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Disciplina: Mutagênese
Organização
Out/2009
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os testes com vegetais, sobretudo A. cepa, ainda são utilizados, rotineiramente, em muitos
laboratórios em todo mundo, como indicadores de potencial genotóxico e mutagênico de
diversos agentes.
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2. Teste de Aberrações
Cromossômicas e Micronúcleos
em Allium cepa
erroneamente, nas células parentais (RIBEIRO, 2003), sendo facilmente visualizados nas
células filhas como uma estrutura similar ao núcleo principal, porém, de tamanho reduzido.
Adicionalmente, o teste do MN vem sendo considerado uma técnica vantajosa,
não apenas pela simplicidade de análise de resultados, mas também pela possibilidade de
aplicação em qualquer população celular em proliferação, não sendo necessário o
conhecimento cariotípico prévio do organismo-teste utilizado (HAYASHI et al., 1998).
Contudo, mesmo sendo o teste do MN aplicável em qualquer tipo de célula, ele é
dependente do ciclo celular, uma vez que os danos induzidos no primeiro ciclo serão
visíveis, como MN, no segundo ou no subseqüente ciclo de divisão celular (TATES et al.,
1980).
Tanto o teste de AC como o do MN, mencionados anteriormente, têm sido
aplicados, com sucesso, no sistema-teste de A. cepa. Por isso, este sistema vem sendo
muito utilizado na avaliação da contaminação ambiental (FERNANDES, 2005;
MATSUMOTO et al., 2006; MAZZEO, 2006; CARITÁ, 2007; BIANCHI, 2008; CARITÁ;
MARIN-MORALES, 2008; LEME; MARIN-MORALES, 2008). É importante ressaltar ainda,
que tal sucesso é devido, não apenas a possibilidade de detecção da genotoxicidade e
mutagenicidade ambiental, mas também pela possibilidade de avaliação dos mecanismos de
ação dos agentes testados (MATSUMOTO et al., 2006, FERNANDES et al., 2007, LEME et
al., 2008).
Yamamoto e Kikuchi (1980) demonstraram que, medindo o diâmetro dos MN, era
possível determinar se o agente era clatogênico ou aneugênico. Os autores observaram que
os MN produzidos por agentes clastogênicos eram, de maneira geral, menores que aqueles
produzidos por agentes aneugênicos. No entanto, apesar do método ter sido satisfatório
para um grande número de MN, Combes et al. (1995) concluíram que a análise do tamanho
do MN não é parâmetro, suficientemente seguro, para a determinação da ação clastogênica
ou aneugênica do agentes tóxicos. Fenech (2000), baseado em estudos com células
humanas e de outros tipos celulares, afirma que o tamanho dos cromossomos, por ser
heterogêneo, não confere em bom parâmetro para o estabelecimento de uma correlação
segura entre o tamanho do MN e o indicativo de efeito clastogênico ou aneugênico. Para o
autor, um MN pequeno pode conter tanto um fragmento de um cromossomo grande, como
um cromossomo pequeno inteiro.
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Figura 2.1. Esquema representativo das mutações por substituição de bases (transição e
transversão).
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Figura 2.2. Esquema representativo das mutações do tipo inserção e deleção. 1. Molécula
de DNA original (seta vermelha indica o local relacionado com a inserção ou
deleção de uma base); 2. Molécula de DNA alterada (seta vermelha indica o
local relacionado com a inserção ou deleção da base).
Além dos processos citados acima, outros caminhos podem levar as aneuploidias,
como a divisão incorreta do centrômero, que resulta na separação incorreta das cromátides
irmãs durante a divisão mitótica (KIRSCH-VOLDER et al., 2002).
A poliploidia pode ser induzida pela ausência de fuso mitótico funcional, que,
conseqüentemente, resulta na falha da migração das cromátides irmãs para os pólos
opostos da célula durante a anáfase. Tal processo, denominado de retardo mitótico, produz
células 4N e 4C, no qual C corresponde ao conjunto haplóide do DNA de uma determinada
espécie (GUERRA, 1988; KIRSCH-VOLDERS et al., 2002) (Figura 4.5).
4.3. Micronúcleos
Como já descrito anteriormente, MN são pequenos corpos extranucleares, que
aparecem nas células como resultado da não incorporação de fragmentos
cromossômicos/cromatídicos acêntricos ou da perda de cromossomos/cromátides inteiras
durante o processo de divisão celular (MATEUCA et al., 2006).
MN provenientes de fragmentos cromossômicos, provavelmente, são resultados
diretos de DSBs, da conversão de quebras de fita simples (SSBs – single-strand breaks) em
DSBs, após a replicação ou pela inibição da síntese de DNA. MN provenientes de perdas
cromossômicas são decorrentes de falhas na maquinaria da segregação cromossômica,
como deficiências no controle gênico do ciclo celular, falhas no fuso mitótico, falhas no
cinetócoro ou em outras partes do aparato mitótico ou ainda por danos na estrutura
cromossômica (MATEUCA et al., 2006).
Contudo, segundo Ribeiro et al. (2003), para uma estrutura ser considerada um
micronúcleo ela deve ser morfologicamente semelhante ao núcleo principal, porém, de
tamanho reduzido, com diâmetro entre 1/16 à 1/3 do núcleo principal. Além disso, outras
características também devem ser consideradas como a não refringência do material, a não
conexão com o núcleo principal e ter a mesma coloração do núcleo principal, embora
algumas vezes o micronúcleo possa apresentar coloração um pouco mais intensa
(FENECH, 2000).
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3. Materiais e Métodos
Bulbos:
• No Brasil, os bulbos são provenientes de regiões distintas e suas variedades
diferem durante as estações do ano;
• Utiliza uma maior quantidade do químico a ser testado por ensaio, o que
acarreta na geração de grandes quantidades de resíduo ao final do experimento;
• Necessita da disponibilidade de um maior espaço físico para a realização do
experimento;
• Apresenta raízes maiores, mais facilmente manuseadas;
• São mais utilizadas, mundialmente, como material teste.
iii.
Nesta apostila, o protocolo descrito será baseado na utilização de sementes, devido às suas vantagens e por estar
padronizado no Laboratório de Mutagênese da UNESP de Rio Claro.
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Reagentes
• Ácido acético PA;
• Álcool etílico absoluto;
• Ácido clorídrico PA;
• Fucsina básica;
• Metabissulfito de potássio ou de sódio;
• Carvão ativado;
• Carmim em pó;
• Resina sintética para montagem de lâmina.
Equipamentos
• Banho-maria;
• Microscópio de luz;
5.3. Metodologiaiii
• Controle Positivo (CP) e Controle Negativo (CN)
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iv.
Os testes CN são realizados no Laboratório de Mutagênese do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências
de Rio Claro, expondo as sementes de A. cepa para germinação em água ultrapura (Milli-Q ou Osmose Reversa).
v.
Para o preparo da solução, diluir 0,770µL em 100 mL de água destilada. A solução deve ser preparada
imediatamente antes de ser usada e não deve ser armazenada. Obs. Seu descarte não deve ser feito na pia,
devendo ser estocado em recipientes apropriados, bem fechados e, posteriormente, enviados para tratamento em
laboratórios de resíduos.
vi.
Para o preparo da solução, diluir 190 µL em 100 mL de água destilada. Após o preparo, essa solução pode ser
armazenada por tempo indeterminado, desde que esteja protegida da luz, uma vez que este herbicida caracteriza-se
por ser fotodegradável.
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• Germinação
A germinação é sempre feita em placas de Petri de vidro, sendo uma placa para
cada ensaio, incluindo o controle negativo e o positivo. As placas são forradas com papel de
filtro umedecido com água (para tratamento temporário) ou com a substância a ser testada
(para o tratamento contínuo). Sobre o papel de filtro úmido de cada placa, são dispostas
cerca de 100 sementes. O crescimento das radículas é monitorado, constantemente, para
que não haja ressecamento do papel de filtro. O experimento deve sempre ser realizado
sobre as mesmas condições de luminosidade e temperatura, para evitar a influência desses
parâmetros nos resultados dos testes.
• Testes de toxicidade
A toxicidade de uma substância, avaliada por meio do sistema teste de A. cepa,
pode ser obtida pelo índice de germinação e pela variação do comprimento médio das raízes
(VCMR). O índice de germinação é obtido pela razão entre o número de sementes
germinadas e o total de sementes expostas à germinação. Para se obter o valor do VCMR,
as raízes emergidas são medidas e com estes valores extrai-se a média do comprimento da
raiz por placa.
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Hidrólise
Após as lavagens, retirar o excesso de água das raízes encostando-as,
delicadamente, em papel filtro. A hidrólise das raízes é feita em frascos contendo HCl 1N à
60°C, aquecidos em banho Maria, por 8 a 11 minutos.
Coloração
Após a hidrólise, as raízes devem passar, novamente, por três banhos de água
destilada, para interromper o processo de hidrólise e retirar o excesso do ácido das raízes.
As raízes são novamente secas em papel filtro (tomando bastante cuidado, pois o meristema
encontra-se ainda mais frágil), para serem colocadas em frascos de vidro âmbar, contendo o
Reativo de Schiffvii, onde deverão permanecer por 2 horas em local escuro. Após esse
tempo, as raízes serão lavadas em água destilada, até que todo o excesso de corante seja
retirado.
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sugere que esse agente é tóxico para o organismo utilizado no teste. O índice de
germinação é calculado pela fórmula:
aos obtidos com um número maior de indivíduos. Como os resultados não variam, as duas
opções apresentadas são viáveis e permitem uma análise estatística confiável.
mais evidente e intenso. A divisão pode ser inibida ou bloqueada e ter conseqüências
graves, que podem levar desde problemas no desenvolvimento (pela inibição) até a morte
do organismo (pelo bloqueio). Em A. cepa, e em vegetais em geral, a interrupção na divisão
celular impede a germinação da semente, caracterizando um efeito tóxico que leva o
indivíduo a morte. No entanto, a inibição das células em divisão, normalmente, não leva o
organismo à morte, mas pode interferir no seu desenvolvimento devido à significativa
quantidade de células em processo de morte, caracterizando assim um efeito citotóxico.
Para a análise dos efeitos citotóxicos, são analisados os índices mitóticos de cada
tratamento. O índice mitótico é obtido pela relação entre as células em divisão celular e o
total de células observadas, segundo a fórmula:
ix.
Os micronúcleos podem aparecer em qualquer fase do ciclo celular. Nestes casos, os MN que não foram expulsos das
células em eventos anteriores podem ou não apresentar sincronia com o material genético do núcleo principal. Segundo
STOPPER e MÜLLER (1997), os MN sincrônicos podem vir a ser incorporados novamente no conteúdo original, sem
causar grandes problemas para a célula.
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lobulados). Adicionalmente, Leme et al. (2008) inferem que a presença de núcleos lobulados
pode também decorrer na indução de processos de morte celular, uma vez que estes
núcleos não aparecem nas análises de células F1 das raízes primárias de A. cepa.
Alguns autores acreditam que as perdas e quebras cromossômicas, como
também o próprio material excedente, promovido por replicação do material genético,
tendem a formar MN que podem ser eliminados da célula, sob a forma de pequenas células
(microcitos), formando pequenas porções citoplasmáticas portadoras de um reduzido
conteúdo nuclear (FERNANDES et al., 2007). Leme et al. (2008) observaram elevadas
freqüências de microcitos em células meristemáticas de A. cepa expostas em águas
contaminadas por petróleo. Os autores inferiram que estas anormalidades parecem ser
decorrentes da eliminação de MN de células multimicronucleadas. Tais dados são
concordantes com os apresentados por Fernandes et al. (2007), quando os autores
analisaram o efeito de um agente aneugênico.
A B C D E
A1 A2 B1 C1 C2 D1 E1
A3 A4 B2 C3 C4 D2 E2
A5 A6 B3 C5 C6 D3 E3
A7 A8 B4 C7 D4 E4
Figura 4: Aberrações cromossômicas e nucleares em Allium cepa. A. Núcleo interfásico; A1. Broto nuclear; A2. MN; A3. Microcito; A4. Célula
trinucleada com MN; A5 e A6. Células com núcleo lobulado; A7. Célula com núcleo poliplóide; A8. Núcleo lobulado (seta) e célula tribucleada
(cabeça de seta); B. Prófase; B1. Prófase com broto e MN; B2 e B3. Prófase com MN; B4. Prófase binucleada; C. Metáfase com aderência
cromossômica; C3. Metáfase com perda cromossômica; C4. Metáfase poliplóide; C5. Metáfase com quebra cromossômica; C6. Metáfase com MN;
C7. C-metáfase com quebra cromossômica; D. Anáfase; D1. Anáfase com perda cromossômica; D2. Anáfase com ponte (seta) e quebras
cromossômicas (cabeça de seta); D3. Anáfase com ponte cromossômica; D4. Anáfase multipolar; E. Telófase; E1. Telófase com atraso
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cromossômico; E2. Telófase com ponte cromossômica; E3. Telófase com ponte (cabeça de seta) e perda cromossômica (seta); E4. Telófase com
MN.
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5. Considerações Finais
6. Preparo de Soluções
• HCl 1 N – 1L
Medir 83,30 mL de HCl e completar com 1000 mL de água. Armazenar em frasco
de vidro com tampa. Manter bem vedado.
• Reativo de Schiff
1,5 g de fucsina básica
4,5 g de metabisssulfito de K ou Na
45 mL de HCl 1N
1 g de carvão ativado
300 mL de H2O torneira
Modo de preparo:
Aquecer a água a 50ºC e dissolver a fucsina com o auxílio de um bastão;
Acrescentar o metabissulfito e o HCl;
Agitar por 15 minutos;
Guardar no escuro completo (envolver em plástico preto) por 24 horas;
Adicionar o carvão ativado e agitar por 1 minuto;
Filtrar (no claro);
Guardar na geladeira em frasco escuro, envolto por papel alumínio.
• Camim acético 2%
Dissolver 2 gramas de carmim em 100 mL de ácido acético 45% (45 mL de ácido
acético glacial em 55 mL de água destilada). Ferver em um condensador de refluxo por 2 a 3
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horas. Esfriar, filtrar com papel filtro comum e guardar em recipiente bem fechado.
Conservar em geladeira.
Obs: Caso não possua um condensador de refluxo, juntar o carmim e o ácido
acético em um béquer de vidro, tampar com uma placa de Petri e ferver por 2 a 3 horas.
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