Evaluacin de la Actividad Proteoltica Extracelulares Producidas por Bacterias Marinas Aisladas en Punta Fort William, Antrtida

Rosado, A.1 y Arroyo, M.F 2 1. Laboratorio de Protal-INTEC, ESPOL-CIBE, Escuela Superior Politcnica del Litoral, Km. 30.5 va Perimetral. abrosado@espol.edu.ec 2. Instituto de Investigaciones de Recursos Naturales (IIRN), Facultad de CCNN de la Universidad de Guayaquil. suberina99@yahoo.es

Resumen
Un total de 15 cepas de bacterias marinas con actividad proteoltica fueron aisladas de agua de mar en Punta Fort William, Antrtida; las mismas que se evaluaron en base al crecimiento y formacin de halos de actividad en Agar Marino suplementados con casena al 1%, pH 8,0 e incubados a 25 C por 72 h. Cinco cepas, seleccionadas por presentar los mejores halos de actividad fueron evaluadas a su vez por su crecimiento y produccin de proteasas a diferentes concentraciones de NaCl, rangos de temperatura y pH; siendo consideradas finalmente como bacterias halotolerantes, psicrotrficas y alcalfilas moderadas. Estas cepas tambin fueron evaluadas por su actividad proteoltica especfica sobre la casena, siendo la cepa EAT19 (Pseudomonas sp.) la que present la mejor actividad especfica (17,85 U/mg) a las 72 horas, y seguidas por las cepas EAT17 (Alcaligenes spp.) (11,67 U/mg) y tres cepas de Aeromonas sp. (EAT15, EAT16 y EAT18) con valores de 11,36; 9,85 y 10,23 U/mg respectivamente.
Palabras clave: Bacterias marinas, psicrotrficas, enzimas extracelulares, proteasas.

Abstract
A total of 15 strains of marine bacteria with proteolytic activity was isolated from sea water in Punta Fort William, Antrtida; they were evaluated in basis of their growth and formation of activity halos in Marine Agar supplemented with casein to 1%, pH 8,0 and incubated to 25 C per 72 hours. Selected five strains were evaluated on the basis of displaying the best halos of activity as well by their growth and production of proteases at different concentrations of NaCl, temperature ranges and pH; being finally considered as moderate halotolerants bacteria, psicrotrophics and alkalophile. These strains also were evaluated by their specific proteolytic activity on the casein, being strain EAT19 (Pseudomonas spp.) the one that presented the best specific activity (17,85 U/mg) at 72 hours, and followed by strain EAT17 (Alcaligenes sp.) (11,67 U/mg) and three strains of Aeromonas sp. (EAT15, EAT16 and EAT18) with values of 11,36; 9,85 and 10,23 U/mg respectively.

Keywords: Marine bacteria, psicrotrophics, extracellular enzymes, proteases.

1. Introduccin
Las bacterias marinas son por su naturaleza psicrotrficas y halotolerantes; poseen procesos metablicos adaptados a bajas temperaturas y realizan sus actividades en altas concentraciones de sales, elevadas presiones hidrostticas, pH alcalinos e incluso condiciones anxicas. Bajo estas condiciones moderadamente extremas pueden producir una serie de metabolitos, entre ellos las enzimas extracelulares (Fller et al., 1996). Entre las enzimas extracelulares producidas por bacterias marinas se incluyen amilasas, glucamilasas, glucosaisomerasas, pectinasas (Stanley & Stanley, 1986) y otras como agarasas, quitinasas, alginasas, lipasas, DNasas, esterasas y proteasas (Fenical & Jensen, 1993; Len et al., 2000).

En la actualidad, las bacterias productoras de proteasas han adquirido especial relevancia, ya que pueden ser utilizadas en procesos productivos como la industria de los detergentes, alimentos y bebidas, as como la clarificacin de cerveza fra y otras bebidas, ablandamiento de carnes rojas, industria del cuero, entre otras (Schmidt, 1981). Asimismo, la tecnologa enzimtica microbiana ocupa un papel importante dentro de la biotecnologa, especficamente en el sector alimentario, farmacutico y salud. Alrededor del 65% de las enzimas que se producen industrialmente estn de una u otra manera relacionadas con la industria alimentaria. Slo las proteasas alcalinas empleadas en la industria de detergentes ocupan el 25% del total, las restantes corresponden a aplicaciones en las reas farmacuticas, industrial y analtica (Brzana & Lpez-Murgua, 1995). Una de las alternativas viables para mejorar la eficiencia, reducir los costos y aumentar la disponibilidad de algunas enzimas de inters industrial, es el de buscar y seleccionar microorganismos con altas capacidades de produccin a partir de ambientes marinos. Asimismo, es de suma importancia evaluar sus condiciones ptimas de crecimiento, produccin, actividades enzimticas y caracterizacin fenotpica. El continente Antrtico presenta un rango de condiciones climticas extremas y constituye uno de los medioambientes ms severos de la Tierra. Constituye una de las reas idneas para la bsqueda de organismos adaptados a bajas temperaturas. Los organismos que viven aqu (psicrfilos y psicrotolerantes), presentan adaptaciones en sus sistemas enzimticos, en sus membranas y por tanto en sus genes, lo que representan un gran potencial biotecnolgico El presente estudio tuvo como finalidad aislar y seleccionar bacterias con capacidad de producir proteasas extracelulares de inters o aplicacin biotecnolgica procedentes de zonas marinas en Punta Fort William, Antrtida.

Fig. 1. rea de estudio y ubicacin de los muestreos en Punta Fort William, Isla Greenwich. Antrtida

2.1 Recoleccin de Muestras

Un total de 25 muestras de agua de mar se colectaron en frascos estriles de 50 mL de capacidad a una distancia entre 5 a 15 metros de la orilla. Las muestras fueron refrigeradas y transportadas con gran cuidado y bioseguridad a los Laboratorios de Microbiologa Industrial de la ESPOL Protal-Intec y al CIBE.

2.2 Aislamiento de las Bacterias

Las muestras colectadas fueron procesadas en el laboratorio realizando diluciones seriadas al dcimo (10-1, 10-2 ...10-5) y utilizando como diluyente agua de mar filtrada y esterilizada. El aislamiento y el recuento de bacterias marinas se realiz segn la metodologa indicada por Len et al. (2000), sembrando alcuotas de 0,1 mL de las diluciones en Agar Marino (AM) 2216 (Difco), a pH 8,0, e incubados a 25 C por 5 das.

2. Materiales y Mtodos
El rea de estudio comprende el sector de la pennsula Punta Fort William (Isla Greenwich, Antrtida), donde se encuentra la Estacin Cientfica Pedro Vicente Maldonado. El muestreo se lo realiz durante el verano antrtico del 2010. (Fig. 1)

2.3 Eleccin de cepas proteolticas

Para determinar la capacidad proteoltica de las cepas se tomaron 10 mL de los cultivos de 48 h y se repicaron en AM suplementado con casena al 1%, pH 8,0. Los cultivos fueron incubados a 25 C hasta por 5 das. La capacidad hidroltica de las cepas se reconoci mediante la formacin de halos transparentes alrededor de las colonias; los cuales se midieron cada 24 horas hasta por un periodo de 5 das. Las cepas fueron mantenidas en AM semislido con adicin de 10% de glicerol para realizar las pruebas experimentales posteriores.

Optimizacin Crecimiento
2.4

de

los

Parmetros

de

La optimizacin de los parmetros de crecimiento se realiz utilizando las cinco cepas seleccionadas designadas como EAT15, EAT16, EAT17, EAT18 y EAT19; las cuales fueron sembradas en Caldo Marino (CM) suplementados con casena 1% y sometidas al efecto de diferentes temperaturas (5, 8, 15, 25, 36 y 45 C), pH (5,0; 6,0; 8,0; 9,0 y 10,0) y concentraciones crecientes de NaCl (0, 3, 6, 9 y 10%). Los cultivos en todos los casos fueron incubados hasta por 5 das.

Tabla 1. Comportamiento proteoltico de las 15 cepas de bacterias marinas seleccionadas segn el tamao de los halos de actividad (mm de dimetro) en relacin al tiempo de incubacin)
CEPAS

24 hrs

48 hrs

72 hrs

96 hrs

120 hrs

2.5 Evaluacin de la Actividad Proteoltica.

Para estimular la actividad enzimtica de las cepas aisladas, stas se reactivaron en CM bajo las condiciones ya indicadas, y luego se sembraron 1 mL de estos cultivos (106 UFC/mL) en frascos conteniendo 100 mL de CM suplementados con casena al 1%, a pH 8,0 e incubados a 25 C con agitacin constante de 120 rpm hasta por 96 horas. La actividad enzimtica (U/mL) y actividad especfica (U/mg de protena) de las cepas fueron determinadas segn la metodologa recomendada por Nieto y Ellis (1986) y Takahashi y Osaka (1970). Para ello, se tomaron los sobrenadantes de cultivos obtenidos luego de una centrifugacin a 2500 rpm por 10 minutos a 4 C. Estas pruebas se ejecutaron cada 24 h hasta completar las 96 hrs. La mezcla de reaccin se prepar en tubos conteniendo 1 mL de la solucin de casena (Difco) al 1%, pH 8,0 y agregando alcuotas de 0,2, 0,5 y 1 mL de los sobrenadantes. La mezcla se incub en bao mara por 20 minutos a 25 C agitando suavemente y se detuvo dicha reaccin adicionando 2 mL de cido Tricloroactico (ATC) al 10% (p/v); luego se centrifug a 2500 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente, y a cada sobrenadante se le midi su Densidad ptica a 280 nm comparndose los resultados con la curva estndar del aminocido tirosina. Se realiz el mismo experimento con las cinco cepas en estudio. La unidad de actividad fue definida como la cantidad de enzima que libera un micromol de aminocidos por minuto por mL o miligramo de protena. Por otro lado, el contenido proteico de los extractos obtenidos se realiz por el mtodo de Lowry empleando el reactivo Folin Ciocalteau (Sigma) y Seroalbmina de bovino (mg/mL) (Sigma) como estndar.

EAT 02 EAT 03 EAT 05 EAT 06 EAT 06 EAT 07 EAT 10 EAT 14 EAT 15 EAT 16 EAT 17 EAT 18 EAT 19 EAT 25 EAT 37

+ + + + + + + +

+ + + + + + ++ + + ++ +

+ + + + + + + + + ++ ++ ++ +++ + +

+ + + ++ + + + ++ + + + + + + + ++ ++ ++ +++ +++ ++ +++ ++ ++ ++++ ++++ + ++ + +

Tamao de los Halos de Actividad -. : No se evidencia Halo + : ~ 10 mm ++ : ~ 15 mm +++ : ~ 20 mm ++++ : ~ 25 mm

2.6 Caracterizacin fenotpica de las bacterias aisladas

La caracterizacin fenotpica de las cepas EAT15, EAT16, EAT17, EAT18 y EAT19 se realiz mediante mtodos convencionales en tubos y placas. Como medio base para todas las pruebas se utiliz el CM o AM a pH 8,0. La temperatura de incubacin fue en todos los casos a 25 C hasta por 5 das. Las cepas en estudio fueron sometidas a observaciones microscpicas y pruebas conducentes a la caracterizacin morfolgica, fisiolgica y bioqumica segn procedimientos descritos por Baumman et al. (1972), Oliver (1982), Ortigoso et al. (1994).

3. Resultados y Discusin
3.1 Cepas con Actividad Proteoltica
El comportamiento proteoltico de las 15 cepas aisladas a partir de muestras de agua de mar en Punta Fort William, Antrtida se muestran en la Tabla 1.

Como se puede apreciar, es la cepa EAT19 la que present el mayor halo de actividad (tamao aproximado de 25 mm de dimetro) luego de 96 horas de incubacin a 25 C; sin embargo, el comportamiento de las dems cepas es algo homogneo. Estos resultados son coincidentes con los reportados por otros autores como Marty & Martn (1992) y Harris (1993), quienes analizaron la actividad enzimtica de bacterias aisladas de varias especies de invertebrados acuticos, demostrando que una gran proporcin de crustceos y moluscos estudiados eran portadores de bacterias con actividad multienzimtica principalmente proteoltica. Por su parte, Len et al. (2000) en estudios realizados sobre la microbiota bacteriana asociada a invertebrados marinos de la costa central peruana encontraron que el 62,74% de las cepas aisladas mostraban actividad proteoltica sobre la casena, sugiriendo la posibilidad de utilizar cepas nativas con propsitos biotecnolgicos. Ramrez et al. (1999), evaluaron la actividad proteoltica extracelular de levaduras marinas aisladas en Agar Papa Dextrosa enriquecida con casena al 1%.

Tabla 2. Efecto de los parmetros Fsico-Qumicos en el crecimiento de 5 cepas de bacterias seleccionadas por su mayor actividad proteoltica sobre casena al 1%. CEPAS PARAM
EAT 15 EAT 16 EAT 17 EAT 18 EAT 19

NaCl (%) 0 3 6 9 10 Ph: 5 6 8 9 10 Temp. (C ) 5 8 15 25 36 45 ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ + + ++ ++ + + + ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ + + ++ ++ + + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ +

3.2 Determinacin de los Parmetros ptimos de crecimiento

Los resultados de la evaluacin de las cinco cepas frente a diferentes parmetros fsico- qumicos, se muestran en la Tabla 2. Se observa que la mayora de las cepas crecen en un amplio rango de cloruro de sodio incluyendo la ausencia de esta sal en el medio (EAT15, EAT16, EAT17 y EAT18). Debido a este comportamiento las bacterias de este tipo han sido consideradas por otros autores, como posibles cepas alctonas que se adaptaron a las condiciones marinas, tal vez bacterias de aguas continentales o de origen terrestre (Ronald & Bartha, 1998). Las cepas EAT15, EAT17 y EAT19 tuvieron un buen crecimiento en medios hasta con 10% de NaCl. Asimismo, todas las cepas tuvieron buen crecimiento en el rango de 3 a 9% de NaCl, excepto la cepa EAT19, la cual no creci en ausencia de NaCl, considerndose por lo tanto como una cepa autctona de ambientes marinos. Onishi et al. (1965), realizaron estudios en ambientes marinos encontrando a bacterias proteolticas halotolerantes inclusive a altas concentraciones de NaCl (3-20%), con un crecimiento ptimo a 14% de NaCl, siendo las bacterias dominantes pertenecientes a los gneros Pseudomonas y Acinetobacter y un menor porcentaje a Flavobacterium y Caulobacter y algunos Gram positivos como Bacillus y Micrococcus.

- : No crecimiento + : Poco Crecimiento ++ : Buen crecimiento

Las cepas evaluadas frente a diferentes valores de pH mostraron buen crecimiento en el rango de 5,0 a 10,0; demostrando as su comportamiento moderadamente alcalfilo propio de las bacterias de ecosistemas marinos. En cuanto al perfil trmico, cuatro de ellas (EAT16, EAT17 y EAT18 y EAT19) crecieron ptimamente entre 8 a 44 C, excepto la cepa EAT 15 que tuvo como temperatura lmite a 36 C. Ninguna de las cepas creci a 5 C. En relacin con nuestros resultados, Vzquez et al. (1999) aislaron 8 cepas de Pseudomonas spp de biotopos costeros antrticos, productoras de proteasas con una actividad ptima a 25 C a pesar de haber sido aisladas de ambientes con temperaturas bajas. Estas temperaturas de crecimiento son caractersticas de los microorganismos considerados como psicrotrficos o psicrfilos moderados.

3.3 Evaluacin de la Actividad Proteoltica

La evaluacin de la actividad proteoltica de las 5 cepas en estudio, demostr que la cepa EAT19 perteneciente al gnero Pseudomonas spp. fue la que present mejor actividad enzimtica frente a la casena al 1% y a diferentes volmenes de los crudos enzimticos. Asimismo, en evaluaciones posteriores con crudos tomados de cultivos de diferentes tiempos de incubacin (desde 24 hasta 96h) las actividades enzimticas ms altas las registr la cepa EAT19, con actividades enzimticas de 10 y de 11 U/mL y actividades especficas de 17,85 y 17,97 U/mg con crudos enzimticos de 72 y 96 horas de incubacin respectivamente (Tabla 3).

Al respecto, Velsquez et al. (1999) tambin encontraron valores similares de actividad proteoltica de 33,65 U/mL, aunque dichos autores emplearon una cepa de Flavobacterium indolegenes cultivadas en medio Horikoshi (inductor de proteasas) en agitacin constante de 200 rpm y 30 C de incubacin, durante 72 horas. Por otro lado Vzquez et al. (1999) reportaron la actividad proteoltica de 8 cepas de Pseudomonas aisladas de biotopos costeros antrticos. Las proteasas mostraron actividades de 1700 U/L a 1x105 U/L en extractos de cultivos de 48 a 72 h a 20 C. Dichos autores no presentan resultados de actividad especfica. Por otro lado, Ramrez et al. (1999), evaluaron tambin la actividad proteoltica de crudos enzimticos producidos por levaduras marinas de los gneros Pichia y Debaromyces cultivados en el medio Papa Dextrosa con casena al 1% e incubados a temperatura ambiente por 4 das. Los resultados de esta evaluacin, a pesar que en nuestro caso no se trabaj con levaduras, son de alguna manera comparables a los halos presentados por nuestras cepas luego de 4 das de incubacin en medio AM suplementado con casena al 1%, siendo la cepa EAT19 una Pseudomonas spp. la que demostr mayor actividad, con un dimetro superior a 20 mm de dimetro a las 96 horas de incubacin a 25 C y a un pH de 8,0 (Tabla 1). La actividad proteoltica de las 5 cepas marinas (EAT 15, EAT 16, EAT 17, EAT 18 y EAT 19) comparadas con otros trabajos mencionados resultan ser interesantes para continuar los estudios relacionados a mejorar las condiciones de crecimiento y produccin de enzimas proteolticas extracelulares en microorganismos marinos.

Tabla 3. Actividad Enzimtica (U/mL) y Actividad Especfica (U/mg) de los crudos enzimticos de cultivos de 5 cepas de bacterias proteolticas sometidas a diferentes tiempos (h) de incubacin.

3.4 Caracterizacin Fenotpica

72h

Cepas U/mL
EAT 15

24h U/mg 11,1 U/mL 4

48h U/mg 11,25 U/mL 7

96h U/mg 11,36 U/mL 8 U/mg 12,17

EAT 16

3 2 2 4

8,25 7,84 8,17 14,65

5 3 2 7

8,31 8,56 8,33 16,04

5 6 4 10

9,85 11,67 10,23 17,85

6 8 4 11

8,34 11,05 9,55 17,97

EAT 17

EAT 18

EAT 19

La caracterizacin fenotpica de las 5 cepas de bacterias previamente seleccionadas se muestra en la Tabla 4. Todas ellas resultaron tener formas bacilares o cocobacilares, Gram negativas, mviles, flagelares, catalasa y oxidasa positivas. De acuerdo a las pruebas de caracterizacin morfolgica, fisiolgica y bioqumica las cepas en estudio pertenecen a los siguientes gneros: Aeromonas (cepas EAT 15, EAT 16 y EAT 18), Pseudomonas (cepa EAT 19) y Alcaligenes (cepa EAT 17). En gran parte nuestros resultados corroboran los hallazgos de otros autores (Vsquez et al., 1999; Velsquez et al., 1999; Len y Garca-Tello, 1998; Len et al., 2000), quienes trabajando con muestras procedentes de ambientes marinos tales como agua, organismos bentnicos, invertebrados de vida libre y en cultivos, lograron aislar bacterias con actividad proteoltica pertenecientes a los gneros Pseudomonas, Vibrio, Flexibacter, Moraxella, Bacillus y Flavobacterium.

Otros autores como Ramrez et al. (1999), adems de cepas bacterianas reportan tambin el hallazgo de levaduras marinas con actividad proteoltica sobre la casena pertenecientes a los gneros Pichia y Debaromyces.

4. Conclusiones
Las bacterias marinas productoras de proteasas y otras exoenzimas pueden presentar mejores ventajas que las fuentes actuales utilizadas en la industria, ya que dichas cepas presentan un buen crecimiento a bajas temperaturas, valores de pH variables (5,0 10,0) y un rango amplio de concentraciones de cloruro de sodio. En este sentido, las bacterias marinas son ideales para ser utilizadas en la produccin de enzimas de importancia industrial; asimismo, ofrecen alternativas en el tratamiento de aguas contaminadas. Los resultados mostraron que la cepa con mayor actividad proteoltica correspondi al gnero Pseudomonas spp. considerada esta cepa como autctona de ambientes marinos por crecer ptimamente en pH alcalino y requerir de condiciones halfilas y psicrfilas moderadas.

Tabla 4. Caracterizacin fenotpica de las 5 cepas de bacterias con actividad proteoltica sobre casena al 1%. CEPAS Pruebas
Morfologa celular/Gram Motilidad Indol H2S Catalasa Oxidasa
EAT 15 EAT 16 EAT 17 EAT 18 EAT 19

5. Bibliografa
Brzana, E. y Lpez-Murgua. 1995. La Tecnologa Enzimtica. En: Biotecnologa Alimentaria, pp. 103-123. Limusa, Mxico D.F. Baumann, L.; M. Baumann, M. Mandel and R. Allen, 1972. Taxonomy of aerobic marine Eubacteria. J. Bacteriol 110: 402-429. Feller, G.; E. Narinx, J. A. Arpingny, M. Haleb, E. Baise, S. Genicot and Ch. Gerday. 1996. Enzymes from psychrophylic organism. FEMS. Microbiol. Rev. 18: 189-202. Fenical, W. and PR. Jensen. 1993. Marine microorganisms: a new biomedical resource. In: Marine Biotechnology. Pharmaceutical and Bioactive Natural Products. Ed. D. H. Attaway, O.R. Zaborsky. New York Plenum Press, 1:419-457. Harris, J.M. 1993. The presence, nature and role of gut microflora in aquatic invertebrates: a synthesis. Microb. Ecol. 25: 195-231. Len, J. y P. Garca Tello. 1998. Cepas Nativas del Bacteriomeuston Marino y su Actividad inhibitoria de Bacterias Ictiopatogenas. Rev. peru. biol. 5(1): 47-64. Len, J.; F. Pelln, V. Unda, J. David, C. Anaya, y V. Mendoza. 2000. Produccin de enzimas extracelulares por bacterias aisladas de invertebrados marinos. Rev. Peru. Biol. 7(2): 202-210.

B/(-)

B/(-)

CB/(-) B/(-)

B/(-)

+ + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + +

Enzimas Extracelulares: DNasa Celulasa Amilasa Lipasa O/F (Glucosa)

+ + + F

+ + F

+ + F

+ + F

+ O

B : bacilos CB : cocobacilos F : fermentativo O : oxidativo

Marty, P. & Y. Martn. 1992. Aerobic heterotrophic bacteria associated with some Mediterranean coastal benthic invertebrates: characterization of strains, exoenzyme and antibiotic production. Mar Life 1(1): 1-8. Nieto, T. & A. Ellis. 1986. Characterization of extracelular metallo and serine proteases of Aeromonas hydrophila. Gem. Microbiol. 132: 1975-1979. Oliver, J. D. 1982. Taxonomic Scheme for the identification of marine bacteria. Deep-Sea Res. 29: 795-798. Onishi, H; E. Mac Cane & E. Gibbons. 1965. A synthetic medium for extremely halophilic bacteria. Can. J. Microbiol. 11: 365-373 Ortigoso, M.; E. Garay & M-J. Pujalte. 1994. Numerical Taxonomy of aerobic, Gram negative bacteria associated with oysters and surrounding seawater of the Mediterranean coast System. Appl. Microbiol. 17: 589-600 Ramrez, O.; N. Hernndez & J. Ochoa. 1999. Aprovechamiento biotecnolgico de levaduras marinas, Memorias del IV Congreso
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