 antes


e após os tratamentos (A) microbiológico com S. cerevisiae e (B) eletroquímico/
S. cerevisiae ........................................................................................................ 103

Figura 17 – Cromatogramas de HPLC-UV das soluções (A) controle Acid Blue


161, (B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F)
288 h de tratamento microbiológico com o fungo A. terreus com e sem pré-
tratamento eletroquímico ............................................................................ 105

Figura 18 – Cromatogramas de HPLC-UV das soluções (A) controle Acid Blue


161, (B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F)
13

288 h de tratamento microbiológico com a levedura S. cerevisiae com e sem


pré-tratamento eletroquímico .............................................................................. 106

Figura 19 – Valores da área integrada do pico em 3,42 min para cada


tratamento de degradação testado ..................................................................... 107

Figura 20 – Resultados de crescimento radicular (cm) das plântulas de L.


sativa, após exposição às soluções provenientes dos tratamentos de
descoloração, microbiológicos e eletroquímico/microbiológicos do corante Acid
Blue 161 .............................................................................................................. 109

Figura 21 – Inibição de crescimento radicular e concentração de Acid Blue 161


remanescente, após tratamentos de degradação. (A) A. terreus e A.
terreus/argila; (B) eletroquímico/A. terreus e eletroquímico/A. terreus/argila; (C)
S. cerevisiae e S. cerevisiae/argila; (D) eletroquímico/S. cerevisiae e
eletroquímico/S. cerevisiae/argila ........................................................................ 116

Figura 22 – Cromatogramas HPLC-UV Acid Blue 161, após 288 h de


tratamentos de descoloração (A) A. terreus, (B) Eletroquímico/A. terreus, (C) S.
cerevisiae, (D) Eletroquímico/S. cerevisiae antes e após tratamento adsortivo
com argila branca imobilizada em alginato .......................................................... 119

Figura 23 – Área integrada do pico em 3,42 min, após 288 h de tratamento de


descoloração (A) A. terreus, (B) Eletroquímico/A. terreus, (C) S. cerevisiae, (D)
Eletroquímico/S. cerevisiae antes e após tratamento adsortivo com argila
branca imobilizada em alginato ........................................................................... 120

Figura 24 – Dados de descoloração corante Procion Red MX-5B. (A)


tratamento microbiológico; (B) absorbância relativa tratamento microbiológico;
(C) tratamento eletroquímico/microbiológico (D) absorbância relativa
tratamento eletroquímico/microbiológico ............................................................. 121

Figura 25 – Pellets miceliais do fungo A. terreus após interação com o corante


Procion Red MX-5B ............................................................................................. 123

Figura 26 – Espectros de FTIR da (A) controle do corante Procion Red MX-5B,


(B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h
de tratamento A. terreus e eletroquímico/A. terreus ............................................. 124
14

Figura 27 – Espectros de FTIR da (A) controle do corante Procion Red MX-5B,


(B) após 1 h de tratamento eletroquímico, e (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288
h de tratamento S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae ................................ 127

Figura 28 – Cromatogramas de HPLC-Vis das soluções de Procion Red MX-


5B antes e após os tratamentos (A) microbiológico com A. terreus e (B)
eletroquímico/A. terreus ...................................................................................... 129

Figura 29 – Cromatogramas de HPLC-Vis das soluções de Procion Red MX-


5B antes e após os tratamentos (A) microbiológico com S. cerevisiae e (B)
eletroquímico/ S. cerevisiae ................................................................................. 130

Figura 30 – Cromatogramas de HPLC-UV da (A) solução controle Procion Red


MX-5B, (B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F)
288 h de tratamento A. terreus e eletroquímico/A. terreus ................................... 132

Figura 31 – Valores da área integrada dos picos em (A) 4,12, (B) 4,47 e (C)
5,61 min para cada tratamento de degradação testado no sistema com o fungo
A. terreus eletroquímico/A. terreus ...................................................................... 133

Figura 32 – Cromatogramas de HPLC-UV da (A) solução controle Procion Red


MX-5B, (B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F)
288 h de tratamento S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae ......................... 134

Figura 33 – Valores da área integrada do pico em 3,82 min para cada


tratamento de degradação testado no sistema com a levedura S. cerevisiae e
eletroquímico/ S. cerevisiae ................................................................................. 135

Figura 34 – Resultados de crescimento radicular (cm) das plântulas de L.


sativa, após exposição as soluções provenientes dos tratamentos de
descoloração, microbiológicos e eletroquímico/microbiológicos do corante
Procion Red MX-5B............................................................................................. 137

Figura 35 – Inibição de crescimento radicular e concentração de Procion Red


MX-5B remanescente após tratamentos de degradação. (A) A. terreus e A.
terreus/argila; (B) eletroquímico/A. terreus e eletroquímico/A. terreus/argila; (C)
S. cerevisiae e S. cerevisiae/argila; (B) eletroquímico/S. cerevisiae e
eletroquímico/S. cerevisiae/argila ........................................................................ 143
15

Figura 36 – Cromatogramas Procion Red MX-5B, após 288 h de tratamentos


de descoloração (A) A. terreus; 4,47 min, (B) Eletroquímico/A. terreus; 4,47 min,
(C) S. cerevisiae; 3,82 min, (D) Eletroquímico/S. cerevisiae; 3,82 min antes e
após tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato ................ 146

Figura 37 – Área integrada dos picos em 3,82 e 4,47 min, após 288 h de
tratamento de descoloração (A) A. terreus; 4, 47 min, (B) Eletroquímico/A.
terreus; 4,47 min, (C) S. cerevisiae; 3,82 min, (D) Eletroquímico/S. cerevisiae;
3,82 min antes e após tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em
alginato ................................................................................................................ 147

CAPÍTULO III

Figura 1 – Dados de descoloração solução binária. (A) tratamento A. terreus;


(B) taxa de remoção total e de cada corante individualmente – sistema A.
terreus; (C) tratamento eletroquímico/A. terreus (D) taxa de remoção total e de
cada corante individualmente – sistema eletroquímico/ A. terreus ....................... 158

Figura 2 – Dados de descoloração solução binária. (A) tratamento S.


cerevisiae; (B) taxa de remoção total e de cada corante individualmente –
sistema S. cerevisiae; (C) tratamento eletroquímico/ S. cerevisiae (D) taxa de
remoção total e de cada corante individualmente – sistema eletroquímico/ S.
cerevisiae ............................................................................................................ 159

Figura 3 – Pellet A. terreus após exposição a solução binária pelo período de


288 h .................................................................................................................... 161

Figura 4 – Micrografias dos pellets A. terreus antes e após exposição a solução


binária. (1a, 1b, 1c, 1d, 1e e 1f) pellet antes da interação com a solução binária,
aumento de 70 a 5.000 vezes; (2a, 2b, 2c, 2d, 2e e 2f) pellet após interação
com a solução binária, aumento de 70 a 5.000 vezes .......................................... 162

Figura 5 – Espectros de FTIR da (A) controle da solução binária, (B) após 1 h


de tratamento eletroquímico, e (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento A. terreus e eletroquímico/A. terreus .................................................. 165
16

Figura 6 – Espectros de FTIR da (A) controle da solução binária, (B) após 1 h


de tratamento eletroquímico, e (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento S. cerevisiae e eletroquímico/ S. cerevisiae ...................................... 166

Figura 7 – Espectro de absorção dos corantes Acid Blue 161 e Procion Red
MX-5B ................................................................................................................. 168

Figura 8 – Cromatogramas das soluções dos corantes (A) Acid Blue 161 e
Procion Red MX-5B em solução simples e (B) Solução Binária ........................... 169

Figura 9 – Cromatogramas solução binária após tratamento (A) A. terreus e (B)


eletroquímico/A. terreus ...................................................................................... 170

Figura 10 – Cromatogramas solução binária após tratamento (A) S. cerevisiae


e (B) eletroquímico/ S. cerevisiae ........................................................................ 171

Figura 11 - Cromatogramas de HPLC-UV da (A) solução binária controle (B)


após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento A. terreus e eletroquímico/A. terreus .................................................. 173

Figura 12 - Cromatogramas de HPLC-UV da (A) solução binária controle (B)


após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae ........................................ 174

Figura 13 – Valores da área integrada do pico em 3,53 min para cada


tratamento de degradação testado ...................................................................... 175

Figura 14 – Cromatogramas solução binária (288 h) em 292 nm (A) A. terreus


(B) Eletroquímico/A. terreus (C) S. cerevisiae (D) Eletroquímico/S. cerevisiae
antes e após tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato ... 176

Figura 15 – Área integrada do pico em 3,53 min após 288 h de tratamento de


descoloração (A) A. terreus, (B) Eletroquímico/A. terreus, (C) S. cerevisiae, (D)
Eletroquímico/S. cerevisiae antes e após tratamento adsortivo com argila
branca imobilizada em alginato ........................................................................... 177

Figura 16 – Resultados de crescimento radicular (cm) das plântulas de L.


sativa, após exposição às soluções binárias compostas pelos corantes Acid
Blue 161 e Procion Red MX-5B, tratadas pelos sistemas microbiológicos e
eletroquímico/microbiológicos.............................................................................. 178
17

Figura 17 – Resultados de crescimento do hipocótilo (cm) das plântulas de L.


sativa, após exposição às soluções binárias compostas pelos corantes Acid
Blue 161 e Procion Red MX-5B, tratadas pelos sistemas microbiológicos e
eletroquímico/microbiológicos.............................................................................. 179

Figura 18 – Resultados de toxicidade para sementes de L. sativa após


tratamento descoloração A. terreus. Valores antes e após tratamento adsortivo
com argila branca imobilizada em alginato de sódio. (A) Inibição de crescimento
radicular e (B) Inibição de crescimento do hipocótilo ........................................... 185

Figura 19 – Resultados de toxicidade para sementes de L. sativa após


tratamento de descoloração eletroquímico/A. terreus. Valores antes e após
tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato de sódio. (A)
Inibição de crescimento radicular e (B) Inibição de crescimento do hipocótilo.... 186

Figura 20 – Resultados de toxicidade para sementes de L. sativa após


tratamento de descoloração S. cerevisiae. Valores antes e após tratamento
adsortivo com argila branca imobilizada em alginato de sódio. (A) Inibição de
crescimento radicular e (B) Inibição de crescimento do hipocótilo
............................................................................................................................. 187

Figura 21 – Resultados de toxicidade para sementes de L. sativa após


tratamento de descoloração eletroquímico/S. cerevisiae. Valores antes e após
tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato de sódio. (A)
Inibição de crescimento radicular e (B) Inibição de crescimento do hipocótilo
............................................................................................................................. 188
18

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 19

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................................. 21

2.1. Indústria têxtil e seus aspectos socioambientais................................... 21

2.2. Corantes sintéticos.................................................................................. 23

2.2.1. Acid Blue 161............................................................................. 24

2.2.2. Procion Red MX-5B.................................................................... 25

2.3. Poluentes emergentes............................................................................ 26

2.3.1. Emprego de micro-organismos no tratamento de corantes........ 27

2.3.2. Emprego de tratamentos eletroquímicos para oxidação de


corantes................................................................................................ 30

2.4. Toxicidade de mutagenicidade de azo corantes..................................... 32

3. OBJETIVOS...................................................................................................... 35

4. CAPÍTULO I – Avaliação da degradação de azo corantes têxteis por meio de


tratamento de oxidação eletroquímica.................................................................. 37

5. CAPÍTULO II – Avaliação da degradação de azo corantes têxteis a partir de


tratamento microbiológico associado a pré-tratamento de oxidação
eletroquímica ........................................................................................................ 74

6. CAPÍTULO III – Avaliação da degradação e mutagenicidade de azo corantes


têxteis por meio de associação de tratamentos de descoloração ....................... 149

REFERÊNCIAS .................................................................................................... 198


19

1 INTRODUÇÃO

Nos últimos anos aumentaram as discussões quanto ao uso e disposição de


substâncias químicas, que podem trazer prejuízos ao meio ambiente e aos
organismos a elas expostos. A maior parte dessas discussões giram em torno dos
recursos naturais, e de sistemas que sejam capazes de minimizar ou extinguir os
impactos negativos causados por essas substâncias.

Diante desse cenário, a indústria têxtil é uma das maiores consumidoras de


água, e de corantes sintéticos que possuem alto potencial de poluição, quando
comparado aos demais setores industriais.

Anualmente, em todo o mundo 280 mil toneladas de corantes têxteis são


descartadas na forma de efluentes industriais. Por exemplo, para colorir 1 kg de
algodão com corantes reativos são necessários 0,6-0,8 kg de cloreto de sódio, 30-60
g de corante e de 70-150 L de água. Sendo que de 20 a 30 % dos corantes utilizados
não se fixam às fibras e são descartados nas águas de lavagem, gerando águas
residuárias com concentração de corante em torno de 200 ppm, alto teor de sal, além
de outras substâncias que auxiliam o processo de tingimento (ARSLAN-ALATON et
al., 2008; SEN et al., 2016).

A preocupação quanto aos efeitos nocivos desses compostos é crescente, já


que os corantes possuem potencial toxicológico em plantas, animais e micro-
20

organismos, sendo desta forma, importante o desenvolvimento de estudos detalhados


que avaliem o seu modo de ação.

Tratamentos de efluentes contendo corantes são difíceis de serem executados,


pois essas substâncias são altamente complexas e resistentes a grande parte dos
sistemas de tratamentos disponíveis. O grande impasse das pesquisas envolvendo
esses compostos, é encontrar um processo que seja economicamente viável e capaz
de realizar a remoção completa dos contaminantes ou pelo menos levar a formação
de compostos biodegradáveis (AQUINO NETO; DE ANDRADE, 2011).

Nesse contexto surge como boas possiblidades para a remoção dessas


substâncias, os tratamentos biológicos de biossorção e biodegradação utilizando
fungos, leveduras e bactérias, e os processos oxidativos avançados, onde pode-se
encontrar por exemplo, a oxidação eletroquímica, ozonização, fotólise e ozonização
fotolítica.

Quanto aos processos oxidativos avançados, seu alto potencial no tratamento


de águas contaminadas por poluentes é amplamente conhecido, mas, sabe-se
também que os custos de funcionamento desses sistemas, para realizar a total
oxidação de compostos orgânicos, permanecem relativamente elevados em
comparação aos sistemas biológicos. No entanto, pensando em reduzir o custo
energético e aumentar a eficiência dos processos, a sua utilização como uma etapa
de pré-tratamento, para a melhoria da biodegradabilidade das águas residuais
contendo compostos recalcitrantes, pode ser justificada se em um tratamento
biológico os micro-organismos apresentarem capacidade de degradação dos
intermediários formados após a oxidação das moléculas.

Sendo assim, diante dessa problemática, o presente estudo se propôs a


analisar a degradação dos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B em solução
simples e associados em solução binária. A degradação foi realizada por sistemas
microbiológicos com e sem pré-tratamento de oxidação eletroquímica, utilizando o
fungo filamentoso Aspergillus terreus e a levedura Saccharomyces cerevisiae. As
soluções foram testadas quanto à sua toxicidade aguda e mutagenicidade, antes e
após os tratamentos, e os resultados obtidos foram divididos em capítulos que serão
discutidos a seguir.
21

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Indústria têxtil e seus aspectos socioambientais

A indústria têxtil está presente em qualquer país devido principalmente a


necessidade humana de vestuário. Tem significado social, cultural, econômico e
político, a ponto de influenciar costumes e tendências no modo de vida, em diferentes
épocas, nas mais diversas sociedades (FUJITA; JORENTE, 2015).

No Brasil a indústria têxtil é uma atividade tradicional, considerada fator


fundamental na estratégia de desenvolvimento da política industrial brasileira, pelo
fato de gerar muitos empregos, ter grande volume de produção e exportações
crescentes. Foi a partir desse segmento que o país iniciou seu processo de
industrialização, sendo que dentro do cenário brasileiro as indústrias têxteis são, na
sua maioria, de pequeno e médio porte, embora 80-90 % do faturamento e a maior
parte da produção sejam provenientes das indústrias de grande porte (LEÃO et al.,
2002; FUJITA; JORENTE, 2015).

Esse setor é o segundo maior empregador da indústria de transformação no


Brasil, ficando atrás somente do setor de alimentos e bebidas. No início de 2016 foram
contabilizados 1,7 milhão de empregados diretos (ABIT, 2016), em sua grande maioria
22

mulheres, que trabalham na confecção de vestuários. Esses dados evidenciam o


grande valor social dessas indústrias e sua importância na economia do país.

Embora possua muitos aspectos benéficos, esse setor está diretamente


relacionado à poluição ambiental dos corpos aquáticos. O fato da maioria das
empresas serem de pequeno e médio porte, dificulta a implantação de sistemas de
tratamentos de efluentes eficientes, pois os mesmos precisam de uma área de
implementação relativamente grande, além de possuírem alto custo de instalação.
Portanto, a falta de estruturas adequadas para tratar esses efluentes, aliada a
reduzida fiscalização dos órgãos ambientais responsáveis, resultam no descarte
incorreto desses efluentes, que são altamente poluidores e possuem como principal
característica alta coloração e alcalinidade, além de conter elevada carga orgânica e
compostos químicos tóxicos ao homem e ao ambiente.

As soluções empregadas nos banhos de tingimento dos tecidos não podem ser
recicladas, pois perdem a eficiência de coloração após seu uso. Devido a isso a
produção de águas residuárias nas indústrias têxteis é constante durante todo o
processo produtivo.

A presença de corantes em ambientes aquáticos impede a penetração da luz


solar nas camadas de água mais profundas, perturbando a atividade fotossintética do
meio, resultando em deterioração da qualidade dessa água, diminuindo a solubilidade
de oxigênio, provocando efeitos tóxicos sobre a fauna e a flora aquática
(LALNUNHLIMI; KRISHNASWAMY, 2016). Esses efluentes contêm considerável
concentração de sólidos suspensos, e substâncias com baixa taxa de
biodegradabilidade como aditivos, detergentes, surfactantes e os corantes sintéticos
(PHUGARE et al., 2011; HASANBEIGI; PRICE, 2015).

2.2 Corantes sintéticos

Corante é qualquer substância que quando aplicada a algum tipo de substrato


é capaz de lhe conferir cor. Eles podem ser retidos a esse material, por adsorção,
retenção mecânica, por ligações químicas iônicas ou covalentes (ABIQUIM, 2017;
COLOUR INDEX, 2017).
23

Após a síntese do primeiro corante sintético, a Malveína, em 1856, estima-se


que entre 65 e 70 % de todos os corantes utilizados industrialmente sejam sintéticos
(ZHANG et al., 2016).

O sistema Colour Index (2017) possui registro de aproximadamente 13.000


corantes sintéticos que são produzidos industrialmente. Sendo que de 20 a 50 %
desses corantes estão disponíveis para o segmento têxtil (GUARATINI; ZANONI, 2000;
MURUGESAN et al., 2007; COLOUR INDEX, 2017).

Os corantes sintéticos apresentam potencial de acumulação, podendo ser


transportados para estações de tratamento de águas municipais, contribuindo para a
contaminação de mananciais e da água que é distribuída a população (GUARATINI;
ZANONI, 2000).

A família dos azo corantes correspondem ao maior e mais diversificado grupo,


representando aproximadamente 70 % de todo corante sintético que é produzido
mundialmente, sendo que essa alta produção deve-se ao fato deles serem
amplamente consumidos nos processos de tingimento de produtos têxteis,
alimentícios, papel e cosméticos. São compostos aromáticos complexos, com
estrutura molecular do tipo Ar1-N=N-Ar2, preparados pelo acoplamento entre um
composto de diazônio e uma anilina, fenol ou outro composto aromático (ZOOROB;
CARUSO, 1997; FRANCISCON et al., 2010).

Possuem grande diversidade estrutural, que sempre os proporcionam elevado


grau de estabilidade química, biológica, fotocatalítica, resistência à ação do tempo,
exposição à luz solar, micro-organismos, água e sabão. Todas essas características os
tornam resistentes a degradação, o que dificulta os processos de tratamento de águas
residuárias que contenham azo corantes (BAÊTA, 2015; BRILLAS; MARTÍNEZ-
HUITLE, 2015; IMRAN et al., 2016).

A maioria dos azo corantes sintéticos liberados no ambiente, incluindo os


produtos de sua degradação, são cancerígenos e/ou mutagênicos para os seres
humanos, a fauna e a flora dos ambientes nos quais eles são descartados (CHEQUER
et al., 2015; BRÜSCHWEILER; MERLOT, 2017; VACCHI et al., 2017).

De acordo com dados disponibilizados pela ABIQUIM (2017), entre os anos de


2006 e 2011, o Brasil teve aumento de 500 milhões de dólares em importações de
corantes, pigmentos e branqueadores ópticos, enquanto as exportações tiveram
24

aumento de 80 milhões de dólares. Observando a Figura 1, é possível visualizar que


o Brasil consome grande quantidade dessas substâncias e, se a disposição desses
resíduos continuarem a ocorrer de forma incorreta, os impactos causados ao meio
ambiente serão extremamente nocivos, devido à alta recalcitrância desses
compostos.

Figura 1 – Importações e exportações de corantes, pigmentos e branqueadores


ópticos no Brasil.

1000
Importações
Exportações
800
Milhões de dólares

600

400

200

0
2006 2007 2008 2009 2010 2011
Anos

Fonte: Abiquim, 2017.

2.2.1 Acid Blue 161

O azo corante têxtil Acid Blue 161, também conhecido como Acid Blue 193 (C.I.
15076; CAS 12392-64-2), apresenta a fórmula C20H13N2O6SNaCrx e peso molecular
de 416,39 g mol-1. A estrutura molecular do corante está representada na Figura 2.
25

Figura 2 – Estrutura molecular do azo corante têxtil Acid Blue 161.

Fonte: Sigma-Aldrich.

Acid Blue 161 pertence ao grupo dos corantes ácidos, que é um importante
grupo de corantes aniônicos que fornecem uma ampla faixa de coloração, boa fixação,
e possuem em sua estrutura molecular de um a três grupos sulfônicos. Estes grupos
substituintes ionizáveis tornam o corante solúvel em água e têm extrema importância
no método de aplicação em fibras proteicas (lã, seda) e poliamida sintética. No
processo de tingimento, o corante se liga às fibras através de uma troca iônica
envolvendo o par de elétrons livres dos grupos amino e carboxilato das fibras
proteicas, na forma não-protonada (GUARATINI; ZANONI, 2000).

2.2.2 Procion Red MX-5B

Procion Red MX-5B é um corante azóico, que pode também ser denominado
de Reactive Red 2 (CAS 17804-49-8) apresenta a fórmula C19H10Cl2N6Na2O7S2 e peso
molecular de 615,34 g mol-1. Na Figura 3 é possível observar sua estrutura molecular.
26

Figura 3 – Estrutura molecular do azo corante têxtil Procion Red MX-5B.

Fonte: Sigma-Aldrich.

Os corantes do tipo procion, pertencem ao grupo dos corantes reativos, são


solúveis em água e compõem o maior grupo de corantes utilizados no Brasil. Eles são
utilizados no tingimento de fibras celulósicas como algodão e linho, e a interação entre
a molécula do corante e a fibra têxtil se dá através de interações de Van der Waals
(GUARATINI; ZANONI, 2000). As moléculas desses corantes possuem grupos
funcionais específicos que podem sofrer reações de adição ou substituição com os
grupos -SH, -OH e -NH2 presentes nas fibras têxteis (HUNGER, 2003).

Por serem altamente solúveis em água, estima-se que de 10-20 % desses


corantes permaneçam na água residuária gerada durante o seu processo de
produção. Quanto aos processos de tingimento de tecidos, estima-se que
aproximadamente 50 % dos corantes reativos utilizados possam ser perdidos para o
efluente, devido a não fixação as fibras e aos processos de lavagem após a etapa de
tingimento (ZUBIETA et al., 2008).

2.3 Poluentes emergentes

Quando a preservação do meio ambiente torna-se uma questão de grande


preocupação social e uma legislação mais rigorosa está sendo imposta para o
descarte de efluentes, são necessários sistemas de tratamentos mais eficazes para
27

lidar com os poluentes não biodegradáveis e tóxicos. Os corantes sintéticos presentes


nos efluentes têxteis não podem ser removidos por tratamentos de águas residuárias
convencionais e, consequentemente, surge um desafio, que é o desenvolvimento de
tecnologias mais sustentáveis, com capacidade para mineralizar completamente
esses compostos (BRILLAS; MARTÍNEZ-HUITLE, 2015).

Os corantes sintéticos se enquadram na categoria de poluentes emergentes,


definidos como qualquer substância química que não foi incluída em programas de
monitoramento, nem em legislação pertinente a qualidade ambiental, mas estão
constantemente sendo introduzidas no meio ambiente por atividades antrópicas
(HORVAT et al., 2012; LUNA et al., 2014).

Nas últimas décadas, vários métodos físico-químicos têm sido desenvolvidos


para a remoção de corantes em efluentes têxteis, mas esses métodos não são
adequados, devido à formação de lodo tóxico e compostos secundários como, por
exemplo, as aminas aromáticas (GOVINDWAR et al., 2014).

Vários métodos de tratamento têm como objetivo a degradação de


contaminantes orgânicos ou pelo menos realizar sua oxidação a compostos menos
tóxicos. A escolha da metodologia envolve fatores relacionados principalmente ao
custo e eficiência, visto que cada método oferece suas vantagens, bem como suas
limitações (AQUINO NETO; DE ANDRADE, 2011).

2.3.1 Emprego de micro-organismos no tratamento de corantes

A maioria dos corantes são difíceis de tratar por métodos convencionais de


tratamento de águas residuárias, sendo que as técnicas biológicas utilizadas para
remoção da coloração dessas águas são mais eficientes quando comparados aos
métodos físicos e químicos, pois são mais viáveis economicamente, possuem
eficiência mais elevada e geram menos poluição secundária (GAJERA et al., 2015).

A aplicação de micro-organismos na degradação de corantes é mais simples e


promissora em comparação a outros organismos. No processo de biodegradação, à
descoloração inicial ocorre por meio da clivagem redutora das azo ligações, presente
nas moléculas dos corantes (IMRAN et al. 2016; TAN et al. 2016), e encontrar micro-
28

organismos que sejam eficazes para realizar esse processo é o desafio da maioria
das pesquisas atuais.

O processo bacteriano de degradação de corantes geralmente é iniciado a


partir de enzimas envolvidas na clivagem das azo ligações com a ajuda de uma
azoredutase e um doador de elétrons. Os subprodutos formados como aminas
aromáticas podem ser posteriormente degradados por hidroxilases e oxigenases.
Entretanto, muitos outros subprodutos resultantes do processo de degradação, tais
como ácidos sulfônicos, aminobenzenos sulfônicos também são recalcitrantes ao
ataque bacteriano, restringindo assim o tratamento de alguns corantes por esses
sistemas (DAVIES et al., 2006; PANDEY et al., 2007; TAN et al., 2016).

Em contrapartida, os fungos podem efetivamente degradar ou mesmo


mineralizar vários compostos orgânicos recalcitrantes, devido ao seu sistema de
enzimas lignolíticas extracelulares que apresentam baixa especificidade ao substrato
(SAROJ et al., 2014; CHEN; TING, 2015). Entre todos os micro-organismos utilizados
na biodegradação de corantes, os fungos filamentosos são amplamente estudados.
Eles estão presentes de forma abundante no meio ambiente e são capazes de adaptar
rapidamente seu metabolismo a diferentes fontes de carbono e nitrogênio, na busca
pela sua sobrevivência (SOLÍS et al., 2012).

Os fungos têm papel crucial no funcionamento do ecossistema, pois são os


responsáveis pela ciclagem dos nutrientes. A lignocelulose da parede celular das
plantas possui três componentes principais: celulose, hemicelulose e lignina. Na
parede celular, as fibrilas de celulose são revestidas por matrizes reticuladas de
hemicelulose, que por sua vez estão covalentemente ligadas a lignina. A lignina possui
característica hidrofóbica que protege as paredes celulares de umidade e degradação
microbiana. A complexidade estrutural desses componentes os tornam altamente
recalcitrantes e resistentes à degradação. Entretanto, diferentes gêneros de fungos
possuem complexos enzimáticos lignocelulolíticos capazes de realizar a degradação
desses materiais e, assim, realizar a ciclagem dos nutrientes na natureza (KÜES,
2015).

Esse mesmo complexo enzimático está relacionado à capacidade desses


micro-organismos degradarem compostos poluentes persistentes, visto que
estruturalmente eles são muito parecidos com os compostos encontrados na
29

lignocelulose. Outras enzimas como lacase, manganês peroxidase, fenoloxidases,


também estão envolvidas nos processos de degradação desses compostos
(MAHMOUD et al., 2017).

Chakraborty et al. (2013), em estudo de remoção do corante Congo Red pelo


fungo filamentoso Alternaria alternata, obtiveram ao final de 48 h de tratamento
completa descoloração de uma solução com concentração de corante inicial igual a
600 mg L-1. A estirpe utilizada mostrou ser uma excelente candidata para remoção de
azo corantes presente em solução. Análises de HPLC-UV/Vis e FTIR sugeriram aos
pesquisadores que a remoção do corante pelo fungo foi realizada por processos de
adsorção à biomassa microbiana e por biodegradação. Análises de estabilidade
térmica também foram realizadas indicando que o fungo pode reter o corante
adsorvido, mesmo em altas temperaturas e tratamentos ácidos/alcalinos.

O gênero Aspergillus sp é amplamente estudado, sendo encontrado na


literatura diversos artigos relacionados à biodegradação de corantes com esse fungo.
Kumar et al. (2012) relataram a degradação do corante Brillant Green por Aspergillus
sp estirpe CB-TKL-1, indicando grande versatilidade metabólica desses fungos para
degradar e descolorir as soluções contendo corante. O fungo removeu 90 % da
concentração inicial de corante em 15 dias de tratamento. Os intermediários de
desmetilação formados durante o processo de degradação, forneceu fortes evidências
de que o corante ao final do tratamento realmente foi mineralizado. Em contrapartida,
levando em consideração a potencialidade toxicológica desses compostos, testes de
toxicidade aguda poderiam ter sido realizados no início e ao final do tratamento, a fim
de se confirmar a real eficiência do tratamento microbiológico.

Jin e Ning (2013) testaram o fungo Aspergillus fumigatus na forma peletizada,


obtendo sucesso na degradação de diferentes corantes sintéticos. Os autores
relacionaram a capacidade de descoloração e degradação dos corantes a enzima
lacase, em tratamentos que duraram 12 h. Os autores reforçaram as vantagens do
processo microbiológico na biorremediação de ambientes contaminados, tais como,
baixo custo, rápida degradação, manuseio simples, o que facilitaria a aplicação desse
tipo de tratamento de águas residuárias proveniente de operações de tingimento e
estampagem de tecidos.
30

Leveduras como a Saccharomyces cerevisiae também são utilizadas em


processos de biorremediação de metais pesados como manganês (FADEL et al.,
2017), chumbo (XIN et al., 2017) e cobre (AMIRNIA et al., 2015), principalmente a
partir de tratamentos de biossorção, devido ao seu baixo custo e alta eficiência.
Pesquisas envolvendo a degradação de corantes por S. cerevisiae ainda não foram
extensivamente estudadas, mas essa levedura é um micro-organismo promissor
nesse tipo de tratamento, devido a complexa cadeia enzimática que possuem,
crescimento rápido e capacidade de sobreviver em ambientes desfavoráveis.

2.3.2 Emprego de tratamentos eletroquímicos para oxidação de corantes

O crescente volume de águas residuais, contendo poluentes não


biodegradáveis descartados nos ambientes aquáticos diariamente, exige a busca pelo
desenvolvimento de novas tecnologias de descontaminação, que sejam limpas e
seguras. Nesse contexto os processos oxidativos podem ser utilizados no tratamento
dessas águas residuárias (MALDONADO et al., 2007).

Como exemplo de poluente, há os azo corantes, que não são completamente


removidos por tratamentos biológicos convencionais. Processos baseados na
biodegradação aeróbia, como lodos ativados e consórcios bacterianos promovem
reações de redução nessas moléculas, mas são incapazes de levá-los a
mineralização (ROBINSON et al., 2001). Enquanto os processos oxidativos têm
elevado potencial para degradar, seja parcialmente ou totalmente esses corantes.

Embora existam diferentes sistemas de reação para os processos oxidativos,


todos eles são caracterizados pela produção de radicais hidroxila (•OH), que é um
forte agente oxidante não seletivo, com capacidade para mineralizar praticamente
qualquer molécula orgânica, produzindo CO2, H2O e íons inorgânicos não tóxicos ou
com baixa potencialidade toxicológica (RAMÍREZ et al., 2013). Dentre os diferentes
tipos de tratamentos oxidativos, encontram-se a oxidação eletroquímica, que é uma
tecnologia emergente para o tratamento de águas residuárias contendo corantes
(JAGER et al., 2018).

A utilização de processos eletroquímicos para a degradação de corantes,


apresenta várias vantagens frente aos métodos convencionais de tratamentos, com
31

destaque para, o uso de catalisadores como revestimento dos eletrodos de óxidos, o


que evita problemas de separação dos catalisadores do meio reacional, formação de
várias espécies reativas oxidantes na superfície do eletrodo, e facilidade de operação
e automação (KATHAEE et al., 2014; SALAZAR et al., 2018).

Os eletrodos mais frequentemente utilizados são os de ânodo


dimensionalmente estáveis (ADEs), preparados a partir de uma base metálica
revestida por óxidos de metais nobres, tais como RuO2, SnO2, Co3O4, IrO2, (ARAVIND
et al., 2016). A preparação desses eletrodos normalmente é realizada por
decomposição térmica de seus precursores, dissolvidos em solvente apropriado, que
posteriormente são depositados em um suporte de material inerte, como por exemplo
o titânio. A forte adesão da mistura de óxidos ao suporte metálico é assegurada pela
formação, a partir do Ti metálico, de uma camada de TiO2 durante a calcinação da
mistura precursora (PELEGRINI et al., 2001). A composição mais utilizada é a de
RuO2 e TiO2, que compõem os eletrodos comerciais, onde o rutênio é o agente
catalítico, e o titânio é o responsável por fornecer estabilidade mecânica necessária
para uma boa aderência da mistura (ISARAIN-CHÁVEZ et al., 2017).

Salazar et al. (2018) estudaram a degradação eletroquímica do azo corante


têxtil Disperse Yellow 3, em solução aquosa utilizando diferentes materiais
eletrocatalíticos, diamante dopado com boro, Ti/Ru0,3Ti0,7.O2 e ânodos de Ti/Pt. Os
tratamentos foram realizados aplicando diferentes densidades de corrente (40 e 60
mA cm-2), a 40 ºC, utilizando diferentes tipos de eletrólitos suporte (Na2SO4 50mM e
NaCl 50 mM) e pH variável (2,3, 7, e 10). Os resultados obtidos após os tratamentos
mostraram que para todos os materiais eletrocatalíticos testados, usando Na 2SO4
como eletrólito suporte, a degradação das moléculas do corante ocorreu de forma
mais rápida no início do processo eletroquímico, sendo que o ânodo BDD foi mais
eficiente na remoção de TOC da solução, removendo aproximadamente 90 %. Na
presença de NaCl, a completa mineralização do corante foi alcançada no sistema
Ti/Ru0,3Ti0,7O2, seguido por BDD e Ti/Pt.
32

2.4 Toxicidade e mutagenicidade de azo corantes

Outra questão importante a se discutir é a toxicidade desses efluentes, sendo


que, esse parâmetro é analisado a partir de métodos que avaliam a capacidade de
um agente tóxico, provocar efeitos nocivos sobre os organismos. Nesta análise são
usados bioindicadores dos mais variados grupos de cadeia ecológica, como por
exemplo, o das plantas (MALACHOVA et al., 2013; RAWAT et al., 2016), micro-
organismos (DÁVILA-JIMÉNEZ et al., 2015), microcrustáceos (PUNZI et al., 2015) e
dos peixes (ZHANG et al., 2013; ABE et al., 2018).

No Brasil, assim como em outros países da América Latina, a avaliação da


qualidade de um efluente baseava-se apenas em suas características físico-químicas.
Entretanto, em 2005 foi publicada a Resolução CONAMA nº 357, que estabelece as
condições e padrões para lançamento de efluentes industriais, inclusive quanto ao
potencial para provocar efeitos tóxicos no corpo receptor. Em maio de 2011 a
Resolução nº 430 do CONAMA, altera e complementa a Resolução nº 357,
estabelecendo critérios para a cobrança do atendimento aos parâmetros de toxicidade
pelos órgãos ambientais estaduais. Com isto, estes órgãos já estão exigindo, por meio
de Portarias e Resoluções, que as empresas atendam aos limites de toxicidade
estabelecidos para efluentes (BRASIL, 2005; BRASIL, 2011).

Para facilitar sua implementação é desejável que os testes toxicológicos sejam


rápidos, de baixo custo e de fácil execução. O procedimento para a realização desses
testes implica em diluir sucessivamente o efluente, para simular sua diluição no corpo
receptor, uma vez que ele passará por esse processo após o descarte. Os
organismos-teste são expostos a essas várias diluições por períodos de tempo
específicos e os efeitos analisados, após o período de exposição, podem ser
mortalidade, menor fecundidade, imobilidade, inibição do crescimento, dentre outros
(KLAUCK te al., 2013).

Vegetais superiores são muito utilizados para testar a toxicidade de diferentes


substâncias, sendo que, a Lactuca sativa e Allium cepa são os modelos mais
comumente utilizados avaliar a toxicidade de efluentes urbanos e industriais. Esses
organismos compõem um grupo representativo na detecção de alterações genéticas,
provocadas por poluentes ambientais, sendo reconhecidos como excelentes
33

indicadores de efeitos mutagênicos e toxicidade aguda de ambientes com presença


de substâncias tóxicas (FISKESJÖ, 1985; KASTURY et al., 2015).

Os estudos com esses organismos podem avaliar efeitos tóxicos agudo, como
por exemplo, inibição de germinação das sementes, inibição do crescimento radicular
e do hipocótilo das plântulas. São avaliados também danos causados ao DNA, a partir
de análises de aberrações cromossômicas, utilizadas para detectar genotoxicidade;
distúrbios no ciclo mitótico, que são usados para avaliar a citotoxicidade; e análise de
micronúcleos, para verificar a mutagenicidade dos efluentes (LEME; MARIN-
MORALES, 2009; DELLAMATRICE et al., 2017).

Quanto aos efluentes têxteis, de forma geral, a toxicidade está associada aos
corantes e aos produtos de sua degradação. Os corantes representam grande parte
da carga orgânica total presente nesses efluentes, sendo então importante a
realização de testes de toxicidade como ferramenta adicional para avaliar a eficiência
dos tratamentos de descoloração realizados (PUNZI et al., 2015).

Outro fator preocupante que deve ser analisado é a potencialidade de azo


corantes sintéticos, causarem dano ao material genético, de organismos que vierem
a entrar em contato com essas substâncias e/ou com os subprodutos de sua
degradação. Considerando a grande variedade de azo corantes sintéticos disponíveis
para o segmento têxtil, e que os efeitos mutagênicos dessas substâncias estão
relacionados com a natureza e posição dos radicais substituintes, ligados aos
agrupamentos azo, é de extrema importância realizar avaliação mutagênica e
genotóxica de cada corante individualmente, pois pequenas diferenças ou alterações
na molécula podem alterar de forma significativa as suas propriedades mutagênicas
(VENTURA-CAMARGO; MARIN-MORALES, 2013; CHEQUER et al., 2015; SEN et
al., 2016).

O ensaio mais utilizado para detecção de mutações no DNA, induzidas por


produtos químicos é o proposto por Bruce Ames (AMES et al., 1975; AMES, 1979).
No teste de Ames, também conhecido como ensaio Salmonella/microssoma,
mutações do tipo frameshift (deslocamento do quadro de leitura) ou por substituições
de pares de base do DNA, são detectadas após exposição de estirpes, geneticamente
modificadas para biossíntese da histidina, de Salmonella typhimurium a um agente
químico a ser testado. Quando essas linhagens são expostas ao mutágeno, mutações
34

reversas restauram a capacidade das bactérias de sintetizar a histidina e assim


crescer em um meio deficiente deste aminoácido (IQBAL; NISAR, 2015; GADALETA
et al., 2016).

Chequer et al. (2015) analisaram a mutagenicidade do azo corante Disperse


Red 13 (DR 13) antes e após processo de eletrólise, com potencial controlado para
simular a biotransformação hepática dessas moléculas. Além disso, uma solução de
DR13 foi oxidada utilizando um homogenato de células de fígado de rato. Os produtos
formados após a oxidação/redução do corante foram identificados utilizando técnicas
de cromatografia líquida e cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de
massas. O ensaio Salmonella/microssoma usando as linhas TA98 e YG1041 de
Salmonella typhimurium mostraram atividade mutagênica dos subprodutos formados
após a oxidação das moléculas do corante. Essa atividade mutagênica foi relacionada
a presença de moléculas de 4-nitro-benzamina, 2-cloro-4-nitro-benzamina que são
moléculas amino aromáticas e com alto potencial de toxicidade e/ou mutagenicidade.
35

3 OBJETIVOS

Com base no que foi exposto, o presente estudo teve como objetivo geral
avaliar a degradação dos azo corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B, utilizando
sistemas de tratamento microbiológicos e microbiológicos com pré-tratamento de
oxidação eletroquímica.
Os resultados obtidos foram divididos em 3 capítulos na forma de manuscritos,
sendo eles:

 Capítulo I: Degradação de azo corantes têxteis por meio de tratamento


de oxidação eletroquímica

Esta etapa teve como objetivo, realizar a caracterização do eletrodo de


trabalho, e encontrar as melhores condições para o tratamento de oxidação
eletroquímica dos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B, em solução simples
e binária. Buscou-se encontrar condições brandas de tratamento, pois o intuito do
estudo foi utilizar um método combinado de descoloração, onde a oxidação
eletroquímica foi utilizada como um pré-tratamento das soluções.

 Capítulo II: Avaliação da degradação de azo corantes têxteis a partir de


tratamento microbiológico consorciado a pré-tratamento de oxidação eletroquímica
36

Os objetivos desse capítulo foram testar um tratamento combinado de


degradação dos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B em solução simples,
utilizando pré-tratamento de oxidação eletroquímica associado a tratamentos
microbiológicos com o fungo filamentoso Aspergillus terreus e com a levedura
Saccharomyces cerevisiae. Também foram realizados tratamentos adsortivos com
argila branca imobilizada em alginato, com o intuito de remover metabólitos
intermediários com alto potencial toxicológico gerados após a biotransformação das
moléculas dos corantes. A eficiência dos tratamentos foi testada a partir de testes de
toxicidade aguda com sementes de Lactuca sativa.

 Capítulo III: Degradação e mutagenicidade de azo corantes têxteis por


meio de consórcio de tratamentos de descoloração

Nesta etapa o presente estudo se propôs avaliar a degradação dos corantes


Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B associados em solução binária, pelo fungo
filamentoso A. terreus e pela levedura S. cerevisiae em sistemas com e sem pré-
tratamento de oxidação eletroquímica, associados a testes de adsorção com argila
branca imobilizada em alginato. Também foram realizadas análises de
mutagenicidade por meio do ensaio Salmonella/microssoma (Teste de Ames) e testes
de toxicidade aguda com sementes de L. sativa das soluções testadas, antes e após
os tratamentos de descoloração.
37

4 CAPÍTULO I

Avaliação da degradação de azo corantes têxteis por meio de tratamento de


oxidação eletroquímica

Resumo

Azo corantes são poluentes tóxicos e recalcitrantes. O descarte de águas residuárias


contendo esses compostos em ambientes aquáticos podem, dentre outros fatores,
acarretar na redução da transparência da água, influenciando diretamente no
processo de fotossíntese realizado pelas plantas, levando a um grande desequilíbrio
desses ecossistemas. Devido à preocupação ambiental que gira em torno do descarte
incorreto desses compostos, inúmeras pesquisas vêm sendo realizadas para se
descobrir novos métodos de tratamento ou otimizar os métodos já existentes, e assim
tratar de forma adequada efluentes com alta coloração. Portanto, o presente estudo
teve como objetivo, encontrar as melhores condições para o tratamento de oxidação
eletroquímica dos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B, em solução simples
e sua mistura, chamada de solução binária. As condições de tratamento adotadas
foram as mais brandas possíveis, pois o intuito do estudo foi utilizar um método
combinado de tratamento, onde a oxidação eletroquímica surge como um pré-
38

tratamento das soluções, que posteriormente foram submetidas a tratamentos


microbiológicos. Sendo assim, após os tratamentos de oxidação eletroquímica das
diferentes soluções, foi possível verificar que a velocidade do fluxo do sistema filtro-
prensa influencia diretamente na descoloração e remoção de carbono orgânico total,
sendo que de modo geral o fluxo que apresentou os melhores resultados foi o de 10
mL min-1. Isso infere que um maior tempo de retenção da solução dentro da célula
eletroquímica favorece a degradação e mineralização desses corantes.

1 INTRODUÇÃO

A qualidade das águas e deterioração dos ecossistemas aquáticos é um dos


problemas ambientais mais importantes da atualidade, pois vários compostos
orgânicos tóxicos são detectados em níveis críticos em águas residuais, subterrâneas
e de superfície (AYATI et al., 2016). A maior parte dessa contaminação é proveniente
das atividades industriais, com destaque para a indústria têxtil, que dentre outros
compostos utiliza extensivamente como matéria-prima corantes sintéticos nos
processos de tinturaria e estampagem dos tecidos. Essas indústrias estão
constantemente gerando grandes volumes de efluente que possuem como principais
características elevada coloração e salinidade (VIJAYALAKSHMIDEVI;
MUTHUKUMAR, 2015).

Atualmente, mais de 100.000 diferentes tipos de corantes sintéticos estão


disponíveis comercialmente, sendo que entre 60 e 70 % deles pertencem ao grupo
dos azo corantes, cuja característica é ter na sua molécula uma ou mais azo ligações
(R1-N=N-R2) (QUAN et al., 2015; IMRAN et al., 2016).

Esses corantes possuem moléculas complexas, altamente estáveis e,


consequentemente, de difícil degradação. É reconhecido que as variedades
estruturais dos azo cromóforos são geralmente resistentes à biodegradação aeróbica
pela microbiota natural presente nesses efluentes, e não são fáceis de serem
removidas por tratamentos convencionais (HUANG et al., 2015).

Diferentes tipos de técnicas são utilizadas para remoção de corantes sintéticos


de efluentes têxteis, incluindo coagulação química/precipitação, adsorção física,
39

oxidação química, degradação biológica anaeróbica ou aeróbica e os processos de


oxidação, que são apontados como uma técnica muito promissora para o tratamento
de águas residuais, pois são capazes de oxidar uma ampla gama de compostos
orgânicos recalcitrantes (MEERBERGEN et al., 2017).

O grande impasse na utilização dessa técnica é o alto custo energético. Devido


a isso, sua utilização como um pré-tratamento de compostos orgânicos em processos
combinados tem ganhado destaque, pois acarreta em redução desses custos. A
combinação de métodos de tratamento geralmente aumenta a taxa de degradação
dos compostos orgânicos, elevando assim a chance de sucesso dos tratamentos.

Sendo assim, os objetivos desta etapa do estudo foram realizar a preparação


e caracterização do eletrodo de trabalho, e determinar as melhores condições do
tratamento de oxidação eletroquímica para os corantes Acid Blue 161 e Procion Red
MX-5B em solução simples e binária.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Azo Corantes

Para o desenvolvimento desse estudo foram utilizados os corantes Acid Blue


161 fabricado pela Aldrich Chemical Company, Inc., número CAS 12392-64-2, com
grau de pureza de ~40 %, peso molecular de 416,39 e solúvel em água. E o corante
Procion Red MX-5B fornecido pela I.C.I. Brasil S.A., número CAS 17804-49-8, grau
de pureza de ~40 %, peso molecular de 615,34, também solúvel em água.

2.2 Preparo dos eletrodos

O eletrodo de trabalho utilizado nos tratamentos de oxidação eletroquímica é


composto por ânodos dimensionalmente estáveis e foi preparado pelo método de
decomposição térmica (SONI et al., 2017). Ele é constituído por uma placa de titânio
metálica, que foi recoberta com uma mistura de óxidos de rutênio e titânio,
40

respectivamente na proporção de 30 e 70 %. Foram preparados também eletrodos


com áreas definidas de 1 cm2, com a mesma composição nominal testada, que foram
utilizados na determinação da área eletroquimicamente ativa do eletrodo de trabalho.
Os suportes metálicos utilizados na preparação dos eletrodos estão esquematizados
na Figura 1.

Figura 1 – Suportes de titânio metálico utilizados na preparação dos eletrodos (A)


caracterização do eletrodo (B) eletrodo de trabalho.

Fonte: COTEIRO, 2006.

2.2.1 Pré-tratamento dos suportes metálicos

Antes da deposição dos óxidos metálicos, os eletrodos foram tratados para


eliminar impurezas que viessem a prejudicar a deposição dos óxidos. Esse pré-
tratamento foi constituído pelas seguintes etapas:

a) Jateamento com areia, para aumentar a rugosidade do suporte de titânio e


possibilitar maior aderência do filme de óxido de rutênio e titânio;
b) Imersão em água deionizada em ebulição durante 30 min, para eliminar as
impurezas presente na placa de titânio metálico;
c) Ultrassonicação em isopropanol (CH3CHOHCH3 – J. T. Baker) durante 30 min,
para eliminação das impurezas orgânicas;
d) Imersão em solução de HCl (Vetec) 20 % (v) em ebulição por 5 min, para
remover resquícios de ferro proveniente da etapa de jateamento;
41

e) Imersão em solução de ácido oxálico (H2C2O4 – Synth) 10 % (m) em ebulição


por 20 min, para remover a camada de TiO2 que se forma sobre o titânio
metálico.

2.2.2 Deposição dos óxidos metálicos

A deposição dos óxidos metálicos na superfície dos eletrodos, foi realizada a


partir das resinas precursoras de óxido de rutênio e óxido de titânio. O cálculo da
massa de cada um dos óxidos metálicos depositados sobre o suporte de titânio foi
realizado a partir da Equação 1 a fim de se obter um filme com espessura de 2 µm.

𝑚 = 𝑒 𝑥 𝐴 𝑥 ∑𝑛𝑖=1(𝑋𝑖 𝑥 𝜌𝑖) Eq. 01

onde, m é a massa de óxido a ser depositada, e é a espessura do filme, A é a


estimativa da área do suporte metálico, Xi é a fração molar do óxido i, ρ é a densidade
do óxido i, n é o número de óxidos constituintes.

Após os cálculos foi preparada a mistura das resinas precursoras nas


proporções necessárias para obtenção dos óxidos de titânio e rutênio na proporção
de 70 e 30 %.

A deposição da mistura precursora foi realizada de acordo com o esquema


representado na Figura 2.
42

Figura 2 – Esquema representando as etapas de deposição dos óxidos metálicos no


suporte de titânio, durante a preparação dos eletrodos.

Fonte: COTEIRO, 2006.

Cada uma das etapas tem significado importante na deposição dos óxidos,
sendo que no período em que o eletrodo permanece na estufa ocorre polimerização
da mistura precursora na superfície do suporte metálico, enquanto que na mufla
ocorre a calcinação dos eletrodos. Essas etapas foram repetidas diversas vezes para
cada um dos eletrodos até a obtenção da massa de óxidos desejada.

O eletrodo utilizado para a caracterização do eletrodo de trabalho foi


confeccionado de acordo com a Figura 3.

Figura 3 – Configuração do eletrodo utilizado para a caracterização do eletrodo de


trabalho.

Fonte: COTEIRO, 2006.

Para o preparo desse eletrodo, a haste do suporte metálico foi lixada, para
remover a camada de óxido de titânio formada durante a etapa de calcinação. O
contato elétrico foi estabelecido por meio de uma solda de ponta, de um fio de cobre
fino em torno da haste do suporte metálico. Do lado oposto, soldou-se com estanho
43

um fio de cobre de espessura grossa, que também foi lixado para facilitar o contato
elétrico do eletrodo com o potenciostato. Feito isso, o eletrodo foi transferido para um
tubo de vidro e vedado em ambas as extremidades com cola de silicone.

2.3 Testes de toxicidade aguda do eletrólito suporte utilizando Lactuca sativa

Antes do início das eletrólises, foi realizado teste de toxicidade aguda com o
eletrólito suporte sulfato de sódio (Na2SO4) a fim de se determinar uma concentração
do eletrólito que não causasse prejuízos ao desenvolvimento das plântulas de Lactuca
sativa, impedindo assim que sua presença interferisse nos resultados das análises de
toxicidade, realizadas após os tratamentos de oxidação eletroquímica e biológicos.

A metodologia utilizada foi baseada em Sobrero e Ronco (2008), sendo


conduzida em placas de Petri e em triplicata, para cada concentração testada. As
placas foram preparadas com papel de filtro, onde foi adicionado 20 sementes e 3 mL
de solução. As concentrações de eletrólito suporte testadas foram iguais a 0,01, 0,02,
0,03, 0,04, 0,05 e 0,1 mol L-1. Após o preparo as placas foram envoltas individualmente
em filme plástico, para evitar a evaporação da água e acondicionadas em câmara
climática BOD a 21 ± 1 ºC ao abrigo de luz, por 120 h. O teste controle positivo foi
realizado com solução de ZnSO4 a 0,05 N e o controle negativo com água destilada.
Ao final do período de exposição, foram tomadas as medidas radiculares das
plântulas. Foram consideradas, para efeito de medida, as sementes que
apresentaram crescimento radicular maior ou igual a 2 mm. O cálculo de inibição de
crescimento radicular foi realizado segundo a Equação 2 descrita abaixo:

(𝑐𝑟𝑒𝑠𝑐𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 − 𝑐𝑟𝑒𝑠𝑐𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)


%IC = 𝑥 100 Eq. 2
(𝑐𝑟𝑒𝑠𝑐𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜)
44

2.4 Caracterização dos eletrodos

A caracterização do eletrodo de trabalho foi realizada pela técnica de


voltametria cíclica, que permitiu calcular a área eletroquimicamente ativa e verificar a
sua estabilidade.

2.4.1 Voltametria cíclica

Para verificar a estabilidade dos eletrodos, foi empregado o método de


voltametria cíclica. O potenciostato/galvanostato utilizado no estudo foi um Eco
Chemie modelo AUTOLAB PGSTAT30. Devido ao tamanho do eletrodo de trabalho,
as eletrólises foram realizadas em um béquer de vidro com capacidade para 500 mL,
contendo 300 mL de solução de eletrólito suporte Na2SO4 e dois eletrodos auxiliares
de fio de platina. Foram registrados 50 ciclos, com velocidade de varredura igual a 50
mV s-1, eletrólito suporte com concentração igual a 0,02 mol L-1 e intervalo de potencial
entre +0,2 até 1,1 V.

Essa mesma condição de estudo foi empregada na realização de voltametrias


cíclicas das soluções contendo os corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B na
concentração de 100 mg L-1, e o eletrólito suporte Na2SO4 na concentração de 0,02
mol L-1, a fim de verificar transições redox ou modificação do sistema de interação
entre o eletrodo e os corantes testados.

2.4.2 Determinação da área eletroquimicamente ativa do eletrodo

O cálculo da área eletroquimicamente ativa do eletrodo de trabalho foi realizado


a partir de comparações sobre as cargas efetivas do eletrodo com área conhecida de
1 cm2 e o eletrodo de trabalho. A correlação entre as cargas anódicas e catódicas dos
voltamogramas cíclicos, referentes aos dois eletrodos, permitiu a determinação da
área eletroquimicamente ativa do eletrodo de trabalho (COTEIRO; ANDRADE, 2007).
45

2.4.3 Morfologia e composição

A caracterização morfológica da superfície do eletrodo de trabalho, sua


microestrutura e composição do filme de óxido depositado foram determinadas a partir
das técnicas de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia
dispersiva de raios X (EDX) em microscópio Leica-Zeiss modelo LEO TEM acoplado
a um detector modelo Oxford 7060. Nas análises de MEV o aumento foi de 300 vezes.

2.5 Eletrólises

Para a realização das eletrólises, utilizou-se uma célula tipo filtro prensa. A
configuração da célula pode ser visualizada na Figura 4.

A célula é composta por dois eletrodos, o auxiliar de aço inoxidável e o de


trabalho. A estrutura externa é constituída por duas placas de titânio e duas de Teflon®
e a estrutura interna por materiais de borracha, para garantir a vedação adequada do
sistema. Os espaçadores de borracha e Teflon® foram utilizados para aumentar o
volume de solução que flui entre os eletrodos e também para impedir o contato elétrico
entre eles. A placa de Teflon® contém duas aberturas que permitem a entrada e a
saída das soluções testadas. O sistema montado para a realização das eletrólises
pode ser visualizado na Figura 5.
46

Figura 4 – Configuração da célula eletroquímica utilizada nas eletrólises, composta


por (A) placas metálicas de titânio; (B) Placas de Teflon®; (C) borrachas de
vedação; (D) eletrodo auxiliar de aço inoxidável; (E) espaçadores de borracha; (F)
espaçador de Teflon®; (G) eletrodo de trabalho.

Fonte: COTEIRO, 2006.

Figura 5 – Sistema utilizado para a realização das eletrólises. (A) célula filtro prensa,
(B) bomba peristáltica, (C) solução a ser tratada e (D) reservatório composto por
tubos de quartzo.

Fonte: elaborado pela autora.

O reservatório composto por tubos de quartzo com capacidade para 140 mL,
foi acoplado a uma estrutura móvel, na presença de um espelho. Esse sistema foi
47

desenvolvido para que em trabalhos futuros ele pudesse ser utilizado em tratamentos
de descoloração de soluções de corantes fotoeletroquímicos e fotoeletroquímicos
solares.

Inicialmente as soluções tratadas foram mantidas em fluxo constante de 25 mL


min-1 saindo do frasco Erlenmeyer, passando pelo sistema de tubos de quartzo e em
seguida pela célula filtro-prensa. O volume inicial de solução a ser tratada foi igual a
150 mL, com concentração de eletrólito suporte Na2SO4 igual a 0,02 mol L-1.

Os corantes foram testados em solução simples e solução binária. As soluções


simples do corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B foram preparadas a partir da
dissolução de 0,1 g de pó de corante dissolvido em 1000 mL de água destilada, para
obtenção de uma solução na concentração de 100 mg L-1. Enquanto a solução binária
foi preparada pela dissolução de 0,1 g de pó de cada um dos corantes, dissolvido em
1000 mL, obtendo-se uma solução com concentração final de 200 mg L -1.

As eletrólises foram realizadas sob corrente constante de 50 mA cm-2, durante


4 h. A cada 1 h foram retiradas alíquotas de 5 mL para a realização de análises de
espectrofotometria UV-Vis e carbono orgânico total (COT).

2.5.1 Variação de fluxo

Para verificar se a velocidade com que a solução passa dentro da célula,


interfere no processo de degradação das moléculas dos corantes, foram realizadas
eletrólises variando o fluxo, nas mesmas condições citadas no item 2.5. Esse teste foi
realizado com o corante Acid Blue 161.

2.5.2 Análises de espectrofotometria UV-Vis

As análises UV-Vis foram realizadas em espectrofotômetro Shimadzu


Ultravioleta – Visível (UV-Vis) modelo 2401PC e permitiram determinar a
concentração de corante remanescente nas soluções durante o tratamento
eletroquímico, a partir da variação de absorbância no λ máximo de cada um dos
48

corantes. Também foi possível determinar a porcentagem de descoloração


(ALMEIDA; CORSO, 2014) das soluções a partir da Equação 3.

(𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙)


% 𝐷𝑒𝑠𝑐𝑜𝑙𝑜𝑟𝑎çã𝑜 = 𝑋 100 Eq. 3
(𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙)

As curvas de calibração foram determinadas a partir de varreduras espectrais


de cada uma das soluções analisadas nas concentrações de 20, 40, 60 80 e 100 mg
L-1. Essas soluções foram preparadas a partir de diluições de uma solução estoque
com concentração de 100 mg L-1. As leituras foram realizadas na região de 720 a 240
nm, em cubeta de quartzo e caminho óptico de 5 mm. Na calibração do
espectrofotômetro, foi utilizada água destilada como referência.

2.5.3 Determinação do Carbono Orgânico Total (COT)

As análises de COT foram realizadas em um equipamento TOC-VCPN (Total


Organic Carbon Analyzer) Shimadzu, acoplado a um microcomputador, utilizando o
software TOC-Control V da Shimadzu e a técnica de CONP (carbono orgânico não
purgável). De acordo com esta técnica, a amostra analisada (3 mL) foi acidificada com
solução de HCl a 2,0 mol L-1 e posteriormente borbulhada com O2 ultrapuro (tipo 6.0
White Martins Praxair Inc.), com a finalidade de remover todo o carbono inorgânico
presente. Após esse processo, a amostra foi inserida na câmara de combustão (680
ºC) contendo catalisador a base de platina, onde ocorreu a mineralização dos
compostos orgânicos, ou seja, onde eles se transformaram em CO2 e H2O. Em
seguida, o CO2 é arrastado até um desumidificador e identificado em detector de
infravermelho não dispersivo, finalizando a quantificação de carbono presente na
amostra.

A quantificação do COT foi determinada tomando-se por base uma curva de


calibração da solução padrão biftalato de potássio 500 mg L -1, fornecido pela
fabricante do equipamento. Antes do preparo da solução padrão o biftalato de potássio
foi seco em estufa a 110 ºC por 1 h.
49

A integração dos picos e a construção da curva de calibração foram realizadas


pelo próprio software do equipamento. A partir dos valores de desvio padrão e
coeficiente de variância obtidos em cada amostra, o próprio equipamento elimina,
automaticamente, valores anormais e realiza uma medida adicional para corrigir esses
possíveis erros, quando necessário.

2.5.4 Eficiência de corrente instantânea (ECI)

A eficiência de corrente instantânea expressa o rendimento do tratamento


eletroquímico e, é definida como a razão entre a carga utilizada para a eletro-oxidação
da molécula orgânica e a carga total fornecida, ou seja, é a razão entre a quantidade
de moléculas oxidadas e a quantidade de moléculas que teriam sido oxidadas se toda
corrente aplicada fosse utilizada para a reação de interesse. Os cálculos foram
realizados a partir da Equação 4, considerando os valores de COT das amostras antes
e após os tratamentos de oxidação eletroquímica (PACHECO et al., 2007).

FV (2,6 x COT)t − (2,6 x COT)t+∆t


𝐸𝐶𝐼 = Eq. 4
8I ∆t

onde, F é a constante de Faraday (C mol-1), V é o volume de eletrólito (m3), I é a


corrente aplicada (A), COTt e COTt + ∆t (mg L-1) correspondem aos valores de carbono
orgânico total nos tempos t e t + ∆t (s), respectivamente.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Caracterização espectrofotométrica UV-Vis dos azo corantes

Espectrofotometria UV-Vis é uma das técnicas analíticas mais empregadas


para análise colorimétrica de soluções, em função de sua robustez, custo
50

relativamente baixo e grande número de aplicações que podem ser desenvolvidas


(ROCHA; TEIXEIRA, 2004).

As análises espectrofotométricas permitiram determinar os comprimentos de


onda máximos (λmáximo) dos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B em solução
simples e binária. Os valores encontrados foram 602 nm para o corante Acid Blue 161
e 538 nm para o Procion Red MX-5B. De forma geral esses valores são fixos, mas em
função da sensibilidade do equipamento espectrofotômetro utilizado e, de como a
solução de corante foi preparada, podem ocorrer pequenas alterações nesses valores,
como por exemplo, Puchana-Rosero et al. (2017) também realizaram análises de
descoloração com o corante Acid Blue 161 e o comprimento de onda que utilizaram
foi de 572 nm.

Observando as Figuras 6, 7 e 8 é possível visualizar o espectro de absorção


UV-Vis dos corantes em solução aquosa.

Figura 6 – Espectro de absorção UV-Vis do corante Acid Blue 161.

Acid Blue 161


OH HO

2,0
N N SO3Na

xCr
1,5
Absorbância

1,0 602 nm

0,5

0,0
300 400 500 600 700
Comprimento de onda (nm)

Nota: Concentração 100 mg L-1; λ = 602 nm.


Fonte: elaborado pela autora.
Figura 7 – Espectro de absorção UV-Vis do corante Procion Red MX-5B.
51

Procion Red MX-5B


2,0
NaO 3S SO 3Na

N N

NH OH
1,5

N N

538 nm
Absorbância

Cl N Cl

1,0

0,5

0,0
300 400 500 600 700
Comprimento de onda (nm)

Nota: Concentração 100 mg L-1; λ = 602 nm.


Fonte: elaborado pela autora.

Figura 8 – Espectro de absorção dos corantes (----) Procion Red MX-5B, (----) Acid
Blue 161 em solução simples e (----) solução binária.
Solução Binária
3,5
OH HO NaO3S SO3Na

3,0 N N SO3Na N N
+
NH OH

2,5 xCr
N N
Absorbância

2,0 Cl N Cl

538 nm

1,5

1,0 602 nm

0,5

0,0
300 400 500 600 700 800
Coprimento de onda (nm)

Nota: Concentração 200 mg L-1; λ = 538 e 602 nm.


Fonte: elaborado pela autora.
52

A análise dos espectros dos corantes em solução binária (Figura 8) nos permite
afirmar que a cor roxa que ela apresenta é proveniente da soma dos espectros dos
corantes na região localizada entre 500 e 550 nm. Enquanto que na região entre 602
e 700 nm ocorre absorção apenas do corante Acid Blue 161. Essa característica
espectral é o que torna possível os cálculos de concentração remanescente de cada
um dos corantes após os tratamentos em solução binária.

3.2 Curvas de calibração dos corantes

As curvas de calibração de cada um dos corantes em solução simples e binária


foram determinadas para que fosse possível a realização dos cálculos das
concentrações remanescentes, após os tratamentos de descoloração. Em solução
binária, admitiu-se, após analisar os espectros UV-Vis, que o corante Procion Red
MX-5B está totalmente em extinção na região de absorção máxima do corante Acid
Blue 161, 602 nm. Sendo assim, foi possível determinar a concentração do corante
Acid Blue 161, a partir desse resultado, subtrair a interferência de concentração desse
corante em 538 nm e, por fim, determinar a concentração remanescente do corante
Procion Red MX-5B, após os tratamentos.

As figuras 9, 10 e 11 correspondem as curvas de calibração das soluções dos


corantes Acid Blue 161, Procion Red MX-5B e solução binária.
53

Figura 9 – Curva de calibração do corante Acid Blue 161.

Nota: [AB 161] = 20, 40, 60, 80 e 100 mg L-1; λmáx = 602 nm; Abs602nm = 0,0104 +
0,00779*[corante]; R = 0,999.
Fonte: elaborado pela autora.

Figura 10 – Curva de calibração do corante Procion Red MX-5B.

Nota: [PR MX-5B] = 20, 40, 60, 80 e 100 mg L-1; λmáx = 538 nm; Abs538nm = 0,01885 +
0,01146*[corante]; R = 0,999.
Fonte: elaborado pela autora.
54

Figura 11 – Curva de calibração da solução binária.

Nota: (A) espectros de absorção UV-vis [corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B] =
40, 80, 120, 160 e 200 mg L-1; λmáx = 538 e 602 nm; (B) Curva Procion Red MX-5B: Abs538nm
= 0,01885 + 0,01146*[corante]; R = 0,999; (C) Curva Acid Blue 161: Abs602nm = 0,0104 +
0,00779*[corante]; R = 0,999; (D) Curva Acid Blue 161 interferente: Abs538nm = 0,0139 +
0,00485*[corante]; R = 0,999.
Fonte: elaborado pela autora.

3.3 Teste de toxicidade com o eletrólito suporte

O eletrólito suporte têm ampla aplicação em processos eletroquímicos, e deve


apresentar alta solubilidade, alto grau de ionização, estabilidade química e
eletroquímica. Com relação às suas aplicações, verifica-se que eles mantém os
coeficientes de atividade praticamente constantes, o número de transporte da espécie
eletroativa praticamente igual a zero, diminui a espessura da dupla camada elétrica,
mantém a viscosidade, o coeficiente de difusão e o número médio de ligantes
55

constantes, além de incrementar a condutividade em meios solventes polares, tanto


orgânicos quanto inorgânicos (AGOSTINHO et al., 2004).

Sendo assim, o eletrólito suporte escolhido para os estudos eletroquímicos foi


o sulfato de sódio (Na2SO4), que é um sal inerte, que não apresenta hidrólise
significativa e nem forma complexo com íons metálicos (DAVI; GNUDI, 1999). Com o
objetivo de encontrar uma concentração que não interferisse nos resultados dos testes
de toxicidade aguda com sementes de Lactuca sativa, antes e após os tratamentos
de descoloração foi necessário determinar uma concentração de eletrólito suporte que
não influenciasse negativamente ou positivamente o desenvolvimento das plântulas.

Após 120 h de exposição às soluções contendo Na2SO4, foi possível determinar


as porcentagens de inibição de crescimento radicular das plântulas. Os dados obtidos
podem ser observados na Figura 12.

Figura 12 – Inibição de crescimento das raízes das plântulas de L. sativa, após 120
h de exposição a diferentes concentrações do eletrólito suporte Na2SO4.

100

80
Inibição de crescimento (%)

60

40

20

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10


-1
Concentração de Na2SO4 (mol L )

Fonte: elaborado pela autora.

Analisando os resultados, é possível verificar que as concentrações de 0,01 e


0,02 mol L-1 não apresentaram nenhum tipo de interferência no desenvolvimento das
56

raízes das plântulas, enquanto as concentrações mais altas apresentaram efeito


nocivo.

Admitindo que uma concentração mais alta de eletrólito suporte favorece as


reações eletroquímicas, adotou-se a concentração de 0,02 mol L-1 para ser utilizada
durante as eletrólises.

3.4 Caracterização dos eletrodos

3.4.1 Condicionamento eletroquímico

A voltametria cíclica é uma das técnicas empregadas em eletroquímica para


investigar os mecanismos eletroquímicos. Investigação de reações do tipo redox que
ocorrem na superfície do eletrodo, devido a oxidação do corante em uma fina película
de óxidos é melhor determinada por essa técnica (SONI et al., 2017).

Sendo assim, o condicionamento eletroquímico foi determinado por voltametria


cíclica, onde aplicou-se 50 ciclos consecutivos dentro da janela de potencial 0,2 e 1,1
V vs. ECS, e eletrólito suporte na concentração de 0,02 mol L-1.

Analisando o voltamograma presente na Figura 14 é possível verificar ligeiro


aumento da carga anódica ao final de 50 ciclos voltamétricos. Esse comportamento é
frequentemente observado e está relacionado com a estrutura porosa da película de
óxido que recobre o eletrodo, que é submetida à contínua hidratação dos sítios ativos
menos acessíveis durante o processo de eletrólise (RIBEIRO; DE ANDRADE, 2004).
57

Figura 13 – Voltamogramas cíclicos do eletrodo de composição nominal


Ti/Ru0,3Ti0,7O2, antes e após a realização do condicionamento voltamétrico.

0,05
1º ciclo
0,04 Após 50 ciclos

0,03

0,02
2
I /A cm

0,01

0,00

-0,01

-0,02

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2


E / V vs. ECS

Nota: ν = 50 mV s-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1.


Fonte: elaborado pela autora.

3.4.2 Determinação da área eletroquimicamente ativa

A área eletroquimicamente ativa foi determinada pela integração da parte


anódica do voltamograma cíclico em um intervalo de potencial, onde o solvente
empregado não foi reduzido ou oxidado eletroquimicamente (MAKSIMOV;
PODLOVCHENKO, 2017). A integração do voltamograma cíclico fornece uma medida
proporcional ao número de sítios ativos presentes do agente catalisador (rutênio).

Sendo assim, a partir dos resultados obtidos para o eletrodo de placa com área
conhecida de 1 cm2, foi possível determinar que a área eletroquimicamente ativa do
eletrodo de trabalho foi igual a 13,32 cm2.
58

3.4.3 Voltametria cíclica na presença dos corantes estudados

Para verificar se a oxidação dos corantes ocorria na janela de potencial do


eletrodo de Ti/Ru0,3Ti0,7O2, foram registrados voltamogramas cíclicos das soluções
compostas pelos corantes Acid Blue 161 (Figura 14) e Procion Red MX-5B (Figura
15). A concentração de corante testada foi de 100 mg L-1 e Na2SO4 com concentração
de 0,02 mol L-1.

Figura 14 - Voltamogramas cíclicos eletrodo de Ti/Ru0,3Ti0,7O2 na presença do


corante Acid Blue 161.

Acid Blue 161


1º Ciclo
0,0015
Após 50 ciclos

0,0010

0,0005
2
I / A cm

0,0000

-0,0005

-0,0010

-0,0015

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2


E / V vs. ECS

Nota: ν = 50 mV s-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1; [AB 161] = 100 mg L-1.
Fonte: elaborado pela autora.
59

Figura 15 - Voltamogramas cíclicos do eletrodo de Ti/Ru0,3Ti0,7O2 na presença do


corante Procion Red MX-5B.

Procion Red MX-5B


1º Ciclo
0,0015
Após 50 ciclos

0,0010

0,0005
-2
I / A cm

0,0000

-0,0005

-0,0010

-0,0015

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2


E / V vs. ECS

Nota: ν = 50 mV s-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1; [corante] = 100 mg L-1.


Fonte: elaborado pela autora.

Observando os voltamogramas cíclicos é possível verificar que a oxidação dos


corantes ocorre em potenciais maiores que a reação de desprendimento de oxigênio,
evidenciando que ocorre competição entre a oxidação dos corantes e a oxidação da
água, o que resulta em diminuição significativa da degradação dessas moléculas no
decorrer do tratamento eletroquímico (JAGER et al., 2018).

3.4.4 Análises de espectroscopia dispersivas de Raios-X

O estudo de espectroscopia dispersiva de Raios-X (EDX) permitiu determinar


as concentrações experimentais de rutênio e titânio que compõem o filme de óxidos
depositado sobre o eletrodo de titânio metálico. A composição nominal de Ru e Ti são
respectivamente iguais a 30 e 70 % e a composição determinada experimentalmente
60

foi de 34 e 66 %. Como o processo de deposição dos óxidos estima as concentrações


de Ru e Ti, os resultados obtidos estão dentro dos valores esperados.

3.4.5 Análises de microscopia eletrônica de varredura

As análises de microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram realizadas


para que fosse possível determinar a morfologia da superfície do eletrodo de trabalho.

Observando a Figura 16 verifica-se que a superfície do eletrodo apresenta


morfologia rugosa e porosa, com presença de algumas fendas. Essa morfologia é
típica de filmes finos preparados por decomposição térmica de precursores
poliméricos (FORTI et al., 2001)

Figura 16 – Micrografia do filme de óxido Ti e Ru depositado sobre o titânio metálico


do eletrodo de trabalho.

Nota: aumento de 300x.


Fonte: elaborado pela autora.
61

3.5 Eletrólises

Dois processos simultâneos ocorrem durante o processo de oxidação


eletroquímica de azo corantes, a oxidação heterogênea direta/redução na superfície
do eletrodo e reações homogêneas indiretas. A descoloração da solução ocorre
devido a mudanças na estrutura química das moléculas dos corantes após o processo
de oxidação e/ou pela quebra das azo ligações que correspondem ao grupo cromóforo
dos corantes (JAGER et al., 2018), sendo que a quebra das azo ligações produzem
aminas aromáticas primárias como metabólitos intermediários (TROVÓ et al., 2016).

Sendo assim, as primeiras eletrólises que foram realizadas, tiveram como


objetivo principal verificar o comportamento de descoloração das soluções compostas
pelos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B em solução simples e binária. As
Figuras 17, 18 e 19 ilustram os espectros de absorção UV-Vis, antes e após o
tratamento de oxidação eletroquímica, bem como os resultados de descoloração
dessas soluções.

Figura 17 – Espectros de absorção UV-Vis e descoloração da solução de Acid Blue


161.

Acid Blue 161


Acid Blue 161
3,0 Controle 100
Após 1 h
Após 2 h
2,5 Após 3 h 80
Após 4 h
2,0
Descoloração (%)
Absorbância

60

1,5

40
1,0

20
0,5

0,0 0
200 300 400 500 600 700 1 2 3 4
Comprimento de onda (nm) Tempo de tratamento (h)

Nota: [Inicial de corante] = 100 mg L-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1; corrente aplicada = 50 mA
cm-2; fluxo = 25 mL min-1; λmáx = 602 nm.
Fonte: elaborado pela autora.
62

Figura 18 – Espectros de absorção UV-Vis e descoloração da solução de Procion


Red MX-5B.

Procion Red MX-5B Procion Red MX-5B


2,5
Controle 100
Após 1 h
Após 2 h
2,0
Após 3 h 80
Após 4 h
Absorbância

1,5

Descoloração
60

1,0
40

0,5 20

0,0 0
200 300 400 500 600 700 1 2 3 4
Comprimento de onda (nm) Tempo de tratamento (h)

Nota: [Inicial de corante] = 100 mg L-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1; corrente aplicada = 50 mA
cm-2; fluxo = 25 mL min-1; λmáx = 538 nm.
Fonte: elaborado pela autora.

Figura 19 – Espectros de absorção UV-Vis e descoloração da solução binária


composta pelos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B.

Solução Binária
3,5 Solução Binária
Controle
100
Após 1 h
3,0
Após 2 h
Após 3 h
2,5 80
Após 4 h
Absorbância

Descoloração (%)

2,0
60

1,5
40
1,0

20
0,5

0,0 0
200 300 400 500 600 700 1 2 3 4

Comprimento de onda (nm) Tempo de tratamento (h)

Nota: [inicial de corante] = 200 mg L-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1; corrente aplicada = 50 mA
cm-2; fluxo = 25 mL min-1; λmáx = 538 e 602 nm.
Fonte: elaborado pela autora.

Comparando os resultados de descoloração (Figura 20), é possível afirmar que


em todos os tratamentos as taxas de descoloração obtidas foram satisfatórias, sendo
63

que as moléculas mais fáceis de serem degradadas foram as do corante Procion Red
MX-5B, pois em 2 h de tratamento eletroquímico a solução já havia perdido
aproximadamente 92 % de sua coloração.

Figura 20 – Comparativo de descoloração das soluções compostas pelos corantes


Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B, após o tratamento eletroquímico.

Acid Blue 161 Procion Red MX-5B Solução Binária

100

80
Descoloração (%)

60

40

20

0
1 2 3 4
Tempo de tratamento (h)

Nota: [Inicial de corante] = 100 mg L-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1; corrente aplicada = 50 mA
cm-2; fluxo = 25 mL min-1.
Fonte: elaborado pela autora.

Nas Figuras 21, 22 e 23 é possível observar à descoloração das soluções após


o tratamento eletroquímico.
64

Figura 21 – Soluções do corante Acid Blue 161, antes e após tratamento


eletroquímico (A) controle; (B) 1 h; (C) 2 h; (D) 3 h; (E) 4 h de tratamento.

Fonte: elaborado pela autora.

Figura 22 – Soluções do corante Procion Red MX-5B, antes e após tratamento


eletroquímico (A) controle; (B) 1 h; (C) 2 h; (D) 3 h; (E) 4 h de tratamento.

Fonte: elaborado pela autora.


65

Figura 23 – Solução binária dos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B,
antes e após tratamento eletroquímico (A) controle; (B) 1 h; (C) 2 h; (D) 3 h; (E) 4 h
de tratamento.

Fonte: elaborado pela autora.

Ao final das 4 h de tratamento, somente o corante Acid Blue 161 em solução


simples, apresentava corante remanescente, indicando menor taxa de
degradabilidade dessa molécula, nas condições de tratamento adotadas nesse
estudo. Outro comportamento observado foi que, em solução binária, a degradação
desse corante foi favorecida nas 2 primeiras horas de tratamento, enquanto que o
corante Procion Red MX-5B, que havia exibido alta descoloração em solução simples,
foi mais dificilmente degradado nessa solução. A Figura 24 apresenta os dados de
descoloração de cada um dos corantes em solução binária.

Uma hipótese que justifica esse comportamento é a de que o cloro presente na


estrutura molecular do corante Procion Red MX-5B, se desprende da molécula
durante o processo de oxidação e colabora com a oxidação do corante Acid Blue 161,
visto que o cloro é um forte agente oxidante de moléculas orgânicas (RHEDA et al.,
2017).
66

Figura 24 – Comparativo de descoloração dos corantes Acid Blue 161 e Procion


Red MX-5B em solução binária.

Acid Blue 161 Procion Red MX-5B

100

80
Descoloração (%)

60

40

20

0
1 2 3 4
Tempo de tratamento (h)

Fonte: elaborado pela autora.

Também foram realizadas análises de COT, cujos resultados podem ser


observados na Figura 25.

Figura 25 – Comparativo de Remoção de COT nas soluções compostas pelos


corantes Acid Blue 161, Procion Red MX-5B e solução binária.
50
Acid Blue 161
Procion Red MX-5B
40
Solução Binária
Remoção de COT (%)

30

20

10

0
1 2 3 4
Tempo de tratamento (h)

Nota: [Inicial de corante] = 100 mg L-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1; corrente aplicada = 50 mA
cm-2; fluxo = 25 mL min-1.
Fonte: elaborado pela autora.
67

Os resultados de COT evidenciam que os tratamentos eletroquímicos foram


eficientes na descoloração da solução, mas removeram pouca quantidade de
carbono, ou seja, ocorreu quebra das ligações dos grupos cromóforos, gerando
metabólitos que permaneceram na solução. A solução simples do corante Procion
Red MX-5B e a solução binária foram as que apresentaram maior porcentagem de
remoção de COT com 14 e 15 % respectivamente ao final das 4 h de tratamento de
oxidação eletroquímica.

A baixa remoção de COT já era esperada, pois o processo eletroquímico não


foi testado em condições extremas, ou seja, foi aplicado baixa intensidade de corrente
elétrica (50 mA cm-2) e reduzida concentração de eletrólito suporte, além do fato de
que, somente o processo eletroquímico não é eficiente na mineralização de moléculas
de corantes sintéticos (BRILLAS; MARTÍNEZ-HUITLE, 2015).

Jager et al. (2018) estudaram a oxidação eletroquímica do azo corante Reactive


Black 5, utilizando eletrodo de ânodo dimensionalmente estável, constituído por um
suporte metálico de titânio, recoberto por uma mistura de óxidos de RuO2/IrO2/TiO2,
concentração de corante de 300 mg L-1, NaCl como eletrólito suporte, corrente
constante de 1,5 A cm-2, pelo período de 1 h. Após o período de tratamento, as
soluções apresentaram 100 % de descoloração e, apenas 18 % de remoção de COT.
Evidenciando que mesmo realizando o processo de oxidação eletroquímica em
condições mais drásticas, o que ocorre é a quebra das ligações dos grupos
cromóforos, com baixa taxa de mineralização dos intermediários formados após a
oxidação das moléculas iniciais.

3.5.1 Variação de fluxo

Para o estudo de variação de fluxo, foi escolhido o corante Acid Blue 161, pelo
fato dele apresentar maior resistência a degradação durante o tratamento
eletroquímico com fluxo de 25 mL min-1. Os outros fluxos testados foram de 10 e 70
mL min-1, com corrente constante de 50 mA cm-2, durante 4 h de tratamento. A Figura
26 representa os espectros de absorção das soluções antes e após esses
tratamentos.
68

Figura 26 – Espectros de absorção do corante Acid Blue 161 antes e após


tratamento eletroquímico.

3,5 3,5
Acid Blue 161 - 1 h de tratamento Acid Blue 161 - 2 h de tratamento
Solução controle Solução controle
3,0 3,0
-1 -1
fluxo 10 mL min fluxo 10 mL min
-1 -1
2,5 fluxo 25 mL min 2,5 fluxo 25 mL min
-1 -1
fluxo 70 mL min fluxo 70 mL min
Absorbância

Absorbância
2,0 2,0

1,5 1,5

1,0 1,0

0,5 0,5

0,0 0,0
200 300 400 500 600 700 200 300 400 500 600 700
Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

3,5 3,5
Acid Blue 161 - 3 h de tratamento Acid Blue 161 - 4 h de tratamento
Solução controle Solução controle
3,0 3,0
-1 -1
fluxo 10 mL min fluxo 10 mL min
-1 -1
2,5 fluxo 25 mL min 2,5 fluxo 25 mL min
-1 -1
fluxo 70 mL min fluxo 70 mL min
Absorbância

Absorbância

2,0 2,0

1,5 1,5

1,0 1,0

0,5 0,5

0,0 0,0
200 300 400 500 600 700 200 300 400 500 600 700
Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

Fonte: elaborado pela autora.

As Figuras 27 e 28 representam os dados comparativos de descoloração e


COT, respectivamente. Alíquotas foram retiradas a cada 30 min para realização de
análises UV-Vis e a cada 1 h para análises de COT. As análises de COT foram
realizadas a cada hora pelo fato do método ser destrutivo, ou seja, a alíquota retirada
(5 mL) não foi devolvida para o sistema eletroquímico.
69

Figura 27 – Comparativo de descoloração das soluções do corante Acid Blue 161


em diferentes velocidades de fluxo.
100
-1
Fluxo 10 mL min
90
-1
Fluxo 25 mL min
80 -1
Fluxo 70 mL min
70
Descoloração (%)

60

50

40

30

20

10

0
30 60 90 120 150 180 210 240
Tempo de tratamento (min)

Nota: [Inicial de corante] = 100 mg L-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1; corrente aplicada = 50 mA
cm-2.
Fonte: elaborado pela autora.

Figura 28 – Comparativo de Remoção de COT das soluções de Acid Blue 161 em


diferentes velocidades de fluxo.
50
Acid Blue 161
-1
Fluxo 10 ml min
40 -1
Fluxo 25 ml min
-1
Fluxo 70 ml min
Remoção de COT (%)

30

20

10

0
60 120 180 240
Tempo de tratamento (min)

Nota: [Inicial de corante] = 100 mg L-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1; corrente aplicada = 50 mA
cm-2.
Fonte: elaborado pela autora.
70

Nas primeiras 3 h de tratamento o fluxo, mais eficiente quanto a remoção da


cor, foi o de 10 mL min-1, enquanto que na última hora de tratamento os resultados
para os três diferentes fluxos testados foram equivalentes e não apresentaram
diferença entre si. Quanto a remoção de COT na primeira hora de tratamento, o fluxo
de 70 mL min-1 apresentou maior eficiência, entre 2 e 3 h os fluxos de 10 e 70 mL min-
1 foram semelhantes, e ao final do tratamento o fluxo de 10 mL min -1 foi o que
apresentou maior capacidade de remoção de COT.

Levando em consideração à descoloração da solução, é possível afirmar que o


tempo de retenção na célula filtro-prensa favorece diretamente esse processo, visto
que o fluxo de 10 mL min-1 apresentou os melhores resultados de descoloração.
Embora o tratamento com o fluxo de 70 mL min -1 tenha apresentado maior remoção
de COT durante a primeira hora de tratamento, os valores obtidos para esse intervalo
de tempo não foram muito expressivos em nenhuma das condições testadas. Sendo
que somente ao final das 4 h de tratamento os resultados de remoção de COT
apresentaram-se mais satisfatórios, sendo que o fluxo de 10 mL min-1 apresentou os
melhores resultados.

5.5.2 Eficiência da corrente instantânea (ECI)

Os dados de eficiência de corrente instantânea obtidos nas eletrólises dos


corantes Acid Blue 161, Procion Red MX-5B e solução binária, fluxo de 25 mL min-1,
[Na2SO4] = 0,02 mol L-1 e corrente aplicada de 50 mA cm-2, podem ser observados na
Figura 29.
71

Figura 29 – Dados relativos a eficiência de corrente instantânea nas eletrólises dos


corantes Acid Blue 161, Procion Red MX-5B e solução binária.
15
Acid Blue 161
Procion Red MX-5B

Eficiência de Corrente Instantânea (%)


Solução Binária

10

0
1 2 3 4
Tempo de tratamento (h)

Nota: [Inicial de corante] = 100 mg L-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1; corrente aplicada = 50 mA
cm-2; fluxo = 25 mL min-1.
Fonte: elaborado pela autora.

Esses resultados evidenciam que o tratamento do corante Acid Blue 161


nessas condições foi o que apresentou menor eficiência de corrente, o que é
justificado pela baixa mineralização (baixa redução de COT) desse composto, pois
embora tenha ocorrido alta descoloração das soluções do corante, a degradação dos
metabólitos formados, após a quebra do grupo cromóforo da molécula, não ocorreu
de modo significativo. Para o corante Procion Red MX-5B, é possível verificar que a
melhor eficiência de corrente ocorreu na primeira hora de tratamento, que foi
diminuindo gradativamente com o tempo. O tratamento da solução binária foi o que
se mostrou mais eficiente. Isso ocorreu, provavelmente, pelo fato dessa ser uma
solução mais concentrada, porque na solução binária existe uma maior quantidade de
moléculas orgânicas (concentração 200 mg L-1) que favorece o processo de oxidação
eletroquímica.

A Figura 30 expressa os resultados de ECI para as eletrólises com variação de


fluxo do corante Acid Blue 161, onde a maior eficiência de corrente pode ser
visualizada no fluxo de 70 mL min-1 com 1 h de tratamento. O tratamento de 10 mL
72

min-1 também apresentou boa eficiência de corrente, sendo que a maior porcentagem
obtida foi no tratamento de 2 h com 6,7 % de ECI.

Figura 30 – Dados relativos eficiência de corrente instantânea nas eletrólises dos


corantes Acid Blue 161, com variação de fluxo 10, 25 e 70 mL min-1.

Acid Blue 161


15
-1
Fluxo 10 mL min
-1
Fluxo 25 mL min
Eficiência de Corrente Instantânea (%)

-1
Fluxo 70 mL min

10

0
1 2 3 4
Tempo de tratamento (h)

Nota: [Inicial de corante] = 100 mg L-1; [Na2SO4] = 0,02 mol L-1; corrente aplicada = 50 mA
cm-2.
Fonte: elaborado pela autora.

De uma forma geral os baixos resultados obtidos para ECI indicam que a
densidade de corrente no sistema está em sua maior parte, sendo convertida para a
oxidação da água, na reação de desprendimento de oxigênio, sendo esse um
problema característico de processos eletro-oxidativos (PACHECO et al., 2007; SONI
et al., 2017).

4 CONCLUSÃO

Após a análise dos resultados obtidos, pode-se afirmar que quanto à


descoloração das soluções, as primeiras eletrólises apresentaram-se eficientes,
embora tenham apresentado baixa remoção de carbono orgânico total. O corante
73

Procion Red MX-5B apresentou-se mais susceptível ao tratamento de oxidação


eletroquímica, apresentando descoloração de aproximadamente 92 %, após 2 h de
tratamento no fluxo de 25 mL min-1.

O eletrodo escolhido com composição nominal Ti/(Ru0,3Ti0,7)O2 apresentou boa


capacidade de oxidação das moléculas dos corantes. Foi possível verificar que a
velocidade do fluxo das soluções durante os tratamentos influencia, diretamente na
descoloração e remoção de COT, sendo que de modo geral o fluxo que apresentou
os melhores resultados foi o de 10 mL min-1. Esses resultados nos leva a afirmar que
um maior tempo de residência da solução dentro da célula favorece a degradação e
a taxa de mineralização desses azo corantes.
74

5 CAPÍTULO II

Avaliação da degradação de azo corantes têxteis a partir de tratamento


microbiológico associado a pré-tratamento de oxidação eletroquímica

Resumo

A indústria têxtil no Brasil possui lugar de destaque, apresentando expressivo valor


econômico-social, mas está entre as principais indústrias geradoras de efluentes com
alto potencial poluidor. Esses efluentes contêm elevada carga orgânica, cor acentuada
e compostos químicos tóxicos ao homem e ao meio ambiente. A alta coloração deve-
se a presença de corantes sintéticos que não se fixaram às fibras têxteis durante o
processo de tingimento. Corantes sintéticos, possuem alta complexidade molecular, o
que os tornam altamente estáveis e resistentes a diferentes tipos de tratamentos.
Entretanto, os tratamentos microbiológicos e os processos oxidativos são amplamente
estudados, pois são capazes de transformar substâncias persistentes e de difícil
degradação em substâncias com baixo potencial toxicológico e biologicamente
degradáveis. Sendo assim, o presente trabalho se propôs a estudar os tratamentos
de descoloração microbiológico e eletroquímico/microbiológico dos azo corantes
têxteis Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B em solução aquosa. Os tratamentos
75

microbiológicos de descoloração foram realizados pelo fungo filamentoso Aspergillus


terreus e pela levedura Saccharomyces cerevisiae e, como tratamento oxidativo
utilizou-se um sistema eletroquímico. A toxicidade aguda das soluções foi analisada
antes e após os tratamentos, a partir de um sistema teste vegetal composto por
sementes de Lactuca sativa. No intuito de remover metabólitos intermediários, nocivos
ao desenvolvimento das sementes, ao final dos tratamentos de degradação, foi
realizado tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato.

1 INTRODUÇÃO

A indústria têxtil, apresenta em diversos países um expressivo valor econômico


e social, mas está entre as principais indústrias geradoras de efluentes com alto
potencial poluidor. Do ponto de vista ambiental, o sistema operacional de tingimento
dos tecidos é o mais preocupante, devido à variedade e complexidade dos produtos
químicos empregados no processo, sendo os corantes sintéticos as substâncias que
têm atraído maior atenção de pesquisadores.

Anualmente, em todo o mundo, são descartados na forma de efluente


aproximadamente 280 mil toneladas de corantes têxteis (SEN et al., 2016). O grupo
mais utilizado nessas indústrias correspondem aos azo corantes, que são compostos
que contém uma ou mais ligações do tipo R1-N=N-R2, ligados a anéis aromáticos
(benzeno e/ou naftaleno), além de grupos funcionais (-NH2, -OH, -COOH, NO2, -Cl, -
SO3), com excelente solubilidade em água e estabilidade da cor (BRÜSCHWEILER;
MERLOT, 2017).

É inegável a importância e necessidade da utilização desses compostos nos


processos de tingimento e estampagem de tecidos, mas a grande preocupação em
torno dessas substâncias é devido à sua alta persistência e resistência aos
tratamentos convencionais de águas residuárias. As tecnologias convencionais de
tratamento dessas águas ainda possuem muitas limitações, como por exemplo, alto
custo de operação, alto consumo energético, redução de eficiência devido à
estabilidade química dessas moléculas e/ou à complexidade do seu processo de
degradação (ROSU et al., 2017; ZHANG et al., 2017).
76

Nesse contexto os processos biológicos utilizando fungos filamentosos e


leveduras têm a vantagem de serem ambientalmente rentáveis, pois causam menos
impactos por produzir uma menor quantidade de lodo e ter um menor custo energético,
quando comparados aos processos convencionais. Nesses tratamentos, a bioredução
desses compostos está diretamente associada a processos enzimáticos, pois os
fungos possuem alta capacidade para degradar compostos orgânicos complexos, a
partir da produção de enzimas lignolíticas extracelulares. Como exemplos, têm-se as
enzimas lacase, manganês peroxidase e lignina peroxidase (SEN et al., 2016; HSUEH
et al., 2017). Entretanto, a grande desvantagem dos tratamentos microbiológicos é
que são processos muito lentos, principalmente devido a sua limitação na
decomposição de corantes macromoleculares. Os azo corantes sintéticos são
moléculas quimicamente estáveis e, na maioria dos casos resistentes ao ataque
microbiano, resultando assim em baixa eficiência de degradação do sistema
microbiológico de tratamento (HAQUE et al., 2015).

Por outro lado, existe um interesse crescente em estudos de degradação de


compostos orgânicos por meio da oxidação anódica, a partir do processo de oxidação
eletroquímica, com base na geração in situ de radicais hidroxila (•OH) na superfície
do eletrodo. Esses radicais têm alto potencial de redução e reagem com moléculas
orgânicas de forma não seletiva podendo levar a sua completa mineralização
(ISARAIN-CHÁVEZ et al., 2017). A desvantagem dessa técnica é o seu alto custo
energético. Desta forma, há uma real necessidade de desenvolvimento de
tratamentos alternativos para remoção de corantes sintéticos de efluentes têxteis que
sejam eficientes, ambientalmente sustentáveis e de menor custo de implementação.

Sendo assim, no presente estudo o objetivo foi utilizar um tratamento


combinado de degradação dos azo corantes têxteis Acid blue 161 e Procion Red MX-
5B, onde o tratamento de oxidação eletroquímica foi empregado como pré-tratamento
das soluções, que posteriormente foram submetidas a tratamentos microbiológicos
com o fungo filamentoso Aspergillus terreus e com a levedura Saccharomyces
cerevisiae. A utilização do sistema oxidativo como um pré-tratamento teve o intuito de
reduzir o custo energético, já que ele foi aplicado por um curto intervalo de tempo e
com baixa intensidade de corrente elétrica (50 mA cm-2). No primeiro tratamento
iniciou-se o processo de degradação das moléculas dos corantes, facilitando assim o
processo de degradação microbiano. As soluções foram analisadas antes e após os
77

tratamentos, a partir de análises de UV-Vis, FTIR, HPLC-UV/Vis e toxicidade aguda


utilizando sementes de Lactuca sativa como bioindicador. Ao final dos tratamentos de
descoloração, foram realizados estudos de adsorção com argila branca imobilizada
em alginato, com o objetivo de remover metabólitos intermediários com alto potencial
toxicológico gerados após a degradação das moléculas dos corantes.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Azo corantes

O estudo de degradação foi realizado com o corante Acid Blue 161 (Figura 1),
também conhecido como Acid Blue 193 (C.I. 15076; CAS 12392-64-2) cuja fórmula
empírica é C20H13N2O6SNaCrx, peso molecular de 416,39 g mol-1, pureza de
aproximadamente 40 %, solúvel em água e fabricado pela Aldrich Chemical Company,
Inc; e com o corante Procion Red MX-5B (Figura 2) ou Reactive Red 2 (CAS 17804-
49-8) que possui fórmula C19H10Cl2N6Na2O7S2, peso molecular 615,34 g mol-1, pureza
aproximada de 40 %, solúvel em água e fabricado pela I.C.I. Brasil S.A.

Figura 1 – Estrutura molecular do azo corante têxtil Acid Blue 161.

OH HO

N N SO3Na

xCr

Fonte: Sigma-Aldrich, 2017.


78

Figura 2 – Estrutura molecular do azo corante têxtil Procion Red MX-5B.

NaO 3S SO 3Na

N N

NH OH

N N

Cl N Cl

Fonte: Sigma-Aldrich,2017.

2.2 Micro-organismos

Os tratamentos microbiológicos foram realizados com o fungo Aspergillus terreus


e com a levedura Saccharomyces cerevisiae.

2.2.1 Aspergillus terreus

Os estudos de biodegradação foram realizados com o fungo filamentoso


Aspergillus terreus (CCT 2679) (Figura 3), proveniente da Coleção de Culturas da
Fundação Tropical de Pesquisas e Tecnologia André Tosello. As matrizes fúngicas
foram mantidas em tubos de ensaio com meio extrato de malte 2 % (LODDER, 1970)
modificado (adição de sacarose e peptona) e em temperatura ambiente.
79

Figura 3 – (A) Fungo A. terreus (B) Imagem microscópica do fungo A. terreus.

Fonte: (A) elaborado pela autora; (B) MycoBank, 2016.

Os componentes utilizados para o preparo do meio estão descritos à seguir. O


meio de cultura depois de preparado foi esterilizado em autoclave a 120 ºC e 1 atm,
durante 20 min.

 Extrato de malte 2 % ............................................................ 2,00 g

 Peptona 1 % ............................................................ 1,00 g

 Glicose 4 % ............................................................ 4,00 g

 Ágar 4 % ............................................................ 4,00 g

 Água destilada q.s.p. ............................................................ 100 mL

Depois dos tubos de ensaio contendo 8 mL do meio de cultura estarem prontos


e esterilizados, eles foram mantidos inclinados até resfriarem. Após essa etapa, o
fungo, com o auxílio de uma alça de inoculação foi repicado nos tubos e incubados
em estufa a 28 ºC por 7 dias.
As culturas de 7 dias foram utilizadas para a obtenção da biomassa peletizada
(pellets - forma paramorfogênica física). A produção de biomassa seguiu o método
descrito por Marcanti-Contato et al. (1997) modificado. Para esse procedimento foi
80

utilizado o meio líquido de Vogel (VOGEL, 1956), suplementado com 2 % de sacarose.


Para o preparo desse meio, utilizou-se uma solução de elementos traços em água
destilada. A esta solução acrescentou-se 1,0 mL de clorofórmio como agente
antimicrobiano.
Solução de elementos traços:
 Ácido cítrico . H2O ............................................................ 5,00 g

 ZnSO4 . 7H2O ............................................................ 5,00 g

 Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O ........................................................... 1,00 g

 CuSO4 . 5H2O ............................................................ 0,25 g

 MnSO4 . H2O ............................................................ 0,005 g

 H3BO3 ............................................................ 0,005 g

 Na2MoO4 . 2H2O ............................................................ 0,005 g

 Água destilada q.s.p. ............................................................ 100 mL

A solução de Vogel foi preparada a partir da dissolução dos sais descritos a


seguir em água destilada.

 Citrato de sódio .5H2O ........................................ 15,0 g

 KH2PO4 ........................................ 25,0 g

 NH4NO3 ........................................ 10,0 g

 MgSO4 . 7H2O ........................................ 1,00 g

 CaCl2 . 2H2O ........................................ 0,50 g

 Solução de biotina (0,1 mg mL-1) ........................................ 0,50 mL

 Solução de elementos traços ........................................ 0,50 mL

 Água destilada q.s.p. ........................................ 100 mL

Após o preparo foi adicionado 0,2 mL de clorofórmio a essa solução como


agente antimicrobiano, que, em seguida, foi estocada sob refrigeração a 4 ºC.
81

Para o preparo do meio de cultura líquido, a solução de Vogel foi diluída 50


vezes (1 mL solução de Vogel : 49 mL de água destilada), suplementada com
sacarose na concentração de 2 % como fonte de carbono.

A obtenção da forma paramorfogênica física do fungo se deu em duas etapas,


descritas a seguir.

Etapa 1: consistiu na preparação de um pré-inóculo produzido a partir do


fracionamento dos micélios do fungo. Para o preparo desse pré-inóculo em 10 frascos
Erlenmeyers contendo 100 mL de solução de Vogel suplementada com 2 % de
sacarose, foi adicionado 10 g de cilindros de vidro com diâmetro aproximado de 0,4 –
0,6 cm. Os frascos foram esterilizados em autoclave por 20 min a 120 ºC e 1 atm.
Após essa etapa, foi inoculada em cada frasco uma suspensão de esporos na
concentração de 107 esporos mL-1, preparada a partir de culturas de 7 dias que
cresceram em meio extrato de malte 2 % modificado. Realizado esse processo, 10
mL de cada suspensão de esporos foi utilizada como inóculo. Para que ocorresse o
fracionamento dos micélios, esse pré-inóculo permaneceu sob agitação a 180 rpm em
temperatura ambiente por 24 h.

Etapa 2: nessa etapa 10 frascos Erlenmeyers contendo 100 mL de solução de Vogel


suplementada com 2 % de sacarose foi esterilizado, e em seguida, 15 mL de cada
pré-inóculo foi transferido assepticamente para esses frascos, que foram mantidos
sob agitação a 215 rpm por 72 h. Após as 72 h de cultivo os pellets foram filtrados e
lavados com água destilada estéril gelada até a remoção de todo meio de cultura. A
biomassa formada foi conservada em suspensão em água destilada, sob refrigeração
a 4 ºC, até a sua utilização nos tratamentos microbiológicos.

Na Figura 4 é possível observar um esquema geral da produção dos pellets


miceliais.
82

Figura 4 – Esquema da produção de biomassa fúngica (pellets miceliais).

Fonte: Marcanti-Contato et al. (1997).

2.2.2 Saccharomyces cerevisiae

A título de comparação de sistemas microbiológicos, também foi realizado


tratamento de degradação dos corantes com a levedura Saccharomyces cerevisiae
(Figura 5), obtida a partir de fermento biológico seco instantâneo Fleischmann® lote
241.
83

Figura 5 – (A) Imagem do fermento biológico seco; (B) imagem de microscopia


eletrônica da levedura S. cerevisiae.

Fonte: (A) elaborado pela autora; (B) MycoBank, 2017.

Para melhor quantificação da biomassa de levedura a ser utilizada nos


tratamentos, as células foram imobilizadas em alginato. Para o processo de
imobilização foi preparado uma solução de cloreto de cálcio (CaCl2) 0,1 M e gel de
alginato com concentração de 1,5 %. A solução de CaCl2 foi refrigerada para ser
utilizada posteriormente. Foram misturados 25 mL de suspensão de levedura na
concentração de 10 % e 25 mL de ácido algínico, e com o auxílio de uma bureta, essa
mistura foi gotejada em 400 mL de solução de CaCl2 refrigerada, sob agitação,
obtendo-se assim as esferas de levedura imobilizada em alginato.

2.2.3 Obtenção do peso seco dos micro-organismos

Foi necessária para a quantificação de biomassa utilizada nos tratamentos de


biodegradação, a obtenção do peso seco dos pellets miceliais do fungo A. terreus e
das esferas da levedura S. cerevisiae imobilizada em alginato. Para o fungo A. terreus
a análise, foi realizada em triplicata, onde em cada cadinho com peso previamente
determinado foi adicionado 1 mL de suspensão de pellets miceliais.

O peso seco das esferas de alginato de cálcio, com e sem S. cerevisiae


imobilizada, também foi realizado em triplicata, e em cada um dos cadinhos foram
adicionadas 20 esferas, ou seja, 3 cadinhos com 20 esferas de alginato e 3 cadinhos
com 20 esferas de levedura imobilizada no alginato. A biomassa de levedura
84

imobilizada foi calculada a partir de diferença de peso entre as esferas com e sem a
levedura.

Depois de preparados, os cadinhos foram mantidos em estufa de secagem a


105 ± 1 ºC por 24 h, ou até obtenção de peso constante. Ao final do período de
secagem, os cadinhos foram transferidos para um dessecador até resfriarem e, logo
em seguida, foram pesados em balança do tipo analítica0. As biomassas secas
obtidas foram determinadas em mg mL-1.

2.3 Determinação de proteínas totais

Considerando que nos tratamentos microbiológicos dos corantes o complexo


enzimático produzido pelos micro-organismos é o principal agente de biodegradação
molecular (SEM et al., 2016), esse teste teve como objetivo quantificar as proteínas
totais produzidas no meio reacional e determinar o pico de produção dessas proteínas.

O método utilizado foi o colorimétrico de Lowry (LOWRY et al., 1951). Esse é o


método mais utilizado para estimar concentração de proteínas devido a sua alta
sensibilidade e facilidade de execução, podendo ser realizado em diferentes meios de
cultura. Ele consiste na adição de hidróxido de sódio e carbonato de cálcio a uma
mistura contendo proteínas, além de sulfato de cobre e tartarato de sódio potássio.
Durante o processo de determinação surge uma coloração azul correspondente a
reação da proteína com o íon cobre em solução alcalina. Acrescenta-se em seguida
o reagente de Folin-fenol Ciocalteau. Este reagente sofre uma redução quando reage
com proteínas na presença do catalisador cobre (II), produzindo um composto de
absorção máxima em 660 nm (ZAIA et al., 1998; MIWA, 2003).

O procedimento foi realizado utilizando amostras do meio de cultura contendo


biomassa peletizada do fungo A. terreus e da levedura S. cerevisiae imobilizada em
alginato, cultivados durante 30 dias, em meio líquido de Vogel, suplementado com 2
% de sacarose. Os meios foram os mesmos utilizados nos estudos de biodegradação.
As análises foram realizadas em intervalos de 72 h.

O método foi realizado a partir de dois reagentes, o reagente A e o reagente de


Folin-fenol Ciocalteau. O reagente A foi composto de:
85

 Na2CO3 2 % em NaOH 0,1 N .................................................................100 mL


 CuSO4 1 % ............................................................................................1,00 mL
 Tartarato Na e K 1 % .............................................................................1,00 mL

Em seguida, o teste foi preparado adicionando-se 0,2 mL de amostra a um tubo


de ensaio e 0,8 mL de água destilada. Posteriormente foi adicionado 5 mL do reagente
A, recém preparado. A solução foi agitada e permaneceu em repouso durante 15 min.
Decorrido o tempo de reação da amostra com o reagente A, adicionou-se o reagente
de Folin-fenol Ciocalteau diluído 1:1 com água destilada. Os tubos foram novamente
agitados e o tempo de reação foi de 30 min. Ao final do teste, as soluções foram
analisadas espectrofotometricamente no comprimento de onda de 660 nm. O teste foi
realizado em triplicata para cada tempo analisado.

A curva de calibração foi determinada a partir de uma suspensão proteica de


soro albumina bovina (SBA) com concentrações conhecidas variando de 5 a 150 µg
mL-1 de proteínas.

2.4 Eletrólises

Para a realização das eletrólises foi utilizado uma célula do tipo filtro prensa
descrita no item do 2.5. capitulo 1.

As eletrólises foram realizadas utilizando o equipamento


potenciostato/galvanostato Eco Chemie modelo AUTOLAB PGSTAT30 com corrente
constante de 50 mA cm-2, durante 1 h. As soluções tratadas foram mantidas em fluxo
constante de 10 mL min-1. O volume inicial de solução a ser tratada foi igual a 150 mL,
concentração de 100 mg L-1 e eletrólito suporte Na2SO4 0,02 mol L-1.

2.5 Tratamentos microbiológicos

Os tratamentos de biodegradação (Figura 6) foram conduzidos em Erlenmeyers


de 125 mL contendo 50 mL de solução de corante na concentração de 100 mg L -1,
86

com solução de sais de Vogel e, suplementada com 2 % de sacarose. Os frascos


foram esterilizados a 120 ºC e 1 atm por 20 min. Após esse processo, foram
transferidos assepticamente para cada frasco o volume de suspensão de biomassa
necessária para obtenção de uma concentração igual a 3 mg mL-1 de pellets miceliais
ou esferas de levedura imobilizada em alginato. Por fim os frascos foram incubados
em estufa de cultivo a 30 ± 1 ºC, por 12 dias. Foram preparados 2 frascos Erlenmeyers
para cada tempo de tratamento testado.

As análises foram realizadas em intervalos de 72 h. As amostras retiradas


foram filtradas em membrana Whatman® (composição: celulose regenerada),
tamanho de poro de 0,45 µm e 47 mm de diâmetro, para remoção da biomassa
microbiológica. Decorrido esse processo as soluções foram submetidas a análises de
espectrofotometria UV-Vis, FTIR, HPLC-UV/Vis, toxicidade aguda com L. sativa e
tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato. Período total de
análise igual a 12 dias.

Figura 6 – Esquema geral do teste de biodegradação com o fungo A. terreus e com


a levedura S. cerevisiae.

Fonte: elaborado pela autora.


87

As análises UV-Vis foram realizadas em espectrofotômetro Shimadzu


Ultravioleta – Visível (UV-Vis) modelo 2401 PC, na região de 720 a 240 nm, em cubeta
de quartzo com caminho óptico de 5 mm, e permitiram determinar a % de remoção
dos corantes em solução após os tratamentos de degradação. A calibração do
equipamento foi realizada utilizando água destilada como referência.

A partir dos espectros de absorção UV-Vis obtidos, também foi possível a


realizar cálculos de absorbância relativa, que é um método rápido para determinar
qual processo de remoção de corantes, biodegradação e biossorção, está sendo
predominante no meio reacional durante os tratamentos de descoloração. Sendo
assim as absorbâncias relativas, respectivamente, para os corantes Acid Blue 161 e
Procion Red MX-5B foram calculadas pela razão das absorbâncias
Abs602nm/Abs323nm e Abs538nm/Abs327 (GLENN; GOLD, 1983; ALMEIDA;
CORSO, 2016).

2.6 Teste de toxicidade aguda com L. sativa

O teste foi conduzido de acordo com a metodologia proposta por Sobrero e


Ronco (2008), em placas de Petri, em câmara climática BOD a 21 ± 1 ºC ao abrigo de
luz, por 120 h. Metodologia completa foi descrita no capítulo 1, item 2.3.

2.6.1 Análises estatísticas

Os dados de crescimento radicular (cm) das plântulas de L. sativa antes e após


os tratamentos de descoloração, foram analisados estatisticamente utilizando o
software BioEstat 5.0, pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis (Dunn), a 5 % de
probabilidade (p<0,05) (MORAES JR; BIDOIA, 2015; AGUIAR et al., 2016). O teste
foi escolhido pelo fato, dos dados obtidos não apresentarem distribuição normal.

2.7 Análises FTIR


88

As análises de FTIR das soluções dos corantes antes e após os tratamentos


de descoloração, foram realizadas em espectrofotômetro IR com transformada de
Fourier Shimadzu modelo FTIR-8300. As soluções testadas foram colocadas em
cadinhos previamente identificados e, mantidas em estufa de secagem a 105 ºC por
48 h. Decorrido esse intervalo de tempo os cadinhos foram transferidos para um
dessecador, onde permaneceram a vácuo por 24 h. Após esses processos, foram
preparadas pastilhas contendo 1 mg de solução de corante (em peso seco) e 149 mg
de brometo de potássio (KBr) compactadas a 30 kN por 5 min. As leituras foram
realizadas em intervalos de 4000 a 400 cm -1, 16 varreduras e resolução de 4 cm-1
(VITOR; CORSO, 2008; ALMEIDA; CORSO, 2014)

2.8 Análises de HPLC-UV/Vis

As análises de cromatografia liquida de alta eficiência, foram realizadas pelo


método de fase reversa em um cromatógrafo LC Shimadzu modelo 6 AD, com
Detector Arranjo de Diodo UV-Vis modelo SPD-10AVP, bomba modelo LC-20AT, e
forno modelo CTO-10ASVP.

Para detecção de compostos amino aromáticos, os corantes foram monitorados


antes e após os tratamentos de descoloração, utilizando uma coluna de Separação
Shim-pack CLC-ODS(M)® C18 Shimadzu, com dimensões de 4.6 x 250 nm, tamanho
de partícula de 5 µm, a partir da técnica de Espectrofotometria UV-Vis nos
comprimentos de onda de 254 nm (CARVALHO et al., 2008; JONSTRUP et al., 2011)
para o Acid Blue 161 e 292 nm (SILVERSTEIN et al., 1994) para o Procion Red MX-
5B. Na região do visível, as soluções foram analisadas em 602 e 538 nm,
respectivamente para os corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B. Esses
comprimentos de onda são correspondentes aos grupos cromóforos dos corantes.

A temperatura do forno foi regulada para 35 ºC com fase móvel composta por
uma mistura de metanol e água em diferentes proporções para as soluções
analisadas. As proporções da fase móvel foram respectivamente iguais a 65 %
metanol e 3 5% água para o corante Acid Blue 161 e, 35 % metanol e 65 % água para
o corante Procion Red MX-5B. As análises nos comprimentos de onda do visível
tiveram duração de corrida igual a 25 min e, no ultravioleta de 15 min. Como
89

modificadores de fase utilizou-se ácido acético/trietilamina 0,1 % e, o fluxo da fase


móvel foi igual a 1 mL min-1.

Antes de serem injetadas no equipamento, as amostras passaram por um filtro


de celulose regenerada de 0,45 µm, diâmetro de 25 mm, com o objetivo de reter
qualquer material particulado que pudesse estar presente na amostra, evitando assim
a contaminação da coluna.

2.9 Adsorção de toxinas por argila branca imobilizada em ácido algínico

A argila branca, conhecida como bentonita é amplamente utilizada na


agropecuária, onde é adicionada a rações dos animais a fim de adsorver e neutralizar
micotoxinas que são potencialmente tóxicas (LOPES et al., 2006; SOBRANE FILHO,
2014). Visando a detoxificação das soluções ao final dos tratamentos e tendo
conhecimento da grande capacidade adsortiva desse material, foi realizado teste de
adsorção com argila branca, com o objetivo de remover possíveis toxinas produzidas
pelos micro-organismos, bem como metabólitos secundários produzidos a partir da
degradação das moléculas dos corantes. A argila foi imobilizada em alginato, a fim
de se evitar a etapa de centrifugação, após o tratamento adsortivo.

Para tanto, foi utilizada uma suspensão de argila com concentração igual a 10
% e a metodologia seguida foi a mesma descrita no item 2.1.2. deste capítulo. As
esferas de argila imobilizada em alginato podem ser visualizadas na Figura 7.

Figura 7 – Esferas de argila branca imobilizada em alginato.

Fonte: elaborado pela autora.


90

Para determinar a quantidade de argila que ficou retida em cada esfera, após
o processo de imobilização, foi realizado o peso seco das esferas de alginato de sódio
com e sem argila. A obtenção desse dado foi necessária para quantificar a biomassa
de argila utilizada no tratamento. A metodologia para essa análise foi a mesma
descrita no item 2.1.3 deste capítulo.

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1 Obtenção do peso seco dos pellets miceliais e das células de levedura
imobilizada em alginato

A quantificação em mg mL-1 de biomassa peletizada seca do fungo A. terreus


presente em 1 mL de suspensão de pellets miceliais, foi realizada para que fosse
possível calcular o volume de suspensão necessário para chegar a concentração de
biomassa de 3 mg mL-1 utilizada nos testes de biodegradação. Admitindo-se que a
suspensão de pellets é homogênea e que não houve diferença de pipetagem, em 1
mL de suspensão, foi obtido 14,5 mg de biomassa peletizada seca.

Para a levedura imobilizada em alginato quantificou-se a biomassa de células


que ficaram retidas em 20 esferas, e obtivemos o valor de 91,3 mg de células de
levedura. A partir desse resultado foi possível estimar quantas esferas seriam
necessárias para obtenção de uma concentração de biomassa igual a 3 mg mL-1.

3.2 Quantificação das proteínas totais

A quantificação das proteínas totais produzidas pelos dois micro-organismos


testados, foi realizada a partir de uma suspensão proteica de soro albumina bovina. A
curva de calibração com concentrações conhecidas, variando de 5 a 150 µg mL-1 de
proteínas, pode ser observada na Figura 8.
91

Figura 8 – Curva de calibração para quantificação de proteínas totais produzida pelo


fungo A. terreus e pela levedura S. cerevisiae.

Fonte: elaborado pela autora.

O principal objetivo desse teste foi verificar o pico de produção de proteínas


para cada micro-organismo. A partir desses dados foi possível determinar a duração
do tratamento de biodegradação, pois as proteínas presentes no meio reacional estão
diretamente relacionadas à degradação dos corantes, ou seja, quanto maior a
quantidade de proteínas, maior é a concentração de enzimas responsáveis pela
degradação das moléculas. O pico de produção para o fungo A. terreus ocorreu em
12 dias (288 h) de fermentação, onde foi obtido 24,3 µg mL-1, sendo que, a partir de
15 dias (360 h) iniciou-se a redução da concentração de proteínas no meio. Para a
levedura S. cerevisiae imobilizada em alginato, o pico de produção se deu com 6 dias
(144h) de tratamento, produzindo cerca de 75,3 µg mL-1 de proteínas totais e, a partir
de 9 dias (216 h) iniciou-se a queda dessa produção.

Quando compara-se os resultados obtidos, é possível verificar que a produção


de proteínas totais pela levedura foi 3 vezes maior que a produção fúngica em 6 dias
92

de fermentação. Essa característica pode ser justificada pelo fato de que em


quantidades iguais de biomassa, a levedura possui maior número de células, além do
fato desse micro-organismo apresentar maior atividade metabólica, em relação ao
fungo filamentoso.

Sendo assim, visando a eficiência dos tratamentos, e para que fosse possível
comparar os dados obtidos para cada micro-organismo, o teste de biodegradação foi
realizado por um período de 12 dias, que foi o período onde o fungo apresentou maior
produção de proteínas totais. Observando a Figura 9 e 10, é possível verificar,
respectivamente, a produção de proteínas totais pelo fungo A. terreus e pela levedura
S. cerevisiae, durante 30 dias de fermentação.

Figura 9 – Concentração de proteínas totais produzida (µg mL-1) pelo fungo A.


terreus durante 30 dias de fermentação, em meio de solução de sais de Vogel
enriquecido com 2 % de sacarose.

Fonte: elaborado pela autora.


93

Figura 10 – Concentração de proteínas totais produzida (µg mL-1) pela levedura S.


cerevisiae durante 30 dias de fermentação, em meio de solução de sais de Vogel
enriquecido com 2 % de sacarose.

Fonte: elaborado pela autora.

3.3 Tratamentos de degradação

3.3.1 Acid Blue 161

3.3.1.1 Descoloração

Os tratamentos de descoloração foram realizados com o fungo A. terreus e com


a levedura S. cerevisiae, com e sem pré-tratamento de oxidação eletroquímica. As
soluções compostas pelo corante Acid Blue 161 com concentração inicial de 100 mg
L-1 foram analisadas antes e após 72, 144, 216 e 288 h de tratamento com os micro-
94

organismos. Sendo assim, ao final de 288 h de tratamento obteve-se 96 % de


descoloração para o sistema composto pelo fungo filamentoso e 94 % para o sistema
com a levedura. Evidenciando que para o tratamento exclusivamente microbiológico,
quanto à descoloração não ocorreu diferenças entre os dois micro-organismos.

O pré-tratamento de oxidação eletroquímica para esse corante conseguiu


remover, ao final de 1 h, 37 % da coloração inicial da solução. Ao final das 288 h de
tratamento com os micro-organismos ambas soluções ficaram completamente
descoloridas. Na Figura 11 pode-se observar os resultados de descoloração e
absorbância relativa do corante Acid Blue 161 após os tratamentos.

Figura 11 – Dados de descoloração corante Acid Blue 161. (A) tratamento


microbiológico; (B) absorbância relativa tratamento microbiológico; (C) tratamento
eletroquímico/microbiológico; (D) absorbância relativa tratamento
eletroquímico/microbiológico.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1; λ = 602 nm.


Fonte: elaborado pela autora.
95

De acordo com Glenn e Gold (1983) a análise de absorbância relativa permite,


a partir de espectros de UV-Vis, verificar de forma rápida alterações moleculares de
corantes, antes e após tratamentos de descoloração. Para tanto, admite-se que, se
não ocorrer alteração desses valores, o processo predominante no meio reacional é
o de adsorção/biossorção, enquanto que, se ocorrerem alterações significativas dos
resultados de absorbância relativa no decorrer do tratamento, inferindo que o
processo de remoção do corante predominante no meio é o de biodegradação.

Analisando a Figura 11 (imagens B e D) pode-se afirmar que, apesar de ambos


tratamentos serem eficientes quanto à descoloração das soluções, o sistema
composto pela levedura foi o que apresentou maiores alterações dos valores de
absorbância relativa, principalmente nas primeiras 72 h de tratamento, evidenciando
a capacidade desse micro-organismo para degradar as moléculas do corante Acid
Blue 161.

Na Figura 12 verifica-se a biomassa peletizada do fungo A. terreus e os as


esferas de levedura S. cerevisiae imobilizada em alginato, ao final dos tratamentos de
descoloração. A coloração presente nos pellets e nas esferas de levedura confirma
que ocorreu, além da biodegradação, processo biosortivo/adsortivo do corante pelos
micro-organismos.

A presença de intensa coloração nas biomassas microbianas indica que existe


alta afinidade das moléculas do corante Acid Blue 161 pela parede celular desses
micro-organismos, que é rica em componentes lipídicos e heteropolissacarídeos, que
possuem diferentes grupos funcionais, incluindo grupos aminos, carboxilas, hidroxilas,
fosfato e outros grupos carregados, que causam fortes forças de atração entre a
molécula do azo corante e a parede celular dos micro-organismos (SOLÍS et al., 2012).

Ainda nesta mesma Figura, imagem A, é possível verificar a presença de


alguns pellets do fungo A. terreus com coloração mais intensa. Células mortas não
possuem barreiras de resistência contra o processo biossortivo, então, acredita-se
que as células que compõem esses pellets estejam mortas e, apresentaram grande
capacidade de remoção dessas moléculas do meio reacional (SALVI;
CHATTOPADHYAY, 2017).
96

Figura 12 – (A) Pellets miceliais do fungo A. terreus e (B) esferas de levedura S.


cerevisiae imobilizadas em alginato, após 288 h de interação com o corante Acid
Blue 161.

Fonte: elaborado pela autora.

Vatandoostarani et al. (2017) relataram a degradação do corante Methyl Red


pela levedura S. cerevisiae, e também enfatizaram a grande capacidade desse micro-
organismo na degradação desse tipo de composto orgânico. Os autores também
destacaram o fato desse tipo de biomassa ser produzida a partir de matérias-primas
baratas, e o sistema empregado para descoloração serem facilmente empregados e
manipulados. Em condições especificas de meio de cultura, temperatura, pH e
utilização de células livres, os autores conseguiram remover 99 % da cor da solução
de corante, com concentração inicial de 200 mg L-1 em 24 h de tratamento com a
levedura.

3.3.1.2 Análises de FTIR

Análises de FTIR permitem observar a presença de diferentes grupos


funcionais (–N=N–, –NH2, –NH, –OH, –SO3-, –C–Cl, –COO- e núcleos aromáticos) na
estrutura molecular de moléculsas orgânicas. O surgimento ou desaparecimento de
muitas bandas características desses grupos funcionais indicam alterações
moleculares que ocorreram nessas substâncias, após os tratamentos de degradação
aos quais foram submetidas (ARAVIND et al., 2016).
97

Sendo assim, as análises de FTIR das soluções do corante Acid Blue 161,
antes e após os tratamentos, foram realizadas na forma de pastilhas de KBr, na
proporção de 1 mg de amostra para 149 mg de sal de KBr. Na Figura 13 é possível
observar os espectros de FTIR das soluções tratadas pelo fungo A. terreus em
sistemas com e sem pré-tratamento de oxidação eletroquímica. As principais bandas
desses espectros também podem ser visualizadas.
98

Figura 13 – Espectros de FTIR das soluções (A) controle do corante Acid Blue 161,
(B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento A. terreus e eletroquímico/A. terreus.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1.


Fonte: elaborado pela autora.

Para os tratamentos com o fungo A. terreus, ao analisar os espectros, verificou-


se que ocorreu aumento das bandas nas regiões de 3450 e 2924 cm-1 que são
99

características da presença de ligações do tipo –OH (COATES, 2000), –NH (AYED et


al., 2010; TELKE et al., 2010), e aminas aromáticas (COATES, 2000), no tratamento
exclusivamente microbiológico, após 144 h de exposição a biomassa fúngica, sendo
que, esse aumento foi mais expressivo após 288 h. Essas alterações nos levam a
inferir que ocorreu degradação da molécula inicial e, consequente, formação de
metabólitos secundários, como por exemplo, aminas aromáticas secundárias e grupos
fenólicos.

Na região em 1141 cm-1 verifica-se a presença de uma banda muito intenso


após o tratamento de oxidação eletroquímica, que é característico de ligações –CO
do grupo naftol (ARAVIND et al., 2016), e presença de grupos sulfônicos. Ele
desaparece após o tratamento microbiológico, indicando biodegradação desses
intermediários que foram formados após o pré-tratamento oxidativo.

A banda que surge na região em 1342 cm-1 nos tratamentos microbiológicos de


216 e 288 h, e no tratamento eletroquímico/A. terreus de 288 h indica deformação
angular da ligação –CO, presença de compostos sulfonados (COATES, 2000) e
deformação de grupos –OH (IYIM et al., 2008).

Em todos os tratamentos ocorreu intensificação da banda na região espectral


de 1049 cm-1, característica de deformação angular de –CH, presença de grupos
fenólicos e sulfônicos (OLUKANNI et al., 2010), além de estiramento da ligação –CO
(COATES, 2000), sendo que o aumento dessa região foi mais expressivo a partir de
144 h do tratamento somente com o fungo A. terreus.

As alterações evidenciadas na região espectral de 1641 a 1417 cm -1 (JADHAV


et al., 2008, OLUKANNI et al., 2010), são características de agrupamentos azo e
aminos, indicando a presença desses metabólitos na solução tratada. Enquanto que
as alterações na região de 900 e 623 cm-1 são indicativos de significativas mudanças
estruturais que ocorreram nos núcleos aromáticos das moléculas (POLUNIN et al.,
2008, EL-KABBANY et al., 2011). Observa-se que em relação ao tratamento com o
fungo A. terreus, o tratamento eletroquímico/A. terreus foi o que apresentou maiores
alterações nessa região, indicando maior capacidade de degradação dos núcleos
aromáticos pelo após o pré-tratamento de oxidação eletroquímica.

Quanto ao tratamento realizado com a levedura S. cerevisiae os espectros de


FTIR, antes e após os tratamentos, podem ser visualizados na Figura 14.
100

Figura 14 – Espectros de FTIR das soluções (A) controle do corante Acid Blue 161,
(B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento S. cerevisiae e eletroquímico/ S. cerevisiae.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1.


Fonte: elaborado pela autora.
101

Observando a Figura 14, verifica-se a presença de estiramentos das ligações


–OH e –NH nas regiões de 3450 e 2924 cm-1. Em 2924 cm-1 ainda pode-se visualizar
estiramento de grupos metilenos (–CH) (EDISON et al., 2016).

Grupos funcionais do tipo –C=O e –NH2, característicos de intermediários


formados após a degradação da molécula inicial de corantes como amidas e aminas,
encontram-se na região de 1741 e 831 cm -1 (ARAVIND et al., 2016). Nota-se que a
banda em 1741 cm-1 surge em ambos tratamentos após as primeiras 72 h de contato
com a levedura, e permanece presente no tratamento exclusivamente microbiológico
após 216 h. Já no tratamento microbiológico com pré-tratamento eletroquímico, após
144 h essa banda desaparece, indicando melhor capacidade de degradação dos
metabólitos formados pelo sistema eletroquímico/S. cerevisiae. Ao final das 288 h
essa banda desaparece em ambos tratamentos. Esse foi o mesmo padrão
apresentado pelo sistema composto pelo fungo A. terreus, o que é muito interessante,
visto que a formação e persistência desses compostos no meio reacional é indesejável
devido à alta toxicidade que possuem.

A banda em 1141 cm-1, característico de ligações –CO do grupo naftol


(ARAVIND et al., 2016) e presença de grupos sulfônicos (DYER, 1969), desaparece
completamente após as primeiras horas de tratamento com a levedura, indicando
quebra dessas ligações. Também surge após o início do tratamento microbiológico
com a levedura, uma banda em 1384 cm-1, que é característico da presença de íons
nitratos, que são metabólitos característicos de compostos que possuem nitrogênio
em suas moléculas (EDISON et al., 2016).

Para o tratamento S. cerevisiae com pré-tratamento de oxidação eletroquímica,


ocorreu expressivo aumento da banda em 1128 cm-1 a partir de 144 h de tratamento,
que é característico da presença de ligações do tipo –CO presentes em ácidos
alifáticos, como por exemplo, os ácidos propanóico e pentanóico (ARAVIND et al.,
2016), que são subprodutos finais da degradação de moléculas orgânicas.

3.3.1.3 Análises de HPLC-UV/Vis


102

Análises de HPLC-Vis também foram realizadas, e nas Figuras 15 e 16 é


possível verificar os cromatogramas das soluções de Acid Blue 161, antes e após os
tratamentos de degradação com o fungo A. terreus e com a levedura S. cerevisiae. As
leituras foram realizadas na região do visível no comprimento de onda de 602 nm.

Figura 15 – Cromatogramas de HPLC-Vis das soluções de Acid Blue 161 antes e


após os tratamentos (A) microbiológico com A. terreus e (B) eletroquímico/A. terreus.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1; λ = 602 nm.


Fonte: elaborado pela autora.
103

Figura 16 – Cromatogramas de HPLC-Vis das soluções de Acid Blue 161 antes e


após os tratamentos (A) microbiológico com S. cerevisiae e (B) eletroquímico/ S.
cerevisiae.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L1; λ = 602 nm.


Fonte: elaborado pela autora.

Analisando os cromatogramas da solução controle é possível observar 3 picos


máximos de retenção em 5,9, 8,5 e 10,9 min, que tiveram redução da área integrada
respectivamente iguais a 82, 88 e 82 %, após 1 h de tratamento de oxidação
104

eletroquímica. Para os sistemas microbiológicos com o fungo filamentoso e a


levedura, ao final das 288 h os picos desapareceram, confirmando os resultados das
análises de espectrofotometria UV-Vis e indicando que a molécula inicial do corante
foi degradada e/ou removida via processo adsortivo pela biomassa microbiana.

As análises de HPLC-UV em 254 nm indicam aumento do pico em 3,42 min


após os tratamentos. Essa é uma região característica da presença de aminas
primárias e secundárias (CARVALHO et al., 2008; JONSTRUP et al., 2011; ALMEIDA;
CORSO, 2016). Na Figura 17 e 18 verifica-se as alterações dos cromatogramas das
soluções antes e após os tratamentos de descoloração com o fungo A. terreus e com
a levedura S. cerevisiae, respectivamente.
105

Figura 17 - Cromatogramas de HPLC-UV das soluções (A) controle Acid Blue 161,
(B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento microbiológico com o fungo A. terreus com e sem pré-tratamento
eletroquímico.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1; 1 λ = 254 nm.


Fonte: elaborado pela autora.
106

Figura 18 - Cromatogramas de HPLC-UV das soluções (A) controle Acid Blue 161,
(B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento microbiológico com a levedura S. cerevisiae com e sem pré-tratamento
eletroquímico.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1; λ = 254 nm.


Fonte: elaborado pela autora.
107

A partir dos cromatogramas obtidos no comprimento de onda em 254 nm, foi


possível realizar análise das áreas integradas do pico em 3,42 min para os
tratamentos microbiológicos, com e sem pré-tratamento de oxidação eletroquímica.
Esses dados podem ser observados na Figura 19.

Figura 19 – Valores da área integrada do pico em 3,42 min para cada tratamento de
degradação testado.

Nota: área integrada do pico em 3,42 min do tratamento eletroquímico = 1333,1.


Fonte: elaborado pela autora.

Analisando os resultados obtidos para a variação de valor da área integrada do


composto eluído em 3,42 min, compilados na Figura 19, observou-se, que em todos
os tratamentos ocorreu aumento desses valores, indicando intensa degradação da
molécula inicial e consequente produção de metabólitos secundários do tipo amino
aromáticos. Sendo que, esse aumento foi mais expressivo no tratamento
exclusivamente microbiológico, utilizando o sistema com a levedura S. cerevisiae
imobilizada em alginato. Essa característica indica alta capacidade de degradação da
108

levedura, mas baixo poder de mineralização dos metabólitos intermediários formados,


provavelmente devido ao alto potencial de toxicidade desses subprodutos para as
células do micro-organismo.

Rawat et al. (2018) estudaram a degradação do corante Acid Orange 7, que é


um corante com estrutura molecular semelhante ao corante Acid Blue 161. A
degradação das moléculas do corante foi realizada a partir de um consórcio
microbiano e, comparando espectros de FTIR antes e após o tratamento, os autores
destacam a produção de aminas aromáticas como metabólitos, após a quebra das
moléculas. Eles também realizaram análises de cromatografia gasosa acoplada a
espectrômetro de massa (GC-MS) e, conseguiram identificar a formação do ácido 4-
aminobenzenosulfônico e moléculas de 1-amino-2-naftol, que é uma potente molécula
amino aromática carcinogênica.

3.3.1.4 Análises de toxicidade aguda e adsorção com argila branca


imobilizada em alginato

Sementes de vegetais superiores têm duas funções principais, reprodução e


dispersão. A produção de sementes completa o processo de reprodução vegetal e, o
processo de germinação é responsável por originar a próxima geração dessas plantas
(KRANNER; COLVILLE, 2011). Durante os primeiros dias de desenvolvimento da
plântula, ocorrem numerosos processos fisiológicos e, é nesse momento que a
presença de substâncias tóxicas pode comprometer o desenvolvimento desses
organismos (SOBRERO; RONCO, 2008).

Reconhecendo a grande sensibilidade que sementes de L. sativa possuem


quando submetidas a presença de substâncias tóxicas (ALMEIDA; CORSO, 2016), foi
realizado teste de toxicidade aguda para avaliar a inibição de crescimento radicular
das plântulas, quando expostas a soluções não tratadas e tratadas do corante Acid
Blue 161.

Na Figura 20, podem ser observados os dados de crescimento radicular (cm)


obtidos após os tratamentos de descoloração, dos sistemas microbiológicos e
eletroquímico/microbiológicos. Os resultados de crescimento para os tratamentos
109

controle negativo (água destilada) e solução de corante sem tratamento de


descoloração, foram respectivamente, iguais a 3,3 ± 0,5 e 2,5 ± 0,6 cm. Analisando
essa Figura, verificou-se que a inibição de crescimento radicular foi menor nos
sistemas envolvendo o fungo A. terreus, demonstrando que esse micro-organismo
possui maior capacidade de degradação dos metabólitos formados após os
tratamentos de descoloração. Nos tratamentos com a levedura, ocorreu expressivo
aumento da taxa de inibição de crescimento das raízes das plântulas de L. sativa,
indicando a presença de compostos nocivos no meio reacional, resultantes da
degradação incompleta das moléculas do corante Acid Blue 161.

Figura 20 – Resultados de crescimento radicular (cm) das plântulas de L. sativa,


após exposição às soluções provenientes dos tratamentos de descoloração,
microbiológicos e eletroquímico/microbiológicos do corante Acid Blue 161.

Fonte: elaborado pela autora.

As análises estatísticas de crescimento radicular, realizadas pelo teste de


Kruskal-Wallis (Dunn), a 5 % de probabilidade (p<0,05), apresentaram diferenças
110

significativas entre os tratamentos de descoloração e o tratamento controle negativo


(água destilada), indicando que os tratamentos de descoloração foram responsáveis
por aumentar a inibição de crescimento radicular das plântulas. Nas Tabelas 1, 2, 3 e
4, observam-se os resultados das análises estatísticas obtidos respectivamente, para
os tratamentos A. terreus, eletroquímico/A. terreus, S. cerevisiae e eletroquímico/S.
cerevisiae.

Tabela 1 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa após o
tratamento de descoloração A. terreus do corante Acid Blue 161.

Controle negativo – Corante sem tratamento n.s.


Controle negativo – 72 h A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 144 h A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 216 h A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 288 h A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h A. terreus p < 0,05
72 h A. terreus – 144 h A. terreus p < 0,05
72 h A. terreus – 216 h A. terreus n.s.
72 h A. terreus – 288 h A. terreus n.s.
144 h A. terreus – 216 h A. terreus p < 0,05
144 h A. terreus – 288 h A. terreus p < 0,05
216 h A. terreus – 288 h A. terreus n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
111

Tabela 2 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa após o
tratamento de descoloração eletroquímico/A. terreus do corante Acid Blue 161.

Controle negativo – Corante sem tratamento n.s.


Controle negativo – 72 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 144 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 216 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 288 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
72 h eletroquímico/A. terreus – 144 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
72 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/A. terreus n.s.
72 h eletroquímico/A. terreus – 288 h eletroquímico/A. terreus n.s.
144 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
144 h A. terreus – 288 h A. terreus p < 0,05
216 h A. terreus – 288 h A. terreus n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
112

Tabela 3 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa após o
tratamento de descoloração S. cerevisiae do corante Acid Blue 161.

Controle negativo – Corante sem tratamento n.s.


Controle negativo – 72 h S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 144 h S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 216 S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 288 h S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h S. cerevisiae p < 0,05
72 h S. cerevisiae – 144 h S. cerevisiae n.s.
72 h S. cerevisiae – 216 h S. cerevisiae n.s.
72 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae n.s.
144 h S. cerevisiae – 216 h S. cerevisiae n.s.
144 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae n.s.
216 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
113

Tabela 4 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa após o
tratamento de descoloração eletroquímico/S. cerevisiae do corante Acid Blue 161.

Controle negativo – Corante sem tratamento n.s.


Controle negativo – 72 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 144 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 144 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s.
72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s.
72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
144 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s.
144 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae terreus p < 0,05
216 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Nas Tabelas 5 e 6, podem ser observados os resultados da análise estatística


para os sistemas microbiológicos e eletroquímico/microbiológicos. Comparando os
tratamentos com o fungo e com a levedura, em sistemas com e sem pré-tratamento
de oxidação eletroquímica, verificou-se diferenças significativas entre os tratamentos,
indicando que os sistemas envolvendo a levedura apresentou maior inibição de
crescimento radicular das plântulas de L. sativa.
114

Tabela 5 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos de descoloração A. terreus e S. cerevisiae do corante Acid Blue 161.

72 h A. terreus – 72 h S. cerevisiae p < 0,05


144 h A. terreus – 144 h S. cerevisiae p < 0,05
216 h A. terreus – 216 h S. cerevisiae p < 0,05
288 h A. terreus – 288 h S. cerevisiae p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Tabela 6 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos de descoloração eletroquímico/A. terreus e eletroquímico/S. cerevisiae
do corante Acid Blue 161.

72 h eletroquímico/A. terreus – 72 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05.


144 h eletroquímico/A. terreus – 144 h eletroquímico/S. cerevisiae n.s.
216 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05
288 h eletroquímico/A. terreus – 288 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

No intuito de reduzir a taxa de toxicidade após os tratamentos de descoloração,


foi realizado o processo de adsorção com argila branca imobilizada em alginato
durante 24 h.

Argilas são adsorventes naturais, formados basicamente por silicatos de


alumínio, ferro ou magnésio hidratado, sendo a argila branca, também denominada
bentonita, a principal representante. É um material poroso, que abriga anéis
tetraédricos de silicato, sendo que, as moléculas tetraédricas formadas por silício e
oxigênio, ficam em uma disposição estrutural onde os oxigênios da base do tetraedro
se ligam, formando uma espécie de folha (JOUANEY, 2007). Essa estrutura é
responsável por tornar esse composto um excelente material adsorvente, que é
amplamente utilizado no setor agropecuário, para detoxificar ração de animais.
Durante o processo de estocagem da ração, ocorre crescimento de fungos
filamentosos, que produzem micotoxinas como metabólitos secundários. Essas
115

toxinas são nocivas para os animais e, a função da argila é adsorver essas moléculas
e, melhorar a qualidade do alimento que é fornecido aos animais (ESCRIVÁ et al.,
2015; KANG et al., 2016)

O processo adsortivo, conseguiu reduzir a toxicidade em todos os tratamentos,


indicando que esse material pode servir como adsorvente de outras substâncias
nocivas, além das micotoxinas. Na Figura 21 é possível verificar os resultados de
inibição de crescimento radicular e concentração de corante remanescente após os
tratamentos microbiológicos e microbiológicos com pré-tratamento de oxidação
eletroquímica.

Analisando essa Figura observa-se que para os tratamentos com o fungo A.


terreus, a toxicidade aguda da solução inicial com concentração igual a 100 mg L-1
sem nenhum tipo de tratamento é nula, e ao final do tratamento microbiológico
verificou-se que ocorreu aumento de aproximadamente 80 % de inibição para o
desenvolvimento das raízes. Para esse tratamento, o processo de adsorção com a
argila conseguiu reduzir a toxicidade final da solução em 52 %.

Quanto ao tratamento eletroquímico/A. terreus a toxicidade final da solução,


foi menor, em relação ao tratamento exclusivamente biológico, apresentando 52 % de
inibição no crescimento das raízes. Após o tratamento adsortivo com argila, obtivemos
uma redução de 15 % desse valor.
116

Figura 21 – Inibição de crescimento radicular e concentração de Acid Blue 161


remanescente, após tratamentos de degradação. (A) A. terreus e A. terreus/argila;
(B) eletroquímico/A. terreus e eletroquímico/A. terreus/argila; (C) S. cerevisiae e S.
cerevisiae/argila; (D) eletroquímico/S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae/argila.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1.


Fonte: elaborado pela autora.

Para os tratamentos com a levedura S. cerevisiae, os resultados de toxicidade


do tratamento exclusivamente microbiológico apresentaram 100 % de inibição de
crescimento das raízes já nas primeiras 72 h de contato com a biomassa microbiana,
se manteve assim até o final das 288 h de tratamento.

Para o tratamento eletroquímico/S. cerevisiae, as taxas de inibição de


crescimento também foram de 100 % nas primeiras 144 h de tratamento, mas a partir
de 216 h de exposição elas começaram a reduzir, ou seja, a partir desse período o
sistema foi capaz de começar a degradar os intermediários tóxicos formados após a
degradação das moléculas do corante.
117

As análises estatísticas para os resultados de crescimento radicular das


plântulas antes e após os tratamentos adsortivos com argila branca imobilizada em
alginato, podem ser visualizadas nas Tabelas 7, 8, 9 e 10, respectivamente, para os
tratamentos A. terreus, eletroquímico/A. terreus, S. cerevisiae e eletroquímico/S.
cerevisiae.

Analisando essas Tabelas, verificou-se que os resultados de crescimento


radicular das soluções com e sem tratamento adsortivo com a argila, foram
estatisticamente diferentes (p < 0,05), confirmando a capacidade da argila para
remover metabólitos tóxicos do meio reacional, favorecendo assim o crescimento
radicular das plântulas de L. sativa.

Tabela 7 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos A. terreus e A. terreus/argila.

72 h A. terreus – 72 h A. terreus/argila p < 0,05


144 h A. terreus – 144 h A. terreus/argila p < 0,05
216 h A. terreus – 216 h A. terreus/argila p < 0,05
288 h A. terreus – 288 h A. terreus/argila p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Tabela 8 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos eletroquímico/A. terreus e eletroquímico/A. terreus/argila.

72 h eletroquímico/A. terreus – 72 h eletroquímico/A. terreus/argila p < 0,05.


144 h eletroquímico/A. terreus – 144 h eletroquímico/A. terreus/argila n.s.
216 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/A. terreus/argila p < 0,05
288 h eletroquímico/A. terreus – 288 h eletroquímico/A. terreus/argila p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
118

Tabela 9 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos S. cerevisiae e S. cerevisiae/argila.

72 h S. cerevisiae – 72 h S. cerevisiae/argila p < 0,05


144 h S. cerevisiae – 144 h S. cerevisiae/argila p < 0,05
216 h S. cerevisiae – 216 h S. cerevisiae/argila p < 0,05
288 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae/argila p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Tabela 10 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos eletroquímico/S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae/argila.

72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 72 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila p < 0,05


144 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 144 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila n.s.
216 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 216 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila p < 0,05
288 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Na Figura 22 é possível observar os cromatogramas de HPLC-UV das soluções


ao final dos tratamentos de descoloração, antes e após o processo adsortivo com a
argila branca imobilizada em alginato. E na Figura 23 verificou-se as variações da área
integrada do pico em 3,42 min no comprimento de onda de 254 nm, antes e após o
tratamento adsortivo.
119

Figura 22 – Cromatogramas HPLC-UV Acid Blue 161, após 288 h de tratamentos de


descoloração (A) A. terreus, (B) Eletroquímico/A. terreus, (C) S. cerevisiae, (D)
Eletroquímico/S. cerevisiae antes e após tratamento adsortivo com argila branca
imobilizada em alginato.

Nota: λ = 254 nm.


Fonte: elaborado pela autora.
120

Figura 23 – Área integrada do pico em 3,42 min, após 288 h de tratamento de


descoloração (A) A. terreus, (B) Eletroquímico/A. terreus, (C) S. cerevisiae, (D)
Eletroquímico/S. cerevisiae antes e após tratamento adsortivo com argila branca
imobilizada em alginato.

Nota: λ = 254 nm.


Fonte: elaborado pela autora.

Analisando essas Figuras, verificou-se que a maior redução da área integrada


do pico em 3,42 min foi para o tratamento exclusivamente microbiológico com o fungo
A. terreus, após o tratamento adsortivo com a argila branca imobilizada em alginato.
O que corrobora os resultados de toxicidade aguda, onde esse mesmo tratamento foi
o que apresentou maior redução de inibição de crescimento radicular plântulas de L.
sativa.

A redução da toxicidade após o processo adsortivo demonstra a alta


capacidade que a argila imobilizada tem para remover metabólitos tóxicos do meio
reacional (LALA et al.; 2015).
121

3.3.2. Procion Red MX-5B

3.3.2.1 Descoloração

As soluções do corante Procion Red MX-5B com concentração inicial de 100


mg L-1 também foram analisadas após 72, 144, 216 e 288 h de contato com os micro-
organismos (A. terreus e S. cerevisiae), em sistemas com e sem pré-tratamento de
oxidação eletroquímica. A descoloração das soluções foi determinada a partir das
análises de espectrofotometria UV-Vis. Os resultados de descoloração e absorbância
relativa para cada um dos sistemas testados podem ser visualizados na Figura 24.

Figura 24 – Dados de descoloração corante Procion Red MX-5B. (A) tratamento


microbiológico; (B) absorbância relativa tratamento microbiológico; (C) tratamento
eletroquímico/microbiológico (D) absorbância relativa tratamento
eletroquímico/microbiológico.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1; λ = 538 nm.


Fonte: elaborado pela autora.
122

Analisando os resultados expressos na Figura 24 é possível afirmar que o


sistema S. cerevisiae atinge quase que o máximo de descoloração já nas primeiras
72 h de tratamento, com aproximadamente 82 % de descoloração, sendo que à
descoloração final foi de 93 %, enquanto que o processo de descoloração do sistema
composto pelo fungo ocorreu de forma mais lenta, indo de 30 % nas primeiras 72 h
até 96 % após 288 h de tratamento.

Quanto a absorbância relativa para os tratamentos exclusivamente


microbiológicos observa-se um padrão de variação semelhante ao de descoloração
entre os sistemas fúngico e da levedura. No tratamento com o fungo A. terreus a
variação dos valores de absorbância relativa ocorre de forma gradativa até o final das
288 h de exposição, indicando processo de degradação mais lento das moléculas do
corante.

No sistema com a levedura S. cerevisiae, a maior alteração do valor de


absorbância relativa ocorreu em 72 h de tratamento e, após esse período, os valores
permaneceram praticamente constantes, indicando que após esse período os
metabólitos formados após a degradação da molécula inicial, provavelmente foram
muito tóxicos para a S. cerevisiae, acarretando na morte das células e, consequente,
redução da atividade metabólica do meio reacional.

De forma geral, as alterações dos valores de absorbância relativa em todos os


tratamentos de descoloração testados, indicam que o processo de remoção do
corante ocorreu predominantemente por biodegradação das moléculas (GLENN;
GOLD, 1983; ALMEIDA; CORSO, 2016).

A diminuição dos valores de absorbância no seu comprimento de onda máximo


em 538 nm no decorrer dos tratamentos microbiológicos, indicou boa capacidade dos
micro-organismos em remover o corante do meio, seja por biodegradação e/ou
biossorção/adsorção das moléculas. O sistema eletroquímico também foi muito
eficiente na descoloração desse corante e, ao final de 1 h de tratamento, removeu
praticamente toda a coloração da solução.

Na Figura 25 pode-se observar os pellets miceliais do fungo A. terreus


completamente coloridos, após interação com o corante. Nessa Figura verifica-se a
presença de alguns pellets com coloração muito mais intensa, assim como ocorreu no
123

tratamento com o corante Acid Blue 161. A hipótese é a de que as células fúngicas
nesses pellets estariam mortas.

Células mortas são utilizadas em tratamentos adsortivos de corantes e, têm


vantagens como biossorventes sobre as células vivas, pois, não requerem nutrientes,
podem ser armazenados durante longos períodos e podem ser regeneradas usando
solventes orgânicos ou surfactantes e não apresentam resistência para impedir o
processo de adsorção do corante a parede celular, aumentando assim a capacidade
adsortiva dessa biomassa (FU; VIRARAGHAVAN, 2001).

Figura 25 – Pellets miceliais do fungo A. terreus após 288 h de interação com o


corante Procion Red MX-5B.

Fonte: elaborado pela autora.

3.3.2.2 Análises de FTIR

A espectroscopia de infravermelho nos permite analisar a estrutura molecular


do corante com um maior número de detalhes, antes e após os tratamentos de
degradação. Na Figura 26 é possível observar os espectros de FTIR das soluções,
antes e após os tratamentos microbiológicos, com e sem pré-tratamento de oxidação
eletroquímica com o fungo A. terreus.
124

Figura 26 – Espectros de FTIR da (A) controle do corante Procion Red MX-5B, (B)
após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento A. terreus e eletroquímico/A. terreus.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1.


Fonte: elaborado pela autora.
125

Nessa Figura, é possível verificar que o espectro de FTIR do corante, após 1 h


de tratamento eletroquímico, apresentou intensas alterações das bandas e, no
decorrer do tratamento microbiológico, essas bandas sofreram redução de
intensidade, indicando possível degradação ou adsorção dos metabólitos formados,
pela biomassa fúngica.

A banda em 1354 cm-1 presente no espectro do tratamento eletroquímico,


corresponde a deformação angular da ligação –CO e presença de grupos sulfônicos
(COATES, 2000). Ela desaparece nos tratamentos seguintes, indicando quebra
dessas ligações.

Em 1435 cm-1, região correspondente a deformação angular das ligações –CH


e deformação assimétrica da ligação –C=C– de anéis aromáticos, ocorre redução de
intensidade da banda no decorrer do tratamento A. terreus (SILVERSTEIN et al.,
1994; VIJAYALAKSHMIDEVI; MUTHUKUMAR, 2015).

Em todos os períodos e tratamentos analisados ocorreu intensificação da


banda na região espectral de 1066 cm-1, que é característica de vibrações da ligação
–NH de aminas (GAO et al., 2010). O aumento da intensidade dessa banda indica
possível quebra da azo ligação do corante, promovida pela ação de enzimas
azoredutases, gerando aminas como metabólitos. Alterações na região espectral de
1641 a 1417 cm-1 também são características de agrupamentos azo e aminos
(JADHAV et al., 2008; OLUKANNI et al., 2010).

É possível observar em todos os espectros alterações na região entre 920 e


800-700 cm-1 característica de compostos aromáticos e ligações –CCl presente nas
moléculas do corante (COATES, 2000; BARBOSA, 2007; POLUNIN et al., 2008; EL-
KABBANY et al., 2011).

A banda em 2927 cm-1 região característica de composto amino aromáticos


(SILVERSTEIN et al., 1994; MANE et al., 2008; AYED et al., 2010), reduz, após o
tratamento eletroquímico, indicando possível oxidação e quebra dos principais
núcleos aromáticos da molécula. Porém, após o contato com a biomassa fúngica,
essa banda volta a se intensificar, indicando que durante o tratamento microbiológico,
ocorreu formação de novos subprodutos aromáticos.
126

A região de 3450 cm-1 indica deformação axial da ligação –OH (SILVERSTEIN


et al., 1994) do grupo fenólico presente na molécula do corante. A redução da banda
nessa região, durante os tratamentos, é devido a degradação das moléculas e,
consequente das ligações envolvendo esse grupo funcional.

Na Figura 27 podem ser observados, os espectros de FTIR das soluções, antes


e após os tratamentos S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae.
127

Figura 27 – Espectros de FTIR da (A) controle do corante Procion Red MX-5B, (B)
após 1 h de tratamento eletroquímico, e (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1.


Fonte: elaborado pela autora.
128

Os espectros de FTIR das soluções, após o tratamento de degradação com a


levedura, apresentaram uma banda em 1642 cm-1, correspondente ao estiramento de
azo ligações (–N=N–), e presença de compostos heteroaromáticos (ARAVIND et al.,
2016; RACLES et al., 2017).

A banda em 1384 cm-1, que surge após o contato com a levedura em ambos
sistemas de tratamento, é característico da presença de íons nitratos (EDISON et al.,
2016) que são intermediários formados após a degradação de compostos
nitrogenados, como é o caso da molécula do corante Procion Red MX-5B. Bandas
nessa região também podem ocorrer pela presença de vibrações de ligações do tipo
–C=O de grupos carbonilas de ácidos carboxílicos (SKORIC et al., 2016).

A região de 1112 e 1107 cm-1, sofreram intensas modificações e são


características da presença de agrupamentos sulfonados (–SO3). A banda em 1136
cm-1, que surge após o tratamento eletroquímico é característico de vibrações de
ligações do tipo –CO de intermediários que foram formados após a etapa de oxidação
das moléculas (ARAVIND et al., 2016).

Em todos os tratamentos, assim como aconteceu no tratamento com o fungo


A. terreus, é possível observar alterações na região entre 930 e 800-700 cm-1
característica de compostos aromáticos e ligações –CCl presentes na molécula do
corante (COATES, 2000; BARBOSA, 2007; POLUNIN et al., 2008; EL-KABBANY et
al., 2011).

3.3.2.3 Análises de HPLC-UV/Vis

As análises de HPLC-Vis foram realizadas em 538 nm e nas Figuras 28 e 29 é


possível verificar os cromatogramas das soluções do corante Procion Red MX-5B,
antes e após os tratamentos com o fungo e com a levedura, respectivamente, em
sistemas com e sem pré-tratamento de oxidação eletroquímica. Analisando o
cromatogramas da solução controle verifica-se 5 picos máximos de retenção em 8,3,
17,2, 17,7, 19,9 e 20,6 min, que desaparecem completamente ao final dos
tratamentos, indicando que toda a molécula inicial do corante foi degradada e/ou
adsorvida pela biomassa fúngica.
129

Figura 28 – Cromatogramas de HPLC-Vis das soluções de Procion Red MX-5B


antes e após os tratamentos (A) microbiológico com A. terreus e (B) eletroquímico/A.
terreus.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1; λ = 538 nm.


Fonte: elaborado pela autora.
130

Figura 29 – Cromatogramas de HPLC-Vis das soluções de Procion Red MX-5B


antes e após os tratamentos (A) microbiológico com S. cerevisiae e (B)
eletroquímico/ S. cerevisiae.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1; λ = 538 nm.


Fonte: elaborado pela autora.

Os cromatogramas de HPLC-UV das soluções do corante Procion Red MX-5B,


antes e após os tratamentos de descoloração, na região de 292 nm, que é
131

característica de aminas aromáticas primárias e secundárias (SILVERSTEIN et al.,


1994), apresentou surgimentos de novos picos, indicando formação de intermediários
do tipo amino aromáticos, que possuem como principal característica alto potencial
toxicológico (GADALETA et al., 2016).

Na Figura 30 é possível observar as alterações dos cromatogramas das


soluções de corante, antes e após o tratamento com o fungo A. terreus e
eletroquímico/A. terreus. Analisando essa Figura, verificou-se que após 1 h de pré-
tratamento de oxidação eletroquímica ocorreu o desaparecimento dos picos em 4,32
e 8,30 min, presentes no cromatograma da solução controle. Após o tratamento
eletroquímico, um novo pico surgiu em 4,12 min e, se manteve presente após o
tratamento microbiológico. Após a interação com a biomassa fúngica ocorre o
surgimento de um novo pico em 4,47, indicando grande capacidade desse micro-
organismo para realizar a biotransformação da molécula do corante, levando a
formação de novos subprodutos.
132

Figura 30 - Cromatogramas de HPLC-UV da (A) solução controle Procion Red MX-


5B, (B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento A. terreus e eletroquímico/A. terreus.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1; λ = 292 nm.


Fonte: elaborado pela autora.
133

A partir dos resultados contidos na Figura 30, foi possível realizar a análise dos
picos em 4,12 e 4,47 min, e na Figura 31 é possível verificar a análise comparativa
dos valores da área integrada desses picos.

Figura 31 – Valores da área integrada dos picos em (A) 4,12 e (B) 4,47 min para
cada tratamento de degradação testado no sistema com o fungo A. terreus
eletroquímico/A. terreus.

Nota: área integrada do pico em 4,12 da solução com pré-tratamento de oxidação


eletroquímico igual a 807.
Fonte: elaborado pela autora.

Na Figura 31, verifica-se que foram formados pelo menos dois compostos
amino aromáticos principais, sendo que o composto identificado em 4,47 min (gráfico
B) é o que se apresenta em maior concentração no meio reacional, em ambos
sistemas, mas principalmente no sistema exclusivamente microbiológico ao final de
288 h de tratamento. O composto presente no gráfico A, ao final das 288 h teve
comportamento semelhante em ambos sistemas, tendo seu pico de produção no
sistema A. terreus em 144 h e, ao final das 288 h, estava presente em concentrações
equivalentes nos dois sistemas testados.

Quanto aos tratamentos com S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae os


cromatogramas em 292 nm, podem ser visualizados na Figura 32. Analisando essa
Figura verifica-se que, assim como ocorreu no tratamento com o fungo A. terreus, o
tratamento com S. cerevisiae, em ambos sistemas, também apresentou o surgimento
de novos picos, após o contato com a biomassa microbiana, sendo que o pico mais
expressivo foi o que surgiu no tempo de retenção do composto eluído em 3,82 min.
134

Na Figura 33 observam-se os resultados de área integrada para esse pico em ambos


sistemas.

Figura 32 - Cromatogramas de HPLC-UV da (A) solução controle Procion Red MX-


5B, (B) após 1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de
tratamento S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1; λ = 292 nm.


Fonte: elaborado pela autora.
135

Figura 33 – Valores da área integrada do pico em 3,82 min para cada tratamento de
degradação testado no sistema com a levedura S. cerevisiae e eletroquímico/ S.
cerevisiae.

Fonte: elaborado pela autora.

Na Figura 32, verifica-se que o sistema eletroquímico/S. cerevisiae foi mais


eficiente no início do processo (72 h) quanto à degradação do metabólito amino
aromático formado após a biodegradação das moléculas do corante Procion Red MX-
5B eluído em 3,82 min, visto que a partir de 144 h de tratamento esse metabólito
apresentou-se em menor concentração nesse sistema.

Estudos de degradação com o corante Acid Red 88, que é uma molécula
semelhante a do corante Procion Red MX-5B, pelo fungo filamentoso Achaetomium
strumarium, análises de HPLC após os tratamentos também apresentaram o
surgimento de novos picos de retenção, confirmando que o fungo foi capaz de
degradar as moléculas do corante, formando metabólitos intermediários. Os autores
conseguiram identificar a formação de aminas aromáticas, como subprodutos de
degradação das moléculas do corante por análises de FTIR e, atribuíram o processo
de degradação a enzimas lignolíticas extracelulares e enzimas azoredutases
produzidas pelo micro-organismo (BANKOLE et al., 2018).
136

Avaliando os cromatogramas obtidos após os tratamentos com o fungo e com


a levedura, é possível identificar que a rota de degradação das moléculas do corante
ocorreu de forma diferente para cada micro-organismo, pois foram formados
compostos diferentes após cada tratamento. O que é muito interessante quando se
pensa em sistemas biológicos consorciados tendo esses micro-organismos como
protagonistas, pois, juntos poderiam atuar de forma extremamente eficiente na
degradação de moléculas de corantes do tipo reativo, que é o caso do corante Procion
Red MX-5B.

3.3.2.4 Análises de toxicidade aguda e adsorção com argila branca imobilizada


em alginato

Sementes de L. sativa possuem uma grande superfície de contato, mas


pequeno tamanho, o que acarreta em baixa quantidade de endosperma disponível. O
endosperma é o mecanismo de resistência da semente durante o processo de
germinação, frente à condições ambientais adversas. O tegumento e o endosperma
também são responsáveis por proteger o embrião contra agentes tóxicos e a
permeabilidade varia entre espécies, mas sementes pobres em endospermas são
mais suscetíveis às condições do meio, principalmente nos primeiros estágios do seu
desenvolvimento (ANDRADE et al., 2010; KRANNER; COLVILLE, 2011).

O processo de germinação de sementes de plantas, dependem diretamente da


disponibilidade e qualidade da água presente no meio. Uma vez hidratadas as
sementes rompem seu estado de dormência, e a partir daí passarão por intensas
alterações fisiológicas, tornando-se altamente susceptíveis as variação ambientais
(WANG; FREEMARK, 1995). É nesse momento que a presença de compostos
nocivos, podem causar prejuízos a esses organismos, como por exemplo, inibição de
germinação e do crescimento radicular (ALMEIDA; CORSO, 2014).

Reconhecendo a alta sensibilidade desses organismos a presença de


compostos tóxicos, foi avaliado a inibição de crescimento das raízes das plântulas de
L. sativa, após exposição a soluções tratadas e não tratadas do corante Procion Red
MX-5B. Os resultados de toxicidade obtidos, demonstraram que para todos os
sistemas de tratamentos testados, microbiológico e eletroquímico/microbiológico,
137

ocorreu aumento da toxicidade final das soluções. Indicando que os metabólitos


secundários resultantes da degradação molecular incompleta do corante Procion Red
MX-5B, são potencialmente tóxicos para o desenvolvimento desses organismos. A
Figura 34 expressa os resultados de crescimento radicular (cm) após os tratamentos
de descoloração testados.

Figura 34 – Resultados de crescimento radicular (cm) das plântulas de L. sativa,


após exposição às soluções provenientes dos tratamentos de descoloração,
microbiológicos e eletroquímico/microbiológicos do corante Procion Red MX-5B.

Fonte: elaborado pela autora.

As análises estatísticas dos dados de crescimento radicular, realizadas pelo


teste de Kruskal-Wallis (Dunn), a 5 % de probabilidade (p < 0,05), assim como no
tratamento do corante Acid Blue 161, apresentaram diferenças significativas ( entre
os tratamentos de descoloração microbiológicos, eletroquímicos/microbiológicos e, o
tratamento controle negativo (água destilada), indicando que os tratamentos de
descoloração foram responsáveis por aumentar a inibição de crescimento radicular
das plântulas. Nas Tabelas 11, 12, 13 e 14, estão compilados os resultados
138

estatísticos obtidos respectivamente, para os tratamentos A. terreus, eletroquímico/A.


terreus, S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae.

Tabela 11 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa após o
tratamento de descoloração A. terreus do corante Procion Red MX-5B.

Controle negativo – Corante sem tratamento n.s.


Controle negativo – 72 h A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 144 h A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 216 h A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 288 h A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h A. terreus p < 0,05
72 h A. terreus – 144 h A. terreus n.s.
72 h A. terreus – 216 h A. terreus n.s.
72 h A. terreus – 288 h A. terreus n.s.
144 h A. terreus – 216 h A. terreus n.s.
144 h A. terreus – 288 h A. terreus n.s.
216 h A. terreus – 288 h A. terreus n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
139

Tabela 12 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa após o
tratamento de descoloração eletroquímico/A. terreus do corante Procion Red MX-5B.

Controle negativo – Corante sem tratamento n.s.


Controle negativo – 72 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 144 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 216 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Controle negativo – 288 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
72 h eletroquímico/A. terreus – 144 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05
72 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/A. terreus n.s.
72 h eletroquímico/A. terreus – 288 h eletroquímico/A. terreus n.s.
144 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/A. terreus n.s.
144 h A. terreus – 288 h A. terreus n.s.
216 h A. terreus – 288 h A. terreus n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
140

Tabela 13 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa após o
tratamento de descoloração S. cerevisiae do corante Procion Red MX-5B.

Controle negativo – Corante sem tratamento n.s.


Controle negativo – 72 h S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 144 h S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 216 S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 288 h S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h S. cerevisiae p < 0,05
72 h S. cerevisiae – 144 h S. cerevisiae n.s.
72 h S. cerevisiae – 216 h S. cerevisiae n.s.
72 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae p < 0,05
144 h S. cerevisiae – 216 h S. cerevisiae n.s.
144 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae p < 0,05
216 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
141

Tabela 14 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa após o
tratamento de descoloração eletroquímico/S. cerevisiae do corante Procion Red MX-
5B.

Controle negativo – Corante sem tratamento n.s.


Controle negativo – 72 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 144 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
Controle negativo – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05
72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 144 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s.
72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s.
72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s.
144 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s.
144 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae terreus n.s.
216 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

A comparação entre os tratamentos envolvendo os sistemas A. terreus e


eletroquímico/A. terreus, com os sistemas S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae,
assim como nos tratamentos com o corante Acid Blue 161, verificou-se diferenças
significativas (p < 0,05), demonstrando que os sistemas envolvendo a levedura
apresentou maior inibição de crescimento radicular das plântulas. Nas Tabelas 15 e
16, podem ser observados os resultados da análise estatística para os sistemas
microbiológicos e eletroquímico/microbiológicos.
142

Tabela 15 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos de descoloração A. terreus e S. cerevisiae do corante Procion Red MX-
5B.

72 h A. terreus – 72 h S. cerevisiae p < 0,05


144 h A. terreus – 144 h S. cerevisiae p < 0,05
216 h A. terreus – 216 h S. cerevisiae p < 0,05
288 h A. terreus – 288 h S. cerevisiae p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Tabela 16 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos de descoloração eletroquímico/A. terreus e eletroquímico/S. cerevisiae
do corante Procion Red MX-5B.

72 h eletroquímico/A. terreus – 72 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05


144 h eletroquímico/A. terreus – 144 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05
216 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05
288 h eletroquímico/A. terreus – 288 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

O tratamento de adsorção com argila branca imobilizada em alginato, após os


tratamentos de descoloração, conseguiu reduzir a toxicidade aguda para as
sementes. Na Figura 35 podem ser visualizados, os resultados de inibição de
crescimento radicular das plântulas, após exposição às soluções de corante tratadas.
143

Figura 35 – Inibição de crescimento radicular e concentração de Procion Red MX-


5B remanescente após tratamentos de degradação. (A) A. terreus e A. terreus/argila;
(B) eletroquímico/A. terreus e eletroquímico/A. terreus/argila; (C) S. cerevisiae e S.
cerevisiae/argila; (D) eletroquímico/S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae/argila.

Nota: [inicial de corante] = 100 mg L-1.


Fonte: elaborado pela autora.

A redução de toxicidade mais significativa após o tratamento de adsorção com


argila branca foi observada para os tratamentos eletroquímico/microbiológicos no
tempo de 288 h para ambos micro-organismos, embora também tenha ocorrido
redução da toxicidade nos tratamentos microbiológicos, após o processo adsortivo
com argila.

Nas Tabelas 17, 18, 19 e 20 podem ser observados os resultados das análises
estatísticas de crescimento radicular das plântulas, respectivamente, para os
tratamentos A. terreus, eletroquímico/A. terreus, S. cerevisiae e eletroquímico/S.
cerevisiae, após tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato.
144

Tabela 17 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos A. terreus e A. terreus/argila.

72 h A. terreus – 72 h A. terreus/argila p < 0,05


144 h A. terreus – 144 h A. terreus/argila p < 0,05
216 h A. terreus – 216 h A. terreus/argila n.s.
288 h A. terreus – 288 h A. terreus/argila n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Tabela 18 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos eletroquímico/A. terreus e eletroquímico/A. terreus/argila.

72 h eletroquímico/A. terreus – 72 h eletroquímico/A. terreus/argila n.s.


144 h eletroquímico/A. terreus – 144 h eletroquímico/A. terreus/argila n.s.
216 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/A. terreus/argila n.s.
288 h eletroquímico/A. terreus – 288 h eletroquímico/A. terreus/argila p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Tabela 19 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos S. cerevisiae e S. cerevisiae/argila.

72 h S. cerevisiae – 72 h S. cerevisiae/argila n.s.


144 h S. cerevisiae – 144 h S. cerevisiae/argila p < 0,05
216 h S. cerevisiae – 216 h S. cerevisiae/argila p < 0,05
288 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae/argila n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
145

Tabela 20 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos eletroquímico/S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae/argila.

72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 72 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila n.s.


144 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 144 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila p < 0,05
216 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 216 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila p < 0,05
288 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

A análise estatística para os tratamentos A. terreus e A. terreus/argila (Tabela


17), indicou que somente os tratamentos de 72 e 144 h foram estatisticamente
diferentes (p < 0,05), enquanto que, para os tratamentos eletroquímico/A. terreus e
eletroquímico/A. terreus/argila (Tabela 18), somente o tratamento final de 288 h,
apresentou diferença significativa do crescimento radicular das plântulas.

Nos tratamentos com a levedura, as análises estatísticas para os sistemas S.


cerevisiae e S. cerevisiae/argila (Tabela 19) foram estatisticamente diferentes
somente para os períodos intermediários, 144 e 216 h, enquanto que, para os
tratamentos eletroquímico/S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae/argila (Tabela
20), os tempos de 144, 216 e 288 h apresentaram diferença significativa. Sendo assim,
pode-se inferir que a argila demonstrou boa capacidade de remoção dos
intermediários tóxicos formados após a degradação do corante Procion Red MX-5B,
do meio reacional, após o tratamento adsortivo, favorecendo o crescimento radicular
das plântulas de L. sativa.

Após o tratamento adsortivo com a argila branca imobilizada em alginato, foram


realizadas análises de HPLC-UV em 292 nm, para os tratamentos de descoloração
de 288 h e, na Figura 36 é possível observar esses cromatogramas.
146

Figura 36 – Cromatogramas Procion Red MX-5B, após 288 h de tratamentos de


descoloração (A) A. terreus; 4,47 min, (B) Eletroquímico/A. terreus; 4,47 min, (C) S.
cerevisiae; 3,82 min, (D) Eletroquímico/S. cerevisiae; 3,82 min, antes e após
tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato.

Fonte: elaborado pela autora.

Na Figura 37 é possível verificar que as variações da área integrada dos picos


em 292 nm, antes e após o tratamento adsortivo com a argila. Para os tratamentos
exclusivamente microbiológicos, embora tenha ocorrido redução do pico de aminas
aromáticas nas análises de HPLC-UV, no teste de toxicidade aguda não ocorreu
redução significativa da taxa de inibição de crescimento das plântulas. Isso deve-se
principalmente à alta toxicidade dos compostos formados que, mesmo em
concentrações mais baixas, causam grandes prejuízos aos organismos a eles
expostos.
147

Para o tratamento com o sistema A. terreus, o pico analisado foi em 4,47 min e
para S. cerevisiae em 3,82 min.

Figura 37 – Área integrada dos picos em 3,82 e 4,47 min, após 288 h de tratamento
de descoloração (A) A. terreus; 4,47 min, (B) Eletroquímico/A. terreus; 4,47 min, (C)
S. cerevisiae; 3,82 min, (D) Eletroquímico/S. cerevisiae; 3,82 min antes e após
tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato.

Fonte: elaborado pela autora.

4 CONCLUSÕES

Quanto à descoloração das soluções, todos os tratamentos testados foram


eficientes, sendo que os sistemas envolvendo o fungo A. terreus, foram mais
representativos, pois apresentaram menor taxa de toxicidade aguda para as sementes
de L. sativa ao final de 288 h de exposição a biomassa fúngica, e após o tratamento
adsortivo com a argila branca, para ambos corantes. Esses resultados indicaram
148

maior taxa de degradação e adsorção dos metabólitos formados, após a


biotransformação das moléculas dos corantes pelo fungo, ou seja, os metabólitos
formados após a degradação com A. terreus demonstraram menor grau de toxicidade,
em relação aos metabólitos formados no tratamento com a levedura.

Para o corante Acid Blue 161, comparando os cromatogramas de HPLC-UV em


254 nm ao final das 288 h de exposição às biomassas microbiológicas e após o
tratamento adsortivo com a argila, é possível verificar a redução da área integrada do
pico em 3,42 min em todos os tratamentos, após a etapa de adsorção. O resultado
mais expressivo, o do tratamento exclusivamente microbiológico com o fungo A.
terreus, foi o que apresentou redução de 39 %. Esses resultados indicam que o
tratamento adsortivo com argila branca demonstrou possuir alta capacidade de
remoção de metabólitos intermediários, o que é uma característica muito importante
do ponto de vista toxicológico.

Os tratamentos com o Procion Red MX-5B mostraram que a biodegradação do


corante seguiu rotas diferentes quando exposto ao fungo filamentoso e a levedura.

A redução da toxicidade aguda em todos os tratamentos após o tratamento


adsortivo com a argila branca imobilizada, também indica alta sensibilidade das
sementes de L. sativa às variações de concentração dos metabólitos com potencial
toxicológico presentes no meio reacional, o que é muito interessante, visto que este
tipo de teste é fácil e rápido de ser executado, além de possuir baixo custo.
149

6 CAPÍTULO III

Avaliação da degradação e mutagenicidade de azo corantes têxteis por meio de


associação de tratamentos de descoloração

Resumo

O tratamento de efluentes têxteis é desafiador e tem recebido muita atenção nas


últimas décadas. Esses efluentes contêm substâncias tóxicas, como aditivos,
detergentes e surfactantes além dos corantes sintéticos e os subprodutos de sua
degradação. Os azo corantes compõem o objeto de estudo do presente trabalho, por
serem comprovadamente tóxicos, cancerígenos, mutagênicos ou teratogênicos para
humanos e outras formas de vida. Essa classe química de corantes é caracterizada
pela presença de uma ou mais ligações do tipo R1-N=N-R2, anéis aromáticos, além
de grupos sulfônicos que aumentam a solubilidade em água. Não há um sistema de
tratamento padrão para esse tipo de efluente c pois, considera-se que a combinação
de tratamentos é promissora e a aplicação de tratamentos de oxidação eletroquímica
aliados a tratamentos microbiológicos podem ser capazes de degradar e mineralizar
corantes sintéticos, reduzindo ou eliminando completamente o impacto ambiental que
o descarte incorreto desses compostos pode causar aos sistemas aquáticos. Sendo
150

assim o presente estudo propôs avaliar a degradação dos corantes Acid Blue 161 e
Procion Red MX-5B associados em solução binária, pelo fungo filamentoso A. terreus
e pela levedura S. cerevisiae em sistemas com e sem pré-tratamento de oxidação
eletroquímica. Também foram realizados testes de adsorção com argila branca
imobilizada em alginato, após os tratamentos de descoloração para remoção de
metabólitos intermediários formados depois da degradação das moléculas dos
corantes. Obtivemos após esses tratamentos, uma completa descoloração das
soluções em todos os sistemas testados. O ensaio Salmonella/microssoma com as
linhagens TA98 e TA100, na ausência e na presença de metabolização exógena
(sistema microssomal S9) mostrou que as moléculas iniciais e derivados da
metabolização dos corantes eram mutágenos direto. O sistema eletroquímico/A.
terreus/argila conseguiu descolorir às soluções e transformar compostos mutagênicos
direto em compostos não mutagênicos. Além de reduzir a potência mutagênica dos
compostos pró-mutágenos para a linhagem TA100, na presença do sistema
cromossomal S9, o que indica alta eficiência desse sistema para descolorir e degradar
moléculas de azo corantes.

1 INTRODUÇÃO

O tratamento de efluentes têxteis é desafiador e tem recebido muita atenção


nas últimas décadas. Esses efluentes geralmente contêm algumas substâncias
tóxicas, como aditivos, detergentes e surfactantes (ZHANG et al., 2012), além dos
corantes sintéticos e os subprodutos de sua degradação que são comprovadamente
tóxicos, cancerígenos, mutagênicos ou teratogênicos para humanos e outras formas
de vida (LE et al., 2016).

Para se entender essa problemática, os corantes têxteis compõem o objeto de


estudo desse estudo e baseado na estrutura química do grupo cromóforo os corantes
sintéticos podem ser classificados em diferentes classes, sendo que os do tipo azo
lideram o mercado mundial de consumo industrial, 70 % de 9,9 milhões de tonelada
de corantes utilizados anualmente como matéria-prima (RAWAT et al., 2018).

Essa classe química de corantes, é caracterizada pela presença de uma ou


mais ligações do tipo R1-N=N-R2, anéis aromáticos, além de grupos sulfônicos que
151

aumentam a sua solubilidade em água. São compostos sintetizados para terem alta
estabilidade fotolítica e resistência aos principais agentes antioxidantes (CHEQUER,
et al., 2015; FRANCISCON et al., 2015; PÉREZ-IBARBIA et al., 2016).

Quando liberados diretamente sem tratamento nos corpos hidricos, os corantes


impedem a penetração da luz solar nas camadas de águas mais profundas, alterando
a atividade fotossintética, resultando em deterioração da qualidade da água,
diminuindo a solubilidade do gás oxigênio, e finalmente, causando efeitos tóxicos
agudos à flora e fauna aquática (LALNUNHLIMI; KRISHNASWAMY, 2016). Além do
fato de que a maioria dos azo corantes apresentam respostas mutagênicas nos
sistemas de ensaio Salmonella/microssoma - Teste de Ames, sendo que o potencial
mutagênico depende da natureza do corante, número e posição dos anéis aromáticos
e ao átomo de nitrogênio (CHEQUER et al., 2015; AYED et a., 2017).

A ineficiência dos processos de tratamento de efluentes aplicados nas


indústrias têxteis para a remoção de corantes é demonstrado pela detecção de
corantes e os produtos de sua transformação em águas superficiais (LEITE et al.,
2016). Devido a isso, existe grande preocupação no meio cientifico em encontrar
sistemas de tratamento que sejam eficientes e de baixo custo de implementação.

Nesse contexto, os processos microbiológicos são bastante utilizados no


tratamento desses efluentes, devido ao fato de serem ambientalmente menos
impactantes e possuírem menores custos de implementação. No entanto, estudos de
degradação dessas substâncias (SHARMA et al., 2016; ALMEIDA; CORSO, 2016;
VENTURA-CAMARGO et al., 2016), indicam que somente o tratamento
microbiológico, por si só, não é o suficiente para desintoxicar e degradar os corantes,
sendo que na maioria dos casos ocorre somente mineralização parcial dessas. Assim,
apesar de apresentar menor concentração de compostos orgânicos, as águas
residuais têxteis tratadas por sistemas biológicos, podem ser mais tóxicas do que o
efluente não tratado, pois a biotransformação de alguns corantes pode acarretar na
formação de moléculas com alto potencial toxicológico, como por exemplo, aminas
aromáticas (ALMEIDA; CORSO, 2014).

Mesmo assim os tratamentos biológicos oferecem vantagens e não devem ser


descartados, principalmente devido aos baixos gastos energéticos e sua capacidade
de lidar com altas cargas orgânicas (PATHAK et al., 2014; PUNZI et al., 2015).
152

Entretanto, a fim de se aumentar a eficiência de técnicas já existentes, sistemas


consorciados de tratamentos estão sendo bastante estudados, para aliar diferentes
sistemas e obter o máximo de eficiência em cada um, sempre tendo como objetivo
final a mineralização desses compostos e de seus intermediários, que são
conhecidamente tóxicos (LIU et al., 2018).

Portanto a combinação de tratamentos de descoloração é promissora e a


aplicação de tratamentos de oxidação eletroquímica aliados a tratamentos biológicos
podem ser capazes de degradar e mineralizar corantes sintéticos, reduzindo ou
eliminando completamente o impacto ambiental que o descarte incorreto desses
compostos pode causar aos sistemas aquáticos.

Sendo assim, o objetivo desse estudo foi analisar a degradação biológica dos
azo corantes têxteis Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B associados em solução
binária, em sistemas exclusivamente biológicos e com pré-tratamento de oxidação
eletroquímica. A eficiência dos tratamentos foi avaliada por testes de toxicidade aguda
utilizando um sistema teste vegetal composto por sementes de Lactuca sativa, e a
mutagenicidade pelo ensaio Salmonella/microssoma (Teste de Ames). Os
tratamentos biológicos foram realizados com o fungo filamentoso Aspergillus terreus
e com a levedura Saccharomyces cerevisiae. Além da avaliação de toxicidade aguda
e mutagenicidade da solução, antes e após os tratamentos, foram realizadas análises
de espectrofotometria UV-Vis, FTIR e HPLC – UV/Vis.

3 2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Micro-organismos

Os tratamentos microbiológicos foram realizados com o fungo Aspergillus


terreus e com a levedura Saccharomyces cerevisiae. Os procedimentos de
peletização da biomassa fúngica e imobilização das células da levedura em ácido
algínico seguiram as metodologias descritas nos itens 2.1.1. e 2.1.2. do capítulo 2 do
presente trabalho.
153

2.2 Azo corantes

Foram estudados os corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B.

 Acid Blue 161:

Número CAS: 12392-64-2;

Fórmula empírica: C20H13N2O6SNaCrx;

Peso molecular: 416,39 g mol-1;

Pureza: ~40 %;

Fabricante: Aldrich Chemical Company, Inc.

 Procion Red MX-5B:

Número CAS: 17804-49-8;

Fórmula empírica: C19H10Cl2N6Na2O7S2;

Peso molecular: 615,34 g mol-1;

Pureza: ~40 %;

Fabricante: I.C.I. Brasil S.A.

2.3 Eletrólises

Para a realização das eletrólises foi utilizado uma célula do tipo filtro prensa
descrita no item 2.5. do capitulo 1.

As eletrólises foram realizadas utilizando o equipamento


potenciostato/galvanostato Eco Chemie modelo AUTOLAB PGSTAT30 com corrente
constante de 50 mA cm-2, durante 1 h. As soluções tratadas foram mantidas em fluxo
constante de 10 mL min-1. O volume inicial de solução a ser tratada foi igual a 150 mL,
concentração de 100 mg L-1 e eletrólito suporte Na2SO4 0,02 mol L-1.
154

2.4 Tratamentos microbiológicos de degradação

Os tratamentos de biodegradação foram conduzidos em Erlenmeyers de 125


mL contendo 50 mL de solução com concentração total igual a 200 mg L-1 de corantes
(100 mg L-1 Acid Blue 161 + 100 mg L-1 Procion Red MX-5B) em solução de sais de
Vogel e enriquecida com 2 % de sacarose. Os frascos foram esterilizados a 120 ºC e
1 atm por 20 min. Após esse processo, foram transferidos assepticamente para cada
frasco o volume de suspensão de biomassa necessária para obtenção de uma
concentração igual a 3 mg mL-1 de pellets miceliais ou esferas de levedura imobilizada
em alginato. Por fim, os frascos foram incubados em estufa de cultivo a 30 ± 1 ºC, por
12 dias.

As análises foram realizadas em intervalos de 72 h. As amostras retiradas


foram filtradas em membrana Whatman® composta por celulose regenerada,
tamanho de poro de 0,45 µm e 47 mm de diâmetro, para remoção da biomassa
microbiológica. Decorrido esse processo, às soluções foram submetidas a análises de
espectrofotometria UV-Vis (720 a 240 nm, em cubeta de quartzo com caminho óptico
de 5 mm), FTIR, HPLC-UV/Vis, tratamento adsortivo com argila branca imobilizada
em alginato, toxicidade aguda com L. sativa, ensaio Salmonella/microssoma.

2.5 Análises de FTIR, HPLC-UV/Vis, toxicidade aguda e tratamento adsortivo


com argila branca imobilizada em alginato

As análises de FTIR e HPLC-UV/Vis seguiram as metodologias descritas no


capítulo 2, respectivamente nos itens 2.7. e 2.8, sendo que para as análises de HPLC-
UV/Vis da solução binária a proporção da fase móvel foi de 35 % metanol e 65 %
água, enquanto que para o tratamento adsortivo com argila branca, a metodologia
utilizada pode ser visualizada no capitulo 2, item 2.9. A toxicidade aguda seguiu o
protocolo descrito no capítulo 1 item 2.3.

Os dados de crescimento radicular e do hipocótilo (cm) das plântulas de L.


sativa antes e após os tratamentos de descoloração, foram analisados
estatisticamente utilizando o software BioEstat 5.0, pelo teste não paramétrico de
155

Kruskal-Wallis (Dunn), a 5 % de probabilidade (p<0,05) (MORAES JR; BIDOIA, 2015;


AGUIAR et al., 2016). O teste foi escolhido pelo fato, dos dados obtidos não
apresentarem distribuição normal.

2.6 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Foram realizadas análises de MEV dos pellets miceliais do fungo A. terreus,


antes e após interação com a solução binária. O equipamento utilizado foi um
microscópio eletrônico Leica-Zeiss, modelo LEO 440 TEM, acoplado a um detector
modelo Oxford 7060. As micrografias foram realizadas com aumento variando entre
70 e 5.000 vezes. Também foi fotografado o pellet, após interação com a solução dos
corantes, em lupa Leica MZ16 equipada com câmera Leica DFC 320.

2.7 Ensaio Salmonella/microssoma - Teste de Ames

O bioensaio de mutagenicidade Salmonella/microssoma, conhecido também


como teste de Ames, foi baseado no protocolo descrito por Maron e Ames (1983) e foi
realizado em colaboração com o laboratório de Mutagênese Ambiental do Instituto de
Biociências da Unesp campus Rio Claro. O ensaio foi conduzido com duas linhagens
de Salmonella typhimurium, a TA98 e TA100.

2.7.1 Protocolo de pré-incubação

Para a realização dos ensaios, 100 µL das culturas das linhagens TA100 e
TA98 de S. typhimurium, provenientes de ampolas de uso rotineiro, foram inoculadas
em 20 mL de caldo nutriente e crescidas por 16 h (overnight) a 37 °C sob agitação de
150 a 170 rpm. Após o crescimento, as culturas foram mantidas sob refrigeração até
o momento de preparação do teste.

Em tubos previamente esterilizados, foram colocados 100 µL de cultura da


linhagem (109 células/mL), 100 µL das soluções dos corantes testados em diferentes
156

concentrações (ou 10 µL de substância usada no controle positivo - CP) e 500 µL de


tampão fosfato 0,2 M, para o ensaio na ausência de ativação metabólica. Nos ensaios
com presença de ativação metabólica S9, o tampão fosfato foi substituído por 500 µL
de mistura S9 (água destilada estéril, tampão fosfato 0,2 M, NADP 0,1 M, glicose-6-
fosfato 1,0 M, solução de sais (KCl 1,65 M e MgCl2 0,4 M) e fração S9). Sendo que, a
ativação metabólica S9 é um sistema de metabolização exógeno (Sistema
microssomal S9, Moltox) constituído de um homogenato de células do fígado do rato
Sprague-Dawley. Após essa etapa os tubos foram homogeneizados e incubados a 37
°C por 30 min. Decorrido esse período foi adicionado 2,0 mL de ágar de superfície aos
tubos. A nova mistura foi então homogeneizada e vertida em placa de Petri com 20
mL de ágar mínimo. As placas foram incubadas invertidas, em temperatura de 37°C
por 72 h.

Como controles positivos, foram utilizados no teste sem S9 (ausência de


atividade metabólica) o 4-nitroquinolina-1-óxido (4NQO) (Sigma, Nº CAS 56-57-5) na
concentração de 0,05 µg µL-1, e para o teste na presença de S9 o 2-aminoantraceno
(2AA) (Sigma, Nº CAS 613-13-8) na concentração de 0,25 µg µL-1. Como controle
negativo foi utilizado água ultrapura.

Devido à complexidade e custo do ensaio, foram testadas apenas às soluções


controle e os tratamentos eletroquímico/A. terreus e eletroquímico/S. cerevisiae no
tempo de 288 h após tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato.
Esses tratamentos obtiveram melhores resultados, quanto ao teste de toxicidade
aguda. Para tanto, as doses testadas de cada uma das amostras foram determinadas
a partir de 7 diluições de cada solução nas proporções de 10, 20, 30, 40, 50, 75 e 100
% de amostra inicial. O teste foi realizado em triplicata para cada solução testada.

Para a análise de mutagenicidade, as colônias de bactérias revertentes foram


contadas manualmente. Os dados foram avaliados no software Salanal (Samonella
Assay Analysis 1.0) (KIM; MARGOLIN, 1999), pelo teste ANOVA e considerados
positivos, quando os resultados do teste estatístico e de dose-resposta foram
significativos. O potencial mutagênico de cada amostra foi obtido a partir do valor de
slope do gráfico para cada conjunto de amostras, utilizando o mesmo software.
157

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Descoloração e análises de MEV

Os tratamentos de descoloração microbiológico da solução binária foram


realizados pelo fungo filamentoso A. terreus e pela levedura S. cerevisiae em sistemas
de tratamento com e sem pré-tratamento de oxidação eletroquímica.

O pré-tratamento de oxidação eletroquímica foi realizado pelo período de 1 h,


e ao final desse período, obteve-se 64 % de descoloração total da solução que tinha
concentração inicial de 200 mg L-1 (100 mg L-1 Procion Red MX-5B + 100 mg L-1 Acid
Blue 161), sendo que a remoção do corante Procion Red Mx-5B (vermelho) foi de
aproximadamente 92 % e a do Acid Blue 161 (azul) foi de 36 %. Esses dados
indicaram a maior facilidade de degradação do corante vermelho pelo sistema
oxidativo. As soluções foram analisadas por espectrofotometria UV-Vis nos
comprimentos de onda de 538 e 602 nm, correspondentes respectivamente aos picos
de absorção máxima dos corantes Procion Red MX-5B e Acid Blue 161, na região do
visível.

Quanto aos tratamentos biológicos, as análises foram realizadas após 72, 144,
216 e 288 h de interação com as respectivas biomassas microbiológicas. Para o
tratamento exclusivamente microbiológico com o fungo A. terreus e o tratamento
eletroquímico/A. terreus, ao final das 288 h de exposição à descoloração das soluções
foi de 100 %.

Na Figura 1 é possível observar os espectros de absorbância UV-Vis das


soluções resultantes dos tratamentos A. terreus e eletroquímico/A. terreus, e as taxas
de descoloração obtidas após cada um dos tratamentos. Analisando o espectro após
1 h de tratamento eletroquímico observa-se a extinção do espectro do corante Procion
Red MX-5B, indicando uma maior facilidade do sistema degradar essas moléculas.

Ainda nessa Figura, é possível verificar uma maior afinidade da biomassa


fúngica pelo corante azul nas primeiras 72 h de tratamento, pois ocorreu uma maior
taxa de remoção desse corante, em relação ao corante vermelho. A partir de 144 h, à
descoloração foi equivalente e não houve diferença de remoção dos corantes nos dois
diferentes sistemas tratamento testados.
158

Figura 1 – Dados de descoloração solução binária. (A) tratamento A. terreus; (B)


taxa de remoção total e de cada corante individualmente – sistema A. terreus; (C)
tratamento eletroquímico/A. terreus (D) taxa de remoção total e de cada corante
individualmente – sistema eletroquímico/ A. terreus.

Nota: concentração inicial da solução igual a 200 mg L-1.


Fonte: elaborado pela autora.

Para o tratamento com a levedura, podem ser visualizados na Figura 2, os


espectros de UV-Vis e taxas de descoloração da solução binária após 288 h de
tratamento S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae.
159

Figura 2 – Dados de descoloração solução binária. (A) tratamento S. cerevisiae; (B)


taxa de remoção total e de cada corante individualmente – sistema S. cerevisiae; (C)
tratamento eletroquímico/ S. cerevisiae (D) taxa de remoção total e de cada corante
individualmente – sistema eletroquímico/ S. cerevisiae.

Nota: concentração inicial da solução igual a 200 mg L-1.


Fonte: elaborado pela autora.

A descoloração total das soluções, ao final de ambos tratamentos foi de


aproximadamente 100 %. Nas análises de 72 e 144 h do tratamento S. cerevisiae,
pode-se verificar que a levedura apresentou maior afinidade pelo corante Acid Blue
161, removendo aproximadamente 94 % do corante já nas primeiras 72 h. Já o corante
Procion Red MX-5B a remoção no mesmo período foi igual a 77 %. No tratamento
eletroquímico/S. cerevisiae à descoloração da solução foi de aproximadamente 95 %
em 72 h de tratamento, e a partir de 144 h a solução já havia perdido completamente
sua cor.
160

Quanto a remoção da cor das soluções é possível afirmar que todos os


sistemas testados demonstraram-se altamente eficientes, sendo que os sistemas
eletroquímico/microbiológico, em 72 h de exposição as biomassas microbianas já
apresentavam aproximadamente 100 % de descoloração, indicando que a utilização
de um pré-tratamento de oxidação eletroquímica, acelerou o processo de tratamento
biológico, aumentando assim a eficiência do sistema biológico, que tende a ser mais
lento, quando não há nenhum tipo de pré-tratamento inicial.

Aravind et al. (2016) também estudaram a degradação de efluentes têxteis


reais e amostras sintéticas, a partir de processos de oxidação eletroquímicos em
sistemas com e sem associação a tratamentos microbiológicos, utilizando eletrodos
do tipo ADE de Ti/RuTiO2. Nos sistemas exclusivamente eletroquímicos os autores
relataram descoloração de 92 % e 89 %, após 100 minutos de eletrólise,
respectivamente para as amostras reais e sintéticas, sem taxa de mineralização
significativa. A remediação das amostras estudadas foi obtida após exposição ao
consórcio bacteriano, sendo que, os autores afirmam que o pré-tratamento
eletroquímico aumentou a biodegradabilidade dos efluentes em 90 %, além de ter
conseguido reduzir a toxicidade para Vigna radiata, após os tratamentos de
degradação.

Na Figura 3 está representada uma imagem do pellet do fungo A. terreus após


288 h de contato com a solução binária. A imagem foi obtida com aumento de 400
vezes em lupa Leica MZ16 equipada com câmera Leica DFC 320. Ao observarmos a
morfologia do pellet, foi possível verificar que ele apresentou um emaranhado de hifas,
rodeado por muitos filamentos soltos na superfície. Essa conformação permite a
aderência das moléculas dos corantes a essa superfície exposta, além do
preenchimento dos espaços internos presentes nos pellets.
161

Figura 3 – Pellet A. terreus após exposição a solução binária pelo período de 288 h.

Nota: aumento 160 x.


Fonte: elaborado pela autora.

Também foram realizadas análises de MEV dos pellets, antes e após a


interação com a solução de corantes, para que fosse possível visualizar alterações
nas hifas dos pellets, após o tratamento de descoloração. As micrografias dos pellets,
antes e após interação com a solução de corantes, podem ser visualizadas na Figura
4. As imagens obtidas tiveram aumento variável de 70 a 5.000 vezes.

Nessa Figura, comparando as imagens da sequência 1 com as imagens da


sequência 2, verifica-se que ocorreu um preenchimento dos espaços que estavam
disponíveis na superfície do pellet, antes da interação com a solução dos corantes.
Isso demonstra alta afinidade das moléculas dos corantes pela parede celular das
hifas fúngica presente no pellet, indicando o intenso processo adsortivo dos corantes
por essa biomassa microbiológica.

A parede celular fúngica é composta por uma elevada quantidade


polissacarídeos, que estão frequentemente associados à capacidade de biossorção
desse tipo de biossorvente. Esses polissacarídeos possuem diferentes grupos
funcionais que podem se unir as moléculas de corante e removê-las do meio em que
se encontram (BOURAS et a., 2017).
162

Figura 4 – Micrografias dos pellets A. terreus, antes e após exposição a solução


binária. 1a, 1b, 1c, 1d, 1e e 1f pellet antes da interação com a solução binária,
aumento de 70 a 5.000 vezes; 2a, 2b, 2c, 2d, 2e e 2f pellet após interação com a
solução binária, aumento de 70 a 5.000 vezes.

Fonte: Elaborado pela autora.


163

3.2 Análises de FTIR

As análises de espectroscopia de infravermelho permitiram verificar que o


processo de descoloração das soluções dos corantes Acid Blue 161 e Procion Red
MX-5B, tratados em solução binária, deu-se predominantemente por degradação
molecular, já que é possível visualizar intensas alterações dos espectros de FTIR,
antes e após os tratamentos. Essas alterações são correspondentes às alterações
ocasionadas às moléculas dos corantes, após os respectivos tratamentos aos quais
foram submetidos.

Sendo assim, na Figura 5 é possível observar os espectros de FTIR das


soluções de corantes, antes e após os tratamentos A. terreus e eletroquímico/A.
terreus.

Analisando essa Figura verifica-se que após 1 h de tratamento de oxidação


eletroquímica, desaparecem as bandas em 1535 e 1141 cm-1 correspondentes
respectivamente a vibrações das ligações -N=N- e C-N (KHAN et al., 2017; WANG et
al., 2017; RAWAT et al., 2016) presentes na molécula inicial, indicando quebra das
moléculas após o tratamento oxidativo. Ocorreu também intensificação da banda em
1049 cm-1, característico de vibrações de estiramento de grupos sulfônicos (R-SO3).

Após a interação com a biomassa peletizada do fungo A. terreus, verifica-se


redução de intensidade, mas não desaparecimento das bandas principais, sendo eles
3452 cm-1, característico de vibração de estiramento de grupos hidroxila (-OH) ligados
a anéis aromáticos (GEORGIEV et al., 2018; RAWAT et al., 2018), 2918 cm-1
estiramento da ligação -CH2 de grupos alifáticos (LIU et al., 2017), 1627 cm-1 vibração
da ligação -C=C- de anéis aromáticos e estiramento da ligação C=O de grupos
carbonilas de ácidos carboxílicos (ROSU et al., 2017). Todas as alterações
visualizadas nessas regiões confirmam que ocorreu degradação das moléculas
iniciais e redução das bandas ao final dos tratamentos A. terreus e eletroquímico/A.
terreus, indicando degradação e/ou mineralização dos intermediários formados. O
tratamento eletroquímico/A. terreus mostrou-se mais eficiente em relação aos outros
tratamentos, pois apresentou menor intensidade das bandas, em todos os tempos de
tratamento analisados.
164

A região correspondente as bandas 893, 755 e 627 cm-1, presente em todos os


tratamentos são características da presença de compostos aromáticos e ligações do
tipo -C-Cl na estrutura molecular do corante Procion Red MX-5B (EL-KABBANY et al.,
2011; HARISHA et al., 2017).
165

Figura 5 – Espectros de FTIR da (A) controle da solução binária, (B) após 1 h de


tratamento eletroquímico, e (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de tratamento A.
terreus e eletroquímico/A. terreus.

Fonte: elaborado pela autora

Nas condições testadas, os tratamentos com a levedura S. cerevisiae foram


muito similares aos tratamentos com o fungo A. terreus.
166

Na Figura 6 observam-se os espectros da solução binária antes e após os


tratamentos de descoloração S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae.

Figura 6 – Espectros de FTIR da (A) controle da solução binária, (B) após 1 h de


tratamento eletroquímico, e (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de tratamento S.
cerevisiae e eletroquímico/ S. cerevisiae.

Fonte: elaborado pela autora.


167

Analisando essa Figura é possível verificar que nas primeiras 72 h de


tratamento com a levedura, em ambos sistemas, ocorreu desaparecimento da banda
em 1049 cm-1 (RAWAT et al., 2018) que é característico da presença de grupos
sulfônicos. Ele volta a surgir novamente a partir de 144 h de tratamento, mas somente
no sistema exclusivamente microbiológico.

Após interação com a biomassa imobilizada da levedura, também ocorre o


surgimento de uma nova banda em 1123 cm-1, que indica presença de agrupamentos
azo (-N=N-) e de aminas aromáticas secundárias (SHABBIR et al., 2017), que se
formaram após a biotransformação das moléculas dos corantes, visto que essa banda
não aparece no sistema de tratamento exclusivamente eletroquímico. Essa banda
apresentou-se com maior intensidade após 216 e 288 h de tratamento
eletroquímico/S. cerevisiae, indicando menor eficiência desse sistema para
mineralizar os metabólitos formados após o processo de degradação dos corantes.

As bandas em 1718 e 1397 cm-1 são característicos de ligações C-O de ácidos


carboxílicos (BORTHAKUR et al., 2017; ROSU et al., 2017; SHANMUGAN et al.,
2017) que são compostos característicos de final de degradação de moléculas
orgânicas.

3.3 Análises de HPLC-UV/Vis

3.3.1 HPLC-Vis

No estudo de HPLC-Vis da solução binária, o comprimento de onda para a


realização das análises foi determinado a partir dos espectros UV-Vis dos corantes
Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B em solução simples. O comprimento de onda
escolhido foi o ponto onde ocorre intersecção dos espectros, indicando que nessa
região ocorre exatamente a mesma intensidade de absorbância para os dois corantes,
que é em 558 nm. Os espectros e o ponto onde ocorre a intersecção dos dois
espectros podem ser visualizados na Figura 7.
168

Figura 7 – Espectro de absorção dos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B.

Fonte: elaborado pela autora.

Sendo assim, as análises de HPLC-Vis foram realizadas no comprimento de


onda de 558 nm. Observando os cromatogramas dos corantes em solução simples,
verifica-se que o cromatograma da solução binária apresenta os picos característicos
de cada um dos corantes. Esses cromatogramas podem ser visualizados na Figura 8.
169

Figura 8 – Cromatogramas das soluções dos corantes (A) Acid Blue 161 e Procion
Red MX-5B em solução simples e (B) Solução Binária.

Fonte: elaborado pela autora.

Os cromatogramas da solução binária, antes e após os tratamentos, podem ser


visualizados na Figura 9 e 10.
170

Figura 9 – Cromatogramas solução binária, após tratamento (A) A. terreus e (B)


eletroquímico/A. terreus.

Fonte: elaborado pela autora.


171

Figura 10 – Cromatogramas solução binária, após tratamento (A) S. cerevisiae e


(B) eletroquímico/ S. cerevisiae.

Fonte: elaborado pela autora.

Analisando os cromatogramas da solução binária controle, é possível identificar


7 picos máximos de retenção em 8,2, 17,0, 17,6, 18,7 20,4, 21,1 e 21,4 min, que
desapareceram completamente ao final de todos os tratamentos, indicando que as
172

moléculas iniciais foram degradadas e/ou removidas do meio aquoso, via processo
adsortivo pelas biomassas do fungo A. terreus e da levedura S. cerevisiae.
Confirmando a eficiência dos sistemas testados, quanto à descoloração das soluções.

3.3.2 HPLC – UV

Apesar do fato de que as moléculas iniciais dos corantes Acid blue 161 e
procion Red MX-5B associados em solução binária, tenham sido completamente
removidas do meio reacional, após os tratamentos, observa-se que ocorreu a
formação de metabólitos secundários. A formação desses metabólitos pode ser
visualizada nas análises de HPLC-UV em 292 nm, sendo que os cromatogramas dos
sistemas A. terreus e S. cerevisiae podem ser observados respectivamente nas
Figuras 11 e 12.

Observando os cromatogramas A e B de ambas Figuras, verifica-se que após


o pré-tratamento de oxidação eletroquímica ocorreu um deslocamento do pico de 3,97
min para 3,53 min e completo desaparecimento do pico em 7,27 min. Essas alterações
indicam degradação das moléculas iniciais e possível formação de metabólitos do tipo
amino aromáticos.
173

Figura 11 - Cromatogramas de HPLC-UV das soluções (A) binária controle (B) após
1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de tratamento
A. terreus e eletroquímico/A. terreus.

Fonte: elaborado pela autora.


174

Figura 12 - Cromatogramas de HPLC-UV das soluções (A) binária controle (B) após
1 h de tratamento eletroquímico, (C) 72, (D) 144, (E) 216 e (F) 288 h de tratamento
S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae.

Fonte: elaborado pela autora.

A partir dos cromatogramas obtidos foi possível calcular as variações das áreas
do pico em 3,53 min para cada tratamento. Os dados obtidos estão representados na
Figura 13.
175

Figura 13 – Valores da área integrada do pico em 3,53 min para cada tratamento de
degradação testado.

Fonte: elaborado pela autora.

Analisando essa Figura é possível verificar que o sistema A. terreus foi o que
demonstrou maior capacidade de degradação e/ou mineralização dos metabólitos
amino aromáticos formados e, a partir de 144 h, os tratamentos A. terreus e
eletroquímico/A. terreus não apresentaram grandes diferenças entre si.

O sistema eletroquímico/S. cerevisiae foi o que apresentou maior produção de


metabólitos entre os sistemas testados no período de 144 h. Para todos os
tratamentos testados, o pico de produção de metabólitos foi o de 144 h. Ao final das
288 h, os sistemas S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae foram equivalentes.

3.3.3 HPLC-UV, após tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em


alginato

A argila branca é extensivamente utilizada na agropecuária, onde é adicionada


a ração dos animais no intuito de adsorver micotoxinas potencialmente tóxicas que
176

são produzidas principalmente por fungos filamentosos, no período em que esse


alimento fica armazenado. É um material de baixa toxicidade, encontrado
abundantemente na natureza e de baixo custo (CHKUASELI et al., 2016; NONES et
al., 2017).

Considerando que estruturalmente as moléculas de corantes sintéticos e seus


intermediários possuem grupos funcionais semelhantes aos das moléculas de
micotoxinas, foi realizado o tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em
alginato com o intuito de remover do meio reacional os metabólitos altamente tóxicos
formados após a degradação dos corantes.

Nas Figuras 14 e 15 é possível visualizar, respectivamente, os cromatogramas


e a variação de área do pico analisado em 3,53 min, no tempo final de 288 h, de todos
os sistemas de tratamento testados.

Figura 14 – Cromatogramas solução binária (288 h) em 292 nm. (A) A. terreus (B)
Eletroquímico/A. terreus (C) S. cerevisiae (D) Eletroquímico/S. cerevisiae antes e
após tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato.

Fonte: elaborado pela autora.


177

Figura 15 – Área integrada do pico em 3,53 min, após 288 h de tratamento de


descoloração (A) A. terreus, (B) Eletroquímico/A. terreus, (C) S. cerevisiae, (D)
Eletroquímico/S. cerevisiae, antes e após tratamento adsortivo com argila branca
imobilizada em alginato.

Fonte: elaborado pela autora.

Observando a Figura 16 verifica-se que a argila possui capacidade para


remover os intermediários do tipo amino aromáticos, formados após a degradação das
moléculas dos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B associados em solução
binária. A biomassa de argila apresentou maior afinidade pelo sistema A. terreus e
eletroquímico/A. terreus, removendo respectivamente 46 e 51 % da concentração
desses compostos que estavam presentes no meio reacional.

Para os sistemas S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae a remoção foi


menor, mas ainda sim apresentou eficiência de 27 e 37 % de remoção. Dentre os
sistemas testados, os sistemas eletroquímico/microbiológico apresentaram maior
eficiência de remoção de metabólitos pela argila branca imobilizada em alginato.
178

3.4 Análise de toxicidade aguda

Os dados de crescimento das raízes e hipocótilo das plântulas de L. sativa,


após exposição às soluções tratadas e não tratadas dos corantes Acid Blue 161 e
Procion Red MX-5B em solução binária, estão expressos, respectivamente nas
Figuras 16 e 17. Os resultados de crescimento para os tratamentos controle negativo
(água destilada) e solução de corante sem tratamento de descoloração, foram
respectivamente, iguais a 3,3 ± 0,5 e 2,6 ± 0,6 cm para as raízes e, 2,1 ± 0,5 e 1,8 ±
0,8 cm para o hipocótilo.

Figura 16 – Resultados de crescimento radicular (cm) das plântulas de L. sativa,


após exposição às soluções binárias compostas pelos corantes Acid Blue 161 e
Procion Red MX-5B, tratadas pelos sistemas microbiológicos e
eletroquímico/microbiológicos.

Fonte: elaborado pela autora.


179

Figura 17 – Resultados de crescimento do hipocótilo (cm) das plântulas de L. sativa,


após exposição às soluções binárias compostas pelos corantes Acid Blue 161 e
Procion Red MX-5B, tratadas pelos sistemas microbiológicos e
eletroquímico/microbiológicos.

Fonte: elaborado pela autora.

Analisando essas Figuras, verificou-se que a inibição de crescimento do


hipocótilo foi maior em relação ao crescimento radicular, indicando maior sensibilidade
do hipocótilo à presença de compostos tóxicos. Ao final de todos os tratamentos de
descoloração testados, ocorreu aumento da inibição de crescimento das raízes e do
hipocótilo. Os sistemas de tratamento envolvendo o fungo filamentoso A. terreus
apresentou-se menos tóxico para o desenvolvimento das plântulas, demonstrando
que esse micro-organismo possui maior capacidade de degradação/adsorção dos
metabólitos formados após os tratamentos de descoloração.

As análises estatísticas de crescimento radicular e do hipocótilo, realizadas


pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn), a 5 % de probabilidade (p<0,05), apresentaram
diferenças significativas entre os tratamentos de descoloração e o tratamento controle
negativo (água destilada), indicando que os tratamentos de descoloração foram
180

responsáveis por aumentar a inibição de crescimento das raízes e hipocótilo das


plântulas. Nas Tabelas 1, 2, 3 e 4, observam-se os resultados das análises estatísticas
obtidos respectivamente, para os tratamentos A. terreus, eletroquímico/A. terreus, S.
cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae.

Tabela 1 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular e do hipocótilo, das plântulas de L. sativa
após o tratamento de descoloração A. terreus da solução binária.

Raízes Hipocótilo
Controle negativo – Corante sem tratamento n.s. n.s.
Controle negativo – 72 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 144 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 216 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 288 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
72 h A. terreus – 144 h A. terreus n.s. n.s.
72 h A. terreus – 216 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
72 h A. terreus – 288 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05.
144 h A. terreus – 216 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
144 h A. terreus – 288 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
216 h A. terreus – 288 h A. terreus n.s. n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
181

Tabela 2 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa após o
tratamento de descoloração eletroquímico/A. terreus da solução binária.

Raízes Hipocótilo
Controle negativo – Corante sem tratamento n.s. n.s.
Controle negativo – 72 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 144 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 216 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 288 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h eletroquímico/A. terreus n.s. p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h eletroquímico/A. terreus n.s. p < 0,05
72 h eletroquímico/A. terreus – 144 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05 n.s.
72 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/A. terreus p < 0,05. p < 0,05
72 h eletroquímico/A. terreus – 288 h eletroquímico/A. terreus n.s. p < 0,05
144 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/A. terreus n.s. n.s.
144 h A. terreus – 288 h A. terreus p < 0,05 p < 0,05
216 h A. terreus – 288 h A. terreus p < 0,05 n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
182

Tabela 3 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa após o
tratamento de descoloração S. cerevisiae da solução binária.

Raízes Hipocótilo
Controle negativo – Corante sem tratamento n.s. n.s.
Controle negativo – 72 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 144 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 216 S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 288 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
72 h S. cerevisiae – 144 h S. cerevisiae n.s. n.s.
72 h S. cerevisiae – 216 h S. cerevisiae n.s. n.s.
72 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
144 h S. cerevisiae – 216 h S. cerevisiae n.s. n.s.
144 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
216 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
183

Tabela 4 – Resultados da análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis


(Dunn) dos dados de crescimento radicular, das plântulas de L. sativa após o
tratamento de descoloração eletroquímico/S. cerevisiae da solução binária.

Raízes Hipocótilo
Controle negativo – Corante sem tratamento n.s. n.s.
Controle negativo – 72 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 144 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Controle negativo – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento –72 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento – 144 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Corante sem tratamento – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 144 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s. n.s.
72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s. n.s.
72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
144 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 216 h eletroquímico/ S. cerevisiae n.s. n.s.
144 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae terreus p < 0,05 p < 0,05
216 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/ S. cerevisiae p < 0,05 n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Nas Tabelas 5 e 6, estão compilados os resultados das análises estatísticas


para os sistemas envolvendo o fungo e a levedura, respectivamente, em processos
sem e com pré-tratamento de oxidação eletroquímica. Comparando esses
tratamentos, verificou-se diferenças significativas entre eles, indicando que os
sistemas envolvendo a levedura apresentou maior capacidade causar efeitos nocivos
as plântulas de L. sativa.
184

Tabela 5 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular e do hipocótilo, das plântulas de L. sativa
comparativa entre os tratamentos de descoloração A. terreus e S. cerevisiae da
solução binária.

Raízes Hipocótilo
72 h A. terreus – 72 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
144 h A. terreus – 144 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
216 h A. terreus – 216 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
288 h A. terreus – 288 h S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Tabela 6 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular e do hipocótilo, das plântulas de L. sativa
comparativa entre os tratamentos de descoloração eletroquímico/A. terreus e
eletroquímico/S. cerevisiae da solução binária.

Raízes Hipocótilo
72 h eletroquímico/A. terreus – 72 h eletroquímico/S. cerevisiae n.s. n.s.
144 h eletroquímico/A. terreus – 144 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05.
216 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
288 h eletroquímico/A. terreus – 288 h eletroquímico/S. cerevisiae p < 0,05 p < 0,05
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

No intuito de reduzir a toxicidade das soluções, após os tratamentos de


descoloração, às soluções tratadas foram submetidas a processo de adsorção física
em argila imobilizada em alginato. Na Figura 18 observam-se os resultados de inibição
de crescimento das raízes e do hipocótilo das plântulas de L. sativa, para os
tratamentos A. terreus e A. terreus/argila.

Comparando esses tratamentos, é possível verificar que para as primeiras 72


h do tratamento A. terreus/argila, a taxa de inibição de crescimento das raízes e
hipocótilo foi aproximadamente 90 %. Essa taxa foi reduzindo e ao final das 288 h foi
de 50 e 60 % respectivamente, para as raízes e hipocótilo. O tratamento adsortivo
com a argila branca imobilizada em alginato apesar de ter removido intermediários
que foram formados após a degradação das moléculas dos corantes, quanto a
185

toxicidade aguda no tratamento A. terreus/argila, não foi obtido resultados


expressivos, sendo que, o melhor resultado obtido para após esse tratamento foi no
período de 288 h, com redução de 10 % na taxa de inibição do crescimento do
hipocótilo.

Figura 18 – Resultados de toxicidade para sementes de L. sativa após tratamento


de descoloração A. terreus. Valores antes e após tratamento adsortivo com argila
branca imobilizada em alginato de sódio. (A) Inibição de crescimento radicular e (B)
Inibição de crescimento do hipocótilo.

Fonte: elaborado pela autora.

Para o tratamento de descoloração eletroquímico/A. terreus, os resultados do


teste de toxicidade aguda foram semelhantes aos resultados obtidos para o
tratamento A. terreus. Mas nesse tratamento, o processo adsortivo com argila branca
foi mais eficiente, sendo que para solução resultante das 288 h de tratamento
eletroquímico/A. terreus/argila, a taxa de inibição final do hipocótilo reduziu de 78 para
40 %, e a inibição de crescimento das raízes foi de aproximadamente 50 %. Os
resultados obtidos para esse estudo, podem ser observados na Figura 19.
186

Figura 19 – Resultados de toxicidade para sementes de L. sativa após tratamento


descoloração eletroquímico/A. terreus. Valores antes e após tratamento adsortivo
com argila branca imobilizada em alginato de sódio. (A) Inibição de crescimento
radicular e (B) Inibição de crescimento do hipocótilo.

Fonte: elaborado pela autora.

Os estudos de toxicidade com as sementes de L. sativa apresentaram para o


tratamento S. cerevisiae de 72 a 216 h de tratamento, 100 % de inibição do
crescimento das raízes e hipocótilo. Somente após as 216 h de tratamento, que o
sistema começou a apresentar redução da taxa de toxicidade, demonstrando que a
partir desse momento, o sistema foi capaz de iniciar a degradação dos intermediários
formados após a biotransformação das moléculas dos corantes pela levedura. O
tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato reduziu a taxa de
inibição de crescimento das raízes e hipocótilo das plântulas, somente nos
tratamentos de 216 e 288 h, sendo que esta redução foi de aproximadamente 10 %
em relação a solução que não foi tratada com argila. Na Figura 20 estão descritos os
resultados de inibição de crescimento, das raízes e hipocótilo para esse estudo.

Para o tratamento eletroquímico/S. cerevisiae os resultados do teste de


toxicidade foram semelhantes aos resultados obtidos para o tratamento S. cerevisiae,
antes e após o tratamento de adsorção com a argila branca imobilizada em alginato.
Os resultados obtidos para esse estudo, podem ser observados na Figura 21.
187

Figura 20– Resultados de toxicidade para sementes de L. sativa, após


tratamento de descoloração S. cerevisiae. Valores antes e após tratamento adsortivo
com argila branca imobilizada em alginato de sódio. (A) Inibição de crescimento
radicular e (B) Inibição de crescimento do hipocótilo.

Fonte: elaborado pela autora.

Figura 21 – Resultados de toxicidade para sementes de L. sativa após


tratamento de descoloração eletroquímico/S. cerevisiae. Valores antes e após
tratamento adsortivo com argila branca imobilizada em alginato de sódio. (A) Inibição
de crescimento radicular e (B) Inibição de crescimento do hipocótilo.

Fonte: elaborado pela autora.


188

Nas Tabelas 7, 8, 9 e 10 podem ser observados os resultados das análises


estatísticas de crescimento radicular e do hipocótilo das plântulas, respectivamente,
para os tratamentos A. terreus, eletroquímico/A. terreus, S. cerevisiae e
eletroquímico/S. cerevisiae, após tratamento adsortivo com argila branca imobilizada
em alginato.

Redução significativa inibição de crescimento, após o tratamento de adsorção


com argila branca, foi observada para o tratamento eletroquímico/A. terreus (Tabela
7) somente no tempo de 144 h para as raízes e para o crescimento do hipocótilo não
houve diferença significativa entre os tempos testados. As análises para o tratamento
eletroquímico/A. terreus e eletroquímico/A. terreus/argila (Tabela 8) indicam que
ocorreu diferença significativa de toxicidade entre os tratamentos, nos tempos de 72,
144 e 216 h para as raízes e, 216 h para o hipocótilo. Para os sistemas envolvendo a
levedura (Tabelas 9 e 10), apenas o tempo tratamento de 216 h apresentou diferença
significativa para o crescimento das raízes e do hipocótilo após o tratamento adsortivo
com a argila branca.

Tabela 7 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos A. terreus e A. terreus/argila.

Raízes Hipocótilo
72 h A. terreus – 72 h A. terreus/argila n.s. n.s.
144 h A. terreus – 144 h A. terreus/argila p < 0,05 n.s.
216 h A. terreus – 216 h A. terreus/argila n.s. n.s.
288 h A. terreus – 288 h A. terreus/argila n.s. n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.
189

Tabela 8 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos eletroquímico/A. terreus e eletroquímico/A. terreus/argila.

Raízes Hipocótilo
72 h eletroquímico/A. terreus – 72 h eletroquímico/A. terreus/argila p < 0,05 n.s.
144 h eletroquímico/A. terreus – 144 h eletroquímico/A. terreus/argila p < 0,05 n.s.
216 h eletroquímico/A. terreus – 216 h eletroquímico/A. terreus/argila p < 0,05 p < 0,05
288 h eletroquímico/A. terreus – 288 h eletroquímico/A. terreus/argila n.s. n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Tabela 9 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos S. cerevisiae e S. cerevisiae/argila.

Raízes Hipocotilo
72 h S. cerevisiae – 72 h S. cerevisiae/argila n.s. n.s.
144 h S. cerevisiae – 144 h S. cerevisiae/argila n.s. n.s.
216 h S. cerevisiae – 216 h S. cerevisiae/argila p < 0,05 p < 0,05
288 h S. cerevisiae – 288 h S. cerevisiae/argila n.s. n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Tabela 10 – Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (Dunn) dos


dados de crescimento radicular das plântulas de L. sativa comparativa entre os
tratamentos eletroquímico/S. cerevisiae e eletroquímico/S. cerevisiae/argila.

72 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 72 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila n.s. n.s.


144 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 144 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila n.s. n.s.
216 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 216 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila p < 0,05 p < 0,05
288 h eletroquímico/ S. cerevisiae – 288 h eletroquímico/S. cerevisiae/argila n.s. n.s.
Nota: n.s. = não significativo; p < 0,05 = estatisticamente diferentes.

Analisando esses resultados, pode-se inferir que a argila demonstrou boa


capacidade de remoção dos intermediários tóxicos formados após a degradação da
solução binária composta pelos corante Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B, do meio
reacional, após o tratamento de adsorção física, favorecendo o crescimento radicular
190

e do hipocótilo das plântulas de L. sativa, principalmente no sistema eletroquímico/A.


terreus/argila, que apresentou os melhores resultados de redução de inibição de
crescimento das raízes das plântulas.

3.5 Salmonella/microssoma teste de Ames

O ensaio Salmonella/microssoma é o mais utilizado em pesquisas de


mutagênese ambiental, utilizando bactérias geneticamente modificadas para
determinar a ação mutagênica de compostos orgânicos. Esta técnica também permite
estimar o efeito genotóxico indireto em organismos superiores, utilizando um sistema
de metabolização exógeno (sistema microssomal S9, Moltox) de homogenato de
células do fígado de rato (FRANCO et al., 2018).

A cepa TA98 apresenta mutação no gene hisD (hisD3052), que codifica para a
histidinol desidrogenase, apresentando como ponto preferencial para a reversão de
oito resíduos repetitivos de G:C, favorecendo a detecção de compostos mutagênicos
que causam deslocamento do quadro de leitura do DNA (mutação frameshift: deleção
ou adição de pares de base do DNA). Para a cepa TA100 a mutação hisG46, encontra-
se no gene que codifica a primeira enzima do processo de biossíntese da histidina,
por meio da substituição do códon selvagem GGG (CCC) – prolina – por GAG (CAT)
– leucina. Assim, essa cepa detecta agentes mutagênicos que ocasionam
substituições de bases, principalmente neste par G:C (GADALETA et al., 2016;
ROCHA et al., 2017).

As duas linhagens utilizadas no ensaio possuem mutação rfa, que causa perda
parcial da barreira lipossacarídica, aumentando a permeabilidade da parede celular e
facilitando a difusão de moléculas grandes para o interior da célula; deleção do gene
uvrB, que proporciona elevação do número de lesões no DNA que são reparadas por
mecanismos sujeitos a erro; e introdução do plasmídeo PKM101, que causa o
aumento da atividade do sistema de reparo do DNA passível de erro, elevando a
mutagênese espontânea e induzida (RIBEIRO et al., 2003; MAZZEO, 2013).

Sendo assim, foram analisadas a atividade mutagênica da solução binária


composta pelos corantes Acid Blue 161 e Procion Red MX-5B, antes e após os
191

tratamentos eletroquímico/A. terreus/argila e eletroquímico/S. cerevisiae/argila. Nas


Tabelas 11, 12 e 13 observam-se os resultados de mutagenicidade para as
respectivas soluções.

As doses testadas de cada solução foram determinadas em porcentagem de


volume de amostra em relação a solução inicial. As porcentagens utilizadas foram 10,
20, 30, 40, 50, 75 e 100 % de solução inicial. As diluições das amostras foram
realizadas com água ultrapura estéril.

Na Tabela 11, estão compilados os dados obtidos para a solução binária sem
tratamento de descoloração. Analisando esses dados é possível verificar que foi
detectado presença de atividade mutagênica direta para a linhagem TA98, e
mutagênica após metabolização (presença sistema microssomal S9) para as
linhagens TA100 e TA98. Para a linhagem TA100 sem ativação metabólica (ausência
sistema microssomal S9) apesar do resultado não ser positivo para o efeito dose-
resposta, o teste de ANOVA foi significativo dando indicativo de mutagenicidade da
solução.
192

Tabela 11 – Resultados do teste de mutagenicidade com as linhagens TA98 e


TA100 de S. typhimurium com diferentes doses da solução binária controle.

Valor de P
Linhagem Dose Revertentes Média ± DP Slope
(ANOVA)
0 29 31 21 27 ± 5 0,001 0,489
10 20 31 26 26 ± 6
20 25 29 21 25 ± 4
TA98-S9

30 22 29 21 24 ± 4
40 22 36 29 ± 10
50 65 56 61 ± 6
75 71 68 70 ± 2
100 90 83 87 ± 5 **

0 258 241 260 259 284 260 ± 15,3 0,001 1,469


10 263 256 209 243 ± 29
20 248 288 268 ± 28
TA98+S9

30 294 318 273 295 ± 23


40 353 364 259 325 ± 58
50 307 309 371 329 ± 36
75 368 370 392 377 ± 13 **
100 381 337 423 380 ± 43 *

0 242 350 296 ± 76 0,001 -0,373


10 174 158 187 173 ± 15
TA100-S9

20 206 254 196 219 ± 31


30 169 182 198 183 ± 15
40 203 218 176 199 ± 21
50 130 139 160 143 ± 15
75 162 133 181 159 ± 24
100 183 204 210 199 ± 14

0 359 461 388 415 406 ± 43 0,015 2,568


10 434 424 429 ± 7
TA100+S9

20 403 380 341 375 ± 31


30 674 826 403 634 ± 214
40 567 594 567 576 ± 16 **
50 596 533 471 533 ± 63
75 425 832 607 621 ± 204
100 629 690 520 613 ± 86 *

Nota: *p<0,05 e **p<0,01 estatisticamente diferentes em relação ao controle negativo.

Para o tratamento eletroquímico/A. terreus/argila, Tabela 12, houve atividade


mutagênica da solução final com efeito dose-resposta positivo somente para a
linhagem TA100 com presença de ativação metabólica. Para TA98 com e sem S9 e
TA100 sem S9 não verificou-se atividade mutagênica, após o tratamento de
descoloração.
193

Tabela 12 – Resultados do teste de mutagenicidade com as linhagens TA98 e


TA100 de S. typhimurium com diferentes doses da solução binária após o
tratamento eletroquímico/A. terreus/argila.

Valor de P
Linhagem Dose Revertentes Média ± DP Slope
(ANOVA)
0 29 31 21 27 ± 5 0,058 -0,013
10 87 65 44 65 ± 22
20 15 52 59 42 ± 24
TA98-S9

30 26 94 50 57 ± 24
40 13 22 36 24 ± 12
50 40 59 68 56 ± 14
75 40 42 36 39 ± 3
100 37 31 27 32 ± 5

0 258 241 260 259 284 260 ± 15 0,380 0,159


10 257 260 231 249 ± 16
20 262 248 228 246 ± 17
TA98+S9

30 267 258 240 255 ± 14


40 243 272 264 260 ± 15
50 252 274 253 260 ± 12
75 275 217 261 251 ± 30
100 284 274 285 281 ± 6

0 350 396 381 242 342 ± 70 0,240 -0,354


10 247 202 255 235 ± 29
TA100-S9

20 212 253 226 230 ± 21


30 201 207 222 210 ± 11
40 243 210 201 218 ± 22
50 261 246 276 261 ± 15
75 216 206 186 203 ± 15
100 214 207 375 265 ± 95

0 359 461 388 415 406 ± 43 0,014 2,472


10 575 534 555 ± 29 *
20 594 540 517 ± 109
TA100+S9

30 478 471 554 501 ± 46


40 553 698 420 557 ± 139
50 656 569 386 537 ± 138
75 583 548 420 517 ± 86
100 768 900 746 805 ± 83 **
Nota: *p<0,05 e **p<0,01 estatisticamente diferentes em relação ao controle negativo.

Os resultados obtidos para o tratamento eletroquímico/S. cerevisiae/argila


estão compilados na Tabela 13. Analisando esses dados verifica-se que existe
atividade mutagênica para ambas linhagens na presença de ativação metabólica (S9).
Para a linhagem TA100 sem S9 o efeito dose-resposta foi negativo, mas a análise de
ANOVA deu indicativo de mutagenicidade. E para TA98 sem S9 não foi observado
atividade mutagênica.
194

Tabela 13 – Resultados do teste de mutagenicidade com as linhagens TA98 e


TA100 de S. typhimurium com diferentes doses da solução binária após o
tratamento eletroquímico/S. cerevisiae/argila.

Valor de P
Linhagem Dose Revertentes Média ± DP Slope
(ANOVA)
0 29 31 21 27 ± 5 0,063 -0,045
10 44 34 39 ± 7
20 62 35 73 57 ± 20
TA98-S9

30 36 36 25 32 ± 6
40 29 25 50 38 ± 13
50 25 30 19 25 ± 6
75 36 29 33 33 ± 4
100 35 34 17 29 ± 10

0 258 241 260 259 284 260 ± 15 0,004 0,535


10 249 259 246 251 ± 7
20 287 239 285 270 ± 27
TA98+S9

30 284 257 263 268 ± 14


40 296 266 250 271 ± 23
50 298 305 302 ± 5 *
75 291 288 298 292 ± 5 *
100 315 302 314 310 ± 7 *

0 350 396 381 242 342 ± 70 0,026 0,367


10 253 195 169 206 ± 43
TA100-S9

20 200 268 265 244 ± 38


30 171 286 299 252 ± 70
40 214 248 296 253 ± 41
50 263 202 165 210 ± 50
75 287 332 300 306 ± 23
100 283 329 315 309 ± 23

0 359 461 388 415 406 ± 43 0,001 4,683


10 488 428 370 429 ± 59
TA100+S9

20 490 486 491 489 ± 3


30 520 419 476 472 ± 51
40 246 315 380 314 ± 67
50 862 642 864 789 ± 128 *
75 686 722 764 785 ± 75 **
100 1458 1022 1240 ± 308 *
Nota: *p<0,05 e **p<0,01 estatisticamente diferentes em relação ao controle negativo.

Foi realizado também a análise da potência mutagênica das amostras, que é


determinada pela inclinação da parte linear da curva dose-resposta. De forma geral,
diferenças significativas entre doses testadas e o controle negativo, e relação dose-
resposta comprovada estatisticamente indicam atividade mutagênica da amostra
(UMBUZEIRO; VARGAS, 2003). Sendo assim, a partir dos valores de slope obtidos
para cada conjunto de amostras testado (Tabelas 1, 2 e 3), foram determinados o
195

potencial mutagênico para cada ensaio que obteve resultado positivo para atividade
mutagênica. Esses valores podem ser observados na Tabela 14.

Tabela 14 – Potencial mutagênico das soluções controle e após os tratamentos de


descoloração eletroquímico/microbiológico/argila.

TA98 +S9 TA98 -S9 TA100 +S9 TA100 -S9


Solução binária controle 1469 489 2568 (*)
Eletroquímico/A. terreus/argila (-) (-) 2472 (-)
Eletroquímico/S. cerevisiae/argila 535 (-) 4683 (*)
Nota: (*) indicativo de mutagenicidade; (-) não mutagênico.

Analisando essa Tabela é possível inferir que a solução binária inicial


apresentou alta potência mutagênica para a TA98 +S9, TA98 -S9, TA 100 +S9. Para
TA100 -S9 somente obtivemos indicativo de mutagenicidade. Os resultados de
mutagenicidade positivos e alto valor de potência mutagênica para os ensaios com
presença de ativação metabólica, indicam que as moléculas dos corantes Acid Blue
161 e Procion Red MX-5B são potentes pró-mutágenos, ou seja, induzem
principalmente efeito mutagênico, após serem metabolizadas. Mas também são
mutágenos diretos, pois apresentou resultado positivo de mutagênese para TA98 -S9
e indicativo de mutagenicidade para TA100 -S9.

Após o consórcio de tratamentos eletroquímico/A. terreus/argila a solução


tratada não apresentou atividade mutagênica para TA98 +S9, TA98 -S9, TA 100 -S9.
Para TA100 +S9 a solução continuou a apresentar atividade mutagênica, indicando
que os metabólitos formados após a degradação das moléculas dos corantes, também
são pró-mutágenos, embora possuam uma potência mutagênica ligeiramente menor,
em relação a solução binária antes do tratamento.

Para o tratamento eletroquímico/S. cerevisiae/argila a solução não apresentou


atividade mutagênica para TA98 -S9. Para TA98 +S9 não ocorreu desaparecimento
da atividade mutagênica, mas obteve-se redução de 64 % do potencial mutagênico
da solução. O resultado mais crítico foi para TA100 +S9, que teve aumento de 182 %
do potencial mutagênico após o tratamento, indicando que os intermediários formados
são pró-mutágenos altamente mutagênicos, tendo predileção por mutações por
196

substituição de pares de base. Para TA100 -S9 a solução continuou apresentando


indicativo de mutagenicidade.

Fransciscon et al. (2015), estudaram a degradação do corante Disperse Red 1


em um reator aeróbio, utilizando um consórcio microbiano e, em 60 h de tratamento
obtiveram 80 % de descoloração e 92 % de redução da demanda química de oxigênio
da solução. Análises de cromatografia líquida associada a espectrometria de massas
indicaram que ocorreu quebra das azo ligações das moléculas do corante, porém,
presença de aminas aromáticas não foram detectadas na solução. Testes de
toxicidade aguda com Daphnia similis e Hydra attenuata mostrou redução da
toxicidade após o tratamento microbiológico. O teste de Ames que indicou
mutagenicidade da molécula inicial do corante para a linhagem de Salmonella YG1041
e, após o tratamento observou-se apenas mutagenicidade marginal das soluções
tratadas.

Após a análise desses resultados é possível afirmar que quanto a eficiência


dos tratamentos, o sistema eletroquímico/A. terreus/argila foi o melhor, já que
conseguiu descolorir às soluções e transformar compostos mutagênicos diretos em
compostos não mutagênicos, além conseguir reduzir a potência mutagênica para a
cepa TA100 +S9.

4 CONCLUSÃO

Analisando à descoloração dos sistemas testados, é possível afirmar que todos


foram eficientes, removendo ao final de 288 h 100 % da cor das soluções. O
tratamento adsortivo com argila apresentou grande capacidade de remoção de
metabólitos tóxicos que foram formados após a degradação dos corantes Acid Blue
161 e Procion Red MX-5B associados em solução binária. A eficiência do tratamento
com a argila pode ser comprovada com a redução da toxicidade aguda das soluções
para as sementes de L. sativa. As análises de HPLC – UV em 292 nm, região
característica de compostos amino aromáticos, também demonstraram que ocorreu
redução do pico em 3,53 min, após interação com argila, confirmando assim a
capacidade desse substrato para remover intermediários com grande potencialidade
toxicológica.
197

Os sistemas eletroquímico/microbiológicos testados apresentaram os melhores


resultados quanto à descoloração e toxicidade aguda, pós tratamento adsortivo com
argila, indicando que a presença do pré-tratamento de oxidação eletroquímica
aumentou a eficiência do sistema para degradar e/ou mineralizar moléculas orgânicas.

O ensaio Salmonella/microssoma demonstrou que, antes dos tratamentos, a


solução binária era mutagênica para as linhagens TA98 e TA100 de S. typhimurium.
Após o tratamento eletroquímico/A. terreus/argila a solução binária apresentou
atividade mutagênica somente para a linhagem TA100 com presença de ativação
metabólica. O mesmo resultado foi obtido para as linhagens TA98 e TA100 na
presença de atividade metabólica, após o tratamento eletroquímico/S.
cerevisiae/argila. Ou seja, os intermediários formados após a degradação dos
corantes só possuem atividade mutagênica, após metabolização no sistema
cromossomal S9.

Quanto à eficiência dos tratamentos é possível afirmar que o sistema


eletroquímico/A. terreus/argila foi o melhor que o sistema envolvendo a levedura S.
cerevisiae, já que conseguiu descolorir às soluções e transformar compostos tóxicos
e não tóxicos diretos em compostos não mutagênicos, além conseguir reduzir a
potência mutagênica para TA100 +S9.
198

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