DETERMINACION DE AMINOACIDOS PATRO N POR HPLC EN FASE REVERSA

PROPUESTA DEL METODO, PRESENTADO POR: RICARDO MARTINEZ SUAREZ JAVIER EDUARDO MUOZ TORRES LAURA CATALINA PEREZ LUQUE MONICA ALEJANDRA PINEDA MUOZ

UNIVERSIDAD PEDAGOGICA Y TECNOLOGICA DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS ESCUELA DE CIENCIAS QUIMICAS PROGRAMA DE QUIMICA DE ALIMENTOS TUNJA 2011

AMINOACIDOS

1. Estructura y clasificacin de los aminocidos. Como su nombre indica los aminocidos son compuestos que poseen un grupo amino (-NH2) y un grupo cido en su estructura. Los aminocidos son los precursores de los pptidos y las protenas, y en ellos el grupo amino y el grupo carboxilo, se encuentran unidos al mismo tomo de carbono, conocido como carbono- ( -aminocidos). La estructura general de los - aminocidos (a excepcin de la prolina, que es cclica) se muestra en la siguiente figura.

Figura 1: Estructura qumica de un aminocido en el plano y estructura espacial.

Las 20 -aminocido presentes en las protenas son de la serie L- y la diferencia entre los aminocidos viene dada por el grupo -R, o cadena lateral, unida al carbono- . Teniendo en cuanta a la naturaleza del grupo -R los aminocidos pueden clasificarse en: y y y y Neutros o apolares Polares sin carga Polares con carga negativa Polares con carga positiva

Neutros o Apolares. Son 8 los aminocidos que se consideran no polares por su cadena lateral. La alanina, valina, leucina e isoleucina, poseen cadenas laterales de hidrocarburos alifticos. La metionina posee una cadena lateral de ter tilico (C-S-C). La prolina es el nico aminocido cclico, pues el grupo -R se cierra sobre el N del grupo -amino (realmente es un amina secundaria). Por su parte, la fenilalanina y el triptfano contienen grupos aromticos. Polares sin carga. Siete son los -aminocidos cuyo grupo -R es polar pero sin carga. La glicina posee la cadena ms simple, un tomo de hidrgeno. La serina y la treonina son portadores de un grupo hidroxilo ( -OH). La asparragina y la glutamina, poseen cadenas laterales que contienen en su estructura un grupo amida, y por hidrlisis dan lugar, respectivamente, a aspartato y glutamato, dos aminocidos con carga negativa. La tirosina posee un grupo fenlico y la cistena debe su polaridad a la presencia de un grupo tilico (-SH).

Polares con carga negativa. Existen dos -aminocidos cuyo de carga negativa a pH fisiolgico, debida a la presencia de un grupo carboxilo ( -COOH), el cido glutmico y el cido asprtico. Polares con carga positiva. Tres son los -aminocidos que poseen grupos R cargados positivamente a pH fisiolgico. La lisina posee una cadena lateral de butilamonio, la arginina presenta un grupo -R de guanidina y la histidina es portadora de un grupo -R de imidazolio. Para este estudio se desea realizar la determinacin de 5 aminocidos: y Lisina e Histidina los cuales son polares con carga positiva y Isoleucina y Leucina los cuales son Neutros o polares y Glicina el cual es polar sin carga 2. MATERIALES Y REACTIVOS 2.1 MATERIAL 2.1.1 MUESTRAS Para las muestras patrn (lisina, Histidina, Isoleucina, Leucina y Glicina), se pr eparan 25mL de solucin en agua tipo HPLC o des ionizada para cada aminocido a una concentracin inicial de 0,5M, realizando diluciones seriadas a partir de esta solucin, para obtener diferentes concentraciones y realizar las curvas de calibracin. 2.2 REACTIVOS Para fase mvil se prepara una disolucin por gradiente de agua tipo HPLC, acetonitrilo y acetato de sodio (en diferentes proporciones) , realizando previamente la filtracin y desgasificacin de cada uno de los eluyentes. PREPARACION DE LAS MUESTRAS Para preparan las muestras antes de la corrida, se realiza una derivatizacin aadieron 20 L de la mezcla de los estndares diluidas a 60 L de una disolucin tampn de borato sdico 0.2 mM a pH 8.8 y agitando vigorosamente. Posteriormente, a esta mezcla se le aadi 20 L de la solucin 6-aminoquinolil-N-hidrosicuccinimidil carbamato (AQC) agitando nuevamente otros 10 segundos y se llevo a un bao de agua a 55C durante 10 minutos, como se muestra en la figura 2, este procedimiento

Figura 2: procedimiento de derivatizacin (tomado de Trabajo de investigacin presentado por Raquel Callejn Desarrollo de un mtodo de HPLC para la determinacin de aminocidos en vinagre y su validacin en muestras reales ) EQUIPO El equipo de HPLC a utilizar es agilent 1200 series, compuesto por: inyector manual, desgasificador, bomba cuaternaria, detectores UV-visible con lmparas de wolframio y deuterio, horno, columna C18 en fase reversa y ordenador EZ-CRHOM. ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES CROMATOGRFICAS Se partio de las condiciones cromatograficas recomendadas en el mtodo original para vinos (Hernndez-Orte et al., 2003) (tomado del trabajo de investigacin de Raquel Callejn) - Fases moviles: acetato sodico 0.14 M a pH 4.92 y 5.15, acetonitrilo y agua tipo HPLC filtrada y des gasificada - Flujo: 1 mL/min. - Temperatura de la columna: 34C. - Deteccion: fluorescencia con ex de 250 nm y em de 395nm. ORDEN DE ELUCIN Segn el Trabajo de investigacin presentado por Raquel Callejn Desarrollo de un mtodo de HPLC para la determinacin de aminocidos en vinagre y su validacin en muestras reales el orden de elucin de los aminocidos escogidos para las corridas son: Histidina, Glicina, Lisina, Isoleucina y Leucina.