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PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO PADRÃO

Assunto :CUIDADOS EM UMA ANÁLISE DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA


EFICIÊNCIA
Procedimento n°.: Substitui n°.: Página:
B.178-4 B.178-3 1 / 23

Departamento Emissor : Preparado por :


CONTROLE DE QUALIDADE
Aprovado por Departamento Emissor : Aprovado por Garantia de Qualidade :
JANAÍNA DOMINGUES MACARI
Unidade : Data de Vigência : Visto/G.Q. :
EMBU-GUAÇU ____ / ____ / ____ _______________

A. OBJETIVO

1. Estabelecer normas e padronizar limpeza e condicionamento das colunas de Cromatografia


Líquida de Alta Eficiência (HPLC).

2. Assegurar a correta preparação e uso de fase móvel para HPLC.

3. Estabelecer normas e padronizar a verificação das condições dos sistemas de HPLC no


Laboratório de Controle de Qualidade.

4. Descrever a rotina de análise cromatográfica do Laboratório de Controle de Qualidade.

B. DEFINIÇÕES

Número de Pratos Teóricos (N) - Medida da eficiência da coluna.

Repetibilidade do Sistema Cromatográfico – Medida através do Cálculo Desvio Padrão Relativo


(DPR) em injeções consecutivas de uma solução na coluna que está sendo testada.

Fator de Encaudamento ( T ) – Parâmetro utilizado para medir a simetria dos picos.

Resolução – Separação, entre dois picos subsequentes. Cálculo efetuado em determinações


quantitativas.

Linearidade da Resposta Cromatográfica – Cálculo efetuado para verificar a linearidade de uma


solução padrão utilizada dentro de uma faixa de 10%; preparando-se uma segunda solução padrão
com uma concentração conhecida de 10% acima.

C. ÁREAS ENVOLVIDAS

- Laboratório de Controle de Qualidade

D. PROCEDIMENTO

1. Colunas Cromatográficas
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1.1. As especificações para colunas de HPLC variam de acordo com cada fabricante.
Por isso, é importante verificar as especificações e cuidados no boletim informativo do
produto.

1.2. Lavar a coluna após o seu uso.

1.3. Tipos de colunas

COLUNA TIPO FAIXA DE TRABALHO


C18, RP18, ODS Fase reversa pH 2 a 8 (ideal entre 4 e 7)
Nitrila, CN Fase normal ou reversa pH 2 a 8 (ideal entre 4 e 7)
Amino, NH2 Fase normal ou reversa pH 2 a 8 (ideal entre 4 e 7)
Diol Fase normal pH 2 a 7
Sílica gel Fase normal pH 2 a 7

1.4. A eficiência da coluna depende de:

1.4.1. Tamanho médio da partícula da fase estacionária

1.4.2. Distribuição da partícula da fase estacionária.

1.4.3. Forma da partícula da fase estacionária (esférica ou irregular)

1.4.4. Comprimento da coluna

1.4.5. Viscosidade da fase móvel

1.4.6. Uniformidade no leito da fase estacionária

1.4.7. Polaridade do solvente utilizado para dissolver a amostra

1.4.8. Diâmetro da coluna

1.4.9. Efeitos extra-coluna (conexões, tubulações).

1.5. Cálculo da Eficiência da Coluna

1.5.1. O cálculo de N pode ser feito pelas seguintes equações

2
N= 5,54 t
Wh/2

Onde:
N = número de pratos teóricos por metro
t = tempo de retenção
Wh/2 = largura do pico a meia altura
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C = comprimento da coluna em cm

Esta fórmula é utilizada no cálculo de System Suitability do Empower; é também


citada na USP sendo adotada internamente no cálculo manual de eficiência de
colunas.

2
N= 16 t
W

Onde:
N = número de pratos teóricos por metro
t = tempo de retenção
W = largura do pico na base
C = comprimento da coluna em cm

Esta representa uma segunda fórmula para cálculo de eficiência de colunas


apresentada pela USP.

2
N= 25 t
Wh4%

Onde:
N = número de pratos teóricos
t= tempo de retenção
Wh4% = largura do pico a 4% da altura

OBS: Este cálculo para eficiência de colunas foi baseado no catálogo do fabricante
de colunas cromatográficas (Waters)

1.5.2. É necessário, ao se fazer o teste de eficiência para abertura de colunas


cromatográficas, definir os parâmetros de integração e processamento:
(fixar “treshould”, “largura do pico” e “intervalo de inibição”).

1.5.3. A razão entre o número de pratos teóricos e o comprimento da coluna, pode ser
representada por N/L. Quando o valor N/L for menor que 15.000, ou quando o fator
de cauda não apresentar valores entre a faixa de aceitação de 0,8 a 1,5, adotar os
seguintes procedimentos:
- Limpeza
- Regeneração (obedecendo o mesmo sentido de fluxo)
- Inversão de fluxo
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Ver item 8.3. deste POP.

O analista deve realizar o teste de eficiência de colunas após efetuar cada


procedimento, e só passar para o procedimento seguinte quando o resultado não for
satisfatório. Se após realizar todos os procedimentos acima e o valor N/L for menor
que 15.000 ou então o fator de cauda não atender a faixa de 0,8 a 1,5, a coluna deve
ser avaliada junto a supervisão que então autorizará o seu descarte.

1.5.4. O Teste de Eficiência de Coluna deve ser realizado anualmente, tanto nas Estoque
de Colunas e Colunas em Uso.

NOTA: Todos os dados devem ser adequadamente registrados (Anexo I) e


arquivados em pasta devidamente identificada.

1.5.5. O número de pratos teóricos definido no teste de adequabilidade do sistema da


metodologia farmacopéica específica deve ser rigorosamente seguido. No caso do
teste não ser especificado na monografia, ou esta não ser farmacopéica, o Teste de
Eficiência da Coluna deve ser realizado segundo item 1.6, se necessário
(consultando a folha de registro da coluna).

1.6. Fluxograma da Coluna Cromatográfica

1.6.1. Quando a coluna requisitada pelo Departamento de Compras chega ao Laboratório, o


analista responsável deve registrá-la preenchendo o cabeçalho do formulário (anexo
I) e deixando em branco os espaços de “ Nº” e “DATA DE INICIO DE UTILIZAÇÃO”.

1.6.2. Consultar o item 1.7 deste POP e preencher os espaços correspondentes às


condições cromatográficas para realização do teste de eficiência de colunas.

1.6.3. Antes do teste de eficiência, a coluna deve ser ativada. Portanto, condicionar o
sistema cromatográfico de acordo com o tipo de coluna a ser ativada:

- Fase Reversa: ativação com 100% de metanol


- Fase Normal: ativação com 100% de hexano

Dessa maneira, garante-se a retirada de qualquer traço de água, fase móvel ou outro
solvente diverso da tubulação.

1.6.4. Conectar a coluna neste sistema cromatográfico e ativá-la durante 20 minutos com o
solvente adequado (metanol ou hexano) a um fluxo de 1,0mL/min.
Obs: procedimento válido para as colunas de fase reversa e de sílica. Em caso de
dúvida, consultar o manual que acompanha a coluna.

1.6.5. Realizar o Teste de Eficiência de Coluna com as condições cromatográficas pré-


definidas e registradas no formulário.

1.6.6. Integrar e processar o pico utilizando o recurso de cálculo do Empower (treshould,


largura do pico, intervalo de inibição).
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1.6.7. Preencher os campos da tabela considerando que, neste caso, o espaço


correspondente a “Procedimento” deve ser 1 (Abertura).

1.6.8. Anexar ao formulário devidamente preenchido o Certificado da coluna (se existir) e o


cromatograma contendo o resultado do número de pratos teóricos e fator de cauda.

1.6.9. Arquivar estes documentos em uma pasta identificada como “Estoque de Colunas”.

1.6.10. Quando o analista responsável julgar necessário, pode-se retirar uma determinada
coluna do estoque e colocá-la em uso através dos procedimentos descritos abaixo:

Analisar a fase móvel que será utilizada e classificar a coluna no grupo


correspondente (anexo II).

Consultar a pasta de “Colunas em Uso” e numerar a coluna de


maneira sequencial, etiquetando a mesma como forma de identificação. Isto é feito
colocando-se G (grupo), especificando qual o grupo (I, II, III, IV, V, VI, uso
específico), a ordem sequencial e a unidade (PA= Pouso Alegre). Por exemplo, GII-
4/PA.

Localizar o Formulário desta coluna na pasta de “Estoque de Colunas” e preencher


os campos de “Nº” E “DATA DE INÍCIO DE UTILIZAÇÃO”.

Transferir os documentos correspondentes a esta coluna da pasta de “Estoque de


Colunas” para a de “Colunas em Uso”.

Passado 1 ano da data de início de utilização da coluna, deve ser realizado novo
Teste de Eficiência correspondendo ao Procedimento 2 (rotina) devidamente
preenchido no Formulário (anexo I).

Em casos excepcionais pode ser feito o Teste de Eficiência antes de vencer 1 ano,
ou seja, quando a coluna apresentar desvios de performance. Nestes casos,
primeiramente se faz a Limpeza de Regeneração (ver 1.9) e realiza-se o Teste de
Eficiência correspondendo ao Procedimento 3. Se o número de pratos teóricos por
metro e/ou fator de cauda continuar apresentando valores insatisfatórios, a coluna
deve ser invertida (com a devida identificação usando para isso uma etiqueta em
forma de seta que indicará o novo sentido de fluxo) e realizar um novo Teste de
Eficiência (Procedimento 4). Esgotada todas as possibilidades de regeneração e a
coluna continuar com desvios nos parâmetros de aceitação (número de pratos
teóricos por metro e/ou fator de cauda) a coluna deve ser descartada (Procedimento
5) sob autorização da supervisão.

1.7. Condições cromatográficas para Teste de Eficiência de Colunas


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OBS.: As soluções de comparação abaixo descritas devem ser preparadas no dia do


uso. O seu registro assim como o das Fases Móveis devem seguir POP B.035

1.7.1. Colunas de Fase Reversa (C18 e similares, CN, NH 2, Fenil)

- Fase Móvel: Acetonitrila + Água (60:40)


- Fluxo: 1,0 mL / minuto
- Detector UV: 254 nm
- Volume de injeção: 5 µL
- Solução de Comparação: 25,0 mg de naftaleno / bv 50 mL com fase móvel

1.7.2. Método alternativo para colunas C18 e similares

- Fase Móvel: Acetonitrila + Água (40 : 60)


- Fluxo: 1,0 mL / minuto
- Detector UV: 254 nm
- Volume de injeção: 5 µL
- Solução de Comparação: 25,0 mg de naftaleno / bv 50 mL com fase móvel

1.7.3. Colunas de Fase Normal (sílica, diol, CN, NH2)

- Fase Móvel: Hexano + Etanol (95 :5)


- Fluxo: 1,0 mL / minuto
- Detector UV: 254 nm
- Volume de injeção: 5 µL
- Solução de Comparação: 25,0 mg de tolueno / bv 100 mL com fase móvel

1.7.4. Coluna Polymerx 5 µ RP-1 100A 4,6 x 250 mm (L21)

- Fase Móvel: Ácido cítrico 0,05M pH 4,2 ajustado com NaOH 1N


- Fluxo: 0,75 mL / minuto
- Detector UV: 254 nm
- Volume de injeção: 5 µL
- Solução de Comparação: 25,0 mg de uridina / bv 25 mL com fase móvel

OBS.: Esta coluna possui recheio de poliestireno divinilbenzeno (PSDVB) e não deve ser
submetida a temperatura maior que 60ºC e pressão acima de 5000 psi; a faixa de pH
da fase móvel utilizada pode variar de 0 a 14 e o procedimento de limpeza consiste
em passar água durante 20 minutos e a seguir fazer um gradiente com água e
acetonitrila por 30 minutos, começando com 100% de água e terminando com 100%
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de acetonitrila e tal gradiente deve ser repetido 3 vezes, sendo que a coluna deve ser
guardada com Solvente de Limpeza (acetonitrila + água 90 :10)

1.7.5. Hamilton PRP-1 5 µm 4,1 x 150 mm ou 4,6 x 250 mm

- Fase Móvel: Ácido cítrico 0,05M pH 4,2 ajustado com NaOH 1N


- Fluxo: 1,0 mL / minuto
- Detector UV: 254 nm
- Volume de injeção: 5 µL
- Solução de Comparação: 25,0 mg de uridina / bv 25 mL x 5,0 mL / bv 25 mL com
fase móvel

1.7.6. OHpak SB-804 HQ 8 x 300 mm Shodex

- Fase Móvel: Água Milli-Q


- Fluxo: 0,8 mL / minuto
- Detector: índice de refração (refratômetro)
- Volume de injeção: 5 µL
- Solução de Comparação: solução aquosa de etilenoglicol a 0,5%

1.7.7. Método alternativo para Phenosphere 5 µ CN 80A

- Fase Móvel: Metanol + Água (50 : 50)


- Fluxo: 1,0 mL / minuto
- Detector UV: 254 nm
- Volume de injeção: 5 µL
- Solução de Comparação: 25,0 mg de bifenil / bv 25 mL x 5,0 mL / bv 50 mL com
fase móvel

1.7.8. Phenogel 5 µ 100A 7,8 x 300 mm (Colunas de Permeação em Gel)

Usar sempre a pré-coluna Phenogel 5 µ Linear / Mixed 50 x 7,8 mm a fim de


prolongar a vida útil da coluna.

Os solventes mais comumente utilizados no armazenamento da coluna são THF,


clorofórmio, cloreto de metileno e tolueno, devendo ser evitados alguns que
evaporam a temperatura ambiente (acetona, éter etílico) ou que são agentes
oxidantes (DMSO).

A utilização da coluna com diferentes solventes deve ser evitada sendo recomendado
que dedique a coluna para um solvente específico, mas caso seja necessário, alguns
critérios devem ser adotados:
Checar a miscibilidade dos diferentes solventes de acordo com a tabela abaixo:
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Durante o processo de troca dos solventes o fluxo deve ser reduzido para 0,2 mL /
minuto e a pressão não deve exceder 650 psi.
O uso de solventes impróprios pode danificar a coluna. Por isso, após averiguar a
miscibilidade dos dois solventes em questão, é necessário avaliar o esquema abaixo:

A - 70-80% SWELL
Toluene TCB
THF p-Xylene
Chloroform Cyclopentane
Benzene Pyridine
o-Dichlorobenzene

B – 60% SWELL
Ethyl Ether
Methylene Chloride
Methyl Ethyl Ketone
Cycloheptane
Ethyl Acetate

C – 50% SWELL
Acetone Dimethyl Acetamide
m-Cresol N-Methyl Pyrrolidone
o-Chlorophenol DMSO
Dimethyl Formaldehyde Dioxane

D – 30% SWELL
Acetonitrlle Iso-Propanol
Cyclohexane n-Butyl Alcohol
Freon 113 Methanol
HFIP

Se os solventes 1 e 2 são miscíveis e pertencem a mesma categoria, a troca pode


ser realizada; se os solventes 1 e 2 são miscíveis e pertencem a categorias
sucessivas, então a troca também pode ser feita; porém se os solventes 1 e 2 não
pertencem a mesma categoria e não são de categorias sucessivas, então a troca
deve ser feita usando primeiramente um solvente intermediário (como consta no
esquema acima).
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Segue abaixo uma tabela indicando quais solventes podem ser usados ou não com a
Coluna Phenogel.

PHENOGEL PORE SIZE LINEAR & SUGGESTED


MOBILE PHASE SOLVENT 50Â 100Â 500Â 103Â 104Â 105A 106A MIXED OPERATING

CHART FOR PHENOGEL GCP


TEMPERATURE

SOLVENT COMPATIBILITY
ACETONE Y Y Y Y Y Y Y Y
BENZENE Y Y Y Y Y Y Y Y
CARBON TETRACHLORIDE Y Y Y Y Y Y Y Y

COLUMNS
TABLE 13
CHLOROFORM Y Y Y Y Y Y Y Y
30%HFIP/CHLOROFORM Y Y Y Y Y Y Y Y
DIETHYL ETHER Y Y Y Y Y Y Y Y
DIMETHYLACETAMIDE (DMAC) Y* Y Y Y Y Y Y Y 60ºC
DIMETHYLACETAMIDE (DMF) Y* Y Y Y Y Y Y Y 60ºC
DIOXANE Y Y Y Y Y Y Y Y
DMSO Y* Y Y Y Y Y Y Y 60ºC
ETHYL ACETATE Y Y Y Y Y Y Y Y
HEXAFLUOROISOPROPANOL (HEIP) Y Y Y Y Y Y Y Y
* Not recommended on 5µ 50Â columns. N= NOT COMPATIBLE Y= COMPATIBLE

PHENOGEL PORE SIZE LINEAR & SUGGESTED


MOBILE PHASE SOLVENT 50Â 100Â 500Â 103Â 104Â 105A 106A MIXED OPERATING

CHART FOR PHENOGEL GCP


TEMPERATURE

SOLVENT COMPATIBILITY
HEXANE Y Y Y Y Y Y Y Y
M -CRESOL Y* Y Y Y Y Y Y Y 100ºC
METHYL ETHYL KETONE Y Y Y Y Y Y Y Y

COLUMNS
METHYLENE CHLORID Y Y Y Y Y Y Y Y TABLE 13
O-CHLOROPHENOL Y* Y Y Y Y Y Y Y 100ºC
O-DICHLOROBENZENE Y* Y Y Y Y Y Y Y 135ºC
QUINOLIN Y* Y Y Y Y Y Y Y 60ºC
TETRAHYDROFURAN Y Y Y Y Y Y Y Y
TOLUENE Y Y Y Y Y Y Y Y
TRICHLOROBENZENE Y* Y Y Y Y Y Y Y 135ºC
WATER N N N N N N N N
XYLENE Y Y Y Y Y Y Y Y
* Not recommended on 5µ 50Â columns. N= NOT COMPATIBLE Y= COMPATIBLE

Condições Cromatográficas para o Teste de Eficiência


- Fase Móvel: THF
- Fluxo: 1,0 mL / minuto
- Detector UV: 280 nm
- Volume de injeção: 1 µL
- Solução de Comparação: Acetona

Dessa maneira, a coluna será armazenada com THF sendo que, no momento da
abertura da coluna para o uso na rotina, é necessário avaliar a compatibilidade do
solvente que será adotado com o THF.

1.8. Condições de Armazenagem da Coluna

- C18 e similares: Acetonitrila + Água (90 : 10)


- NH2 / CN: Acetonitrila + Água (90 : 10)
- Sílica: Hexano
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- Outras: Conforme instrução do fabricante

1.9. Limpeza das colunas

1.9.1. Sempre que utilizar fase móvel contendo sais, lavar a coluna imediatamente após o
uso com água grau HPLC durante, 30 minutos e fluxo máximo de 1,0 mL / minuto.
Em seguida repetir o procedimento com solvente de lavagem (Acetonitrila + água,
90:10). Quando for utilizada uma fase móvel que contenha apenas água e solventes
orgânicos, lavar a coluna somente com solvente de lavagem conforme procedimento
acima.
OBS.: Lembrar que antes de usar uma coluna que tinha sido armazenada com
acetonitrila : água 90:10 com fase móvel contendo sais deve-se utilizar água
primeiro, antes da fase móvel.

1.9.2. Sílica
Lavar a coluna com THF por 30 minutos e em seguida com hexano por 30 minutos.

NOTA 1: Antes de utilizar a coluna com uma fase móvel imiscível com água, submeter
sistema cromatográfico a uma lavagem com metanol ou acetonitrila por 20 minutos,
em seguida com THF por mais 20 minutos. Conectar a coluna e passar THF por mais
10 minutos. A seguir, colocar a fase móvel.

NOTA 2: É necessário trocar o Solvente de Lavagem do injetor pelo diluente utilizado na


preparação das amostras, uma vez que aquele utilizado na rotina contém metanol +
água (50:50).

1.9.3. Limpeza de colunas utilizadas na análise de polivitamínicos.


Para as colunas utilizadas nas análises de polivitampinicos, sempre que necessário,
fazer uma limpeza com água grau HPLC por 30 minutos e depois com uma mistura
de água : THF (1:1) por cerca de 40 minutos ou até que não se observe mais a saída
de nenhum pico estranho.

1.9.4. Limpeza para regeneração de colunas de fase reversa


Quando a coluna tiver o valor de N/L menor que 15.000, como explicado no item
1.5.3 ou quando estiver apresentando picos com deformidades ou assimétricos
devemos submeter a coluna a uma limpeza, diminuindo a polaridade do solvente e
retornando para o mais polar.
Primeiro submeter a coluna a uma limpeza com água, depois com metanol, seguindo
com acetonitrila e por fim THF. Depois retornar acetonitrila, depois metanol e
finalizando com água, sendo que o tempo de limpeza com cada solvente deve ser, no
mínimo, 20 minutos.

1.10. Com o objetivo de preservar a vida útil das colunas cromatográficas, estas serão
agrupadas de acordo com o tipo de fase móvel utilizada segundo Anexo II.

2. Fase Móvel
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2.1. A preparação de fase móvel para HPLC consome tempo e solventes de alto custo. Para
evitar desperdício, alguns cuidados devem ser seguidos.

2.1.1. Antes de utilizar um solvente ou reagente, verificar as especificações do fabricante


no rótulo do frasco e o prazo de validade.

2.1.2. Ao preparar uma fase móvel, escolher frascos limpos, secos e que possam ser bem
fechados.

2.1.3. Avaliar se a fase móvel pode ser armazenada sem o risco de ocorrer contaminação
por fungos ou volatilização de alguns de seus componentes.

2.1.4. Nunca preparar uma fase móvel sem antes verificar se existe alguma quantidade
preparada em condições de uso.

2.1.5. Filtrar a fase móvel antes de usá-la; para tal procedimento utilizar membrana com
porosidade de 0,45 m. Observar, conforme a composição da fase móvel, o tipo de
membrana mais indicada: (item 4). A seguir, degaseificar a fase com a utilização
combinada de vácuo e banho ultra-sônico por 2 a 3 minutos.

2.1.6. No caso de desenvolvimento de método, testar os solventes a serem utilizados na


preparação da fase móvel, principalmente se baixos comprimentos de onda forem
utilizados ou quando houver éteres ou acetonitrila na composição da fase móvel.

2.1.7. Nunca reciclar a fase móvel, sendo que a mesma, quando utilizada, deve ser
descartada.

2.1.8. Os solventes tipo p.a., para cromatografia gasosa e espectroscopia não são
apropriados para utilização em cromatografia líquida.

2.2. Filtração de Fase Móvel: consultar POP B. 135.

3. Solventes para HPLC

3.1. Os solventes orgânicos usados para HPLC devem sofrer um controle de qualidade rigoroso
por parte do fabricante e inclui:

3.1.1. Controle da transparência ótica na faixa de ultravioleta.

3.1.2. Controle de pureza mínima e que, em geral, é de 99,9%.

3.1.3. Controle de quantidade de água, muito importante para o trabalho com colunas de
fase normal.

3.1.4. Controle de substâncias cuja polaridade difere muito da polaridade do próprio


solvente.
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3.1.5. Os solventes devem estar livres de conservantes e antioxidantes que possam


interferir na separação (clorofórmio livre de etanol, THF e éter livres de inibidores de
formação de peróxidos).

4. Membranas para Filtração

4.1. As membranas utilizadas são de 47, 25 mm e de 13 mm de diâmetro, e apresentam


porosidade de 0,45 m. Porém vários outros tipos de membranas podem ser encontradas, a
destacar:

4.1.1. Acetato / nitrato de celulose: serve somente para água, tampões, ácidos diluídos e
alguns hidrocarbonetos saturados como hexano e iso-octano. Esta membrana é
altamente inflamável.

4.1.2. Teflon (melhor sem suporte de polietileno): serve para todo tipo de fase móvel,
exceto aquelas que contém ácido perclórico concentrado. Possui, porém, uma
superfície que não se deixa molhar com água ou acetonitrila dificultando a filtração
desses dois solventes. Este problema pode ser resolvido molhando a membrana com
poucas gotas de metanol, etanol, THF ou diclorometano antes de efetuar a filtração.
Assim a membrana se tornará permeável, possibilitando a passagem de água e
acetonitrila.

4.1.3. Difluoreto de Polivinilideno (PVDF): a melhor membrana para uso geral com água e
todos os solventes orgânicos com exceção de acetona e dimetilformamida.

4.1.4. Nylon: para uso geral com água e a maioria dos solventes orgânicos, exceto fenol, m-
cresol, ácido fórmico concentrado e outros ácidos inorgânicos fortes.

4.1.5. Alumina: para uso geral com água e solventes orgânicos. Não pode ser usada com
soluções básicas (NH4OH, NaOH). nem com aminas fortes (etanolamina).

4.2. De maneira mais específica existem as membranas da marca Millipore que são utilizadas
rotineiramente no laboratório:

4.2.1. HATF 04700 (0,45m): hidrofílicas, membranas em ésteres de celulose com 47mm
de diâmetro usadas somente para fases contendo água ou solução tampão.

4.2.2. GVWP 04700 (0,22m): membrana Durapore hidrofílica em PVDF com 47mm de
diâmetro.

4.2.3. HVLP 04700 (0,45m): membrana Durapore hidrofílica em PVDF com 47mm de
diâmetro e usadas para qualquer tipo de fase móvel exceto aquelas que contém
acetona e dimetilformamida.

4.2.4. HVLP 01300 (0,45m): membrana Durapore hidrofílica em PVDF com 13mm de
diâmetro.
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4.2.5. HVLP 02500 (0,45m): membrana Durapore hidrofílica em PVDF com 25mm de
diâmetro.

NOTA 1: As membranas de 47mm são utilizadas para filtrar fase móvel enquanto que as de
13mm e 25mm, associadas ao Swinnex Millipore, são usadas para filtrar as
soluções padrão e amostras que serão analisadas.

NOTA 2: Em casos eventuais, membranas similares a Millipore podem ser utilizadas.

4.3. Outra alternativa para filtração de amostras é a utilização de Millex®.

5. Outros Cuidados Relacionados

5.1. Para uso de solventes em fase normal devemos estar certos da ausência de água no
solvente. Se for necessário remover água do solvente, utilizando sulfato de sódio e após a
remoção da água, filtrar a fase. Porém esse procedimento não será freqüente porque os
solventes utilizados são na sua maneira, grau HPLC e por isso apresentam um alto índice de
pureza.

5.2. Em fases com grande quantidade de água, podem ocorrer crescimento de fungos, devendo
a mesma ser descartada.

6. Testes de Conformidade

Nota: Um resumo do item 6 consta nos anexos III e IV.

6.1. Executar os testes conforme o item adequabilidade do sistema do método analítico e repeti-
los sempre que ocorrer uma das seguintes condições:

6.1.1. Mudança de parâmetros de operação tais como fluxo, proporção de solventes na fase
móvel, coluna, comprimento de onda.

6.1.2.Reparo, limpeza ou substituição de alguma peça do cromatógrafo.

6.1.3. Mudança inexplicada nos tempos de retenção ou na resposta (área ou altura).

6.2. A diferença entre os tempos de retenção de duas injeções consecutivas não deve ser maior
que 2%.

6.3. Verificação da Repetibilidade do Sistema Cromatográfico

6.3.1. Calcula-se o desvio padrão relativo (DPR) da área (ou altura) de cinco injeções de
padrão analítico pela fórmula:

DPR = 100  ( xi –x )2 1/2

x 4
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Onde:
x = média dos 5 valores de área ou altura
xi = valores individuais de área ou altura

6.3.2. Para as substâncias ativas a resposta é considerada reprodutível se DPR  2%.

6.3.3. Para sub-produtos, produtos de decomposição, conservantes em formulações,


solventes residuais, aplicam-se os valores da tabela abaixo. O tipo de determinação,
(1 ou 2) está estipulado em cada método analítico. Se o resultado encontrado estiver
próximo ao limite da especificação do produto, então devem ser usados os limites
mais rigorosos da segunda coluna.

Concentrações (1) (2)


- para subprodutos (AS=100%) Teor simultâneo com a Teor em cromatograma
- para outros (AS) Substância ativa (DPR) separado (DPR)
(peso da amostra = 100%)

> 10%  2%  2%
10 - 2%  10%  2%
2 - 0,5%  20%  4%
0,5 - 0,1%  30%  6%
0,1 - 0,02%  40%  8%
200 - 50 ppm  10%
50 - 10 ppm  12%
10 - 2 ppm  14%
2 - 0,5 ppm  16%
0,5 - 0,1 ppm  18%

Onde:
S.A. = Substância ativa

6.4. Fator de encaudamento (T)

6.4.1. Este parâmetro é usado para medir a simetria dos picos de acordo com a fórmula
abaixo:
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Onde:

T = fator de encaudamento

W0.05 = largura do pico a 5% da


Altura

h = altura do pico

f = distância entre o começo do


pico e a máxima altura do
mesmo, medido a 5% da altura.

6.4.2. Para determinações quantitativas, quando não especificado no método analítico, é


aconselhável um fator de cauda entre 0,80 e 1,50. Se o pico estiver visualmente em
perfeita simetria, não é necessário efetuar nenhum cálculo.

6.5. Resolução (R)

6.5.1. Para determinações quantitativas, dois picos vizinhos devem apresentar separação
na linha base; para esta condição ser preenchida calcular a resolução conforme a

fórmula abaixo. A largura extrapolada de um pico é determinada pela intersecção da


linha de base com as tangentes dos pontos de inflexão.

6.5.2. Quando não especificado no método analítico a resolução não deve ser menor que
1,5.

t1, t2 = tempo de retenção para cada um dos componentes.

R = fator de resolução dos dois picos


W1, W2 = medida da base dos dois picos.
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6.6. Eficiência da Coluna

6.6.1. Este é um parâmetro utilizado para avaliar as condições da coluna isoladamente


como também averiguar um dos itens dos Testes de Conformidade para o Sistema
Cromatográfico.

NOTA:Consultar item 1.5 deste Procedimento de Operação Padrão.

6.7. Linearidade da Resposta Cromatográfica

6.7.1. A linearidade da resposta é verificada preparando-se um segundo padrão com a


concentração 10% acima da concentração do padrão de calibração (e portanto do
valor esperado para as amostras). Para componentes principais a linearidade da
resposta é considerada satisfatória se o desvio entre a concentração teórica e a
concentração obtida do padrão linear for no máximo 2%. Exceto no caso de produtos
polivitamínicos e extratos, onde o desvio permitido é de no máximo 3% (conforme
POP B.091). É importante que a resposta das amostras se encontre no intervalo
entre os dois padrões utilizados.

6.7.2. Calcular a linearidade da resposta (L) pela fórmula:

L = (Rpl x Cpd) / (Cpl x Rpd)

Onde:

Rpl = resposta do padrão linear


Rpd = resposta do padrão de calibração
Cpd = massa do padrão de calibração
Cpl = massa do padrão linear

NOTA: A linearidade da resposta é considerada satisfatória se L = 1,000 ± 0,020 ou L =


1,00 ± 0,030 no caso de produtos polivitamínicos e extratos.

7. Sistema Cromatográfico

7.1. As condições de cada análise como tipo de coluna, fluxo, fase móvel, volume de injeção,
comprimento de onda estão descritas nos métodos analíticos específicos de cada produto
ou matéria-prima.

7.2. A análise cromatográfica é realizada para calcular a concentração de determinado princípio


ativo através da área relativa do seu pico no cromatograma contra uma curva de calibração.
Esta é feita a partir de, no mínimo, 05 injeções de um padrão, de preferência na mesma
concentração teórica da amostra. A curva é feita plotando-se as áreas obtidas com os picos
contra a concentração do padrão, o desvio relativo destas áreas deve ser menor ou igual
2%.
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NOTA:Consultar POP B.091.

7.3. Purga : consiste na retirada de bolhas do filtro de fase móvel e dos pistões da bomba. As
bolhas do filtro são detectadas visualmente na tubulação que precede a bomba. Para retirá-
las aspire quantidade suficiente de fase móvel até que as mesmas saiam pela válvula de
purga. Bolhas estacionadas nos pistões são detectadas através de grandes variações
cíclicas na pressão (> 150 psi) ou através do ruído característico durante o movimento dos
mesmos. Para se retirar estas bolhas deve-se abrir a válvula de saída de fase móvel,
impedindo que o fluxo entre no injetor, e em seguida colocar um fluxo alto ( 8ml/min) e
injetar a fase móvel com auxílio de uma seringa na válvula de purga em quantidade
suficiente para expulsar a bolha pela válvula de saída.

NOTA: O procedimento de purga específico para cada modelo de bomba está


descrito no POP B.295.

7.4. Pressão: deve ser observada com freqüência e deve permanecer constante durante toda a
análise. O valor da pressão não deve exceder nunca o valor limite de cada módulo do
sistema , uma vez que se isto ocorrer, as bombas pararão de funcionar automaticamente.

7.5. Equilíbrio: o sistema deve permanecer em funcionamento, nas condições da análise a ser
realizada, por pelo menos 20 minutos antes do começo da mesma. Este tempo é suficiente
para que a coluna se equilibre com a fase móvel e a lâmpada do detector se aqueça.

7.6. Coluna: evitar qualquer tipo de choque mecânico e assegurar que estão limpas antes de
guardá-las.

7.7. Detectores: após o período de equilíbrio zerar todos os detectores envolvidos na análise. Se
o sistema estiver realmente equilibrado, o zero do detector permanecerá constante.

7.8. Solvente de lavagem do injetor: frascos localizados atrás do sistema com solvente para a
lavagem do injetor automático. O volume do mesmo deve ser averiguado e sempre
conservá-los cheios para evitar a entrada de bolhas no sistema. Para análise de fase
reversa, a composição do solvente de lavagem deve ser metanol: água 50:50 e para análise
de fase normal deve ser o diluente utilizado na preparação das amostras.

8. Problemas Comumente Encontrados na Rotina do Laboratório e Possíveis


Soluções

8.1. Pressão subindo linearmente até o limite da bomba: entupimento das tubulações.
Primeiramente, descobrir qual a região do sistema cromatográfico está entupida. Para isso,
retirar a coluna e desconectar cada um dos módulos (começando pelas bombas até chegar
no detector) com as bombas ligadas. Se a região não estiver entupida a pressão deve ficar
próxima de zero, caso contrário foi encontrada a região problemática. Para desentupir o
sistema pode-se fazer um fluxo invertido ou então usar um fluxo mais elevado, tomando a
devida precaução para que a alta pressão não afete a cela do detector.
PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO PADRÃO
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NOTA: O entupimento mais comum é o da tubulação que sai do injetor para a coluna, ocorre
principalmente por precipitação de sal da fase móvel. Neste caso, cortar e reconstruir
as pontas da tubulação.

8.2. Pressão com grande variação: bolha no pistão, realizar a purga conforme descrito no
item 7.3.

8.3. Pressão alta, acima do esperado para determinado tipo de coluna: a coluna deve estar
saturada de contaminantes, deve ser feita uma lavagem da coluna e do sistema com um
gradiente de fase móvel, começando com água, depois com metanol, passando para
acetronitrila seguida de tetrahidrofurano e retornando pelo mesmo gradiente até a água.

NOTA 1:Caso o teste de Eficiência de coluna não seja realizado no mesmo dia, passar
solvente de lavagem por 30 minutos antes de guardá-la.

NOTA 2: Nunca armazenar uma coluna após ter sido lavada apenas com água.

8.4. Vazamento nas conexões: provavelmente o tamanho da anilha não é o mesmo da conexão
em que está sendo utilizada. Isto é muito comum ao trocar a marca de determinada coluna.
Reconstruir a ponta da tubulação utilizando a própria conexão na qual a anilha vai ser
encaixada.

8.5. Picos fantasmas cíclicos no cromatograma: podem ser causadas por pequenas bolhas
estacionadas na cela do detector. Desconectar a tubulação de entrada do detector, conectar
uma seringa apropriada e injetar metanol puro, em seguida conectar o sistema novamente e
através do acompanhamento da linha de base certificar que a bolha saiu.

8.6. Falta de reprodutibilidade de injeções repetidas do padrão, quedas bruscas nas áreas de
análises conhecidas, flutuações na linha de base durante uma análise: podem ser causadas
por baixa energia na lâmpada do detector ou por manchas na lente do mesmo. Monitorar a
energia da lâmpada freqüentemente e valores abaixo de 30 indicam problemas e a lâmpada
deve ser trocada. Uma lâmpada nova ao ser instalada deve alcançar valores próximos a
200, caso os valores sejam baixos, efetuar a troca da lente.

8.7. Resultados absurdos encontrados em análises de medicamentos com baixas concentrações


de princípio ativo (exemplo: dissolução de anticoncepcionais): determina uma provável
contaminação dos vials. A forma adequada de lavagem dos vials está descrita no POP
B.137.

E. RESPONSABILIDADES

- Analistas do Controle de Qualidade: proceder conforme este POP.

- Encarregado / Supervisor / Coordenador de Controle de Qualidade: verificar e garantir o


cumprimento deste POP.
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F. DOCUMENTOS – LISTA DE ANEXOS

- Anexo I – Teste de Eficiência de Coluna – HPLC


- Anexo II – Divisão das Colunas Cromatográficas por Grupo de Fase Móvel
- Anexo III– Sumário dos Limites ou Valores Padrão
- Anexo IV - Componentes x Teste de Conformidade

G. REFERÊNCIA

- Catálogos e manuais de Cromatografia Líquida.


- USP 28.

H. PROCEDIMENTOS RELACIONADOS

- POP B.035 - Preparação, Rotulagem e Estocagem de Soluções.

- POP B.091 - Critérios Analíticos para Preparação de Amostras, Padrões e Avaliação de


Resultados.

- POP B.135 - Utilização do Sistema de Filtração a Vácuo.

- POP B.137 - Lavagem de Vidraria do Laboratório.

- POP B.295 - Utilização do Sistemas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) Waters.

I. MOTIVO DE REVISÃO

- Alterações nas condições cromatográficas para teste de Eficiência de Colunas.


- Alteração do anexo I e II.

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