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Autores:
Duarte Filipe da Silva Martins 52497
Paulo Jorge Teixeira Freitas 52516
Sofia Alexandra Araújo Pereira 52530
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica
Biotecnologia Alimentar
Resumo
A segurança alimentar é uma meta global de saúde podendo as doenças causadas por alimentos
levar a uma grave crise ao nível da saúde mundial. O diagnóstico de patogénicos nos alimentos é uma das
soluções para a prevenção e para o reconhecimento dos problemas relacionados com a segurança e saúde
alimentares. Deste modo, o objectivo deste trabalho passa por fazer, não apenas uma revisão global dos
métodos de diagnóstico de patogénicos em alimentos, mas também descrever métodos convencionais e
rápidos, desenvolvimentos recentes, identificação e quantificação.
Métodos convencionais de diagnóstico de patogénicos, como métodos de contagem de colónias,
podem demorar várias horas ou até mesmo alguns dias para ser obtida uma resposta, o que é obviamente
insuficiente. O avanço da biotecnologia é importante para um desenvolvimento contínuo de métodos que
permitam o diagnóstico de patogénicos de uma forma mais rápida e confiável. Desenvolvimentos no campo
da imunologia, da biologia molecular, da automação e das tecnologias de computação continuam a ter um
efeito positivo no desenvolvimento de métodos tradicionais da microbiologia alimentar quanto à rapidez, à
sensibilidade e à especificidade. Métodos modernos são baseados em técnicas da biologia molecular, como
o PCR, em ensaios imunológicos, como ELISA, imunofluorescência e separação imunomagnética, em
técnicas físicas e bioquímicas com a aplicação de biosensores, como a bioluminescência e biosensores
analíticos utilizando enzimas, anticorpos e ácidos nucléicos.
São necessários estudos contínuos relativamente a técnicas de separação de microrganismos das
matrizes alimentares e concentração destes antes da sua detecção no melhoramento da segurança
alimentar por ensaios imunológicos e ensaios baseados em ácidos nucléicos. A possibilidade de
combinações de diferentes métodos deve ser ainda explorada. Porém, desenvolvimentos em protocolos de
ensaios imunológicos e PCR devem resultar num diagnóstico quantitativo de microrganismos e
simultaneamente, de mais do que um patogénico ou toxina.
1. Introdução.................................................................................................................................................................................. 1
2. Patogénicos nos alimentos, desafios e riscos associados .............................................................................................................. 3
2.1 Desafios ............................................................................................................................................................................... 5
3. Métodos de detecção de patogénicos ......................................................................................................................................... 5
3.1 Métodos Tradicionais ........................................................................................................................................................... 6
3.1.1 Método de contagem de células viáveis ........................................................................................................................ 6
3.2. Métodos rápidos ................................................................................................................................................................. 6
3.2.1. Técnicas biofísicas........................................................................................................................................................ 7
3.2.1.1 Contagem de células fluorescentes por microscopia ................................................................................................... 7
3.2.2. Técnicas bioquímicas ................................................................................................................................................... 8
3.2.2.1 ATP Bioluminescência............................................................................................................................................ 8
3.2.3. Ensaios imunológicos ................................................................................................................................................... 8
3.2.3.1. Ensaio de ELISA/EIA .............................................................................................................................................. 9
3.2.3.2. Ensaios de aglutinação com látex (LA) ................................................................................................................. 10
3.2.3.3. Ensaios de imunodifusão .................................................................................................................................... 10
3.2.3.4.Ensaios de imunofluorescência ............................................................................................................................ 11
3.2.3.5 Ensaio de separação imunomagnética (IMS) ........................................................................................................ 11
3.2.4 Ensaios de hibridação de ácidos nucleicos ................................................................................................................... 12
3.2.4.1 Polymerase chain reaction (PCR).......................................................................................................................... 13
3.2.5. Biosensores ............................................................................................................................................................... 13
3.2.5.1 Biorreceptors ...................................................................................................................................................... 14
3.2.5.1.1 Anticorpos ................................................................................................................................................... 14
3.2.5.1.2 Enzimas ....................................................................................................................................................... 14
3.2.5.1.3 Ácidos Nucleicos .......................................................................................................................................... 15
3.2.5.1 Transdutores....................................................................................................................................................... 15
3.2.5.1.1 Óptico ......................................................................................................................................................... 15
3.2.5.1.2. Electroquímico............................................................................................................................................ 15
3.2.5.1.3.Sensibilidade à massa .................................................................................................................................. 15
4. Mercado dos Métodos de Diagnósticos em Alimentos ............................................................................................................... 16
5. O Futuro das técnicas actuais .................................................................................................................................................... 17
5.1 Contagem das células viáveis .............................................................................................................................................. 17
5.2 Monitorização da Higiene ................................................................................................................................................... 18
5.3 Ensaios imunológicos ......................................................................................................................................................... 18
5.4 Biossensores e microarrays ................................................................................................................................................ 18
5.5 Ensaios baseados em ácidos nucleicos ................................................................................................................................ 18
6. Conclusão................................................................................................................................................................................. 18
7. Bibliografia ............................................................................................................................................................................... 19
Tabela 1. Microrganismos patogénicos presentes em alimentos, responsáveis pela transmissão de doenças (adaptado de Velusamy et al., 2010).
Microrganismo Alimentos associados Dose doentia Tempo de Sintomas Doença
(nº de m.o.)* incubação**
Campylobacter Leite cru, carne crua ou mal cozida, 400 - 500 2 a 5 dias Febre, dor de cabeça, dores musculares, Campilobacteriose
jejuni aves, marisco diarreia, dor abdominal e náuseas
Salmonella spp. Ovos crus, ovos mal cozidos, leite cru e 15 - 20 12 a 24 horas Dor de estômago, dor de cabeça, febre, Salmonelose
lacticínios, chocolate, aves, carnes, calafrios, náuseas, diarreia
frutos do mar, saladas e especiarias
Escherichia coli Ovos crus, ovos mal cozidos, leite cru, < 10 2 a 4 dias Dor de estômago, dor de cabeça, febre, Colite
lacticínios, aves, carnes, frutos do mar, calafrios, náuseas, diarreia, hemorrágica
vegetais folhosos
Listeria Queijo de pasta mole, leite cru, gelado < 102 2 dias a 3 Dor nas costas, dor de cabeça, febre, Listeriose
monocytogenes mal processado, vegetais folhosos semanas calafrios e, por vezes, dor abdominal e
crus, carnes cruas, aves diarreia
Bacillus cereus Carnes, leite, legumes, peixes, massas, > 106/g 30 minutos a 15 Dor abdominal, náuseas, vómitos, diarreia, Intoxicação por
arroz queijo horas cãibras Bacillus cereus
Clostridium Carnes mal cozidas, produtos de > 108 8 a 22 horas Cólicas abdominais e diarreia Intoxicação por C.
perfringens carne, molhos perfringens
Shigella Saladas, vegetais crus, produtos < 10 12 a 50 horas Dor abdominal, cólicas, febre, vómitos, Shigelose
lácteos, aves diarreia contendo sangue e/ou muco
Yersinia Carne (principalmente de porco), Desconhecida 1 a 3 dias Diarreia e/ou vómito, febre, dor abdominal Yersinose
enterocolitica ostras, peixes, leite cru
Vibrio Peixe cru ou mal cozido, marisco, > 105 4 horas a 4 dias Dor abdominal, dor de cabeça, febre, Gastroenterite
parahaemolyticus ostras calafrios, náuseas, vómitos, diarreia (associada a V.
parahaemolyticus)
Vibrio vulnificus Ostras cruas ou recontaminadas, < 100 < 16 horas Diarreia e infecções com ferida Septicemia
mariscos e caranguejos primária
Hepatitis A virus Sanduíches, frutas, sumos de frutas, 10 a 100 Desconhecido Febre, mal-estar, náuseas, anorexia, dor Hepatite A
leite, lacticínios, verduras, saladas, abdominal, desconforto, icterícia
mariscos, bebidas geladas
Norwalk Ostras cruas/crustáceos, água, gelo, Desconhecida 1 a 2 dias Náuseas, vómitos, diarreia, cólicas Gastroenterite
virus/Norovirus saladas, geada (presume-se abdominais viral
ser baixa)
** dose doentia: quantidade de agente que deve ser consumida para dar origem a sintomas de doenças transmitidas por alimentos.
** tempo de incubação: duração entre o consumo de um alimento contaminado e o aparecimento dos primeiros sintomas da doença.
3.2.3.4.Ensaios de imunofluorescência
Esta técnica tem sido amplamente utilizada tanto em microbiologia alimentar, como em
microbiologia clínica desde o seu desenvolvimento em 1942. Um anticorpo específico para um dado
antigene é acoplado a um composto fluorescente sendo emitida fluorescência aquando da formação do
complexo antigene-anticorpo, que pode ser detectada através da utilização de um microscópio de
fluorescência. Os marcadores fluorescentes geralmente usados são a Rodamina B., isocianato de
fluresceina e isotiocianato de fluoresceina. Na figura 2 pode ser observado uma fotografia na qual foi
identificada a Yersinia pestis por imunofluorescência.
3.2.5. Biosensores
Um biossensor é um dispositivo analítico que converte uma resposta biológica num sinal eléctrico.
Este é composto por um elemento de biorreconhecimento - o biorreceptor - que reconhece o analito que
se pretende identificar e um elemento que converte a resposta obtida num sinal eléctrico quantificável - o
transdutor. Através de um amplificador o sinal é aumentado, seguindo para um processador de sinal no
qual poderá ser armazenado, apresentado e analisado. Podem ser utilizados como biossensores, tecidos,
microrganismos, organelos, células, enzimas, anticorpos, ácidos nucleicos, entre outros, e a transdução
pode ser óptica, electroquímica, termométrica, piezoeléctrica, magnética e micromecânica ou combinações
de duas ou mais destas técnicas (Velusamy et al., 2010). A figura 4 demonstra esquematicamente o
funcionamento de um biossensor.
3.2.5.1 Biorreceptors
Biorreceptores são espécies moleculares que utilizam um mecanismo bioquímico para o
reconhecimento. Estes podem ser anticorpos/antigenes, enzimas, ácidos nucleicos/DNA, estruturas
moleculares/células e bacteriófagos. As enzimas, os anticorpos e os ácidos nucleicos formam o principal
grupo de biorreceptores.
3.2.5.1.1 Anticorpos
Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais ou recombinantes dependendo das suas
propriedades selectivas e do modo como são sintetizados. Por vezes, são imobilizados num substrato,
podendo este servir como superfície de detecção.
A forma como um antigene e um complexo antigene-anticorpo específico interagem, é semelhante
ao modelo de chave e fechadura. O antigene original liga-se ao complexo antigene-anticorpo específico,
ficando estas estruturas tridimensionais encaixadas. Assim, é possível encontrar um anticorpo que
reconheça e se ligue a uma grande variedade de produtos químicos, biomoléculas e microrganismos.
Podem utilizar-se anticorpos como sondas específicas para o reconhecimento de analitos de interesse em
que se encontram, mesmo que em reduzidas quantidades, numa mistura com um grande número de
substâncias químicas. São exemplos de biossensores que utilizam anticorpos como o elemento
biorreceptor na detecção de patogénicos em alimentos, o SPR (surface plasmon resonance), sensores de
ressonância magnetoelástica e imunossensores.
3.2.5.1.2 Enzimas
As enzimas são utilizadas como biossensores com base na sua alta especificidade e também na sua
actividade catalítica de amplificação de bactérias patogénicas, de modo a serem detectadas e
quantificadas, permitindo uma análise sensível. Estas oferecem outras vantagens como a alta sensibilidade,
possibilidade de visualização directa e serem estáveis durante anos.
3.2.5.1 Transdutores
Os biossensores podem ser classificados baseados no método de transdução aplicados. Os métodos
de transdução mais populares são o óptico, o electroquímico e o método baseado na sensibilidade à massa,
possuindo cada um destes métodos várias subclasses.
3.2.5.1.1 Óptico
Os biossensores ópticos têm recebido especial interesse na detecção de patogénicos devido à sua
elevada sensibilidade e selectividade. A detecção óptica pode ser baseada na absorção, reflexão, dispersão,
infravermelhos, quimioluminescência, fluorescência e fosforescência.
3.2.5.1.2. Electroquímico
Os biossensores electroquímicos podem ser amperimétrico, potenciométrico, impedimétrico e
condutométrico baseados em parâmetros observados tal como a corrente eléctrica, o potencial,
impedância e condutância, respectivamente. Estes têm como vantagens o baixo custo, a capacidade de
funcionarem em amostras turvas e a sua fácil miniaturização, apesar da sua sensibilidade e selectividade
serem mais reduzidas que nos métodos ópticos.
3.2.5.1.3.Sensibilidade à massa
Os biossensores com sensibilidade à massa são adequados para detecções muito sensíveis nas
quais a transdução é baseada em pequenas alterações na massa. Os principais meios de análise da massa
dependem do uso de cristais piezoeléctricos, geralmente de quartzo, que podem ser postos em vibração a
uma frequência específica através da aplicação de um sinal eléctrico. A frequência de vibração é
dependente da frequência eléctrica aplicada bem como da massa do cristal. Assim, quando a massa
aumenta devido à ligação de compostos químicos, a frequência de vibração dos cristais é alterada
Tabela 2. Mercado Global dos testes microbiológicos no ano de 1999 - métodos tradicionais versus métodos rápidos (von
Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).
O mercado europeu dos testes de diagnóstico aos alimentos contabilizou no ano de 1999, cerca de
490 milhões de euros, sendo apenas 18 % desta quantia referente a métodos rápidos como é possível
verificar pela tabela 3.
Como se verifica pela tabela 3, na Europa foram realizados em 1999 cerca de 28 milhões de testes a
patogénicos, totalizando uma receita de cerca de 98 milhões de euros. Neste ano os métodos rápidos para
detecção de patogénicos geraram receitas de cerca de 13 milhões de euros correspondendo a 13 % do
mercado.
Como é possível verificar pela tabela 4 no mercado dos métodos rápidos, os imunoensaios
contabilizaram ainda a maior fatia deste mercado seguido do métodos de DNA (PCR).
Tabela 4. Mercado dos testes microbiológicos aos alimentos utilizando métodos rápidos no ano de 2009 (von Blanknfeld-Enkvist e
Brannback, 2002).
6. Conclusão
A segurança alimentar tem-se tornado uma preocupação ao nível da saúde pública devido ao
aumento da exposição por parte dos alimentos a seres patogénicos, principalmente, derivada às técnicas
de produção e ao crescente amontoar de etapas de processamento a que estes são sujeitos, por vezes em
condições de higiene menos apropriadas. Muitas das vezes, o objectivo passa por uma produção em massa
e obtenção de lucros, e não pela segurança alimentar do produto para o ser humano.
Deste modo, visando garantir a segurança de produtos alimentares é importante a implementação
de programas de gestão da segurança alimentar como o HACCP (Hazard Analysis and Critical Control
7. Bibliografia
Altekruse, S. F., Bauer, N., Chanlongbutra, A., DeSagun, R., Naugle, A., Schlosser, W., Umholtz, R., White, P.,
Salmonella Enteritidis in broiler chickens, Emerging Infectious Diseases, 12, 1848-1852, 2006.
BD, Acridine Orange Stain para detecção de microrganismos em esfregaços directos pela técnica de coloração fluorescente,
Folheto informativo português, 212536-212537, 2004.
Bhunia, A. K., Biosensors and bio-based methods for the separation and detection of foodborne pathogens, Advances
in Food and Nutrition Research, 54, 1-44, 2007.
Biswas, A. K., Kondaiah, N., Bheilegaonkar, K. N., Anjaneyulu, A. S. R., Mendiratta, S. K. et al., Microbial profiles of frozen
trimmings and silver sides prepared at Indian buffalo meatpacking plants, Meat Science, 80, 418-422, 2008.
Brandl, M. T., Fitness of human enteric pathogens on plants and implications for food safety, Annual Review of
Phytopathology, 44, 367-392, 2006.
Carter, M. J., Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection,
Journal of Applied Microbiology, 98, 1354-1380, 2005.
CDC., Update on Multi-State Outbreak of E. coli O157: H7 Infections from Fresh Spinach E. coli O157: H7 Outbreak in
Spinach. CDC., New York, New Jersey, 2006.
Chang, Y. H., Prevalence of Salmonella spp. in poultry broilers and shell eggs in Korea, Journal of Food Protection, 63, 655-
658, 2000.
De Boer, E., Beumer, R. R., Methodology for typing and detection of food home microorganisms, International
Journal of Food Microbiology, 50, 119-130, 1999.
Doyle, M. P., Erickson, M. C., Reducing the carriage of foodborne pathogens in livestock and poultry, Poultry Science, 85,
960-973, 2006.
Doyle, M. P., Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers, 2nd Edition, ASM Press, Washillgton, 2001.
Feldhusen, F., The role of seafood in bacterial foodborne diseases, Microbes and Infection, 2, 1651-1660, 2000.
Feng, P., Impact of molecular biology on the detection of foodborne pathogens, Molecular Biotechnology, 7, 267-268, 1997.
FDA, 2009. Food and Drug Administration, U.S Department of Health & Human Services.
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm109652.htm.
Consultado em 04/12/2010.
Ge, B., Meng, J., Advanced technologies for pathogen and toxin detection in foods: Current applications and future
directions, Journal of the Association for Laboratory Automation, 235-241, 2009.
Hahm B. K, Bhunia A. K., Effect of environmental stresses on antibody-based detection of Escherichia coli O157: H7,
Salmonella enterica serotype enteritidis and Listeria monocytogenes, Journal of Applied Microbiology, 100, 1017–27, 2006.
Iqbal, S. S., Mayo, M. W., Bruno, J. G., Bronk, B. V., Batt, C. A., Chambers, P., A review of molecular recognition
technologies for detection of biological threat agents, Biosensors and Bioelectronics, 15, 549-578, 2000.
Kumar R, Surendran P. K., Thampuran N., Evaluation of culture ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in
seafood, Letters in Applied Microbiology, 46, 221–226, 2008.
Kwang, J., Microbes and livestock. In: KUN, L. Y., Microbial biotechnology, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.,
Singapore, 391-461, 2006.
Lynch, M., Painter, J., Woodruff, R., Braden C., Surveillance for foodbornedisease outbreaks: United States, 1998–2002,
MMWR Surveillance Summaries, 55, 1-42, 2006.
Mandal, P. K., Biswas, A. K., Choi, K., Pal, U. K., Methods for rapid detection of foodborne pathogens: An overview,
American Journal of Food Technology , 6, 87-102, 2010.
Meng, J. H., Doyle, M. P., Introduction Microbiological food safety, Microbes and Infection, 4, 395-7, 2002.
Murphy, N. M., McLauchlin, J., Ohai, C., Grant, K. A., Construction and evaluation of a microbiological positive process
internal control for PCR-based examination of food samples for Listeria monocytogenes and Salmonella enteric, International
Journal of Food Microbiology, 120, 110–119, 2007.
Park, Y. H., Application of biotechnology in animal products safety. Proceeding of 3rd CJK Symposium on Biotechnology and
Animal Production, (CSBAP’01), Jinju National University, Korea, 33-69, 2001.
Rijpens, N. P., Herman, L. M., Molecular methods for identification and detection of bacterial food pathogens, Journal of
AOAC International, 85, 984-995, 2002.
Solomon, E. B., Yaron, S., Mathews, K. R., Transmission of Escherichia coli 0157:H7 from contaminated manure and
irrigation water to lettuce plant tissue and its subsequent internalization, Applied and Environmental Microbiology, 68, 397-
400, 2002.
Tauxe, R. V., Emerging foodborne pathogens, International Journal of Food Microbiology, 78, 31-42, 2002.
Toze, S., PCR and the detection of microbial pathogens in water and wastewater, Water Research, 33, 3545-3556, 1999.
Vasavada, P. C., Rapid methods and automation in dairy microbiology, Journal of Dairy Science, 76, 3101-3113, 1993.
Vidová, B., Godány, A., Sturdik, E., Rapid Detection Methods of Microbial Pathogens in Foods – Short Survey, Nova
Biotechnologica, 8, 5-22 2008.
von Blankenfeld-Enkvist, G., Brännback, M., Technological Trends and Needs in Food Diagnostics, Technology Review,
National Technology Agency, 2002.
Velusamy V., Arshak K., Korostynska O., Oliwa K., Adley C., An overview of foodborne pathogen detection: In the
perspective of biosensors, Biotechnology Advantages, 2009.
Wang, H., Rapid method for detection and enumeration of Campylobacter spp. in Food, Journal of AOAC International, 85,
996-999, 2002.
Wang, R. F., Cao, W. W., Cerniglia, C. E., A universal protocol for PCR detection of 13 species of foodborne pathogens in
foods, Journal of Applied Microbiology, 83, 727-736, 1997.