CULTURAS DE TUBEROSAS AMILÁCEAS LATINO AMERICANAS Volume 2 - Agricultura: Tuberosas Amiláceas Latino Americano

Capitulo 6 tar a produtividade e qualidade dos produtos obtidos (farinha, amido, feno, etc.),
valor protéico, resistência a patógenos e tolerância a pragas.
Marcadores moleculares em mandioca
Com esses objetivos instituições como o Instituto Agronômico de Campinas
(IAC) em Campinas-SP, Embrapa Mandioca e Fruticultura (EMBRAPA-
CNPMF) em Cruz da Almas-BA e o Centro Internacional de Agricultura Tropi-
Maria Inez Fernandes Faraldo1;
cal (CIAT) na Colômbia, desenvolvem programas de melhoramento.
Rainério Meireles da Silva1
Os marcadores moleculares constituem ferramentas de grande importância
Akihiko Ando & Elizabeth Ann Veasey2
para a identificação e caracterização dos acessos mantidos pelos Bancos de
Germoplasma de mandioca, cujo principal objetivo é a manutenção da variabi-
lidade genética e, consequentemente, a utilização dos acessos mantidos. Sabe-
6.1. INTRODUÇÃO
se que muitos melhoristas evitam trabalhar com materiais disponíveis nas cole-
ções (genótipos silvestres, etnovariedades, etc..) por falta de identificação e ca-
O capítulo apresenta uma revisão da situação atual da aplicação de técnicas
racterização de genes com potencial para o melhoramento genético (Nass, 2001).
que revelam marcadores moleculares em mandioca. A utilização dessas técni-
As informações obtidas por meio dos marcadores moleculares são muito úteis
cas é bastante empregada em espécies vegetais.
para auxiliar na identificação dos genótipos contrastantes em programas de me-
A mandioca é considerada uma das mais importantes fontes de calorias para
lhoramento, permitindo a análise de genótipos de interesse, a obtenção de infor-
populações de baixa renda, chegando a fornecer 50% das calorias necessárias à
mações relativas à variabilidade existente e a associação com características
dieta alimentar diária. Todas as partes da planta são utilizadas: raízes são em-
fenotípicas. A seleção assistida por marcadores detecta diferenças genético-
pregadas na alimentação humana e animal e na indústria; hastes e folhas (32%
moleculares, representando futuro promissor na agricultura.
de proteína) como fonte de proteína na alimentação humana e animal. Estudos
têm demonstrado a superioridade nutritiva do farelo e feno de folhas e hastes de
mandioca na alimentação bovina, quando comparada com outras culturas.
6.2. MARCADORES ISOENZIMÁTICOS
O Brasil é o segundo produtor mundial com 20,17 milhões de toneladas em
1999, perdendo apenas para a Nigéria que apresentou 32,69 milhões de tonela-
A análise de isoenzimas constitui a maneira mais direta e rápida de avaliar
das no mesmo ano. No Brasil, as Regiões Norte e Nordeste apresentam o maior
genotipicamente muitos locos num grande número de indivíduos. E, no caso da
consumo da mandioca, além de concentrar a maioria das lavouras da cultura.
mandioca, tem sido bastante empregada nos estudos de variação genética. Por
Porém, o maior rendimento médio por hectare é obtido no Estado de São Paulo,
ser marcador codominante, os genótipos individuais podem ser amostrados atra-
nas regiões de Assis, Mogi Mirim e Ourinhos (São Paulo, 1999).
vés de bandas, permitindo a avaliação das freqüências gênicas e genotípicas, da
A produção mundial da mandioca vem crescendo nos últimos anos, porém, o
heterozigosidade observada na amostra e da esperada, do equilíbrio de Hardy-
rendimento médio não tem aumentado nas mesmas proporções, havendo neces-
Weinberg das populações, da proporção de locos polimórficos, dos coeficientes
sidade de aumentar a produtividade e melhorar a qualidade dos produtos para
de endogamia e modelos de isolamento por distância (Alfenas at al., 1998).
atender as exigências do mercado mundial. Dentro desse contexto, os marcadores
A aplicação de marcadores isoenzimáticos tem sido realizada para diferen-
moleculares, contribuem de maneira significativa no sentido de facilitar a sele-
tes finalidades dentro do gênero Manihot. A técnica de eletroforese de enzimas
ção de materiais promissores nos programas de melhoramento, visando aumen-
vem sendo utilizada desde 1950 (Smithies, 1955) com muita eficiência para
estimar e avaliar o grau de variabilidade genética em populações naturais, fluxo
1
Centro de Raízes e Amidos Tropicais – CERAT/UNESP – Botucatu-SP – seccerat@fca.unesp.br. gênico, hibridação, relação filogenética, entre outros. Além disso, a freqüência
2
Departamento de Genética – Laboratório de Ecologia Evolutiva e Genética Aplicada – ESALQ/ dos estudos que utilizam essa técnica vem aumentando e sendo cada vez mais
USP – Piracicaba-SP

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 CULTURAS DE TUBEROSAS AMILÁCEAS LATINO AMERICANAS
aprimorada e aceita, mesmo frente às modernas técnicas moleculares (Hills et
al., 1995). O uso dessa técnica representou salto muito grande nos estudos de
populações naturais de plantas, pois eram realizados com base nas variações
genéticas de caracteres morfológicos, qualitativos e quantitativos (Alfenas et
al., 1991).
Dentro desse contexto, centros nacionais e internacionais de pesquisa em
agricultura têm mostrado grande interesse na caracterização e manutenção de
germoplasma, bem como preocupação em aumentar as coleções com a introdu-
ção de novos acessos. Dentre esses Centros merece destaque o Centro Internaci-
onal de Agricultura Tropical -CIAT, na Colômbia, o Centro de Recursos Gené-
ticos e Biotecnologia -CENARGEN e o Instituto Agronômico de Campinas -
IAC, ambos no Brasil, além da coleção de germoplasma de mandioca do Depar-
tamento de Genética da Escola Superior “Luiz de Queiroz” (ESALQ) da Uni-
versidade de São Paulo. A técnica de eletroforese de enzimas é eficiente e
confiável para a caracterização de material presente nos bancos de germoplasma.
No Brasil, a maior preocupação na preservação do material se localiza na
Bacia Amazônica, onde coletas esporádicas têm sido feitas (Gulick et al., 1983;
Morishima & Martins, 1994).
Ramirez et al. (1987) determinaram o padrão isoenzimático de diferentes
variedades de mandioca, obtido a partir de 16 sistemas enzimáticos, por meio da
técnica de eletroforese de enzimas em gel de poliacrilamida. O padrão enzimático
observado variou conforme o tecido utilizado (folha, raiz, pecíolo e gemas
foliares), apresentando variação no número de bandas. Dos 16 sistemas
enzimáticos analisados, quatro sistemas: fosfatase ácida (ACP), esterase (EST),
aspartato aminotransferase (AAT) e glucose-6-fosfato isomerase (GPI) foram
suficientes para caracterizar o material avaliado, servindo como marcadores
isoenzimáticos.
Hussain et al. (1987), utilizando a técnica de eletroforese de enzimas em gel
de poliacrilamida à 12%, determinaram o padrão isoenzimático específico apre-
sentado pela enzima esterase (EST) na identificação de treze cultivares diferen-
tes de mandioca, com o objetivo de tornar a metodologia rotineira na identifica-
ção das cultivares de mandioca baseado nos padrões isoenzimáticos das esterases.
Grattapaglia et al. (1987), interessados em relacionar dados de genética bio-
química com dados de taxonomia, utilizaram a técnica de eletroforese de prote-
ína solúvel em gel de poliacrilamida com SDS na avaliação de sementes em 19
espécies do gênero Manihot. Concluíram que os perfis eletroforéticos observa-
dos apresentaram correlação com a variabilidade morfológica, hábito de cresci-
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Volume 2 - Agricultura: Tuberosas Amiláceas Latino Americano
mento e distribuição geográfica do gênero.
Lefèvre & Charrier (1993b) descreveram a diversidade isoenzimática de 365
cultivares de M. esculenta e mais 109 acessos de parentes silvestres (M. glaziovii
e híbridos espontâneos) da África. O estudo baseou-se em 17 locos polimórficos.
M. esculenta e M. glaziovii apresentaram baixos níveis de polimorfismo, sendo
a heterozigosidade estimada em 0,225 e 0,252, respectivamente. Para espécies
silvestres, a variação foi detectada em apenas um loco; e as análises multilocos
revelaram padrão geográfico. A organização da diversidade na mandioca culti-
vada não é clara, porém, o estudo baseado em alelos raros e comuns pode levar
à identificação de diferentes grupos de clones com muitos genótipos intermedi-
ários.
A técnica da eletroforese em gel de amido foi utilizada para a avaliação do
nível de polimorfismo isoenzimático em duas espécies do gênero Manihot. Ex-
tratos brutos foram obtidos de folhas não expandidas e de pólen. Foram analisa-
dos 365 cultivares e 109 acessos selvagens, principalmente provenientes da
África. A herança destas enzimas foi examinada utilizando-se 13 progênies intra
e interespecífica. Dezessete locos polimórficos foram observados para os dez
sistemas enzimáticos avaliados, onde foram detectados 59 alelos. Todos os pa-
drões revelados pelas enzimas, mostraram heterogeneidade dissômica e três gru-
pos de ligação foram identificados (Lefèvre & Charrier, 1993a).
Faraldo (1994) caracterizou 30 etnovariedades de mandioca (Manihot
esculenta Crantz) pertencentes a sete diferentes roças localizadas no litoral Sul
do Estado de São Paulo, por meio da técnica de eletroforese de enzimas em gel
de penetrose 30 à 13%. Um total de 12 locos foram identificados, sendo nove
locos polimórficos, pertencentes a cinco sistemas enzimáticos: malato
desidrogenase (MDH), citosol aminopeptidase (CAP), xiquimato desidrogenase
(SKDH), alfa-esterase (Alfa-EST) e aspartato aminotransferase (AAT). O
polimorfismo isoenzimático observado mostrou que populações do litoral apre-
sentaram maior variabilidade que populações do vale. Os parâmetros de
heterozigosidade média estimados demonstraram índice de variação genética
maior nas roças estudadas (H = 0,242) que a média de dados observados na
literatura (H = 0,225). Análises dos dados pelo índice de similaridade genética
através dos métodos “Simple Matching” e “Jaccard” e agrupamento U.P.G.M.A.,
resultaram em quatro grupos fenéticos distintos.
Borsoi Filho (1995) estudou a variabilidade isoenzimática, em tecido de raiz
e folha, de seis cultivares de mandioca (M. esculenta Crantz), em condições
normais, em regime de estresse hídrico e ataque por ácaros (Monony chellus
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 CULTURAS DE TUBEROSAS AMILÁCEAS LATINO AMERICANAS Volume 2 - Agricultura: Tuberosas Amiláceas Latino Americano

tanajoa), concluindo que: 1) os seis sistemas enzimáticos analisados ACP, Autores como Peroni (1998) e Sambatti (1998) também utilizaram a técnica
glutamato oxaloacético (GOT), glutamato desidrogenase (GTDH), leucil de eletroforese de enzimas em gel de amido de milho (penetrose 30 à 13%), para
aminopeptidase (LAP), MDH e peroxidase (PER) foram estáveis em condições caracterizar etnovariedades de mandioca (M. esculenta) em roças de agricultura
normais; 2) os sistemas ACP, MDH e PER não apresentaram padrões alterados tradicional, e para analisar o polimorfismo e a distribuição da variabilidade ge-
quando as plantas eram submetidas às condições de estresses; 3) as cultivares nética. Silva (2000) utilizou marcadores isoenzimáticos (CAP, GPI, SKDH,
Moça-Branca e Sete-Égua foram as que apresentaram maior divergência genéti- glucose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH), AAT, GTDH, ACP e catalase (CAT)
ca, pelo índice de “Jaccard”; 4) o método de Tocher permitiu a formação de em gel de poliacrilamida em gradiente para avaliar a dinâmica de alelos em 56
dois grupos, sendo um deles formado apenas por uma cultivar. etnovariedades de mandioca de diferentes regiões geográficas do Brasil. Consi-
Brondani (1996a) estimou o grau de similaridade genética entre M. esculenta derando 8 locos polimórficos, obteve 91,5% de taxa de cruzamento, confirman-
e três espécies morfológicamente semelhantes: M. flabellifolia, M.peruviana, do ser a mandioca uma espécie preferencialmente alógama. O fluxo gênico mos-
M.pilosa, através de 17 sistemas isoenzimáticos: Xiquimato desidrogenase trou ser efetivo, via grão de polén, entre as etnovariedades das diferentes regi-
(SKDH), LAP, Hexocinase (HK), superóxido dismutase (SOD), ACP, Fosfatase ões geográficas do Brasil (Fig. 6.1).
alcalina (ALP), 6-fosfogluconato desidrogenase (PGD), fosfoglucose isomerase Cabral (2001) utilizou marcadores isoenzimáticos para avaliar a variabilida-
(PGI), aldolase (ALD), Isocitrato desidrogenase (IDH), MDH, Fosfoglucomutase de genética de 200 acessos de mandioca e identificação de acessos duplicados
(PGM), Fosfatase alcalina (AK), GOT, Nicotinamida adenina dinucleotídeo constatando 3% de acessos em duplicata.
desidrogenase (NADHDH), Glucose desidrogenase (GDH) e Nicotinamida O melhorista de mandioca deve ser criativo e saber qual informação quer
adenina dinucleotídeo fosfato desidrogenase (NADPHDH). M. flabellifolia, M. gerar, qual técnica escolher e como irá utilizá-la frente aos avanços nas tecnologias
peruviana e M. esculenta formaram um grupo bastante relacionado, enquanto de análise genômica, cultura de embriões e engenharia genética. Além disso,
que M. pilosa formou um grupo separado. O autor concluiu que é possível fazer técnicas que não utilizam eletroforese como a hibridização de DNA em lâminas
cruzamentos convencionais entre as espécies M. flabellifolia e M. peruviana que contêm moléculas de DNA muito específicas imobilizadas em arranjos sis-
com M. esculenta. Estudos das relações filogenéticas entre estas espécies, a temáticos, chamados de DNA chips estão se tornando disponíveis para estudos
determinação do genoma precursor, o momento da especiação e qual a espécie em mandioca.
que deu origem às outras duas, podem ser realizados através do uso de marcadores
isoenzimáticos, conclui o autor.
Brondani (1996b) utilizando sistemas enzimáticos avaliou dois possíveis hí-
bridos naturais entre espécies do gênero Manihot, concluindo que provavel-
mente o primeiro híbrido natural seria resultante do cruzamento entre M. nana e
M. nogueirae. O segundo híbrido seria resultante da hibridação entre M. hilariana
e M. salicifolia. O índice de similaridade genética de Jaccard mostrou que entre
os indivíduos analisados não havia híbrido natural entre M. nana e M. nogueirae,
mas indícios de ocorrência de híbridos entre M. hilariana e M. salicifolia.
Epperson et al. (1997) utilizaram marcadores isoenzimáticos na avaliação
dos custos de manutenção das coleções de germoplasma de mandioca “in vitro”
e no campo, no Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), constatan-
do que os gastos eram das mesmas proporções, e que a análise isoenzimática
reduzia a possibilidade de incorporar acessos duplicados, diminuindo assim cus-
tos com a manutenção da coleção.

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 CULTURAS DE TUBEROSAS AMILÁCEAS LATINO AMERICANAS
Figura 6.1
Gel corado para a enzima SKDH apresentando 1 loco com 4 alelos em 22
etnovariedades de mandioca (Manihot esculenta Crantz).
Os trabalhos acima mencionados mostram que marcadores isoenzimáticos
podem ser utilizados em estudos de quantificação de níveis de variabilidade
genética, diversidade genética, identificação de acessos duplicados em bancos de
germoplasma, detecção de híbridos naturais, estudos de filogenia e estimativas de
fluxo gênico. Por ser metodologia rápida, de fácil acesso e de custo baixo, facil-
mente adaptável para os diversos organismos e permitir analisar grande número
de indivíduos em muitos locos e ser marcador do tipo codominante (todos os
alelos são evidenciados no gel), continua sendo utilizada nos laboratórios.
6.3. MARCADORES DE DNA E APLICAÇÕES EM ESTUDOS GENÉTICOS DE
MANIHOT (MANDIOCA)
Desde a invenção da eletroforese em gel de amido (Smithies, 1955), da
visualização histoquímica das enzimas em géis de amido e poliacrilamida (Hunter
e Market, 1957), e dos estudos clássicos de Hubby e Lewontin (1966) e Lewontin
e Hubby (1966), uma nova classe de marcadores genéticos foi descoberta: os
marcadores isoenzimáticos. Esse marcador representou um avanço frente às téc-
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Volume 2 - Agricultura: Tuberosas Amiláceas Latino Americano
nicas citológicas e morfológicas, pois não são afetados drasticamente pela
interação com o ambiente. No entanto, apesar da extensiva utilização da técnica
de eletroforese de proteínas, as análises de isoenzimas não se mostravam sufici-
entemente variáveis, necessitando de técnicas mais apropriadas (Arias e Infan-
te-Malachias, 2001).
No fim da década de 60, Linn e Arber (1968) e Meselson e Yuan (1968)
revolucionaram a nascente Biologia Molecular, com a descoberta das enzimas
de restrição (Arias e Infante-Malachias, 2001). As primeiras técnicas que per-
mitiram a detecção de polimorfismo de DNA surgiram na década de 80. A partir
dessa data, técnicas vêm sendo aprimoradas e outras estão sendo criadas visan-
do a simplificação dos procedimentos experimentais, melhorando a resolução
das eletroformas e diminuição dos custos.
Os marcadores de DNA disponíveis, seguindo critérios genéticos, podem ser
classificados em:
6.3.1. MARCADORES DE DNA BASEADOS EM HIBRIDIZAÇÃO, LOCO ESPECÍFI-
CO CODOMINANTE
• Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição – RFLP
O polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição - RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism), descrito no final da década de
70, é um marcador de DNA baseado no padrão de fragmentos produzidos pela
digestão de DNA por meio de endonuclease específica.
O desenvolvimento das técnicas de marcadores de DNA por meio de RFLP
propiciou um avanço significativo no conhecimento da biossistemática, evolu-
ção e genética de plantas e animais. A associação entre a sensibilidade da técni-
ca e a descoberta de regiões com variabilidade, têm possibilitado avanços em
estudos de genética de populações, biogeografia e polimorfismo em populações
de diversos organismos, em particular em populações humanas, onde têm sido
aplicadas na medicina forense, na determinação de paternidade e no diagnóstico
de doenças hereditárias (Arias e Infante-Malachias, 2001).
Os marcadores do tipo RFLP apresentam algumas vantagens em relação aos
marcadores do tipo citológico, morfológico ou isoenzimáticos tais como: a) são
herdados como marcadores mendelianos livres de efeitos pleiotrópicos; b) não
são afetados pelo ambiente; c) podem ser obtidos em número elevado; d.) têm
distribuição aleatória no genoma.
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 CULTURAS DE TUBEROSAS AMILÁCEAS LATINO AMERICANAS
• Polimorfismos de minissatélite
O termo minissatélite significa um tipo de DNA repetitivo freqüentemente
encontrado em organismos eucariotos. Consiste de pequenas seqüências que se
repetem uma ao lado da outra (em tandem) várias vezes, sendo que o número de
vezes que a seqüência se repete varia entre os indivíduos. A variação individual
no número de vezes que determinada seqüência é repetida caracteriza o
polimorfismo genético.
A análise de polimorfismo de minissatélites com sondas de locos múltiplos é
utilizada em medicina forense, em testes de paternidade, identificação de crimi-
nosos e estupradores. Em vegetais, é utilizada na identificação de acessos para
fins de registro de patentes, proteção de cultivares e identificação de material
transgênico.
• Polimorfismos de microssatélites detectados por hibridização
Tautz e Renz (1984) propuseram o termo seqüências simples repetidas (SSR),
para descrever o tipo de DNA freqüentemente encontrado em organismos
eucarióticos, denominado de microssatélites. Como nos minissatélites, o núme-
ro de vezes que uma determinada seqüência (de dois a dez pares de base) se
repete varia de indivíduo para indivíduo, evidenciando o polimorfismo genéti-
co. Microssatélites também podem ser detectados através de PCR (reação da
polimerase em cadeia) além da estratégia de hibridização.
6.3.2. MARCADORES DE DNA BASEADOS EM PCR
A técnica de PCR foi descrita no final da década de 80 por Mullis e Faloona
(1987), que permite obter in vitro várias cópias de um determinado segmento de
DNA.
O desenvolvimento da técnica de PCR aumentou a eficiência de detecção de
polimorfismo em nível de DNA e RNA. Além disso, reduziu o tempo de execu-
ção dos experimentos, custo e complexidade.
A PCR se aplica a vários campos da biologia incluindo genética, botânica,
entomologia, a metodologias para identificação de material transgênico nos ali-
mentos, etc
Atualmente, é técnica amplamente difundida, sendo utilizada em universida-
des, institutos de pesquisas, empresas particulares, e em áreas bastante distin-
tas. Esta técnica, no momento, é a mais utilizada na análise de polimorfismo.
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Volume 2 - Agricultura: Tuberosas Amiláceas Latino Americano
• Loco específico codominante: - Microssatélite
É o marcador molecular que apresenta seqüências curtas que se repetem em
tandem (uma ao lado da outra) em um loco específico e utilizado na análise de
polimorfismo. A natureza da variação é o número de repetições das unidades
repetidas. A estratégia para a análise é amplificação do fragmento que contém
as repetições, utilizando-se como primers, oligonucleotídeos que hibridizam
com as regiões que flanqueiam as repetições (em torno de 20 nucleotídeos). A
técnica também é conhecida como STR (Short Tandem Repeats) ou SSR (Simple
Sequence Repeats).
O fator limitante para o emprego da técnica é a disponibilidade de informa-
ções (em relação às seqüências de nucleotídeos no genoma das plantas) de regi-
ões que possuem repetições para o organismo que deseja estudar. Na falta de
conhecimento dessas seqüências da região do genoma, é necessário a constru-
ção de uma biblioteca genômica do organismo em estudo.
As principais características do uso de microssatélites como marcadores de
DNA são: alta freqüência e ampla dispersão pelo genoma e alta taxa de mutação
a que estão sujeitos, resultando consequentemente, em grande variabilidade; ser
codominante e apresentar segregação mendeliana.
Em relação aos estudos de polimorfismo, duas metodologias podem utiliza-
das: hibridização por sondas que contenham seqüências repetitivas ou amplifi-
cação por PCR de locos contendo microssatélites. A mais empregada é a técnica
PCR. Em estudos de mandioca esse marcador tem sido utilizado principalmente
para detecção de polimorfismo, estudos de evolução, origem e domesticação da
mandioca (Olsen & Schaal, 1999 e 2001), relações filogenéticas (Carvalho et
al., 2000), grau de parentesco entre as espécies silvestres do gênero Manihot e a
cultivada (Cabral et al., 2000), construção de mapas genéticos, caracterização,
estudos de herança e variabilidade (Chavarriaga-Aguirre et al., 2000),
mapeamento do genoma (Fregene et al, 2000), e caracterização e identificação
de acessos e etnovariedades presentes nos bancos de germoplasma (Mühlen,
1999; Carvalho et al., 2001).
Faraldo et al. (dados não publicados) utilizando marcador do tipo
microssatélite, realizaram estudos de variabilidade genética e identificação de
materiais contrastantes e divergentes para serem utilizados em programas de
melhoramento de mandioca (Fig. 6.2).
109
 CULTURAS DE TUBEROSAS AMILÁCEAS LATINO AMERICANAS
Figura 6.2
Gel de microssatélite corado com nitrato de prata: foram avaliados seis primers
(locos) em três etnovariedades, constando polimorfismo genético nos primers
1, 3, 4 e 6. A última linha corresponde ao marcador de 100pb.
Os microssatélites são marcadores moleculares do tipo codominante, ou seja,
todos os alelos são identificados. Por exemplo, se o indivíduo é diplóide, a am-
plificação do loco apresentará uma banda se o indivíduo for homozigoto e duas
bandas se heterozigoto.
O mapa molecular de mandioca está sendo construído a partir da segregação
de marcadores do tipo RFLP, RAPD, isoenzimas, AFLP em genes conhecidos
na geração F2, SSR ou marcadores microssatélites e ESTs (“Expressed Sequence
Tags” ou Etiquetas de Seqüências Expressas). Os marcadores do tipo
microssatélites apresentam maior conteúdo informativo, por apresentar nature-
za multialélica, herança codominante, ampla distribuição no genoma e possibi-
lidade de detectar variações de seqüências por meio de PCR, como RAPD e
AFLP, e podendo ser transferíveis de genoma para genoma dentro da mesma
espécie e entre espécies geneticamente relacionadas (Grattapaglia, 2001).
Normalmente, em mandioca, a metodologia é utilizada para detectar a ligação
entre marcadores moleculares e locos de herança simples ou QTL (“Quantitative
Trait Loci”), envolvendo análises de população F2 e retrocruzamentos que se-
gregam para a expressão do caráter e para os marcadores. O objetivo principal
está relacionado à identificação de genótipos contrastantes para o caráter de
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Volume 2 - Agricultura: Tuberosas Amiláceas Latino Americano
interesse com o loco de marcador molecular.
Neste sentido, pesquisas têm sido desenvolvidas visando o mapeamento de
QTLs em mandioca, com destaque para o CIAT, na Colômbia, com perspectivas
de quantificar a influência de QTL específico na expressão de característica de
interesse.
• Loco não específico dominante: - RAPD
Muitas vezes não dispomos nos laboratórios de técnicas e equipamentos ne-
cessários que permitem o conhecimento das seqüências de nucleotídeos que
flanqueiam a região do genoma a ser amplificada, que apresentam polimorfismo
e que possam ser desenhados para que primers flanqueadores de regiões
repetitivas específicas (microssatélites) possam ser sintetizados de acordo com
espécie de interesse. Essa informação depende da clonagem e seqüenciamento
dessas regiões que representam atividades onerosas e dependentes de tempo.
Nesse caso, existem alternativas que dispensam esse conhecimento. A alternati-
va mais utilizada é o uso de primers arbitrários ou aleatórios cuja composição
pode ter homologia total ou parcial com uma ou mais regiões no genoma, usa-
dos para o marcador molecular do tipo RAPD.
O termo RAPD significa “DNA polimórfico amplificado ao acaso” (em in-
glês: randon amplified polymorphic DNA). O termo AP-PCR, menos utilizado,
significa “PCR com primers arbitrários” (em inglês: arbitrarily primed PCR).
A técnica RAPD baseia-se na amplificação de regiões anônimas dispersas pelo
genoma. O tamanho do primer é menor, normalmente 10 nucleotídeos, que o
utilizado em PCR específico (em torno de 20 nucleotídeos).
O problema da técnica de RAPD é a dificuldade de padronização, uma vez
que deve existir discriminação exata entre a presença de um sítio RAPD que
hibridiza com o primer para que o polimorfismo possa ser detectado. Altera-
ções dos resultados em função das condições do PCR, também são problemas
acarretados no uso dessa técnica. Os principais fatores que afetam o padrão de
bandas são a concentração de MgCl2, de DNA molde e de nucleotídeos na solu-
ção; a temperatura de anelamento; o tipo de polimerase; o tipo de termociclador;
a composição e o comprimento dos iniciadores (Colombo et al., 1997; Mühlen,
1999).
Neste caso, o polimorfismo é caracterizado quando há presença de banda em
um indivíduo e ausência no outro indivíduo, após a amplificação e eletroforese
em gel. Normalmente, o padrão de bandas observado nessa técnica é do tipo
dominante, pois são amplificadas, ao mesmo tempo, mais de uma região do
111
 CULTURAS DE TUBEROSAS AMILÁCEAS LATINO AMERICANAS
genoma, não se fazendo distinção entre bandas provenientes de um mesmo loco
com diferentes alelos e bandas provenientes de diferentes locos (Williams et al.,
1990; Williams et al., 1993; Chalmers et al., 1992). Não se distingue indivíduos
homozigotos dos heterozigotos, ocorrendo amplificação nos dois tipos de indi-
víduos, pois o fenótipo molecular do heterozigoto é semelhante ao do homozigoto,
caracterizado pela vizualização de apenas uma banda.
Em mandioca, esta técnica vem sendo utilizada para avaliar o nível de diversi-
dade genética por Mühlen, (1999); Carvalho et al. (2000); Carvalho et al. (2001);
Colombo et al. (2000) e construção de mapa genético (Fregene et al., 1997).
• AFLP (amplified fragment length polymorphism)
O termo AFLP significa polimorfismo de tamanho de fragmentos amplifica-
dos (“amplified fragment length polymorphism”), inicialmente descrita por Van
Eck et al. (1995) e Vos et al. (1995). A técnica é baseada na amplificação por
PCR de fragmentos aleatórios do genoma, como na técnica de RAPD. A técnica
permite que fragmentos aleatórios do genoma sejam amplificados por PCR após
terem sido originados pela digestão do genoma por enzimas de restrição. As
principais etapas que envolvem a detecção dos fragmentos de AFLP são: a)
digestão do genoma pela enzima de restrição; b) ligação de “adaptadores” aos
fragmentos gerados; c) amplificação dos fragmentos a partir de primers que
hibridizam com os adaptadores.
O emprego do marcador molecular dominante do tipo AFLP em estudos de
mandioca foi usado na detecção de variação e diversidade genética por Colombo
et al. (2001) e Elias et al. (2001).
6.4. PERSPECTIVAS FUTURAS
O melhoramento genético de plantas está relacionado ao grau de variabilida-
de genética disponível nas populações de interesse, possuindo papel fundamen-
tal nos programas de cruzamento e seleção de genótipos promissores. Por isso,
é importante conhecer a maneira como essa variabilidade está distribuída entre
as diferentes populações, e em seus habitats naturais. É essencial conhecer a
estrutura genética e o comportamento reprodutivo das populações, uma vez que
os padrões de distribuição da variabilidade genética estão correlacionados com
o sistema reprodutivo.
Os marcadores moleculares vieram para auxiliar e agilizar os trabalhos de
112
Volume 2 - Agricultura: Tuberosas Amiláceas Latino Americano
melhoramento genético, visto que inicialmente a variabilidade genética era ex-
plorada pela intuição do agricultor Harlan & Wet (1971). O patrimônio genético
acumulado ao longo das gerações passou a ser utilizado com mais freqüência,
provocando mudanças fenotípicas que atendem as necessidades do homem, prin-
cipalmente em mandioca, espécie que faz parte da agricultura autóctone do Bra-
sil.
Os marcadores isoenzimáticos e de DNA permitem comparar avaliações de
variabilidade genética em populações naturais de plantas, proporcionando me-
lhor interpretação da estrutura genética das populações. As técnicas que reve-
lam os marcadores moleculares agilizam a avaliação dos genótipos de interesse.
Segundo Souza (2001), a Biologia Molecular e Celular têm permitido avan-
ços significativos no conhecimento da genética e biologia dos organismos, for-
necendo ferramentas que auxiliam na manipulação dos genótipos. Dessa forma,
consegue-se resultados desejados (genótipos superiores) no melhoramento ge-
nético, em menor espaço de tempo. As técnicas correspondem à utilização da
cultura de tecidos, transformação genética de plantas com genes vindos de ou-
tros organismos (aumenta a variabilidade genética) e utilização de marcadores
moleculares.
Programas de melhoramento em mandioca apresentam fatores limitantes,
que têm retardado o seu avanço. Com o advento da engenharia genética e sua
utilização como “ferramenta” no melhoramento, abriu-se a possibilidade de trans-
ferência de genes relacionados às características desejáveis entre espécies in-
compatíveis (que não se cruzam naturalmente).
O conteúdo cianogênico e o baixo valor nutritivo são características desvan-
tajosas da cultura da mandioca que causam descontentamento tanto na dieta
alimentar como na utilização industrial. Atualmente, a tecnologia de engenharia
genética representa uma ferramenta alternativa para o melhoramento convenci-
onal, como tentativas para aumentar o nível de vitamina A.
O melhorista de mandioca deve ter clareza do objetivo do programa de me-
lhoramento para escolher a técnica molecular a ser empregada e a informação
que será gerada, frente aos avanços na tecnologia de análise genômica e enge-
nharia genética. A tecnologia de análise genômica com a hibridização de DNA
em lâminas contendo moléculas de DNA específicas imobilizadas em arranjos
sistemáticos, chips de DNA, constitui avanço promissor para avaliação de
sequências de DNA que influenciam os caracteres morfológicos.
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 CULTURAS DE TUBEROSAS AMILÁCEAS LATINO AMERICANAS
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