Unidad 3. Estudio de cultivos bacterianos puros y Unidad 4.

Estudio microscpico y cultivo de hongos algas y protozoarios

Prctica 5. Tcnicas de siembra y cultivo de bacterias y hongos

Objetivos
Al finalizar este ejercicio el alumno ser capaz de: Aplicar las diferentes tcnicas de siembra que se emplean para el estudio y asilamiento de bacterias y hongos levaduriformes y filamentosos. Relacionar la presentacin del medio de cultivo con la tcnica de siembra. Distinguir las condiciones de incubacin para el cultivo de bacterias y hongos. Describir las caractersticas morfolgicas macroscpicas y microscpicas de las bacterias y hongos (levaduriformes y filamentosos) Comprobar la pureza de los cultivos mediante tinciones simples y/o diferenciales

Introduccin
La identificacin de microorganismos se basa en la observacin de las caractersticas microscpicas y de desarrollo que presentan en medios lquidos, semislidos y slidos. En los ltimos la formacin de colonias visibles con caractersticas particulares permite diferenciar a los microorganismos, as como detectar contaminantes en los cultivos puros.

Materiales
Cultivos puros de bacterias: Escherichia coli Serratia marcescens Micrococcus luteus Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptomyces griseus Streptomyces erythraeus Cultivos puros de hongos:

Saccharomyces cerevisiae Rhodototula sp Penicillum sp Aspergillus niger Rhizopous sp Alternaria sp Fusarium sp

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 Material por equipo 1 Microscopio 2 mecheros 2 gradillas 2 asas bacteriolgicas 2 asas micolgicas 1 vaso de precipitados de 250mL Colorantes 1 juego de colorantes de Gram Lactofenol azul de algodn Azul de metileno para tincin simple Medios de cultivo 8 cajas de Petri con Tripticasa soya agar 2 cajas con YPDM 4 cajas con Agar Sabouraud Material que deben tener los alumnos: 4 tubos con caldo BHI* 2 tubos con medio semislido* 4 tubos con agar BHI inclinado* Pipetas Pasteur estriles Portaobjetos

Metodologa
1 sesin Cultivo de bacterias, hongos y actinomicetos
Siembra de bacterias (Cada equipo debe sembrar 2 bacterias diferentes)

1. A partir de la muestra problema preparar un frote, teir con Gram y observar a inmersin 2. Registrar sus observaciones 3. Organizar el material de modo que cada alumno cuente con lo siguiente 4 cajas con TSA 2 tubos con caldo* 2 tubos con agar inclinado* 1 tubo con medio semislido* * Material preparado la prctica anterior 4. Identificar las cajas de Petri y tubos de ensayo con plumn indeleble o con etiquetas con los siguientes datos:
1515-09-# de equipo Nombre del microorganismo dd/mm/aa

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Tener cuidado de que las anotaciones queden en la periferia de la base de la caja o cerca de la boca del tubo. 5. A partir de la muestra bacteriana inocular una asada en un tubo con 7mL de caldo BHI (tubo 1). 6. A partir del tubo 1 inocular el material que se muestra en el cuadro siguiendo es esquema de trabajo. 7. Sellar con las cajas dos tiras de masking tape, y colocar los tubos en un bote de metal o plstico. Incubar los dos tubos y las cajas invertidas a 37 C durante 24 horas en condiciones aerbicas. 8. Transcurrido el tiempo de incubacin, revisar y guardar en refrigeracin a 4C.
1 tubo con caldo mediante la transferencia una gota con

pipeta Pasteur.

1 tubo con agar semislido mediante picadura (emplear

el asa recta o en aguja)

2 tubos con agar inclinado. Uno con estra recta y el

segundo con estra ondulada.

1 caja

de Petri con hisopo mediante la tcnica de extendido o siembra masiva. Esta tcnica tambin puede hacerse con asa bacteriolgica.

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 1 caja de Petri con el asa trazar una estra simple en un

cuarto de caja (cuadrante simple). Esta tambin puede aplicarse en el rea total de la caja.

2 cajas de Petri con el asa trazar una serie de estras con

el fin de aplicar la tcnica de cuadrante radial o estriado por agotamiento.

Organigrama
Cepa bacteriana

Siembra con asa

Tincin de Gram

Tubo 1 Caldo BHI

Caldo BHI Siembra con pipeta Pasteur

Medio semislido Siembra con aguja de siembra por picadura

Agar BHI Siembra con asa, estra recta y estra ondulada

Agar BHI Siembra con asa, cuadrante simple

Agar BHI Siembra con hisopo, siembra masiva

Agar BHI Siembra con asa, cuadrante radial

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 Siembra de actinomicetos o bacterias filamentosas (Cada equipo debe sembrar 2

bacterias diferentes) 1. A partir de la muestra problema preparar un frote, teir con Gram y observar a inmersin 2. Registrar sus observaciones 3. Con una pipeta Pasteur estril colocar en un extremo de la placa de YPDM dos gotas del cultivo de Streptomyces griseus o Streptomyces erythraeus 4. Esterilizar el asa y estriar el cultivo sobre el medio con la tcnica de cuadrante radial 5. Identificar las cajas de Petri con plumn indeleble o con etiquetas con los siguientes datos:
1515-09-# de equipo Nombre del microorganismo dd/mm/aa

6. Sellar las cajas, invertirlas e incubar a 28 C durante 3 a 7 das

Con el asa trazar una serie de estras con el fin de aplicar la

tcnica de cuadrante radial o estriado por agotamiento.

Siembra de hongos levaduriformes (Cada equipo debe sembrar 2 levaduras diferentes)

1. Con el asa inocular 1 placa de Agar Sabouraud con el cultivo del hongo correspondiente. Emplear la tcnica de estra radial. 2. Identificar las cajas de Petri con plumn indeleble o con etiquetas con los siguientes datos:
1515-09-# de equipo Nombre del microorganismo dd/mm/aa

3. Sellar las cajas, invertirlas e incubar a 28 C de 2 a 5 das.

Siembra de hongos filamentosos (Cada equipo debe sembrar 2 hongos filamentosos

diferentes) 1. Identificar las cajas de Petri con plumn indeleble o con etiquetas con los siguientes datos:
1515-09-# de equipo Nombre del microorganismo dd/mm/aa

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2. Esterilizar el asa micolgica y dejar enfriar dentro de la zona asptica 3. Tomar una pequea cantidad del cultivo del hongo seleccionado y sembrar en el centro de la placa de Agar Sabouraud, para ello presionar ligeramente el asa sobre la placa 4. Sellar las cajas e invertirlas. 5. Incubar a 28 C de 5 a 7 das.

2 sesin Resultados del desarrollo de bacterias, hongos y actinomicetos

Resultados de bacterias

1. Describir las caractersticas de desarrollo en los tubos (medio lquido, semislido y slido) y en las cajas de acuerdo con las guas de observacin del manual de Microbiologa General. 2. A partir del cultivo lquido y de dos colonias aisladas preparar 3 frotes y teir con Gram. 3. Registrar sus resultados en el cuadro 1.
Bacterias filamentosas

1. Revisar las caractersticas coloniales. 2. Preparar un frote y teir con Gram. 3. Comparar la morfologa colonial y microscpica de las bacterias estudiadas en la sesin anterior y la actual. 4. Registrar los resultados en el cuadro 2.
Hongos levaduriformes

1. Revisar las caractersticas coloniales. 2. Realizar un frote y una tincin simple de cada una de las levaduras en estudio. 3. Comparar la morfologa colonial y microscpica con las caractersticas de las bacterias. 4. Registrar los resultados en el cuadro 3. La descripcin de las colonias debe hacerse de acuerdo con las caractersticas indicadas en el Manual de Microbiologa General.
Hongos filamentosos

1. Revisar las caractersticas coloniales. 2. Mediante la tcnica de impronta con diurex, hacer una preparacin en fresco y teir, para ello: Cortar un pedazo de diurex de aproximadamente 1.5 cm. Colocar una gota de lactofenol azul de algodn en un portaobjetos limpio y desengrasado. Esterilizar el asa micolgica y dejar enfriar. Colocar el diurex en el extremo del asa y presionar el diurex sobre el cultivo de hongo en caja cuidando de no frotar (figura 1). ME1515 2011/2 - Prctica 5 - Pgina 6

 Con ayuda del asa bacteriolgica depositar el diurex (con la muestra hacia el

colorante) en el portaobjetos (figura 2). Agregar una gota de colorante sobre el diurex para evitar la formacin de burbujas. Colocar un cubreobjetos (figura 3). 3. Observar al microscopio con los objetivos 10x y 40x Registrar los resultados en el cuadro 4, para ello describir las caractersticas de los hongos con ayuda de los esquemas del Manual de Microbiologa General.

Fig. 1. Toma de muestra por impronta.

Fig. 2. Colocacin del diurex en el portaobjetos.

Fig. 3. Muestra lista para observarse al microscopio.

Disposicin de desechos
1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los laboratorios 2. Despus de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solucin sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un frasco con alcohol al 95 %. 3. En el caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel, esterilizar el paquete en autoclave y despus desecharlos en el contenedor de vidrio roto 4. Los cultivos muestra deben ser esterilizados en autoclave, antes de ser desechados. 5. Despus de observar las caractersticas de desarrollo, esterilizar los cultivos en autoclave. 6. Vaciar el agar sobre un papel y envolverlo 7. Colocar el paquete en una bolsa de plstico y depositarla en el contenedor correspondiente. 8. Sellar las cajas de plstico con cultivos y depositarlas en el contendor rojo del laboratorio A

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 Cuadro 1. Caractersticas microscpicas y de crecimiento en medios lquidos, semislidos

y slidos, inoculados mediante diferentes tcnicas

Nombre cientfico de la bacteria: ______________________________________________________

Presentacin del medio de cultivo y tcnica de siembra Caractersticas microscpicas

Caractersticas de desarrollo

Resultados

Forma Agrupacin Gram Caldo inoculado con Superficial (pelicular o anillado) asa Sedimento Turbiedad Picadura en medio Caractersticas de crecimiento semislido Movilidad (+ o -) Agar vertical inoculado con pipeta Agar inclinado Superficial En todo el medio En el fondo Formacin de burbujas Forma del crecimiento: (filiforme, perlado o arborescente) Color Textura (acuosa, butirosa, cremosa, membranosa, viscosa) Consistencia (seca, hmeda) Desarrollo masivo o confluente Presencia de colonias aisladas Color Desarrollo a lo largo del estriado Presencia de colonias aisladas Caractersticas de las colonias: Forma (puntiforme, circular, ameboide, rizoide, fusiforme) Color (blanquecino, blanco opaco, amarillo etc) Borde (entero, ondulado, lobulado, crenado, filamentoso) Elevacin (plana, elevada, convexa, rugosa, papilar, embonada) Textura (acuosa, butirosa, cremosa, membranosa, viscosa) Consistencia (seca, hmeda)

Placa por extensin o masivo Placa cuadrante simple

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Placa estra radial (cuadrante radial o agotamiento)

Presencia de colonias aisladas Caractersticas de las colonias: Forma (puntiforme, circular, ameboide, rizoide, fusiforme) Color (blanquecino, blanco opaco, amarillo etc) Borde (entero, ondulado, lobulado, crenado, filamentoso) Elevacin (plana, elevada, convexa, rugosa, papilar, embonada) Textura (acuosa, butirosa, cremosa, membranosa, viscosa) Consistencia (seca, hmeda)

Cuadro 2. Caractersticas microscpicas y de crecimiento de bacterias filamentosas

Nombre cientfico de la bacteria: _________________________________________________________

Caractersticas coloniales

Caractersticas microscpicas

Forma Color Elevacin Textura Aspecto (seco, hmedo) Forma Otras estructuras Gram

Cuadro 3. Caractersticas de crecimiento y microscpicas de un hongo levaduriforme

Nombre cientfico: _______________________________________________________________________

Coloniales

Microscpicas

Color Aspecto superficial (liso, rugoso, cerebriforme) Consistencia (cremosa, seca) Forma Tamao relativo con respecto a las bacterias Presencia y distribucin de blastosporas

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 Cuadro 4. Caractersticas de crecimiento y microscpicas de un hongo filamentoso

Nombre cientfico: _______________________________________________________________________

Coloniales

Microscpicas

Desarrollo (escaso, medio, abundante) Color Aspecto del micelio superficial (algodonoso laxo, lanoso, aterciopelado) Color del micelio profundo Aspecto del micelio profundo (homogneo, con anillos concntricos, sectorial Color Tipo de hifas (cenoctica, septada) Tipo de cuerpo fructfero (esporangiforo, conidiforo) De las esporas: Morfologa (esfrica, oval, reniforme, fusiforme) Color Aspecto externo (lisas, punteadas, estriadas, verrugosas)

Bibliografa complementaria
Cappuccino, James G. and Sherman Natalie. 2005. Microbiology: a laboratory

manual. 7th edition. Pearson/Benjamin Cummings. USA. QR63 C36 2005. Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and application. 2nd edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006. Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition. Pearson Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006 Prescott Lansing M., Harley John P. and Klein Donald A. 2005. Microbiology. 6th edition. McGraw-Hill. USA. QR41.2 P74 2005 Ramrez-Gama, R. M., B. Luna Milln, O. Velsquez Madrazo, L. Vierna Garca, A. Meja Chvez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernndez Gmez, I. Mggenburg, A. Camacho Cruz y M del C. Urza Hernndez. 2006. Manual de Prcticas de Microbiologa General. 5 edicin. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico. Schaechter Moselio, Ingraham John L. and Neidhardt Frederick C. 2006. Microbe. American Society for Microbiology. USA. QR41.2 S288 Tortora Gerard J., Funke Berdell R. and Case Christine L. 2007. Microbiology : an introduction. 9th edition. Benjamin Cummings. USA. QR41.2 T67 2007

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