Bioquímica I

2010-2011

Caracterização de Aminoácidos
e Proteínas

Alunas:

Andreia Sousa
n.º 40261
Alexandra Salvado
n.º 40267

15 de Março de 2011

1º ano-2º semestre

2010-2011
 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

1. Apresentação, Tratamento e Discussão de Resultados

1.1.Reacções coradas de aminoácidos e proteínas

Quadro 1. Observações e resultados dos testes da ninidrina e do biureto.

Observações
Teste Solução Resultado
Início Após aquecimento

Água destilada Amarelo muito claro Amarelo muito claro Positivo

Glicina Incolor Púrpura intenso Positivo
Ninidrina
Albumina Amarelo muito claro Púrpura intenso Positivo
Clara do ovo Amarelo muito claro Púrpura menos intenso Positivo
Água destilada Azul muito claro Negativo
Glicina Azul muito claro Negativo
Biureto
Albumina Violeta Positivo
Clara do ovo Violeta Positivo

Figura 1 – Observações iniciais das cores

antes dos testes.

Figura 2 – Observações das cores do teste do

biureto.

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

Figura 3 – Observações das cores do teste da ninidrina após aquecimento

1.1.1. Teste de ninidrina

A ninidrina é um produto químico usado para a

detecção de aminoácidos pois é um poderoso agente
oxidante que reage com α-aminoácidos, entre pH 4 e 8.
Os α-aminoácidos possuem um átomo de carbono
central (α) onde estão ligados covalentemente um grupo
amina primário (−NH2), um grupo carboxílico (−COOH),
Figura 4 – Estrutura geral
de um α-aminoácido. um átomo de hidrogénio e uma cadeia lateral (R)
diferente para cada aminoácido.

A reacção dos aminoácidos com a ninidrina origina um composto de

cor púrpura, no geral, e amarelo para a prolina, não apresentando sempre a
mesma intensidade de coloração. Para além da formação de um composto
corado, devido à descarboxilação dos α-aminoácidos, o teste com a ninidrina
produz também CO2, água e aldeídos, como se pode ver na reacção que a
seguir se segue.

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

Figura 5 – Reacção dos α-aminoácidos com a ninidrina e formação do composto corado.

A reacção da ninidrina foi positiva com todas as soluções testadas.

A glicina é um dos aminoácidos codificados pelo código genético, como

tal era de esperar que reagisse com a ninidrina. Inicialmente não se observou
claramente uma reacção deste aminoácido com a ninidrina, mas assim que o
tubo de ensaio foi colocado em água a ferver a reacção foi instantânea pelo
que se comprovou que, de facto, a ninidrina estava na presença de um
aminoácido – a glicina, que em contacto com a ninidrina, sofre uma grande
oxidação e origina um composto de cor púrpura, no entanto isso não se
observou no momento instantâneo da sua junção, apenas no momento em que
esteve exposta a altas temperaturas, o que provocou um aumento da
velocidade da vibração molecular que “ajudou” a ninidrina a reagir com a
glicina.

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

No caso da albumina, que é uma proteína hidrossolúvel do tipo globular

cuja função é armazenar nutrientes, não reagiu instantaneamente com a
ninidrina e por conseguinte não se formou o composto corado. Isto aconteceu
porque, sendo a albumina uma proteína, os aminoácidos que a constituem
estão ligados por ligações peptídicas e não no estado livre – motivo pelo qual
não reagem com a ninidrina visto que esta apenas detecta os aminoácidos
livres. No entanto, depois de expor a albumina a uma temperatura elevada (≈
100 °C), esta reagiu com a ninidrina uma vez que as ligações peptídicas foram
quebradas, pois houve um aumento da vibração das partículas (consequência
do aumento da temperatura) alterando a conformação desta proteína e
expondo os aminoácidos livres á ninidrina – daí a observação da cor púrpura
da solução após o aquecimento durante 10 minutos a 100 °C,
aproximadamente.

Em relação à clara do ovo, esta é composta por proteínas,

nomeadamente a albumina e por outras substâncias que dificultam a reacção
com a ninidrina, pelo que inicialmente também não se observou a formação do
composto corado. Novamente, depois do aquecimento a uma temperatura
elevada (≈ 100 °C), a ninidrina reagiu com os aminoácidos da clara do ovo,
pela mesma razão explicitada no parágrafo anterior. No entanto, a cor do
composto foi a menos intensa uma vez que, sendo a clara do ovo um material
biológico possui mais substâncias na sua composição para além de proteínas.
Assim, a quebra dessas ligações peptídicas foram dificultadas pela presença
de outras substâncias, o que contribuiu também para um menor número de
aminoácidos livres a reagir com a ninidrina, resultando num número inferior de
compostos corados, daí a cor menos intensa desta solução comparada com as
da glicina e da albumina.

Em conclusão, a solução da glicina, depois de aquecida, foi a mais

corada uma vez que este aminoácido é livre e reagiu em maior quantidade com
a ninidrina. A solução da albumina apresentou uma cor intensa, mas menos

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

que a da glicina, porque como a albumina é uma proteína, só os aminoácidos

libertos pela quebra das ligações peptídicas que os uniam é que vão reagir com
a ninidrina.

1.1.2. Teste do biureto

No que se refere à reacção do biureto este detecta a presença de

ligações peptídicas. Os compostos com duas ou mais ligações peptídicas
tomam uma coloração violeta quando tratadas com uma solução diluída de
sulfato de cobre em meio alcalino, devido ao complexo entre cada ião de cobre
e quatro átomos de azoto (dois de cada ligação). A intensidade da cor varia
com a concentração de proteínas. A reacção que ocorre é a seguinte:

Cu 2+
2
OH -

Biureto

Complexo de biureto

Figura 6 – Reacção do biureto.

Neste teste, o tubo de ensaio com água destilada foi utilizado como
tubo controlo pois é sabido que a água não contém proteínas. Assim, este tubo,
no qual não ocorre reacção, serve de referência para os restantes. Os tubos
cujos comportamentos forem semelhantes ao do biureto com a água, pode-se
dizer que têm um resultado final negativo – não ocorre reacção. Por outro lado,
os tubos cujos comportamentos se mostrem diferentes ao da água destilada

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

quando se adiciona biureto, dizem-se ter um resultado positivo – ocorre

reacção e é de esperar que apresentem uma cor violeta.

Uma vez que o teste com o biureto apenas dá positivo (apresentação

de uma cor violeta) quando existem ligações peptídicas no meio, podíamos
logo deduzir que o teste à glicina seria negativo uma vez que é um aminoácido.
E assim se verificou – ao adicionar biureto à glicina não se observou a
formação de um complexo de cor violeta.

Como já foi referido, a albumina é uma proteína cujos aminoácidos

formam uma cadeia e estão ligados por ligações peptídicas. Assim, o teste à
albumina resultou positivo – foi possível também observar a formação de um
composto de cor violeta.

Igualmente positivo, foi o teste à clara de ovo porque, para além de

outras substâncias, contém proteínas (albumina, inclusive) que apresentam
ligações peptídicas – também se observou a cor violeta, característica da
presença de ligações peptídicas.

1.2. Agentes desnaturantes de proteínas

1.2.1. Fluxograma explicativo do processo de isolamento das

ficobiliproteínas.

Procedimento

Cápsula de Células Spirulina

Registar a
massa
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(sem cápsula)
 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

Transferir para um
almofariz

Triturar bem a mistura

durante 10 minutos

(de preferência contra os

lados)
Dividir a mistura por 4
tubos de ensaio

Figura 7 – Divisão da Adicionar 7mL de tampão de

mistura opor 4 tubos
de ensaio. fosfatos (pH 7.0) 100mM a
cada tubo de ensaio

Centrifugar a 2000 rpm

Suspender a mistura da
durante 4min, à
solução tampão com
temperatura ambiente
uma vareta

Recolher o filtrado (a Remover o sobrenadante

solução deve ser límpida e (não perturbar o
apresentar uma cor azul precipitado)
petróleo)

Figura 8 – Observação
da cor azul petróleo da
solução proteica
preparada.

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

1.2.2. Testes qualitativos de desnaturação das ficobiliproteínas

por diversos agentes assim como o efeito da temperatura e agitação
mecânica na estrutura das proteínas.

Quadro 2 – Reacção da solução de proteínas com vários agentes desnaturantes.

Observações
Ensaio Agente Desnaturante Resultado
Cor Transparência
Tampão de Fosfatos (pH 7.0)
1 Azul claro Translúcido Negativo
100nM
2 NaCl 100mM Azul claro Translúcido Negativo
3 Água destilada Azul claro Translúcido Negativo
4 Acetona Azul muito claro Opaco Positivo
5 Etanol Azul muito claro Opaco Positivo
Ureia 8M em tampão de fosfatos
6 Incolor Translúcido Positivo
(pH 7.0) 100 mM
Incolor (formação
7 SDS 5% (v/v) Translúcido Positivo
de espuma)
8 Ácido tricloroacético a 10% (m/v) Azul claro Opaco Positivo
9 HCl 1M Azul claro Opaco Positivo
10 NaOH 1M Verde claro Translúcido Positivo
11 T=0 °C Incolor Translúcido Positivo
12 T= 100 °C Azul claro Translúcido Negativo
13 Agitação mecânica Azul claro Translúcido Negativo

Figura 9 – Observação
das cores da solução
proteica por adição de
diversos agentes
desnaturantes.

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

Figura 10 – Observação das cores da solução proteica a uma temperatura de 0 °C, 100 °C e por
agitação mecânica, respectivamente.

Nestes ensaios, são considerados resultados negativos aqueles que

não desnaturam as proteínas e resultados positivos os que, pelo contrário,
provocam modificações na sua conformação e as desnaturam.

O tubo de ensaio de controlo é o de tampão de fosfatos (pH 7,0) 1M,

uma vez que já tinha sido utilizado anteriormente quando se adicionou
quantidades do mesmo aos 4 tubos de ensaio contendo as células de Spirulina
(não faria sentido preparar uma solução proteica adicionando tampão de
fosfatos se esta pudesse desnaturar as células). Por isso, quando se adicionou
novamente tampão de fosfatos, não se verificou nenhum tipo de alteração na
solução proteica. Tal também se comprova uma vez que esta solução tem
iguais concentrações de ácido e base – pH neutro (solução estabilizada) – e
onde se encontram moléculas polares que solubilizam as proteínas, não
alterando a sua conformação. O resultado final pode-se dizer negativo uma vez
que não ocorreu desnaturação das proteínas. Comparando os outros ensaios
com este, que é o tubo de controlo, os resultados finais negativos serão
aqueles em que não ocorrerá desnaturação das proteínas e os positivos serão
aqueles em que ocorrerá.

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

A água destilada, conhecida como uma substância pura, é um

composto isento de qualquer substância e por isso não provoca nenhuma
alteração nas proteínas quando entra em contacto com elas, pelo que
apresenta um resultado negativo.

A presença de um sal (NaCl) em solução resulta na estabilização dos

grupos iónicos das proteínas, o que aumenta a sua solubilidade - NaCl é um
composto polar. Assim, podemos afirmar que a presença do NaCl em solução
não provoca nenhuma alteração na conformação da proteína, não a
desnaturando. Apresenta, portanto, um resultado negativo.

A acetona e o etanol são solventes orgânicos miscíveis com a água e

como as proteínas também são solúveis em várias soluções aquosas, pois
apresentam grupos polares hidrofílicos (que têm afinidade com os grupos
polares das soluções), vão reagir com o etanol e com a acetona e estes vão
provocar a ruptura das pontes de hidrogénio e das ligações hidrofóbicas nas
proteínas, fazendo com que ocorra a sua desnaturação e com que se tornem
insolúveis, verificando-se então um precipitado. Este resultado final diz-se
positivo pois ocorreu a desnaturação das proteínas.

A ureia é uma molécula tóxica também polar e por isso entra em

contacto com os grupos hidrofílicos das proteínas, alterando a sua
conformação e inactivando-as. Neste caso ocorre a desnaturação das
proteínas, mas não ocorre precipitação das mesmas. O resultado diz-se, então,
positivo.

O SDS é um detergente aniónico que ao entrar em contacto com as

proteínas, lhes confere uma forte carga negativa. Este detergente rompe,
assim, quase todas as interacções não covalentes existentes numa proteína,
destruindo a sua estrutura nativa, ou seja, desnaturando-a. O resultado final é,
então, positivo.

Ao adicionar os ácidos tricloroacético e clorídrico ou o hidróxido de

sódio, as cargas das proteínas foram modificadas e por conseguinte também o

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

seu pH. Meios mais básicos ou mais ácidos alteram o estado de ionização das
cadeias laterais dos aminoácidos e ocorre o rompimento de atracções
eléctricas que ajudavam a manter a configuração espacial da proteína (ligações
de hidrogénio e ligações iónicas). Assim sendo, como o pH da proteína foi
alterado, assim como a sua conformação ela deixou de estar no seu estado
nativo, pelo que o resultado final foi positivo.

Com o aumento da temperatura, aumentou-se a velocidade da

vibração molecular o que levou a uma quebra das ligações fracas – de
hidrogénio – que leva também a uma alteração na conformação da proteína.
Mais uma vez a proteína tornou-se inactiva (desnaturada) pelo que o resultado
se considera também positivo.

Com o arrefecimento da temperatura não se observaram modificações

na solução proteica uma vez que apenas se deu a inactivação das proteínas e
não a sua desnaturação, pelo que se se repusesse a temperatura a que elas se
encontravam inicialmente, estariam de novo activas. Assim sendo, este
resultado diz-se negativo.

A agitação mecânica também não provocou a alteração na estrutura

das proteínas, pois as ligações fortes não se quebram assim tão facilmente. O
resultado foi também negativo.

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

2. Bibliografia
 Voet, D. e Voet, J.G. (1995) Biochemistry, 2ª ed., John Wiley & Sons: New
York, pp. 56-62 & 105-119.
 L. Nelson, David e M. Cox, Miaches, Lenhinger, Princípios de Bioquímica, 3ª
ed.
 Quintas, A.,Halpern, M.J., Freire, A.P. Eds., “Bioquímica – Organização
Molecular da Vida”, Lidel, Lisboa, 2008

3. Questionário

3.1. Defina grupo prostético, apoproteína e holoproteína.

Concretiza para as ficobiliproteínas.

As proteínas são um dos constituintes básicos dos organismos, sendo

uma das classes de moléculas mais estudadas em Bioquímica. São polímeros
(compostos orgânicos) de alto peso molecular não ramificados de aminoácidos
ligados entre si por ligações peptídicas, podendo ser constituídas por um ou
mais de tais polímeros. Representam cerca de 50 a 80% do peso seco da
célula sendo, portanto, o composto orgânico mais abundante da matéria viva.

Quanto à composição das suas moléculas, as proteínas podem ser

classificadas em simples e conjugadas. As proteínas simples, ou
homoproteínas, são formadas exclusivamente por aminoácidos. As proteínas
conjugadas, ou heteroproteínas, são constituídas por aminoácidos mais outro
componente não-proteico, denominado grupo prostético, essencial para a
actividade biológica dessas proteínas. Proteínas que são desprovidas deste
grupo prostético denominam-se apoproteína – partes proteicas que compõem
uma proteína conjugada.

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

Assim, uma proteína diz-se completa, ou holoproteína, quando é

constituída pela sua cadeia polipeptídica (união de aminoácidos) juntamente
com o seu grupo prostético. Então, sendo a ficocianina e a aloficocianina duas
ficobiliproteínas das cianobactérias da Spirulina que contêm um grupo
cromógrafo (ficocianobilina) ligado covalentemente à proteína – grupo
prostético –, podemos classificar as ficobiliproteínas como holoproteínas.

3.2. Quais são os diferentes níveis de estrutura possíveis

apresentados por uma proteína e como são afectados durante o seu
processo de desnaturação?

Existe um nível hierárquico de organização estrutural das proteínas –

podem ser primárias, secundárias, terciárias ou quaternárias.

A sequência dos aminoácidos nos polipéptidos que constituem uma

molécula proteica é chamada estrutura primária – é a sequência linear de
aminoácidos. Essa sequência é muito importante para a função da proteína.
Em geral, a substituição de um único aminoácido basta para prejudicar a
actividade da proteína, com sérias consequências para o organismo.

No entanto, a cadeia polipeptídica é flexível podendo enrolar-se sobre si

mesma, assumindo conformações espaciais diferentes. As conformações mais
comuns são as hélice-α - nesta estrutura o esqueleto polipeptídico está
estreitamente enrolado ao longo do maior eixo da molécula e os grupos R dos
resíduos de aminoácidos projectam-se para fora do esqueleto helicoidal. A sua
estabilização dá-se pela presença de múltiplas ligações de hidrogénio no
interior da hélice – e a folha-β – é uma estrutura também mantida por pontes de
hidrogénio entre as unidades peptídicas. No entanto, neste caso, as ligações
são estabelecidas entre cadeias polipeptídicas diferentes, distendidas e
paralelas, ou entre segmentos distantes e distendidos de uma mesma cadeia.
As pontes de hidrogénio são perpendiculares ao eixo das cadeias, e os grupos

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

R dos aminoácidos projectam-se para cima e para baixo do plano –. Este nível
de organização diz-se secundário e, para além das ligações peptídicas,
também envolve ligações por pontes de hidrogénio.

A estrutura terciária de proteínas resulta do enrolamento da hélice-α ou

da folha-β, sendo estabilizada por pontes de hidrogênio e pontes dissulfeto.
Esta estrutura confere a actividade biológica às proteínas e descreve o
dobramento final de uma cadeia, por interacções de regiões com estrutura
regular ou de regiões sem estrutura definida, podendo haver interacções de
segmentos distantes de estrutura primária, por ligações não covalentes.
Enquanto a estrutura secundária é determinada pelo relacionamento estrutural
de curta distância, a terciária é caracterizada pelas interacções de longa
distância entre aminoácidos, denominadas interacções hidrofóbicas, pelas
interacções electrostáticas, pontes de hidrogênio e de sulfeto. Todas têm
sequências de aminoácidos diferentes, reflectindo estruturas e funções
diferentes.

Para finalizar, as proteínas podem também adquirir um nível de estrutura

quaternária. Esse nível de estrutura é adquirido quando as proteínas são
constituídas por duas ou mais cadeias polipeptídicas. Esta transformação das
proteínas em estruturas tridimensionais é a designada estrutura quaternária,
que são estabilizadas pelas mesmas interacções da estrutura terciária. A
junção de várias cadeias polipeptídicas pode produzir diferentes funções para
os compostos.

Contudo, as proteínas podem perder a sua estrutura se forem expostas

a condições químicas adversas, tais como: pH’s extremos, ambientes
hidrofóbicos, altas concentrações de sais ou altas temperaturas. Este processo
é denominado desnaturação. Uma proteína desnaturada não tem uma
estrutura definida e tende a agregar-se em massas insolúveis, especialmente
se se encontrar numa concentração relativamente elevada. A desnaturação é
um processo, geralmente irreversível, que consiste na quebra das estruturas
secundária e terciária de uma proteína. Nestas estruturas, quando uma

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

proteína é exposta a um ambiente diferente daquele onde ela se desenvolveu,

há a quebra das interacções fracas aí existentes, havendo uma alteração na
distribuição espacial do polipéptidos e por conseguinte, uma alteração na sua
composição.

3.3. Explique detalhadamente o mecanismo de desnaturação de

uma proteína por adição de um solvente orgânico (por ex., etanol). Qual
a dependência que este processo deverá apresentar com a temperatura
do meio?

A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que

em água. Isso acontece porque a capacidade de interacção com as partículas
do soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade
de interacção do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica.

Com a adição de solventes orgânicos, como o etanol, às soluções

aquosas de proteínas pode ocorrer a precipitação das mesmas. Isto pode ser
explicado pelo facto destes solventes apresentarem uma constante dielétrica
inferior à da água.

Numa solução contendo exclusivamente água e moléculas proteicas

existe uma interacção água-proteína e uma interacção proteína-proteína. Neste
caso, podemos afirmar com certeza que o primeiro tipo de interacção
prevalecerá sobre o segundo porque a água possui uma grande capacidade de
separação das partículas do soluto (constante dielétrica elevada).

Para os solventes orgânicos a situação é um pouco diferente. Como este

tipo de solvente apresenta valor de constante dielétrica bem inferior à da água,
a interacção proteína-proteína "vence" o poder de solvatação da água
(interacção água-proteína), pelo que a proteína precipita.

A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura.

Os solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

úteis na separação de misturas de proteínas. Quando a temperatura é mais

elevada, este tipo de solventes pode levar à desnaturação das proteínas por
rompimento das pontes de hidrogénio, interacções fracas, por aumento da
vibração molecular do meio.

3.4. Porque é que, no caso das proteínas globulares solúveis, a

sua desnaturação é, em geral, acompanhada por precipitação? Porque
não acontece este fenómeno quando o agente desnaturante usado é um
detergente aniónico, como por exemplo o SDS?

A maioria das proteínas é solúvel em água, facto que poderá ser

atribuído às interacções que se estabelecem entre as moléculas de água e os
grupos polares e/ou ionizados das moléculas proteicas.

A precipitação das proteínas ocorre quando existe um agente que altera

a constante dieléctrica ou força iónica de uma solução aquosa, influenciando a
solubilidade das proteínas. A precipitação dá-se quando as forças de atracção
proteína-água são excedidas pelas forças de coesão entre as diferentes
moléculas proteicas.

Quando o solvente considerado é um detergente aniónico, por exemplo,

o SDS que tem uma grande cadeia polar e uma cadeia hidrofóbica, não se dá a
precipitação das proteínas uma vez que, apesar da proteína desnaturar, as
forças de coesão entre as moléculas proteicas não excedem as forças de
atracção entre o novo solvente e a proteína dado que este é aniónico e não
influencia a mobilidade de cargas, apenas por interacções hidrofóbicas as
converte em estruturas com uma forte carga negativa e privilegia a repulsão em
vez da atracção das moléculas.

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 Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

3.5. O processo inverso também pode ocorrer, isto é, pode

realizar-se uma precipitação selectiva de proteínas sem que acorra a sua
desnaturação. Como se designa e realiza esta técnica?

A precipitação induzida por um sal é o tipo de precipitação selectiva mais

comum para as proteínas sem que ocorra a sua desnaturação.

No entanto, e de entre outros factores, a solubilidade de uma proteína

depende da concentração de sal presente na solução.

Quando as concentrações do sal são baixas, a sua presença vai estabilizar os

vários grupos electricamente carregados da proteína, atraindo deste modo a
proteína para a solução e aumentando a solubilidade da proteína. Este
processo é conhecido como salting-in. Se, por outro lado, se aumentar a
concentração do sal na solução, é atingido o ponto máximo de solubilidade da
proteína. Se se aumentar ainda mais a sua concentração, vão existir cada vez
menos moléculas de água disponíveis para solubilizar as proteínas. Quando já
não existem moléculas de água suficientes para interagir com as proteínas,
estas começam a precipitar. A este processo de precipitação de proteínas em
presença de excesso de sal dá-se o nome de salting-out. Esta precipitação vai
ser selectiva porque as proteínas têm diferentes graus de solubilidade.

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