Universidade Federal de São Paulo

Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas Campus Diadema

Análise instrumental II - ADE

RELATÓRIO 1- Cromatografia Líquida - HPLC

ALUNOS
1- Julia Guirão Ferreira - 142471
2- Lais Julio Marinheiro - 143502
3- Milena Santana Costa - 140296

EXPERIMENTO: Influência do fluxo da bomba na separação de triptofano, tirosina e fenilalanina.

ROTEIRO
1. Instrumentação e condições analíticas
• Equipamento: HPLC marca Shimadzu
• Detecção UV em 254 nm
• Coluna: C18, 15 cm de comprimento, tamanho de partícula 3 µm;
• Fluxo da bomba a ser avaliado: 1,0, 1,5 e 2,0 ml/min;
• Volume de Injeção: 20 µL
• Fase móvel: Água/metanol (75:25)

2. Amostra
Solução A contendo uma mistura de padrões: triptofano, tirosina e fenilalanina na concentração
de 1,0 mMol L-1 cada.

3. Procedimento (fazer em triplicata)

• Injetar o branco (água) em uma fluxo de 1.0 ml/;
• Injetar a solução A em um fluxo de 1.0 ml/;
• Injetar a solução A em um fluxo de 1.5 ml/;
• Injetar a solução A em um fluxo de 2.0 ml/
 Item 1 - Qual o valor de prato teórico em cada condição de separação para cada?
Segundo a fórmula abaixo, é possível calcular os pratos teóricos de cada condição de separação:

Dessa forma, com a fórmula descrita acima, os dados da tabela abaixo e sabendo que quanto maior
o N, maior a eficiência da separação, assim como quanto menor o N, menor a separação, é possível
calcular o número de pratos teóricos (N) de cada fluxo de injeção, e ainda, realizar uma
interpretação dos resultados:

Para o fluxo de 1 mL/min:

Para o fluxo de 1,5 mL/min:

Para o fluxo de 2 mL/min:

Levando em conta que cada número de pratos teóricos (N) representa uma etapa de equilíbrio entre a fase
estacionária e a fase móvel, é possível concluir que o fluxo de 1 mL/min obteve a melhor eficiência no
processo, o que também é possui observar quando os cromatogramas são analisados.
4. Relatório

a) (2,0) Qual a ordem de eluição dos compostos? Apresentar as estruturas químicas e

discutir.

No experimento, foi usada como fase móvel uma proporção de 75 de água para 25 de metanol,
ou seja, ela possui alta polaridade. Em geral, a relação entre polaridade e solubilidade consiste
em, o soluto polar se dissolve num solvente polar e o soluto apolar se dissolve em solvente
apolar.
Assim, observando as estruturas abaixo e seus respectivos grupamentos, é possível concluir que a
tirosina é o primeiro composto a ser eluído devido sua alta polaridade, afinal apresenta em sua
estrutura um grupo fenil, um ácido carboxílico e uma amina primária - grupos aceptores de
elétrons. Em seguida, o segundo composto a ser retido é a fenilalanina, pois, em sua estrutura
existe um ácido carboxílico e uma amina primária, dessa forma, a fenilalanina possui eluição
intermediária, apresenta menos grupamentos polares do que a tirosina. E por fim, o último
composto a ser eluído é o triptofano, pois apesar de ter em sua estrutura um ácido carboxílico e
uma amina primária e secundária, sua cadeia carbonílica é grande e com a presença de anéis,
tornando-o o menos polar dentre os três compostos em análise.

Triptofano
Tirosina

Fenilalanina

b) (2,0) Discutir a variação do tempo de retenção dos compostos em cada fluxo.

O tempo de retenção é definido pelo tempo decorrido entre a injeção da amostra e o ápice do
pico cromatográfico. Quanto mais polar for o composto, menos retido ele ficará, pois sua
afinidade maior será pela fase móvel. Dessa forma podemos concluir que a ordem de tempo de
retenção é Triptofano > Fenilalanina > Tirosina.
c) (2,0) Discutir o aumento da pressão da bomba.
A HPLC é utilizada para separar compostos com alto peso molecular que possuam baixa
volatilidade e não apresentam possibilidade de serem separados por cromatografia gasosa,
devido a característica desses compostos que se torna necessária a utilização da bomba. Sabendo
que o aumento da bomba está relacionado diretamente com o aumento de pressão ocorre,
consequentemente, o aumento do fluxo presente na coluna. Logo, com o crescente aumento da
vazão mL/min, na coluna, as substâncias interagem menos com a fase estacionária e, portanto, a
eficiência de separação entre as substâncias, nesse caso, é menor e por isso que os picos estão
mais próximos no fluxo de 2 mL/min.

d) (2,0) Qual o valor do prato teórico para o último pico em cada fluxo?
Questão respondida no item 1

e) (2,0) Se uma indústria tem 10 cromatógrafos e opera 360 dias por ano, 24 horas, qual o
volume de resíduo produzido em cada condição de fluxo.

Para o fluxo de 1 mL/min:

Para o fluxo de 1,5 mL/min:

 Para o fluxo de 2 mL/min:

DADOS DO EXPERIMENTO :
Fluxo (mL/min) Pressão da bomba (kgf) Tr último pico (min) Wb do último pico (min)

1 171 4,4 0,5

1,5 245 2,9 0,4

2,0 320 2,3 0,3

Fluxo 1 mL/min
Fluxo 1,5 mL/min

Fluxo 2,0 mL/min