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PROFESOR GUÍA:
Sra. BLANCA ESCOBAR MIGUEL
MIEMBROS DE LA COMISIÓN:
Sra. ORIANA SALAZAR AGUIRRE
Sr. TOMÁS VARGAS VALERO
Santiago de Chile
Abril, 2007
RESUMEN DE LA MEMORIA
PARA OPTAR AL TÍTULO DE
INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA
POR: KATHLEEN HOLZER SCHAA
FECHA: MARZO 2006
PROF.GUÍA: SRA. BLANCA ESCOBAR
Los más importantes, mi familia. Mis papás, por aguantarse todas mis crisis, mis dudas y
mis cambios de humor (especialmente cuando tenía una prueba para la cual estudiar o un trabajo
que entregar), gracias por su paciencia y amor. Mis hermanos, Heilkki (mi “mellizo”) y Karen
(mi “hermanita chica”) nuestras peleas no tienen comparación, sin ellas no seríamos los mismos,
gracias por hacerme reír. Y mi “cuarta hermana” Angélica, te quiero mucho. Ustedes son lo más
importante para mí.
A mi profesora guía, Blanquita, gracias por todo el tiempo, por ser tan preocupada de mi
trabajo, por sus consejos y nuestras conversaciones. Aprendí mucho con usted.
A mis amigos y compañeros. Los más antiguos, los que entraron a la Escuela conmigo,
gracias por todo Ha Nui y Magaly, ustedes sí que me entienden. Mis compañeros BT, gracias por
hacer de las clases un momento agradable, me reí mucho con ustedes, hicieron que fuera más
fácil y más entretenido terminar la carrera. Y mis amigas químicas, Gabriela, Carmina y Perla, lo
hemos pasado bien, no? Sobre todo en nuestros paseos en Buin.
Gracias a todos.
1
ÍNDICE
5 ANEXOS...........................................................................................65
5.1 ANEXO I. COMPOSICIÓN DE REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO...............65
5.2 ANEXO II. MÉTODOS .............................................................................................68
5.2.1 Electroforesis en gel de agarosa ..........................................................................68
5.2.2 Protocolo determinación de fierro .......................................................................68
5.3 ANEXO IV. CEPAS UTILIZADAS EN EL DISEÑO DE PRIMERS ........................69
5.3.1 Acidithiobacillus thiooxidans..............................................................................69
5.3.2 Sulfobacillus thermosulfidooxidans.....................................................................71
5.4 ANEXO V. TABLA DE NMP ...................................................................................72
5.5 ANEXO VI. FECHA DE RECEPCIÓN DE MUESTRAS..........................................73
6 BIBLIOGRAFÍA..............................................................................74
3
1 CAPÍTULO I: Introducción
1.1 INTRODUCCIÓN
Durante los últimos 50 años la vida útil de las reservas mundiales conocidas de cobre se
han mantenido constantes. La discusión planteada hoy en día no es el agotamiento de las
reservas, si no la capacidad de innovación en tecnologías que permitan satisfacer la demanda del
mineral. La demanda de cobre total para el siglo XXI se estima en 5 mil millones de toneladas,
unas 10 veces la producción del siglo XX. En este escenario Chile juega un rol fundamental con
un 35% de la producción mundial. Preservar el liderazgo obtenido dentro de la producción
minera significaría aumentar la producción a 11.5 millones de toneladas para el año 2050, lo que
pasaría por incentivar la creación de nuevas tecnologías de producción competitivas,
involucrando a toda la producción privada. Una de estas tecnologías es el proceso de
Biolixiviación, la cual tiene un rol cada vez más importante dentro de la industria minera.
Las reservas minerales disminuyen en ley y contenido de óxidos a través del tiempo,
aumentando la cantidad de sulfuros, lo que hace más difícil la extracción con tecnologías
convencionales. Todo este material sulfurado cuyo contenido de cobre no es posible recuperar,
ha sido considerado de descarte por décadas. La biolixiviación, practicada industrialmente desde
1960 para el tratamiento de minerales de baja ley en botaderos (dump leaching), permite el
tratamiento de este material y ha permitido incorporar como reservas los millones de toneladas de
minerales de descarte acumulados en diversas minas de cobre del mundo [1]. La contribución de
la biolixiviación es estimada en un 15% a la producción mundial total de cobre [2].
4
pero muy lenta. Sin embargo el proceso es fuertemente catalizado ante la presencia de ciertos
microorganismos que están presentes en la microflora natural del mineral, esto es lo que se
denomina biolixiviación [1].
La microflora natural del mineral es variada, desde bacterias mesófilas y termófilas que
oxidan hierro y azufre, sólo hierro o sólo azufre, hasta arqueas. Las bacterias involucradas son
microorganismos acidófilos, autótrofos y quimiolitrótofos, es decir viven a pH bajo, ocupan
5
como fuente de carbono CO2 y obtienen su energía de la oxidación de compuestos inorgánicos
(como el Fe y el S). El más común (encontrado en mayor cantidad, el más estudiado y utilizado)
en procesos industriales de biolixiviación es la especie Acidithiobacillus ferrooxidans. Sin
embargo existen muchas otras que de acuerdo a las condiciones del medio del proceso
predominarán sobre la anterior [4].
6
1.2 ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
A pesar de una serie de mecanismos nuevos que se han propuesto, aún continua
estudiándose ambos mecanismos para una mejor comprensión del proceso. A continuación se
describe cada uno de los mecanismos.
MS + 2O2 bacterias
→ MSO4
7
La adherencia de las bacterias al mineral es una condición necesaria para la lixiviación.
Sin embargo, no es una condición suficiente en sí misma debido a la existencia de un mecanismo
alternativo: el indirecto. Las bacterias libres en solución pueden secretar un oxidante al medio
que lixivia al mineral en forma alternativa al propio mecanismo directo.
MS + 2 Fe 3+ → M 2 + + S + 2 Fe 2 +
Por otro lado, la oxidación del ión ferroso y del azufre elemental catalizada por la acción de
bacterias se lleva a cabo según las siguientes reacciones:
1
2 Fe 2+ + O2 + 2 H + bacterias
→ 2 Fe 3+ + H 2 O
2
3
S + O2 + H 2 O bacterias
→ 2 H 2 SO4
2
Para la explicación de este mecanismo, en los últimos años distintos investigadores han
tratado de proponer modelos que aclaren su funcionamiento. Así los trabajos del grupo de W.
Sand en la Universidad de Hamburg [6] son muy interesantes. Según este modelo los iones
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férricos y/o los protones son los únicos agentes que disuelven el sulfuro, por lo tanto, el
mecanismo es estrictamente indirecto. Por otro lado, el modelo afirma que las funciones de las
bacterias son: regenerar los iones férrico y/o los protones; y concentrar estos iones en la interfase
mineral/agua o mineral/célula bacteriana para favorecer la degradación del mineral. También
proponen la formación de una capa fina de exopolímeros (EPS) que rodea las células, en la cual
se llevan a cabo los procesos químicos que producen la degradación del sulfuro (Figura 1).
Basándose en los compuestos intermediarios, diferencian dos tipos de mecanismo indirecto: vía
tiosulfato y vía polisulfuro.
Figura 1. Diagrama esquemático de las reacciones involucradas en el proceso de lixiviación a través de la superficie
que rodea al mineral, llamada exopolisacárido (EPS).
Aquí la solubilización del metal se produce gracias al ataque del ión férrico sobre el
mineral sulfurado, donde el tiosulfato es el principal compuesto intermedio y el sulfato el
principal producto final. La reacción sobre calcopirita procede de la siguiente manera:
9
Mecanismo del polisulfuro
En este caso la solubilización del metal sulfurado es una combinación del ataque de
protones y del ión férrico, donde el azufre elemental es el principal compuesto intermedio. Este
azufre elemental es relativamente estable, pero puede ser oxidado a sulfato por la acción de
microorganismos azufre-oxidantes. Así la reacción procede de la siguiente manera:
Esto explica por qué algunas bacterias como Acidithiobacillus thiooxidans son capaces de
oxidar sólo algunos minerales sulfurados. Por otro lado, el ión ferroso producido durante el
proceso puede ser reoxidado por la acción de microorganismos hierro-oxidantes a ión férrico.
10
Una gran variedad de microorganismos participan en la oxidación de minerales
sulfurados, los que constituyen la microflora natural de estos minerales. Es decir, coexisten
distintos microorganismos cuyo metabolismo aporta los elementos necesarios para el desarrollo
de cada uno de ellos. Estos tienen varias características en común: son quimiolitótrofos (ocupan
compuestos inorgánicos como fuente de energía (azufre reducido o Fe+2), son autótrofos (CO2
como fuente de carbono), son acidófilos (pH óptimo está en un rango de 1.6 a 2) y de acuerdo a
la temperatura a la que pueden desarrollarse se dividen en mesófilos, termófilos moderados y
termófilos [4, 7].
Aunque está claro que existe una gran variedad de microorganismos involucrados, los más
importantes en el proceso de biolixiviación, y de los que se tiene mayor conocimiento son
principalmente bacterias, entre ellas: Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum ferrooxidans,
Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus termosulfidooxidans. Y también algunas arqueas:
Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus metallicus, etc. [4]. Se describen a continuación las
principales características de las especies lixiviantes que involucra este estudio:
Durante años se ha utilizado como único método de detección la técnica de cultivo, el que
es eficiente en detectar el microorganismo más estudiado en procesos de biolixiviación:
Acidithiobacillus ferrooxidans. Sin embargo, hay estudios que sugieren que existen otras especies
que jugarían un papel importante en el proceso como Leptospirillum ferrooxidans y Sulfobacillus
thermosulfidooxidans, especies que requieren mucho tiempo para crecer en medio sólido o que
son incapaces de formar colonias [9]. Por otro lado, la dificultad de aislar las cepas desde un
conjunto de microorganismos con requerimientos metabólicos semejantes, hace que los métodos
tradicionales sean insuficientes en describir la población microbiana de un sistema complejo. Las
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técnicas moleculares e inmunológicas han sido desarrolladas para poder detectar y cuantificar
grupos filogenéticos específicos de microorganismos, lo que es importante para entender la
dinámica poblacional del sistema.
Métodos convencionales
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Estas técnicas presentan una serie de desventajas y dificultades, que acarrean
principalmente mayores tiempos de trabajo. En primer lugar, las técnicas de cultivo requieren
largos tiempos de espera y monitoreo de las muestras, además de la dificultad de cultivar
microorganismos que no crecen en medio sólido [8]. En segundo lugar, el cultivo de
microorganismos no permite la identificación de una especie filogenética específica, si no que
aisla microorganismos de acuerdo a sus necesidades nutricionales: hierrooxidantes o
azufreooxidantes. Por último, esta técnica no entrega una visión acabada de la población nativa
de la solución de proceso al utilizar medios con composición diferente a la de origen. Esto
privilegia el crecimiento de un microorganismo por sobre otro o simplemente algunas especies no
son capaces de crecer. Todas estas dificultades son obstáculos para la posterior cuantificación,
siendo la etapa de cultivo la etapa previa necesaria.
Métodos inmunológicos
Sin embargo presentan una serie de desventajas como son el alto costo asociado y los
múltiples serotipos que existen por especies, de los cuales hay una gran cantidad para los que no
existen anticuerpos asociados.
14
Métodos moleculares basados en el DNA.
15
Los métodos de amplificación presentan una sensibilidad superior a las técnicas de
hibridación. Por esto su uso se ha hecho común en la detección de diversos microorganismos de
distintos ambientes microbianos. Sin embargo, existe una técnica de hibridación cuantitativa,
FISH (Fluorescente in situ hybridization), mediante la cual no es necesario extraer el material
genético y que detecta DNA o RNA que se encuentra en la célula de la especie a identificar. La
secuencia de prueba es marcada con un compuesto fluorescente por lo tanto, las células con
secuencias complementarias al DNA de prueba pueden ser visualizadas en microscopios de
epifluorescencia. Se trata de una técnica que entrega información acerca de la diversidad
bacteriana de la muestra además del aporte de cada especie, que no depende de extracción de
DNA; sin embargo, es una técnica laboriosa y de gran consumo de tiempo.
Por último, las técnicas asociadas a PCR para la identificación del gen 16S rDNA son
ampliamente usadas en el estudio de la ecología de procesos de biolixiviación, siendo un método
rápido en la detección e identificación de especies desde una comunidad diversa. La
identificación del gen 16S rDNA se utiliza en diversas técnicas asociadas a PCR como etapa
previa, sin embargo en el caso de este trabajo se implementará como técnica individual, que se
16
combinará con el método microbiológico de NMP. De este modo, se convierte en una técnica de
detección cuantitativa.
La amplificación directa del gen 16S rDNA desde muestras de poblaciones microbianas
naturales, usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa, ha concentrado gran interés,
convirtiéndose en una técnica atractiva para la caracterización de los miembros de una
comunidad compleja, principalmente porque evita los métodos tradicionales de cultivo. Existen
diversas modalidades de amplificación del 16S rDNA, principalmente referidas al objetivo de
amplificación, realizando la identificación de un microorganismo específico o del conjunto de la
población.
Por medio de ciclos térmicos se lleva a cabo las etapas que comprende un programa de
PCR: denaturación del DNA de doble hebra, alineamiento y extensión. Estas tres etapas
constituyen un ciclo de amplificación y cada una se realiza a una temperatura específica. Para la
denaturación se utiliza una temperatura entre 92 y 95ºC que rompe los enlaces que unen ambas
hebras para separarlas y dejarlas disponibles para el alineamiento con los partidores. La
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temperatura de alineamiento depende de los partidores utilizados ya que en esta etapa los
partidores se unen a cada hebra de DNA en su secuencia complementaria. La última etapa se
realiza a 72ºC, en que la enzima DNA polimerasa Taq realiza la extensión de la hebra de DNA
incorporando los nucleótidos. Por cada ciclo de amplificación se obtiene el doble de DNA de la
etapa previa, por lo tanto luego de n ciclos se tendrá un 2n números de copias.
La técnica de amplificación por si sola es una técnica cualitativa, que permite identificar
un microorganismo específico dentro de una población compleja de microorganismos. Esto es
posible gracias a que el gen 16S rDNA varía filogenéticamente, y posee zonas altamente
conservadas para organismos del mismo género, que sirven como blanco para ser reconocidas por
partidores específicamente diseñados. En bacterias de lixiviación el número de copias de 16S
rDNA por genoma es de 1 a 2, lo que da una relación proporcional entre el número de bacterias y
el número de copias de 16S rDNA por muestra [20].
Aunque la técnica de amplificación mediada por PCR presenta importantes ventajas, tales
como rapidez, sensibilidad, necesidad de baja concentración de templado, independencia de
cultivo y especificidad, trae consigo una serie de desventajas intrínsecas de la técnica. Uno de
estos problemas es la aparición de falsos positivos por efecto de contaminación con ácidos
nucleicos; en este caso la extrema sensibilidad de la técnica pasa a ser un problema, basta una
minúscula concentración de estas secuencias para que sirvan de templado y generen
amplificación indeseada [21]. También hay que considerar la inhibición de la reacción, que puede
ser por degradación de reactivos (como la hidrólisis de dNTPs por efecto de ciclos de
congelamiento/descongelamiento) o por contaminantes como metales y proteínas que inhiben la
acción de la enzima DNA polimerasa Taq. Otro problema es la formación de productos
quiméricos o distorsiones (mutaciones puntuales, deleciones, etc.). Por último, se tiene la
amplificación de productos inespecíficos, problema que está relacionado principalmente con el
tiempo y la temperatura de alineamiento.
Método de NMP
Figura 2. Esquema gráfico del método de Número Más Probable. En este caso la característica asociada a la
presencia de bacterias es la turbidez del medio luego de su desarrollo.
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La implementación PCR-NMP consiste en ocupar la metodología de NMP pero en la
etapa de amplificación, es decir, las diluciones antes mencionadas se realizan en el templado de la
reacción. Así se obtienen amplificaciones a distintas concentraciones de DNA. Esta técnica ha
sido utilizada con relativo éxito en la detección de poblaciones de Nitrobacter en suelo [22],
subestimando en algunos casos la población; sin embargo, resultó ser un procedimiento rápido
eficiente y directo que, con este trabajo, se pretende utilizar en bacterias de biolixiviación.
20
1.3 DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO
21
1.3.2 Objetivos
Poder cuantificar mediante Técnicas Moleculares las variaciones de las poblaciones de las
bacterias más importantes en procesos de biolixiviación de minerales sulfurados de Cobre.
.
22
1.3.3 Alcances
23
2 CAPÍTULO II: Materiales y Métodos
Luego se trabaja con muestras de solución de una columna de biolixiviación de las cuales
se extrae el DNA, y con cada una se realiza la detección de cada microorganismo para después
proceder con la cuantificación.
2.2 MATERIALES
2.2.1 Muestras
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2.2.2 Reactivos
En cada etapa del proceso, cultivo, extracción de DNA y amplificación del 16s rDNA se
utilizan una serie de reactivos que corresponden a los protocolos correspondientes. Para ver la
composición y elaboración de cada uno ver la sección de Anexos.
2.2.3 Microorganismos
2.2.4 Equipamiento
• Cámara de electroforesis
• Microcentrífuga, Biofuge A
• Espectrofotómetro
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• Vórtex
2.3 MÉTODOS
En esta sección se describen cada uno de las metodologías empleadas para cada etapa del
proceso:
Para poder llevar a cabo la amplificación del gen 16S rDNA de los microorganismos
Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans primero se debe contar con
los partidores para cada uno de ellos. Así, estos deben ser diseñados de manera específica a partir
de secuencias nucleotídicas del gen de distintas cepas disponibles en bases de datos de Internet, y
con la ayuda de herramientas computacionales.
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la Ribosomal Database Project II1, RDP, herramienta creada por investigadores de la University
of Illinois at Urbana-Champaign (UIUC) y apoyada por la Michigan State University (MSU),
que además de almacenar secuencias del gen 16S rDNA ofrece análisis de datos en línea,
creación de árboles filogenéticos a partir de rRNA, y alineamiento de secuencias de rRNA. Las
secuencias utilizadas para el diseño de los partidores de las bacterias antes nombradas se
obtuvieron desde esta base de datos. En el caso de Acidithiobacillus thiooxidans se utilizó 17
cepas de las 27 disponibles en la base de datos, con largos que variaron entre 1301 y 1499 pb.
Para Sulfobacillus thermosulfidooxidans se utilizó las 5 cepas disponibles en la base de datos, con
largos que variaron entre 1334 y 1519 pb.
Luego se trabaja con el software Primer Premier versión 5.0, una herramienta
computacional que ayuda en el diseño de partidores. El programa realiza alineamientos de las
secuencias obtenidas desde las bases de datos, buscando un patrón común a todas, es decir, la
posición de los nucleótidos en la secuencia ribosomal. Luego el programa entrega una lista de
todos los posibles partidores para cada alineamiento.
Para el diseño, es necesario además definir los parámetros de búsqueda, es decir de todos
los posibles partidores el programa desplegará aquellos que se ajusten a las necesidades del
usuario. Los parámetros de búsqueda son:
Destino de la secuencia: se define que la secuencia será utilizada para amplificación mediada
por PCR, en el programa se elige la opción PCR Primers.
Tipo de búsqueda: en esta sección se define qué tipos de partidores se está buscando, en este
caso se busca un par de partidores complementarios a ambas hebras. Un partidor sense
complementario a la hebra 3`-5`, y un partidor antisense complementario a la hebra 5`-3` del
DNA. En el programa se elige la opción Pairs.
1
RDP II, http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp
27
Rango de búsqueda: aquí se le indica al programa que busque un par de partidores entre el
nucleótido número 1 y el último nucleótido del alineamiento. En el caso de Acidithiobacillus
thiooxidans la búsqueda se hace hasta el nucleótido número 1377, y para Sulfobacillus
thermosulfidooxidans se realiza hasta el nucleótido número 1369. Por último se define el tamaño
mínimo del producto de PCR en 900 pb y el tamaño máximo como el largo del alineamiento.
Por otro lado, cada par de partidores va acompañado por una tabla de información que
entrega los parámetros fisicoquímicos de la reacción: temperatura de meeting (Tm) de los
partidores, el porcentaje GC de cada partidor y la energía libre de Gibbs (ΔG) de la reacción de
hibridación del partidor a la hebra de DNA. También entrega otra tabla con las posibles
estructuras secundarias indeseadas que podrían formarse, como dímeros entre partidores,
autoplegamiento de un partidor y falso partidor (un partidor se pega en una región distinta de la
secuencia blanco), con su respectivo ΔG.
Basado en los parámetros anteriores se elige un par de partidores que además sea
específico. La especificidad de cada partidor se analiza nuevamente en el sitio de RDP, el cual
ofrece una herramienta para realizar match entre los partidores y todas las secuencias
almacenadas en su base de datos. Este análisis entrega una lista de organismos que podrían ser
amplificados con los partidores ingresados. Este proceso se realiza para cada par de partidor que
entrega el programa computacional, hasta encontrar un par de partidores que reconozcan sólo
secuencias de cepas de los organismos deseados.
Los siguientes son los protocolos diseñados previamente [15, 23] para la extracción de
DNA de bacterias de biolixiviación provenientes desde cultivos, soluciones de refino y mineral.
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Protocolo de extracción de DNA desde cultivos
Para visualizar los resultados obtenidos se realiza electroforesis en gel de agarosa al 0.8%.
29
Protocolo de extracción de DNA desde soluciones de procesos de biolixiviación
• Filtrar el volumen de solución a tratar (entre 1 y 1.5 litros) con membrana de 0.2 um. Una
vez concluido recuperar la membrana y depositarla en el interior de un tubo para
centrífuga de 40 ml.
• Lavar el pellet con 20 ml de PBS 1X pH 1.2 agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 rpm
por 15 min. Descartar sobrenadante.
• Lavar con 10 ml de buffer de lavado agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 rpm por 15
min. Descartar sobrenadante.
• Resuspender en 3 ml de buffer A2X. Adicionar lisozima a una concentración final de 3
mg/ml e incubar por 1 hora a 37 ºC.
• Agregar SDS a una concentración final de 4% p/v.
• Agregar NaCl 5M hasta llegar a una concentración final de 0.7M y luego CTAB (CTAB
10% en 0.7M NaCl) para tener una concentración final de 1% CTAB. Incubar a 65 ºC por
1 hr.
• Realizar 3ciclos de congelamiento-descongelamiento, de 3 min cada uno, a -20 ºC y 70
ºC, respectivamente.
• Centrifugar a 1.000 rpm por 2 min. Recuperar sobrenadante y repartir en tubos Eppendorf
de 1.5 ml, aproximadamente 0.7 ml en cada tubo.
• Agregar fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) hasta una concentración de 50%
v/v. Vortex hasta homogenizar. Centrifugar a 12.000 rpm por 5 min. Recuperar fase
superior y traspasar a tubos Eppendorf de 1.5 ml limpios.
• Agregar isopropanol absoluto frío hasta una concentración de 50% v/v y acetato de sodio
3M pH 5.2 a una concentración final de 10% v/v. Incubar a -20 ºC toda la noche.
• Centrifugar a 14.000 rpm por 25 min. Descartar sobrenadante.
• Lavar con 500 ul de etanol al 70%, agitar suavemente. Centrifugar a 14.000 rpm por 10
min. Repetir el lavado.
• Descartar sobrenadante y secar el pellet al mechero por 20 min.
• Resuspender en 50 ul de buffer TE (sólo en un tubo). Almacenar a -20 ºC.
Para visualizar los resultados obtenidos se realiza electroforesis en gel de agarosa al 0.8%.
30
Protocolo de extracción de DNA desde minerales
Para visualizar los resultados obtenidos se realiza electroforesis en gel de agarosa al 0.7%.
31
2.3.3 Amplificación del 16s rDNA mediante PCR
Para la amplificación por PCR es necesario definir las condiciones de reacción, es decir
los reactivos usados con sus respectivas concentraciones y el programa de PCR con las
respectivas temperaturas y tiempos de reacción.
Para este volumen de reacción se usa un volumen de DNA genómico de 1 ul, utilizándose
sin diluir y en diluciones que van desde 1:10 a 1:1000000.
32
Denaturación inicial: 95 ºC por 2 min.
Denaturación: 95 ºC por 45 s
Alineamiento: Ta por 45 s se repite 20 veces
Extensión. 72 ºC por 45 s
33
2.3.4 Técnica de determinación del número más probable NMP.
Para la cuantificación con NMP y PCR se realizan distintas diluciones de la muestra que
van desde 1:10 hasta 1:1000000. Luego se realiza la amplificación en triplicado de cada una de
las diluciones, incluyendo la muestra sin diluir, según el protocolo antes descrito. En este caso la
señal positiva del método de NMP será la amplificación del templado, las que se obtienen luego
de realizar una electroforesis en gel de agarosa de las muestras amplificadas.
34
3 CAPÍTULO III: Resultados y Discusión
Acidithiobacillus thiooxidans
35
Este par de partidores permite la amplificación de 23 cepas de Acidithiobacillus
thiooxidans de las 27 cepas cuyo gen 16S de DNA ribosomal se encuentra secuenciado y
almacenado en las bases datos. Mediante el programa Primer Premier v5.0 es posible predecir el
largo del producto de amplificación, este corresponde a 1021 pb el cual se extiende desde el
nucleótido 210 al 1230 de la secuencia blanco. De esta manera, el partidor AzufreI que se alinea a
la hebra 3`-5`, lo hace a partir del nucleótido 210. Por otro lado, el partidor AzufreII se alinea a la
hebra 5`-3`a partir del nucleótido 1230.
El software además entrega las principales propiedades de los partidores (Tabla II), así
como también condiciones termodináminas bajo las cuales se pueden producir reacciones
indeseadas.
36
reacción de interés. En este caso la energía de activación de la reacción de hibridación para el
partidor forward y el partidor reverse es de -34.7 Kcal/mol y -34.3 Kcal/mol, respectivamente.
Lo que comparado con las energías de activación de las reacciones indeseadas: 0.1Kcal/mol para
el autoplegamiento, -6.3 Kcal/mol para el dímero y -3.9 Kcal/mol para el dímero cruzado, es un
valor muy inferior. Así se puede inferir que la probabilidad de que se formen estructuras
secundarias es mucho menor a la probabilidad de la reacción de la correcta amplificación para la
cuál se diseñaron los partidores.
Por último, todos los valores y datos entregados anteriormente se realizan en base a la
temperatura óptima de alineamiento entregada por el software, la que corresponde a 54.2 ºC. Esta
es la temperatura que se usa como punto de partida para encontrar la temperatura de alineamiento
definitiva que se aplicará en la reacción de PCR.
Sulfobacillus thermosulfidooxidans
El software además entrega las principales propiedades de los partidores (Tabla III), así
como también condiciones termodináminas bajo las cuales se pueden producir reacciones
indeseadas.
Por último, todos los valores y datos entregados anteriormente se realizaron en base a la
temperatura de melting entregada por el software, la que corresponde a 58.4 ºC. Esta es la
38
temperatura que se usó como punto de partida para encontrar la temperatura de alineamiento
definitiva usada en la reacción de PCR.
Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% de extracción de DNA genómico. Carril 1: marcador de peso
molecular 1Kb, carril 2: Acidithiobacillus ferrooxidans, carril 3: Acidithiobacillus thiooxidans y carril 4:
Sulfobacillus thermosulfidooxidans.
En el caso de las cuatro especies se utilizó el mismo protocolo de extracción, el cual fue
estudiado y probado en tesis anteriores [15, 23]. Sin embargo se le introdujo algunas
modificaciones con el fin de mejorar la recuperación de material genético y eliminar
contaminantes. Con este objetivo se estudiaron tres etapas del protocolo:
40
En el caso del lavado previo, se hace necesario no generalizar el protocolo a cualquier
muestra, es decir dependiendo de la suciedad de la muestra es conveniente repetir una o dos veces
el lavado con buffer de lavado. Así mismo, se puede incorporar como una primera etapa la
centrifugación a 1000 rpm por 10 min, recuperando el sobrenadante y descartando el pellet con
los elementos contaminantes.
Finalmente, la etapa de lavado con etanol al 70% para la recuperación de DNA desde la
mezcla de Isopropanol y Acetato de Sodio, se realizó dos veces para eliminar contaminantes
como metales, que puedan interferir en la reacción de PCR. El procedimiento utilizado fue lavar
el pellet de DNA con 500 μl de etanol al 70%, agitarlo por inversión del tubo, suavemente, hasta
visualizarlo en la solución.
Sin embargo, los efectos de las modificaciones mencionadas anteriormente fueron apenas
visibles, manteniéndose la presencia de un barrido producto de suciedad en la muestra. Sin
embargo, permiten que se produzca la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) sin problemas
de inhibición.
Las modificaciones del protocolo de extracción son extensibles para soluciones de refino
y mineral, de acuerdo a las condiciones de la muestra.
41
3.2.3 Extracción de DNA desde soluciones de refino
Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% de DNA genómico extraído desde muestras de solución de
refino. Carril 1: marcador de peso molecular 1 Kb, carril 2: DNA genómico muestra 5, carril 3: DNA genómico
muestra 6, carril 4: DNA genómico muestra 7, carril 5: DNA genómico muestra 8, carril 6: DNA genómico muestra
9.
Se aprecia una banda de alto tamaño molecular, sobre 10,000 pb, según el patrón esperado
en una extracción de DNA genómico. Se aprecia además una especie de barrido bajo la banda de
DNA, lo que corresponde a DNA genómico degradado y contaminación propia de las muestras.
Esta contaminación se intentó eliminar mediante modificaciones en el protocolo de extracción,
principalmente en la etapa de lavado con fenol-cloroformo y con etanol al 70%, tal como se
describió en la sección anterior. Sin embargo, dado que las soluciones contienen escasa presencia
de células, del orden de 106 cel/ml, la incorporación de mayor cantidad de etapas de lavado se
42
traduciría en pérdida de DNA. Por otro lado, la alta concentración de contaminantes del tipo sales
y metales se hacía evidente en la etapa previa de filtración de la muestra, produciéndose la
saturación de los filtros. Todo lo anterior muestra la dificultad de obtener DNA limpio desde este
tipo de soluciones.
Cabe destacar que la extracción de DNA genómico se realizó directamente desde las
soluciones de refino no enriquecidas, logrando un buen resultado. Esto es un importante aporte
para el estudio de la diversidad bacteriana real de una muestra.
El protocolo usado para esta extracción también sufrió modificaciones para obtener un
DNA libre de impurezas. Así, se incluyó un lavado adicional con buffer de lavado de mineral y
un lavado adicional con etanol al 70%. En la Figura 5 se presenta la foto de un gel de
electroforesis con la extracción de la muestra de mineral, la que se ajusta al patrón esperado de
extracción de DNA genómico, con un tamaño sobre 10,000pb.
43
Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% de muestra de DNA genómico proveniente de mineral
aglomerado. Carril 1: DNA genómico de muestra de mineral, carril 2: marcador de peso molecular 1 Kb.
La extracción de DNA desde las células presentes en el mineral se realizó sin ningún tipo
de enriquecimiento bacteriano, obteniéndose una concentración suficiente de DNA para realizar
una reacción de PCR, como se verá más adelante. Luego, al comparar el resultado de esta
extracción con el de las soluciones de refino, que son aquellas muestras cuyo material genético es
de una mezcla de microorganismos, no se aprecia una gran diferencia en la intensidad de las
bandas de los respectivos geles. Esto significa una eficiencia de recuperación semejante entre
ambas muestras, lo que da cuenta de la efectividad del protocolo de extracción usado para
muestras de biolixiviación.
Para realizar la amplificación del gen 16S rDNA de cada uno de estos microorganismos,
es necesario determinar la temperatura de alineamiento de ambos partidores. Con la ayuda del
programa Primer Premier v5.0 se obtuvo las secuencias de los partidores específicos así como
también los productos de amplificación esperados, sin embargo el programa predice una
temperatura de alineamiento óptima que en muchos casos no arroja los mejores rendimientos de
44
amplificación. Por lo tanto, es necesario utilizar un método experimental para determinar esta
temperatura, que en este caso se trata de un PCR de gradiente de temperatura.
Tabla IV. Temperaturas utilizadas en PCR con gradiente de temperatura para A. thiooxidans y S.
thermosulfidooxidans.
Pocillo A. thiooxidans [ºC] S. thermosulfidooxidans [ºC]
1 45 48
2 45.3 48.3
3 46.4 49.4
4 48.2 51.2
5 50.4 53.5
6 53 56.1
7 55.8 58.8
8 58.5 61.5
9 61 64
10 63.1 66.1
11 64.7 67.7
12 65.6 68.5
45
3.2.6 Temperatura de alineamiento de partidores específicos para Acidithiobacillus
thiooxidans
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR con gradiente de temperatura para
Acidithiobacillus thiooxidans. Parte A, carril 1: marcador de peso molecular 1 Kb; carril 2: 45ºC; carril 3: 45.3ºC;
carril 4: 46.4ºC; carril 5: 48.2ºC; carril 6: 50.4ºC; carril 7: 53ºC; carril 8: 55.8ºC; carril 9: 58.5ºC. Parte B, carril 1:
marcador de peso molecular 1 Kb; carril 2: 61ºC, carril 3: 63.1ºC; carril 4: 64.7ºC, carril 5: 65.6ºC.
De todas las temperaturas se eligió aquella que diera como resultado una banda intensa,
pero que además fuera relativamente alta para evitar reacciones indeseadas o productos
inespecíficos. En este caso se escogió una temperatura de 63.1 ºC.
46
Prueba de especificidad de partidores diseñados para Acidithiobacillus thiooxidans
Para probar la especificidad de los partidores y dado que todas las temperaturas entregan
una sola banda como resultado de amplificación se realiza un PCR cruzado. Es decir la
amplificación de la secuencia 16S rDNA con los partidores específicos para Acidithiobacillus
thiooxidans diseñados, de DNA genómico proveniente de cultivos puros de: Acidithiobacillus
thiooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum
ferrooxidans.
Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR cruzado con partidores de A.
thiooxidans para T=63.1 ºC. Carril 2-3: amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100
y 10-1, respectivamente. Carril 4-5: amplificación DNA genómico cultivo puro L. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1,
respectivamente. Carril 6-7: amplificación DNA genómico cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 10-
1
, respectivamente. Carril 8-9: amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1,
respectivamente. Carril 1: marcador peso molecular 1Kb.
47
thiooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans y Acidithiobacillus ferrooxidans, cultivos que
pueden presentar algún tipo de contaminación. En el caso de Sulfobacillus thermosulfidooxidans
no hay certeza de que efectivamente se trate de un cultivo puro, mientras que en trabajos de tesis
anteriores [15] se detectó, mediante la técnica de T-RFLP, la presencia de Acidithiobacillus
thiooxidans en cultivos puros de Acidithiobacillus ferrooxidans, en el laboratorio de
Biohidrometalurgia de la Universidad de Chile.
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR cruzado partidores A. thiooxidans para
T=65.8 ºC. Carril 2, 3, 4: amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100, 10-1 y 10-2,
respectivamente. Carril 5-6: amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1,
respectivamente. Carril 7-8: amplificación DNA genómico muestra proveniente de lodos, en duplicado. Carril 1:
marcador peso molecular 1Kb.
48
3.2.7 Temperatura de alineamiento de Sulfobacillus thermosulfidooxidans
En la Figura 9 se presenta la foto del gel de electroforesis del resultado del PCR con
gradiente de temperatura para Sulfobacillus thermosulfidooxidans.
Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR de gradiente de temperatura para
Sulfobacillus thermosulfidooxidans. Parte superior del gel, carril 1: marcador de peso molecular, carril 2: 48ºC,
carril 3: 48.3ºC, carril 4: 49.4ºC, carril 5: 51.2ºC, carril 6: 53.5ºC, carril 7: 56.1ºC, carril 8: 58.8ºC, carril 9: 61.5ºC.
Parte inferior del gel, carril 1: marcador de peso molecular 1Kb, carril 2: 64ºC, carril 3: 66.1ºC, carril 4: 67.7ºC y
carril 5: 68.5ºC.
Aquí se puede ver bandas inespecíficas para las siete primeras temperaturas, de este modo
la temperatura de alineamiento será de entre 61.5 ºC y 68.5 ºC. En la medida que se aumenta la
temperatura de alineamiento desaparecen bandas inespecíficas producto de reacciones
indeseadas. Por otro lado, las bandas observadas para cada una de las temperaturas corresponden
al tamaño molecular esperado de 927 pb, ubicándose por debajo de la banda de 1000 pb del
marcador de peso molecular 1 Kb.
49
Prueba de especificidad de partidores diseñados para Sulfobacillus thermosulfidooxidans
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR cruzado con gradiente de temperatura
para partidores de Sulfobacillus thermosulfidooxidans. T = 62.1 ºC, carriles 2-3 amplificación DNA genómico
cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 4-5 amplificación DNA
genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 6-7 amplificación DNA
genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente. T=62.7 ºC, carriles 8-9 amplificación
DNA genómico cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 10-11
amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 12-13
amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente. T=63.3, carriles
14-15 amplificación DNA genómico cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente;
carriles 16-17 amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente;
carriles 18-19 amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente.
Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% resultado de cuantificación de A. ferrooxidans en cutltivo
puro. Carril 1: estándar peso molecular 1Kb. Carril 2-3-4: dilución 100; carril 5-6-7: dilución 10-1; carril 8-9-10:
dilución 10-2; carril 11-12-13: dilución 10-3.
En el gel anterior se aprecia la señal de amplificación positiva hasta la dilución 10-3, con
la visualización de tres bandas en cada dilución. Se aprecia también la ausencia de amplificación
51
en la dilución 100. Esto es señal de una elevada concentración de DNA en la muestra, lo que se
traduce a su vez en una elevada concentración de los contaminantes que contiene esta muestra,
los cuales inhiben la amplificación.
Con esta calibración se calculó la concentración real de células en cada muestra, mediante
una relación lineal entre la concentración celular de la calibración y la concentración medida por
técnicas moleculares.
Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% resultado de cuantificación de A. ferrooxidans en muestra de
solución de refino. Carril 2-4: dilución 100; carril 5-7: dilución 10-1; carril 8-10: dilución 10-2; carril 2-4, inferior:
dilución 10-3; carril 1: marcador de peso molecular 1Kb.
52
La tendencia en la cuantificación de esta bacteria fue la aparición de señal sólo hasta la
dilución 10-3, y al igual que para las otras bacterias en estudio lo habitual es que desaparezca la
señal por completo, en triplicado, en una dilución específica. Esta desaparición de las tres
muestras de una misma dilución da cuenta de la reproducibilidad de la técnica de PCR.
53
ferroso mencionada anteriormente, corresponde a la muestra 2 recibida el día 28 del período de
estudio Esta muestra a su vez, es aquella con la concentración más baja de UG del
microorganismo, de 8 UG/ml.
10.000
Concentración [mg/l]
9.000 Fierro total
8.000 Ferroso
Férrico
7.000
6.000
5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
0
0 28 35 40 47 56 78 88 92 96
tiempo [días]
Gráfico 1. Análisis de Fe total (verde), Fe+2 (rojo) y Fe+3 (amarillo) para cada muestra de solución de refino
proveniente de columna de biolixiviación de Sociedad minera El Abra. Cada trío de columnas corresponde a una
muestra, cuya variable tiempo corresponde al día de recepción de la muestra.
Uno de los objetivos de este trabajo tiene que ver con el estudio de la relación que existe
entre la concentración de microorganismos y las condiciones del medio. En el caso de
Acidithiobacillus ferrooxidans, su capacidad oxidativa se ve afectada por diversos factores, entre
los cuales uno de los más importantes es la elevada concentración de ión férrico en la solución.
Este compuesto es capaz de inhibir el crecimiento de esta bacteria, sin embargo es posible que la
baja concentración de ión ferroso disponible sea aún más relevante para el crecimiento de
Acidithiobacillus ferrooxidans. Si se intenta relacionar la concentración de UG de
Acidithiobacillus ferrooxidans con algún parámetro de la solución, no es posible encontrar un
comportamiento coherente. La variación de hierro total no permite establecer una relación entre
el consumo de ión ferroso y la disminución de la concentración de Acidithiobacillus
ferrooxidans. Por otro lado, las concentraciones de ión férrico detectadas no son suficientemente
altas como para inhibir el crecimiento de Acidithiobacillus ferrooxidans.
54
Según estudios [8], la ausencia de Acidithiobacillus ferrooxidans relacionada con un
coeficiente Fe+3/Fe+2 elevado, se traduciría en el aumento de la concentración de Leptospirillum
ferrooxidans. Sin embargo, en este trabajo no se detectó Leptospirillum ferrooxidans en ninguna
de las diez muestras analizadas. Esto podría tener su explicación en el elevado pH de las
muestras, alrededor de 2.02, siendo el pH óptimo de crecimiento de Leptospirillum ferrooxidans
de 1.3 [24, 8]. En el Gráfico 2 se presenta el análisis de pH realizado para cada una de las
muestras, observándose que ese parámetro no baja de 1.9. Por otro lado, como se trata de una
bacteria que sólo oxida hierro, su crecimiento es menos eficiente en minerales sulfurados del tipo
calcopirita [4] si no tiene disponible ión ferroso para sus requerimientos metabólicos.
2,15
2,1
2,05
2
pH
1,95
1,9
1,85
1,8
1,75
0 28 35 40 47 56 78 88 92 96
tiempo [días]
Gráfico 2. Análisis de pH para cada muestra de solución de refino proveniente de columna de biolixiviación de
Sociedad minera El Abra. Cada columna corresponde a una muestra, cuya variable tiempo corresponde al día de
recepción de la muestra.
Por otro lado, se buscó también Leptospirillum ferrooxidans en muestras de mineral, dado
que se trata de una bacteria que crece mejor adherida al mineral que en solución. Sin embargo no
55
se detectó, lo que se puede atribuir, como se dijo anteriormente, al tipo de mineral con el que se
está trabajando.
Figura 13. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% resultado de cuantificación de A. thiooxidans en muestra de
solución de refino. Carril 2-4: dilución 100; carril 5-7: dilución 10-1; carril 8-10: dilución 10-2; carri 11-13: dilución
10-3; carril 14-16: dilución 10-4; carril 1 y 20: marcador de peso molecular 1Kb.
56
Tabla VI. Resultados de la cuantificación de Acidithiobacillus thiooxidans presente en soluciones de
refino, expresado como concentración en Unidades genómicas (UG) por ml.
Calibración
Muestra 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 UG/100ml UG/ml UG/ml
P1 3 3 3 3 0 0 0 80000 8x102 1x109
P2 3 3 3 3 3 3 0 8000000 8x104 1x1011
P3 3 3 3 3 0 0 0 80000 8x102 1x108
P4 3 3 3 0 0 0 0 8000 8x101 1x108
P5 3 3 3 3 0 0 0 80000 8x102 1x109
P6 3 3 3 2 0 0 0 14000 1,4x102 1,75x10
2
P7 3 3 3 3 0 0 0 80000 8x10 1x109
P8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
P9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
P10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Por otro lado, estudios [26] muestran que poblaciones bacterianas mixtas compuestas
predominantemente por Acidithiobacillus thiooxidans y por Acidithiobacillus ferrooxidans
presentan los mayores niveles de recuperación de cobre, mejorando el proceso.
57
0,9
Concentración Cu [g/l]
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 28 35 40 47 56 78 88 92 96
tiempo [días]
Gráfico 3. Análisis de Cu disuelto en solución de refino para cada muestra de solución de refino proveniente de
columna de biolixiviación de Sociedad minera El Abra. Cada columna corresponde a una muestra, cuya variable
tiempo corresponde al día de recepción de la muestra.
58
Concentración Sulfato [g/l]
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 28 35 40 47 56 78 88 92 96
tiempo [días]
Gráfico 5. Análisis de sulfato para cada muestra de solución de refino proveniente de columna de biolixiviación de
Sociedad minera El Abra. Cada columna corresponde a una muestra cuya variable tiempo corresponde al día de
recepción de la muestra.
Este microorganismo se logró detectar en sólo siete muestras de las diez totales, como se
aprecia en la Tabla VII.
59
Tabla VII. Resultados de la cuantificación de Sulfobacillus thermosulfidooxidans presente en
soluciones de refino, expresado como concentración en Unidades genómicas (UG) por ml.
Calibración
Muestra 1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 UG/100ml UG/ml UG/ml
P1 3 3 3 0 0 0 0 8000 8x101 1x108
P2 3 3 2 0 0 0 0 1400 1,4x101 1,75x107
P3 3 3 3 0 0 0 0 8000 8x101 1x108
P4 3 3 0 0 0 0 0 800 8x100 1x107
P5 3 3 3 3 0 0 0 80000 8x102 1x109
P6 3 3 3 0 0 0 0 8000 8x101 1x108
P7 3 3 3 1 0 0 0 11000 1,1x102 1,38x108
P8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
P9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
P10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
60
900
Concnetración [UG/ml]
800
700
600 ST
500
400 AF
300
200 A
100
0
0 28 35 40 47 56 78 88 92 96
Concentración [UG/ml] tiempo [días]
90000
80000
70000
60000
50000
AT
40000
30000
20000 B
10000
0
0 28 35 40 47 56 78 88 92 96
tiempo [días]
61
Finalmente, dado que no se trata de un ambiente controlado no es posible establecer
relaciones precisas y certeras entre la concentración de un determinado microorganismo y los
parámetros de la solución del proceso, como ocurre en la mayoría de los estudios realizados hasta
ahora. En el caso de Leptospirillum ferrooxidans, diversos trabajos [8, 25] avalan la tendencia de
esta especie de predominar por sobre Acidithiobacillus ferrooxidans a concentraciones elevadas
de Fe+3. Sin embargo, se trata de estudios llevados a cabo bajo ambientes diseñados
especialmente a escala de laboratorio, donde los nutrientes, pH, T, Eh, etc., de la solución fueron
controlados. Esto puede ser la causa de la imposibilidad de establecer la misma tendencia en el
presente trabajo. Esto hace que los resultados obtenidos no se correlacionen exactamente con la
información disponible.
62
4 CAPÍTULO IV: Conclusiones
Con los resultados obtenidos para cada una de las actividades realizadas y en base a los
objetivos planteados al inicio de este trabajo se puede concluir que:
Acidithiobacillus ferrooxidans es la única especie común en todas las muestras, aún para
los niveles detectados de Fe+3 más elevados, 8.700 mg/l. Así mismo, este nivel coincide con la
63
concentración más baja de UG y con el Eh más elevado. Sin embargo, no se trata de una
concentración lo suficientemente elevada como para inhibir su crecimiento y favorecer el
crecimiento de Leptospirillum ferrooxidans.
No fue posible establecer una relación entre las poblaciones bacterianas y la composición
de las soluciones, tal como se ha obtenido en trabajos anteriores. Esto principalmente debido a la
diferencia de las condiciones experimentales, es decir los registros que existen son en base a
procesos a escala de laboratorio y con parámetros controlados. Esto hace que los resultados
obtenidos no se correlacionen exactamente con la información disponible.
Se trató de establecer una relación entre el cobre disuelto (como una medida de la
recuperación de cobre) y la concentración de los microorganismos. Así, se estableció que la
mayor concentración de Cobre disuelto, o recuperación de Cu, se obtuvo cuando
Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans, estaban presentes. Mientras que la
disminución de alguno de ellos se traduce en la disminución del metal en solución. Lo que
concuerda con las observaciones de que la presencia de ambos microorganismos significa
mayores niveles de recuperación de cobre.
En resumen, en este trabajo se presenta una técnica cuya implementación aún se está
trabajando, cuya mayor importancia es permitir identificar y cuantificar especies directamente
desde muestras de soluciones de refino de procesos industriales, sin previo enriquecimiento. Sin
embargo, debe ser validada mediante el uso de otras técnicas de cuantificación sobre muestras del
mismo origen. De cualquier forma, es un avance en el estudio de poblaciones bacterianas de
procesos reales de biolixiviación.
64
5 ANEXOS
En las tablas VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV y XV se entregan las composiciones de cada
reactivo usado en la etapa de extracción de DNA genómico. Además de la composición de los
reactivos usados en electroforesis.
Compuesto Concentración
Tris HCL pH 7.6 50mM
EDTA 50mM
Sacarosa 20% p/v
65
Tabla XI. Composición Buffer TE.
Compuesto Concentración
Glicerol 30% v/v
Azul de bromofenol 0.25% p/v
Compuesto Concentración
Tris HCL 24.2% p/v
Ácido acético glacial 5.71% v/v
EDTA 0.5M pH 8.0 10% v/v
66
Todas las soluciones son preparadas con agua destilada, a excepción de buffer TAE 50X
que fue preparado con agua desionizada. Los pH fueron ajustados con H2SO4 o NaOH
concentrado según lo requerido, excepto en el caso de Tris HCl cuyo pH fue ajustado con HCl.
(NH4)2SO4 0.4
MgSO4x7H2O 0.4
K2HPO4x3H2O 0.056
(NH4)2SO4 0.2
MgSO4x7H2O 0.4
K2HPO4x3H2O 0.1
Para la preparación de los medios de cultivo se disolvieron las sales en 1 litro de agua y el
pH se ajustó con H2SO4 concentrado a 1.6 para el medio MC y 1.7 para el medio 9K modificado.
Luego se esterilizan mediante calor húmedo por 15 minutos.
67
5.2 ANEXO II. MÉTODOS
• Pesar 0.8 o 1.2 gramos de agarosa, dependiendo del uso que se le dará al gel (para DNA
genómico o producto de PCR). Disolver en 100ml de Buffer TAE 1X en horno
microondas agitando cada 20 segundos hasta disolver completamente.
• Adicionar 10μl de Bromuro de Etidio a la mezcla tibia.
• Armar la cámara de electroforesis con las peinetas correspondientes. Luego agregar la
agarosa disuelta hasta que las peinetas queden levemente sumergidas y se forme el
pocillo.
• Una vez sólida la agarosa cubrir con Buffer TAE 1X y luego retirar las peinetas.
• Cargar las muestras en el gel. Para esto se mezcla 5μl de muestra de DNA y 3μl de Buffer
de carga 6X. Luego el volumen total se carga en uno de los pocillos del gel.
• Cargar 5μl de estándar de peso molecular.
• Correr el gel por 40 minutos a 100Volts.
• Retirar el gel de la cámara y visualizar en transiluminador UV.
Usar guantes para manipular el Bromuro de etidio y la agarosa, y lentes con protección UV para
manipular el transiluminador.
Determinación de ferroso.
68
Determinación de Fierro total.
Las diluciones de la muestra original son hechas en agua ácida (pH 1.6).
69
4. S000467259 Acidithiobacillus thiooxidans; OGCS3; AY830898
5. S000467260 Acidithiobacillus thiooxidans; ONAS8; AY830899
6. S000467261 Acidithiobacillus thiooxidans; ORCS8; AY830900
7. S000467262 Acidithiobacillus thiooxidans; OYCS3; AY830901
8. S000467263 Acidithiobacillus thiooxidans; NBRC13701; AY830902
9. S000474032 Acidithiobacillus thiooxidans; WJSo; AY495961
10. S000538630 Acidithiobacillus thiooxidans; DQ067562
11. S000630428 Acidithiobacillus thiooxidans; PIAC10; AY552079
12. S000630429 Acidithiobacillus thiooxidans; COSI13.1; AY552080
13. S000630430 Acidithiobacillus thiooxidans; SACA46; AY552081
14. S000630437 Acidithiobacillus thiooxidans; DAMS; AY552088
15. S000630439 Acidithiobacillus thiooxidans; Sed6.3; AY552090
16. S000630441 Acidithiobacillus thiooxidans; CASQ23; AY552092
17. S000712735 Acidithiobacillus thiooxidans; SZS; DQ676508
71
5.4 ANEXO V. TABLA DE NMP
Combinación Combinación
de NMP/100ml de NMP/100ml
positivos positivos
0 0 0 <2 4 2 0 22
0 0 1 2 4 2 1 26
0 1 0 2 4 3 0 27
0 2 0 4 4 3 1 33
4 4 0 34
1 0 0 2
1 0 1 4 5 0 0 23
1 1 0 4 5 0 1 31
1 1 1 6 5 0 2 43
1 2 0 6 5 1 0 33
5 1 1 46
2 0 0 5 5 1 2 63
2 0 1 7
2 1 0 7 5 2 0 49
2 1 1 9 5 2 1 70
2 2 0 9 5 2 2 94
2 3 0 12 5 3 0 79
5 3 1 110
3 0 0 8 5 3 2 140
3 0 1 11
3 1 0 11 5 3 3 180
3 1 1 14 5 4 0 130
3 2 0 14 5 4 1 170
3 2 1 17 5 4 2 220
5 4 3 280
4 0 0 13 5 4 4 350
4 0 1 17
4 1 0 17 5 5 0 240
4 1 1 21 5 5 1 350
4 1 2 26 5 5 2 540
5 5 3 920
5 5 4 1600
5 5 5 ≥2,400
72
5.5 ANEXO VI. FECHA DE RECEPCIÓN DE MUESTRAS
73
6 BIBLIOGRAFÍA
4. Norris, P.R. 1990. Acidophilic Bacteria and their activity in mineral Sulfide Oxidation.
Microbial Mineral recovery. G. Rossi & A.E. Torma. Iglesias, Italy: Associazione Mineraria
Sarda. Capítulo 1, pp. 3-23.
5. Rawlings D.E. 2004. Microbially assisted dissolution of minerals and its use in the mining
industry. Pure Appl. Chem. Vol. 76 (4): 847-859.
6. Sand, W., T. Gehrke, P-G. Jozsa, A. Schippers. 2001. (Bio)chemistry of bacterial leaching-
direct vs. Indirect bioleaching. Hydrometalllurgy 59, 159-175.
7. Ballester, A. “Lixiviación Bacteriana”. Parte IV: Hidrometalurgia, Cap. 17. pp. 398-425.
9. De Wulf-Durand, P., L.J. Bryant and L. Sly. 1997. Pcr –mediated detection of acidophilic
bioleaching associated bacteria. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 63 (7): 2944-
2948.
74
10. Groudeva, V.I., S.N. Groudev, D.V. Vassilev. 1990. Microflora of two industrial copper
dump leaching operations. Biohydrometallurgy pp. 210-217.
11. Amaro, A.M., K.B. Hallberg, E.B. Lindstrom, C.A. Jerez. 1994. An immunological assay
for detection and enumeration of thermophilic biomining microorganisms. Applied and
Environmental Microbiology. Vol. 60: 3470-3473.
13. Dziurla, M-A., W.Achouak, B-T. Lam, T. Heulin and J. Berthelin. 1998. Enzyme-linked
immunofiltration assay to estimate attachment of thiobacilli to pyrite. Applied and
Environmental Microbiology. Vol 64 (8): 2937-2942.
14. Romero, J., C. Yañez, M. Vasquez, E.R.B Moore., R.T. Espejo. 2003. Characterization
and identification of an iron-oxidizing, Leptospirilllum-like bacterium, present in the high sulfate
leaching solution of a commercial bioleaching plant. Res Microbiol. Vol. 143:353-359.
16. Stoner, D.L., C.K. Browning, D.K. Bulmer, T.E. Ward, and M.T. MacDonell. 1996.
Direct 5SrRNA assay for monitoring mixed-culture bioprocesses. Applied and Environmental
Microbiology. Vol. 62 (6): 1969-1976.
17. Demergasso, C.S., P.A. Galleguillos, L.V. Escudero, V.J. Zepeda, D. Castillo, E.O.
Casamayor. 2005. Molecular characterization of microbial populations in a low-grade copper
ore bioleaching test heap. Hydrometallurgy. Vol. 80: 241-253.
20. Liu, C-Q., J. Plumb, P. Hendry. 2005. Rapid specific detection and quantification of
bacteria and archaea involved in mineral sulfide bioleaching using real-time PCR. Biotechnology
and Bioengineering. Vol. 94 (2): 330-336
21. Persing D.H. 1991. Minireview. Polymerase chain reaction: trenches to benches. Journal of
Clinical Microbiology. Vol. 29 (7): 1281-1285.
22. Degrange, V., R. Bardin. 1995. Detection and Counting of Nitrobacter populations in Soil
by PCR. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 61 (6): 2093-2098.
24. Breed, A.W., G.S. Hansford. 1999. Effect of pH on ferrous-iron oxidation kinetics of
Leptospirillum ferrooxidans in continuous culture. Biochemical Engineering Journal. Vol. 3: 193-
201.
25. Norris, P.R., , D.W. Barr, D. Hinson. 1988. Iron and mineral oxidation by acidophilic
bacteria: affinities for iron and attachment to pyrite. Biohydrometallurgy, Proceedings of the
International Symposium, pp. 43-59. Edited by P.R. Norris&D.P. Kelly. Kew: Science and
Technology Letters.
26. Qiu, M-q., S-y. Xiong, W-m. Zhang, G-x. Wang. 2005. A comparrison of bioleaching of
chalcopyrite using pure culture or a mixed culture. Minerals Engineering. Vol. 18: 987-990.
76