Seminário de Parasitologia Clínica

02/05/2022

DIAGNOSTICOS IMUNOLÓGICOS
principais técnicas imunológicas utilizadas na identificação de parasitas

Abla Gomes Teixeira - 22270

Bianca Luiza de Souza Bitencourt - 22690
Carolina dos Santos Freitas - 22539
Gabriela Duarte Silva Fonseca – 22803
Maria Clara Macedo de Azevedo - 22220
Mariana F. do Nascimento - 3071
DIAGNOSTICOS IMUNOLÓGICOS

As parasitoses são causas relevantes de agravo à saúde em países subdesenvolvidos

e em desenvolvimento, onde condições sócio-econômicas-culturais permitem a manutenção
e disseminação de ciclos biológicos de vários parasitas. Os parasitas intestinais são um dos
principais fatores debilitantes da população, associando-se frequentemente a quadros de
diarreia crônica e desnutrição, comprometendo o desenvolvimento físico e intelectual,
particularmente das faixas etárias mais jovens da população.

Os métodos imunológicos a serem empregados no diagnóstico de qualquer patologia

devem apresentar altas sensibilidade e especificidade, utilizar reagentes estáveis, além de
ser práticos e econômicos.

Os testes detectam a presença de anticorpos contra parasitas, fungos, bactérias ou

vírus. Podem também detectar a presença dos antígenos desses agentes, indicando
diretamente a sua presença no hospedeiro. Os testes imunológicos podem ainda ser
utilizados para a detecção de hormônios ou outras substâncias químicas.

A escolha do teste deve levar em consideração, principalmente, sua sensibilidade e a

especificidade. Teste de maior sensibilidade devem ser utilizados como triagem de indivíduos
já doentes, pois tendem a ter menor número de reações falso-negativas. Para confirmação de
um diagnóstico deve-se buscar técnicas mais específicas.

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

O teste de imunofluorescência tem o objetivo de diagnosticar doenças tanto em

humanos quanto em animais. Doenças dermatológicas como dermatites, colagenases, no
diagnóstico de sífilis, de autoanticorpos autoimunes, detecção direta de microrganismos como
bactérias, parasitas, em secreções como urina, fezes, cortes histológicos de tecidos (tumores)
e investigação de parasitoses.

Os testes indiretos são utilizados para mensurar anticorpos no soro, quando são
mensurados, o antígeno é empregado em esfregaço que sofre incubação com soro suspeito
de conter anticorpos contra o antígeno. O soro é lavado, deixando apenas os anticorpos
específicos ligados ao antígeno e são visualizados por meio da incubação do esfregaço em
antiglobulina marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC), o corante fluorescente. A
quantidade de anticorpos no soro testado pode ser estimada ao se examinar diluições
crescentes do soro em diferentes preparações de antígenos (TIZARD, 2009).

Teste de imunofluorescência (passo a passo):

1. Existem protocolos de Antígenos que são escolhidos de acordo com o material a ser
analisado onde são fixadas a lâminas de vidro para posteriormente adicionarmos o material;

2. Realiza-se a diluição do soro teste, colocando-o sobre o antígeno e incubando-o para que
possa formar o complexo antígeno-anticorpo.

3. Na etapa seguinte são feitas várias lavagens para a retirada dos anticorpos que não foram
ligados na reação.
4. Toda a reação é incubada com o marcador fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o
marcador reage com o anticorpo específico para o antígeno.

5. Antígeno específico + Marcador fluoresceinado → Observa-se a reação no microscópio.

6. Anticorpo pesquisado visualizado para leitura.

IMUNOENSAIO ENZIMÁTICO - ELISA (“Enzyme Linked Immunosorbent Assay”)

Trata-se de técnica imunoenzimática sensível, heterogênea (múltiplas fases), para a

quantificação de antígenos ou anticorpos. Um dos reagentes é imobilizado na fase sólida,
enquanto outro pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática
como da imunológica do anticorpo.
 A fase sólida pode ser constituída por partículas de agarose, poliacrilamida, dextrano,
poliestireno, etc. Placas plásticas são as mais difundidas por permitirem múltiplos ensaios e
automação. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou
anticorpos, podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros forem bem
padronizados.

Para a pesquisa de antígeno o anticorpo específico correspondente é imobilizado à

fase sólida. Os conjugados enzimáticos devem ser preparados com anticorpos de alta
afinidade e muito purificados. Os substratos cromogênicos empregados pela degradação
enzimática dão origem a produtos solúveis coloridos, cuja determinação é feita medindo-se a
densidade ótica da solução por espectrofotometria. Para a peroxidase, o substrato é o
peróxido de hidrogênio e os cromógenos ou doadores de hidrogênio mais utilizados são a
ortofenilenodiamina (OPD), ácido 5-amino-salicílico, ortotoluidina, 2,2’-diazino do ácido
etilbenzotialino sulfônico (ABTS) e tetrametilbenzidina (TMB).

O ELISA direto é quando o alvo é um antígeno ligado à placa, e um anticorpo primário

conjugado a um emissor de cor é colocado diretamente ao alvo. O ELISA indireto é mais
usado e é bem parecido com o direto. Tem como alvo um antígeno, porém é detectado em 2
passos, primeiro um anticorpo primário é ligado ao antígeno e depois um anticorpo secundário
é ligado novamente (um anti-anticorpo), e então detecta-se esse anticorpo secundário.

O ELISA de competição é um método que pode detectar um antígeno com baixo peso
molecular ou com poucos epítopos de ligação. Utiliza um antígeno marcado para competir
com o antígeno alvo, então, o antígeno marcado se liga menos quanto tem menos antígenos
alvos na amostra. O ELISA sanduíche é o mais comum, em que anticorpos de captura são
ligados ao fundo da placa, para evitar que nenhum outro anticorpo interfira na reação com os
antígenos alvo que possivelmente estarão presentes na amostra. E então, são adicionados
anticorpos conjugados à enzima para que façam o reconhecimento do antígeno.

É utilizado para diagnóstico das seguintes doenças parasitarias: esquistossomose,

giardíase, amebíase, teníase, ancilostomíase, entre outras.

As vantagens do método de ELISA é ser um teste de alta sensibilidade, detectando

quantidades mínimas do alvo pesquisado, com isso tem menor risco de falso negativo, e com
alta especificidade, com muita precisão no resultado daquilo que se pesquisa, com isso tem
menor risco de falso positivo, pode-se realizar o teste em várias amostras ao mesmo tempo,
rápido e simples de ser realizado. As desvantagens é que necessita de mão de obra
especializada, é um este muito susceptível a erros mecânicos, como erro de pipetagem,
variação no tempo de incubação e lavagem, e alterações nos reagentes.
TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO

O teste imunocromatográfico é um tipo de teste rápido que identifica doenças

infecciosas, hormônios e outros analitos, por associação específica a anticorpos com
partículas coloridas conjugadas.

O resultado de um teste de imunocromatografia geralmente considera a presença de

antígenos na amostra. Antígenos são substâncias externas que, uma vez no organismo,
desencadeiam a produção de anticorpos, as proteínas que são as principais responsáveis
pelas defesas do nosso organismo.

O primeiro passo para a realização de um teste imunocromatográfico é a coleta da

amostra, que pode ser de sangue, saliva, soro, plasma, secreção da nasofaringe, urina, etc..
Essa amostra é depositada no local indicado do exame, junto com uma solução-tampão (uma
solução aquosa capaz de resistir a mudanças de pH) e aguardar o tempo de reação.

O resultado é demonstrado através do surgimento de marcadores coloridos em uma

membrana de nitrocelulose ou nylon que possui áreas reagentes e outras bloqueadas com
proteína inerte. O analito reage nos locais correspondentes, formando um padrão que deve
ser lido e interpretado pelo profissional da saúde, ou de acordo com as instruções do
fabricante.

A solução tampão (um líquido que permite manter o pH da reação estável e ajudar a
molhar a membrana de nitrocelulose, levando os anticorpos do sangue para uma área
intermediária que fica protegida do meio externo pelo carcaça do teste), nessa área
intermediária, se encontra o conjugado, que irá se ligar aos anticorpos do sangue (caso a
pessoa seja positiva). A medida que esses produtos correm pela membrana, eles encontram
a área de teste (marcado com T na maioria dos produtos). Lá eles entrarão em contato com
os antígenos de interesse. Caso a amostra de sangue for positiva, os anticorpos do paciente
se ligarão aos antígenos e ficarão presos lá, que acabará formando uma faixa avermelhada.
O restante dos anticorpos e do conjugado que não se ligou seguirá pela fita até serem parados
por anticorpos que se prendem a qualquer outro anticorpo. Se tudo deu certo, essa parte
também terá cor (a área de controle (C).
 A grande vantagem desse teste é a facilidade em ser aplicado, mesmo em áreas longe
de laboratórios e eletricidade e permite fazer uma triagem de uma determinada doença em
uma região. É um teste rápido, da coleta da amostra ao resultado, não costumam se passar
mais do que 15 minutos; de baixo custo, a realização do exame não demanda estrutura
laboratorial complexa, e todos os componentes são descartáveis; além da praticidade, são
facilmente encontrados em farmácias, a realização dos exames pode ser executada pelo
próprio farmacêutico (mediante treinamento apropriado).

Atualmente existem cinco principais tipos de testes imunocromatográficos disponíveis no

Brasil: imunocromatografia de fluxo lateral, imunocromatografia de dupla migração, teste por
aglutinação e teste por fase sólida.

Independentemente da metodologia por trás do exame, um teste imunocromatográfico

pode ter 3 resultados possíveis:

-Positivo / Reagente: o mostrador exibe duas linhas visíveis, uma na região controle (C) e
outra na região teste (T). A intensidade de cor da linha teste (T) pode variar de acordo com a
concentração de antígeno detectada na amostra, mas se a linha é visível, em qualquer
intensidade, indica reação, ou seja, presença do analito e resultado positivo.

-Negativo / Não reagente: Quando temos resultado não reagente, identifica-se apenas uma
linha visível no mostrador, na região controle (C). O marcador teste (T) não sofre alteração,
indicando ausência do analito.

-Inválido: Um teste de imunocromatografia apresenta resultado inválido quando nenhuma

reação é detectada: A linha controle (C) sempre precisa apresentar reação e ficar visível. Caso
ela não apareça, recomenda-se a execução de um novo teste.

Testes de malária, neurocisticerose, leishmaniose visceral, chagas são exemplos de

parasitoses que podem ser diagnosticadas pelo teste rápido.
RFERENCIAS UTILIZADAS

UECKER, M., et al. Infecções parasitárias: diagnóstico imunológico de enteroparasitoses.

Revista Brasileira de Análises Clínicas, vol. 39(1): 15-19, 2007.

Macedo, H. W., et al. Avaliação de testes imunológicos para o diagnóstico da

neurocisticercose. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, Rio de Janeiro,
v. 38, n.2, p. 93-103, 2002.

Coordenadoria de Vigilância em Saúde. Núcleo de vigilância epidemiológico. SECRETARIA

DE SAÚDE DO ESTADO DO CEARÁ. Disponível em: https://www.saude.ce.gov.br/wp-
content/uploads/sites/9/2018/06/NOTA-T%C3%89CNICA-NOVO-TR-LSH-Ab-ECO-Teste-
LV_1_07_01_2020.pdf .

Bender, A. L., Mühlen, C. A V. Capítulo 5, Testes laboratoriais aplicados à imunologia

clínica. Disponível em: http://docente.ifsc.edu.br/rosane.aquino/MaterialDidatico/Analises
Clinicas/avalia%C3%A7%C3%A3o/Testes-Laboratoriais-Aplicados-Imunologia-Clinica.pdf

Vidal, A. M. B., Catapani, W. R. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

immunoassaying versus microscopy: advantages and drawbacks for diagnosing giardiasis.
Associação Paulista de Medicina, São Paulo Med J. 2005;123(6):282-5.
ESTUDO DIRIGIDO

1) Qual é o objetivo do teste de imunofluorescência?

O teste de imunofluorescência tem o objetivo de diagnosticar doenças tanto em humanos

quanto em animais. Doenças dermatológicas como dermatites, colagenases, no diagnóstico
de sífilis, de autoanticorpos autoimunes, detecção direta de microrganismos como bactérias,
parasitas, em secreções como urina, fezes, cortes histológicos de tecidos (tumores) e
investigação de parasitoses.

2) Preencha as lacunas e assinale a alternativa correta.

O teste_________ , também conhecido como técnica de dupla camada, é utilizado na

detecção de anticorpos no _________ do paciente por meio de antígenos fixados em
uma lâmina, na qual se aplica primeiramente um __________ específico não
fluorescente.

a) ELISA / soro / anticorpo

b) Da imunofluorescência indireta / soro / anticorpo
c) ELISA / anticorpo / antígeno
d) Da imunofluorescência direta / plasma / anticorpo

Resposta: letra B

3) Cite uma vantagem e uma desvantagem da técnica de ELISA para o diagnóstico

de parasitoses.

Vantagem: é um teste de alta sensibilidade, e alta especificidade, rápido e simples de ser

realizado
Desvantagem: necessita de mão de obra especializada, e susceptível a erros mecânicos,
como erro de pipetagem

4) São características da técnica de ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática)

EXETO:
a) Boa sensibilidade e especificidade.
b) Rapidez e baixo custo.
c) Subjetividade na leitura.
d) Possibilidade de adaptação a diferentes graus de automação.

Resposta: letra C
 5) Quais as vantagens do teste imunocromatográfico mediante os outros testes
imunológicos?

É um teste rápido, da coleta da amostra ao resultado, não costumam se passar mais do que
15 minutos; de baixo custo, a realização do exame não demanda estrutura laboratorial
complexa, e todos os componentes são descartáveis; além da praticidade, são facilmente
encontrados em farmácias, a realização dos exames pode ser executada pelo próprio
farmacêutico (mediante treinamento apropriado).

6) Cite doenças que podem ser diagnosticadas com o teste imunocromatográfico.

Doença de chagas, leishmaniose visceral, malária.

7) O material utilizado para realizar o teste imunocromatográfico é apenas sangue?

Não. Também pode ser utilizado, saliva, urina, secreção traqueal, etc.