MANUAL PARA GERMINAÇÃO IN VITRO DE ORQUIDEAS Dra.

Sheena McKendrick
© Copyright 2000, Fundação Ceiba para Conservação Tropical Março 2000 O manual seguinte inclui a biologia básica para a germinação de sementes de orquídeas, algumas técnicas usadas para a germinação de orquídeas com ajuda da técnica em vitro, e um apêndice dos meios e espécies experimentados dentro do programa de germinação em vitro na Reserva Orquideológica O Pahuma. O manual foi desenhado especificamente para o Programa Orquideologico de O Pahuma, porém pode adaptar-se a outros programas. RECONHECIMENTOS Agradecimento especial para Nelson Zabala e para a Universidade São Francisco de Quito por permitir a Ceiba para fazer uso dos seus equipamentos para levar a cabo o programa de germinação em vitro. Nós também agradecemos Margaret Ramsay de Jardins Botânicos Reais, Kew, Inglaterra, pela sua util coleção de notas sobre propagação de orquídeas, e para Robert Mitchell e Grace Prendergast, também de Kew, por ter me ensinado estas técnicas. Igualmente eu quero estender meu agradecimento a Dick Warren da Companhia de Planta Equatorial, David Menzies de Glasgow Botanic Gardens e a Mónica de Navarro da Sociedade Orquideológica de Quito por toda sua ajuda e seus conselhos. Também agradeço a Lorena Gamboa de Rainforest Rescue que fez a tradução deste manual para espanhol. Por ultimo, quero agradecer de um modo especial a Família Lima que com o grande desejo em conservar a floresta tornou possível que este projeto fosse realizado. 2 ÍNDICE 1 INTRODUÇÃO 1. 2. propósitos do Programa de Germinação Em Vitro em O Pahuma A biologia da germinação de sementes de orquídeas

1.3 Fundações da germinação em vitro 1.3.1 germinação de Sementes Simbióticas e não Simbióticas 1.3.2 Bases para manter as condições de esterilização 1.3.3 Uso da câmara de fluxo laminar 2. PREPARAÇÃO DOS MEIOS 2.1 introdução para a preparação dos meios 2.2 metodologia geral para a preparação dos meios 2.3 transferência dos Meios 3. SEMEADURA DAS SEMENTES

estimular o interesse público e coletar.2 disseminação a partir de cápsulas verdes 3.4 manutenção de registros 4 CUIDADO DAS PLANTULAS 4.2. e para prover sementes a programas de restauração e regeneração de florestas. rendas para o desenvolvimento da Reserva e outros programas de . 3.2.1 propósitos do Programa de Germinação Em Vitro em O Pahuma A germinação em vitro de sementes de orquídeas é um componente importante do programa de conservação da Fundação Ceiba para a Conservação Tropical na Reserva Orquideológica O Pahuma. 2.Equador.1 As plántulas nos frascos 4.1 Coleta e armazenamento das sementes 3.1 método da Seringa 3.3. Reproduzir espécies raras e únicas de orquídeas para aumentar tanto o numero nos meios naturais da Reserva como em lugares fora dela (como jardins botânicos.2 Transplante 5 CONCLUSÃO 6 BIBLIOGRAFIA 7 APENDICES 3 1. Prover sementes para a venda na Reserva como um meio para parar a coleção de espécimes silvestres.2. Os objetivos deste programa de propagação em vitro são os seguintes: 1. a Noroeste de Quito.3.3.1 cápsulas verdes vs. programa de conservação. Cultivar orquídeas para o Jardim Botânico O Pahuma.3 cobertura dos recipientes 3.2. INTRODUÇÃO 1.2. cápsulas maduras 3.2 método do Pacote (ou fundo de papel) 3.2 Semeadura das sementes 3. entre outro).3 disseminação a partir de cápsulas maduras 3.

. as mesmas que tendem a crescer facilmente em comparação com suas parentes em áreas temperadas. orgânico e inorgânico e os açúcares devem estar disponíveis para a orquídea em uma forma apropriada já que não existe intermediação do fungo. é de importância vital que a relação orquídea -fungo se conserve durante os estados do ciclo de vida da planta no qual o protocornio enterrado não pode fabricar alimento por si mesmo. e portanto não se dispõe do fungo micorriza apropriado. Cultivar sementes de espécies sem igual ou ornamentais para a exportação em frascos com o propósito de apoiar a conservação empreendido na Reserva Orquideológica O Pahuma. A germinação asimbiótica é normalmente usado na propagação de orquídeas tropicais. tanto em O Pahuma como por meio da exportação. coloniza às sementes em processo de germinação e se origina uma relação simbiótica que se espera alimenta ao protocornio até produzir folhas e se tornar autotrófico. as sementes se semeiam com uma porção pequena de fungo micorriza apropriado. Na germinação simbiótica. Mantendo as condições normais. o protocornio continuarão seu crescimento durante várias semanas.3 Fundamentos da Germinação Em Vitro 1. Toda receita que vêm da venda de espécies de orquídeas. e como resultado das plantas micorrizadas são normalmente mais fortes e mais resistentes a infecções que as cultivadas asimbióticamente. O fungo cresce nos meios. Quando a semente germina produz uma massa indiferenciada de células chamados protocornio (figura 1). Por outro lado.1 germinação Simbiótica e não Simbiótica de Sementes Por meio da germinação em vitro. 4. o mesmo que abastecem as plantas jovens com açúcares e nutrientes que eles precisam até que eles são o suficientemente grande para fabricar seu próprio alimento. meses ou até mesmo anos dependendo das espécies até que alcança a idade apropriada para produzir raízes e folhas. se reproduzem sementes em frascos de vidro ou plástico sobre um meio de ágar nutritivo que contém os açúcares e minerais necessário de forma que as sementes germinem e cresçam. Tem a vantagem de usar um meio simples ( um dos mais geralmente usados consiste em aveia em pó com uma quantidade pequena de extrato de levedura). A relação orquídea-fungo não esteve em sua totalidade investigado para o caso das orquídeas tropicais. 4 1. 1. a desvantagem é que se precisa selecionar o tipo de fungo micorriza apropriado para que se origine a simbiose e prevenir o parasitismo e a morte conseqüente das sementes. o que os facilita produzir parte. Há dois tipos básicos de germinação em vitro: simbiótica e não simbiótica. eles serão reinvestidos na Reserva e em outros projetos de conservação. Estas sementes normalmente não germinam nos meios naturais a menos que eles sejam infetados por um fungo micorriza. de seu alimento. Existe pequena investigação na relação do micorriza em forma de fungo com as orquídeas tropicais. o protocornios de orquídeas epífitas é geralmente verde.conservação de orquídeas. No caso de orquídeas terrestres.2 A biologia da germinação de sementes de orquídeas As sementes de orquídeas são normalmente conhecidas como sementes em pó porque elas são minúsculas e elas contêm poucas reservas de alimento. Porém.3. Os meios usados para o germinação asimbiótica é mais complexo que para a germinação simbiótica Já que todos os nutrientes. Esta técnica é amplamente usada para propagação de orquídeas terrestres em áreas temperadas.

Use um avental de laboratório e lave-o constantemente.2 Fundamentos para manter condições de esterilização Tanto para a germinação simbiótica e asimbiótica é de importância vital que os meios. Tudo que entrará na câmara deve ser esterilizado. passando álcool e os mantendo na câmara até que o álcool seque. os aparatos e as sementes se mantenham desinfetados desde o inicio do processo de germinação. As condições de esterilização na preparação do meio se criam autoclavando o meio e os frascos a serem utilizados por 15 minutos a 15 atm.3.3 uso da câmara de fluxo laminar Deve-se prestar atenção a certas regras básicas ao usar a câmara de fluxo laminar: 1. Geralmente. Use um roceador e limpe todas as superfícies da câmara com um algodão encharcado de álcool (inclusive as paredes e o teto). Tenha o cuidado de não inalar quando se passe o etanol para usar a câmara . Com certo cuidado e pratica se pode criar e manter condições de esterilização desde a germinação até o transplante das sementes.3. é possível no lugar de usar luvas. ter muito cuidado se utiliza álcool anti-séptico que também contém metanol. porém no caso de existirem problemas com contaminação bacteriana usar as luvas novamente. os frascos. 1. ou peroxido de hidrogênio. este processo se realiza semeando desde a superfície desinfetada de cápsulas verdes. Deve ser desinfetado tanto antes como depois de usar a câmara . ou desinfetando sementes maduras com hypochlorito de sódio ou cálcio. No programa de germinação para O Pahuma. Use luvas e os desinfete completamente antes de usar. secar e esterilizar com álcool. lavar as mãos e esfregar as unhas usando um sabão antibacteriano.A germinação asimbiótica é um método usado no momento no programa de germinação em vitro na Reserva Orquideológica O Pahuma. 1. O metanol é tóxico e pode causar cegueira se ingerido). No caso de se dispor do fungo a partir de semeaduras em situ. . Sempre se deve desinfetar por completo usando álcool de 70-90 % (de preferência Etanol. Temos de ter certeza que estão desinfetados todos os instrumentos usados na transferência. Com prática. haveria a possibilidade usar técnicas simbióticas no futuro. porém eles são complicados tecnicamente e não devem ser desenvolvido em condições úmidas e sem limpeza apropriada. a esterilização consiste em esvaziar os meios e semear as sementes em uma câmara de fluxo laminar. Esta temperatura e pressão são bastante para matar todos os esporos de bactérias e fungos presentes nos meios. 5 As sementes devem ser esterilizadas e ser transferidas aos frascos sem introduzir fungos ou bactérias externas. Qualquer bactéria ou fungo que introduzido nos frascos crescerá mais rápido que as sementes e logo vai ocupar o espaço delas até as matar. Outras técnicas para manter estas condições de esterilização são possíveis ( Thompson 1980).

a esterilização é assegurada submergindo em etanol 100% e incendiando-a três vezes antes de usar. 1. Quando se inicia o processo de germinação de uma nova espécie é aconselhável provar com diferentes meios para uma concentração total e parcial para determinar qual é o melhor meio para esta espécie.ou queimar as sementes que você esta transferindo de um lugar para outro . rocearlos com etanol não serão necessários. desinfete os instrumentos novamente depois do seu uso e lave as mãos novamente depois de ter tido contato com qualquer objeto fora da câmara . Se lembre que qualquer esporo de bactéria ou fungo dentro da câmara flutuará para o interior e em direção a sua pessoa. Deixe-os esfriar antes do uso. Nunca ponha as mãos. não toque no cabelo ou na face com as luvas colocadas. ADVERTÊNCIAS DE PRECAUÇÃO 1.5 porem. 3 Mantenha as condições de esterilização por meio da limpeza regular da câmara com álcool. Mantenha movimentos leves e evite criar turbulência de ar que possa causar contaminação. Qualquer nota escrita com marcador no vidro será apagada pelo etanol. Ao experimentar com o pH se deve considerar que o pH dos meios será mais alto somando o ágar que antes de fazê-lo. 2. Os frascos de vidro podem ser roceados com álcool ao introduzi-los na câmara . Há diferente tipos de meios disponíveis para a venda como também outros específicos para certas espécies projetadas por peritos profissionais. Aldrich. . Tenha cuidado para não QUEIMAR . Se os frascos estão limpos. Não fale.9 (Mónica de Navarro. embrulhando-os previamente em papel de alumínio ou papel de empacotar café fechado com fita adesiva. O nível de pH também é importante.os instrumentos a ser usados se esquentam altamente depois de duas . Vantajosamente o etanol queima em baixa temperatura e podem ser facilmente evaporado quando agitado com força. A maioria de orquídeas germina dentro de um meio de pH 5. o gênero Masdevallias é conhecido como um gênero "escolhedor" dos meios em qual desenvolverá (Richard Warren.6 ao 5. O melhor modo para conservar o etanol está em frascos grandes de vidro para permitir a máxima exposição dos instrumentos ao etanol. Trabalhe no possível pela parte de atrás da câmara e minimize o tempo de exibição dos meios quanto possível. espécies andinas preferem níveis mais altos de pH. De um modo especial. tussa ou espirre dentro da câmara . apêndice 1) ou comprar em pó dos fornecedores. As preparações comerciais de Phytamax (Sigma Química. 3.1 introdução para a Preparação dos Meios Os meios podem ser preparados usando ingredientes básicos (Thompson. Depois de Flambar os instrumentos estes devem ser colocados depressa em um frasco de vidro esterilizado para continuar com o flameado. Uma vez na câmara . 5. Esses instrumentos podem ser autoclavados antes do seu uso. Tenha cuidado para não QUEIMAR suas MÃOS . 2 PREPARAÇÃO DOS MEIOS 2. mas com precaução.tanto no isqueiro de fogo como na parte superior do cilindro de gás.1977. Inglaterra) e Murashige e Skoog foram os meios principais usados no projeto de O Pahuma (março de 2000). SEMPRE SE LEMBRE DE FEICHAR O GAS . Por exemplo.particularmente quando usa luvas! É fácil de fazer isto pois você não pode sentir se o álcool das luvas evaporaram completamente.Tenha certeza que os frascos de vidro estejam limpos. conversação pessoal). mangas ou outro objeto sobre ou em direção de algo desinfetado (como os meios). conversação pessoal).

os papeis indicadores de pH são suficientes. * Precaução: se estiver usando um medidor de pH não se deve misturar o meio quando se encontra dentro o pHmetro: a membrana é muito delicada e cara e pode quebrar facilmente. Fechar a tampa da garrafa sem apertar totalmente. TENHA CUIDADO AO TIRAR OS FRASCOS E GARRAFAS DA AUTOCLAVE . NÃO RESPIRE O PHYTAMAX EM PÓ E EVITE O CONTATO COM A PELE E OS OLHOS. 1. 2. Só para Murashige e Skoog: somar a quantidade correta de açúcar e 2gr/l de carvão ativado. Eles estarão bastante quentes e você pode sofrer queimaduras. alcançando uma distribuição melhor do carvão ativado no mesmo. 3.2 método geral para a preparação dos meios 1. . 6. por razões de segurança a Universidade prefere usar duas garrafas ou frascos de 500 ml deste modo para manter a barra magnética na garrafa e agitar suavemente antes de verter para dispersar o carvão ativado.Qualquer um destes meios pode estar tanto preparado para uma concentração parcial ou total (a concentração parcial é recomendada para Murashige e Skoog). ADVERTÊNCIAS DE PRECAUÇÃO 1. 7 O método geral para a preparação destes meios é o que é detalhado a seguir. Verter a metade do líquido em um frasco. 4. Somar uma barra magnética e uma pequena quantidade de água destilada e misturar até que se dissolva. Encher o recipiente com água destilada até obter 1 litro e agitar continuamente. Porém.6 usando HCl ou NaOH e misturando completamente com a barra magnética. 2. O elevado aumento de pressão na autoclave causará explosão do frasco ou garrafa. Se não temos o medidor de pH. NUNCA FECHE HERMETICAMENTE A TAMPA DO FRASCO OU GARRAFA ANTES DE COLOCA-LA NA AUTOCLAVE. 2. Em condições ideais os meios devem ser preparados em uma garrafa com a barra magnético durante todo processo de autoclave inteiro com o propósito de que o meio seja misturado antes de vertê-lo nos frascos. cobrir os frascos com papel alumínio e os levar ao autoclave. Medir o pH e ajusta-lo a 5. Se você tiver contato com o pó do Phytamax. lave os imediatamente com água fria e solicite cuidado clínico. ou o carvão ativado. Sempre tenha certeza que as tampas estão frouxas ao colocar os frascos na autoclave: só podem fechar eles fortemente depois dos frascos esfriarem. Medir a quantidade correta do meio em pó usando uma garrafa de 1 litro e evitando o contato com o pó da atmosfera. e Skoog. Murashige. 3. acrescentar 4 gramas de ágar a cada recipiente (8 gr/l de ágar) e misturar para que se disperse. Se tiver contato com os olhos. 7. deverá lavar imediatamente a parte afetada com bastante água fria.

Se a pessoa não tiver tampas disponíveis." está intato. Os frascos devem ser ensaboados e lavados completamente quatro vezes antes de usar. A preparação completa do meio desde a mistura dos ingredientes até o estabelecimento do meio vertido tem um tempo estimado de 4 horas de duração. pode -se armazenar por muitos meses em frascos fechados dentro de um refrigerador (4-5°C). Não se deve armazenar as sementes em potes de plástico pois as cápsulas suarão e serão apodrecidas. soltando o tampas dos frascos. Quando o ágar est a menos líquido e a garrafa ou frasco não está tão quente. e no caso de períodos mais prolongados (como uma meia hora) se provocara a precipitação do carvão ativado. Deve-se repetir a esterilização dos frascos que saem da autoclave com papel alumínio ou sem o papel de alumínio. 9 Se for possível. e desinfetado por 15 minutos a 15 Psi. A água disponível nos frascos pode ou não ser útil dependendo da maturidade das sementes. 19xx). Uma vez as sementes estão secas. e esta pronta para ser semeado. Espere os meios esfriarem bastante para pegar com as mãos. 3.2. Ponha em linha os frascos ou caixas Petri começando do fundo da câmara de fluxo laminar. pode cobrir os frascos com um pedaço de papel alumínio. Deixe que se assente o meio e ponha as tampas novamente. Pode se cobrir esses frascos imediatamente depois que derramou o meio." As cápsulas podem ser armazenadas por algumas semanas se envolvidas em papel de cozinha e se os coloca num lugar do refrigerador com bastante aeração (como o compartimento para o queijo). é melhor coletar cápsulas que foram expostas a um dia seco. 2. pode-se secar com cloreto de cálcio. Se este composto não esta à disposição. 3. deve-se usar a câmara de fluxo laminar (veja item 1. SEMEADURA DAS SEMENTES 3. É aconselhável usar sementes frescas ou secas numa solução saturada de hexahidrato de cálcio (Seaton & Pitchard. na autoclave. está cheio com sementes e não se deforma quando se aperta com as pinças. (mais áspero que o cloreto de cálcio e somente recomendado usar a curto prazo) ou simplesmente secar a temperatura ambiente em um quarto (só em climas secos).8 2.3 Transferência dos Meios (colocar nos frascos) Verter os meios nos frascos ou caixas Petri esterilizadas. 1. Se derramar o ágar muito quente pode-se causar uma condensação alta. A estufa quente só deve ser usado por pouco tempo (emergências). as sementes nunca devem ser armazenadas ou transportadas em potes de plástico ou recipientes com ar dentro. gel de sílica.3). Se temos frascos com tampa se lembre de fecha-las totalmente antes de coloca-los na autoclave. 1. . Tire as tampas dos frascos ou caixas Petri e verta o ágar movendo da esquerda para direita (se és destro) para evitar que qualquer parte da mão ou do avental de laboratório toque em um frasco ou caixa aberta.1 Coleta e Armazenamento das Sementes As sementes podem ser coletadas a partir de cápsulas verdes ou cápsulas maduras. Novamente. mas a pessoa pode causar condensação. Você também pode usar papel de empacotar café fechado com um barbante. mas é mais inadequado. Se foi preparado 2 litros prontos de meio você pode usar uma estufa para manter uma garrafa quente até terminar de usar a outra. pode-se derramar nos meios. Uma cápsula verde que está amadurecendo.

remova a flor morta da cápsula cuidadosamente 2. 1. algumas sementes tomadas de cápsulas quase maduras poderiam germinar mais rapidamente que as vindo de cápsulas maduras por causa dos mecanismos de dormência. onde fungos e bactérias podem ser desenvolvidas. as sementes deixam de ser estéreis e requerem um processo de esterilização.O tempo desde o florescimento até a maturação das sementes varia significativamente de acordo com as espécies e o lugar. Deveria ser considerado que o que se semeia é determinado pela disposição de qualquer uma das duas formas de encontrar as sementes de acordo com a época que se coletam.1 Cápsulas verdes vs. Também se deve considerar que as sementes semeadas a partir de cápsulas que não amadureceram bastante poderiam germinar lentamente ou simplesmente não germinar. Semeadura a partir de sementes secas. Introduza a cápsula aproximadamente durante 10 minutos em uma solução de hypochlorito de sódio a 1% ao qual foi acrescentada uma gota de detergente (levar em conta que o cloro comum é hypochlorito de sódio a 5% portanto é necessário diluir).2. O interior das cápsulas de orquídeas permanece estéril se as cápsulas estão intatas. e lembrando-se de incluir este número nos detalhes do semeadura. Use uma escova de dente macia para esfregar a cápsula suavemente com a solução ensaboada. Geralmente. então se enxágua com água destilada e se semeia nos meios preparados. Transfira a cápsula submersa na solução de cloro à câmara de fluxo laminar.2 Semeadura a partir de cápsulas verdes O método geral para semear sementes a partir de cápsulas verdes é o seguinte : 1. se a parte externa da mesma é esterilizado. e abre-se as cápsulas debaixo de condições de esterilização as sementes poderão manter-se desinfetadas. na realidade uma cápsula que cresce em um recipiente de vidro quente vai amadurecer muito mais rápido do que aquele crescendo na floresta nublada. 3.2 Semeadura das Sementes 3. Enxágüe a cápsula em água. as sementes de Epidendrum ou Masdevallia requerem aproximadamente de 3. hypochlorito de cálcio ou peroxido de hidrogênio. conversação pessoal). A vantagem deste método é que não se requer a esterilização das sementes. 3. As estimativas convencionais não levam em conta as diferenças climáticas. As sementes são agitadas dentro da solução que também contém uma gota de detergente para " umedecer". Logo são descritas as vantagens e desvantagens de ambos os métodos: 1. Também. 3. A vantagem deste método é que as sementes podem ser coletadas. Com ajuda de um bisturi. é usada uma solução de hypochlorito (cloro) de sódio. Então. armazenado por vários meses no refrigerador e usado quando é necessário.5 meses para amadurecer enquanto as sementes de Odontoglossum requerem ao redor de 18 meses (Mónica de Navarro. Semeadura a partir de cápsulas verdes. 4. . o que poderia causar sua deterioração. Todas as plantas coletadas na Reserva Orquideológica O Pahuma deve ser marcado com uma fita adesiva e registrada com um código. Por exemplo. A desvantagem deste método é que ao abrir a cápsula todas as sementes dela devem ser usadas ou eliminadas (algumas sementes maduras poderiam secar e ser armazenadas). 2.2. secadas ao ar. Uma vez que a cápsula está aberta. sementes secas Você pode semear sementes a partir de cápsulas verdes ou a partir de sementes secas.

autoclave uma certa quantidade de água destilada (em frascos ou garrafas) e as pinças.2. tape a ponta da seringa com um pedaço de algodão envolto em um pedaço de meia de nylon (veja o diagrama). Se não for possível sustentar pelo pecíolo.6. 2. do tempo de maturação logo que a semente é coletada.1 Método da Seringa 1. Em geral. É possível usar outras técnicas. 9. Corte a cápsula longitudinalmente ao meio com ajuda de um bisturi desinfetado. insira o embolo novamente e autoclave. mas eles não são incluídos neste manual. 3. 3. uma gama de tempos de esterilização é recomendado para as sementes novas. Por isto. método que usa o funil de Buchner. das condições climáticas do momento da coleta e dos métodos de secar e armazenamento. O tempo de esterilização também varia. Transfira a cápsula a uma superfície desinfetada (como uma caixa esterilizada Petri). 10. Use uma folha de bisturi nova para cada cápsula prevenir a propagação de vírus. mas as técnicas variam. Repetir este passo até que todas as sementes são usadas.2. 7. O programa de conservação em O Pahuma usa duas técnicas principalmente para semear sementes maduras: o método da seringa e o método do pacote (ou saco de papel). Pegue uma seringa de 5 ml. Normalmente são somadas algumas gotas de água em cada frasco de modo que certos grupos de sementes se separem e se distribuam no ágar. As sementes menos maduras podem ser retiradas da cápsula com a pinça. Tire o embolo da seringa e coloque uma quantidade pequena de sementes na seringa. Erga uma metade da cápsula com a pinça e bata ligeiramente no meio para espalhar as sementes. mude a posição da pinça antes de flambar novamente. Ao mesmo tempo. Tanto para o método da seringa como para o método do pacote é aconselhável esterilizar os instrumentos e a água necessária previamente 1 dia. Repita o processo duas vezes para as cápsulas grandes. já que a água demora bastante para esfriar-se depois do autoclave. Deixe que o álcool se queime completamente e que a cápsula e a pinça se esfriem. Todos eles se baseiam na esterilização das sementes e lavagem em água destilada antes dos semear.3 Semeadura a partir de capsulas dehiscentes (aberto com sementes secas) 11 Métodos diferentes existem para o semeadura a partir de sementes secas. a técnica da seringa é usada para a maioria das sementes enquanto a técnica do pacote é usada para sementes mais raras e menores. dependendo das espécies. 8. Para o caso das cápsulas pequenas e frágeis você decide com discrição o tempo de passar pela chama (talvez só uma vez). Então submirja em álcool a 100% e passe rapidamente pelo fogo (Flambar). como a filtração. Tire a cápsula da solução de cloro usando uma pinça e levando preferivelmente do lado que cai o pecíolo. .3.

(Uma grande quantidade de sementes formará uma massa em forma de pasta se você usa a técnica 5b para o semeadura. Agite. vertendo as sementes nos meios e eliminando o excesso de água ou b) expelindo todo excesso de água. Submirja em água destilada por de 5-10 minutos. 5. Insira o embolo novamente.3 Fechamento dos Frascos Depois do semeadura os frascos podem se fechar usando "filme" ou papel cortado celofane das bolsas transparentes para assar. ao usar esta técnica se colocam os pacotes em um recipiente que contenha cloro e este sobre uma placa magnética. Transfira o pacote mais o cloro para a câmara de fluxo laminar. 4. tirando fora o algodão com uma pinça e colocando as sementes sobre os meios. Corte e abra o pacote usando tesoura desinfetada e semeie as sementes nos meios. Aperte os pacotes suavemente para eliminar o excesso de água e transferi-los para uma superfície esterilizada. Repita isto 3-4 vezes para enxaguar as sementes. Agite durante outras 5 minutos e a expulse novamente. Lave as sementes 3-4 vezes absorvendo água destilada e esterilizada na seringa. e ao submergir ao mesmo tempo vários pacotes em cloro podem apressar o processo de semeadura. 5. Freqüentemente agitando os pacotes os mesmos resultados são obtidos.2. Elabore um pacote a partir de um pedaço de papel (veja o diagrama) 2. 1. 1. Isto nunca funcionou em minha experiência pessoal. os grampos agirão como campos magnéticos e eles agitarão os pacotes automaticamente. agitando por um momento e logo expelindo o líquido. Usando pinças transplante o pacote para água destilada (em um frasco). Esparrame uma quantidade pequena de sementes dentro dos pacotes. agitando-os continuamente. Normalmente. Dobre e marque os pacotes usando grampos. dobrado um lado sobre o outro. transfira os pacotes à solução de cloro a 1% e que também contém uma gota de detergente. Agite a seringa durante 5 minutos (ou outro tempo de esterilização). tenha certeza que as sementes estão completamente molhadas dentro da solução e que não estão em bolsas de ar. 3. Com ajuda de pinça. o filme devera estar desenrolado na câmara de fluxo. quantidades grandes de sementes causará ajuntamento das sementes e impedem a penetração do cloro.2 método do Pacote (ou saco de papel) 12 1.3. 4. 3. Expulse esta solução e absorva outra porção de solução fresca novamente. Novamente. apertando suavemente para dispersar qualquer bolsa de ar. De acordo com a teoria. 3. ficando difícil a semeadura apropriada). Semeie as sementes assim: a) esterilizando o colo da seringa. Se é usado "filme". e o mais próximo lado para a parte posterior da câmara é o que devera ser . Deixe-os na solução durante 10 minutos (ou outro tempo de esterilização). Absorver com a seringa 4 ml da solução de cloro a 1% (a que foi adicionado uma gota de detergente).

Corta-se o papel celofane em quadrados. 4. Em casos como este. As sementes no USFQ crescem 40 cm abaixo dos tubos fluorescentes de 20 watts em um quarto de crescimento que é regulado aos 18°C com 16 horas de luz e 8 horas de escuridão. Água destilada pode ser adicionada se os frascos estão secos.4 Manutenção de registros 13 Os registros devem ficar tanto em um caderno de laboratório e um sistema de cartões ou no computador. uma contaminação de fungos poderiam motivar a germinação (Mónica de Navarro. uma vez que o fungo produziu esporos. usando uma seringa desinfetada. De um modo ocasional. O cartão não devera ser descartado. O papel celofane é mais fácil de administrar que o filme e é reutilizável. conversação pessoal). Cada frasco também está rotulado com um código simples no momento verter os meios. Se um frasco é eliminado deve-se marcar em algum lugar visível com um X e devese registrar a causa (por exemplo.1 As sementes nos frascos. Por tanto é recomendado para usar como material de cobertura. tipo de meio (e a data que se preparou se lembrar ). segura-se o filme com uma fita elástica e corta-se a sobra. 3. Os detalhes sobre os meios preparados. não é aconselhável combater esta contaminação. pode-se combater antes que se disperse totalmente . com o propósito de prevenir qualquer confusão durante o armazenamento ou a semeadura. o processo de semeadura e as notas de observação devem registrar no caderno. o mesmo que consiste no código das espécies (por exemplo TF = Trichopilia fragrans) mais o código de semeadura (por exemplo TF12 se é no décimo segundo semeio de Trichopilia). As plantas pequenas são transplantadas quando elas começarem a aparecer folhas e começam a encher o frasco. Os recentes frascos devem ser revisados regularmente depois da semeadura pelo risco de contaminação. pode ser útil mais tarde para analisar as causas do problema. 4. A data em que a semeadura foi feito é colocado no canto superior esquerdo do cartão.colocado nos frascos. nomeando um código para cada um. No sistema de cartões se registram todo o semeio. As plántulas são transferidas a frascos novos que contêm o meio usando pinças desinfetados. Das bolsas transparentes assar KLAR 2000 a pessoa pode obter 20 quadrados por bolsa e 160 quadrados por pacote (8 bolsas por pacote). pode-se deixar que as sementes cresçam. Se todos os frascos de um lote foram eliminados . e se coloca no frasco que contém o meio e assegura ele usando uma fita elástica. O quadrado de celofane se retira dos frascos usando pinças. . mas devem ser transplantadas antes que o fungo ocupe seu espaço e as destrua (contatar com Mónica para conselhos). deve ser apontado com um X ao lado do código da espécie e com um X grande no cartão inteiro. o frasco deve ser eliminado. CUIDADO DAS PLÁNTULAS. e abaixo da data o número de frascos. Cada frasco tem um rótulo com o código de semeadura e qualquer outra informação relevante e útil para te-la em um acesso fácil e não ter que recorrer aos cartões. ou se existe pouco líquido no fundo do frasco. Porém. A exceção para esta regra se da quando for mais eficaz remover os protocornios de um frasco ou caixa Petri contaminada. e se autoclava dentro dos frascos fechados antes de ser usado. Neste último caso. o código e fonte da semente e qualquer outra observação durante o processo de semeadura. Se a contaminação é descoberta mais cedo possível. Então. como é o tempo de esterilização. contaminação por fungos ou bactérias). Os frascos são examinados semanalmente e se deve registrar qualquer contaminação e germinação com a data correspondente.

substâncias complexas (como banana . as plántulas devem ser cuidadas diariamente para evitar problemas. tanto na fase de aclimatação como no de transplante. 4. precise se acostumar gradualmente para meios mais secos antes de ser transplantadas. Deixe-as deste modo durante 1 semana. o plántulas que cresceram em condições de alta umidade terá cutículas fracas e para isto. As novas plantas devem ser protegidas de modo especial da luz solar forte: uma pequena quantidade de luz solar poderia queimar as folhas destas plantas até mesmo as que normalmente crescem na sombra. Se é possível a fase de transplante começar no inicio de um período chuvoso. Abra os frascos um pouco mais. Também. Os deixe deste modo por outros poucos dias e revise diariamente. suco de abacaxi ou vitamina B) fomentar o desenvolvimento da raiz (ver o Apêndice xx). Finalmente. (Porém é necessário considerar que um alto teor de umidade poderia fomentar um ataque de fungos quando é plantado neste tempo) Coloque os frascos num lugar sombrio e protegido da chuva de forma que se aclimatem as novas condições de luz e temperatura.Uma agulha de crochê é útil nesta fase para retirar sementes delicadas ( Mónica de Navarro. conversação pessoal). 3. Os baixos níveis de luz e a umidade alta por este tempo ajudaria que as sementes se aclimatassem e se estabilizassem. 4. a luz é baixa e tanto a luz como a temperatura são praticamente constante. A pessoa pode fazer um buraco pequeno nas tampas (se eles são feitos de metal ou plástico. bactérias e herbívoros. Nos meios naturais. 15 6. 1. Na continuação se detalham alguns conselhos para o transplante.2 Transplante Nos frascos as plántulas foram desenvolvidos em uma atmosfera fechada e limpa e para que devera se acostumar gradualmente à atmosfera externa antes de ser transplantadas para as bandejas. Deve-se fazer alguns transplantes antes que as plantas estejam prontas. No quarto de crescimento. 1. Abra os frascos completamente. O meio seguinte pode ser o mesmo que o primeiro. A umidade nos frascos são altas e as plantas são protegidas de ataques de fungos. Solte o tampas para permitir a entrada de quantidades pequenas de ar. Os deixe durante alguns poucos dias e revise diariamente. Modifique estes passos quando for necessário. O tempo de duração de cada fase pode variar com respeito ao especificado: o constante monitorando deveria dar uma idéia da coisa mais apropriada para cada espécie debaixo de certas condições. possivelmente no celofane e não aconselhável no filme) e selando dois ou três vezes com o microporo para proporcionar uma superfície de respiração seguro a prova de esporos nas tampas. Os deixe deste modo durante outros poucos dias e revise diariamente. Abra as tampas três quartos. . Os deixe de 2 a 4 semanas com as tampas. Se é possível mante-los abertos por uma semana antes de levar as plántulas e transplanta-las no criador. Abra as tampas até a metade da abertura. temperatura e iluminação variam constantemente. Revise diariamente se tem folhas murchas e que os meios estão úmidos mas não totalmente molhado. 2. leite de coco. mas é normalmente melhor se a pessoa acrescentar ao meio. e mais de uma vez ao dia se o clima é seco e ensolarado.

16 6. PÁG. plantadas em bandejas para venda ou para introdução na floresta da Reserva ou outras áreas. 10. Quando a bandeja é retirada da água. Um grupo destas sementes germinadas poderá ser exportado facilmente porque as orquídeas cultivadas e mantidas em frascos esterilizados estão isentas dos regulamentos habituais CITES relativo a sanidade vegetal e vida selvagem Outro grupo de sementes pode ser enviado para o berçário de orquídeas da Reserva Orquideológica O Pahuma. Arditti (o Ed. H... Métodos modernos em conservação de orquídea: O papel de fisiologia. o meio deve aderir as raízes das orquídeas sem os destruir. Ramsay. 1989. Novamente. Escolha os meios corretos para plantar as plantas pequenas. ecologia e administração. o que significa que poderão admirar muitas plantas. eles podem ser transplantadas a bandejas maiores ou simplesmente aderido ao tronco de uma árvore. 19xx. Apontamentos não publicados sobre germinação de sementes de orquídeas. Umedeça as raízes da planta com fungicida e plante em meios flutuantes. remover a proteção da chuva. Cornell Universidade Imprensa.8. Germinação de semente de orquídea e cultura de muda . . Cambridge. (ver o Apêndice) 9. remover a carpa mas proteger da chuva. (o Ed. mas o crescimento de fungos não pode ser propiciado. 1982. Londres. 11. O do´s e don´ts de armazenamento de semente de orquídea. porta completamente aberta. ramo ou pedaço de cortiça (com ou sem um pouco de musgo experimental) Rocee água nas fases iniciais do desenvolvimento. & Pritchard. Coloque as novas plántulas na câmara de aclimatação ou em uma pequena carpa de mesa feita de plástico transparente para que assegure a alta umidade durante a fase de estabelecimento. Cuidadosamente retire as plantas dos frascos. 243 -370. 12. Pritchard. os separe suavemente e enxágüe os resíduos de ágar. H. julgue você quanta quantidade de água e quando colocar considerando que deve ser evitado que a planta seja ressecada . Cada cápsula de orquídeas contém muitos milhares de sementes.W. 5. J.) Biologia de orquídea: revisões e perspectivas II. Encha uma bandeja (funda com buracos) com composto e submerge isto dentro uma grande fonte de água. aclimate as plántulas gradualmente aos novos meios (por exemplo carpa completamente marcada. Págs. Em J. CONCLUSÃO Por meio da germinação em vitro um número maior de plantas pode ser cultivado por um período de tempo relativamente menor (alguns meses para espécies mais rápidas). BIBLIOGRAFIA Arditti... M.) 1989. porta da carpa parcialmente aberta.A Manual. Rocear água ajudarão manter a umidade nas primeiras fases. Cambridge Universidade Imprensa. com certeza espécies deveria ser protegido todas as plantas provavelmente em baixo de um coberto com plástico) Quando eles já são aclimados e são suficientemente grandes. Seaton.

HMSO. 1980. Garrafa de Pyrex de 1 litro Frasco de Pyrex de 1 litro Placa e barra magnética Medidor de PH NaOH e HCl para ajustar o pH Água destilada Meio Phytamax para o cultivo de orquídeas (P6668. P. Sigma Químico) Sales Murashige e Skoolg (xxx) Ágar-ágar (Sigma Químico) Açúcar Carvão ativado Vitamina B Complexo Pinça de vários tamanhos 2 bisturis com folhas disponíveis Potes de vidro para o etanol Frascos de vidro Potes de plástico de 250 ml . 16 horas de luz. 8 horas de escuridão) Estantes com abajures fluorescentes de 20 watts. Thompson. 17 APÊNDICE 1 Equipamentos e materiais usados para a germinação de sementes na USFQ Câmara de fluxo laminar Autoclave Quarto de crescimento (18°C. Orquídeas de semente. Londres.Xxxx.A.

Caixas Petri Recipientes pequenos de vidro para as sementes Tampas para frascos Avental de laboratório Papel de alumínio Toalha pequena para mãos Pacotes de papel Luvas de cozinha marrons Fita adesiva Luvas de plástico descartáveis Filme Pedaços de tela Bolsas de assar (celofane) Papel de cozinha Fitas elásticas Microporo Papel Álcool anti-séptico (etanol a 70%) Etanol a 100% Roceador para o etanol Marcadores indeléveis (preto) Cloro Seringas Algodão Meia nylon Grampeador e grampos .

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