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MANUAL PARA GERMINAO IN VITRO DE ORQUIDEAS Dra.

Sheena McKendrick
Copyright 2000, Fundao Ceiba para Conservao Tropical Maro 2000 O manual seguinte inclui a biologia bsica para a germinao de sementes de orqudeas, algumas tcnicas usadas para a germinao de orqudeas com ajuda da tcnica em vitro, e um apndice dos meios e espcies experimentados dentro do programa de germinao em vitro na Reserva Orquideolgica O Pahuma. O manual foi desenhado especificamente para o Programa Orquideologico de O Pahuma, porm pode adaptar-se a outros programas. RECONHECIMENTOS Agradecimento especial para Nelson Zabala e para a Universidade So Francisco de Quito por permitir a Ceiba para fazer uso dos seus equipamentos para levar a cabo o programa de germinao em vitro. Ns tambm agradecemos Margaret Ramsay de Jardins Botnicos Reais, Kew, Inglaterra, pela sua util coleo de notas sobre propagao de orqudeas, e para Robert Mitchell e Grace Prendergast, tambm de Kew, por ter me ensinado estas tcnicas. Igualmente eu quero estender meu agradecimento a Dick Warren da Companhia de Planta Equatorial, David Menzies de Glasgow Botanic Gardens e a Mnica de Navarro da Sociedade Orquideolgica de Quito por toda sua ajuda e seus conselhos. Tambm agradeo a Lorena Gamboa de Rainforest Rescue que fez a traduo deste manual para espanhol. Por ultimo, quero agradecer de um modo especial a Famlia Lima que com o grande desejo em conservar a floresta tornou possvel que este projeto fosse realizado. 2 NDICE 1 INTRODUO 1. 2. propsitos do Programa de Germinao Em Vitro em O Pahuma A biologia da germinao de sementes de orqudeas

1.3 Fundaes da germinao em vitro 1.3.1 germinao de Sementes Simbiticas e no Simbiticas 1.3.2 Bases para manter as condies de esterilizao 1.3.3 Uso da cmara de fluxo laminar 2. PREPARAO DOS MEIOS 2.1 introduo para a preparao dos meios 2.2 metodologia geral para a preparao dos meios 2.3 transferncia dos Meios 3. SEMEADURA DAS SEMENTES

3.1 Coleta e armazenamento das sementes 3.2 Semeadura das sementes 3.2.1 cpsulas verdes vs. cpsulas maduras 3.2.2 disseminao a partir de cpsulas verdes 3.2.3 disseminao a partir de cpsulas maduras 3.2.3.1 mtodo da Seringa 3.2.3.2 mtodo do Pacote (ou fundo de papel) 3.3 cobertura dos recipientes 3.4 manuteno de registros 4 CUIDADO DAS PLANTULAS 4.1 As plntulas nos frascos 4.2 Transplante 5 CONCLUSO 6 BIBLIOGRAFIA 7 APENDICES 3

1. INTRODUO 1.1 propsitos do Programa de Germinao Em Vitro em O Pahuma A germinao em vitro de sementes de orqudeas um componente importante do programa de conservao da Fundao Ceiba para a Conservao Tropical na Reserva Orquideolgica O Pahuma, a Noroeste de Quito,Equador. Os objetivos deste programa de propagao em vitro so os seguintes: 1. Cultivar orqudeas para o Jardim Botnico O Pahuma. 2. Reproduzir espcies raras e nicas de orqudeas para aumentar tanto o numero nos meios naturais da Reserva como em lugares fora dela (como jardins botnicos, programa de conservao, entre outro), e para prover sementes a programas de restaurao e regenerao de florestas. 3. Prover sementes para a venda na Reserva como um meio para parar a coleo de espcimes silvestres, estimular o interesse pblico e coletar, rendas para o desenvolvimento da Reserva e outros programas de

conservao de orqudeas. 4. Cultivar sementes de espcies sem igual ou ornamentais para a exportao em frascos com o propsito de apoiar a conservao empreendido na Reserva Orquideolgica O Pahuma. Toda receita que vm da venda de espcies de orqudeas, tanto em O Pahuma como por meio da exportao, eles sero reinvestidos na Reserva e em outros projetos de conservao. 1.2 A biologia da germinao de sementes de orqudeas As sementes de orqudeas so normalmente conhecidas como sementes em p porque elas so minsculas e elas contm poucas reservas de alimento. Estas sementes normalmente no germinam nos meios naturais a menos que eles sejam infetados por um fungo micorriza, o mesmo que abastecem as plantas jovens com acares e nutrientes que eles precisam at que eles so o suficientemente grande para fabricar seu prprio alimento. Quando a semente germina produz uma massa indiferenciada de clulas chamados protocornio (figura 1). Mantendo as condies normais, o protocornio continuaro seu crescimento durante vrias semanas, meses ou at mesmo anos dependendo das espcies at que alcana a idade apropriada para produzir razes e folhas. No caso de orqudeas terrestres, de importncia vital que a relao orqudea -fungo se conserve durante os estados do ciclo de vida da planta no qual o protocornio enterrado no pode fabricar alimento por si mesmo. Por outro lado, o protocornios de orqudeas epfitas geralmente verde, o que os facilita produzir parte, de seu alimento. A relao orqudea-fungo no esteve em sua totalidade investigado para o caso das orqudeas tropicais. 4 1.3 Fundamentos da Germinao Em Vitro 1.3.1 germinao Simbitica e no Simbitica de Sementes Por meio da germinao em vitro, se reproduzem sementes em frascos de vidro ou plstico sobre um meio de gar nutritivo que contm os acares e minerais necessrio de forma que as sementes germinem e cresam. H dois tipos bsicos de germinao em vitro: simbitica e no simbitica. Na germinao simbitica, as sementes se semeiam com uma poro pequena de fungo micorriza apropriado. O fungo cresce nos meios, coloniza s sementes em processo de germinao e se origina uma relao simbitica que se espera alimenta ao protocornio at produzir folhas e se tornar autotrfico. Esta tcnica amplamente usada para propagao de orqudeas terrestres em reas temperadas. Tem a vantagem de usar um meio simples ( um dos mais geralmente usados consiste em aveia em p com uma quantidade pequena de extrato de levedura), e como resultado das plantas micorrizadas so normalmente mais fortes e mais resistentes a infeces que as cultivadas asimbiticamente. Porm, a desvantagem que se precisa selecionar o tipo de fungo micorriza apropriado para que se origine a simbiose e prevenir o parasitismo e a morte conseqente das sementes. Existe pequena investigao na relao do micorriza em forma de fungo com as orqudeas tropicais, e portanto no se dispe do fungo micorriza apropriado. A germinao asimbitica normalmente usado na propagao de orqudeas tropicais, as mesmas que tendem a crescer facilmente em comparao com suas parentes em reas temperadas. Os meios usados para o germinao asimbitica mais complexo que para a germinao simbitica J que todos os nutrientes, orgnico e inorgnico e os acares devem estar disponveis para a orqudea em uma forma apropriada j que no existe intermediao do fungo.

A germinao asimbitica um mtodo usado no momento no programa de germinao em vitro na Reserva Orquideolgica O Pahuma. No caso de se dispor do fungo a partir de semeaduras em situ, haveria a possibilidade usar tcnicas simbiticas no futuro. 1.3.2 Fundamentos para manter condies de esterilizao Tanto para a germinao simbitica e asimbitica de importncia vital que os meios, os frascos, os aparatos e as sementes se mantenham desinfetados desde o inicio do processo de germinao. Qualquer bactria ou fungo que introduzido nos frascos crescer mais rpido que as sementes e logo vai ocupar o espao delas at as matar. As condies de esterilizao na preparao do meio se criam autoclavando o meio e os frascos a serem utilizados por 15 minutos a 15 atm. Esta temperatura e presso so bastante para matar todos os esporos de bactrias e fungos presentes nos meios. 5 As sementes devem ser esterilizadas e ser transferidas aos frascos sem introduzir fungos ou bactrias externas. Geralmente, este processo se realiza semeando desde a superfcie desinfetada de cpsulas verdes, ou desinfetando sementes maduras com hypochlorito de sdio ou clcio, ou peroxido de hidrognio. Temos de ter certeza que esto desinfetados todos os instrumentos usados na transferncia. Com certo cuidado e pratica se pode criar e manter condies de esterilizao desde a germinao at o transplante das sementes. No programa de germinao para O Pahuma, a esterilizao consiste em esvaziar os meios e semear as sementes em uma cmara de fluxo laminar. Outras tcnicas para manter estas condies de esterilizao so possveis ( Thompson 1980), porm eles so complicados tecnicamente e no devem ser desenvolvido em condies midas e sem limpeza apropriada. 1.3.3 uso da cmara de fluxo laminar Deve-se prestar ateno a certas regras bsicas ao usar a cmara de fluxo laminar: 1. Sempre se deve desinfetar por completo usando lcool de 70-90 % (de preferncia Etanol, ter muito cuidado se utiliza lcool anti-sptico que tambm contm metanol. O metanol txico e pode causar cegueira se ingerido). Use um roceador e limpe todas as superfcies da cmara com um algodo encharcado de lcool (inclusive as paredes e o teto).

Deve ser desinfetado tanto antes como depois de usar a cmara . Tenha o cuidado de no inalar quando se passe o etanol para usar a cmara . Tudo que entrar na cmara deve ser esterilizado. Use luvas e os desinfete completamente antes de usar, passando lcool e os mantendo na cmara at que o lcool seque. Com prtica, possvel no lugar de usar luvas, lavar as mos e esfregar as unhas usando um sabo antibacteriano, secar e esterilizar com lcool, porm no caso de existirem problemas com contaminao bacteriana usar as luvas novamente. Use um avental de laboratrio e lave-o constantemente.

Tenha certeza que os frascos de vidro estejam limpos. Os frascos de vidro podem ser roceados com lcool ao introduzi-los na cmara , mas com precauo. Qualquer nota escrita com marcador no vidro ser apagada pelo etanol. Se os frascos esto limpos, rocearlos com etanol no sero necessrios. Esses instrumentos podem ser autoclavados antes do seu uso, embrulhando-os previamente em papel de alumnio ou papel de empacotar caf fechado com fita adesiva. Uma vez na cmara , a esterilizao assegurada submergindo em etanol 100% e incendiando-a trs vezes antes de usar. O melhor modo para conservar o etanol est em frascos grandes de vidro para permitir a mxima exposio dos instrumentos ao etanol. Depois de Flambar os instrumentos estes devem ser colocados depressa em um frasco de vidro esterilizado para continuar com o flameado. Deixe-os esfriar antes do uso. 1. Se lembre que qualquer esporo de bactria ou fungo dentro da cmara flutuar para o interior e em direo a sua pessoa. Nunca ponha as mos, mangas ou outro objeto sobre ou em direo de algo desinfetado (como os meios). Mantenha movimentos leves e evite criar turbulncia de ar que possa causar contaminao. No fale, tussa ou espirre dentro da cmara . Trabalhe no possvel pela parte de atrs da cmara e minimize o tempo de exibio dos meios quanto possvel. 3 Mantenha as condies de esterilizao por meio da limpeza regular da cmara com lcool, desinfete os instrumentos novamente depois do seu uso e lave as mos novamente depois de ter tido contato com qualquer objeto fora da cmara . De um modo especial, no toque no cabelo ou na face com as luvas colocadas. ADVERTNCIAS DE PRECAUO 1. Tenha cuidado para no QUEIMAR suas MOS - particularmente quando usa luvas! fcil de fazer isto pois voc no pode sentir se o lcool das luvas evaporaram completamente. Vantajosamente o etanol queima em baixa temperatura e podem ser facilmente evaporado quando agitado com fora. 2. Tenha cuidado para no QUEIMAR - ou queimar as sementes que voc esta transferindo de um lugar para outro - os instrumentos a ser usados se esquentam altamente depois de duas .

3. SEMPRE SE LEMBRE DE FEICHAR O GAS - tanto no isqueiro de fogo como na parte superior do cilindro de gs. 2 PREPARAO DOS MEIOS 2.1 introduo para a Preparao dos Meios Os meios podem ser preparados usando ingredientes bsicos (Thompson,1977, apndice 1) ou comprar em p dos fornecedores. H diferente tipos de meios disponveis para a venda como tambm outros especficos para certas espcies projetadas por peritos profissionais. Quando se inicia o processo de germinao de uma nova espcie aconselhvel provar com diferentes meios para uma concentrao total e parcial para determinar qual o melhor meio para esta espcie. Por exemplo, o gnero Masdevallias conhecido como um gnero "escolhedor" dos meios em qual desenvolver (Richard Warren, conversao pessoal). O nvel de pH tambm importante. A maioria de orqudeas germina dentro de um meio de pH 5.5 porem, espcies andinas preferem nveis mais altos de pH, 5.6 ao 5.9 (Mnica de Navarro, conversao pessoal). Ao experimentar com o pH se deve considerar que o pH dos meios ser mais alto somando o gar que antes de faz-lo. As preparaes comerciais de Phytamax (Sigma Qumica, Aldrich, Inglaterra) e Murashige e Skoog foram os meios principais usados no projeto de O Pahuma (maro de 2000).

Qualquer um destes meios pode estar tanto preparado para uma concentrao parcial ou total (a concentrao parcial recomendada para Murashige e Skoog). 7 O mtodo geral para a preparao destes meios o que detalhado a seguir. 2.2 mtodo geral para a preparao dos meios 1. Medir a quantidade correta do meio em p usando uma garrafa de 1 litro e evitando o contato com o p da atmosfera.

2. S para Murashige e Skoog: somar a quantidade correta de acar e 2gr/l de carvo ativado. 3. Somar uma barra magntica e uma pequena quantidade de gua destilada e misturar at que se dissolva. 4. Encher o recipiente com gua destilada at obter 1 litro e agitar continuamente. 1. Medir o pH e ajusta-lo a 5.6 usando HCl ou NaOH e misturando completamente com a barra magntica.

* Precauo: se estiver usando um medidor de pH no se deve misturar o meio quando se encontra dentro o pHmetro: a membrana muito delicada e cara e pode quebrar facilmente. Se no temos o medidor de pH, os papeis indicadores de pH so suficientes. 6. Verter a metade do lquido em um frasco, acrescentar 4 gramas de gar a cada recipiente (8 gr/l de gar) e misturar para que se disperse. 7. Fechar a tampa da garrafa sem apertar totalmente, cobrir os frascos com papel alumnio e os levar ao autoclave. Em condies ideais os meios devem ser preparados em uma garrafa com a barra magntico durante todo processo de autoclave inteiro com o propsito de que o meio seja misturado antes de vert-lo nos frascos, alcanando uma distribuio melhor do carvo ativado no mesmo. Porm, por razes de segurana a Universidade prefere usar duas garrafas ou frascos de 500 ml deste modo para manter a barra magntica na garrafa e agitar suavemente antes de verter para dispersar o carvo ativado. ADVERTNCIAS DE PRECAUO 1. NO RESPIRE O PHYTAMAX EM P E EVITE O CONTATO COM A PELE E OS OLHOS. Se voc tiver contato com o p do Phytamax, Murashige, e Skoog, ou o carvo ativado, dever lavar imediatamente a parte afetada com bastante gua fria. Se tiver contato com os olhos, lave os imediatamente com gua fria e solicite cuidado clnico. 2. NUNCA FECHE HERMETICAMENTE A TAMPA DO FRASCO OU GARRAFA ANTES DE COLOCA-LA NA AUTOCLAVE.

O elevado aumento de presso na autoclave causar exploso do frasco ou garrafa. Sempre tenha certeza que as tampas esto frouxas ao colocar os frascos na autoclave: s podem fechar eles fortemente depois dos frascos esfriarem. 3. TENHA CUIDADO AO TIRAR OS FRASCOS E GARRAFAS DA AUTOCLAVE . Eles estaro bastante quentes e voc pode sofrer queimaduras.

8 2.3 Transferncia dos Meios (colocar nos frascos) Verter os meios nos frascos ou caixas Petri esterilizadas, deve-se usar a cmara de fluxo laminar (veja item 1.2.3). Os frascos devem ser ensaboados e lavados completamente quatro vezes antes de usar, e desinfetado por 15 minutos a 15 Psi. na autoclave. Se temos frascos com tampa se lembre de fecha-las totalmente antes de coloca-los na autoclave. Se a pessoa no tiver tampas disponveis, pode cobrir os frascos com um pedao de papel alumnio. Voc tambm pode usar papel de empacotar caf fechado com um barbante, mas mais inadequado. Deve-se repetir a esterilizao dos frascos que saem da autoclave com papel alumnio ou sem o papel de alumnio. 1. Espere os meios esfriarem bastante para pegar com as mos. Quando o gar est a menos lquido e a garrafa ou frasco no est to quente, pode-se derramar nos meios. Se derramar o gar muito quente pode-se causar uma condensao alta. 1. 2. 3. Ponha em linha os frascos ou caixas Petri comeando do fundo da cmara de fluxo laminar, soltando o tampas dos frascos. Tire as tampas dos frascos ou caixas Petri e verta o gar movendo da esquerda para direita (se s destro) para evitar que qualquer parte da mo ou do avental de laboratrio toque em um frasco ou caixa aberta. Deixe que se assente o meio e ponha as tampas novamente. Pode se cobrir esses frascos imediatamente depois que derramou o meio, mas a pessoa pode causar condensao.

A gua disponvel nos frascos pode ou no ser til dependendo da maturidade das sementes. A preparao completa do meio desde a mistura dos ingredientes at o estabelecimento do meio vertido tem um tempo estimado de 4 horas de durao. Se foi preparado 2 litros prontos de meio voc pode usar uma estufa para manter uma garrafa quente at terminar de usar a outra. A estufa quente s deve ser usado por pouco tempo (emergncias), e no caso de perodos mais prolongados (como uma meia hora) se provocara a precipitao do carvo ativado. 3. SEMEADURA DAS SEMENTES 3.1 Coleta e Armazenamento das Sementes As sementes podem ser coletadas a partir de cpsulas verdes ou cpsulas maduras. Uma cpsula verde que est amadurecendo, e esta pronta para ser semeado, est cheio com sementes e no se deforma quando se aperta com as pinas," est intato." As cpsulas podem ser armazenadas por algumas semanas se envolvidas em papel de cozinha e se os coloca num lugar do refrigerador com bastante aerao (como o compartimento para o queijo). No se deve armazenar as sementes em potes de plstico pois as cpsulas suaro e sero apodrecidas. 9 Se for possvel, melhor coletar cpsulas que foram expostas a um dia seco. aconselhvel usar sementes frescas ou secas numa soluo saturada de hexahidrato de clcio (Seaton & Pitchard, 19xx). Se este composto no esta disposio, pode-se secar com cloreto de clcio, gel de slica, (mais spero que o cloreto de clcio e somente recomendado usar a curto prazo) ou simplesmente secar a temperatura ambiente em um quarto (s em climas secos). Uma vez as sementes esto secas, pode -se armazenar por muitos meses em frascos fechados dentro de um refrigerador (4-5C). Novamente, as sementes nunca devem ser armazenadas ou transportadas em potes de plstico ou recipientes com ar dentro.

O tempo desde o florescimento at a maturao das sementes varia significativamente de acordo com as espcies e o lugar. Por exemplo, as sementes de Epidendrum ou Masdevallia requerem aproximadamente de 3.5 meses para amadurecer enquanto as sementes de Odontoglossum requerem ao redor de 18 meses (Mnica de Navarro, conversao pessoal). As estimativas convencionais no levam em conta as diferenas climticas; na realidade uma cpsula que cresce em um recipiente de vidro quente vai amadurecer muito mais rpido do que aquele crescendo na floresta nublada. Todas as plantas coletadas na Reserva Orquideolgica O Pahuma deve ser marcado com uma fita adesiva e registrada com um cdigo, e lembrando-se de incluir este nmero nos detalhes do semeadura. 3.2 Semeadura das Sementes 3.2.1 Cpsulas verdes vs. sementes secas Voc pode semear sementes a partir de cpsulas verdes ou a partir de sementes secas. Logo so descritas as vantagens e desvantagens de ambos os mtodos: 1. Semeadura a partir de cpsulas verdes. O interior das cpsulas de orqudeas permanece estril se as cpsulas esto intatas. Ento, se a parte externa da mesma esterilizado, onde fungos e bactrias podem ser desenvolvidas, e abre-se as cpsulas debaixo de condies de esterilizao as sementes podero manter-se desinfetadas. A vantagem deste mtodo que no se requer a esterilizao das sementes, o que poderia causar sua deteriorao. Tambm, algumas sementes tomadas de cpsulas quase maduras poderiam germinar mais rapidamente que as vindo de cpsulas maduras por causa dos mecanismos de dormncia. A desvantagem deste mtodo que ao abrir a cpsula todas as sementes dela devem ser usadas ou eliminadas (algumas sementes maduras poderiam secar e ser armazenadas). Tambm se deve considerar que as sementes semeadas a partir de cpsulas que no amadureceram bastante poderiam germinar lentamente ou simplesmente no germinar. 2. Semeadura a partir de sementes secas. Uma vez que a cpsula est aberta, as sementes deixam de ser estreis e requerem um processo de esterilizao. Geralmente, usada uma soluo de hypochlorito (cloro) de sdio, hypochlorito de clcio ou peroxido de hidrognio. As sementes so agitadas dentro da soluo que tambm contm uma gota de detergente para " umedecer", ento se enxgua com gua destilada e se semeia nos meios preparados. A vantagem deste mtodo que as sementes podem ser coletadas, secadas ao ar, armazenado por vrios meses no refrigerador e usado quando necessrio.

Deveria ser considerado que o que se semeia determinado pela disposio de qualquer uma das duas formas de encontrar as sementes de acordo com a poca que se coletam. 3.2.2 Semeadura a partir de cpsulas verdes O mtodo geral para semear sementes a partir de cpsulas verdes o seguinte : 1. Com ajuda de um bisturi, remova a flor morta da cpsula cuidadosamente 2. Use uma escova de dente macia para esfregar a cpsula suavemente com a soluo ensaboada. 3. Enxge a cpsula em gua. 4. Introduza a cpsula aproximadamente durante 10 minutos em uma soluo de hypochlorito de sdio a 1% ao qual foi acrescentada uma gota de detergente (levar em conta que o cloro comum hypochlorito de sdio a 5% portanto necessrio diluir). 1. Transfira a cpsula submersa na soluo de cloro cmara de fluxo laminar.

6. Tire a cpsula da soluo de cloro usando uma pina e levando preferivelmente do lado que cai o pecolo. Ento submirja em lcool a 100% e passe rapidamente pelo fogo (Flambar). Deixe que o lcool se queime completamente e que a cpsula e a pina se esfriem. Repita o processo duas vezes para as cpsulas grandes. Para o caso das cpsulas pequenas e frgeis voc decide com discrio o tempo de passar pela chama (talvez s uma vez). Se no for possvel sustentar pelo pecolo, mude a posio da pina antes de flambar novamente. 7. Transfira a cpsula a uma superfcie desinfetada (como uma caixa esterilizada Petri). Corte a cpsula longitudinalmente ao meio com ajuda de um bisturi desinfetado. Use uma folha de bisturi nova para cada cpsula prevenir a propagao de vrus. 8. Erga uma metade da cpsula com a pina e bata ligeiramente no meio para espalhar as sementes. 9. Repetir este passo at que todas as sementes so usadas. As sementes menos maduras podem ser retiradas da cpsula com a pina. 10. Normalmente so somadas algumas gotas de gua em cada frasco de modo que certos grupos de sementes se separem e se distribuam no gar. 3.2.3 Semeadura a partir de capsulas dehiscentes (aberto com sementes secas) 11 Mtodos diferentes existem para o semeadura a partir de sementes secas. Todos eles se baseiam na esterilizao das sementes e lavagem em gua destilada antes dos semear, mas as tcnicas variam. O tempo de esterilizao tambm varia, dependendo das espcies, do tempo de maturao logo que a semente coletada, das condies climticas do momento da coleta e dos mtodos de secar e armazenamento. Por isto, uma gama de tempos de esterilizao recomendado para as sementes novas. O programa de conservao em O Pahuma usa duas tcnicas principalmente para semear sementes maduras: o mtodo da seringa e o mtodo do pacote (ou saco de papel). possvel usar outras tcnicas, como a filtrao, mtodo que usa o funil de Buchner, mas eles no so includos neste manual. Tanto para o mtodo da seringa como para o mtodo do pacote aconselhvel esterilizar os instrumentos e a gua necessria previamente 1 dia, j que a gua demora bastante para esfriar-se depois do autoclave. Em geral, a tcnica da seringa usada para a maioria das sementes enquanto a tcnica do pacote usada para sementes mais raras e menores. 3.2.3.1 Mtodo da Seringa 1. Pegue uma seringa de 5 ml, tape a ponta da seringa com um pedao de algodo envolto em um pedao de meia de nylon (veja o diagrama), insira o embolo novamente e autoclave. Ao mesmo tempo, autoclave uma certa quantidade de gua destilada (em frascos ou garrafas) e as pinas. 2. Tire o embolo da seringa e coloque uma quantidade pequena de sementes na seringa.

(Uma grande quantidade de sementes formar uma massa em forma de pasta se voc usa a tcnica 5b para o semeadura, ficando difcil a semeadura apropriada). Insira o embolo novamente. 3. Absorver com a seringa 4 ml da soluo de cloro a 1% (a que foi adicionado uma gota de detergente). Agite a seringa durante 5 minutos (ou outro tempo de esterilizao), tenha certeza que as sementes esto completamente molhadas dentro da soluo e que no esto em bolsas de ar. Expulse esta soluo e absorva outra poro de soluo fresca novamente. Agite durante outras 5 minutos e a expulse novamente. 4. 5. Lave as sementes 3-4 vezes absorvendo gua destilada e esterilizada na seringa, agitando por um momento e logo expelindo o lquido. Semeie as sementes assim: a) esterilizando o colo da seringa, vertendo as sementes nos meios e eliminando o excesso de gua ou

b) expelindo todo excesso de gua, tirando fora o algodo com uma pina e colocando as sementes sobre os meios. 3.2.3.2 mtodo do Pacote (ou saco de papel) 12 1. Elabore um pacote a partir de um pedao de papel (veja o diagrama) 2. Esparrame uma quantidade pequena de sementes dentro dos pacotes. Novamente, quantidades grandes de sementes causar ajuntamento das sementes e impedem a penetrao do cloro. 1. Dobre e marque os pacotes usando grampos. Submirja em gua destilada por de 5-10 minutos, apertando suavemente para dispersar qualquer bolsa de ar.

4. Com ajuda de pina, transfira os pacotes soluo de cloro a 1% e que tambm contm uma gota de detergente. Deixe-os na soluo durante 10 minutos (ou outro tempo de esterilizao), agitando-os continuamente. 5. Transfira o pacote mais o cloro para a cmara de fluxo laminar. Usando pinas transplante o pacote para gua destilada (em um frasco). Agite. Repita isto 3-4 vezes para enxaguar as sementes. 1. Aperte os pacotes suavemente para eliminar o excesso de gua e transferi-los para uma superfcie esterilizada. Corte e abra o pacote usando tesoura desinfetada e semeie as sementes nos meios.

Normalmente, ao usar esta tcnica se colocam os pacotes em um recipiente que contenha cloro e este sobre uma placa magntica. De acordo com a teoria, os grampos agiro como campos magnticos e eles agitaro os pacotes automaticamente. Isto nunca funcionou em minha experincia pessoal. Freqentemente agitando os pacotes os mesmos resultados so obtidos, e ao submergir ao mesmo tempo vrios pacotes em cloro podem apressar o processo de semeadura. 3.3 Fechamento dos Frascos Depois do semeadura os frascos podem se fechar usando "filme" ou papel cortado celofane das bolsas transparentes para assar. Se usado "filme", o filme devera estar desenrolado na cmara de fluxo, dobrado um lado sobre o outro, e o mais prximo lado para a parte posterior da cmara o que devera ser

colocado nos frascos. Ento, segura-se o filme com uma fita elstica e corta-se a sobra. Corta-se o papel celofane em quadrados, e se autoclava dentro dos frascos fechados antes de ser usado. O quadrado de celofane se retira dos frascos usando pinas, e se coloca no frasco que contm o meio e assegura ele usando uma fita elstica. Das bolsas transparentes assar KLAR 2000 a pessoa pode obter 20 quadrados por bolsa e 160 quadrados por pacote (8 bolsas por pacote). O papel celofane mais fcil de administrar que o filme e reutilizvel. Por tanto recomendado para usar como material de cobertura. 3.4 Manuteno de registros 13 Os registros devem ficar tanto em um caderno de laboratrio e um sistema de cartes ou no computador. Os detalhes sobre os meios preparados, o processo de semeadura e as notas de observao devem registrar no caderno. No sistema de cartes se registram todo o semeio, nomeando um cdigo para cada um, o mesmo que consiste no cdigo das espcies (por exemplo TF = Trichopilia fragrans) mais o cdigo de semeadura (por exemplo TF12 se no dcimo segundo semeio de Trichopilia). A data em que a semeadura foi feito colocado no canto superior esquerdo do carto, e abaixo da data o nmero de frascos, tipo de meio (e a data que se preparou se lembrar ), o cdigo e fonte da semente e qualquer outra observao durante o processo de semeadura. Os frascos so examinados semanalmente e se deve registrar qualquer contaminao e germinao com a data correspondente. Se um frasco eliminado deve-se marcar em algum lugar visvel com um X e devese registrar a causa (por exemplo, contaminao por fungos ou bactrias). Se todos os frascos de um lote foram eliminados , deve ser apontado com um X ao lado do cdigo da espcie e com um X grande no carto inteiro. O carto no devera ser descartado, pode ser til mais tarde para analisar as causas do problema. Cada frasco tem um rtulo com o cdigo de semeadura e qualquer outra informao relevante e til para te-la em um acesso fcil e no ter que recorrer aos cartes, como o tempo de esterilizao. Cada frasco tambm est rotulado com um cdigo simples no momento verter os meios, com o propsito de prevenir qualquer confuso durante o armazenamento ou a semeadura. 4. CUIDADO DAS PLNTULAS. 4.1 As sementes nos frascos. As sementes no USFQ crescem 40 cm abaixo dos tubos fluorescentes de 20 watts em um quarto de crescimento que regulado aos 18C com 16 horas de luz e 8 horas de escurido. Os recentes frascos devem ser revisados regularmente depois da semeadura pelo risco de contaminao. Se a contaminao descoberta mais cedo possvel, pode-se combater antes que se disperse totalmente . Porm, uma vez que o fungo produziu esporos, ou se existe pouco lquido no fundo do frasco, no aconselhvel combater esta contaminao. Em casos como este, o frasco deve ser eliminado. De um modo ocasional, uma contaminao de fungos poderiam motivar a germinao (Mnica de Navarro, conversao pessoal). Neste ltimo caso, pode-se deixar que as sementes cresam, mas devem ser transplantadas antes que o fungo ocupe seu espao e as destrua (contatar com Mnica para conselhos). gua destilada pode ser adicionada se os frascos esto secos, usando uma seringa desinfetada. As plantas pequenas so transplantadas quando elas comearem a aparecer folhas e comeam a encher o frasco. A exceo para esta regra se da quando for mais eficaz remover os protocornios de um frasco ou caixa Petri contaminada. As plntulas so transferidas a frascos novos que contm o meio usando pinas desinfetados.

Uma agulha de croch til nesta fase para retirar sementes delicadas ( Mnica de Navarro, conversao pessoal). O meio seguinte pode ser o mesmo que o primeiro, mas normalmente melhor se a pessoa acrescentar ao meio, substncias complexas (como banana , leite de coco, suco de abacaxi ou vitamina B) fomentar o desenvolvimento da raiz (ver o Apndice xx). A pessoa pode fazer um buraco pequeno nas tampas (se eles so feitos de metal ou plstico, possivelmente no celofane e no aconselhvel no filme) e selando dois ou trs vezes com o microporo para proporcionar uma superfcie de respirao seguro a prova de esporos nas tampas. Deve-se fazer alguns transplantes antes que as plantas estejam prontas. 4.2 Transplante Nos frascos as plntulas foram desenvolvidos em uma atmosfera fechada e limpa e para que devera se acostumar gradualmente atmosfera externa antes de ser transplantadas para as bandejas. No quarto de crescimento, a luz baixa e tanto a luz como a temperatura so praticamente constante. A umidade nos frascos so altas e as plantas so protegidas de ataques de fungos, bactrias e herbvoros. Nos meios naturais, temperatura e iluminao variam constantemente. As novas plantas devem ser protegidas de modo especial da luz solar forte: uma pequena quantidade de luz solar poderia queimar as folhas destas plantas at mesmo as que normalmente crescem na sombra. Tambm, o plntulas que cresceram em condies de alta umidade ter cutculas fracas e para isto, precise se acostumar gradualmente para meios mais secos antes de ser transplantadas. Finalmente, tanto na fase de aclimatao como no de transplante, as plntulas devem ser cuidadas diariamente para evitar problemas, e mais de uma vez ao dia se o clima seco e ensolarado. Na continuao se detalham alguns conselhos para o transplante. O tempo de durao de cada fase pode variar com respeito ao especificado: o constante monitorando deveria dar uma idia da coisa mais apropriada para cada espcie debaixo de certas condies. Modifique estes passos quando for necessrio. 1. Se possvel a fase de transplante comear no inicio de um perodo chuvoso. Os baixos nveis de luz e a umidade alta por este tempo ajudaria que as sementes se aclimatassem e se estabilizassem. (Porm necessrio considerar que um alto teor de umidade poderia fomentar um ataque de fungos quando plantado neste tempo) Coloque os frascos num lugar sombrio e protegido da chuva de forma que se aclimatem as novas condies de luz e temperatura. Os deixe de 2 a 4 semanas com as tampas. 2. Solte o tampas para permitir a entrada de quantidades pequenas de ar. Deixe-as deste modo durante 1 semana. Revise diariamente se tem folhas murchas e que os meios esto midos mas no totalmente molhado. 4. Abra os frascos um pouco mais. Os deixe durante alguns poucos dias e revise diariamente. 3. Abra as tampas at a metade da abertura. Os deixe deste modo por outros poucos dias e revise diariamente.

15 6. Abra as tampas trs quartos. Os deixe deste modo durante outros poucos dias e revise diariamente. 1. Abra os frascos completamente. Se possvel mante-los abertos por uma semana antes

de levar as plntulas e transplanta-las no criador.

8. Escolha os meios corretos para plantar as plantas pequenas. (ver o Apndice) 9. Cuidadosamente retire as plantas dos frascos, os separe suavemente e enxge os resduos de gar. 10. Encha uma bandeja (funda com buracos) com composto e submerge isto dentro uma grande fonte de gua. Umedea as razes da planta com fungicida e plante em meios flutuantes. 11. Quando a bandeja retirada da gua, o meio deve aderir as razes das orqudeas sem os destruir. Coloque as novas plntulas na cmara de aclimatao ou em uma pequena carpa de mesa feita de plstico transparente para que assegure a alta umidade durante a fase de estabelecimento. Rocear gua ajudaro manter a umidade nas primeiras fases. 12. Novamente, aclimate as plntulas gradualmente aos novos meios (por exemplo carpa completamente marcada, porta da carpa parcialmente aberta, porta completamente aberta, remover a carpa mas proteger da chuva, remover a proteo da chuva; com certeza espcies deveria ser protegido todas as plantas provavelmente em baixo de um coberto com plstico) Quando eles j so aclimados e so suficientemente grandes, eles podem ser transplantadas a bandejas maiores ou simplesmente aderido ao tronco de uma rvore, ramo ou pedao de cortia (com ou sem um pouco de musgo experimental) Rocee gua nas fases iniciais do desenvolvimento, julgue voc quanta quantidade de gua e quando colocar considerando que deve ser evitado que a planta seja ressecada , mas o crescimento de fungos no pode ser propiciado. 5. CONCLUSO Por meio da germinao em vitro um nmero maior de plantas pode ser cultivado por um perodo de tempo relativamente menor (alguns meses para espcies mais rpidas). Um grupo destas sementes germinadas poder ser exportado facilmente porque as orqudeas cultivadas e mantidas em frascos esterilizados esto isentas dos regulamentos habituais CITES relativo a sanidade vegetal e vida selvagem Outro grupo de sementes pode ser enviado para o berrio de orqudeas da Reserva Orquideolgica O Pahuma, plantadas em bandejas para venda ou para introduo na floresta da Reserva ou outras reas. Cada cpsula de orqudeas contm muitos milhares de sementes, o que significa que podero admirar muitas plantas. 16 6. BIBLIOGRAFIA Arditti, J., 1982. Germinao de semente de orqudea e cultura de muda - A Manual. Em J. Arditti (o Ed.) Biologia de orqudea: revises e perspectivas II. Pgs. 243 -370. Cornell Universidade Imprensa, Londres. Pritchard, H.W. (o Ed.) 1989. Mtodos modernos em conservao de orqudea: O papel de fisiologia, ecologia e administrao. Cambridge Universidade Imprensa, Cambridge. Ramsay, M., 1989. Apontamentos no publicados sobre germinao de sementes de orqudeas. Seaton, PG., & Pritchard, H., 19xx. O dos e donts de armazenamento de semente de orqudea.

Xxxx. Thompson, P.A. 1980. Orqudeas de semente. HMSO, Londres. 17

APNDICE 1 Equipamentos e materiais usados para a germinao de sementes na USFQ Cmara de fluxo laminar Autoclave Quarto de crescimento (18C, 16 horas de luz, 8 horas de escurido) Estantes com abajures fluorescentes de 20 watts. Garrafa de Pyrex de 1 litro Frasco de Pyrex de 1 litro Placa e barra magntica Medidor de PH NaOH e HCl para ajustar o pH gua destilada Meio Phytamax para o cultivo de orqudeas (P6668, Sigma Qumico) Sales Murashige e Skoolg (xxx) gar-gar (Sigma Qumico) Acar Carvo ativado Vitamina B Complexo Pina de vrios tamanhos 2 bisturis com folhas disponveis Potes de vidro para o etanol Frascos de vidro Potes de plstico de 250 ml

Caixas Petri Recipientes pequenos de vidro para as sementes Tampas para frascos Avental de laboratrio Papel de alumnio Toalha pequena para mos Pacotes de papel Luvas de cozinha marrons Fita adesiva Luvas de plstico descartveis Filme Pedaos de tela Bolsas de assar (celofane) Papel de cozinha Fitas elsticas Microporo Papel lcool anti-sptico (etanol a 70%) Etanol a 100% Roceador para o etanol Marcadores indelveis (preto) Cloro Seringas Algodo Meia nylon Grampeador e grampos