Anemia en neonato con transfusin intrauterina con enfermedad hemoltica por Rh: no hay evidencia de anti D relacionado con

la supresin de la eritropoyesis in vitro.

Durante dcadas, se ha logrado un importante progreso en la gestin y resultados de nios con EHRN por Rh. La inmunizacin con anti D ha reducido la incidencia de la sensibilizacin por Rh y las transfusiones intrauterinas han evitado el hidrops fetal. Despus del nacimiento, la hiperbilirrubinemia ha sido tratada con fototerapia o en casos severos de ictericia con recambio sanguneo. Sin embargo, en algunos casos, EHRN por Rh puede complicarse por una anemia postnatal prolongada con la necesidad de transfusiones postnatales. Esto es tambin llamado anemia hiporegenerativa, y es caracterizado por una eritropoyesis deficiente del recin nacido, evidenciado por la falta de eritrocitos fetales en sangre perifrica y bajo o ausente recuento de reticulocitos. Esta condicin se observa principalmente en pacientes que han recibido varias transfusiones intrauterinas de GR, pero la base patolgica de estos mecanismos es desconocida. Adems de la hemolisis, la supresin en la medula sea por transfusiones intrauterinas y el dficit de eritropoyetina (EPO) han sido discutidos como posibles mecanismos. Adems de la destruccin de las clulas eritroides con anti D por el sistema retculo endotelial, un efecto directo inhibitorio de anti D en progenitores eritroides, similar a los anticuerpos del sistema Kell, puede ser probable. Adems de las transfusiones, la administracin de EPO recombinante e inmunoglobulinas(IgGIV) intravenosas son el tratamiento preventivo implantado por el clnico. En algunos pacientes esto ha reducido la necesidad de transfusiones postnatales. Sin embargo, en otros pacientes, no se ha observado ningn efecto positivo y se conoce poco acerca de el cuando y en que pacientes esta terapia ser exitosa. La anemia hiporegenerativatarda debe ser distinguida de la llamada anemia tarda de la enfermedad hemoltica. Esta ltima es menos severa ya que la medula sea esta activa y produce una cantidad apropiada de reticulocitos. Se cree que es causada por una combinacin de una hemolisis continua, la disminucin de la vida media de los GR transfundidos, la baja de hemoglobina y el rpido aumento del volumen intravascular en el recin nacido. Tambinest asociado a un aumento en los niveles de bilirrubina. Se presenta un caso de un recin nacido con EHRN por Rh que desarrollo una severa anemia que continuo por 4 meses. Durante este tiempo, no se detectaron reticulocitos en sangre perifrica y fueron necesarias varias transfusiones. Para identificar los mecanismos de base y distinguir entre la hemolisis en curso y el dficit de eritropoyesis, se realizaron aspirados de medula sea y se determinaron los niveles de EPO. Adems el suero materno contiene altas cantidades de anti D que fueron agregados a un modelo humano in vitro de eritropoyesis, inducido por clulas CD34+ de un donante D+.

Presentacin del caso -Curso prenatal: La madre es una mujer de 40 aos, de nacionalidad iraqu. Un hijo muri a los 3 aos por incompatibilidad Rh. El grupo sanguneo determinado inicialmente en el hospital durante la semana 20 de gestacin fue O Rh (Ccddee). El titulo de anti D fue de 512. Durante la semana 24 se determin el grupo sanguneo del feto que resulto ser O Rh + (ccD.Ee). El TAD fue positivo para IgG y la elucin con acido mostro la unin de Anti D a los GR fetales. La Hb fetal en ese tiempo fue 4,9 g/dL y se transfundi con GR O Rh -. Durante el embarazo el titulo de anti D aumento y alcanzo 16000 en el parto. Debido a la anemia del feto, se necesito un total de 7 transfusiones ( en las semanas: 24,25,27,29,31,32 y 34) FIG 1.

FIG. 1: Titulo anti D materno durante el embarazo y transfusiones intrauterinas.

Despus de la segunda transfusin la determinacin de grupo sanguneo fetal fue O Rh con TAD negativo, ambos indican que se pesquisaron los GR transfundidos. Por precaucin se determino el grupo sanguneo con PCR durante la semana 31, y se confirmo O Rh + como el verdadero grupo del beb. -Curso postnatal: Al nacer el beb de sexo masculino peso 2845 g, fue necesario una cesrea en la semana 36. Luego de una leve ventilacin artificial con mascarilla, el nio estaba en buenas condiciones. El examen de sangre perifrica mostro un recuentro de leucocitos de 6,9/nL, plaquetas: 246/nL, Hb: 14.4 g/dL, hematocrito: 42% con volumen de GR = 88.1 fL y 0 % de reticulocitos. La bilirrubina, transaminasas, y gamma glutamiltransferasa estaban en niveles normales. Se determino nuevamente el grupo sanguneo que fue O Rh y TAD a causa de los GR transfundidos. En los das siguientes, la Hb disminuyo, y no aparecieron reticulocitos ni GR O Rh +. 10 das despus del nacimiento, se administrIgG IV (1 g/kg/da), resultando en un leve aumento de Hb de 11.7 a 13.9 g/dL.Despus de esto, la Hb se encontr bajo los 8 g/dL, teniendo como consecuencia 3 transfusiones de GR (FIG. 2: semanas 4,6 y 11 despus de nacido). Durante este tiempo el grupo sanguneo fue O Rh -, sin reticulocitos, TAD negativo. Once semanas luego del nacimiento, el titulo de anti D en sangre perifrica del nio fue de 2048.

FIG 2: Hb postnatal (lnea negra) y recuento de reticulocitos (lnea gris) en sangre perifrica del recin nacido. Tambin se indican las transfusiones de GR y el titulo de anti D del infante. Se detectaron reticulocitos despus de la semana 15 de vida, lo que coincide con una baja del titulo de anti D hasta 16.

Variados procedimientos se hicieron para poder distinguir entre hemolisis en curso por el aumento de titulo de anti D y la deficiente eritropoyesis de otro origen, especialmente una anemia aplasia. Anlisis de sangre perifrico mostraron niveles normales de bilirrubina, lactato deshidrogenasa y no haba evidencias de hemolisis intravascular. Un ultrasonido de abdomen mostro rganos normales y ausencia de hepatoesplenomegalia. Se descarto infeccin por Parvovirus por PCR y por determinacin serolgica. La EPO estaba en lmites normales ( 32.1 U/L). Adems un aspiradoseo obtenido en la semana 13 despus del nacimiento mostro incremento de la eritropoyesis ( 0,3% de eritroblastospolicromaticos y 10,2% de eritroblastospolicromaticos) y una diferenciacin normal de clulas mieloides y trombocitos. Trece semanas despus de nacido, se realizo un segundo tratamiento con IgGIV (1g/kg/ das por dos das), pero la Hb disminuyo. Recin a las 15 semanas del nacimiento se encontraron en sangre perifrica los primeros reticulocitos y GR O Rh +. El titulo de anti D decay en ese momento en 16. Unos pocos das despus, la Hb comenz a aumentar y no fueron necesarios ms tratamientos. Examinaciones posteriores confirmaron que el infante se encontraba en buenas condiciones de salud. Para investigar si la falta de reticulocitos fue causada por una hemolisis intramedular o por un arresto de progenitores maduros eritroides, el anti D del suero materno fue agregado a un ensayo humano in vitro de eritropoyesis, inducido por celular humanas hematopoyticas CD34+ (de donante O Rh +). La proliferacin y diferenciacin de clulas eritroides incubadas con anti D (titulo 2000 y 40) fue comparado con un control que no tenia anticuerpos.

Materiales y Mtodos -Ensayo de eritropoyesis in vitro: El Factor estimulador de colonias de granulocitos de clulas mononucleares fue recolectado de una mujer de 64 aos (grupo O Rh+, ccD.Ee) que sufre de un linfoma no Hodgkin s por media de una leucoferesis, obtenindose con su consentimiento informado. La investigacin fue aprobada por el comit de la Universidad de Lbeck. Las clulas mononucleares fueron aisladas en una gradiente de Ficoll-Hypaque y se lavaron dos veces con PBS. Las clulas CD34+ fueron aisladas por una tcnica de separacin inmunomagnetica acorde a las instrucciones del fabricante. La pureza del aislamiento de CD34+ fue un 96%. A continuacin las clulas CD34+ se cultivaron durante 17 das en un cultivo lquido de doble fase. Para cada experimento, 6 x106clulas CD34+ se colocaron en 6 placas con una densidad de 1 x106clulas /mL. Durante los 8 primeros das, las clulas fueron estimuladas con 1 U/mL de EPO, 100 ng/mL de factor de clulas madres, 40 ng/mL de factor 1 de crecimiento de insulina, 10-6 mol/L de dexametasona y 10-6 mol/L de b-estradiol. En el dia 8 el medio de cultivo cambio y las clulas se estimularon solo con 1 U/mL de EPO y 1ug/mL de insulina para determinar la diferenciacin final. El cultivo liquido se incubo a 37 C con 5% CO2. Para determinar la influencia del anti D en la eritropoyesis se estudio bajo 3 condiciones: 1) sin la adicin del suero materno (control); 2) Con suero materno con anti D en titulo 2000 y; 3) con suero materno con anti D en titulo 40. Anlisis de la proliferacin y diferenciacin: El cultivo se analizo los das 1,3,8,12 y 17. La viabilidad celular fue determinada con la tincin azul de tripano y evaluacin microscpica. Para medir la proliferacin celular, las clulas viables se contaron en cmara de Neubauer. Para supervisar la diferenciacin celular, se incubaron 100 uL de 1x106clulas/mL durante 20 minutos a 4 C con ficoeritrina e isotiocinato de fluorescena con anticuerpos conjugados contra CD45,CD34, CD71, CD36 y glicoforina A. Las clulas fueron lavadas con PBS/1% de albumina srica bovina y se analizaron en un citrometro de flujo. Para el anlisis de la morfologa se realiz una citocentrifugacion (40000 clulas por portaobjeto) y se tieron con Pappenheim. Cada frotis se analizo con microscopia y se contaron por lo menos 200 clulas.

Resultados -Proliferacin de clulas progenitoras eritroides: En el control sin suero materno, el nmero de clulas aumento desde 1x106 a 39x106clulas/mL en el da 13 (39 veces). Con la adicin de anti D con titulo de 2000 la proliferacin fue ligeramente mayor ( 58 veces). La incubacin con anti D con titulo de 40 aumento 31 veces la proliferacin (FIG 3). No se observo supresin de la proliferacin eritroide bajo la incubacin con el anti D que contena el suero. No hubo diferencia en la viabilidad de las clulas.

FIG 3: Proliferacin de clulas CD34+ durante la eritropoyesis in vitro. El numero inicial de clulas fue 6 1x10 clulas/mL. El ensayo se realizo bajo 3 condiciones: Sin suero materno (control) (rombo); Anti D con titulo de 2000 (triangulo); Anti D con titulo de 40 (circulo). Comparando con el control, no se observo inhibicin de la proliferacin de GR por anti D.

-Diferenciacin de clulas eritroides: Para determinar la diferenciacin de celular CD34+ en los progenitores eritroides, se determino la expresin de los antgenos de superficie CD45, CD71 (receptor de transferrina, que se expresa altamente en clulas en proliferacin), CD36 (glicoprotena IIIb expresada en progenitores eritroides y no en GR adultos o precursores granulociticos) y la glicoprotenas A ( marcador especifico de clulas de linaje eritroide) por medio de citrometria de flujo. (FIG 4).

FIG 4: Expresin de CD36 (progenitores eritroides), CD71 (clulas en proliferacin), CD45 (leucocitos), Glicoprotena A (GR) durante la eritropoyesis in vitro. Control sin suero (rombo), Anti D titulo 200 (triangulo), Anti D titulo 40 (circulo).

En el control, luego de 8 das, la mayora de las clulas expreso CD36 (85%) y CD71 (88%), indicando proliferacin de clulas eritroides. Luego de cambiar las condiciones del cultivo en el da 8, la expresin positiva de glicoprotena A en GR aumento a 97% en el da 17. Por Citocentrifugacion el da 17 se mostro una homognea diferenciacin eritroide de normoblastos (37%) y reticulocitos (63%). FIG 5.

FIG 5. : Enumeracin de citocentrifugados en das 8,12 y 17 del ensayo in vitro de eritropoyesis. No hay efecto inhibitorio del anti D en la diferenciacin homognea de clulas eritroides a normoblastos y reticulocitos.

La incubacin con anti D con titulo de 40 mostro que no hay diferencia en la expresin de glicoprotena A (97% en el da 17) comparado con el control. En comparacin con el control, la expresin de CD36 (66 vs. 57%) y CD71 (72 vs. 63%) fue ligeramente mayor en el da 12 con similares niveles bajos el da 17. El anlisis con citocentrifugadomostro una comparable diferenciacin homognea eritroide como en el control con 34% de normoblastos y 66% de reticulocitos. La incubacin con Anti D con titulo 2000 no dio lugar a diferencias significativas en los porcentajes de CD36 (91%), CD71 (91%) y glicoprotena A (65%) de positividad en el da 8. Despus que se cambiaron las condiciones del cultivo, la expresin de CD36 (28 vs. 11% en el da 11), y CD71 (37 vs. 13% en el dia 17) fue ligeramente mayor que el control; el porcentaje de positivad de glicoprotena Aaumento a 91%. Los resultados del citocentrifugado del da 17 (39% normoblastos y 61% de reticulocitos) fueron comparables con el control.

Discusin El paciente con enfermedad hemoltica se diagnostico por el anti D materno y se necesitaron varias transfusiones intrauterinas por la baja Hb fetal. Luego del nacimiento el recin nacido se encontraba en buenas condiciones pero no se detectaron GR O+ ni reticulocitos en sangre perifrica por un periodo de 4 meses. No se detecto aumento de bilirrubina ni otras variables de la hemolisis que cursaba. Se asumi un diagnostico por anemia hiporregenerativa tarda. En algunos pacientes con anemia hiporregenerativa se reconocen bajos niveles de EPO e hipoplasia eritroide de la medula. Luego de las transfusiones intrauterinas, el hematocrito aumento a niveles efectivos que suprimieron la produccin de EPO. Adems, la hemoglobina adulta proveniente de las transfusiones intrauterinas provee mas oxigeno a los tejidos y por lo tanto produjo una reduccin del estimo hipoxico en la produccin de EPO. Sin embargo, un estudio demostr niveles normales o elevados de EPO a pesar de la ausencia de reticulocitos en nio con EHRN por Rh. Si se comparan los niveles de EPO en neonatos con y sin transfusiones intrauterinas no se encontraron diferencias. Estudios investigando los beneficios teraputicos de EPO recombinante revelo resultados controversiales. En nio de este caso, el nivel de EPO era normal 13 semanas despus del nacimiento y no explica la anemia en cuso que padeca. Para descartar hipoplasia medular o fallo en la eritropoyesis de otro origen, se realizo un aspirado medular. Para sorpresa, los resultados mostraron aumento de la eritropoyesis hasta el estado terminal de diferenciacin de las clulaseritroides, aunque no se encontraron reticulocitos en sangre perifrica. Se asume que la mayora de las clulas maduras encontradas en la medula sea eran de las transfusiones, la diferenciacin de las clulas progenitoras del paciente hasta normoblastos estaba intacta. Esta observacin contrasta con la teora de que las transfusiones intrauterinas inducan a una supresin medular en la anemia hiporregenerativa tarda. En este contexto, la eritropoyesis normal o aumentada a pesar de la anemia y ausencia de reticulocitos en sangre perifrica se ha descrito por otros autores. Burk y colegas describieron la unin de anti D a progenitores eritroides en un caso de muchos normoblastos en medula a pesar de la ausencia de reticulocitos en sangre perifrica. Un papel importante de las transfusiones intrauterinas en la patognesis de la anemia hiporregenerativa tarda es poco probable porque la anemia hiporregenerativa tarda se conoca antes que la tecnologa para las transfusiones estuviera disponible. Adems, se ha descrito en nios que no han tenido transfusiones intrauterinas. Por lo tanto, se investigo la influencia del anti D en la eritropoyesis in vitro. El antgeno Rh se detecta en todas las clulas eritroides progenitoras nucleadas y alcanza la mayor expresin en GR maduros. Ya que la eritropoyesis estaba intacta hasta la etapa de normoblasto, se enfoco la atencin en el proceso de enucleacin (eliminacin del ncleo). En la eritropoyesis in vitro se logro generar GR completamente maduros. Los ttulos de anti D elegidos fueron de 2000 (el mismo que tena el bebe a las 10 semanas) y 40 (el mismo que tena el bebe cuando comenzaron a detectarse los primeros reticulocitos). No se observo ningn efecto negativo del anti D en la diferenciacin y proliferacin de las clulas eritroides. Particularmente, el proceso de enucleacin de normoblasto a reticulocito no se altero.

Habanligeras diferencias de expresin de CD36 y CD71 porque la tendencia a un aumento en la proliferacin bajo las condiciones de incubacin con anti D en titulo de 2000 se puede explicar a la adicin del suero materno al ensayo in vitro. Otros experimentos investigaron acerca de la influencia del suero AB en la eritropoyesis in vitro y mostraron los mismos efectos positivos de la proliferacin y aumentos leves de los porcentajes de progenitores eritroides CD71 y CD36 (datos no publicados). El patrn observado concuerda con un pequeo retraso de la diferenciacin por el beneficio de una tasa de proliferacin mas elevada. En conjunto, no se observo deficiencia de EPO y el aspirado medular mostro aumento de la eritropoyesis en el paciente. Adems, el modelo de eritropoyesis in vitro mostro que el anti D no induce a la detencin de la maduracin o a disminuir el proceso de enucleacin. Por lo tanto, se propuso que la anemia prolongada fue principalmente causada por la hemolisis de GR en curso dentro de la medula sea por el constante titulo de anti D materno. La hemolisis intramedular parece no estar asociada con los altos niveles de bilirrubina y otras variables de laboratorio conocidas por la hemolisis. Los primeros reticulocitos se detectaron cuando el titulo de anti D bajo aproximadamente a 16. En neonatos que recibieron transfusin postnatal, la frecuencia de anemia hiporregenerativa es muy baja. Una raznpodra ser la eliminacinsimultnea de anticuerpo Rh durante la transfusin. Los constantes ttulos de anticuerpos son la principal razn de la anemia causada por la destruccin intramedular de progenitores eritroides unidos a anti D, podra ser recomendable monitorizar los anticuerpos postnatales en el recin nacido. De esta manera, el tiempo de aparicin de GR en circulacin puede ser estimado. Hayde y colegas reportaron que el tiempo de vida media es de 14 das para anti D en 4 neonatos con inmunizacin por Rh. Si los ttulos bajan, no es necesaria otra transfusin porque se espera que la Hb aumente en los prximosdas. Si los ttulos son altos son necesarios procedimientos invasivos como puncin medular, sino no. Por otro lado, la anemia en curso asociada con una baja de anticuerpos puede ser indicador para otros diagnsticos. En algunos casos con ttulos extremadamente altos y un largo plazo para esperar transfusiones, un cambio postnatal puede ser usada para reducir los niveles de anticuerpos maternos, aunque el riesgo asociado puede ser limitante. En el paciente no se poda excluir la posibilidad de que la administracin de IgIV dos semanas antes del aumento de Hb tuvo un efecto favorable en la evolucinclnica. Debido a que el efecto de la administracin de Ig luego del nacimiento tuvo un corto efecto (por 1 da), estas terapias pueden ser efectivas cuando los ttulosestn en baja cantidad.