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ESTRATÉGIAS PARA MODIFICAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS NUTRICIONAIS DE PLANTAS

ESTRATÉGIAS PARA MODIFICAÇÃO CAPÍTULO 36


DE CARACTERÍSTICAS NUTRICIONAIS DE PLANTAS

Ricardo Antunes Azevedo

• Introdução
• Aminoácidos, proteínas e nutrição
• Regulação do metabolismo de lisina
— um modelo de estudo
• A via metabólica do ácido aspártico
• Regulação da biossíntese de lisina
• Regulação da degradação de lisina
• As proteínas dos grãos de cereais
• Técnicas de manipulação genética aplicadas
ao melhoramento de plantas
• Considerações finais
• Referências bibliográficas
• Súmula curricular

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ESTRATÉGIAS PARA MODIFICAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS NUTRICIONAIS DE PLANTAS

INTRODUÇÃO nas áreas de produção do milho transgênico acumulando hGH


nas sementes serão suficientes para suprir toda a necessidade
O homem vem alterando os ecossistemas para se alimen- brasileira deste hormônio, a um custo muitas vezes reduzi-
tar, se vestir e, enfim, para criar condições para seu bem-estar do2. Ainda dentro das aplicações de plantas transgênicas como
e qualidade de vida, por pelo menos 10 mil anos. Essa é a biorreatores, outros exemplos estão presentes na literatura,
essência da agricultura, que nos anos recentes tem na biotec- como, por exemplo, o desenvolvimento de alimentos enri-
nologia uma alternativa para adicionar velocidade e precisão quecidos com óleos insaturados3 e o “arroz dourado”, que
a este processo, mas, ao mesmo tempo, tem gerado preocupa- através da introdução de transgenes possibilitou a biossínte-
ção com o momento mais atual de combinação de genes de se de pró-vitamina A na semente de arroz, que era deficiente
diferentes espécies. nesse nutriente4.
Em 1951, NI Vavilov sugeriu que a principal meta da Existe ainda a possibilidade de alterações estáveis de
biologia moderna seria alcançar um controle total sobre o genomas plastidiais de plantas (por exemplo, cloroplastos),
organismo. Por muitos anos, a biotecnologia foi considerada podendo resultar em altos níveis de expressão de proteínas
fundamental para um avanço maior e mais rápido na produ- em cromoplastos de frutos, viabilizando a introdução e ex-
ção agrícola, mas foi apenas em anos mais recentes que re- pressão de caracteres biotecnológicos de interesse. Nesse sen-
sultados pontuais dessa nova revolução começaram a atingir tido, projetos estão sendo desenvolvidos para a transformação
aplicações nos níveis de campo experimental e mercado agrí- de cloroplastos5 com o objetivo de aumentar o teor de vitami-
cola. Fica ainda mais claro o enorme potencial para avanços na E funcional em frutos de tomate. Tal iniciativa é um im-
posteriores, seja com a aplicação da genômica na área médi- portante passo para o estabelecimento e a otimização da
ca e de fármacos, como nas áreas aplicadas à produção ani- tecnologia em aplicações biotecnológicas, auxiliando no me-
mal e vegetal, na área básica para o estudo de rotas metabólicas lhoramento nutricional das plantas e tornando possível a dis-
e na área agrária de uma forma geral, incluindo-se ainda a ponibilização para a população em geral de uma fonte
produção de alimentos em quantidade e com um balanço nu- relativamente barata e de fácil acesso, com mais altos níveis
tricional mais adequado, seja para alimentação animal e para de vitamina E.
o próprio homem, produção de plantas mais tolerantes a es-
tresses abióticos (seca, salinidade, metais pesados, etc.) e bi- Muitos, porém, são os procedimentos que podem ser uti-
óticos (patógenos), modificação da arquitetura das plantas, lizados para manipular as características das plantas. Neste
geração de plantas que produzem e acumulam compostos capítulo, vamos utilizar um modelo de estudo que vem sendo
bioativos de alto valor (peptídeos, proteínas), plantas bioacu- desenvolvido visando à melhoria da qualidade nutricional para
muladoras de elementos tóxicos para uso em biorremediação o nível e distribuição de aminoácidos em sementes de cere-
de solos e ambientes aquáticos, entre outros. ais, visando a uma melhor utilização desse grupo vegetal na
alimentação animal e humana. Nesse sentido, uma revisão de
Vários desses aspectos já vêm sendo investigados e avan-
conceitos básicos e conhecimento específico será descrita,
ços significativos foram obtidos. Por exemplo, a semente de
seguida da apresentação e discussão dos procedimentos e dis-
jojoba tem uma característica talvez única entre as plantas
tintas estratégias que vêm sendo utilizadas, as quais envol-
superiores que é o acúmulo de ceras líquidas em vez de trigli-
cerídeos, que são produzidas durante a formação do embrião vem procedimentos de genética clássica até a utilização da
e normalmente utilizadas como ingrediente de cosméticos1. engenharia genética.
Devido à alta estabilidade desse óleo sob altas temperaturas e
pressão, ele também tem potencial como componente de lu- AMINOÁCIDOS, PROTEÍNAS E
brificantes industriais. Porém, considerando-se o elevado custo
do óleo de jojoba, transgenes estão sendo introduzidos em
NUTRIÇÃO
outras espécies mais comuns e mais adaptadas a determina- Os aminoácidos são peptídeos que formam as proteínas
das regiões, que poderão ser uma nova fonte desse tipo de e, portanto, os maiores determinantes das propriedades físi-
óleo, com custo bastante reduzido. cas e químicas desse tipo de macromolécula. Os aminoácidos
Em outro trabalho bastante interessante e certamente de desenvolvem uma enorme gama de funções nos organismos
impacto extremamente significativo, os genes que codificam e são os principais componentes nitrogenados em plantas.
o hormônio de crescimento (hGH) e pró-insulina humanos Existem 20 aminoácidos que normalmente são incorporados
foram introduzidos por transformação genética em plantas em proteínas, embora possam estar sujeitos a alterações pos-
de milho, sendo expressos apenas nas sementes2. Essas pro- teriores em reações enzimáticas, tais como fosforilação, me-
teínas recombinantes foram analisadas, tendo sido produzi- tilação e acetilação. Todos os aminoácidos apresentam uma
das corretamente, com níveis de produção de 2% de estrutura primária composta de um carbono, denominado car-
pró-insulina e 1% de hGH em relação à proteína total solúvel bono α, um grupamento carboxila, um grupamento amino
da semente de milho. Cálculos iniciais sugerem que peque- (imino, no aminoácido prolina), um átomo de hidrogênio e

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uma cadeia lateral (R). Com exceção do aminoácido glicina, hipóteses sejam apresentadas quanto à complexidade dessas
para todos os outros aminoácidos esses grupamentos estão rotas metabólicas em plantas, porém com muitas facetas da
assimetricamente arranjados, levando à existência de pelo bioquímica e genética da regulação do metabolismo de ami-
menos duas formas estereoisoméricas, L e D. Com raríssimas noácidos estando ainda por ser estabelecidas.
exceções, somente a forma L é incorporada em proteínas.
De fato, nos últimos 40 anos, as pesquisas sobre aminoá-
Residem no grupamento R dos aminoácidos as propriedades
cidos concentraram esforços para responder a muitas pergun-
químicas dessas moléculas, e a enorme variabilidade encon-
tas, entre elas: Quais são as vias metabólicas dos aminoácidos?
trada para as proteínas na natureza é determinada pela quan-
Como elas são reguladas? Onde estão localizadas dentro na
tidade e seqüência com que esses aminoácidos as compõem.
célula? Quais os genes que controlam e regulam cada etapa?
Em adição a esses aminoácidos protéicos, mais de 300 Será que os resultados encontrados em experimentos in vitro
outros aminoácidos adicionais foram isolados e caracteriza- correspondem à realidade celular in vivo?
dos em plantas, e esse número deve aumentar com a contínua
evolução das técnicas analíticas. Esses aminoácidos podem Quando considerado o ponto de vista nutricional, o valor
estar presentes em baixas concentrações e ter papel vital nutritivo de uma proteína está estreitamente relacionado à
como intermediários em vias metabólicas, como, por exem- proporção de aminoácidos que a compõem. Entre os 20 ami-
plo, ornitina, homoserina ou cistationina. Em contraste, eles noácidos que podem ser incorporados em proteínas, no caso
podem ainda agir como uma fonte importante de acúmulo e de animais monogástricos, que incluem o homem, alguns deles
armazenamento de nitrogênio, como no caso da canavanina, devem ser fornecidos por meio de suplementação na dieta
ou mesmo ser produzidos em altas concentrações em resposta desses organismos, sejam adultos, jovens em crescimento ou
a estresse externo, como, por exemplo, o α-aminobutirato. É ambos, uma vez que não têm a capacidade de sintetizá-los.
possível que muitos desses aminoácidos não-protéicos pos- Esse grupo de aminoácidos recebeu a denominação de “es-
sam servir como agentes inseticidas ou fungicidas. Existe senciais”. Para o ser humano adulto, são essenciais os seguin-
ainda a possibilidade de análogos dos aminoácidos serem in- tes aminoácidos: isoleucina, leucina, lisina, metionina,
corporados em proteínas, como é o caso da aminoetilcisteína, fenilalanina, treonina, triptofano, valina e histidina6. As quan-
um análogo da lisina. tidades relativas de aminoácidos presentes nas proteínas e na
Muitos dos avanços na bioquímica da biossíntese de forma solúvel ingeridas devem ser próximas aos requisitos
aminoácidos ocorrida no início nos anos 1970-80 foram fun- do organismo em questão. Por outro lado, quando a ingestão
damentais para adicionar evidências que apoiavam e refina- de carboidratos é reduzida, a quantidade de proteína utilizada
vam conceitos previamente desenvolvidos. A utilização de pelo organismo para fins anabólicos também é reduzida, sen-
estratégias essencialmente genéticas e moleculares permitiu do direcionada para a produção de energia. Dessa forma, tor-
que uma considerável quantidade extra de informação fosse na-se relevante integrar as informações relativas à qualidade
obtida, abrindo ainda perspectivas significativas para que e à quantidade da proteína ingerida, ou, ainda, os aminoáci-
novos avanços fossem feitos, principalmente pela associação dos assimilados na forma solúvel com as do valor energético
das novas técnicas que vêm sendo desenvolvidas tão rapida- total da dieta7.
mente com o passar dos anos, com procedimentos usuais clás-
Considerando a composição protéica da dieta, as proteí-
sicos de caracterização bioquímica/fisiológica da célula.
nas devem ter uma composição adequada para que ocorra a
A maioria dos conceitos iniciais relacionados aos meca- substituição adequada e satisfatória das proteínas degradadas
nismos bioquímicos associados ao metabolismo geral dos no catabolismo. Entretanto, com exceção do leite materno
distintos grupos de aminoácidos em plantas superiores foi para os recém-nascidos, os demais alimentos são relativamente
definida a partir das informações obtidas em estudos realiza- incompletos para satisfazer as necessidades nutricionais da
dos com microrganismos, principalmente nos anos 1960. espécie humana. De maneira geral, as proteínas de origem
Muitas, mas não todas as vias biossintéticas de aminoácidos, animal têm valor biológico mais elevado quando compara-
foram então confirmadas nos vegetais quando esses mesmos
das às proteínas de origem vegetal, e a digestibilidade das
estudos foram realizados com plantas. Estudos subseqüentes
proteínas vegetais é mais baixa, quando comparada à das de
permitiram desvendar ainda mais aspectos únicos estruturais
origem animal.
e metabólicos dessas vias em plantas, principalmente a loca-
lização intracelular dessas rotas metabólicas, essencialmente Apesar de reconhecido o problema de deficiência da dieta
realizadas pelo isolamento, purificação e caracterização das para determinados aminoácidos, em termos protéicos, não só
enzimas que participam dessas vias metabólicas, e a identifi- a falta, mas também o excesso de um ou mais aminoácidos,
cação de mecanismos regulatórios específicos. Informação pode ser prejudicial. Assim, o valor nutricional de uma pro-
relativa à natureza e à expressão dos genes que codificam tais teína pode ser limitado não apenas por deficiências de ami-
enzimas tem sido obtida mais recentemente e, junto aos co- noácidos como também pelo excesso, parecendo ser esse o
nhecimentos bioquímicos, permite que novas inferências e caso do milho, que tem elevado valor de leucina. Entre os

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casos patológicos devidos ao desequilíbrio de aminoácidos, As proteínas destacam-se na hierarquia bioquímica que
citam-se na literatura clínica infantil correlação com distúr- mantém a homeostase do organismo vivo não apenas por suas
bios mentais (fenilalanina, histidina, valina) assim como al- funções de sustentação de órgãos e tecidos mas por sua atua-
terações morfológicas no sistema nervoso, os quais estariam ção como hormônios protéicos e enzimas, relacionado a qua-
associados a deficiências protéicas. As concentrações muito se todas as etapas do metabolismo. Assim, entre os grupos de
reduzidas dos aminoácidos lisina e triptofano, associadas ao substâncias associados à alimentação e à nutrição, a carência
excesso do aminoácido leucina (proteína do milho comum), de proteínas reflete-se mais intensamente sobre o equilíbrio
proporcionam crescimento mais lento em ratos quando com- dinâmico do metabolismo que outros grupos integrantes da
parado ao milho comum suplementado com os aminoácidos alimentação de seres humanos e animais. Essa situação tor-
limitantes lisina e triptofano até o teor contido no milho opa- na-se mais evidente em estados de carência nutricional, que,
co-2, que é caracterizado por conter concentrações elevadas persistindo por certo período comprometem o indivíduo, le-
de lisina e triptofano. Contudo, uma dieta contendo proteínas vando a danos irreversíveis7,8.
do milho comum adicionada destes suplementos não atinge o Considerando um contexto geral mais amplo, que inclui
nível de crescimento dos animais alimentados com a própria aspectos biológicos, econômicos e sociais, ou seja, o papel
variedade de milho opaco-2. Além do mais, quando o milho dos aminoácidos e proteínas e suas concentrações entre os
opaco-2 é suplementado com leucina no nível presente no diferentes grupos vegetais, e o fato de que grandes contin-
milho comum, o ritmo de crescimento dos animais diminui gentes da população mundial, principalmente aqueles de
até o nível do milho comum suplementado com lisina e trip- países subdesenvolvidos, utilizam os cereais como principal
tofano, indicando que o excesso de leucina é prejudicial ao e muitas vezes a única fonte protéica, tem ocorrido empenho
crescimento7. no sentido da seleção e produção de cereais com conteúdo de
A utilização e a combinação de alimentos específicos tam- aminoácidos mais adequados aos requisitos nutricionais da
bém podem contribuir para que a mistura das distintas proteí- espécie humana, fazendo uso das distintas técnicas de mani-
nas em uma mesma refeição faça com que as deficiências de pulação genética para o melhoramento da qualidade nutricio-
aminoácidos em uma delas seja complementada pelos exces- nal desse grupo vegetal9.
sos destes em outras, obtendo-se eventualmente um valor
nutritivo superior ao de cada integrante isoladamente. Entre
algumas das culturas de maior produção mundial predomi- REGULAÇÃO DO METABOLISMO DE
nam os cereais e leguminosas, que apresentam determinadas LISINA — UM MODELO DE ESTUDO
particularidades em relação à composição química, não po-
A VIA METABÓLICA DO ÁCIDO ASPÁRTICO
dendo individualmente suprir as necessidades nutricionais
humanas. Nesse sentido, pode-se, por exemplo, combinar ce- Os 20 aminoácidos protéicos dividem-se em diversos
reais que são deficientes em lisina (mais treonina e triptofano) grupos de acordo com rotas metabólicas específicas. Dentre
e excesso de sulfurados, com leguminosas que são deficientes os 20 aminoácidos e mais especificamente os essenciais,
em sulfurados mas que contêm excesso de lisina. Por outro aqueles derivados do ácido aspártico destacam-se por sua
lado, cerca de dois terços da população mundial ainda utilizam importância do ponto de vista nutricional. Os aminoáci-
essencialmente arroz, milho, trigo e mandioca como fontes dos essenciais, lisina, treonina, metionina e isoleucina são
principais de proteínas, sendo a de origem animal ainda muito sintetizados em uma mesma via metabólica a partir de um
limitada. No caso de animais ruminantes, pelo fato de serem precursor comum, o ácido aspártico8. A deficiência dos cere-
poligástricos, as diferentes fontes protéicas apresentam valor ais, primariamente em lisina e em escala menor, em outros
biológico equivalente, pois, após a ingestão e a fermentação, aminoácidos, é fator extremamente preocupante visto que,
irão formar as proteínas dos microrganismos que são, de fato, de acordo com a FAO, esse grupo vegetal representa cerca de
a fonte protéica para o animal. 70% da matéria seca produzida e cerca de 73% da proteína
Finalmente, o valor biológico de uma proteína também é vegetal consumida, tanto na alimentação humana como na
afetado pelo método de preparação dos alimentos, sendo a alimentação animal. Estudos bioquímicos contribuíram em
lisina bastante comprometida nas reações que ocorrem en- um primeiro momento para o isolamento, a purificação e a
tre as funções redutoras dos glicídios e os grupamentos caracterização das enzimas para cada passo metabólico, per-
amina das proteínas. De fato, principalmente em alimentos mitindo um considerável acúmulo de informação e conheci-
de origem vegetal, ocorrem interações que podem diminuir mento dos aspectos regulatórios da via metabólica do ácido
a digestibilidade de suas proteínas, bem como sua biodis- aspártico (Fig. 36.1), mostrando que as enzimas-chave são
ponibilidade. Isso é devido à presença, nesses alimentos, de positiva ou negativamente reguladas por retroinibição8, ou
substâncias fenólicas e substâncias aldeídicas e cetônicas seja, o excesso de um determinado aminoácido inibe sua pró-
(açúcares redutores, produtos de degradação de ácidos gra- pria síntese ou estimula a síntese de outros aminoácidos.
xos insaturados). Análises genéticas e moleculares permitiram, a partir dos anos

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80, o isolamento de muitos genes que codificam enzimas- sozinha inibir a atividade da AK ou até, curiosamente, esti-
chave na regulação dessas vias metabólicas, abrindo um novo mular a atividade da AK em algumas plantas quando em con-
e amplo campo de investigação científica9. centrações mais elevadas11. A isoenzima da AK sensível à
inibição pela treonina normalmente não é a forma predomi-
nante, contribuindo apenas com até 20% da atividade total de
REGULAÇÃO DA BIOSSÍNTESE DE AK, sendo os 80% restantes de atividade devidos às isoenzi-
LISINA mas sensíveis à lisina, havendo porém exceções na literatura,
como no caso de Coix lacryma-jobi12.
A primeira enzima da via metabólica do ácido aspártico,
a aspartato quinase (AK), que converte o ácido aspártico em Apesar do avanço dos estudos bioquímicos, apenas re-
β-aspartil fosfato, foi bem caracterizada em plantas superio- centemente a clonagem de genes que codificam as isoenzi-
res, incluindo arroz, cenoura, cevada, milho e tabaco10. Duas mas da AK foi relatada8. Análises moleculares permitiram o
classes de isoenzimas da AK que podem ser inibidas por lisi- estudo da expressão desses genes em diferentes tecidos das
na ou por treonina foram observadas em plantas8,9. Estudos plantas10. No caso de milho, o gene ask1, que codifica uma
bioquímicos com mutantes têm mostrado que até duas isoen- AK monofuncional sensível à lisina, foi mapeado no cromos-
zimas sensíveis à lisina podem estar presentes9. A sensibili- somo 7 estando ligado ao gene opaco-213.
dade à lisina pode ainda ser sinergisticamente aumentada na Um aspecto dos estudos regulatórios para AK e que vem
presença de S-adenosilmetionina (SAM), que pode também causando controvérsia é um possível papel regulatório do

Fig. 36.1 — Via do ácido aspártico e de degradação da lisina em plantas superiores. Os pontos regulatórios estão indicados em linhas tracejadas
vermelhas para retroinibição ou repressão e em linhas pontilhadas azuis para ativação enzimática. AK, aspartato-quinase que pode ser inibida
por lisina, treonina e SAM, dependendo da forma isoenzimática; HSDH, homoserina desidrogenase, que pode ser inibida por treonina; DHDPS,
dihidrodipicolinato sintase, que é inibida por lisina; CS, cistationina γ-sintetase, que é reprimida por SAM; TS, treonina sintase, que apresenta
ativação por SAM; TDH, treonina desidratase, que é sensível à inibição por isoleucina; LOR-SDH, enzima bifuncional lisina 2-oxoglutarato
redutase-sacaropina desidrogenase que é estimulada por lisina.

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cálcio e da calmodulina. O Ca2+ é conhecido por modular a da degradação da lisina sugeriram que o catabolismo é um
atividade de várias enzimas sendo também um importante dos mecanismos que controlam a concentração da lisina so-
mensageiro em transdução de sinal em plantas10. A calmodu- lúvel no endosperma18. A quantidade de lisina que é translo-
lina é um importante componente na regulação de complexos cada para o tecido de reserva da semente, o endosperma,
de quinases interagindo com vários tipos de moléculas efeto- durante o desenvolvimento da semente, para a síntese de pro-
ras10. Alguns trabalhos têm sugerido a estimulação das isoen- teínas de reserva é 2-3 vezes mais alta do que seria necessá-
zimas de AK por Ca2+ e a participação da calmodulina como rio19. Portanto, esperar-se-ia que houvesse acúmulo de lisina
uma das subunidades da holoenzima, porém vários outros tra- na semente. Contudo, isso não ocorreu, pois a concentração
balhos não encontraram qualquer evidência para apoiar tal de lisina durante o desenvolvimento do endosperma mante-
papel regulatório para o Ca2+ ou para a calmodulina8,10,11. ve-se baixa, provavelmente para não inibir a atividade da AK
A enzima homoserina desidrogenase (HSDH), que cata- e conseqüentemente a biossíntese de metionina (Fig. 36.1),
lisa a redução do aspartato semialdeído em homoserina, está aminoácido essencial no processo de síntese de proteínas.
presente em plantas na forma de isoenzimas, uma resistente O catabolismo da lisina é regulado pela ação de duas en-
(HSDH-R) à inibição pela treonina e a outra sensível à inibi- zimas: a lisina 2-oxoglutarato redutase (LOR) (também de-
ção por esse aminoácido (HSDH-S)8. Por meio de análises nominada lisina α-cetoglutarato redutase, LKR), que condensa
bioquímicas e moleculares, observou-se que a HSDH-S é na a lisina e o 2-oxoglutarato, formando sacaropina, e a saca-
realidade parte de um polipeptídeo bifuncional, ou seja, que ropina desidrogenase (SDH), que catalisa a hidrólise da sacaro-
contém também a atividade de AK sensível à treonina8,14. pina em aminoadípico semialdeído e glutamato. Essas enzimas
Desde então, a existência deste polipeptídeo foi observada têm sido isoladas e caracterizadas em detalhe em várias espé-
em todas as espécies de plantas superiores estudadas10. Ge- cies de plantas, incluindo milho20, arroz21 e feijão22. De forma
nes que codificam para a enzima bifuncional AK-HSDH têm similar aos resultados que foram observados em mamíferos, as
sido isolados e estudados em várias espécies de plantas10, atividades da LOR e SDH também fazem parte de um mesmo
mostrando que a expressão do gene está sujeita muitas vezes polipeptídeo bifuncional20,21. No caso de cereais, um aspecto
à regulação espacial e temporal em tecidos vegetativos, flo- fundamental e determinante para as concentrações baixas de
res e sementes em desenvolvimento10. lisina encontradas nas sementes dessas espécies é o fato de as
enzimas LOR e SDH serem específicas do endosperma da se-
Em outro ramo da via do ácido aspártico que leva à bios- mente, ou seja, confirmam a via de degradação desse aminoá-
síntese de lisina, a enzima dihidrodipicolinato sintetase cido no tecido que armazena as proteínas de reserva.
(DHDPS), que catalisa a fusão do piruvato e do aspartato
semialdeído em dihidrodipicolinato, apresenta papel-chave Recentemente, demonstrou-se também em plantas que
na regulação, tendo sido purificada e caracterizada em várias as atividades de LOR-SDH são afetadas diferentemente por
espécies de plantas ocorrendo em apenas uma forma, forte- Ca2+, força iônica e fosforilação/desfosforilação23,24. Em mi-
mente inibida por baixas concentrações de lisina10. Clones de lho, enquanto a atividade de LOR é modulada por Ca2+, a
cDNA codificando DHDPS foram isolados em várias espécies atividade de SDH não sofre tal regulação23. O aumento de ati-
de plantas8, e, no caso de milho, o gene da DHDPS foi sub- vidade de LOR dependente de Ca2+ pode ser inibido por EGTA
metido a mutagênese dirigida e mostrou que substituições sim- e antagonistas de calmodulina, contudo não foi observada a
ples de aminoácidos nas posições 157, 162 e 166 eliminaram ligação de calmodulina no domínio LOR23. Esses resultados
a sensibilidade da enzima à inibição pela lisina15. foram também observados para a LOR-SDH de arroz24 e para
outras espécies de plantas10. Também para força iônica foi
observado que a atividade de LOR foi estimulada, enquanto
REGULAÇÃO DA DEGRADAÇÃO DE a atividade de SDH permaneceu inalterada, tanto em milho23
LISINA como em arroz24. No caso das enzimas de tabaco e soja, a
atividade de LOR mostrou ser modulada por fosforilação,
O catabolismo da lisina foi demonstrado pela primeira mas não a atividade de SDH10. A auto-regulação por lisina e
vez em plantas em experimentos utilizando lisina-C14, com a fosforilação da atividade de LOR também foi observada em
radioatividade sendo incorporada ao aminoadípico semial- milho17.
deído e ao glutamato, indicando que a degradação da lisina é A análise de seqüências genômicas e de cDNA da enzi-
via sacaropina (Fig. 36.1)16. ma bifuncional LOR-SDH que foram isoladas revelou um
Apesar dos avanços nos estudos da biossíntese de lisina domínio amina correspondente a LOR e um domínio carbo-
e do papel importante da enzima DHDPS, pouco ainda era xila para SDH25. No caso do milho, a expressão do gene ZLKR-
conhecido do seu catabolismo até os anos 90. Estudos mais SDH, que codifica a LOR-SDH, mostrou-se reduzida em
recentes fortemente indicam que o catabolismo da lisina tem aproximadamente 90% em sementes opaco-226. A redução
um papel importante na acumulação desse aminoácido em da atividade de LOR-SDH entre 2-18 vezes em comparação
sementes10,17. Em milho, os primeiros estudos com enzimas com o tipo normal também foi demonstrada no mutante opa-

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co-2 e em variedades de milho QPM (Quality Protein Maize que é uma massa viscoelástica formada pelo complexo pro-
— milho de qualidade protéica)27, o que sugere claramente téico contido na semente de trigo.
que nesses materiais que têm concentrações mais elevadas de No caso do milho, as proteínas da semente também são
lisina na semente a via de degradação está fortemente inibida classificadas em grupos distintos com base em suas caracte-
ou reduzida. rísticas de solubilidade, seguindo o protocolo clássico des-
O efeito de um análogo da lisina, a aminoetilcisteína crito por Osborne30. Desse modo, podem ser fracionadas
(AEC), e da SAM foi testado na atividade de LOR-SDH de quatro classes principais de proteínas a partir do endosperma
arroz24, o que permitiu verificar que a AEC pode substituir de sementes de milho: albuminas (solúveis em água), globu-
a lisina como substrato da atividade da LOR, porém menos linas (solúvel em soluções salinas), prolaminas (solúveis em
efetivamente que a lisina, não confirmando resultados ante- álcool) e glutelinas (solúveis em álcali diluído).
riores para a LOR de milho28. A AEC foi ainda capaz de As albuminas e globulinas representam aproximadamente
inibir a atividade de LOR, possivelmente refletindo uma 6% das proteínas totais; entretanto, as glutelinas respondem
capacidade mais baixa de conversão para sacaropina com a por 30-45% do total. As prolaminas, conhecidas tradicional-
AEC como substrato, quando comparada à lisina como subs- mente como zeínas em milho, são as mais abundantes e re-
trato24. Como mencionado anteriormente, a SAM inibe a presentam 50-70% do total de proteínas. A família de proteínas
atividade da enzima AK sensível à lisina, assim como esti- zeínas consiste em uma mistura de polipeptídeos que podem
mula a biossíntese de treonina pela indução da atividade de ser identificados por técnicas de eletroforese (PAGE) e divi-
treonina sintase (TS)29. Em arroz, foi demonstrado que a didos em classes: γ-zeínas (28 kDa), α-zeínas (22 e 20 kDa),
SAM não afeta as atividades de LOR-SDH, indicando que, β-zeínas (16 e 14 kDa) e δ-zeínas (10 kDa).
apesar de atuar na regulação da biossíntese de lisina, a SAM Entre as décadas de 1960 e 90, várias mutações em genes
não apresenta nenhum aspecto regulatório no catabolismo que codificam as proteínas de reserva do endosperma foram
desse aminoácido24. observadas e mostraram ser capazes de alterar a taxa de sínte-
se dessas proteínas de reservas da semente31. Um gene mu-
tante denominado opaco-2 (o2), se destacou e foi amplamente
AS PROTEÍNAS DOS GRÃOS DE estudado, mostrando uma melhoria sensível na distribuição e
CEREAIS qualidade das proteínas da semente de milho31.
Atualmente, as proteínas de armazenamento de cereais Embora o gene o2 altere favoravelmente o espectro de
são objeto de intensos estudos, por parte de bioquímicos, aminoácidos nas sementes de milho, ou seja, apresentando
biologistas moleculares e geneticistas, na tentativa de melho- altas concentrações de lisina e triptofano, ele apresenta várias
rar a qualidade nutricional da semente. A atenção é devida deficiências que limitam seu uso comercial; 1) geralmente as
primariamente a dois aspectos principais, o primeiro relacio- comparações entre plantas de milho normal e o mutante opa-
nado ao fato de as proteínas de reserva da semente corres- co-2 mostram que, em relação à produção de sementes, as
ponderem a aproximadamente 10% da massa seca da semente, variedades de milho opaco-2 apresentam uma produção de
e o segundo, à elevada proporção das proteínas denominadas sementes reduzida pela diminuição no peso seco das semen-
prolaminas, que são caracterizadas pela baixa concentração tes, sendo os mutantes de 10 a 30% mais leves que no milho
dos aminoácidos essenciais lisina e triptofano, no conteúdo normal, 2) os mutantes apresentam de 1,8 a 4,2% a mais de
total de proteínas da semente. umidade relativa nas sementes do que seus tipos normais. Isso
implica a necessidade de secagem adicional após a colheita,
As proteínas de reserva são importantes sob vários as- 3) as sementes mutantes apresentam-se mais farináceas e de
pectos, pois para a planta essas proteínas são reserva de ni- tonalidade cinza, com aparência opaca o que contrasta com
trogênio a ser utilizada pelo embrião durante a germinação e as sementes brilhantes e translúcidas das variedades de milho
os primeiros dias de crescimento da planta em desenvolvi- normal, 4) em conseqüência, as sementes opaco-2 são mais
mento. Por outro lado, como já mencionado, as sementes dos susceptíveis à infecção por patógenos, com percentagem ele-
cereais são intensamente utilizadas na alimentação de ani- vada na perda de peso da semente, 5) as variedades de milho
mais e do próprio homem. Como referência direta, podemos opaco-2 são caracterizadas por apresentarem melhor balanço
citar o consumo de arroz na Ásia e do trigo em todo o mundo, de aminoácidos nas sementes, contendo 60 a 130% a mais de
este último tanto na panificação como na preparação de mas- lisina e triptofano do que nos tipos normais, porém com uma
sas. No caso do trigo, além de intensa pesquisa utilizando o redução de 12 a 40% de leucina. Finalmente, o aumento de
melhoramento genético para melhoria das características agro- lisina e triptofano no mutante opaco-2 ocorre devido à dimi-
nômicas, principalmente o aumento da produção de grãos, nuição das prolaminas, proteínas pobres nesses aminoácidos,
existe uma atenção especial para a qualidade tecnológica de e concomitante aumento das outras frações protéicas, ricas
sua farinha, a qual é determinada principalmente pelo glúten, nesses aminoácidos27.

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ESTRATÉGIAS PARA MODIFICAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS NUTRICIONAIS DE PLANTAS

TÉCNICAS DE MANIPULAÇÃO
GENÉTICA APLICADAS AO
MELHORAMENTO DE PLANTAS
Apesar da reconhecida necessidade de se aumentar a pro- A B C D
dução de grãos, melhorar o valor nutritivo dos vegetais vem
sendo, há algum tempo, um ponto de consenso entre pesqui-
sadores. Para isso, várias estratégias foram idealizadas, com
o intuito de produzir cereais com sementes acumulando lisi-
na em concentrações mais elevadas nas sementes dos cereais.
Quatro procedimentos/técnicas principais têm sido testados:
1) o melhoramento genético convencional, 2) a identificação
de mutantes espontâneos em populações naturais, 3) a indu-
ção de mutantes bioquímicos e 4) a produção de plantas trans-
gênicas. No caso das plantas transgênicas, amplas variações
na estratégia são ainda possíveis, favorecendo ainda mais a Fig. 36.2 — Espigas de milho. Em (A), uma espiga de milho de uma
utilização da transformação de plantas e a engenharia genéti- linhagem flint, em (B) uma espiga de milho híbrido do tipo flint, em (C)
ca dessas plantas. uma espiga de uma linhagem de milho dentado e em (D) uma espiga
de milho híbrido dentado. Observa-se o incremento na produção obtida
Pelo melhoramento genético convencional, o qual está com os materiais híbridos, independentemente do tipo de grão, flint ou
detalhadamente descrito no Capítulo 33 — Genética e Me- dentado.
lhoramento Vegetal, genótipos de milho têm sido seleciona-
dos apresentando variabilidade para a concentração de lisina
na semente32. Esse procedimento baseia-se no conhecimento terizaram-se como eventos importantes que determinaram
das técnicas de melhoramento genético que foram desenvol- novos rumos para as pesquisas desenvolvidas desde então e
vidas ao longo do século passado e que ainda são amplamen- que ao longo dos anos permitiu uma acelerada evolução nas
te utilizadas para a produção de linhagens, variedades e técnicas de manipulação in vitro utilizadas a partir dos anos
híbridos (Fig. 36.2) que apresentam características melhora- 70 com grande intensidade. Contudo, após a euforia inicial
das geneticamente, como, por exemplo, para resistência a uma devida à alta concentração de lisina constatada nesses mutan-
determinada praga ou doença, aumento da produtividade de tes, atribuída a uma alteração na distribuição das proteínas de
grãos e biomassa vegetal, modificação na estrutura geral ou reserva do endosperma e também à maior disponibilidade do
arquitetura da planta, modificação na composição de ácidos aminoácido na forma solúvel, seguiu-se um grande desapon-
graxos e concentração de óleo, tolerância a estresses abióticos tamento, pela associação a eles, de características agronômi-
e bióticos, entre outros. Apesar do grande sucesso obtido ao cas indesejáveis, tais como baixa produtividade e alta
longo dos anos e da particular eficiência para características suscetibilidade a patógenos, que mostraram ser devidas prin-
multigênicas (quantitativas — características condicionadas por cipalmente ao aspecto farináceo que caracteriza a estrutura
vários genes), em geral essa linha de trabalho requer, na maior da semente nesses mutantes.
parte dos casos, um longo tempo para se atingir um progresso Após um longo período de anos de quase abandono des-
significativo, além de ser muito laboriosa. Além disso, para ses mutantes do ponto de vista do uso comercial, em anos
determinadas características, o progresso é lento, e mesmo recentes, genes modificadores que induzem alterações pro-
após anos o resultado obtido é ainda muito limitado. Esse é nunciadas no fenótipo da semente foram descobertos e pude-
justamente o caso dos programas de melhoramento genético ram então ser incluídos em programas de melhoramento do
para aumento do teor de lisina e triptofano em cereais, que mutante opaco-2, alterando a semente desse mutante de mi-
apresentam até o momento um avanço muito discreto. lho de aspecto opaco para o aspecto vítreo e duro, mantendo
Curiosamente, dentro de programas de melhoramento porém o valor nutritivo do opaco-227. Os programas de me-
de milho e cevada, importantes resultados foram obtidos lhoramento desenvolvidos no Centro Internacional de Mejo-
quando da análise de sementes de populações naturais des- ramiento de Maiz y Trigo (CIMMYT) no México e pela
sas espécies para características morfológicas diferentes. O Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) no
isolamento desses mutantes naturais apresentou-se rapidamen- Brasil resultaram na liberação de linhagens e híbridos do tipo
te como uma primeira alternativa que trouxe progressos muito QPM, os quais já estão disponíveis comercialmente desde a
significativos para a área de melhoria da qualidade nutricio- segunda metade dos anos 90, sendo que a área de produção
nal das sementes de cereais. A identificação do mutante opa- desses materiais tem sido aumentada consideravelmente nos
co-2 de milho31, entre outros, e a do mutante de cevada últimos anos, com ampla utilização na alimentação de ani-
“Hiproly”, ambos classificados como de alta lisina33, carac- mais, particularmente porcos.

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GENÔMICA VEGETAL — IMPACTO NA SAÚDE HUMANA

Com base na extensa caracterização enzimológica da via to e o aprimoramento da cultura de células e tecidos com sub-
metabólica do ácido aspártico, foram obtidas evidências di- seqüente possibilidade de regeneração de plantas favorece-
retas de regulação por retroinibição de seus passos-chave ram em muito a utilização desse modelo de seleção in vitro
(Fig. 36.1). A possibilidade de seleção de mutantes bioquími- (Fig. 36.3). Por esse procedimento, um grande número de
cos caracterizou-se então como mais uma ferramenta impor- mutantes pode ser selecionado em espaços reduzidos de pla-
tante a contribuir para o entendimento da regulação dessa via cas de Petri e tubos de cultura, nos quais um grande número
metabólica. De certa forma, fisiologistas vegetais têm utiliza- de células pode ser manipulado e mantido por períodos lon-
do o conceito genético de isolar ou criar mutantes específicos, gos34. Atravez desse sistema, culturas de calos em meio de
o que gerou extensos estudos na área de fotossíntese, metabo- cultura gelatinoso (grupos de células) ou células em suspen-
lismo de carboidratos e ácidos graxos. Vários estudos relacio- são (células mais individualizadas) em meio de cultura líqui-
nados especificamente ao metabolismo de aminoácidos do podem ser tratadas com mutagênico químico (geralmente
demonstraram que esses mutantes apresentam enzimas altera- azida sódica) ou físico (bomba de cobalto) e então transferi-
das na sua sensibilidade à retroinibição, podendo exibir au- das para novo meio de cultura contendo o agente seletivo
mentos nos aminoácidos produtos finais. Esses mutantes foram como descrito acima para sementes. A presença do agente
obtidos pela utilização de mutagênese de sementes ou de célu- seletivo irá inibir o desenvolvimento das células normais, e
las in vitro, que foram então submetidas a processo de seleção aquelas que eventualmente crescerem são potencialmente
em meio contendo esses aminoácidos ou seus análogos34. células mutadas, podendo conter as enzimas-alvo alteradas
Para a seleção de mutantes bioquímicos, duas alternati- na sua regulação. Exemplificando no caso da via metabólica
vas principais foram utilizadas com sucesso para várias rotas do ácido aspártico, a enzima AK se tornaria insensível à ini-
metabólicas distintas, incluindo-se a do ácido aspártico. Ini- bição pelo aminoácido lisina, o que pode por conseqüência
cialmente, sementes foram utilizadas diretamente, sendo que levar ao acúmulo desse aminoácido, produzindo, como re-
o sistema envolve o uso de embriões maduros de sementes sultado desse processo, uma planta mutante nutricionalmen-
derivadas de sementes que foram tratadas com mutagênico te superior àquela original que deu origem às células utilizadas
químico ou físico34. Esses embriões são então germinados e no início do procedimento de mutação e seleção (Fig. 36.4).
crescidos em meio estéril contendo agentes seletivos especí- O processo seletivo é normalmente mantido durante vários
ficos (causam inibição do crescimento), como, por exemplo, ciclos para garantir que ocorra a multiplicação apenas das
os aminoácidos lisina, treonina ou análogos desses aminoá- células mutantes, processo que é repetido quando as células
cidos no modelo aqui exemplificado. Plantas jovens geradas são transferidas para meio de regeneração. A intensidade e
a partir desses embriões que apresentam capacidade de cres- continuidade da pressão de seleção são determinantes e im-
cer normalmente nessas condições são mutantes em potencial, portantes visto que revertentes e/ou células não-mutadas nor-
sendo então cultivadas até a maturidade e então autofecunda- malmente são observadas como escapes do processo. Tem-se
das. As sementes produzidas são analisadas bioquimicamen- verificado também que o sistema utilizando calos geralmente
te para as atividades das enzimas-chave da regulação da via é menos eficiente devido à formação de gradientes de con-
metabólica do ácido aspártico. Paralelamente, as plantas são centração do agente seletivo, de forma que, por estarem mais
analisadas geneticamente para determinação do modelo de distantes do meio de cultura, as células localizadas na parte
herança da característica em estudo. Finalmente, os mutantes superior do calo podem vir a receber quantidades proporcio-
devem passar por uma caracterização e avaliação agronômi- nalmente menores do agente seletivo. Sugere-se, portanto,
ca, para que possam então ser incluídos em um programa de que no caso da utilização de calos, as subculturas sejam mais
melhoramento específico ou diretamente determinar a viabi- freqüentes e em intervalos de tempo mais curtos. Uma vez
lidade comercial e econômica do material modificado gera- que sejam regeneradas, as plantas deverão passar pelos mes-
do. A maior vantagem desse sistema reside no fato de os mos procedimentos de análise aplicados a sementes já des-
embriões dependerem unicamente dos nutrientes do meio de critos anteriormente.
cultura e da capacidade de síntese de seus próprios aminoáci- Utilizando-se da cultura de tecidos, Hibberd e Green35
dos, sendo mais sensíveis aos agentes seletivos que sementes selecionaram mutantes de milho resistentes à inibição do cres-
intactas porque o endosperma não está presente para prover a cimento por lisina + treonina, utilizados conjuntamente como
semente de outros nutrientes e aminoácidos que não os do agentes seletivos. Esses mutantes apresentaram no endosper-
próprio meio de cultura. Por outro lado, uma limitação ma altas concentrações de treonina, mas não de lisina, que
importante do sistema reside principalmente no fato de de- era o objetivo da pesquisa. Os genes denominados ask1 e ask2
mandar grande quantidade de trabalho e espaço, levando con- codificam isoenzimas da AK sensíveis a lisina e nesses mu-
seqüentemente a uma limitação no número de indivíduos que tantes mostraram estar insensíveis à retroinibição pela lisina,
podem ser analisados34. confirmando a hipótese originalmente considerada. Em estu-
Além do uso de sementes, a possibilidade da manipula- dos posteriores, o mutante de alta treonina ask1 foi cruzado
ção de células não-diferenciadas in vitro e o desenvolvimen- com o mutante de alta lisina opaco-2, resultando em um efei-

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ESTRATÉGIAS PARA MODIFICAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS NUTRICIONAIS DE PLANTAS

conhecimento detalhado da via metabólica do ácido aspárti-


A C
co possibilitaram interpretar as inconsistências observadas nos
mutantes obtidos. Uma vez que o gene que codifica a enzima
AK foi mutado, isso gerando uma enzima da AK também
modificada, portanto insensível à inibição pela lisina altera-
da, isso sugere que o ponto regulado pela enzima DHDPS
deveria ser fundamental para o acúmulo de lisina nos mutan-
tes, visto que esta enzima também é inibida por lisina, mas
permanece inalterada nos mutantes obtidos.
Partindo-se da suposição de que uma alteração da enzi-
ma DHDPS possa levar ao acúmulo de lisina nas sementes de
cereais, mutantes para a DHDPS também foram obtidos em
algumas espécies de plantas, mas, apesar de o gene que codi-
fica a enzima DHDPS ter sido mutado produzindo uma enzi-
B ma modificada, portanto insensível à inibição pela lisina, foi
observado acúmulo desse aminoácido apenas em folhas, mas
não nas sementes dos cereais modificados9.
Como visto, a seleção de mutantes bioquímicos em um
prazo curto de tempo, permite a obtenção de plantas geneti-
camente modificadas. Tal procedimento foi amplamente uti-
lizado, e os mutantes obtidos para vários aspectos do
metabolismo celular estudados e em alguns casos utilizados.
Com base nesses aspectos e pelo desenvolvimento, nos anos
80 e 90 de procedimentos para a transformação genética de
plantas, discutidos em detalhe no Capítulo 33 — Genética e
Melhoramento Vegetal, plantas transgênicas foram produzi-
das para as mais variadas características, incluindo a via me-
Fig. 36.3 — Cultura de tecidos vegetais in vitro. Cultura de células de tabólica do ácido aspártico. No caso dos mutantes
milho não-diferenciadas (A) apresentando embriogênese somática (B) bioquímicos, a mutação não é dirigida, ou seja, durante o pro-
e dando origem à regeneração de plantas (C) que podem ser crescidas
cedimento de mutação as alterações genéticas ocorrem alea-
até a maturidade.
toriamente, produzindo portanto vários mutantes distintos
(Fig. 36.6), e no procedimento de seleção apenas os mutantes
desejados são selecionados, eliminando-se os tipos não-mu-
to sinergístico para o aumento na concentração de treonina tados e outros mutantes que foram produzidos. No caso de
na semente, chegando a 144 vezes quando comparado com plantas transgênicas, o procedimento de transformação de
mutante Ask1 (Fig. 36.5). Tal efeito sinergístico também foi plantas permite a introdução de um determinado gene, modi-
observado para a concentração total de aminoácidos solúveis ficado ou não, de uma espécie no genoma de outra espécie,
(três vezes mais elevada) e para a concentração das proteínas portanto uma técnica dirigida e relativamente mais controla-
de reserva do endosperma13. Esses resultados, associados a da, visto que o local de inserção e o número de cópias incor-
análises posteriores que incluíram o mapeamento do gene ask1 poradas no genoma são alguns fatores, entre outros, a serem
ligado ao gene opaco-2 no cromossomo 7 de milho, sugeri- considerados (ver Capítulo 33).
ram que o gene o2 pode desempenhar um papel regulatório
Dentro do modelo de estudo proposto neste capítulo,
sobre o gene ask127. Assim como no caso de milho, a mesma
pesquisadores utilizaram os conhecimentos adquiridos com
estratégia foi adotada com outras espécies, porém, todos os
os mutantes bioquímicos para AK e DHDPS e geraram plan-
mutantes demonstraram resultados muito similares àqueles tas transgênicas com a via do ácido aspártico alterada nesses
observados em milho8. mesmos pontos de controle. Plantas transgênicas expressan-
O procedimento mostrou-se eficiente na obtenção de do as enzimas AK e DHDPS, insensíveis à inibição pela lisi-
mutantes, mesmo que os resultados nesse caso em particular na, foram produzidas inicialmente em tabaco, utilizando-se
não correspondessem ao esperado. Nesse sentido, fica evi- de uma estratégia extremamente interessante puramente ba-
dente mais um tipo de contribuição que tal metodologia pode seada no conhecimento da regulação bioquímica e genética
fornecer, ou seja, uma maior compreensão quanto à regula- dessa mesma via em bactérias10. Na realidade, a identificação
ção e à definição de passos metabólicos-chave. Os estudos das vias de síntese desses aminoácidos em microrganismos e
bioquímicos previamente realizados e que permitiram um os processos regulatórios envolvidos foram identificados em

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GENÔMICA VEGETAL — IMPACTO NA SAÚDE HUMANA

A B C

D E F

Fig. 36.4 — Processo de indução e seleção de mutantes bioquímicos utilizando cultura de tecidos. (A) Calos embriogênicos friáveis de milho
mantidos em meio de cultura contendo sais e vitaminas. (B) Calos submetidos a tratamento com o mutagênico azida sódica e mantidos em meio
contendo o agente seletivo, nesse caso os aminoácidos lisina e treonina na concentração de 2 mM. (C) Após tratamento dos calos mutagênico e
manutenção em meio de cultura seletivo por 2-3 meses, as plantas foram transferidas para meio de regeneração, surgindo embriões somáticos
que irão originar plantas. Uma vez regeneradas, crescidas até a maturidade e autofecundadas, os embriões das plantas que originaram a cultura
de células (D) e embriões das plantas regeneradas (E) são excisados das sementes e cultivados em meio de cultura contendo 2 mM de lisina +
treonina por 5 dias. Em (F), pode-se observar esses embriões fora das placas da cultura original (grupo de plantas da direita, apresentando
crescimento inibido), enquanto os embriões do mutante apresentam segregação para o crescimento (grupo de plantas centrais e da direita). A
segregação deve então ser estudada geneticamente para definir que tipo de herança genética condiciona a resistência em questão.

bactérias bem antes do início desses mesmos estudos em plan-


tas10. Além disso, mutantes de Escherichia coli contendo a
enzima AK insensível à lisina já haviam sido obtidos antes
mesmo de essa enzima ter sido isolada, pela primeira vez, de
uma planta8. Assim, já era conhecido, por exemplo, que a
enzima DHDPS de E. coli é cerca de 50 vezes mais resistente
à inibição pela lisina quando comparada a essa enzima de
plantas. Portanto, em vez de se utilizar mutação para DHDPS
de planta, tornando-a insensível à inibição pela lisina, uma
outra possível estratégia seria a transformação de plantas com
o gene da DHDPS de E. coli. Tal procedimento teria resulta-
do equivalente ao da alteração direta na DHDPS da própria
planta e levaria uma planta transformada a necessitar de con-
centrações muito mais altas de lisina para a inibição dessa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
enzima. Dessa forma, aparentemente a enzima seria insensí- Fig. 36.5 — Análise de aminoácidos solúveis por cromatografia em
vel à inibição por esse aminoácido na planta9. camada delgada (TLC) de anteras (que contêm grãos de pólen da
planta) coletadas de plantas mutantes (2-9, 11, 13-16), ou seja, que
Considerando esses pressupostos, um grupo de pesqui-
acumulam o aminoácido treonina nesse tecido e plantas normais (10 e
sadores em Israel realizou uma série de experimentos-mode- 12) que apresentam concentração limitada de treonina. Em 1 e 17, o
lo testando tais possibilidades. Para isso, em um primeiro aminoácido treonina foi colocado como padrão para identificação do
momento, o gene que codifica a enzima AK de E. coli insen- spot referente a esse aminoácido.

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ESTRATÉGIAS PARA MODIFICAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS NUTRICIONAIS DE PLANTAS

A B

C D E F

G H I

Fig. 36.6 — Mutantes aletatórios identificados de processos de seleção para resistência à inibição do crescimento com aminoetilcisteína (análogo
da lisina). Apesar de o processo de seleção ter identificado os mutantes desejados, ou seja, resistentes à aminoetilcisteína, outros foram obtidos,
ou seja, escapes do processo de seleção. Por exemplo, em (A) temos o pólen normal de milho, enquanto em (B) um mutante que só produz grãos
de pólen inférteis. Em (C), o mutante luteus de milho (folha amarelada por deficiência na síntese de clorofila) comparado com plantas normais de
milho (D). Em (E), um mutante selecionado que apresentou macho-esterilidade comparado com plantas normais (férteis) de milho (F). Em (G) e
(H), embriões de milho submetidos a germinação e crescimento por 5 dias em meio nutritivo adicionado de aminoetilcisteína, mostrando segregação
para resistência, ou seja, plantas sensíveis e plantas resistentes à inibição pela aminoetilcisteína. Em (I), variação no tom amarelo das sementes.
Setas indicam sementes mais claras, em comparação com o amarelo mais intenso do milho não-mutado.

sível à inibição pela lisina foi utilizado na transformação de co foram exatamente idênticos àqueles observados para os
tabaco e em outro grupo de plantas transgênicas foi utilizado mutantes bioquímicos com alterações nas enzimas das pró-
o gene que codifica a DHDPS de E. coli, estando a enzima, prias plantas, ou seja, com acúmulo de treonina em todos os
como já era esperado, muitas vezes mais resistente à inibição tecidos da planta transformada com AK e acúmulo de lisina
pela lisina. Finalmente, as plantas transgênicas de tabaco ge- nas folhas e ligeiro acúmulo nas sementes de plantas trans-
radas foram cruzadas, produzindo uma planta de tabaco con- formadas com DHDPS de bactéria36.
tendo tanto a AK como a DHDPS de E. coli, mostrando o A partir do uso da mesma estratégia, outros grupos obti-
acúmulo de treonina, condicionado pela AK, e de lisina con- veram também a superprodução e o acúmulo de lisina em
dicionado pela DHDPS. Os resultados observados para taba- cevada37, canola38 e soja38. Diferentemente de cevada, no caso

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GENÔMICA VEGETAL — IMPACTO NA SAÚDE HUMANA

dos transgênicos de canola e soja o acúmulo de lisina foi ob- naturais de milho, sorgo e cevada, que apresentam caracterís-
servado também em sementes, assim como o de ácido amino ticas típicas do mutante opaco-2 de milho, inclusive as altas
adípico em canola e de sacaropina em soja38, ambos interme- concentrações de lisina9. Esses mutantes, assim como o opa-
diários da via de degradação de lisina10. co-2, apresentam-se como um excelente material de estudo,
A análise desses resultados em conjunto sugere que é desde a análise da composição de aminoácidos solúveis à
possível conseguir a superprodução de lisina pela alteração caracterização das proteínas de reserva e sua composição de
da sensibilidade da DHDPS à lisina9, mas o acúmulo do ami- aminoácidos essenciais, como o padrão modulatório das en-
noácido em sementes de cereais parece depender de outras zimas-chave no metabolismo de lisina na semente.
manipulações, envolvendo também a via de degradação da Paralelamente, existe ainda a possibilidade de manipula-
lisina, pela LOR e/ou SDH, enzimas do catabolismo da lisi- ção de seqüências específicas nos genes que codificam as
na. A favor dessa hipótese aceita atualmente destacam-se cinco proteínas de reserva das sementes dos cereais, ou seja, subs-
aspectos principais: 1) todos os mutantes bioquímicos e plantas tituindo-se nessas proteínas excessos de aminoácidos não es-
transgênicas não apresentaram acúmulo significativo de lisi- senciais por lisina e triptofano, elevando-se a concentração
na nas sementes de cereais, mas apenas em outros tecidos9; 2) desses aminoácidos nas sementes. Contra essa estratégia existe
apenas em cereais as enzimas da degradação, LOR e SDH, o fato de essas proteínas de reserva serem altamente conser-
são específicas da semente20,21, 3) o mutante opaco-2 de mi- vadas e a modificação de aminoácidos poder levar a proble-
lho, que apresenta alta concentração de lisina solúvel e pro- mas estruturais da proteína.
téica nas sementes, apresenta as atividades de LOR e SDH
muitas vezes reduzidas em relação ao tipo normal de milho27,28, Outra estratégia que muito recentemente vem sendo dis-
4) constatou-se acúmulo de intermediários do catabolismo cutida diz respeito à transformação de plantas com biopeptí-
de lisina nas sementes de soja e canola transgênicas super- deos. Esse procedimento envolve a síntese de peptídeos in
produtoras de lisina38, 5) entre os cereais, apesar de a concen- vitro, normalmente curtos, de cerca de até 20 aminoácidos,
tração de lisina ainda ser inferior ao recomendado pela FAO, compostos de uma seqüência de aminoácidos determinada,
o arroz destaca-se por apresentar uma concentração relativa- como, por exemplo, uma seqüência de lisina e triptofano. Os
mente mais alta de lisina na semente, o que pode ser explica- biopeptídeos podem ser então introduzidos e expressos espe-
do pela constatação de atividades mais baixas de LOR e SDH cificamente nas sementes, acumulando durante a formação
nessa planta21. Além disso, feijão22 e soja39 que naturalmente da semente como uma nova proteína de reserva. Além disso,
não apresentam deficiência em lisina, apresentaram as ativi- pode-se alternativamente utilizar pequenos peptídeos natu-
dades de LOR e SDH significativamente mais baixas que no rais que apresentem padrões de aminoácidos de interesse. Essa
endosperma de cereais que são deficientes nesse aminoácido. estratégia baseia-se no princípio de utilizar a semente como
um tecido bioprodutor, como já relatado para plantas de mi-
Esse modelo estabelecido para os cereais com relação à
lho que foram transformadas com os genes da pró-insulina e
sua deficiência em lisina demonstra claramente que a investi-
do hormônio do crescimento humano, sendo ambas proteínas
gação dos parâmetros bioquímicos envolvidos é fundamental
produzidas e acumuladas na semente2.
para dar suporte à elaboração de estratégias de melhoramen-
to genético, baseadas principalmente no conhecimento dos As informações apresentadas e discutidas neste capítulo
passos bioquímicos regulatórios e sua possível manipulação tentaram ilustrar a contribuição e a importância desses mate-
genética. riais geneticamente modificados no estudo do metabolismo
vegetal e no uso aplicado, como, por exemplo, na produção
de plantas de qualidade nutritiva superior e mais indicadas
CONSIDERAÇÕES FINAIS para o consumo animal e humano. Entretanto, a exploração
dessas técnicas, particularmente de transformação de plan-
Como mencionado anteriormente, a utilização de plan-
tas, ainda parece estar longe do final, e certamente trará ou-
tas transgênicas vem tomando uma dimensão enorme, com
tras contribuições significativas no futuro próximo.
resultados rápidos, interessantes, e que já são realidade, tanto
do ponto de vista aplicado na produção de um material de Como mencionado no início deste capítulo, o homem
interesse econômico como no entendimento dos processos procura sempre a melhoria de sua qualidade de vida, e para
celulares. No caso dos cereais e a deficiência em lisina, a isso sua atenção deve estar voltada para o conhecimento e a
utilização de transformação de plantas é ainda mais ampla do melhor compreensão das atividades de pesquisa relacionadas
que a introdução de um gene alterado para enzimas da via aos tipos de manipulações genéticas, a liberação de organis-
metabólica do ácido aspártico. Um estudo bastante amplo vem mos geneticamente modificados para o meio ambiente e os
sendo realizado visando à caracterização de outros mutantes aspectos econômicos, ecológicos e evolucionistas.

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ESTRATÉGIAS PARA MODIFICAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS NUTRICIONAIS DE PLANTAS

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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GENÔMICA VEGETAL — IMPACTO NA SAÚDE HUMANA

SÚMULA CURRICULAR

RICARDO ANTUNES DE AZEVEDO


Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo,
Av. Pádua Dias, 11 — CEP 13418-900 — Piracicaba-SP
Tel: (19) 3429-4475 — Fax (19) 3433-6706 — E-mail: raazeved@esalq.usp.br

Títulos Universitários • Ministério da Educação: Assessoria científica para avaliação


• Biólogo: Formado em Biologia pela PUC Campinas — Cam- das condições de ensino de cursos de Biologia, desde 2002.
pinas em 1983. • Revistas Científicas: Revisor de várias revistas científicas na-
• Mestrado: Genética Vegetal, Unicamp, 1988. cionais e internacionais.
• Doutorado: Plant Biochemistry, Lancaster University, Ingla-
terra, 1992. Sociedades Científicas
• Pós-Doutorado: Plant Biochemistry, Lancaster University, In- • Sociedade Brasileira de Genética, de 1983-1990.
glaterra, 1997. • Sociedade Brasileira de Fisiologia Vegetal, desde 2001.
• Livre-Docência: Biologia Celular, Departamento de Genéti-
ca, ESALQ-USP, 2000. Resumo da Produção Acadêmica e Científica
Publicações
Funções Atuais Periódicos internacionais, 30
Periódicos nacionais, 4
• Professor Associado do Departamento de Genética, ESALQ-
Capítulos de livros internacionais, 4
USP, desde 1993.
Capítulos de livros nacionais, 1
• Research Fellow da Lancaster University, Inglaterra, desde
Total de publicações internacionais: 34
2001.
Total geral de publicações: 39
• Secretário da Sociedade Brasileira de Fisiologia Vegetal, des-
de 2001 e 2003, respectivamente. Congressos
• Editor Associado e Assistente da Brazilian Journal of Plant Trabalhos apresentados em congressos internacionais, 55
Physiology, desde 2001. Trabalhos apresentados em congressos nacionais, 57
• Professor orientador nos cursos de pós-graduação em Genéti- Conferencista/presidente de mesa congressos internacionais, 3
ca e Melhoramento de Plantas da ESALQ-USP (desde 1994), Conferencista/presidente de mesa congressos nacionais, 2
Ecologia de Agroecossistemas do CENA-ESALQ-USP (des-
de 2000) e Genética e Biologia Molecular da Unicamp (desde Formação e Seleção de Pessoal
1994). Teses defendidas/mestrado, 8
• Pesquisador 2A do CNPq desde 2003. Teses defendidas/doutorado, 3
Teses em andamento, 13
Assessorias Orientação de estagiários/IC, 15
• Entidades Internacionais: Consultor Científico da National Sci- Recepção de pós-doutorandos, 4
ence Foundation, EUA. Participação em bancas examinadoras, 40
• Entidades Científicas Nacionais: Consultor Científico do
CNPq e Fapesp.

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