RECOPILADO POR: EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS

NMX-F-256-1977. CUENTA MICROSCPICA DIRECTA EN ALIMENTOS. DIRECT MICROSCOPIC COUNTS IN FOOD. NORMAS MEXICANAS. DIRECCIN GENERAL DE NORMAS. 0. INTRODUCCIN

La cuenta microscpica directa es una tcnica til para obtener informacin sobre la carga bacteriana total de un alimento. Se emplea en diversos alimentos aprovechando ciertas ventajas que muestra sobre el recuento de colonias en placa: no requiere incubacin y por tanto el resultado se obtiene en pocos minutos; el material de estudio (frotis) se puede conservar o transportar sin deterioro durante mucho tiempo; su costo es reducido, y permite finalmente la observacin directa del tipo de flora bacteriana presente. Sin embargo, el mtodo no permite diferenciar clulas viables, de muertas en la muestra original y el volumen de alimento estudiado es muy pequeo y por ello de menor significado al referirlo al lote del cual proviene. 1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIN

Esta Norma especifica el mtodo de prueba para determinarla cuenta microscpica directa en alimentos. 2. 2.1 MATERIALES Y REACTIVOS Materiales Microscopio compuesto de preferencia binocular con objetivo de inmersin Disco ocular sub-dividido en cuadros o cuadrantes para facilitar el recuento por campo Platina mvil. Micrmetro objetivo para calcular el factor del microscopio. Porta-objetos limpios y desengrasados. Placas guas con reas de 1 cm2 para colocarla bajo los porta-objetos. Pipetas o jeringas estriles para transferir 0.01 ml. Vasos de koplin o equivalente. Contador manual. Asa de platino o micrmel con un doblez terminal en ngulo recto de 0.5 cm. Solucin de cloruro de azul de metileno:

En un frasco de 200 ml que contenga 52 ml de alcohol etlico al 95 % y 44 ml de tetracloroctano adicional lentamente 0.6 g de cloruro de azul de metileno certificado. Agitar hasta disolucin. Dejar reposar en la obscuridad durante 12 a 24 horas a 4.4 a 7 .2. Filtrar con papel filtro whatman No 42 equivalente. Adicionar al filtro 4 ml de cido actico glacial. Guardar en un frasco limpio de color mbar y con cierre hermtico (Tapn de baquelita) y conservar en un lugar obscuro y fresco. No refrigerar.

 3. 3.1

Agua destilada. Aceite de inmersin. PROCEDIMIENTO Calibracin del microscopio.

3.1.1 Medir el campo microscpico por medio de un portaobjetos micromtrico marcado en divisiones de 0.1 y 0.01 mm. Leer hasta la tercera cifra decimal (radio del campo en mm). 3.1.2 Usar la siguiente formula para calcular el factor del microscopio. (FM) = Factor del microscopio 10,0000 FM = -------------------3.1416 x r 3.2 Preparacin del frotis.

r = radio en milmetro

Colocar los portaobjetos sobre las placas gua marcadas con reas de 1 cm Agitar la muestra vigorosamente (25 veces). Medir 0.01 ml de muestra con una pipeta o jeringas calibradas. Introducirla lo suficiente para evitar la presencia de espuma, limpiar el exterior de la pipeta con papel. Aforar. Colocar la punta de la pipeta cerca del centro el rea de 1 cm. Descargar 0.01 ml . Extender rpidamente la muestra o la dilucin correspondiente sobre la superficie marcada de 1 cm, por medio de una asa doblada en ngulo recto. Identificar perfectamente los frotis. Secar los frotis sobre una superficie nivelada, libre de polvo y fuera del alcance de insectos a 40 o 45C durante 5 minutos. Sumergir el frotis seco y fijado en el colorante (cloruro de azul de metileno) durante 2 minutos. Escurrir el exceso de colorante en un papel absorbente. Secar perfectamente. Enjuagar 3 veces con agua destilada a 37 a 45C Escurrir y secar. 3.3 Lectura.

3.3.1 Observar con el objetivo de inmersin y contar todo el grupo bacteriano que se encuentra en cada campo. 3.3.2 Contar como grupos separados:

3.3.2.1 Cualquier microorganismo o grupo de microorganismo (aparentemente de la misma especie) separados por una distancia igual o mayor que el doble del dimetro de la clula ms pequea del grupo. 3.3.2.2 Los microorganismos de diferente morfologa 3.3.2.3 Las formas dipocccicas de estreptococos. 3.3.3 El nmero de campos que se examinen dependen del factor microscpico y del grado de contaminacin de la muestra: a mayor factor microscpico, se debe examinar mayor nmero de campos . 3.3.4 Examinar el nmero mayor de campos cuando se trate de una muestra con escaso contenido bacteriano. 3.3.5. El siguiente cuadro puede servir de orientacin para determinar el nmero de campos por observar en cada caso.

DIMETRO DEL CAMPO

CUENTA POR ml g

Menos de 300,000
30 40 50 60

300,000-3,000,000
20 20 20 30

Ms de 3,000,000
10 10 10 16

0.206 0.178 0.160 0.146

4.5 Multiplicar el promedio de grupos por campo por el factor del factor del microscopio y por la inversa de la dilucin . El producto anterior corresponde al nmero de grupos microbianos por mililitro gramos de producto. Informar: Cuenta microscpica directa de grupos bacterianos por gramo mililitro 5. BIBLIOGRAFA

Tcnicas para el muestreo y anlisis microbiolgico de alimentos, Direccin General de Investigacin en Salud Pblica, Secretara de Salubridad y Asistencia. 1975. 6. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES

Esta Norma coincide totalmente con las recomendaciones hechas por el Comit Internacional sobre especificaciones microbiolgicas para alimentos.