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[Laboratório de Sanidade de Animais Aquáticos – Embrapa Amapá]

Dr. Marcos Tavares Dias

1) HEMOGLOBINA (g/dL) (Método de COLLIER 1944)

Drabkin
• 1,4 g de Fosfato monobásico de potássio (KH2PO4)
• 2,0 g de Ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6].
• 0,5 g de Cianeto de potássio (KCN).
• 1000,0 mL de Água Destilada.
OBS. Conservar em temperatura ambiente

Diluição prévia do sangue para leitura em espectrofotômetro (540 nm)

• 10 µL de sangue em 2,0 mL de Drabkin
• Deixar em repouso durante 30 minutos até a leitura.

LEITURA EM ESPECTROFOTÔMETRO EM 540 nm

• Primeiro zerar o aparelho com o Drabkin
• Depois fazer a leitura de cada amostra de sangue diluído em Drabkin (AS)

Fator de Conversão: Leitura da Absorbância em 540 nm x 0,146 *200 em g/dL

OBS: 200 é a diluição
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2) CONTAGEM DE ERITRÓCITOS SANGUÍNEOS OU RBC/µL (ou Red blood cells)

em Solução de Formol Citrato modificada por Oliveira et al.(2008), como
descrito a seguir:
OLIVEIRA-JUNIOR, A. A; TAVARES-DIAS, M.; MARCON, J.L. Biochemical and
hematological reference ranges for Amazon freshwater turtle, Podocnemis expansa
(Reptilia: Pelomedusidae), with morphologic assessment of blood cells. Research in
Veterinary Science, 86: 146–151 2008.

Formol-citrato
• 38,0 g de citrato de sódio
• 20,0 mL de formol (37-40%)
• 0,2 g de azul de toluidina
• Q.s.p 1.000,0 mL
OBS: Filtrar a solução antes do uso

Diluição para contagem de eritrócitos

• Colocar 10 µL de sangue total em 2 mL de Formol-Citrato [200*];
• Homogeneizar suavemente;
• Contar em câmara de Neubauer os eritrócitos (CE) em 5 áreas de 0,04 mm2 e
anotar o número de células contadas, e depois;
• Aplicar a fórmula: CE x 5 x 10 x 200/1.000.000 ou CE x 10.000/1.000.000
OBS: Valor obtido x 106/µL de sangue

OBS:
5= fator de conversão para 1 mm2 (área)
10=fator conversão para 1µL (volume)
200= fator de conversão para a diluição
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ÍNDICES HEMATIMÉTRICOS

VCM ( fL) [Volume corpuscular médio]= Hematócrito (Ht) x 10

RBC (µL)

CHCM (g/dL)[Concentração da hemoglobina corpuscular média= Hb x 100

Ht

3.Coloração das extensões sanguíneas pelo método coloração rápida com May-
Grunwald- Giemsa- Wrigth ( MGGW ) (Tavares-Dias & Moraes, 2003):
Tavares-Dias, M. & Moraes, F.R. Características hematológicas da Tilapia rendalli
Boulenger, 1896 (Osteichthyes: Cichlidae) capturada em "pesque-pague" de
Franca, São Paulo, Brasil. Bioscience Journal, 19: 103-110, 2003.

Solução Corante (MGGW):

▪ 1 g de Eosina-azul de metileno segundo May-Grunwald
▪ 1 g de Eosina e azul de metileno segundo Giemsa
▪ 0,5 g de Eosina-azul de metileno segundo Wrigth
▪ 1.000,0 mL de metanol
OBS: Preparar com pelo menos 3 dias antes de usar [Não usar antes de 3
dias de envelhecimento do corante].

Procedimento de coloração:
1. As extensões devem estar bem secas;
2. Cobrir toda a extensão com o corante durante 1 minuto
3. Diluir com uma solução tampão pH 7.0 (ou seja, acrescentar até a lâmina
estufar, mas sem derramar o corante) e deixar durante 7 minutos.
Homogeneizar com uso de uma pipeta
4. Em seguida, lavar as extensões em água corrente.
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5. No dia seguinte, passar as extensões rapidamente em metanol (5

mergulhadas) e lavá-las em água corrente.

Solução Tampão para Extensões Sangüíneas (pH 7,0)

 Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)................................1,63 g

 Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4).......................................3,20 g
 Água destilada q.s.p..................................................................1.000,0 mL

4) Método para contagem de leucócitos totais, usando as extensões sanguíneas

previamente coradas (Tavares-Dias & Moraes, 2006).
Tavares-Dias, M. & Moraes, F. R. Hematological parameters for the Brycon
orbignyanus Valenciennes, 1850 (Osteichthyes: Characidae) intensively bred.
Hidrobiológica, 16: 271-274, 2006

Deve-se fazer a contagem total de eritrócitos (RBC) em câmara de Neubauer

(Hemocitômetro) e também contar quantos leucócitos há na extensão sangüínea em
relação a 2.000 eritrócitos, homogeneamente distribuídos (evitar áreas com
aglomeração de células), na extensão sangüínea e depois aplicar a seguinte fórmula:

Leucócitos (L) = Leucócitos na extensão sanguínea x RBC (L)

2.000 eritrócitos na extensão

5) Método para contagem de trombócitos totais por estimação, usando as

extensões sanguíneas previamente cora (Tavares-Dias & Moraes, 2006).
Tavares-Dias, M & Moraes, F.R. Hematological parameters for the Brycon
orbignyanus Valenciennes, 1850 (Osteichthyes: Characidae) intensively bred.
Hidrobiologica, 16: 271-274, 2006

Deve-se fazer a contagem total de eritrócitos (RBC) em câmara de Neubauer

(ou Hemocitômetro) e também contar quantos trombócitos há em relação a 2.000
eritrócitos na extensão sangüínea, homogeneamente distribuídos (evitar áreas com
aglomeração de células) e depois aplicar a seguinte fórmula:
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Trombócitos (L) = Trombócitos na extensão sanguínea x RBC (L)

2.000 eritrócitos na extensão sanguínea

6) Contagem diferencial de leucócitos

Deve ser lida a extensão sangüínea previamente, de cada peixe, e obtido o
percentual (contagem relativa) de cada uma deles, em pelo menos 200 leucócitos
contados, e então se faz transformação em número absoluto (em L), como descrita
a seguir:

6.1.Contagem Relativa (%): Esta contagem é feita em no mínimo 200 leucócitos da

extensão sangüínea, mas em espécies que podem apresentam baixo número de
alguns granulócitos (eosinófilos, basófilos, etc), recomenda se contar 200 leucócitos,
no mínimo, para que a contagem fique bem distribuída e todas as células sejam vista
e contadas, uma vez que se percorre uma maior área na extensão sangüínea. Para
esta contagem, que é então uma determinação percentual de todos os leucócitos do
animal, ela não necessita de qualquer outro material que não seja as extensões
sangüíneas coradas.

6.1.Contagem absoluta (µL): Para esta contagem é necessário ter previamente uma
contagem dos leucócitos totais (WBC) e as extensões sangüíneas coradas. Em
seguida, deve ser feita a contagem diferencial dos leucócitos e depois somente
cálculos da contagem de cada tipo de leucócitos. Pega o valor da contagem de WBC
em L de sangue, para cada indivíduo da população estudada, e multiplicar esse valor
pelo percentual de cada tipo de leucócito encontrado na extensão sangüínea e dividir
por 100, o cálculo é então em L de sangue, veja abaixo:
 Por exemplo, WBC foi de 9500 L e a contagem relativa (em percentual) de
linfócitos foi de 40 (%), assim: 9500 x 40/100 = Linfócitos = 3800,0 L.

7. Determinação da Glicose plasmática (Kit Doles)

▪ 3,8 g de tampão enzimas (1 tampão enzimas).
▪ Balão volumétrico de 250 mL.
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Transfere-se todo o conteúdo de 1 frasco de tampão enzimas para 1 balão

volumétrico de 250 mL e completa-se o volume com Água Destilada/ Deionizada.
Agita-se levemente por inversão até a completa dissolução.
A solução permanece estável por 6 meses sob refrigeração (2-8 0C).

7.1 Reagente de Cor: Pipeta-se 1,0 mL de reagente de cor nos Testes, Branco e
Padrão.
7.2 Plasma: Pipeta-se 10 µL de plasma nos Testes.
7.3 Padrão: Pipeta-se 10 μL de Solução padrão no Padrão.
7.4 Água: Pipeta-se 10 μL de H20 no Branco.

Misturar por agitação e incubar por 10 minutos em Banho-maria, a 370C.

Retirar do banho-maria e fazer leitura das absorbâncias em espectrofotômetro
510 nm, zerando o aparelho com o Branco.

7.5 Cálculos: Glicose (mg/dL)= Absorbância da amostra x 100 (mg/dL)

Absorbância Padrão

8. Determinação de Proteína Total Plasmática (Kit Doles)

▪ Reagente de Biureto Concentrado (100 mL)
▪ Hidróxido de Sódio 6M
▪ Solução padrão
Adicionar a solução de 1 frasco de Biureto (concentrado) a 1 balão volumétrico
de 500 mL e acertar o volume até a marca utilizando H 20 destilada ou deionizada.
Homogeneizar bem e transferir para 1 frasco plástico.
A solução permanece estável por 2 anos, à temperatura de 20-30 0C.

8.1 Reagente de Cor: Pipeta-se 1,0 mL de reagente de cor nos Testes (Amostras),
Padrão e Branco.
8.2 Plasma: Pipeta-se 20 µL de plasma nos Testes (Amostras).
8.3 Padrão: Pipeta-se 20 μL de Solução padrão no Padrão.
8.4 Hidróxido de Sódio: 1 gota de Hidróxido de Sódio nos Testes, Padrão e Branco.
9.5 Água: Pipeta-se 20 μL de H20 no Branco.
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Homogeneizar e deixar em repouso durante 5 minutos, à temperatura ambiente

de (20-30 0C). Fazer a leitura das absorbâncias em espectrofotômetro 550 nm,
zerando o aparelho com o Branco.

9.5 Cálculos:

Proteínas Totais (g/dL)= Absorbância da amostra x 4 (g/dL)

Absorbância Padrão