RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA Determinação de glicose em amostras biológicas por espectrofotometria no UV-Vis

1. INTRODUÇÃO

A luz é uma forma de radiação eletromagnética, e pode ser uma mistura de diversas ondas com comprimentos de onda distintos, chamada de policromática, ou apenas um comprimento de onda definido, chamada de monocromática. O comprimento de onda é representando pelo símbolo , medido em nanômetros (nm, 10 -9 m) e indica a distância medida longitudinalmente entre dois picos ou vales da onda. O espectro eletromagnético representa as diferentes faixas de radiação em função do comprimento de onda e freqüência da onda. A freqüência é o movimento oscilatório da onda, medida em oscilações por segundo (s -1) ou Hertz (Hz). Em um espectro eletromagnético cujo comprimento de onda aumenta para a direita, as ondas mais enérgicas e de maior freqüência estão no extremo esquerdo (raios gama e raios-X), enquanto as radiaçõe s mais fracas estão à direita. Assim, a energia contida em uma onda é tão maior quanto menor o comprimento de onda e maior a freqüência.

A espectrofotometria bioquímica está preocupada com as faixas do ultravioleta (UV. 185-400 nm). é porque os comprimentos de onda do vermelho e azul foram absorvidos pelo objeto refletindo a luz. nitrogênio e halogênios [4]. no entanto. As ligações sigma são mais fortes porque os orbitais atômicos dos dois átomos interagem frontalmente. pi e pi). As ligações covalentes podem ser simples (sigma). são fracas porque os orbitais atômicos "se curvam" no espaço para interagir. . A radiação absorvida está relacionada com a estrutura eletrônica espacial da molécula que constitui o material . Quando o olho humano vê verde. Os elétrons numa molécula podem estar compartilhados entre dois átomos (participando de uma ligação covalente) ou em pares isolados em átomos de oxigênio. fundindo em um único orbital molecular linear. formando uma nuvem el etrônica torcida. As cores são faixas de ondas dentro desse intervalo de 300 nm. visível (400-700 nm) e infravermelho (700-15. As ligações pi.A região do espectro eletromagnético compreendida entre 400 -700 nm é aquela em que estão as ondas que sensibilizam as células do olho humano responsáveis por captar as cores. O estudo da relação comprimento de onda absorvido. dupla (sigma e pi) ou tripla (sigma. estrutura eletrônica e material ou molécula pode ser realizado pela espectrometria.000 nm). por exemplo. enxofre.

que é definida como a razão entre a intensidade de luz emitida para a amostra e a intensidade emitida da amostra. como nos orbitais moleculares. a concentração do substrato. passando pela amostra. Lambert afirma que a fração de luz absorvida por um meio é independente da intensidade da luz incidente e que cada cam ada sucessiva do meio absorve a mesma proporção de luz passando por ela. A transmitância e a absorbân cia têm grandezas arbitrárias. assim moléculas que possuam somente ligações covalentes simples sem pares isolados absorvem energia ultravioleta apenas ( < 185 nm). os elétrons devem ser excitados do orbital inferior menos energético (ligante) para um superior mais energético (antiligante). que combinadas são conhecidas como a Lei de BeerLambert[1]. O espectro de absorbância ou gráfico de absorbância é obtido aumentando-se o comprimento de onda de um feixe monocromático de luz e medindo a absorbância. a luz pode sofrer desvios. Em suma. porque estas ondas tem comprimento de onda menor e ener gia maior. A absorção no UV-Vis depende da presença de grupos funcionais com elétrons de valência com energia de excitação menores . os orbitais podem ser classificados como: ligante sigma.grupos cromóforos [4]. Isso é expressado matematicamente pela equação. A absorbância é o inverso do logaritmo da transmitância. ligante pi. Cada orbital ligante possui um respectivo orbital antiligante. . moléculas que possuem ligações pi e/ou pares isolados absorvem no UV -Vis.Os orbitais moleculares ligantes estão preenchidos por elétrons quando a molécula está no estado fundamental. reflexões. Beer afirma que a quantidade de luz absorvida é proporciona l à quantidade de moléculas presentes no meio percorrido pelo feixe. refrações ou absorção. antiligante pi. As intensidades emitidas e recebidas variam porque. Para ocorrer a absorção de energia. há elétrons não ligantes que saltam para orbitais antiligantes. elétrons de pares isolados. Além desse tipo de salto. antiligante sigma . Em energia crescente. Ligações fortes precisam de mais energia para serem excitadas. ou seja. gerando um decaimento exponencial através do caminho percorrido na amostra. de forma que. de energi a maior e geralmente desocupado . a energia necessária é igual à diferença energética entre os d ois orbitais. Os métodos espectrofotométricos em bioquímica residem basicamente sobre duas leis.

A D-glicose possui a hidroxila do lado direito do quinto carbono contando a partir do carbono com o grupo aldeído.1. e posteriormente em outros fungos.1% é transmitida .log10 T. Dessa forma. As enzimas são catalisadores biológicos que aceleram reações bioquímicas nos organismos vivos. Os produtos da catálise de oxidação de . mas não em plantas superiores e animais [5]. Enzimas em tecidos animais que oxidam glicose são fac ilmente diferenciáveis da glicose oxidase porque não precisam de oxigênio molecular e não geram peróxido de hidrogênio. enquanto a L-glicose a possui do lado esquerdo. a função aldeído está no primeiro carbono. no qual a enzima torce ou aproxima partes do substrato para incitar a reação. A relação entre as duas grandezas é dada por A = log 10 (1/T) = . EC 1. é usada a absorbância. [referencia]. Por exemplo.É importante notar que somente a absorbância é linearmente proporcional à concentração do meio. Ela foi descoberta em 1928 por Müller em Aspergilus niger e Penicillium glaucum. a glicose oxidase é um dímero com grupo prostético FAD . Sendo assim.4) é uma enzima e cataliza a oxidação de Beta -D-glicose para Delta-D-glicolactona na presença de oxigênio molecular. seja do tipo chave -fechadura ou induzido. de forma que outros compostos no meio reacional permanecem ilesos. Com exceção do primeiro e sexto carbono. não a transmitância. Quando a hidroxila anomérica está abaixo do plano do anel.em cada um. Isso é devido ao fato da enzima e o substrato terem um encaixe ótimo. O primeiro carbono passa a ser mais um centro quiral chamado de carbono anomérico. diz-se que a glicose é do tipo alfa.3. O anel se arranja no espaço de forma a aumentar os ângulos entre as ligações para estabilizar a estrutura.Flavina Adenina Dinucleotídeo . A glicose oxidase (Beta-D-glicose:oxigênio 1-oxiredutase. Em sua forma aberta. e os outros cinco possuem uma hidroxila lateral. quando A = 2 apenas 1% da luz incidente é transmitida e quando A = 3 apenas 0. para determinações de concentrações usando espectrofotometria. a hidroxila do quinto carbono ataca o primeiro carbono. caso contrário é beta. criando uma cadeia fechada. Em solução aquosa. A glicose é um carboidrato poliidroxialdeído de seis carbonos. As enzimas são específicas para um substrato e só reagem catalisando uma reação. os outros quatro são centros quirais.

Ponteira de 100-1000µL. OBJETIVO Determinar a concentração de glicose em amostras biológicas. Pipetador de 100-1000µL. . Gelo. y y y y y y y y y y MÉTODOS Os cinco tubos de ensaio foram marcados como branco. 4 -aminofenazona. Nos tubos padrão I (P1) e padrão II (P2) foram adicionados 20µL do reativo padrão e 2ml do reativo de trabalh o. Esses reagentes são incolores e a reação não pode ser acompanhada por observação a olho nu. Reagente trabalho . Amostra de plasma de ovelha. Ponteira de 10-100µL. peroxidase. Freqüentemente o peróxido de hidrogênio gerado é aproveitado em outra reação que possa ident ificar o andamento da primeira.solução de glicose de concentração conhecida de 100mg/dL. Nos tubos desconhecido I (D1) e desconhecido II (D2) foram adicionados 20µL da amostra de plasma e 2ml do reativo de trabalho. Pipetador de 10-100µL. Reativo de trabalho resfriado. y y No tubo branco (B) foram adicionados 2 mL do reativo de trabalho. 5 Tubos de ensaio. MATERIAIS y Reagente padrão . que depois é hidrolisado em ácido glucônico linear. Cubeta. fenol e tampão TRIS. padrão I e II e desconhecido I e II.glicose oxidase.glicose são peróxido de hidrogênio e um éster cíclico.

Supôs-se que essa mudança era causada pela quantidade de glicose que cada amostra apresentava. Soluções após aquecimento. nos primeiros minutos antes do aquecimento. RESULTADOS E DISCUSSÕES Observou-se que com a adição do reativo padrão as amostras apresentaram mudança na colo ração. Figura 1.366 0.330 0. Em seguida.292 . Com a análise no espectrofotômetro. Retirados do banho. TUBO B P1 P2 D1 D2 ABSORBÂNCIA 0. tanto para a solução padrão como para a desconhecida.001 0. foram dei xados na bancada para esfriar. pois houve diferença de tom entre mais forte e mais clara (Figura 1).292 0. todos foram homogeinizados e incubados em banho maria a 37ºC por 10 minutos.Após as adições. foi analisado a absorbância da amostra e do padrão a 505 nm no espectrofotômetro. de incolor para rosa. obtivemos os seguintes dados. que foi zerado com a substância do tudo branco.

Isolando ³ e. determinamos a concentração de glicose que era desconhecida. Então temos A p/Cp = Ad/Cd. Uma amostra de concentração conhecida é posta no espectrofotômetro e sua absorbância anotada.b´ na fórmula. b é a espessura da cubeta que contém a amostra e C é a concentração molar do analito. obtemos A/C.Pela Lei de Lambert -Beer. na amostra D1. .b. Essa razão é a mesma para amostras da mesma solução analisadas na mesma cubeta. Com esses. e é a absortividade da solução analisada. A amostra de concentração desconhecida e a absorbância anotada também.905 mg/dL. obtivemos 84. podemos determinar as concentrações de duas amostras do mesmo anali to por comparação.195 e na D2 83. onde A é a absorbância.C. A = e.

foi possível atingir o objetivo proposto : determinar o nível de glicose em amostras através de método enzimático.CONCLUSÕES A suposição foi confirmada pelo Espectrofotômetro que acusou a presença de glicose nas amostras que continham plasma sanguíneo. Usando a metodologia. .

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