CLONAGEM DO DNA:

NOÇÕES BÁSICAS
Adrielly Rodrigues
1. CLONAGEM MOLECULAR
Processo de construção de moléculas de DNA recombinante e
da sua propagação em hospedeiros apropriados que
possibilitam a seleção do DNA recombinante.

OUTROS NOMES:

DNA recombinante, clonagem gênica ou manipulação gênica

 1. CLONAGEM MOLECULAR
DNA RECOMBINANTE

Inserto + Vetor de clonagem

CÉLULA HOSPEDEIRA

Introdução por transformação

 1. CLONAGEM MOLECULAR
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Endonucleases de restrição-
Reconhecem uma sequência de bases
específica na hélice dupla do DNA e
cortam ambas as fitas da hélice, em
lugares determinados

DNA- LIGASE
Catalisa a formação de uma ligação
fosfodiéster entre as duas moléculas.
1. CLONAGEM MOLECULAR
Isolar o gene de interesse
1. CLONAGEM MOLECULAR
UNIR O GENE AO VETOR: DNA RECOMBINANTE
1. CLONAGEM MOLECULAR
TRANSFORMAÇÃO
1. CLONAGEM MOLECULAR
SELEÇÃO DOS CLONES RECOMBINANTES
 2. VETORES
Caracteristicas do vetor na clonagem gênica
Capacidade de replicar dentro da célula hospedeira, de maneira
que numerosas cópias da molécula de DNA recombinante
possam ser produzidas e transmitidas para as células-filhas
Sequências permitindo a sua replicação autônoma dentro da
célula hospedeira.
Um sítio único de clonagem
Sítio múltiplo de clonagem
Forma ideal com menos que 10 kb de tamanho
QUEM SÃO?

P LA SMÍD IO S

Plasmídeos são moléculas de DNA circular, de fita dupla,

extracromossômicas e que possuem capacidade de
replicação autônoma.
 P LA SMÍD IO S
Características
Os primeiros vetores desenvolvidos
Derivados de plasmídeos de bactérias e leveduras
Aumentam o seu número para centenas de cópias
Transportam genes que são marcadores genéticos
auxotrófico, utilizados como forma de distinguir as células
hospedeiras que receberam o vetor daquelas que não
receberam.
Mapas dos plasmídeos pUC18/19

O gene que codifica

resistência à ampicilina

A origem de replicação
do DNA plasmidial

Gene lacZ'

2.643 pb
QUEM SÃO?
O BA CT E R IÓ FAG O Λ

São vírus de bactérias capazes de

replicação autônoma.
FAGO INFECTIVO
CA P SÍD E O + CAU D A + D NA

As proteínas do fago são

produzidas separadamente, a
partir do DNA viral que está
replicando.
EMPACOTAMENTO DO DNA DO FAGO
Concatâmeros, que são formadas por uma série de genomas virais.

Sítios ou sequências cos (12 pb, devem ser repetidas a cada 35 a 50 kb)

Stuffer (do inglês to stuff rechear)

DNA exógenos

λEMBL4
Representação esquemática do vetor λEMBL4

O fragmento central (stuffer), de

14 kb, pode ser substituído por
fragmentos de DNA de 9 a 24 kb.
QUEM SÃO?

COS MÍD E O S
São plasmídeos bacterianos que possuem: uma origem de
replicação, uma marca de resistência a antibiótico, um ou
mais sítios de clonagem e as sequências cos do bacteriófago
lâmbida.
COS MÍD E O S

Usados preferencialmente em clonagem de fragmentos

maiores.
O reconhecimento de sítios cos requer segmentos de DNA,
de pelo menos 35 a 50 kb entre dois sítios cos adjacente.
Produz recombinantes, que podem ser empacotados nos
capsídeos do bacteriófago lâmbida e são utilizados para
infectar células de E. coli.
VETOR
QUEM SÃO?
CROMOS S O MO S AR T IFIC IAIS B AC TE R IANOS
Permitem a clonagem de fragmentos longos (maiores
que 300 kb).
Origem de replicação de baixissima cópia (1)
Plasmídeo F. (genes par)
Fragmentos de DNA maiores que 300 kb podem ser
clonados no vetor e mantidos estavelmente na bactéria
hospedeira.
QUEM SÃO?
CROMOS S O MO S AR T IFIC IAIS D E LE VE D UR A
Permitem a clonagem de fragmentos muito longos (100
kb a 1000 kb).
Plasmídeos (pYACs) que contêm marcadores genéticos
para seleção (TRP1 e NEO) e componentes funcionais de
um cromossomo eucariótico.
Elementos para a replicação autônoma (ARS)
Um centrômero (CEN).
Telômeros (TEL)
3. INTRODUÇÃO DO DNA RECOMBINANTE
EM BACTERIAS
Análise de características.
Transformação: absorção de fragmentos de DNA presentes
no meio.
Introdução da molécula de DNA recombinante em uma
célula que será replicada, produzindo muitas cópias da
molécula.
Existem inúmeros métodos para a introdução de DNA em
células hospedeiras
 TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA
Mandel e Higa, em 1970.

cloreto de cálcio cloreto de cálcio Transfectadas

Bactérias Bactérias com DNA do
DNA DNA bacteriófago

Tratamento induz a um estado de “competência”.

105 -106 colônias transformadas por micrograma de DNA plasmidial.
Em E. coli com mais técnicas é aumentada de 100 a 1.000 vezes.
 TRANSFORMAÇÃO POR ELETROPORAÇÃO

Glicerol 10%
Células tratadas em
Bactérias
baixa concentração
salina DNA

Campo elétrico faz abrir pequenos poros na membrana celular e propicia a

entrada do DNA na célula.
Mais eficiente, pode chegar a 109 -1010 transformantes por micrograma de
DNA
TRANSFECÇÃO COM DNA DE FAGO
Gene bacteriano lamB (receptores)
Adsorção tanto em temperatura
ambiente como a 37ºC.
Penetração e o cliclo lítico não
ocorre de forma eficiente em
temperatura ambiente.
Placas de lise

Maltose
SELEÇÃO DE TRANSFORMANTES

Marca de seleção no plasmídeo

Nova característica para a célula

IDENTIFICAÇÃO DE RECOMBINANTES

DNA recombinantes (vetor com inserto)

Moléculas de vetor que se religaram (vetor vazio),

Não foram clivadas (vetor selvagem)

 PCR

Reação em cadeia da polimerase

Doenças infecciosas

Doenças genéticas
 BIBLIOTECA DE DNA
Bibliotecas genômicas
 BIBLIOTECA DE DNA

Bibliotecas de cDNA
 BIBLIOTECA DE DNA
Seleção de clones em bibliotecas

Seleção imunológica

DICA DE SÉRIE
Seleção Artificial- Netflix
 Créditos e imagens
Apresentadado por Adrielly Rodrigues, Rômulo
Rouseel e Samuel Santos, discentes do IFCE Paracuru.

ZAHA, A. (org) Biologia Molecular Básica . Artmed.

407p, 2014.