Diagnóstico de Patogénicos em Alimentos

Universidade do Minho
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica
Diagnóstico de Patogénicos em Alimentos

Unidade Curricular: Biotecnologia Alimentar
Docentes: José Teixeira, Carla Oliveira, Lígia Rodrigues
Data de entrega: 10-10-2010
Autores:
Duarte Filipe da Silva Martins 52497
Paulo Jorge Teixeira Freitas 52516
Sofia Alexandra Araújo Pereira 52530
Biotecnologia Alimentar
Resumo
A segurança alimentar é uma meta global de saúde podendo as doenças causadas por alimentos
levar a uma grave crise ao nível da saúde mundial. O diagnóstico de patogénicos nos alimentos é uma das
soluções para a prevenção e para o reconhecimento dos problemas relacionados com a segurança e saúde
alimentares. Deste modo, o objectivo deste trabalho passa por fazer, não apenas uma revisão global dos
métodos de diagnóstico de patogénicos em alimentos, mas também descrever métodos convencionais e
rápidos, desenvolvimentos recentes, identificação e quantificação.
Métodos convencionais de diagnóstico de patogénicos, como métodos de contagem de colónias,
podem demorar várias horas ou até mesmo alguns dias para ser obtida uma resposta, o que é obviamente
insuficiente. O avanço da biotecnologia é importante para um desenvolvimento contínuo de métodos que
permitam o diagnóstico de patogénicos de uma forma mais rápida e confiável. Desenvolvimentos no campo
da imunologia, da biologia molecular, da automação e das tecnologias de computação continuam a ter um
efeito positivo no desenvolvimento de métodos tradicionais da microbiologia alimentar quanto à rapidez, à
sensibilidade e à especificidade. Métodos modernos são baseados em técnicas da biologia molecular, como
o PCR, em ensaios imunológicos, como ELISA, imunofluorescência e separação imunomagnética, em
técnicas físicas e bioquímicas com a aplicação de biosensores, como a bioluminescência e biosensores
analíticos utilizando enzimas, anticorpos e ácidos nucléicos.
São necessários estudos contínuos relativamente a técnicas de separação de microrganismos das
matrizes alimentares e concentração destes antes da sua detecção no melhoramento da segurança
alimentar por ensaios imunológicos e ensaios baseados em ácidos nucléicos. A possibilidade de
combinações de diferentes métodos deve ser ainda explorada. Porém, desenvolvimentos em protocolos de
ensaios imunológicos e PCR devem resultar num diagnóstico quantitativo de microrganismos e
simultaneamente, de mais do que um patogénico ou toxina.
Palavras-chave: patogénicos, alimentos, métodos rápidos, métodos tradicionais, ensaios imunológicos,

biosensores, ELISA.

Índice
1. Introdução.................................................................................................................................................................................. 1
2. Patogénicos nos alimentos, desafios e riscos associados .............................................................................................................. 3
2.1 Desafios ............................................................................................................................................................................... 5
3. Métodos de detecção de patogénicos ......................................................................................................................................... 5
3.1 Métodos Tradicionais ........................................................................................................................................................... 6
3.1.1 Método de contagem de células viáveis ........................................................................................................................ 6
3.2. Métodos rápidos ................................................................................................................................................................. 6
3.2.1. Técnicas biofísicas........................................................................................................................................................ 7
3.2.1.1 Contagem de células fluorescentes por microscopia ................................................................................................... 7
3.2.2. Técnicas bioquímicas ................................................................................................................................................... 8
3.2.2.1 ATP Bioluminescência............................................................................................................................................ 8
3.2.3. Ensaios imunológicos ................................................................................................................................................... 8
3.2.3.1. Ensaio de ELISA/EIA .............................................................................................................................................. 9
3.2.3.2. Ensaios de aglutinação com látex (LA) ................................................................................................................. 10
3.2.3.3. Ensaios de imunodifusão .................................................................................................................................... 10
3.2.3.4.Ensaios de imunofluorescência ............................................................................................................................ 11
3.2.3.5 Ensaio de separação imunomagnética (IMS) ........................................................................................................ 11
3.2.4 Ensaios de hibridação de ácidos nucleicos ................................................................................................................... 12
3.2.4.1 Polymerase chain reaction (PCR).......................................................................................................................... 13
3.2.5. Biosensores ............................................................................................................................................................... 13
3.2.5.1 Biorreceptors ...................................................................................................................................................... 14
3.2.5.1.1 Anticorpos ................................................................................................................................................... 14
3.2.5.1.2 Enzimas ....................................................................................................................................................... 14
3.2.5.1.3 Ácidos Nucleicos .......................................................................................................................................... 15
3.2.5.1 Transdutores....................................................................................................................................................... 15
3.2.5.1.1 Óptico ......................................................................................................................................................... 15
3.2.5.1.2. Electroquímico............................................................................................................................................ 15
3.2.5.1.3.Sensibilidade à massa .................................................................................................................................. 15
4. Mercado dos Métodos de Diagnósticos em Alimentos ............................................................................................................... 16
5. O Futuro das técnicas actuais .................................................................................................................................................... 17
5.1 Contagem das células viáveis .............................................................................................................................................. 17
5.2 Monitorização da Higiene ................................................................................................................................................... 18
5.3 Ensaios imunológicos ......................................................................................................................................................... 18
5.4 Biossensores e microarrays ................................................................................................................................................ 18
5.5 Ensaios baseados em ácidos nucleicos ................................................................................................................................ 18
6. Conclusão................................................................................................................................................................................. 18
7. Bibliografia ............................................................................................................................................................................... 19

1. Introdução
De acordo com a Codex Alimentarius Commission sobre a higiene dos alimentos, a segurança
alimentar é definida como a garantia de que os alimentos não causam danos ao consumidor, ao nível sa
saúde, quando preparados e/ou consumidos, de acordo com a sua intenção de uso. Esta definição é, no
entanto, dificultada pela ressalva de que não pode ser obtido um nivel absoluto de segurança alimentar.
Por conseguinte, foi reconhecido que, ao invés, um nível de risco aceitável deve ser definido (von
Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).
Em todo o mundo, a produção, a preparação e distribuição de alimentos têm se tornado cada vez
mais mais complexas, e as matérias-primas são frequentemente encontradas globalmente. As alterações
das técnicas de processamento de alimentos e o surgimento de novos agentes patogénicos mudaram a
epidemologia de doenças de origem alimentar. Nas últimas décadas, as principais doenças humanas
provocadas por agentes patogénicos encontram-se relacionadas com o consumo de carne mal processada,
(salsichas, salame fatiado), com produtos lácteos (queijos feitos com leite não pasteurizado, manteiga) ou
frutas e verduras (Bhunia, 2007; Altekruse et al., 2006; CDC, 2006; Doyle and Erickson, 2006; Lynch et al.,
2006).
Os agentes patogénicos são ubíquos sendo potencialmente perigosos nos alimentos, no solo e na
água, podendo conduzir por vezes, a mortes indesejadas. A presença de patogénicos nos produtos para
consumo é uma séria preocupação devido ao facto de muitos deles não receberem nenhum tratamento
antes do seu consumo. Os alimentos de origem animal são os principais locais de proliferação de muitos
dos agentes patogénicos conhecidos (Biswas et al., 2008). A aplicação de dejectos não tratados nos
terrenos agrícolas, pode contaminar o solo ou a água e, eventualmente, transmitir microrganismos
indesejados para as frutas e legumes (Brandl, 2006; Solomon et al., 2002). Os mariscos são outra fonte de
potenciais patogénicos, como o Vibrio, Listeria, Yersinia, Salmonella, Shigella, Clostridium, Campylobacter e
Hepatite A (Carter, 2005; Feldhusen, 2000). As doses infecciosas de muitos destes patogénicos são muito
baixas (1 a 10 células bacterianas).
Os microrganismos sofrem continuamente mudanças devido à sua capacidade intrínseca de evoluir e
se adaptarem às diferentes formas de stress a que são sujeitos. Novas tecnologias de produção primária e
práticas de fabrico de alimentos são constantemente desenvolvidas. A obtenção da segurança alimentar
deve ser vista como um processo contínuo, que é afectado por factores ambientais, sócio económicos,
políticos e factores culturais. Os consumidores estão cada vez mais conscientes dos problemas de
segurança alimentar, como resultado do uso de anúncios publicitários pelos meios de comunicação acerca
das eventuais doenças de origem alimentar (Griffiths, 1993; Chang, 2000; Park, 2001).
Critérios de obtenção de um produto final e diagnósticos microbiologicos são tradicionalmente
utilizados para avaliar a segurança de um produto alimentar e para definir critérios de rejeição ou aceitação
de um lote de alimentos. No entanto, esta abordagem possui algumas limitaçoes especialmente para
diagnóstico de patogénios que occorem em números reduzidos e à distribuição não homogénea destes. O
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 1

desenvolvimento da biotecnologia tem alterado em muito, os métodos de análise de alimentos e existem
inúmeras empresas que desenvolvem activamente ensaios que são específicos, mais rápidos e muitas vezes
mais sensíveis do que os métodos tradicionais. (von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002; De Boer e
Beumer, 1999). Um método rápido pode ser um ensaio que dá resultados em tempo real ou
instantaneamente, mas por outro lado, pode ser uma simples modificação de um procedimento que reduz
o tempo de ensaio. O grau de eficiência de um método rápido é determinado pelo seu alcance, tipo de
diagnóstico necessário, volume das amostras a serem testadas, disponibilidade de pessoal habilitado e
pelas práticas de fabrico (Vasavada, 1993).
Para garantir a segurança de produtos alimentares é importante a implementação de programas de
gestão da segurança alimentar como o HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points) como parte de
Boas Práticas de Fabricação (BPF) e medidas sanitárias no controlo da qualidade dos produtos. A gestão da
segurança alimentar utiliza ferramentas de informação científica de modo a serem identificados pontos
críticos de contaminação na cadeia alimentar e nos processos de produção. No entanto, a quantidade de
dados fiáveis é muitas vezes limitada e portanto, a sua obtenção é umas das prioridades para futuras
estratégias de segurança alimentar. A análise de alimentos com vista à detecção de patogénicos é uma
prática comum e de extrema importância para garantir a segurança e a qualidade alimentares (Doyle,
2001).

2. Patogénicos nos alimentos, desafios e riscos associados
Através da análise da media e da observação da literatura científica, hoje reconhece-se que as doenças transmitidas por alimentos são um problema
mundial, e por isso, não são restritas a um nenhum país. Dessa forma, os alimentos contaminados por patogénicos são de grande preocupação para saúde pública
mundial, visto que, os custos, em termos de doenças humanas e perdas económicas para as empresas e para o sector de saúde pública, podem ser imensos.
Ao longo do tempo, o espectro de patogénicos muda substancialmente, por várias razões. Os patogénicos cujo veículo de transmissão é bem entendido,
podem ser controlados; outros podem surgir através mutação, ou podem transferir-se para um novo grupo da cadeia alimentar. Dessa forma, os patogénicos
emergentes são objecto de muita pesquisa e discussão, exigindo novos desafios para a sua identificação e controle (Tauxe, 2002). As principais características de
organismos considerados patogénicos emergentes encontram-se na tabela 1.
Tabela 1. Microrganismos patogénicos presentes em alimentos, responsáveis pela transmissão de doenças (adaptado de Velusamy et al., 2010).
Microrganismo Alimentos associados Dose doentia Tempo de Sintomas Doença
(nº de m.o.)* incubação**
Campylobacter Leite cru, carne crua ou mal cozida, 400 - 500 2 a 5 dias Febre, dor de cabeça, dores musculares, Campilobacteriose
jejuni aves, marisco diarreia, dor abdominal e náuseas
Salmonella spp. Ovos crus, ovos mal cozidos, leite cru e 15 - 20 12 a 24 horas Dor de estômago, dor de cabeça, febre, Salmonelose
lacticínios, chocolate, aves, carnes, calafrios, náuseas, diarreia
frutos do mar, saladas e especiarias
Escherichia coli Ovos crus, ovos mal cozidos, leite cru, < 10 2 a 4 dias Dor de estômago, dor de cabeça, febre, Colite
lacticínios, aves, carnes, frutos do mar, calafrios, náuseas, diarreia, hemorrágica
vegetais folhosos
Listeria Queijo de pasta mole, leite cru, gelado < 102 2 dias a 3 Dor nas costas, dor de cabeça, febre, Listeriose
monocytogenes mal processado, vegetais folhosos semanas calafrios e, por vezes, dor abdominal e
crus, carnes cruas, aves diarreia
Bacillus cereus Carnes, leite, legumes, peixes, massas, > 106/g 30 minutos a 15 Dor abdominal, náuseas, vómitos, diarreia, Intoxicação por
arroz queijo horas cãibras Bacillus cereus

Tabela 1. (continuação).
Microrganismo Alimentos associados Dose doentia Tempo de Sintomas Doença
(nº de m.o.)* incubação**
Clostridium Alimentos indevidamente enlatados, < nanogramas 12 a 36 horas Visão dupla, pálpebras secas, dificuldade Bolutismo
botulinum alimentos embalados a vácuo, em falar e engolir, dificuldade em respirar (transmitido por
alimentos firmemente embalados alimentos)
Clostridium Carnes mal cozidas, produtos de > 108 8 a 22 horas Cólicas abdominais e diarreia Intoxicação por C.
perfringens carne, molhos perfringens
Shigella Saladas, vegetais crus, produtos < 10 12 a 50 horas Dor abdominal, cólicas, febre, vómitos, Shigelose
lácteos, aves diarreia contendo sangue e/ou muco
Yersinia Carne (principalmente de porco), Desconhecida 1 a 3 dias Diarreia e/ou vómito, febre, dor abdominal Yersinose
enterocolitica ostras, peixes, leite cru
Vibrio Peixe cru ou mal cozido, marisco, > 105 4 horas a 4 dias Dor abdominal, dor de cabeça, febre, Gastroenterite
parahaemolyticus ostras calafrios, náuseas, vómitos, diarreia (associada a V.
parahaemolyticus)
Vibrio vulnificus Ostras cruas ou recontaminadas, < 100 < 16 horas Diarreia e infecções com ferida Septicemia
mariscos e caranguejos primária
Hepatitis A virus Sanduíches, frutas, sumos de frutas, 10 a 100 Desconhecido Febre, mal-estar, náuseas, anorexia, dor Hepatite A
leite, lacticínios, verduras, saladas, abdominal, desconforto, icterícia
mariscos, bebidas geladas
Norwalk Ostras cruas/crustáceos, água, gelo, Desconhecida 1 a 2 dias Náuseas, vómitos, diarreia, cólicas Gastroenterite
virus/Norovirus saladas, geada (presume-se abdominais viral
ser baixa)
** dose doentia: quantidade de agente que deve ser consumida para dar origem a sintomas de doenças transmitidas por alimentos.
** tempo de incubação: duração entre o consumo de um alimento contaminado e o aparecimento dos primeiros sintomas da doença.

2.1 Desafios
O diagnóstico de patogénicos microbianos e toxinas nos alimentos defronta-se com muitos desafios
associados à análise de alimentos. A complexidade das matrizes dos alimentos e da sua composição,
apresenta-se como um grande obstáculo no desenvolvimento e preparação de amostras e estratégias de
diagnóstico. A detecção eficiente dos patogénicos alvos a partir de matrizes de alimentos é bastante difícil
em produtos avícolas, ovos e carnes. Além disso, os alimentos crus geralmente apresentam níveis altos de
flora normal, o que pode interferir no desempenho de métodos tecnológicos na detecção de patogénicos.
Por outro lado, os atributos dos patogénicos alvos têm também um impacto significativo sobre a
eficiência da detecção. Ao contrário das amostras clínicas, os patogénicos em alimentos estão geralmente
presentes em menor quantidade. Além disso, a distribuição heterogénea dos patogénicos e toxinas nos
alimentos representam um grande desafio no processamento eficaz dos mesmos, especialmente quando
estes causam doenças graves no ser humano em reduzidas doses.
Outro desafio importante para a detecção de patogénicos e toxinas nos alimentos está relacionado
com o rácio entre a quantidade de amostras de alimentos e o volume de ensaios de detecção, que é
particularmente notável no domínio das tecnologias avançadas nas quais somente uma pequena fracção de
amostras de alimentos original é submetida ao ensaio de detecção efectiva.
Devido a estes desafios, é importante que sejam implementadas estratégias de preparação de amostra
eficientes, antes de serem submetidas efectivamente a métodos de detecção de patogénicos (Ge e Meng,
2009).
3. Métodos de detecção de patogénicos

Um diagnóstico completo de patogénicos e toxinas nos alimentos abrange três etapas: a recolha da
amostra, a preparação da amostra e o ensaio de detecção. Como os patogénicos se apresentam
geralmente em número reduzido nos produtos alimentares, o processamento de grandes volumes de
amostra é muitas vezes necessário para a obtenção de uma detecção eficaz. Vários métodos de detecção
de patogénicos nos alimentos têm sido utilizados. O uso de combinações de métodos podem ser
efectuados, tendo a vantagem de apresentar uma maior sensibilidade e especificidade de diagnóstico e um
grau de detecção rápida (Ge e Meng, 2009).
Existem dois tipos de métodos microbiológicos: os métodos tradicionais e os métodos rápidos. Os
métodos tradicionais são ainda considerados como “padrão de ouro” e são muitas vezes exigidos pela
legislação internacional e nacional como os métodos de controlo oficial. A designação de métodos rápidos
é usada para diferentes tipos de diagnósticos incluindo, técnicas bioquímicas e biofísicas, ensaios
imunológicos, ensaios de hibridização de ácidos nucleicos e biosensores.

3.1 Métodos Tradicionais
Tradicionalmente, a detecção e identificação de patogénicos baseiam-se principalmente na
identificação microbiológica e bioquímica. Embora estes métodos possam ser baratos, sensíveis e dar
informações sobre o número e a natureza dos microrganismos diagnosticados, são muito limitados pelo
tempo de ensaio, sendo necessário um enriquecimento inicial para detectar os patogénicos. Cultura é o
termo utilizado para descrever a amplificação biológica de microrganismos cultiváveis usando meios de
cultura artificiais. Estes meios podem ser líquidos (caldo), sólidos (adição de ágar para ser utilizado como
superfície de apoio ao crescimento), enriquecidos (substratos que promovem o crescimento) e selectivos
para reduzir o crescimento de espécies indesejáveis, ou conter indicadores específicos para revelar o
crescimento de espécies de interesse. Os microrganismos têm inicialmente de ser recuperados em culturas
puras e o seu crescimento requer valores de temperatura e condições físico-químicas adequadas (Vidová et
al., 2008).
3.1.1 Método de contagem de células viáveis

O método tradicional mais comum é o da contagem de células viáveis baseada na cultura de
microrganismos em placas de Petri e permite a enumeração de microrganismos. Originalmente, este
método foi introduzido para uma total contagem de células viáveis com a posterior introdução de uma
contagem diferencial de modo a ser quantificada a presença de patogénicos. O número de células viáveis é
determinado pelo cálculo do número de unidades formadoras de colónias (UFC) por mililitro ou grama de
amostra. Isto é conseguido pela diluição da amostra inicial, através de diluições em série devido ao facto de
uma placa não diluída, poder conter inúmeras colónias que impedem a sua contagem exacta. Embora as
contagens sejam de fácil execução e baratas, estas são demoradas em termos de operação e de obtenção
de dados. Geralmente, este método demora 3 dias para determinar a contagem total de células viáveis e 5
a 7 dias para detectar organismos patogénicos específicos e utiliza grandes quantidades de reagentes. Este
fornece informações sobre a qualidade dos alimentos, sua deterioração e segurança alimentar (von
3.2. Métodos rápidos

A maioria dos métodos rápidos tenta substituir a etapa de plaqueamento selectivo e diferencial
característico dos métodos tradicionais por técnicas mais rápidas. O diagnóstico de patogénicos requer
métodos sensíveis pois, para muitos patogénicos a sua tolerância nos alimentos é zero. Para obter tal
sensibilidade, a maioria dos métodos actuais necessitam de, pelo menos, uma etapa de enriquecimento,
geralmente um período mínimo de incubação de 6 a 48 horas. Idealmente, os métodos rápidos devem
permitir uma avaliação rápida dos parâmetros microbianos dos alimentos para permitir uma rápida acção
correctiva. Estes oferecem vantagens em termos de tempo de análise, mas também podem dar a

possibilidade de eliminar etapas intensivas de trabalho e adquirir altos níveis de automação. Sendo assim,
os métodos devem ter alta sensibilidade, alta especificidade, alta precisão, ser rápido, robusto e barato.
(von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).
3.2.1. Técnicas biofísicas

As técnicas biofísicas são usadas para a obtenção de informação quantitativa sobre sistemas
biológicos ao nível atómico ou molecular.
Neste domínio, realizam-se pesquisas direccionadas para o esclarecimento das interacções entre os
diversos sistemas de uma célula, incluindo as interacções entre o DNA, RNA e síntese proteica, além de
como estas interacções são reguladas. Baseada na medição da actividade metabólica dos microrganismos,
uma grande variedade de técnicas é usada para responder a essas questões tais como: contagem, por
microscopia, de células fluorescentes (após filtração e coloração com alaranjado de acridina); determinação
da impedância/condutância (associada à quebra de moléculas de elevado peso molecular em moléculas
mais pequenas e carregadas); microcalorimetria (medição do calor libertado pela actividade metabólica);
radiometria/espectrofotometria de Infravermelhos (detecção do CO2 produzido pela actividade
metabólica).
3.2.1.1 Contagem de células fluorescentes por microscopia

O primeiro princípio adjacente a esta técnica de diagnóstico envolve a filtração de células. Os filtros
de membrana (de nitrocelulose, nylon, poliéster) são utilizados na modificação dos métodos tradicionais
com várias finalidades: concentração dos organismos-alvo para melhorar o limite de detecção, remoção de
inibidores de crescimento, e transferência dos organismos do meio de crescimento por ressuspensão sem
danos físicos. As amostras de alimentos filtradas, são posteriormente, pré-tratadas com detergentes e
enzimas proteolíticas, filtradas em membrana de policarbonato colorada com laranja de acridina e,
finalmente, são examinadas em microscópio de fluorescência. Desta forma, o número de células viáveis é
determinado com base na contagem de células cor-de-laranja no filtro e pode ser realizada em cerca de 10
minutos (Mandal et al., 2010).
Este procedimento, contém naturalmente as suas limitações: a coloração do laranja de acridina
faculta informações sobre a presença e identificação de microrganismos que podem estar presentes na
amostra, a necessidade de aproximadamente 104 CFU/mL para a detecção de patogénicos, a coloração
com laranja de acridina não distingue organismos Gram-positivos de Gram-negativos, certos tipos de
detritos podem emitir fluorescência quando sujeitos a coloração com laranja de acridina (BD, 2010).

3.2.2. Técnicas bioquímicas
A identificação de microrganismos por métodos tradicionais usando diferentes testes bioquímicos é
um trabalho intensivo. Novos sistemas de diagnósticos têm sido desenvolvidos, sendo estas técnicas
usualmente denominadas de técnicas bioquímicas modernas, que são amplamente utilizadas e tem uma
grande importância em práticas laboratoriais.
São utilizadas para o diagnóstico de patogénicos, as seguintes técnicas bioquímicas:
bioluminescência (determinação do ATP, monitorização da higiene, qualidade do produto, carga
microbiana); actividade de catalase (quantificação da carga microbiana); hidrólise do MUG (detecção por
fluorescência, detecção de E. coli, Salmonella, Yersinia, Shigella); análise fotométrica de alterações
bioquímicas (identificação microbiana); análise colorimétrica de alterações bioquímicas (quantificação da
carga microbiana). Ao usar estes métodos, as análises podem ser concluídas de forma rápida e com custos
baixos.
3.2.2.1 ATP Bioluminescência

Todas as células, quer estejam vivas ou mortas, contêm a molécula de adenosina trifosfato (ATP),
que pode ser analisada utilizando um complexo enzima e coenzima (Luciferase-Luciferina). Os
luminómetros quantificam a produção total de luz da amostra, que é directamente proporcional à
quantidade de ATP (Mandal et al., 2010).
É necessário um mínimo de 140 células para produzir um sinal sendo o limite de detecção
equivalente a 1000 células bacterianas (1pg ATP). Este método carece de especificidade, mas devido à
rápida obtenção de resultados, é apropriado para a gestão dos programas de HACCP. Como já referido, o
ATP está presente em células mortas e vivas. Para determinar o ATP proveniente de células vivas, utilize-se
uma extracção selectiva. O ATP de células mortas começa por ser extraído com detergente não-iónico e é,
em seguida, destruído com altos níveis de ATPase por 5 minutos. Posteriormente, quantifica-se o ATP de
interesse extraindo-o com ácido tricloro-acético (5%) ou com um solvente orgânico (acetona, etanol ou
clorofórmio) (Mandal et al., 2010).
3.2.3. Ensaios imunológicos

Os ensaios imunológicos com anticorpos são talvez das únicas tecnologias que têm sido utilizadas
com sucesso na detecção de células de bactérias, esporos, vírus e toxinas (Iqbal et al., 2000). Métodos
baseados nas ligações antigene-anticorpo são amplamente utilizados na determinação de patogénicos de
origem alimentar. Métodos baseados na imunologia têm sido usados na detecção de Escherichia coli,
Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphylococcal enterotoxins (Velusamy et al., 2010). A fim de garantir
a confiança na detecção de patogénicos alimentares usando métodos baseados em anticorpos, a influência
do stress nas reacções de anticorpos deve ser cuidadosamente examinada e entendida, assim como as

actividades fisiológicas das células, que são muitas vezes alteradas em resposta desse stress (Hahm e
Bhunia, 2006).
O princípio básico dos ensaios imunológicos é a ligação dos anticorpos a um antigene alvo, seguido
pela detecção do complexo antigene-anticorpo. Os anticorpos são produzidos pelo corpo em resposta a
uma invasão de um patogénico específico. Experimentalmente, essas moléculas são produzidas em animais
de laboratório contra um componente antigénico específico do patogénico ou toxina. A característica mais
importante de um anticorpo é a sua capacidade de reconhecer apenas o antigene alvo na presença de
outros organismos ou outros compostos presentes nos alimentos. Além disso, o sucesso do uso de
anticorpos para a detecção de patogénicos, depende da expressão do antigene alvo de um patogénico, que
muitas vezes é influenciado pela temperatura, conservantes, ácidos, sais ou outros produtos químicos
constituintes dos alimentos.
Apesar do tempo de ensaio ser muito menor em comparação com os métodos tradicionais, ainda é
incompleta a capacidade de detectar microrganismos em “real-time” (tempo-real). Se as quantidades de
patogénicos forem suficientemente altas, os ensaios imunológicos podem ser utilizados para fornecer
informações em tempo real mas, podem surgir problemas como a baixa sensibilidade dos ensaios, baixa
afinidade do anticorpo para o patogénico e a potencial interferência de contaminantes. (Meng e Doyle,
2002).
Durante as últimas décadas, foram desenvolvidas inúmeras técnicas imunológicas na detecção de
contaminações microbianas, tornando-se num método mais sensível, específico, reprodutível e confiável,
para uma ampla variedade de microrganismos e seus produtos. Neste trabalho será dada importância a
alguns ensaios imunológicos: ensaios de ELISA/EIA, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação com
latéx, ensaios imuno-fluorescentes (FIA) e ensaios de separação imunomagnética.
3.2.3.1. Ensaio de ELISA/EIA

O ensaio de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ou EIA (enzyme immunoassay) é o
formato de ensaio de anticorpos de maior prevalência para a detecção de patogénicos nos alimentos.
Normalmente, é concebido como um ensaio de “sanduíche” onde, um anticorpo ligado a uma matriz sólida
(anticorpo primário) é utilizado para capturar o antigene de culturas de enriquecimento (etapas 1 e 2,
figura 1) . As paredes dos poços de uma placa de poliestireno (placa de 96 poços) são o suporte sólido mais
utilizado, sendo exemplos de outros suportes, sondas, pás, membranas e pontas de pipeta. Os antigenes
não ligados são lavados (etapa 3, figura 1) e os complexos antigene-anticorpo são detectados com a
utilização de um segundo anticorpo, estando este, conjugado a uma enzima, a qual é específica para um
epítopo diferente no antigene (etapa 4, figura 1). Do mesmo modo, os anticorpos não ligados nesta etapa
são lavados. Uma substância é adicionada para que a enzima a possa converter num sinal detectável,
normalmente numa alteração da cor do substrato químico (etapas 5 e 6, figura 1). A quantidade de enzima

presente é quantificada através da determinação colorimétrica do substrato. O limite de detecção de uma
ELISA encontra-se entre . Uma incubação overnight para detectar patogénicos com
baixa ocorrência é necessária (FDA, 2009; Vidová et al., 2008; von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).
As etapas de um ensaio ELISA são mostradas na figura 1.
Figura 1. Etapas básicas de um ensaio ELISA (von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).
3.2.3.2. Ensaios de aglutinação com látex (LA)

Os ensaios de aglutinação são os mais simples na utilização de anticorpos para análise de
alimentos. Os anticorpos, revestidos com esferas de látex coloridas, são utilizados para aglutinar antigenes
específicos de modo a ser formado um precipitado visível. Apesar da reacção de aglutinação ser
extremamente simples e ocorrer quase de imediato, possui reduzida sensibilidade e requer cerca de
células para a sua ocorrência. Contudo, este pode ser até 100 vezes melhor do que os ensaios
tradicionais. Na detecção de toxinas patogénicas, este formato de ensaio é conhecido como aglutinação
reversa passiva em látex (RPLA) porque, os anticorpos estão fixos (reverso) nas esferas de látex (matriz
passiva) e são usados para detectar os antigenes solúveis (toxinas), ao contrário do LA tradicional em que
os antigenes são insolúveis (células). Na análise de alimentos, o LA é usado principalmente para a
identificação ou confirmação de culturas puras isoladas (Feng, 1997).
3.2.3.3. Ensaios de imunodifusão

Este é outro método simples na análise de alimentos que envolve a adição de antigenes e
anticorpos que se difundem em poços num gel de agarose.
O encontro dos reagentes, em proporções definidas, leva à formação de complexos antigene-
anticorpo insolúveis que precipitam, tornando-se visíveis sob a forma de uma linha ou banda de
precipitação. Uma extrema variação na concentração de antigenes e/ou anticorpos pode alterar a

localização ou inibir a formação desta mesma banda. Esta reacção pode ser, ainda, influenciada por uma
variedade de condições físico-químicas, entre elas, a concentração electrolítica, pH e temperatura.
Alterações bruscas da temperatura, durante a incubação, levam a formação de compostos indesejáveis no
teste. Altos níveis de lípidos e proteínas nos reagentes podem afectar a formação e observação da linha de
precipitação.
3.2.3.4.Ensaios de imunofluorescência
Esta técnica tem sido amplamente utilizada tanto em microbiologia alimentar, como em
microbiologia clínica desde o seu desenvolvimento em 1942. Um anticorpo específico para um dado
antigene é acoplado a um composto fluorescente sendo emitida fluorescência aquando da formação do
complexo antigene-anticorpo, que pode ser detectada através da utilização de um microscópio de
fluorescência. Os marcadores fluorescentes geralmente usados são a Rodamina B., isocianato de
fluresceina e isotiocianato de fluoresceina. Na figura 2 pode ser observado uma fotografia na qual foi
identificada a Yersinia pestis por imunofluorescência.
Figura 2. Identificação de Yersinia pestis por imunofluorescência (Vidová et al., 2008).
3.2.3.5 Ensaio de separação imunomagnética (IMS)

O ensaio de separação imunomagnética pode ser utilizado para substituir ou complementar e
acelerar a etapa de enriquecimento que normalmente é necessária antes da detecção de patogénicos. O
IMS apenas funciona como método de detecção quando combinado com outros métodos de detecção (von
No seu procedimento de separação, são utilizados grânulos paramagnéticos que são activados à
superfície e podem ser revestidos com anticorpos por incubação num refrigerador por períodos de tempo
variáveis até 24 horas. Os anticorpos não absorvidos são removidos através de uma lavagem. Quando é
feito um tratamento adequado, os grânulos revestidos são adicionados aos alimentos que contém os
antigenes homólogos dos patogénicos contaminantes, sendo posteriormente incubados, para permitir a
reacção do complexo antigene-anticorpo com os grânulos revestidos. O antigene concentrado é analisado
por outros métodos, como por exemplo ensaios de imunofluorescência e citometria de fluxo (Vidová et al.,
2008). Pode observar-se na figura 3 a detecção de uma Salmonella spp. utilizando o IMS.

Figura 3. The Aureon Biosystems Salmonella A-Beads: Partículas paramagnéticas do tipo 1,5µm polydisperse cluster com
anticorpos purificados por afinidade contra a Salmonella spp. (Vidová et al., 2008).
Este é um processo que não é efectivamente quantitativo devido às diferentes taxas de

recuperação do complexo antigene-anticorpo e à possibilidade de vários antigenes estarem associados a
um grânulo-anticorpo. As taxas de recuperação encontram-se tipicamente entre 25 a 50%. Uma das
vantagens deste ensaio é a redução da flora microbiana que reduz o tempo necessário para a selecção de
colónias suspeitas. Uma desvantagem do IMS está relacionada com a necessidade da sua optimização para
cada tipo de amostra, pois o seu desempenho é determinado por uma série de factores como por exemplo
a concentração de anticorpos revestidos pelas partículas magnéticas, o número de partículas por teste, as
condições de incubação, o tipo de amostra, os regimes de lavagem e a especificidade do anticorpo.
3.2.4 Ensaios de hibridação de ácidos nucleicos

Avanços na biotecnologia têm conduzido ao desenvolvimento de diversos ensaios de diagnóstico
de patogénicos. Análises rápidas que utilizam a hibridação de ácidos nucléicos e técnicas de amplificação
dos mesmos possuem uma maior sensibilidade e especificidade. Muitos métodos atingem altos níveis de
automação, facilitando as suas aplicações em ensaios de rotina (Wang et al., 1997). Certas técnicas e
métodos têm bons resultados quando usados em pesquisas laboratoriais mas não são tão úteis no
diagnóstico de patogénicos (Rijpens and Herman, 2002). Basicamente, estes ensaios são realizados
utilizando material genético (DNA e RNA) no diagnóstico para a identificação de patogénicos suspeitos. O
avanço deste tipo de diagnóstico é consequente de duas vantagens essenciais: os ácidos nucleicos podem
ser medidos de uma forma rápida e sensível e a sequência de nucleótidos num determinado gene é
altamente específico e pode ser usado para diferenciar serotipos intimamente relacionados (Kwang, 2006).
O princípio essencial dos ensaios baseados em ácidos nucléicos é a formação específica de cadeias duplas
de moléculas DNA a partir de duas cadeias moleculares complementares em determinadas condições
físico-químicas. Existem diversos ensaios baseados em acidos nucleicos mas apenas o DNA probe e o PCR
têm sido desenvolvidos comercialmente para o diagnóstico de patogénicos aliementares (Wang, 2002).

A identificação de patogénicos pela hibridação de DNA é baseado na presença de genes
particulares. O gene é composto por moléculas de ácidos nucleicos, mais frequentemente por móleculas
duplas de DNA. Pequenos fragmentos de uma cadeia simples de DNA podem ser sintetizados, basenado-se
em sequencais de nucleótidos do gene de interesse. As cadeias duplas de DNA devem ser desnaturadas
antes da reacção de hibridação.
3.2.4.1 Polymerase chain reaction (PCR)

Este método pode detectar uma única cópia de uma sequência de DNA alvo, e portanto, pode ser
usado para detectar um único patogénico alvo nos alimentos. É um método promissor, pois detecta o
organismo alvo através da amplificação e não sinais sendo, portanto, menos propenso a produzir falsos-
positivos. O DNA alvo pode ser amplificado um milhão de vezes em menos de uma hora (Batt, 2007). É
utilizado para reforçar a sensibilidade dos ensaios baseados em ácidos nucléicos. O PCR possui vantagens
sobre outros métodos de diagnóstico de patogénicos como uma maior especificidade, sensibilidade,
rapidez, precisão e capacidade de detectar pequenas quantidades de ácidos nucleicos alvo numa amostra
(Toze, 1999). Recentemente, foi publicado que a reacção de PCR é mais sensível na detecção de Salmonella
em alimentos marinhos, comparada com o ensaio de ELISA (Kumar et al., 2008). Quando analisados por
PCR, sinais falso-negativos podem ocorrer estando relacionados com a lise das células alvo necessárias para
a extracção de ácidos nucleicos, pela degradação destes últimos e /ou pela própria inibição directa do PCR.
Sendo assim, é importante fazer um controlo adequado na aplicação do PCR para o diagnóstico de
patogénicos alimentares (Murphy et al., 2007). Na figura 4 encontra-se esquematizado o processo de PCR.
Uma das principais limitações do PCR é a não distinção entre células viáveis e não viáveis, uma vez que o
DNA encontra-se sempre presente quer a célula esteja viva ou morta. Mas essa limitação pode ser
superada usando PCR transcriptase reversa (RT-PCR).
3.2.5. Biosensores
Um biossensor é um dispositivo analítico que converte uma resposta biológica num sinal eléctrico.
Este é composto por um elemento de biorreconhecimento - o biorreceptor - que reconhece o analito que
se pretende identificar e um elemento que converte a resposta obtida num sinal eléctrico quantificável - o
transdutor. Através de um amplificador o sinal é aumentado, seguindo para um processador de sinal no
qual poderá ser armazenado, apresentado e analisado. Podem ser utilizados como biossensores, tecidos,
microrganismos, organelos, células, enzimas, anticorpos, ácidos nucleicos, entre outros, e a transdução
pode ser óptica, electroquímica, termométrica, piezoeléctrica, magnética e micromecânica ou combinações
de duas ou mais destas técnicas (Velusamy et al., 2010). A figura 4 demonstra esquematicamente o
funcionamento de um biossensor.

Figura 4. Funcionamento esquemático de um biossensor (Velusamy et al., 2010).
3.2.5.1 Biorreceptors
Biorreceptores são espécies moleculares que utilizam um mecanismo bioquímico para o
reconhecimento. Estes podem ser anticorpos/antigenes, enzimas, ácidos nucleicos/DNA, estruturas
moleculares/células e bacteriófagos. As enzimas, os anticorpos e os ácidos nucleicos formam o principal
grupo de biorreceptores.
3.2.5.1.1 Anticorpos
Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais ou recombinantes dependendo das suas
propriedades selectivas e do modo como são sintetizados. Por vezes, são imobilizados num substrato,
podendo este servir como superfície de detecção.
A forma como um antigene e um complexo antigene-anticorpo específico interagem, é semelhante
ao modelo de chave e fechadura. O antigene original liga-se ao complexo antigene-anticorpo específico,
ficando estas estruturas tridimensionais encaixadas. Assim, é possível encontrar um anticorpo que
reconheça e se ligue a uma grande variedade de produtos químicos, biomoléculas e microrganismos.
Podem utilizar-se anticorpos como sondas específicas para o reconhecimento de analitos de interesse em
que se encontram, mesmo que em reduzidas quantidades, numa mistura com um grande número de
substâncias químicas. São exemplos de biossensores que utilizam anticorpos como o elemento
biorreceptor na detecção de patogénicos em alimentos, o SPR (surface plasmon resonance), sensores de
ressonância magnetoelástica e imunossensores.
3.2.5.1.2 Enzimas
As enzimas são utilizadas como biossensores com base na sua alta especificidade e também na sua
actividade catalítica de amplificação de bactérias patogénicas, de modo a serem detectadas e
quantificadas, permitindo uma análise sensível. Estas oferecem outras vantagens como a alta sensibilidade,
possibilidade de visualização directa e serem estáveis durante anos.

3.2.5.1.3 Ácidos Nucleicos
Na utilização de ácidos nucleicos como biorrecepetores, a identificação dos analitos alvo
constituídos por ácidos nucleicos é conseguida pela complementaridade de bases azotadas, que são
componentes genéricos de um microrganismo. Os biossensores que utilizam ácidos nucleicos para o
biorreconhecimento são simples, rápidos e baratos. Devido à sua ampla actividade física, química e
biológica, biossensores baseados em ácidos nucleicos são geralmente referidos como ideais para a
detecção de patogénicos alimentares tais como E. coli O157:H7, Salmonella spp. e Campylobacter jejuni.
As microarrays de DNA têm sido referidas também como detecção de patogénicos alimentares tais
como Listeria spp., Campylobacter spp., genes de S. aureus enterotoxina e genes de toxinas de Clostridium
perfringens e seus factores virulentos.
3.2.5.1 Transdutores
Os biossensores podem ser classificados baseados no método de transdução aplicados. Os métodos
de transdução mais populares são o óptico, o electroquímico e o método baseado na sensibilidade à massa,
possuindo cada um destes métodos várias subclasses.
3.2.5.1.1 Óptico
Os biossensores ópticos têm recebido especial interesse na detecção de patogénicos devido à sua
elevada sensibilidade e selectividade. A detecção óptica pode ser baseada na absorção, reflexão, dispersão,
infravermelhos, quimioluminescência, fluorescência e fosforescência.
3.2.5.1.2. Electroquímico
Os biossensores electroquímicos podem ser amperimétrico, potenciométrico, impedimétrico e
condutométrico baseados em parâmetros observados tal como a corrente eléctrica, o potencial,
impedância e condutância, respectivamente. Estes têm como vantagens o baixo custo, a capacidade de
funcionarem em amostras turvas e a sua fácil miniaturização, apesar da sua sensibilidade e selectividade
serem mais reduzidas que nos métodos ópticos.
3.2.5.1.3.Sensibilidade à massa
Os biossensores com sensibilidade à massa são adequados para detecções muito sensíveis nas
quais a transdução é baseada em pequenas alterações na massa. Os principais meios de análise da massa
dependem do uso de cristais piezoeléctricos, geralmente de quartzo, que podem ser postos em vibração a
uma frequência específica através da aplicação de um sinal eléctrico. A frequência de vibração é
dependente da frequência eléctrica aplicada bem como da massa do cristal. Assim, quando a massa
aumenta devido à ligação de compostos químicos, a frequência de vibração dos cristais é alterada

resultando numa alteração do sinal medido electricamente que poderá ser utilizado para calcular a massa
adicional do cristal. Este tipo de biossensores são relativamente fáceis de utilizar e de reduzido custo,
porém, são muito menos comuns na detecção de patogénicos em alimentos do que os ópticos e
electroquímicos.
4. Mercado dos Métodos de Diagnósticos em Alimentos

O mercado mundial da análise aos alimentos que engloba todos os métodos de diagnóstico,
contabilizou cerca de 1.1 biliões de euros em 1999. Particularmente, o ramo dos métodos microbiológicos
aos alimentos, que têm como objectivo detectar a presença de microrganismos, totalizou cerca de 565
milhões de euros, sendo estimado que foram realizados cerca de 440 milhões destes testes nesse mesmo
ano (von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).
Apesar da crescente evolução dos métodos rápidos de diagonóstico de patogénicos, principalmente nos
EUA, os métodos tradicionais dominam ainda o mercado dos testes de controlo de higiene e qualidade. Em
1999, foram realizados a nível mundial 44 milhões de testes microbiológicos, sendo que cerca de 80%
destes testes foram realizados recorrendo a métodos tradicionais (Tabela 2).
Tabela 2. Mercado Global dos testes microbiológicos no ano de 1999 - métodos tradicionais versus métodos rápidos (von
O mercado europeu dos testes de diagnóstico aos alimentos contabilizou no ano de 1999, cerca de
490 milhões de euros, sendo apenas 18 % desta quantia referente a métodos rápidos como é possível
verificar pela tabela 3.

Tabela 3. Mercado Europeu dos testes de diagnóstico aos alimentos no ano de 2009 (von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).
Como se verifica pela tabela 3, na Europa foram realizados em 1999 cerca de 28 milhões de testes a
patogénicos, totalizando uma receita de cerca de 98 milhões de euros. Neste ano os métodos rápidos para
detecção de patogénicos geraram receitas de cerca de 13 milhões de euros correspondendo a 13 % do
mercado.
Como é possível verificar pela tabela 4 no mercado dos métodos rápidos, os imunoensaios
contabilizaram ainda a maior fatia deste mercado seguido do métodos de DNA (PCR).
Tabela 4. Mercado dos testes microbiológicos aos alimentos utilizando métodos rápidos no ano de 2009 (von Blanknfeld-Enkvist e
Brannback, 2002).
5. O Futuro das técnicas actuais

O ramo tecnológico de diagnóstico de patogénicos em alimentos é visto como uma recente área de
negócio rentável, sendo emergente particularmente devido à actual indefinição da indústria e mercado
alimentares. Devido à crescente exigência pública no que respeita à segurança e higiene alimentares, este
ramo tecnológico enfrenta vários desafios quanto à procura de novas técnicas e ao aperfeiçoamento das já
existentes. Referem-se abaixo aspectos a melhorar em algumas das técnicas já descritas.
5.1 Contagem das células viáveis

Apesar da importância da contagem de células viáveis sejam elas coliformes, leveduras ou bolores
na avaliação da qualidade e segurança dos produtos alimentares, no contexto industrial, existe a

necessidade de métodos alternativos mais baratos, consistentes e que apresentem resultados em tempo
real tais como métodos baseados em contagem de células fluorescentes por microscopia, citometria de
fluxo e biossensores.
5.2 Monitorização da Higiene

O desenvolvimento de métodos, que permitam a monitorização em tempo real da higiene dos
processos alimentares industriais permitirão, consequentemente, uma melhor segurança na indústria
alimentar. Métodos baseados em ATP bioluminescência, Adenilato Kinase e biossensores podem ser
desenvolvidos nesse sentido.
5.3 Ensaios imunológicos

Vários sistemas comerciais baseados em ELISA que permitem a análise automática, encontram-se
já no mercado. O uso de novos anticorpos recombinantes e técnicas de molecular imprinting permitirão
melhorar a sensibilidade e versatilidade desta técnica.
5.4 Biossensores e microarrays

Os biossensores possuem um elevado potencial na automação dos processos e permitem a
construção de equipamentos simples e portáteis para uma maior facilidade e rapidez nas análises. Estas
propriedades poderão permitir a sua utilização em novas áreas como a qualidade e controlo de processos,
como são exemplos, o controlo de processos de fermentação e a qualidade e segurança das matérias-
primas.
5.5 Ensaios baseados em ácidos nucleicos

O desenvolvimento de ensaios homogéneos e de automação têm melhorado a performance dos
métodos de análise baseados em PCR numa grande parte dos laboratórios alimentares. Novos formatos de
ensaios podem ser explorados para o diagnóstico de patogénicos na indústria alimentar.
6. Conclusão
A segurança alimentar tem-se tornado uma preocupação ao nível da saúde pública devido ao
aumento da exposição por parte dos alimentos a seres patogénicos, principalmente, derivada às técnicas
de produção e ao crescente amontoar de etapas de processamento a que estes são sujeitos, por vezes em
condições de higiene menos apropriadas. Muitas das vezes, o objectivo passa por uma produção em massa
e obtenção de lucros, e não pela segurança alimentar do produto para o ser humano.
Deste modo, visando garantir a segurança de produtos alimentares é importante a implementação
de programas de gestão da segurança alimentar como o HACCP (Hazard Analysis and Critical Control

Points).
Durante as últimas décadas, novas tecnologias têm sido desenvolvidas no sentido da detecção de
patogénicos nos alimentos. Estas técnicas tendem a evoluir no sentido de se tornarem mais rápidas e
fiáveis, com uma maior sensibilidade e selectividade e a um menor custo, sendo possível atingir um nível no
qual se consiga realizar uma monitorização de patogénicos em tempo real recorrendo, por exemplo, a
biossensores. Este, devido às actuais inquietações ao nível da higiene alimentar, tornou-se um mercado de
elevada rendibilidade e em clara expansão a nível mundial.
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