Modos Cromatográficos

Troca iônica Interação hidrofóbica

Afinidade Exclusão por tamanho

Cromatografia de Exclusão por Tamanho

Partículas esféricas de gel de filtração

(ou de exclusão por tamanho)
empacotadas em uma coluna
 Cromatografia de Exclusão por Tamanho

• Princípio básico da cromatografia de exclusão por tamanho (CET)

Moléculas de menor tamanho molecular penetram nos poros do

gel e, dessa forma, percolam o leito com menor velocidade de
migração sendo eluídos em tempos longos

Moléculas de tamanho molecular intermediário penetram alguns

poros do gel, apresentando tempos de eluição mais reduzidos

Moléculas de maior tamanho molecular não penetram nos poros

do gel e, dessa forma, percolam o leito com maior velocidade de
migração sendo eluídos em tempos curtos

Esquema básico da cromatografia de exclusão por tamanho

 Cromatografia de Exclusão por Tamanho

• Principais aplicações
– Separação de grupos
Remoção de contaminantes de alta ou baixa massa molar
Dessalinização
Troca de soluções tampões

– Fracionamento de alta resolução de biomoléculas

Isolar um ou mais componentes
Separar monômeros de agregados
Determinar massa molar
Análise de distribuição de massas molares

Matrizes comerciais cobrem a faixa de massas molares de 100 a 80 milhões de Da, indo
de peptídeos a complexos protéicos.
 Cromatografia de Exclusão por Tamanho

• Ampliação de escala
– Em laboratório são empregadas colunas com comprimento de 20 a 40
vezes maior que seu diâmetro

– Ampliação de escala para operação comercial, o diâmetro da coluna é

aumentado ao invés de seu comprimento

– Uma vez que a CET é fundamentalmente baseada nas taxas de difusão

das moléculas no interior das partículas da fase estacionária, as
colunas de CET são geralmente as maiores em uma planta industrial

– Escalonamento para processos industriais – uso de múltiplas colunas

conectadas em série
 Cromatografia de Exclusão por Tamanho

• Tipos de fases estacionárias

– O termo “gel” infere material elástico, contendo água – estrutura
tridimensional cuja estabilidade mecânica é dada pelo material
contendo ligações cruzadas
– Géis hidrofílicos reticulados – amostras solúveis em soluções aquosas
– Matrizes a base de poliestireno – amostras não aquosas
– Faixa de seletividade ou faixa de fracionamento

Agarose com ligações cruzadas

Dextrana
 Cromatografia de Exclusão por Tamanho

Alguns tipos de matrizes comercialmente disponíveis para CET

Fabricante Nome comercial Tipo de matriz
Sephadex Dextrana
Sephacryl Dextrana/Bisacrilamida
Sepharose Agarose
GE Healthcare Sepharose CL Agarose reticulada
Superdex Agarose/dextrana
Superose Agarose altamente reticulada
Ultrogel AcA Agarose/poliacrilamida
Biosepra S.A.
Trisacryl Polímero de acrilamida
Biogel A Agarose
Bio-Rad Laboratories
Biogel P Poliacrilamida
Pierce Chemical Company Glycophase CPG Sílica
 Cromatografia de Exclusão por Tamanho

• Fatores a serem considerados

- Diâmetro da partícula
Partículas pequenas minimizam os efeitos de alargamento das
bandas, porém são mais compressíveis e limitam a faixa de vazão
de trabalho
Partículas grandes e rígidas suportam maiores vazões, sendo mais
apropriadas para operações em larga escala

- Faixa de fracionamento
Massa molar da proteína (ou biomolécula-alvo)
Massa molar dos contaminantes

- Diluição da amostra

- Estabilidade e inércia química

 Cromatografia de Exclusão por Tamanho

• Seletividade do gel
- A seletividade de um gel é propriedade inerente do material

- O volume de separação da coluna é limitado pelo volume total de

poros do leito empacotado
 Cromatografia de Exclusão por Tamanho

• Coeficiente de distribuição
Coeficiente de distribuição ou fração
da fase estacionária disponível para a
difusão de um dado soluto:
Na CET, em termos ideais, a molécula do
Ve − V0
kd = soluto não deve eluir com kav maior que
Vs 1 ou menor que 0 (0 < kav < 1).
Coeficiente de distribuição ou fração kav > 1, possivelmente ocorrerá algum
de volume do gel disponível para a tipo de interação adsortiva entre o
difusão de um dado soluto: soluto e a matriz do gel
Ve − V0 kav < 0, possivelmente o leito
kav =
Vt − V0 cromatográfico apresentará caminhos
preferenciais e deve ser reempacotado
Ve – volume de eluição; V0 – volume
de vazios ou de exclusão da coluna;
Vs – volume da fase estacionária; Vt
– volume total da coluna
 Cromatografia de Exclusão por Tamanho

• Faixa útil de separação e determinação de massa molar

kd = a + b log M

Variação do coeficiente de distribuição (kd) com o logaritmo da massa molar

(log M) dos compostos
Cromatografia de Troca Iônica
 Cromatografia de Troca Iônica

• Princípio básico da cromatografia de troca iônica (CTI)

- Na CTI a fase estacionária é altamente

carregada, sendo que os solutos com cargas de
Sentido do fluxo da fase móvel

sinais contrários a esta são seletivamente

adsorvidos da fase móvel
- A separação é feita de acordo com as diferenças
no equilíbrio entre os íons da fase móvel e os
íons da fase estacionária
- Matrizes trocadores aniônicos – adsorvem
proteínas com carga líquida negativa
- Matrizes trocadores catiônicos – adsorvem
Esquema básico da proteínas com carga líquida positiva
cromatografia de troca iônica
 Cromatografia de Troca Iônica

• Princípio básico da cromatografia de troca iônica (CTI)

– Contra-íons (íons de substituição), grupos carregados de baixa massa
molar

– Contra-íons mais empregados para trocadores catiônicos:

Na+ e H+

– Contra-íons mais empregados para trocadores aniônicos:

Cl- e OH-

– São classificados segundo as forças de interação com seus respectivos

grupos ionogênicos
 Cromatografia de Troca Iônica

• As resinas podem ser constituídas pelos seguintes materiais:

- Resinas ou polímeros hidrofóbicos de poliestireno ou parcialmente
hidrofóbico de polimetacrilato
- Polímeros macroporosos hidrofílicos naturais ou sintéticos, como
poliacrilamida, celulose, dextrana e agarose
- Polímeros macroporosos hidrofílicos sintéticos constituídos por esferas
rígidas ou moderadamente rígidas apropriadas para operação a alta
pressão
- Partículas não porosas

O pH de estabilidade da proteína desejada deve ser considerado na selação

do grupo funcional.
Se a proteína for mais estável abaixo do seu pI, utiliza-se uma troca catiônica
Se a proteína for mais estável acima do seu pI, utiliza-se uma troca aniônica
 Cromatografia de Troca Iônica
Grupos funcionais usados em trocadores iônicos
Estrutura Nome Designação pKa

Ânions fortes
-CH2N+(CH3)3 Trimetilaminometil TAM -
-C2H4N+(C2H5)3 Trietilaminoetil TEAE 9,5
-C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3 Dietil-2-hidroxipropil aminoetil QAE -
Ânions fracos
-C2H4N+H3 Aminoetil AE -
-C2H4NH(C2H5)2 Dietilaminoetil DEAE 9,0 a 9,5
Cátions fortes
-SO3- Sulfonato S 2,0
-CH2SO3- Sulfometil SM -
-C3H6SO3- Sulfopropil SP 2,0 a 2,5
Cátions fracos
-COO- Carbóxi C -
-CH3COO- Carboximetil CM 3,5 a 4,0
 Cromatografia de Troca Iônica

• Fases móveis:
- A fase móvel é, em geral, aquosa e as propriedades dos eletrólitos
presentes contribuem para dissociação de grupos ionogênicos

- Podem ser constituída por soluções ácidas, básicas ou tampões e

adicionadas de sais neutros ou solventes orgânicos

- Fase móvel deve ser tamponada para evitar flutuações no valor do pH

Evitar desnaturação de proteínas

Determinar a carga líquida superficial de proteínas de modo a

promover o equilíbrio entre a resina e a fase móvel
 Cromatografia de Troca Iônica

Tampões comumente utilizados na troca-iônica de proteínas

Tipo de trocador Tampão pK Faixa de tamponamento

Cátions Acético 4,76 4,8-5,2

Cítrico 4,76 4,2-5,2
Fosfato 6,15 6,7-7,6
Ânions Imidazol 7,00 7,3-7,7
Trietanolamina 7,77 7,5-7,7
Dietanolamina 8,80 8,4-8,8
 Cromatografia de Troca Iônica

• Força iônica de adsorção e eluição

- A força iônica do tampão empregado na troca-iônica é usada para
controlar o grau de bloqueio dos grupos ionogênicos da proteína a ser
purificada

- Quando a concentração desses íons em solução é baixa, as proteínas

se ligam às cargas opostas do trocador iônico por seu grupos
eletricamente carregados

- Na etapa de adsorção deve ser usada a menor força iônica que

permita a máxima adsorção da proteína à matriz

- Na etapa de eluição deve ser usada a maior força iônica possível para
dessorção
 Cromatografia de Troca Iônica

Equilíbrio
Matriz Tampão com Absorção
baixa força Resina de TI equilibrada
iônica com tampão de
Grupos iônicos
equilíbrio
carregados
positivamente

Tempo/volume

Aplicação da amostra Proteínas de cargas

Absorção opostas aos grupos
Proteínas iônicos da resina de TI
carregadas começam a serem
negativamente concentradas na coluna.
Proteínas não
carregadas, ou aquelas
Proteínas
com a mesma carga da
carregadas
resina são eluídas
positivamente Tempo/volume durante a alimentação
ou neutras

Etapa de equilíbrio e adsorção na CTI

Cromatografia de Troca Iônica

Eluição 1
Aumento na força iônica
Absorção (utilizando um gradiente)
desloca as proteínas ligadas
devido a competição dos íons
presentes no tampão pelos
sítios de ligação

Tempo/volume

Eluição 2
Absorção
Um aumento gradativo na força
iônica desloca as proteínas
carregadas moderadamente na
matriz

Tempo/volume

Etapa de eluição na CTI

Cromatografia de Troca Iônica

Eluição 3
Absorção

Tempo/volume

Lavagem
Absorção
Lavagem final com elevada
força iônica remove qualquer
proteína ligada ionicamente
antes do re-equilíbrio

Tempo/volume

Etapa de eluição e equilíbrio na CTI

Cromatografia de Interação Hidrofóbica
 Cromatografia de Interação Hidrofóbica

• Princípio básico da cromatografia de interação hidrofóbica (CIH)

- A CIH é uma técnica simples em que a
biomolécula-alvo em solução salina é
adsorvida em suporte hidrofóbico e depois
eluída por um agente tensoativo
- Entende-se por IH a tendência de grupos
alifáticos ou outras estruturas apolares a se
associarem quanto presentes em meio aquoso
- A intensidade da propriedade hidrofóbica pode
ser aumentada artificialmente agregando-se
sais à solução
- Intensidades hidrofóbicas aumentam com o
Esquema básico da aumento na concentração de sal
cromatografia de interação
hidrofóbica
 Cromatografia de Interação Hidrofóbica

• Princípios do método
– A CIH baseia-se na interação hidrofóbica ou na associação entre a
biomolécula-alvo e ligantes hidrofóbicos imobilizados em suporte
sólido

– Os adsorventes hidrofóbicos típicos incluem cadeias alifáticas lineares

de C4, C6, C8, C10

– A ligação é induzida sob elevadas concentrações salinas, as quais

reduzem a solubilidade de proteínas, bem como o aumento do nível
de entropia na camada de moléculas de água que envolvem os grupos
hidrofóbicos

∆G = ∆H − T∆S
A interação ligante hidrofóbico-proteína é
termodinamicamente favorável
 Cromatografia de Interação Hidrofóbica

• Seleção das condições de operação em CHI

– A CIH tem como principal desvantagem a baixa resolução

– A CIH tem como grande vantagem a elevada capacidade de adsorção

(mesma ordem da CTI), em torno de 10 a 100 mg/cm3

– O emprego da CHI é ideal quando esta é empregada logo após a

precipitação por sal, em que a força iônica da amostra aumentará as
interações hidrofóbicas

– No processo de eluição não há necessidade de troca do tampão da

amostra, desde que reduza a concentração de sal no meio
 Cromatografia de Interação Hidrofóbica

• Eluição em matrizes hidrofóbicas

– Redução da força iônica usando gradiente salino decrescente de
eluição

– Aumento do pH favorece o ganho de carga negativa e tornando as

proteínas mais hidrofóbicas sob condições levemente alcalinas

– Reduzindo a temperatura

– Métodos de deslocamento por adição de um componente que tenha

uma atração mais forte pelo ligante ou torna a proteína mais
hidrofílica (álcoois alifáticos, aminas alifáticas, detergentes iônicos)
Cromatografia de Afinidade
 Cromatografia de Afinidade

• Princípio básico da cromatografia de afinidade (CA)

- A CA distingue-se dos outros métodos por
basear-se nas propriedades biológicas ou
funcionais das espécies que interagem:
proteína a ser separada e a fase estacionária
- A separação por CA depende altamente das
interações altamente específicas entre os
pares de materiais biológicos: enzima-
substrato, enzima-inibidor, antígeno-anticorpo
- Ligante imobilizado em um suporte insolúvel
(matriz porosa) adsorve seletivamente o seu
respectivo par
Esquema básico da
cromatografia de afinidade
 Cromatografia de Afinidade
• Princípios básicos da CA
– Técnica altamente específica
(seletiva)
– Alta capacidade
– Aplicação em qualquer estágio
do processo downstream,
porém dispendiosa
– Recomendada após a remoção
ou redução dos contaminantes
por métodos mais econômicos
• Vantagens e desvantagens
– Alta resolução, alta recuperação
e alta especificidade
– Utilização de grande volume de
amostra
– Purificação de proteínas a partir
de misturas biológicas em
apenas uma etapa
– Separação de formas nativas de
formas desnaturadas da mesma
proteína de interesse a partir de
grande quantidade de outras
proteínas contaminantes
 Cromatografia de Afinidade

• O suporte da matriz sólida para CA deve possuir as seguintes

propriedades:
- Não deve interagir com proteínas (ou adsorbatos) em geral

- Deve ter boas propriedades mecânicas, de forma a manter constante a

vazão nas etapas de eluição e lavagem

- Deve possuir um volume de poros elevado, com poros grandes o

suficiente para permitir fácil adsorção da proteína-alvo

- Deve ter um número suficiente de grupos ativos que são essenciais

nas ligações covalentes cruzadas

- Deve ser mecânica e quimicamente estável para o tratamento químico

de modificação e variação das condições de operação
 Cromatografia de Afinidade

• Tipos de matrizes: • Tipos de ligantes:

– Agarose – Corantes

– Celulose – Polissacarídeos ou
polinucleotídeos
– Dextrana

– Poliacrilamida – Íons metálicos imobilizados

– Proteínas

O ligante deve ter ligação de afinidade específica e reversível com a substância a ser
purificada e grupos modificados que permitam o acoplamento à matriz sem peeder
sua atividade
 Cromatografia de Afinidade

Adsorção da
amostra e Lavagem
Equilíbrio eluição do do material Eluição Re-equilíbrio
material não- não-retido
retido

Tampão
Absorbância

Aplicação da de
amostra eluição

Volume da coluna (CV)