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CAMARA DE NEUBAUER

Conteo en cámara de Neubauer.

Esta cámara se utiliza para conteo celular.

• Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.

• Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.

• Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe

quedar centrada.

• Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la

distribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña

o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser

continuo en un solo intento.

• La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del

recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la

apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del

recuadro

Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno

de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la 124

cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la

cámara de conoce como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se

ve de la siguiente manera:

• Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda

realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células

dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa

que hay tres líneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el
momento del conteo ya que definen cuales células son contables o cuales

están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la segunda línea

son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen. Gráficamente

se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las células que tiene una X son

las que no se deben contar.

Después de contar las células se procede a calcular la el numero de células

por unidad de volumen. Para esto se utiliza el área de cada cuadro, el espacio

ocupado por el líquido en el que están las células que es el mismo espacio que

hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla de cuarzo.

Método del Ácido Dinitrosalicílico (DNS)


Pasos para preparar DNS:
• Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada.
• Adicionar 30 g de tartrato de Na y K
• Adicionar 1 g de DNS
• Aforar a 100 mL con H2O destilada
• Almacenar en frascos ámbar a 4 ºC
Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 ºC. A partir
de la solución de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrón
con la siguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4.
Procedimiento:
• Tomar 0.5 mL de cada dilución y agregar 0.5 mL de reactivo DNS.
• Preparar una muestra blanco por dilución de 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL
del reactivo de DNS.
• Agitar todas las muestras.
• Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos.
• Enfriar con hielo.
• Adicionar 5 mL de H2O destilada.
• Agitar y dejar en reposo 15 min.
• Leer a 540 nm.
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• Realizar la curva Absorbancia versus concentración. Debe tener un coeficiente
de correlación de 0.991 a 0.999.

Método de Lowry
Para obtener la curva estándar de Albúmina se preparan 5 soluciones patrones de
Albúmina en NaCl al 0.9% (P/V) de las siguientes concentraciones: 15.2, 80, 200,
300 y 400 μg/mL. Si la concentración de Proteína es menor de 500 μg/mL se lee
la absorbancia a 750 nm, si está entre 1000 y 2000 μg/mL se lee a 550 nm. Se
prepara un blanco que no lleva Albúmina y en su reemplazo se adicionan 0.5 mL
de solución salina (NaCl) al 0.9% (P/V). Se aplica el mismo procedimiento que a
las demás muestras.
Procedimiento:
• Servir en tubos de ensayo 0.5 mL de las soluciones patrón de albúmina, las
muestras problema y NaCl al 0.9% como blanco. Deben estar marcados para
conservar el orden de concentraciones para la curva.
• Adicionar a cada tubo 0.5 mL de NaOH 2N y llevar al baño María precalentado
a 100°C por un tiempo de 10 minutos.
• Dejar enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente.
• Agregar a cada tubo 5 mL de la solución complejante, mezclar y dejar reposar
por 10 minutos.
• Adicionar 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu 1:1, vortexiar durante 20
segundos.
• Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos.
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patrón construir la gráfica
Absorbancia vs. Concentración de albúmina sérica de bovina (BSA); con esta se
puede determinar la concentración de las muestras problema interpolando el valor

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