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“A UTILIZAÇÃO DE Allium cepa


COMO ORGANISMO TESTE NA
DETECÇÃO DA GENOTOXICIDADE
AMBIENTAL”

Disciplina: Mutagênese

Organização

Dra. Maria Aparecida Marin-Morales

Out/2009
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1. Sistema teste Allium cepa

Os vegetais superiores apresentam características que os tornam excelentes


modelos genéticos para avaliação de poluentes ambientais, por isso têm sido utilizados com
muita freqüência em estudos de monitoramento. Contudo, este destaque não se deve,
apenas, à sensibilidade de detecção de mutágenos em diferentes ambientes, mas também à
possibilidade de utilização de diferentes células e órgãos como biomarcadores genéticos,
capazes de detectar desde mutações pontuais até as aberrações cromossômicas (GRANT,
1994).
Algumas espécies de vegetais superiores têm sido amplamente empregadas para
avaliação da genotoxicidade de agentes químicos, devido às boas características de seus
cromossomos, que permitem, além da investigação do potencial genotóxico, a avaliação dos
mecanismos de ações dos agentes testados. Dentre os vegetais superiores, a espécie
Allium cepa constitui um dos materiais pioneiros nos estudos de aberrações cromossômicas
causadas pela ação de agentes físicos e químicos. O primeiro autor a utilizar essa espécie
como sistema-teste foi Levan (1938) e, desde então, A. cepa tem sido indicada como um
eficiente organismo-teste de citotoxicidade e genotoxicidade, devido às características que
possui na sua cinética de proliferação, pelo crescimento rápido de suas raízes, pelo grande
número de células em divisão, pela sua alta tolerância a diferentes condições de cultivo, pela
sua disponibilidade durante o ano todo, pelo seu fácil manuseio e por possuir cromossomos
em número reduzido (2n=16) e de grande tamanho (GRANT, 1982; FISKESJÖ, 1985;
MATSUMOTO et al., 2006).
O teste de A. cepa, além de todas as vantagens mencionadas acima, tem
mostrado alta sensibilidade e boa correlação quando comparado com outros sistemas-teste,
principalmente com os de mamíferos. Segundo Grant (1982), de 148 químicos, avaliados
pelo teste de Allium, 76% apresentaram respostas positivas, o que levou o autor a sugerir a
inclusão deste teste como rotineiro na triagem para determinação de danos cromossômicos
induzidos por químicos. Já Fiskesjö (1985) relatou que a sensibilidade do teste de A. cepa
foi muito semelhante à observada para sistemas-teste realizados com algas e com linfócitos
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humanos. Posteriormente, Rank e Nielsen (1994) mostraram correlação de 82% do teste de


A. cepa em relação ao teste de carcinogenicidade em roedores. Estes mesmos autores
mostraram ainda que o teste de A. cepa também foi mais sensível que os testes de Ames e
de Microscreen. Muitos trabalhos de comparação entre sistemas-teste vegetais vêm sendo
realizados por diversos autores e a maioria tem mostrado uma maior sensibilidade de A.
cepa em relação a outras plantas superiores utilizadas como organismos-teste, como, por
exemplo, a espécie Vicia faba (MA et al., 1995; MIGID et al., 2007).
A espécie A. cepa tem sido utilizada, com sucesso, na avaliação de químicos,
sendo eles substâncias puras ou misturas complexas, como é o caso de grande parte das
amostras ambientais (FISKESJÖ, 1985; RANK et al., 1993; MA et al., 1995). Dentre os
químicos avaliados, o teste em A. cepa, tem sido bastante eficiente na avaliação de
inseticidas (BIANCHI, 2008; PEDRO, 2008), herbicidas (VENTURA, 2004; FERNANDES et
al., 2007, 2009), metais pesados (MATSUMOTO et al., 2006), derivados de petróleo (LEME;
MARIN-MORALES, 2008; LEME et al., 2008), corantes (CARITÁ; MARIN-MORALES, 2008)
e aditivos alimentares (TÜRKOĞLU, 2007).
Rotineiramente, o sistema-teste A. cepa tem sido aplicado para examinar a
influência de agentes contaminantes presentes em recursos hídricos (CHRISTOFOLETTI et
al., 2007). Leme e Marin-Morales (2008) e Hoshina (2005) demonstraram a importância de
A. cepa ao avaliarem o grau de contaminação de águas impactadas com derivados de
petróleo. Matsumoto e Marin-Morales (2004) e Caritá; Marin-Morales (2008) utilizaram A.
cepa para investigar o potencial genotóxico e mutagênico de águas de rios que recebem
efluentes industriais contaminados com cromo e corantes, respectivamente.
A capacidade de fitorremediação de efluente oriundo de uma fábrica de
fertilizantes químicos foi avaliada por Migid et al. (2007). Os autores concluíram que o teste
de aberrações cromossômicas em A. cepa foi uma ferramenta útil para examinar a eficácia
de tecnologias de biorremediação.
Dentre os vegetais superiores, A. cepa tem sido a espécie mais utilizada para a
avaliação de solos contaminados (WHITE; CLAXTON, 2004). Cotelle et al. (1999) aplicaram
o teste do micronúcleo em A. cepa, V. faba e Tradescantia em extratos aquosos de solos
contaminados com resíduos industriais derivados do petróleo. Os autores verificaram que
essas espécies foram eficientes para avaliação da mutagenicidade das amostras de solo.
Souza; Fontanetti (2007; 2008) aplicaram os testes de aberrações cromossômicas e de
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micronúcleos em A. cepa, para avaliar a eficácia da tecnologia de biorremediação de solo


contaminado com resíduos de petróleo e a capacidade de biodegradação das amostras.
Segundo Rank e Nielsen (1997), o teste de aberrações cromossômicas em A.
cepa não é apenas válido para a detecção do potencial genotóxico, mas também para a
investigação dos mecanismos de ação dos agentes testados, sejam estes, substâncias
puras ou misturas complexas. Assim, de acordo com o tipo e freqüência de aberrações
encontradas é possível determinar se o agente em estudo é clastogênico ou aneugênico.
Esse enfoque foi abordado por Leme et al. (2008), onde as autoras investigaram o
mecanismo de ação de hidrocarbonetos de petróleo em águas de rio impactada pelo
vazamento de um oleoduto.
Antimutagênese é um processo onde as taxas de mutações dos seres vivos
são inibidas e, consequentemente, é inibida também a incidência de câncer (WALTERS et
al., 1996). Liviero e Von Borstel (1996) descreveram este processo nos seres vivos, quando
observaram que um aumento na quantidade de adenosina poderia reverter, em bactérias, às
mutações induzidas pela cafeína. Em 1987, Kada e Shimoi propuseram duas categorias de
agentes antimutagênicos: os desmutagênicos e os antimutagênicos.
• Agentes desmutagênicos: são agentes protetores ou antimutagênicos, que
atuam, diretamente, sobre os compostos que induzem mutações no DNA, inativando-os
química ou enzimaticamente, inibindo a ativação metabólica de pró-mutagênicos ou
seqüestrando moléculas reativas. Assim, um agente desmutagênico promove a alteração
química ou bioquímica dos agentes mutagênicos, antes que danifiquem o DNA.
• Agentes bioantimutagênicos: são agentes que suprimem o processo de
fixação da mutação, após o DNA ser lesado pelo agente mutagênico. Atuam sobre o
processo que leva a indução de mutações, ou no reparo das lesões causadas no DNA
(KADA et al., 1978).
O potencial antimutagênico de uma substância pode ser avaliado pelos mesmos
sistemas utilizados nos estudos de agentes mutagênicos. Diversos sistemas-teste têm sido
utilizados para avaliar o potencial antimutagênico de substâncias naturais. Roberto et al.
(2007), mostrou que a espécie A. cepa é bastante adequada para esse fim, ao avaliar as
propriedades antimutagênicas da própolis.
Atualmente, novos testes de mutagenicidade utilizando microorganismos,
linhagens celulares de mamíferos e outros sistemas biológicos têm sido desenvolvidos, mas
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os testes com vegetais, sobretudo A. cepa, ainda são utilizados, rotineiramente, em muitos
laboratórios em todo mundo, como indicadores de potencial genotóxico e mutagênico de
diversos agentes.
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2. Teste de Aberrações
Cromossômicas e Micronúcleos
em Allium cepa

Atualmente, muitos efeitos adversos observados nos organismos vivos são


decorrentes da crescente introdução de químicos no ambiente, considerados então
poluentes ambientais. Dentre as classes de poluentes, uma das mais preocupantes é a
classe dos agentes genotóxicos e mutagênicos. Estes agentes são capazes de induzirem
alterações na molécula de DNA, o que podem acarretar, não apenas em um sério
comprometimento da saúde dos organismos expostos, mas em um comprometimento das
gerações futuras, uma vez que tais alterações podem ser transmitidas aos descendentes
(RIBEIRO, 2003).
Inúmeros testes de curta-duração, utilizando uma ampla variedade de
organismos-teste, vêm sendo desenvolvidos para a avaliação do perigo genético induzido
por agentes químicos ambientais (VANZELLA, 2006). Uma eficiente investigação ambiental
requer uma escolha adequada do ensaio a ser utilizado, sendo que, para tal sucesso, a
escolha não deve levar em consideração apenas as características da amostra a ser
testada, mas também outros fatores, como a validade do sistema-teste, seu custo relativo e
a simplicidade do mesmo (HOUK, 1992).
Nos últimos 30 anos, o teste de Aberrações Cromossômicas (AC) tem sido
largamente utilizado para o monitoramento ocupacional e ambiental, atuando como um
biomarcador de efeitos genotóxicos induzidos por carcinógenos (HAGMAR et al., 2004).
Desta maneira, este teste tem apresentado posição de destaque entre a bateria de testes
recomendada por lei para avaliação de agentes genotóxicos (MATEUCA et al., 2006).
O teste do Micronúcleo (MN) é considerado, por muitos autores, como uma das
mais promissoras técnicas de avaliação de efeitos mutagênicos induzidos por agentes
químicos (LANDOLT; KOCAN, 1983; HEDDLE et al.,1983; RIBEIRO, 2003; MATSUMOTO et
al., 2006). Tal fato se deve aos MN serem resultantes de danos, reparados ou reparados
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erroneamente, nas células parentais (RIBEIRO, 2003), sendo facilmente visualizados nas
células filhas como uma estrutura similar ao núcleo principal, porém, de tamanho reduzido.
Adicionalmente, o teste do MN vem sendo considerado uma técnica vantajosa,
não apenas pela simplicidade de análise de resultados, mas também pela possibilidade de
aplicação em qualquer população celular em proliferação, não sendo necessário o
conhecimento cariotípico prévio do organismo-teste utilizado (HAYASHI et al., 1998).
Contudo, mesmo sendo o teste do MN aplicável em qualquer tipo de célula, ele é
dependente do ciclo celular, uma vez que os danos induzidos no primeiro ciclo serão
visíveis, como MN, no segundo ou no subseqüente ciclo de divisão celular (TATES et al.,
1980).
Tanto o teste de AC como o do MN, mencionados anteriormente, têm sido
aplicados, com sucesso, no sistema-teste de A. cepa. Por isso, este sistema vem sendo
muito utilizado na avaliação da contaminação ambiental (FERNANDES, 2005;
MATSUMOTO et al., 2006; MAZZEO, 2006; CARITÁ, 2007; BIANCHI, 2008; CARITÁ;
MARIN-MORALES, 2008; LEME; MARIN-MORALES, 2008). É importante ressaltar ainda,
que tal sucesso é devido, não apenas a possibilidade de detecção da genotoxicidade e
mutagenicidade ambiental, mas também pela possibilidade de avaliação dos mecanismos de
ação dos agentes testados (MATSUMOTO et al., 2006, FERNANDES et al., 2007, LEME et
al., 2008).
Yamamoto e Kikuchi (1980) demonstraram que, medindo o diâmetro dos MN, era
possível determinar se o agente era clatogênico ou aneugênico. Os autores observaram que
os MN produzidos por agentes clastogênicos eram, de maneira geral, menores que aqueles
produzidos por agentes aneugênicos. No entanto, apesar do método ter sido satisfatório
para um grande número de MN, Combes et al. (1995) concluíram que a análise do tamanho
do MN não é parâmetro, suficientemente seguro, para a determinação da ação clastogênica
ou aneugênica do agentes tóxicos. Fenech (2000), baseado em estudos com células
humanas e de outros tipos celulares, afirma que o tamanho dos cromossomos, por ser
heterogêneo, não confere em bom parâmetro para o estabelecimento de uma correlação
segura entre o tamanho do MN e o indicativo de efeito clastogênico ou aneugênico. Para o
autor, um MN pequeno pode conter tanto um fragmento de um cromossomo grande, como
um cromossomo pequeno inteiro.
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Considerando que a espécie A. cepa apresenta um cariótipo simétrico e


homogêneo, é perfeitamente possível inferir a ação clastogênica ou aneugênica, pelo
tamanho do micronúcleo observado.

2.1. Lesões no DNA


A molécula de DNA é alvo permanente de danos causados por poluentes
(KOVALCHUCK et. al., 1998), os quais, se não forem reparados ou reparados de maneira
incorreta, podem acarretar em mutações (KIRSCH-VOLDERS et. al., 1998). Embora
ocorram mutações espontâneas, a maioria das mutações é induzida pela exposição dos
organismos a agentes diversos.
Segundo Kirsch-Volders et al. (2002), as mutações no material genético podem
ser classificadas em duas categorias:
Mutações gênicas, classificadas como alterações pontuais na seqüência de
DNA;
Mutações cromossômicas, as quais são visualizadas a partir da presença de
AC.

Mutações Gênicas: Segundo Devoret (2004), as mutações gênicas podem ser


reunidas em três categorias:
1. Mutações por substituição de bases. A mutação por transição de bases
acontece quando as substituições se dão entre as purinas, adenina (A) e guanina (G), ou
entre as pirimidinas, citosina (C) e timina (T). Já substituição entre uma purina e uma
pirimidina, ou vice versa, são denominadas de substituição por transversão de bases, cujo
esquema está representado baixo;

Figura 2.1. Esquema representativo das mutações por substituição de bases (transição e
transversão).
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2. Mutações por inserção e deleção de bases: ocorrem quando há perda ou


ganho de uma ou mais bases na molécula de DNA (Figura 4.2);

Figura 2.2. Esquema representativo das mutações do tipo inserção e deleção. 1. Molécula
de DNA original (seta vermelha indica o local relacionado com a inserção ou
deleção de uma base); 2. Molécula de DNA alterada (seta vermelha indica o
local relacionado com a inserção ou deleção da base).

3. Mutações do tipo frameshift: são caracterizadas por pequenas deleções ou


inserções dentro de um gene, que acarretam na alteração da matriz de leitura da fita de DNA
(Figura 4.3).
As mutações da categoria 2, proposta por Devoret (2004), e anteriormente citada,
pode também ser considerada mutações frameshift.

Figura 2.3. Esquema representativo da mutação do tipo frameshift.

Mutações Cromossômicas: As mutações cromossômicas são caracterizadas


por mudanças na estrutura normal de um cromossomo ou no número total de cromossomos,
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podendo ocorrer espontaneamente ou como resultado da exposição a agentes físicos ou


químicos (RUSSEL, 2002). Alterações cromossômicas estruturais podem ser decorrentes de
quebras no DNA, inibição da síntese de DNA e replicação de DNA alterado (ALBERTINI et
al., 2000).
Análises experimentais têm demonstrado que quebras na dupla fita de DNA
(DSBs – double-strand breaks) são as principais lesões envolvidas com o processo de
formação das alterações cromossômicas estruturais (OBE et al., 1992; BRYANT, 2004).
Apesar das DSB ocorrem espontaneamente em uma freqüência relativamente significativa,
elas também podem ser induzidas por radiação ionizante, alguns antibióticos e diversos
químicos ambientais (OBE et al., 1992; PFEIFFER et al., 2000; BRYANT, 2004).
As alterações cromossômicas numéricas, como aneuploidia e poliploidia, são
conseqüências de segregações anormais de cromossomos durante o processo de divisão
celular, podendo ocorrer tanto espontaneamente como pela ação de um agente aneugênico
(ALBERTINI et al., 2000).

4.2. Processos de Indução de Aberrações Cromossômicas


Aberrações Cromossômicas Numéricas: Como já descrito, as AC numéricas
são caracterizadas pelas aneuploidia e poliploidia. A aneuploidia corresponde às mudanças
no número cromossômico de uma célula, resultando em ganho ou perda de um ou mais
cromossomos durante o ciclo de divisão celular. Por outro lado, a poliploidia é definida como
um aumento no número cromossômico, dado pela multiplicação do conjunto cromossômico
haplóide (GUERRA, 1988; KIRSCH-VOLDERS et al., 2002).
As aneuploidias são conseqüências de dois processos clássicos: a não disjunção
cromossômica e a perda cromossômica. A não disjunção cromossômica ocorre devido a
uma segregação aberrante, que resulta em duas células filhas, uma trissômica (2N+1),
decorrente do ganho de um cromossomo durante a mitose, e a outra monossômica (2N-1),
decorrente da perda de um cromossomo durante a mitose (KIRSCH-VOLDERS et al., 2002)
(Figura 4.4).
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Figura 2.4. Esquema representativo do processo de aneuploidia, que ocorreu durante a


mitose.

Além dos processos citados acima, outros caminhos podem levar as aneuploidias,
como a divisão incorreta do centrômero, que resulta na separação incorreta das cromátides
irmãs durante a divisão mitótica (KIRSCH-VOLDER et al., 2002).
A poliploidia pode ser induzida pela ausência de fuso mitótico funcional, que,
conseqüentemente, resulta na falha da migração das cromátides irmãs para os pólos
opostos da célula durante a anáfase. Tal processo, denominado de retardo mitótico, produz
células 4N e 4C, no qual C corresponde ao conjunto haplóide do DNA de uma determinada
espécie (GUERRA, 1988; KIRSCH-VOLDERS et al., 2002) (Figura 4.5).

Figura 2.5. Esquema representativo do processo de poliploidização cromossômica.


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Aberrações Cromossômicas Estruturais: As AC estruturais são resultantes de


quebras nos cromossomos, seguidas da união de fragmentos em novas posições, o que
resulta em uma alteração da forma e/ou tamanho de um cromossomo.
Segundo Guerra (1988), as AC estruturais podem ser decorrentes de:
Deleções: que ocorre pela perda de um seguimento cromossômico, terminal ou
intersticial, que resulta em um desequilíbrio do cromossomo. Elas podem originar-se por
quebras cromossômicas, com a perda de um segmento acêntrico, ou por um crossing-over
desigual entre cromossomos homólogos ou cromátides irmãs desalinhadas (Figura 4.6).

Figura 2.6. Esquema representativo do processo de deleção de um fragmento cromossômico.

Duplicação: que ocorre quando uma fração do cromossomo é duplicada (Figura


4.7).

Figura 2.7. Esquema representativo do processo de duplicação de um segmento cromossômico.


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Cromossomos em anel: quando há duas quebras em um mesmo cromossomo,


sendo uma em cada extremidade dos braços. As extremidades quebradas afastam-se ou
juntam-se e o pedaço mediano, contendo o centrômero, curva-se formando um anel (Figura
4.8).

Figura 2.8. Esquema representativo do processo de formação de cromossomos em anel.

Inversão: ocorre quando um fragmento cromossômico, proveniente de duas


quebras, sofre rotação de 180º e é religado ao mesmo cromossomo. Quando a inversão
envolve o centrômero é denominada de inversão pericêntrica e quando não envolve o
centrômero é denominada de paracêntrica (Figura 4.9).

Figura 2.9. Esquema representativo do processo de inversão de fragmentos


cromossômicos. A. Inversão pericêntrica e B. inversão paracênctrica.
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Translocação: ocorre quando há trocas entre partes de cromossomos diferentes


(Figura 4.10).

Figura 2.10. Esquema representativo de processo de translocação entre fragmentos de


cromossomos distintos.

Fusão cêntrica: ocorre quando os centrômeros de dois cromossomos


acrocêntricos ou telocêntricos se unem e formam um cromossomo com outra morfologia
(Figura 4.11).

Figura 2.11. Esquema representativo do processo de fusão cêntrica.

Fissão cêntrica: ocorre quando há uma quebra cromossômica na região


centromérica, dando origem a dois cromossomos telocêntricos (Figura 4.12).

Figura 2.12. Esquema representativo do processo de fissão cêntrica.


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Isocromossomos: resultam de um erro na divisão do centrômero que, ao invés


de separar as cromátides, separa os braços do cromossomo (Figura 4.13).

Figura 2.13. Esquema representativo do processo de formação de isocromossomos.

4.3. Micronúcleos
Como já descrito anteriormente, MN são pequenos corpos extranucleares, que
aparecem nas células como resultado da não incorporação de fragmentos
cromossômicos/cromatídicos acêntricos ou da perda de cromossomos/cromátides inteiras
durante o processo de divisão celular (MATEUCA et al., 2006).
MN provenientes de fragmentos cromossômicos, provavelmente, são resultados
diretos de DSBs, da conversão de quebras de fita simples (SSBs – single-strand breaks) em
DSBs, após a replicação ou pela inibição da síntese de DNA. MN provenientes de perdas
cromossômicas são decorrentes de falhas na maquinaria da segregação cromossômica,
como deficiências no controle gênico do ciclo celular, falhas no fuso mitótico, falhas no
cinetócoro ou em outras partes do aparato mitótico ou ainda por danos na estrutura
cromossômica (MATEUCA et al., 2006).
Contudo, segundo Ribeiro et al. (2003), para uma estrutura ser considerada um
micronúcleo ela deve ser morfologicamente semelhante ao núcleo principal, porém, de
tamanho reduzido, com diâmetro entre 1/16 à 1/3 do núcleo principal. Além disso, outras
características também devem ser consideradas como a não refringência do material, a não
conexão com o núcleo principal e ter a mesma coloração do núcleo principal, embora
algumas vezes o micronúcleo possa apresentar coloração um pouco mais intensa
(FENECH, 2000).
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Figura 2.14. Esquema representativo do processo de indução de MN.A. Ação clastogênica;


B. Ação aneugênica
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3. Materiais e Métodos

3.1. Material Biológico


O material biológico utilizado para os testes de AC e MN, a ser abordado nesta
apostila, será a espécie Allium cepa. Para a realização dos bioensaios, podem ser utilizadas
tanto sementes como bulbos de uma mesma variedade de A. cepa, a fim de se evitar
diferentes respostas durante a realização dos testes.

Diferenças na utilização de sementes e bulbos.


Sementes:
• Possibilita a certeza do uso de indivíduos de mesma variedade e marca
durante o ano todo;
• Um mesmo ensaio é realizado com vários indivíduos;
• Utiliza uma menor quantidade do químico a ser testado por ensaio;
• Requer menor espaço físico para a montagem do experimento;
• Apresenta raízes mais delgadas, necessitando de maiores cuidados durante as
etapas de processamento;
• São menos usadas, mundialmente, como material teste.

Bulbos:
• No Brasil, os bulbos são provenientes de regiões distintas e suas variedades
diferem durante as estações do ano;
• Utiliza uma maior quantidade do químico a ser testado por ensaio, o que
acarreta na geração de grandes quantidades de resíduo ao final do experimento;
• Necessita da disponibilidade de um maior espaço físico para a realização do
experimento;
• Apresenta raízes maiores, mais facilmente manuseadas;
• São mais utilizadas, mundialmente, como material teste.
iii.
Nesta apostila, o protocolo descrito será baseado na utilização de sementes, devido às suas vantagens e por estar
padronizado no Laboratório de Mutagênese da UNESP de Rio Claro.
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3.2. Materiais de laboratório


Vidrarias e utensílios
• Placas de Petri (150x20mm), para germinação;
• Papel filtro (90mm);
• Pinça;
• Frascos de vidro com tampa, para coleta e armazenagem das radículas;
• Frascos de vidro com tampa, para hidrólise;
• Frascos de vidro âmbar com tampa e câmara escura, para coloração (reação de
Feulgen);
• Lâminas e lamínulas;
• Bisturi ou lâmina cortante;
• Macerador;
• Lamparina;
• Luvas.

Reagentes
• Ácido acético PA;
• Álcool etílico absoluto;
• Ácido clorídrico PA;
• Fucsina básica;
• Metabissulfito de potássio ou de sódio;
• Carvão ativado;
• Carmim em pó;
• Resina sintética para montagem de lâmina.

Equipamentos
• Banho-maria;
• Microscópio de luz;

5.3. Metodologiaiii
• Controle Positivo (CP) e Controle Negativo (CN)
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A utilização de testes controles é necessária para que se possa estimar as


variações naturalmente encontradas nos organismos testes e também as respostas que
estes organismos possam apresentar frente às situações experimentais. Segundo Takahashi
(2003), o controle positivo deve ser utilizado para garantir a resposta adequada do sistema.
A escolha da substância a ser utilizada como controle positivo deve se dar de forma a
selecionar drogas com conhecida atividade mutagênica (clastogênica ou aneugênica).
Nos testes de AC e de MN, realizados com o organismo teste A. cepa, o
desenvolvimento de teste controle negativo (CN)iv é de essencial importância, pois com ele
pode-se avaliar a freqüência basal destas alterações, quando o organismo teste não é
exposto ao agente em estudo.
Em nosso laboratório, são utilizadas como controle positivo as substâncias:
MMS (metil metano-sulfonato), uma droga de ação clastogênica, na concentração
de 4.10-4 Mv, e o Herbicida Trifluralina, uma substância de ação aneugênica, na
concentração de 0,84ppm de princípio ativovi (FERNANDES et al., 2007).

• Tratamentos: Na realização dos bioensaios, podemos aplicar três tipos de


tratamento:
Tratamento contínuo: onde as sementes de A. cepa são submetidas à
germinação, em placas de Petri, diretamente nas amostras ou agentes (água, solo, droga,
etc.)

Tratamento temporário: onde as sementes de A. cepa são submetidas à


germinação em água e, após atingirem cerca de 1 cm de comprimento, são transferidas, por
um período pré-estabelecido (24h, 48h, etc), para placas de Petri contendo a amostra a ser
estudada.

iv.
Os testes CN são realizados no Laboratório de Mutagênese do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências
de Rio Claro, expondo as sementes de A. cepa para germinação em água ultrapura (Milli-Q ou Osmose Reversa).
v.
Para o preparo da solução, diluir 0,770µL em 100 mL de água destilada. A solução deve ser preparada
imediatamente antes de ser usada e não deve ser armazenada. Obs. Seu descarte não deve ser feito na pia,
devendo ser estocado em recipientes apropriados, bem fechados e, posteriormente, enviados para tratamento em
laboratórios de resíduos.
vi.
Para o preparo da solução, diluir 190 µL em 100 mL de água destilada. Após o preparo, essa solução pode ser
armazenada por tempo indeterminado, desde que esteja protegida da luz, uma vez que este herbicida caracteriza-se
por ser fotodegradável.
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Tratamento de recuperação: Após a realização do tratamento contínuo e/ou


temporário, uma parte das raízes é transferida para placas de Petri com papel filtro
embebidos com água, permanecendo nestas placas por um período de 48 horas. Esse
tratamento é utilizado com a finalidade de restabelecer as condições normais do ambiente e,
assim, avaliar o comprometimento celular da exposição a que o organismo foi submetido.

• Germinação
A germinação é sempre feita em placas de Petri de vidro, sendo uma placa para
cada ensaio, incluindo o controle negativo e o positivo. As placas são forradas com papel de
filtro umedecido com água (para tratamento temporário) ou com a substância a ser testada
(para o tratamento contínuo). Sobre o papel de filtro úmido de cada placa, são dispostas
cerca de 100 sementes. O crescimento das radículas é monitorado, constantemente, para
que não haja ressecamento do papel de filtro. O experimento deve sempre ser realizado
sobre as mesmas condições de luminosidade e temperatura, para evitar a influência desses
parâmetros nos resultados dos testes.

Caso as substâncias a serem testadas sejam fotodegradáveis ou muito voláteis,


os recipientes utilizados para a germinação das sementes devem apresentar características
especiais, o que garantirá a presença do químico durante toda a realização do experimento.
Para substâncias degradáveis à luz, as placas de Petri podem ser envolvidas em papel
alumínio. Já para as substâncias voláteis, as placas podem ser envolvidas por filme plástico,
porém se muito volátil, os frascos utilizados devem possuir tampas revestidas de teflon.

• Testes de toxicidade
A toxicidade de uma substância, avaliada por meio do sistema teste de A. cepa,
pode ser obtida pelo índice de germinação e pela variação do comprimento médio das raízes
(VCMR). O índice de germinação é obtido pela razão entre o número de sementes
germinadas e o total de sementes expostas à germinação. Para se obter o valor do VCMR,
as raízes emergidas são medidas e com estes valores extrai-se a média do comprimento da
raiz por placa.
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• Testes de citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade


Os parâmetros de citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade são avaliados
pela contagem de células meristemáticas e de células F1. Para a realização destes testes,
devem ser seguidos os passos descritos abaixo:
Coleta: As raízes devem ser coletadas após atingirem cerca de 2 cm de
comprimento. O melhor horário para a coleta é sempre por volta das 12 ou 14 horas, uma
vez que as células meristemáticas apresentam uma maior atividade mitótica nestes horários.
Fixação: Após a coleta, as raízes devem ser armazenadas em frascos de vidro
devidamente etiquetados, contendo o fixador Carnoy I, por 6-8 horas, à temperatura
ambiente. Decorrido este período, troca-se o fixador por um novo Carnoy I recém preparado.
Guardar em geladeira, até a confecção das lâminas.

• Preparo das lâminas


Lavagem: Com o auxílio de uma pinça, retirar as raízes dos frascos com fixador,
para serem utilizadas para a confecção das lâminas. Retornar os frascos com as demais
raízes na geladeira.
Para a retirada do excesso de fixador, as raízes devem passar por 3 banhos, de 5
minutos cada, em água destilada. Este processo é feito em placa de Petri.

Hidrólise
Após as lavagens, retirar o excesso de água das raízes encostando-as,
delicadamente, em papel filtro. A hidrólise das raízes é feita em frascos contendo HCl 1N à
60°C, aquecidos em banho Maria, por 8 a 11 minutos.

Coloração
Após a hidrólise, as raízes devem passar, novamente, por três banhos de água
destilada, para interromper o processo de hidrólise e retirar o excesso do ácido das raízes.
As raízes são novamente secas em papel filtro (tomando bastante cuidado, pois o meristema
encontra-se ainda mais frágil), para serem colocadas em frascos de vidro âmbar, contendo o
Reativo de Schiffvii, onde deverão permanecer por 2 horas em local escuro. Após esse
tempo, as raízes serão lavadas em água destilada, até que todo o excesso de corante seja
retirado.
22

• Confecção das lâminas


Sobre uma lâmina limpa e identificada, colocar uma raiz com seu meristema
intacto (porção terminal corada de roxo, destacando-se do resto da raiz corada em rosa).
Com o auxílio de um papel filtro, retirar o excesso de água.
Lâminas das células meristemáticas: Após acomodar uma raiz corada sobre
uma lâmina limpa e identificada, cortar o meristema com o auxílio de uma lâmina de barbear
ou de um bisturi. Descartar o restante da raiz (corada de rosa), adicionar uma gota de
carmim acético 2% sobre o meristemaviii e cobrir com uma lamínula. Pressionar,
cuidadosamente, sobre o material, até que o meristema se transforme em uma pequena
mancha de células espalhadas. Flambar a lâmina em chama de lamparina, monitorando sua
temperatura para não queimar as células. Este processo intensifica o contraste entre o
citoplasma e o núcleo, pela desnaturação das proteínas citoplasmáticas. Retirar o excesso
de carmim acético da lâmina, pressionando, de forma suave, a lâmina e a lamínula
envolvidas por um papel filtro (Figura 3.1).
Lâminas de células F1: Para a confecção de lâminas de células F1, proceder
como o descrito para as lâminas de células meristemáticas. Porém, neste caso, as células F1
são obtidas cortando a região da raiz que fica cerca de 1 cm imediatamente acima da região
meristemática (Figura 3.1).
23

Figura 3.1. Esquema representativo das regiões meristemática e F1 de raiz primária de


Allium cepa.

Retirada das lamínulas: Após a preparação das lâminas, extrair as lamínulas em


nitrogênio líquido ou gelo seco. Também é possível retirar a lamínula colocando a lâmina,
com a lamínula voltada para baixo, sobre um suporte em uma placa de Petri com ácido
acético 45%, de forma que o ácido acético entre no espaço entre a lâmina e lamínula.
Aguardar até que a lamínula se desprenda da lâmina. Neste processo, geralmente o material
fica aderido na lamínula. As lâminas devem secar de um dia para o outro em temperatura
ambiente.
Montagem de lâmina permanente: Para uma maior durabilidade das lâminas,
após a secagem, colocar sobre a lâmina uma pequena quantidade de meio de montagem
(p.e. Entelan, Permout, Bálsamo, resina sintética, verniz) e, imediatamente, recobrir com
uma lamínula seca e limpa. Caso o material tenha ficado na lamínula, colocar o meio de
montagem sobre uma lâmina nova, cobrindo-a com a lamínula, de forma que o material fique
em contato com o meio. Esperar a secagem do meio, para depois observar a lâmina em
microscópio de luz.
24

4. Interpretação dos Resultados

A espécie Allium cepa é um importante organismo utilizado para testes de


avaliação da ação tóxica, citotóxica, mutagênica e genotóxica induzidas pela ação de
diversos agentes presentes no ambiente. Os parâmetros utilizados para investigar cada uma
dessas interferências no organismo diferem com relação aos estágios de desenvolvimento
da espécie e das estruturas morfológicas observadas. A seguir será descrito como analisar
cada um desses parâmetros.

4.1. Análise dos resultados relacionados à investigação de toxicidade, por


meio da freqüência de germinação e comprimento da raiz primária de A. cepa
Quando um organismo é acometido por uma injúria e essa promove um distúrbio
capaz de interferir, drasticamente, na fisiologia desse organismo, o agente envolvido na
causa pode ser considerado tóxico.
A resposta a um agente tóxico é variável e pode resultar em dois tipos de efeitos:
• efeito agudo: quando a reação no organismo acontece imediatamente após a
exposição ao agente tóxico, cujo efeito pode até levar a morte;
• efeito crônico: quando o efeito derivado da exposição ao agente tóxico
decorre em conseqüências sérias, como lesões em órgãos e tecidos ou mesmo pela morte
do organismo.
Nos testes realizados com A. cepa, só é possível avaliar o efeito agudo dos
agentes tóxicos. O efeito agudo pode ser investigado pela avaliação do potencial de
germinação, obtido por meio da freqüência de sementes germinadas, após exposição a um
determinado agente.
A análise desse parâmetro infere que um agente tóxico leva a uma menor
freqüência de germinação, estatisticamente, significativa quando comparada com o controle
negativo.
O fato das sementes não germinarem, significa que o agente foi capaz de inibir ou
impedir o processo de divisão celular. A interferência na multiplicação de células que dariam
origem ao tecido meristemático e, conseqüentemente, ao desenvolvimento da raiz primária,
25

sugere que esse agente é tóxico para o organismo utilizado no teste. O índice de
germinação é calculado pela fórmula:

Índice de germinação (IG) = Número total de sementes que germinaram x 100


Total de sementes expostas ao tratamento

Outro parâmetro importante para avaliar a ação tóxica de diversos agentes é o


desenvolvimento da raiz primária. As raízes devem ser mensuradas, diariamente, iniciando
as mensurações logo após a emergência das raízes. A avaliação dos resultados é feita pela
comparação das médias aritméticas obtidas nos testes controle com as obtidas nos agentes
testados. Tanto um aumento exagerado no crescimento radicular quanto a inibição indicam a
presença de contaminantes tóxico.

4.2. Análise de células radiculares (Meristemáticas e F1)


Para análise de citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade, são
confeccionadas lâminas, a partir de raízes primárias de A. cepa, como já descrito no capítulo
anterior. Devem ser observadas 2 regiões da raiz: a região meristemática onde são
observadas células em processo de divisão celular intensa e todas as fases do ciclo celular;
e a região F1, localizada cerca de 1mm acima da região meristemática, que se caracteriza
por apresentar poucas células em divisão celular e crescimento por alongamento. Na região
meristemática, é possível investigar a citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade do
agente em estudo e na região F1 a sua ação mutagênica. A presença de micronúcleos (MN)
nas células F1 indicam que o agente foi capaz de promover uma mutação que persistiu nos
tecidos adjacentes, formados posteriormente ao tecido meristemático, local este onde a
alteração foi originada.
Análise ao Microscópio Óptico: A análise das lâminas é realizada em
microscopia óptica, utilizando-se a objetiva de 40x. A lâmina deve ser percorrida de maneira
aleatória, porém seqüencial, como mostra a figura 4.1, para evitar que um mesmo campo
seja contado duas vezes. Devem ser analisadas 1000 células de cinco lâminas 500 células
para 10 lâminas, para totalizar uma contagem de 5000 células por tratamento e ou ensaio.
Estatisticamente, os resultados obtidos com, no mínimo, cinco indivíduos são comparáveis
26

aos obtidos com um número maior de indivíduos. Como os resultados não variam, as duas
opções apresentadas são viáveis e permitem uma análise estatística confiável.

Figura 4.1. Representação esquemática da metodologia de análise seqüencial de lâminas.


A. Seqüência horizontal. B. Seqüência vertical.

Em cada campo da lâmina deve-se primeiramente:


• Contabilizar o número total de células presentes;
• Identificar e contabilizar as células em intérfase e as em processo de divisão
celular mitótica (prófase, metáfase, anáfase e telófase), independente delas estarem ou não
com alguma anormalidade;
• Identificar e contabilizar células interfásicas portadoras de anormalidades
(irregularidades na morfologia, células polinucleadas, brotos nucleares, micronúcleos e
microcitos ou em processo de morte celular (citoplasma vacuolizado, núcleo heteropicnótico,
deslocamento periférico do núcleo e fragmentação do núcleo..
• Identificar e contabilizar células mitóticas portadoras de anormalidades, nas
suas diversas fases (prófase: MNix e microcitos; metáfase: aderências cromossômicas,
poliploidias, C-metáfases, quebras e perdas cromossômicas; anáfase e telófase: pontes e
atrasos cromossômicos, anáfases multipolares, quebras e aderências cromossômicas.

4.3. Análise dos resultados, relacionados à investigação de citotoxicidade


O termo citotoxicidade é designado para aquelas alterações celulares causadas
por injúria, que levam a célula a iniciar seu processo de morte. Um dos métodos para se
investigar a citotoxicidade de diferentes agentes é a verificação da freqüência do índice
mitótico e a análise de alterações celulares morfológicas indicativas de morte celular.
Índice Mitótico: Pela avaliação do índice mitótico podemos investigar a
capacidade do organismo multiplicar suas células. A divisão celular se manifesta, em maior
grau, durante o período de formação e desenvolvimento dos organismos, sendo importante
que a análise desse parâmetro seja realizada durante esse período, como também é
indicado que esta análise seja feita em regiões específicas do organismo, onde o processo é
27

mais evidente e intenso. A divisão pode ser inibida ou bloqueada e ter conseqüências
graves, que podem levar desde problemas no desenvolvimento (pela inibição) até a morte
do organismo (pelo bloqueio). Em A. cepa, e em vegetais em geral, a interrupção na divisão
celular impede a germinação da semente, caracterizando um efeito tóxico que leva o
indivíduo a morte. No entanto, a inibição das células em divisão, normalmente, não leva o
organismo à morte, mas pode interferir no seu desenvolvimento devido à significativa
quantidade de células em processo de morte, caracterizando assim um efeito citotóxico.
Para a análise dos efeitos citotóxicos, são analisados os índices mitóticos de cada
tratamento. O índice mitótico é obtido pela relação entre as células em divisão celular e o
total de células observadas, segundo a fórmula:

Índice mitótico = Número total de células em divisão x 100


(IM) Total de células observadas

Morte celular (parâmetros morfológicos): Existem várias metodologias


específicas para avaliar o potencial citotóxico de um agente. Dentre as metodologias
utilizadas, grande parte está relacionada às mudanças no potencial de membrana e à
fisiologia celular, devido as mudanças enzimáticas que ocorrem na célula, quando essas
estão em processo degenerativo. No entanto, é possível observar as conseqüências dessas
alterações celulares, por meio de mudanças morfológicas típicas .
4.4. Análise dos resultados relacionados à investigação de genotoxicidade
O termo genotóxico se aplica ao agente capaz de promover danos no material
genético, seja nos cromossomos ou no DNA. No entanto, tais alterações podem ser
passíveis de reparo. Desta maneira, algumas alterações, observadas durante o ciclo de
divisão celular, são caracterizadas somente como genotóxicas. Como exemplo, temos as
alterações do tipo: C-metáfases, metáfases poliplóides, metáfases com aderências,
metáfases com perdas cromossômicas, anáfases e telófases com atrasos, perdas de
cromossomos inteiros e pontes cromossômicas. Esta classificação é assumida, por não se

ix.
Os micronúcleos podem aparecer em qualquer fase do ciclo celular. Nestes casos, os MN que não foram expulsos das
células em eventos anteriores podem ou não apresentar sincronia com o material genético do núcleo principal. Segundo
STOPPER e MÜLLER (1997), os MN sincrônicos podem vir a ser incorporados novamente no conteúdo original, sem
causar grandes problemas para a célula.
28

saber, com segurança, se as derivações dessas anormalidades decorrem realmente, em


efeito mutagênico, uma vez que as células podem sofrer injúrias e morrer, ou podem ainda
corrigir o “erro”, não derivando assim em uma célula com mutação. A presença destas
alterações, contudo, podem indicar que a substância tem ação sobre o material genético
(CARITÁ; MARIN-MORALES, 2008).
Os índices de alterações cromossômicas devem ser obtidos pela relação entre as
células portadoras de alterações e o total de células observadas, segundo a fórmula:

Índice de alterações cromossômicas = Número total de células alteradas x 100


(IAC) Total de células observadas

4.5. Análise dos resultados relacionados à investigação de mutagenicidade


Um agente é tido como mutagênico quando sua ação é capaz de promover danos
no material genético, sejam no cromossômico ou no DNA, danos estes que não podem ser
reparados pela célula e que são herdados pelas novas gerações celulares, caracterizando,
assim, uma mutação.
As células portadoras de MN e de fragmentos cromossômicos sugerem uma ação
mutagênica, pois decorre em uma alteração no material genético, que não compromete a
viabilidade celular e que persiste através do ciclo de divisão. Os MN devem ser
considerados como decorrentes de ação mutagênica, pois são observados em células
interfásicas, células estas que já passaram por um ciclo completo de divisão, e cuja
presença confirma a viabilidade da célula. As quebras cromossômicas também devem ser
classificadas como aberrações cromossômicas (AC) mutagênicas, pois evidenciam uma
ação direta de um dado agente sobre a molécula de DNA, promovendo assim a
fragmentação do mesmo, porção esta que não mais terá função transcritiva na célula. Esses
fragmentos resultantes podem decorrer também, após a divisão celular, em micronúcleo,
pois por não serem portadores de centrômeros, não se ligam ao fuso, constituindo pequenos
núcleos denominados de MN.
Para a análise dos efeitos mutagênicos, são registradas a ocorrência de MN e
quebras cromossômicas presentes nas células submetidas aos tratamentos. O índice é
calculado segundo a fórmula:
29

Índice de mutagenicidade = Número total de células alteradas x 100


(IMt) Total de células observadas

A avaliação da incidência de AC e MN em células radiculares de A. cepa tem se


mostrado um método fácil de estimar a genotoxicidade e mutagenicidade de diversos
agentes químicos ambientais ((FISKESJÖ, 1985, 1988; RANK; NIELSEN, 1993, 1994;
GRANT, 1994, MA et al., 1995; SMAKA-KINCL et al., 1996; COTELLE et al., 1999;
MATSUMOTO et al., 2006; MIGID et al., 2007; CARITÁ; MARIN-MORALES, 2008; LEME;
MARIN-MORALES, 2008). Além disso, a análise isolada de cada tipo de AC observada
permite inferir os efeitos induzidos pelos químicos testados, quanto ao seu mecanismo de
ação, como ações clastogênica, aneugênica ou promotora de morte celular (RANK;
NIELSEN, 1997; FERNANDES et al., 2007, LEME et al., 2008).
Leme et al. (2008) mostraram que o petróleo, por ser constituído de uma mistura
complexa de hidrocarbonetos, pode apresentar tanto uma ação clastogênica como
aneugênica pelo visualização de MN de tamanhos variados nas células meristemáticas de A.
cepa expostas a águas contaminadas por petróleo. Ainda de acordo com estes autores,
provavelmente, estas ações sobre o material genético estão relacionadas, principalmente,
com os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, devido ao conhecimento dos efeitos tóxicos,
mutagênicos e carcinogênicos promovidos por esta classe de poluentes (AINA et al., 2006).
Ainda em relação ao tamanho dos MN, Bianchi (2008) pela observação de MN de
tamanhos relativamente pequenos em células radiculares de A. cepa expostas a diferentes
concentrações residuais do inseticida malation, caracterizou o malation como um agente
clastogênico. Já Fernandes (2005), na avaliação da genotoxicidade e mutagenicidade do
herbicida trifluralina, caracterizou o mesmo como um agente aneugênico, pela visualização
de MN de tamanhos grandes em células radiculares de A. cepa expostas a diferentes
concentrações deste produto.
Segundo Brinkley e Humphrey (1969), as pontes cromossômicas que aparecem
na anáfase podem ser decorrentes de trocas estruturais ocorridas, anteriormente, entre
cromátides de um mesmo cromossomo ou entre as cromátides de dois cromossomos
distintos. Estes autores classificam as pontes anafásicas em três tipos, de acordo com a sua
formação:
30

Pontes falsas ou pegajosas: resultantes da aderência de materiais externos,


como os ribossomos ou nucléolos persistentes e, também segundo Cimini et al. (2003),
proteínas centroméricas de cromátides irmãs;
Pontes resultantes de trocas entre cromátides irmãs ou entre cromossomos
distintos: derivadas de quebras e deleções terminais. Neste caso, após a quebra, as
porções cromossômicas portadoras de cinetócoro ligam entre si, formando estruturas
dicêntricas. Quando este conjunto move-se para pólos opostos na anáfase, ocorre a
formação de uma ponte cromossômica. As porções terminais acêntricas são perdidas e não
se reintegram ao núcleo principal da célula;
Pontes side-arm: as quais envolvem trocas de fibras em níveis subcromatídico.
As aderências cromossômicas também são sinais típicos da ação tóxica sobre o
material genético e decorre, provavelmente, em efeitos irreversíveis para a célula,
promovendo a morte da mesma (FISKESJÖ, 1993; 1999; TÜRKOGLU, 2007). Segundo
Marcano et al. (2004), as aderências cromossômicas originam pontes e, conseqüentemente,
quebras cromossômicas. As pontes cromossômicas decorrentes de aderências, que podem
ser múltiplas e persistirem até a telófase (GIACOMELLI, 1999).
C-metáfases são evidências da ação aneugênica de uma substância, uma vez
que proporcionam a completa inativação do fuso mitótico das células (FISKESJÖ, 1985;
1993). Os fusos são inativados quando nenhuma placa equatorial é organizada, o que pode
acarretar em um impedimento da divisão dos centrômeros. Segundo Krisch-Volders (2002) e
Fernandes et al. (2007), a presença de C-metáfases pode levar a formação de núcleos
poliplóides, embora o resultado mais freqüente seja a formação de uma grande quantidade
de MN.
De acordo com Rank e Nielsen (1998), anáfases multipolares decorrem do mau
funcionamento do fuso mitótico, que distribui os cromossomos de forma irregular,
encaminhando-os para mais de dois pólos nas células, contrariamente ao que ocorre em
células de divisão normal.
Fernandes (2005) mostrou que a formação de núcleos lobulados podem ser
decorrentes de anáfases multipolares portadoras de pontes cromossômicas. Segundo a
autora, essa instabilidade cromossômica instalada durante a divisão nuclear parece não
impedir que o envoltório nuclear se reestruture. Este envoltório acompanharia a distribuição
irregular do material genético na célula e daria origem a estes núcleos disformes (núcleos
31

lobulados). Adicionalmente, Leme et al. (2008) inferem que a presença de núcleos lobulados
pode também decorrer na indução de processos de morte celular, uma vez que estes
núcleos não aparecem nas análises de células F1 das raízes primárias de A. cepa.
Alguns autores acreditam que as perdas e quebras cromossômicas, como
também o próprio material excedente, promovido por replicação do material genético,
tendem a formar MN que podem ser eliminados da célula, sob a forma de pequenas células
(microcitos), formando pequenas porções citoplasmáticas portadoras de um reduzido
conteúdo nuclear (FERNANDES et al., 2007). Leme et al. (2008) observaram elevadas
freqüências de microcitos em células meristemáticas de A. cepa expostas em águas
contaminadas por petróleo. Os autores inferiram que estas anormalidades parecem ser
decorrentes da eliminação de MN de células multimicronucleadas. Tais dados são
concordantes com os apresentados por Fernandes et al. (2007), quando os autores
analisaram o efeito de um agente aneugênico.

4.6. Análise estatística


As comparações estatísticas devem ser realizadas entre o grupo controle
negativo e os demais grupos do estudo. A escolha do método pode depender da distribuição
dos dados. É a distribuição que prediz se o teste estatístico a ser utilizado deve ser
paramétrico ou não paramétrico.
Para os bioensaios com cebola, os testes mais usados são os não-paramétricos:
Kruskal-Wallis e Mann-Whitney (nível de significância da análise de 5% e 1%).
Desse modo, os resultados obtidos com a análise das lâminas são comparados
pelo teste estatístico escolhido, o qual possibilita a comparação dos tratamentos com os
testes controle negativo.
32

A B C D E

A1 A2 B1 C1 C2 D1 E1

A3 A4 B2 C3 C4 D2 E2

A5 A6 B3 C5 C6 D3 E3

A7 A8 B4 C7 D4 E4

Figura 4: Aberrações cromossômicas e nucleares em Allium cepa. A. Núcleo interfásico; A1. Broto nuclear; A2. MN; A3. Microcito; A4. Célula
trinucleada com MN; A5 e A6. Células com núcleo lobulado; A7. Célula com núcleo poliplóide; A8. Núcleo lobulado (seta) e célula tribucleada
(cabeça de seta); B. Prófase; B1. Prófase com broto e MN; B2 e B3. Prófase com MN; B4. Prófase binucleada; C. Metáfase com aderência
cromossômica; C3. Metáfase com perda cromossômica; C4. Metáfase poliplóide; C5. Metáfase com quebra cromossômica; C6. Metáfase com MN;
C7. C-metáfase com quebra cromossômica; D. Anáfase; D1. Anáfase com perda cromossômica; D2. Anáfase com ponte (seta) e quebras
cromossômicas (cabeça de seta); D3. Anáfase com ponte cromossômica; D4. Anáfase multipolar; E. Telófase; E1. Telófase com atraso
33

cromossômico; E2. Telófase com ponte cromossômica; E3. Telófase com ponte (cabeça de seta) e perda cromossômica (seta); E4. Telófase com
MN.
34

5. Considerações Finais

O teste de micronúcleo (MN) e aberrações cromossômicas (AC) em Allium cepa


tem sido utilizada, a muito tempo, na avaliação de genotoxicidade e mutagenicidade de
compostos químicos, como herbicidas (VENTURA, 2004; FERNANDES et al., 2007),
inseticidas (BIANCHI, 2008; PEDRO, 2008) e amostras ambientais impactadas por
poluentes diversos (HOSHINA, 2005; BIANCHI, 2005; MATSUMOTO; MARIN-MORALES,
2004, MATSUMOTO et al., 2006; CARITÁ; MARIN-MORALES., 2008; LEME; MARIN-
MORALES, 2008, LEME et al., 2008), além de estudos de antimutagênese (ROBERTO,
2006), comprovando a sua eficiência e versatilidade como organismo teste.
Para os testes de AC e de MN em A. cepa, a coloração com reativo de Schiff é
recomendada, pois é uma coloração específica para material genético, o que facilita a
visualização deste material na célula, eliminando o risco de considerações de artefatos de
técnica, o que aumenta a confiabilidade dos resultados obtidos.
O teste realizado com bulbos de A. cepa tem sido bastante utilizado, com diversas
citações descritas na literatura. No entanto, essa metodologia apresenta algumas limitações,
como, por exemplo, a dificuldade de se encontrar a mesma variedade de bulbos de cebola
durante as diferentes estações do ano. No Brasil, ocorre uma grande diversidade de
variedades de cebola cultivadas, o que dificulta a utilização deste material, pela incerteza de
sua origem. Essas desvantagens não são observadas quando o teste é realizado com
sementes, pois sementes da mesma variedade, mesmo lote e mesma origem podem ser
facilmente adquiridos, para serem utilizadas nos experimentos, em qualquer estação do ano,
o que aumenta a confiabilidade do teste e minimiza as variações inter-específicas que
poderiam interferir nos resultados dos experimentos.
O teste de MN e AC em células meristemáticas de A. cepa pode ser utilizado,
tanto para a avaliação de mutagenicidade e antimutagenicidade como para se compreender
os mecanismos da ação dos agentes, das substâncias e/ou compostos testados,
dependendo do tipo de aberrações encontradas. Quando são observadas aberrações do tipo
C-metáfases, pontes anafásicas, atrasos cromossômicos, cromossomos perdidos e
35

anáfases multipolares pode se inferir uma atividade aneugênica do produto, decorrente da


sua ação sobre os fusos mitóticos. Já a observação de quebras cromossômicas pode indicar
uma ação clastogênica. A presença de células portadoras de micronúcleos pode ser
indicativa tanto de atividade clastogênica quanto aneugênica, uma vez que os micronúcleos
podem ser formados a partir de cromossomos inteiros ou de quebras cromossômicas. No
entanto, recomenda-se que, concomitante à avaliação de micronúcleo e aberrações
cromossômicas em células meristemáticas de A. cepa, também seja feita a avaliação das
células F1, para que se possa avaliar, de maneira mais completa, a ação dos químicos
testados, bem como poder predizer o destino das aberrações cromossômicas encontradas
nas células meristemáticas e inferir se as alterações são persistentes, ou recuperáveis.
Frente ao quadro analítico, observa-se que o teste de micronúcleo e aberrações
cromossômicas em A. cepa é um teste bastante eficiente e confiável, podendo ser
amplamente aplicado em estudos de mutagenicidade e anti-mutagenicidade.
36

6. Preparo de Soluções

• Fixador Carnoy I (3:1)


Misturar 3 partes de álcool etílico absoluto e 1 parte de ácido acético glacial. Esta
solução deve ser preparada no momento da sua utilização, para manter suas propriedades
fixadoras.

• HCl 1 N – 1L
Medir 83,30 mL de HCl e completar com 1000 mL de água. Armazenar em frasco
de vidro com tampa. Manter bem vedado.

• Reativo de Schiff
1,5 g de fucsina básica
4,5 g de metabisssulfito de K ou Na
45 mL de HCl 1N
1 g de carvão ativado
300 mL de H2O torneira
Modo de preparo:
Aquecer a água a 50ºC e dissolver a fucsina com o auxílio de um bastão;
Acrescentar o metabissulfito e o HCl;
Agitar por 15 minutos;
Guardar no escuro completo (envolver em plástico preto) por 24 horas;
Adicionar o carvão ativado e agitar por 1 minuto;
Filtrar (no claro);
Guardar na geladeira em frasco escuro, envolto por papel alumínio.

• Camim acético 2%
Dissolver 2 gramas de carmim em 100 mL de ácido acético 45% (45 mL de ácido
acético glacial em 55 mL de água destilada). Ferver em um condensador de refluxo por 2 a 3
37

horas. Esfriar, filtrar com papel filtro comum e guardar em recipiente bem fechado.
Conservar em geladeira.
Obs: Caso não possua um condensador de refluxo, juntar o carmim e o ácido
acético em um béquer de vidro, tampar com uma placa de Petri e ferver por 2 a 3 horas.
38

6. Referências Bibliográficas

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genotoxicity in Trifolium repens L., Chemosphere, v.65, p.666-673, 2006.

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F.; NATARAJAN, A.T.; NORPPA, H.; SHUKER, D.E.; TICE, R.; WATER, M.D.; AITIO, A.
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BIANCHI, J. Análise dos efeitos citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos do inseticida


Malation, utilizando os sistemas teste de Allium cepa e células de mamíferos. 2008.
Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) – Instituto de Biociências,
Universidade Estadual Paulista, Rio Claro.

BIANCHI, J. O uso de técnicas em sistemas-teste de Allium cepa, como instrumento de


avaliação do potencial mutagênico em águas de rio – utilização do rio do Monjolinho
(São Carlos) como modelo. 2005. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em
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