UNIVERSIDAD TCNICA FEDERICO SANTA MARA SEDE VIA DEL MAR - JOS MIGUEL CARRERA

PARMETROS ORGANOLPTICOS Y FISICOQUMICOS PARA LA CARACTERIZACIN Y USO DEL PROPLEOS A NIVEL INDUSTRIAL

Trabajo de Titulacin para optar al Ttulo Profesional de Tcnico Universitario en QUMICA, ANALTICA Alumno: Sr. Jonathan Valladares Salazar Profesor Gua: Dr. Manuel Saavedra Gonzlez MENCIN QUMICA

2009

Para mis padres con mucho cario Gracias a sus esfuerzos y dedicacin a mi formacin como persona. A Ilse por su cario y apoyo incondicional durante todo este largo tiempo. Agradezco en forma mu especial a Don Patricio Fernndez, Don Fredy Valds y APICAS, por la gran ayuda proporcionada; y a todas las personas que con sus conocimientos y aportes contribuyeron a la realizacin de este trabajo.

RESUMEN

Keywords: Propleos Propiedades fisicoqumicas Caractersticas organolpticas Apicultura. El propleos es un producto apcola resinoso y complejo, con una apariencia variable, producto de la mezcla de sustancias resinosas, gomosas y balsmicas. Estas son recolectadas por la abeja (Apis mellifera) de distintas fuentes botnicas, las que son transportadas a la colmena, donde son modificadas fsica y qumicamente, para cumplir con la funcin de proteger a la misma de distintos patgenos y evitar la propagacin de enfermedades. Gracias a la compleja composicin que posee, tiene innumerables propiedades teraputicas que han sido estudiadas en todo el mundo. Los compuestos identicados en propleos de colmenas ubicadas en emplazamientos cercanos entre s no dieren signicativamente, aunque desde el punto de vista cuantitativo pueden ser variables. Ello implica que los propleos deben ser caracterizados en funcin de la zona geogrca de ubicacin de las colmenas, para poder ser comercializados. El presente trabajo tiene como objetivo principal establecer parmetros organolpticos y fisicoqumicos que permitan caracterizar el propleos, para su comercializacin a nivel industrial, a travs de la determinacin de las caractersticas organolpticas y propiedades fisicoqumicas del propleos, recolectado en la localidad de Tapihue, Casablanca, Quinta Regin de Chile. Las caractersticas organolpticas determinadas son: color, aspecto externo, estructura, olor, sabor, consistencia a temperatura ambiente e impurezas visibles. Las determinaciones fisicoqumicas realizadas son: cera, impurezas mecnicas, compuestos fenlicos totales, ndice de oxidacin, compuestos flavonoides totales, ndice de yodo, prdida por calentamiento, cenizas, sustancias extrables en n-hexano, resinas solubles en etanol y espectro de absorcin UV-visible. Todo lo anterior, segn metodologas estipuladas en la norma Rusa RST-RSFSR-317-77 y la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008. A partir de los resultados obtenidos en los anlisis realizados se puede concluir que, en general, las propiedades del propleos analizado se sitan dentro de los parmetros de calidad exigidos por la norma Rusa, y que cumple con todos los parmetros de calidad exigidos por la norma Argentina, por tanto puede ser utilizado a nivel industrial y competir en el mercado externo.

NDICE

PARMETROS

ORGANOLPTICOS

FISICOQUMICOS

PARA LA CARACTERIZACIN Y USO DEL PROPLEOS A NIVEL INDUSTRIAL RESUMEN NDICE NDICE DE FIGURAS NDICE DE TABLAS SIGLAS Y SIMBOLOGA INTRODUCCIN OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECFICOS CAPTULO 1: ANTECEDENTES GENERALES 1.1. PROPLEOS 1.1.1. Definicin tcnica 1.1.2. Caractersticas fisicoqumicas del propleos 1.1.3. Composicin universal del propleos 1.2. RECOLECCIN DEL PROPLEOS 1.2.1. Mtodo tcnico (uso de mallas) 1.2.2. Mtodo artesanal (raspado) 1.2.3. Recomendaciones para la recoleccin de propleos 1.2.4. Almacenamiento, conservacin y transporte 1.3. USOS DEL PROPLEOS 1.3.1. Usos en la colmena 1.3.2. Usos del propleos en el hombre 1.3.3. Formas de propleos 1.4. CARACTERIZACIN Y CALIDAD DEL PROPLEOS 1.4.1. Caracterizacin del propleos de acuerdo a normas 1.4.2. Calidad del propleos CAPTULO 2: PARTE EXPERIMENTAL 2.1. TOMA DE MUESTRA 2.1.1. Tamao de la muestra 2.1.2. Acondicionamiento de la muestra 2.2. DETERMINACIONES ORGANOLPTICAS 2.2.1. Procedimiento

2.3. DETERMINACIONES FISICOQUMICAS 2.3.1. Determinaciones fisicoqumicas, por norma Rusa 2.3.2. Determinaciones fisicoqumicas, por norma Argentina CAPTULO 3: RESULTADOS 3.1. RESULTADOS DE LOS ANLISIS ORGANOLPTICOS 3.2. RESULTADOS DE LOS ANLISIS FISICOQUMICOS 3.2.1. Resultados de los anlisis fisicoqumicos, realizados segn norma Rusa 3.2.2. Resultados de los anlisis fisicoqumicos, realizados segn norma Argentina DISCUSIN CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFA ANEXOS ANEXO A: FOTOGRAFAS EXPERIMENTALES ANEXO B: PROTOCOLO DE LA UNSE-INTA ANEXO C: DETERMINACIN DE LOS ANLISIS ORGANOLPTICOS ANEXO D: GRFICOS PARA CURVAS DE CALIBRACIN

NDICE DE FIGURAS

Figura 1-1. Propleos recin cosechados Figura 1-2. Uso de mallas matrizadas para la recoleccin de propleos Figura 1-3. Uso de mallas mosquiteras para la recoleccin de propleos Figura 1-4. Raspado, para la recoleccin de propleos Figura 1-5. Extracto alcohlico de propleos Figura 1-6. Caractersticas organolpticas que permiten evaluar la calidad del propleos

NDICE DE TABLAS

Tabla 1-1. Flavonoides identificados en el propleos Tabla 1-2. Consideraciones clnicas asociadas al uso de los propleos Tabla 1-3. ndices organolpticos y fisicoqumicos, segn norma Rusa Tabla 1-4. ndices organolpticos y fisicoqumicos, segn norma Argentina Tabla 3-1. Caractersticas organolpticas del propleos analizado

Tabla 3-2. Resultados de la determinacin del porcentaje de cera Tabla 3-3. Resultados de la determinacin del porcentaje de impurezas mecnicas Tabla 3-4. Resultados de la determinacin de los compuestos fenlicos Tabla 3-5. Resultados de la determinacin del ndice de oxidacin (segn norma Rusa) Tabla 3-6. Resultados de la determinacin cualitativa de los compuestos flavonoides Tabla 3-7. Resultados de la determinacin del ndice de yodo Tabla 3-8. Caractersticas fisicoqumicas del propleos analizado, segn norma Rusa Tabla 3-9. Resultados de la prdida por calentamiento Tabla 3-10. Resultados de la determinacin de cenizas Tabla 3-11. Resultados de la determinacin de sustancias extrables en n-hexano Tabla 3-12. Resultados de la determinacin de resinas solubles en etanol Tabla 3-13. Resultados de la determinacin de impurezas mecnicas Tabla 3-14. Resultados de la determinacin de compuestos fenlicos totales Tabla 3-15. Resultados de la determinacin de flavonoides totales Tabla 3-16. Resultados de la determinacin del ndice de oxidacin (segn norma Argentina) Tabla 3-17. Resultados determinacin del espectro de absorcin UV-visible Tabla 3-18. Caractersticas fisicoqumicas del propleos analizado, segn norma Argentina

SIGLAS Y SIMBOLOGA

SIGLAS

INN INTA NCh PM UV

: Instituto Nacional de Normalizacin. : Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria. : Normas Chilenas. : Peso Molecular. : Ultravioleta.

UNSE : Universidad Nacional de Santiago del Estero, Argentina.

SIMBOLOGA

a b cm g C h L m m mg ml mm min N nm ppm r s T

: Intercepto de la recta o curva de calibrado. : Pendiente de la recta o curva de calibrado. : Centmetro. : Gramo. : Grados Celsius. : Hora. : Litro. : Metro. : Metro cuadrado. : Milgramo. : Mililitro. : Milmetro. : Minuto. : Normalidad. : Nanmetro. : Partes por milln. : Coeficiente de regresin. : Segundo. : Temperatura.

INTRODUCCIN

El propleos es un producto apcola utilizado desde tiempos remotos por sus propiedades medicinales, es una sustancia gomo-resinosa, producto del procesamiento por parte de la abeja (Apis mellifera), de resinas vegetales de variado tipo. Las abejas utilizan el propleos para recubrir todas las grietas y abertura de la colmena. Adems de cumplir esta funcin, el propleos evita contaminaciones debido a que posee acciones fungicida y antibitica. Es una sustancia de compleja composicin qumica, ya que contiene ms de ciento sesenta compuestos activos, entre ellos, flavonoides (principalmente quercetina), cido benzoico y cido cafeico y sus derivados [2,8]. Su composicin es compleja y variada por cuanto depende de la flora y de las condiciones geogrficas y climticas donde se elabora el producto. Actualmente existe una demanda mundial creciente de este producto apcola, ya que es utilizado en diversas actividades y en numerosos pases, que cuentan con normas, reglamentacin y aprobacin oficial para su empleo a nivel industrial. Esto ha trado como consecuencia la necesidad de su estudio, control de calidad y caracterizacin en general. En Chile, ste es un recurso natural que no ha sido explotado y aprovechado en su plenitud, existiendo un manejo artesanal de l, adems no se cuenta con normas que permitan la caracterizacin y evaluacin de calidad del propleos, para poder ser utilizado a nivel industrial; por tanto se necesita establecer parmetros que permitan caracterizar el propleos, adems se requiere de un amplio estudio y difusin de las diferentes propiedades y beneficios de l [5]. En el presente trabajo se realiza la caracterizacin organolptica y fisicoqumica de un propleos recolectado de localidad de Tapihue, Casablanca. Quinta Regin de Chile, a travs de anlisis organolpticos y fisicoqumicos, estipulados en dos normas internacionales (norma Rusa RST-RSFSR-317-77 y norma Argentina IRAMINTA-15935-1:2008), utilizadas para su caracterizacin. El desarrollo de este trabajo se fundamenta en que para comercializar en el mercado internacional el propleos chileno es necesario caracterizarlo y cumplir con exigencias de calidad, requeridas por los pases importadores. En este sentido, la concepcin ms actualizada de su caracterizacin y control de calidad consiste en el desarrollo de dos etapas de anlisis, para el uso de propleos a nivel industrial, estas son: Determinacin de las caractersticas organolpticas Determinacin de las propiedades fisicoqumicas

El desarrollo de los anlisis se lleva a cabo en el Laboratorio de Qumica de la Universidad Tcnica Federico Santa Mara, Sede Via del Mar, Jos Miguel Carrera; durante los meses de Noviembre y Diciembre del ao 2008. Establecer parmetros que permitan caracterizar y utilizar a nivel industrial el propleos, a travs de la determinacin de las caractersticas organolpticas y propiedades fisicoqumicas, permitir la elaboracin de normas de calidad adecuadas a este producto a nivel nacional, que sirvan como elementos tiles para su control, verificacin y para caracterizar el producto ofrecido, cuando l mismo sea destinado a la exportacin para poder cumplir con las exigencias del mercado internacional.

OBJETIVO GENERAL

Establecer

parmetros

organolpticos

fisicoqumicos

que

permitan

caracterizar el propleos, a travs de anlisis realizados a un propleos, empleando dos normas internacionales utilizadas para su caracterizacin y control de calidad.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Determinar las caractersticas organolpticas del propleos, a travs de lo

establecido en ambas normas.

Verificar las propiedades y composicin fisicoqumica del propleos a travs de

anlisis estipulados en ambas normas. Analizar estadsticamente los resultados obtenidos. Detectar la norma que permite una mejor caracterizacin del propleos.

CAPTULO 1: ANTECEDENTES GENERALES

1.

ANTECEDENTES GENERALES

1.1.

PROPLEOS

Definicin de acuerdo a la Real Academia Espaola: Sustancia crea con que las abejas baan la colmena o vasos antes de empezar a obrar. 1.1.1. Definicin tcnica Mezcla compleja de origen biolgico elaborado a partir de resinas, blsamos, gomas y otras exudaciones de algunas especies vegetales (pino, abeto, sauce, abedul, varias especies de lamo, fresno, roble, etc.), que la abeja Apis mellifera recoge y modifica, adicionndoles cera, polen y enzimas entre otros materiales, con el propsito de proteger la colmena de las adversidades del medio, asegurando estabilidad trmica y proteccin contra problemas microbiolgicos [2 ,5 ,8].

Fuente: Bracho, 2008

Figura 1-1. Propleos recin cosechados

Tambin se entiende por propleos el producto compuesto de sustancias resinosas, gomosas y balsmicas, ceras, aceites esenciales y polen, de consistencia viscosa, elaborado por las abejas (Apis mellifera), a partir de ciertas especies vegetales, que son transportadas al interior de la colmena y modificadas parcialmente con sus secreciones salivares [8]. Esta sustancia, elaborada por las abejas, es conocida por el hombre desde tiempos remotos. La utilizaban los sacerdotes egipcios y ms tarde, los griegos, quienes lo denominaron propleos. El trmino propleos proviene del griego propolis pro: que

significa delante de, y polis, que quiere decir ciudad [2]. Por su consistencia y estructura, los propleos pueden clasificarse en dos grupos: los de naturaleza fluida y los balsmicos-oleorresinosos. Los primeros presentan una fraccin importante de agentes voltiles, mientras que en los balsmicos predomina la consistencia densa, con bajo contenido de compuestos voltiles, susceptibles de polimerizacin y que con frecuencia se percibe el aroma de las plantas en forma concentrada; en general son sustancias viscosas, semislidas y cauchosas [11]. 1.1.2. Caractersticas fisicoqumicas del propleos Su color puede variar desde amarrillo verdoso, verde oscuro a marrn oscuro, puede ser de color verde, pardo, castao o rojizo, e incluso puede ser casi negro, dependiendo de su origen botnico [8], algunos son firmes, mientras que otros son gomosos y elsticos. El aroma puede ser placentero a yemas de lamo, miel, ceras y vainilla o se puede relacionar con la flora nativa del sector, en algunos casos el propleos suele ser amargo, picante y hasta astringente [3, 8, 11]. El propleos es soluble en alcohol etlico y en solventes como el ter, bencina y acetona entre otros; pero a excepcin del alcohol etlico, estas sustancias son txicas y no deben utilizarse para la elaboracin de extractos de propleos. El propleos presenta una consistencia variable, dependiendo de su origen [8], de las condiciones geogrficas y climticas donde se elabora el producto. Hasta los 15C es duro y se torna ms maleable a medida que aumenta la temperatura. Su punto de fusin vara entre 60 a 70C, llegando en algunos casos hasta 100C [12]. Cuando se calienta el propleos lentamente a bao mara se separa en dos partes; una gruesa se deposita en el fondo y la otra sobrenadante en la superficie (cera de propleos) [4]. 1.1.3. Composicin universal del propleos Su composicin qumica es bastante compleja. La composicin del propleos vara dependiendo de las fuentes vegetales de origen y de su funcin especfica dentro de la colmena [8]. Bsicamente se compone de un 50-55% de resinas y blsamos, 3040% de cera de abeja, 5-10% de aceites esenciales o voltiles, 5% de polen y 5% de materiales diversos (orgnicos y minerales) [2].

En lneas generales, en todos los propleos se encontraran: Resinas y blsamos aromticos Cera Aceites voltiles Polen Sustancias orgnicas y minerales 1.1.3.1. Compuestos identificados en propleos Se han identificado ms de ciento sesenta compuestos, de los cuales un 50% son compuestos fenlicos, a los cuales se les atribuye la accin farmacolgica. En trminos de accin farmacolgica, los principales constituyentes del propleos son los compuestos fenlicos. Estos se caracterizan por la presencia de al menos un grupo oxhidrilo unido directamente a un anillo aromtico [8].Los principales compuestos fenlicos identificados son: Aldehdos aromticos (vainillina e isovainillina). Cumarinas, esculetol, escopoletol. cidos aromticos y sus steres. Triglicridos fenlicos. Flavonoides. En la naturaleza se pueden encontrar diversos tipos de compuestos fenlicos, entre los que se pueden citar, los cidos fenlicos (benzoico, cafeico, ferlico y cinmico) y los flavonoides. Algunos compuestos fenlicos de origen vegetal resultan familiares, al menos por su accin organolptica; por ejemplo, la vainillina, el anetol y el eugenol [8]. 1.1.3.2. Flavonoides identificados en propleos Los flavonoides son compuestos qumicos de origen botnico con una marcada actividad biolgica y han sido usados como indicadores de la calidad del propleos. Los propleos estn constituidos fundamentalmente por flavonoides, derivados de esteres y cidos fenlicos. Walker y Crane en 1987 reportaron la presencia de 38 flavonas, 12 derivados del cido benzoico, 14 derivados del alcohol cinamlico y el cido cinmico, 12 componentes entre alcoholes, cetonas y fenoles, 7 terpenos, 11 esteroides, 7 azcares y 2 aminocidos. Los flavonoides son constituyentes principales de resinas y blsamos 50-55 % 7,5-35 % 10 % 4-5% 5%

[11]. Los flavonoides absorben radiacin electromagntica en la zona UV - VIS y de esta forma representan una proteccin natural para las plantas contra la radiacin UV del sol. Esto explica el efecto protector sobre la piel de ciertos preparados en base a propleos. Por otra parte presentan una barrera qumica de defensa contra microorganismos (hongos, bacterias y virus) [8].

Tabla 1-1. Flavonoides identificados en el propleos

Flavonas Acacetina Crisina Amarilla Pectolinarigenina Tectocrisina Apigenina

Flavonoles Galangina Izalqinina Kampferol Quercetina Ramnocitrina

Flavononas Pinostrobina Sakuranetina.

Flavononoles Pinobanksina

Fuente: Caneo (2006)

Los flavonoides, desde el punto de vista estructural, corresponden a un sistema de tres anillos fusionados en una secuencia de carbonos que presenta un heterociclo central en una estructura C6C3C6, que ha sido discutida ampliamente por su estabilidad y reactividad. Estos compuestos suelen presentar a lo menos tres hidroxilos fenlicos, condicin que facilita su clasificacin y reactividad frente al tricloruro de aluminio y 2,4-Dinitrofenilhidracina (2,4D) [11]. 1.1.3.3. Otras sustancias identificadas en propleos Adems de una gran cantidad de compuestos fenlicos, se han identificado en el propleos otros compuestos: Alcoholes cidos alifticos y steres Aminocidos Chalconas y Dihidrochalconas

 Flavononas Flavonas y Flavonoles Hidrocarburos, steres y teres cidos grasos Cetonas Terpenos Esteroides Azcares Minerales Vitaminas cidos aromticos: cafeico, ferlico, cinmico, cumrico, glico y saliclico. cidos grasos: palmtico, oleico, esterico, linoleico, linolnico, araquidnico, certico y mirstico. Terpenos: cimeno, cineol, limoneno, bisabolol, xantorreol y alfa-acetoxibetulenol. Minerales: aluminio, plata, bario, boro, cromo, cobalto, cobre, estao, hierro, magnesio, manganeso, molibdeno, nquel, plomo, selenio, silicio, estroncio, titanio, vanadio y zinc. Vitaminas: Pro-vitamina A, vitamina B1, B2, y B3.

1.2.

RECOLECCIN DEL PROPLEOS

La recoleccin del propleos de la colmena ha sido realizada casi siempre por simple raspado, con una esptula de acero inoxidable, de las paredes interiores de la colmena, cuadros y otros lugares donde las abejas depositan el propleos, este es un mtodo bastante engorroso. En el mercado existen rejillas para la recoleccin de propleos que se colocan debajo de la tapa y que consisten en una lmina plstica con ranuras que las abejas se apresuran a rellenar con propleos, lo que permite su fcil retirada y recoleccin. Posteriormente se congelan y una simple presin sobre las mismas permitir que los propleos se desprendan de las ranuras [12].Los mtodos ms utilizados para la recoleccin del propleos de la colmena son: el mtodo tcnico (uso de mallas y el mtodo artesanal (raspado).

1.2.1. Mtodo tcnico (uso de mallas) Se ha experimentado con xito el empleo de mallas o rejilla plstica con agujeros de aproximadamente 1,5 - 3,0mm., como las mallas matrizadas y mosquiteras. Mallas matrizadas: placas de material plstico (41 x 25cm y aprox. 0,4 cm de espesor), en las cuales se encuentran estampadas la ranuras donde se depositar el propleos. Mallas mosquiteras: tejidos de hilos plsticos de 55 x 45cm, que se termosella en los bordes antes de utilizar; es recomendables que sean blancas o de colores claros, evitando el color negro (hasta no demostrar que este color sea contaminante). No se utilizan mallas metlicas porque contaminan el propleos y las de fibra de vidrio tienden a romperse con el manipuleo.

Fuente: Salamanca (2000)

Figura 1-2. Uso de mallas matrizadas para la recoleccin de propleos

Fuente: Salamanca (2000)

Figura 1-3. Uso de mallas mosquiteras para la recoleccin de propleos

El mtodo consiste en cortar secciones de la malla del tamao de la superficie de la colmena y colocarlos sobre los marcos de la ltima alza de la colmena [12].Es til colocar estas ltimas en forma simtrica sobre el ancho del alza y luego de algunas semanas moverlas hacia el otro extremo, de tal modo de incentivar a las obreras a que se enfrenten a los nuevos espacios vacos, lo cual permitir obtener una mayor recoleccin. Cualquiera de estas mallas que se vaya a utilizar es conveniente instalarlas en primavera y otoo, pudiendo ser retiradas en cualquier poca del ao, previo congelado en un freezer. Posteriormente, se congelan entre -10 y -20C, para desprender fcilmente el propleos, durante por lo menos una hora, lo que torna a la resina rgida y frgil, fcil de separar de la malla mediante "manipuleo". El congelado generalmente se realiza durante 1 2 horas [7]. 1.2.2. Mtodo artesanal (raspado) Consiste en raspar con una esptula de acero inoxidable las paredes interiores de la colmena, cuadros y otros lugares donde las abejas depositan el propleos. Para un adecuado raspado, hay retirar las alzas y cuadros al preparar las colmenas para la invernada, ya que se aprovecha este momento para confinar la colonia al menor espacio posible y el material excedente ser transportado al taller del apicultor. Adems en esa poca la temperatura baja facilita la separacin del propleos de la madera y el estado rgido de la resina limita la posible contaminacin con trozos de madera, abejas y otros contaminantes macroscpicos. No todas las variedades de abejas propolizan con la misma intensidad, una misma colmena propolizar diferentes cantidades en distintas pocas y an puede haber diferencias en las cantidades producidas en cada ao, pues las abejas trabajan segn sus necesidades y posibilidades [4]. La apariencia externa de los propleos puede variar de una extraccin a otra, vale indicar que los propleos slo pueden retirarse de las colmenas cuando se cosechen por medio de raspado dos veces al ao, sto por razones de proteccin de la misma colmena [12].

Fuente: Salamanca (2000)

Figura 1-4. Raspado, para la recoleccin de propleos

1.2.3. Recomendaciones para la recoleccin de propleos Utilizar una esptula de acero inoxidable, sin mucho filo para reducir el riesgo de arrastrar virutas de madera, para la recoleccin de propleos por raspado. Cuidar de no raspar donde haya pintura sobre la madera, pues sta es uno de los mayores responsables de la contaminacin del propleos y es fcilmente detectable. Realizar el raspado del propleos que se encuentra en las superficies interiores de la colmena: tapa, cuadros y cajas, desechando el que se encuentra en el fondo, pues generalmente est muy contaminado. La recoleccin se debe realizar con las manos y esptula libres de restos de miel, tierra o cualquier otra sustancia que pueda contaminarlo. Durante la cosecha, el propleos no debe exponerse a la incidencia directa de los rayos solares, evitndose su almacenamiento cerca de fuentes de calor. No debe mezclarse con la cera que se encuentra en la tapa, entre los marcos y sobre ellos. Siempre debe tratar de evitarse que el propleos se compacte. Para lograrlo, el propleos recolectado no se debe comprimir con las manos para formar pelotas, por el contrario, se debe mantener en formas de escamas y/o trozos sueltos. En ningn caso se deber recolectar el propleos a partir de chapas o superficies metlicas, el carcter cido del producto por lo general ha permitido la reaccin de dicha superficie induciendo concentraciones indeseables. Durante el trabajo con las abejas no se deben usar tratamientos qumicos, porque estas sustancias qumicas pueden contaminar el propleos. Si se utilizan

tratamientos qumicos para controlar la varroa es imperativo sacar el propleos antes de aplicar cualquier tratamiento. La cosecha del propleos puede variar entre 100g y 400g por colmena al ao, dependiendo de una serie de factores como el mtodo utilizado para la recoleccin del propleos [12]. Con el mtodo de mallas pueden alcanzarse hasta los 500g, mejorando la calidad, sin incrementar demasiado los costos de produccin [7]. 1.2.4. Almacenamiento, conservacin y transporte El primer paso luego de obtenido el propleos, es la limpieza del mismo con una pinza, cuidando de retirar contaminantes macroscpicos como abejas, trozos de madera, pasto, etc. Se debe cuidar de retirar aquellos trozos de propleos que puedan venir con pintura adherida, ya que sta es una de las principales fuentes de contaminacin. Una vez recolectados, deben almacenarse en frascos de vidrio o de preferencia en bolsas de polietileno, se sugiere no embalar ms de un kilogramo para facilitar su anlisis posterior. Es apropiado conservarlo en frascos de vidrio de color mbar, que lo proteja de las altas temperaturas y en especial de la luz. Su temperatura de conservacin idnea es 15C, a ms de 20C comienza a desactivarse y permite la reproduccin de algunos parsitos. Si el propleos recolectado se va a almacenar por largo tiempo, se debe conservar sometindolo a temperaturas que oscilen entre 10 y 20C durante 48 horas.

1.3.

USOS DEL PROPLEOS

1.3.1. Usos en la colmena El propleos en la colmena cumple diversas funciones que son difciles de priorizar, generalmente las abejas lo utilizan para: Barnizar el interior de la colmena (incluidos los panales) con fines desinfectantes.

 Cerrar grietas, reducir vas de accesos y consolidar los componentes estructurales, para evitar las corrientes de aire o el fro. Reducir al mnimo las vas de acceso (piqueras) o crear obstculos que impidan la entrada de enemigos, tales como, mariposas y otros insectos Evitar las vibraciones de los panales cuando las colmenas estn situadas sobre rboles, que mueven sus copas por el viento. Recubrir los cadveres de los enemigos que se hayan introducido en la colmena (escarabajos, roedores, lagartijas, etc.), que quedan embalsamados evitando su descomposicin. Esta propiedad del propleos ya era conocida por los egipcios los sacerdotes lo utilizaban para momificar los muertos [2,8]. De todas las variantes en que lo emplean es seguramente la de barnizar toda la colmena, la ms importante; constituye un modo de escudo protector de los moradores contra una amplia gama de microorganismos, que ayudados por el calor y la humedad procedente de la colmena, viviran sobre las paredes perjudicndolos, para este fin es amasado con las mandbulas y va siendo colocado con gran perseverancia hasta que toda la madera est cubierta [12]. 1.3.2. Usos del propleos en el hombre La utilizacin del propleos en diversos mbitos, radica en sus propiedades antimicrobianas, bacteriostticas y bactericidas, proporcionadas por los cidos oxibenzoico, metoxibenzoico, cafeico, ferulico, etc. Por su parte, los flavonoides (con ms de cuarenta acciones farmacolgicas) son la base de su versatilidad teraputica. Sus cualidades antioxidantes (adems de reducir el efecto de los radicales libres) son responsables de la accin antiviral, al inhibir el desarrollo de virus patgenos. Adems de su amplio efecto antibacteriano, el propleos estimula la reaccin inmunolgica del organismo, complementando ambas funciones sin producir alteraciones de la flora bacteriana, cosa que ocurre con los antibiticos de sntesis. Tambin se lo emplea con buenos resultados en el tratamiento de amigdalitis y faringitis. Los profesionales que emplean su voz son grandes consumidores de miel con propleos y caramelos o jarabe de propleos. Adems, este producto natural brinda resultados ventajosos en infecciones respiratorias altas, cuando se los administra en forma de colutorios o inhalaciones, slo o asociado a antibiticos [8]. Dentro de las principales actividades en las que se utiliza el propleos, destacan:

 La medicina humana y veterinaria. La agricultura. La apicultura. La industria de alimentos. La cosmetologa. La farmacologa. La odontologa. Se han encontrado resultados positivos al usar propleos en el tratamiento de procesos tales como: Gripe. Sinusitis. Otitis. Laringitis. Bronquitis. Asma bronquial. Neumona crnica. Tuberculosis pulmonar. En farmacologa, se utiliza para la preparacin de productos farmacuticos, como remedios, gracias a su gran cantidad de propiedades; en la industria alimenticia, para la conservacin de alimentos; en cosmetologa, para la fabricacin de una gran cantidad de productos, como cremas; en odontologa, incrementa la salud bucal por sus principios antispticos, antibiticos y antiinflamatorios; se utiliza para el tratamiento de abcesos, caries, aftas, gingivitis e higiene bucal. Adems estimula la generacin de la dentina (esmalte dental) e impide la formacin de caries y placa bacteriana. La farmacopea actual menciona su uso como hipocolesterolemiante o reductor de la tasa de colesterol en sangre por el hecho de disminuir la absorcin de las grasas a nivel intestinal. La accin antimicrobiana del propleos est reconocida mundialmente y as lo avalan los numerosos trabajos realizados en este campo en Europa, en los cuales se informa que sus extractos poseen accin antibacteriana, antiviral y antimictica. Su utilizacin se ha mantenido durante siglos hasta nuestros das, en que se estn realizando investigaciones cientficas sobre el empleo de preparados a base de propleos en los campos de la biologa, la medicina humana y la medicina veterinaria.

Tabla 1-2. Consideraciones clnicas asociadas al uso de los propleos

Casos Alergologa Angiologa Colonproctologa Dermatologa Endocrinologa Gastroenterologa Geriatra Inmunologa Oftalmologa alrgicas; dermatitis

Actividad Asma bronquial; inmunodepresiones con manifestaciones alrgica; neurodermatitis; rinofaringitislaringitis alrgicas lcera en las extremidades inferiores de causa vascular Hemorroides; fstulas anales y perianales; colitis ulcerativa Acn; dermatitis seborreica; psoriasis; verrugas vulgares; verrugas plantares; condilonas; epiteliomas; pitiriasis; micosis; vitiligo. Hipercolesterolemias; hipertriglicerclemias Parositsis, especialmente Giardiasi; lceras ppticas; gastritis lceras decbito Inmunodepresiones Conjuntivitis virales, bacterianas y alrgicas Rinitis bacteriana, viral y alrgica; faringitis y laringitis; en amigdolectoma. Artritis reumatoidea, osteomielitis, micosis vaginal; parasitosis;

Otorrinolaringologa postoperatorio de extirpacin de plipos nasales; hemosttico

Otros

paiplomatosis, heridas spticas de difcil cicatrizacin. Lupus eritematoso, estrs; neurosis; demencia senil
Fuente: Salamanca (2000)

1.3.2.1. Propiedades biolgicas y teraputicas [8] A partir de la dcada del sesenta se efectan las primeras investigaciones cientficas que develan la compleja estructura del propleos y ponen de manifiesto numerosas aplicaciones farmacolgicas. Cientficos de diferentes disciplinas profundizaron en su estudio, por lo que hoy se tiene respuesta a muchos interrogantes acerca de los mecanismos de accin que explican sus propiedades antimicrobianas, cicatrizantes, estimulantes del sistema inmunolgico y antioxidantes. Su notable capacidad cicatrizante, desinfectante y antiinflamatoria lo hace indicado para heridas, quemaduras y afecciones de la piel. La compleja composicin le confiere al propleos capacidad:

 Antibacteriana. Antifngica. Antiviral. Cicatrizante. Antiinflamatoria. Bioestimulante y regenerante. Antioxidante. Capacidad antibacteriana: Fue una de las primeras propiedades constatadas. Mltiples estudios bacteriolgicos in vitro confirmaron su accin bacteriosttica y bactericida. Los principales responsables de esta propiedad son los flavonoides galangina y pinocembrina, y los derivados del cido benzoico, ferlico y cafeico. Itoh y colaboradores del Instituto de Investigacin Zenyaku Kogyo Co evaluaron la capacidad antimicrobiana de diferentes tipos de propleos ante el Helicobacter pylori. Hay gran cantidad de evidencias que permiten atribuir a esta bacteria la gnesis de la gastritis, la lcera gastroduodenal e incluso el cncer gstrico. Una muestra de origen argentino demostr poseer la mayor capacidad antibacteriana ante esta bacteria, siendo los principales responsables los flavonoides pinocembrina, en primer lugar, y luego la galangina y la crisina. Los tratamientos actuales consisten en la utilizacin de uno o ms antibiticos, costosos, de eficacia dudosa, y que no estn exentos de efectos secundarios. Un estudio realizado en el Departamento de Bioqumica de la Universidad de Oxford, publicado en Microbiologie Research, informa que el cido cinmico y algunos flavonoides desactivan la energa de la membrana citoplasmtica, inhibiendo la motilidad bacteriana, hacindola ms vulnerable al ataque del sistema inmunitario y potenciando los antibiticos. Capacidad antiviral: En Francia, los Dres. Amoros y Sauvager, de la Facultad de Medicina de Rennes, confirmaron la accin virulicida frente a los tipos uno y dos del herpes, pero tambin ante poliovirus. Establecieron que el propleos reduce la sntesis del ADN viral y que los responsables son los flavonoides, que actan en sinergismo con un ster del cido cafeico y el cido ferlico. Otro tipo de patologa viral que responde favorablemente al propleos es el Herpes Zoster (culebrilla), patologa con expresin cutnea, dolorosa, de pobre respuesta a los tratamientos convencionales. Tratado precozmente en el perodo eruptivo, la remisin se acorta y se evita la neuralgia postherptica. Otro virus como el VIH tambin ha llamado la atencin. Un grupo de investigadores del Albert Einstein College of Medicine de Nueva York public, en 1997,

un trabajo en el que explican cmo determinaron la capacidad del propleos de suprimir la replicacin del VIH-1 y su efecto inmunoestimulante. Capacidad cicatrizante y antiinflamatoria: El propleos gan espacios importantes en el tratamiento de heridas por su capacidad antibacteriana, y por su notable capacidad cicatrizante y antiinflamatoria. Estas ltimas son comparables a la capacidad de antiinflamatorios de sntesis como el diclofenac. Se seal al cido cafeico como responsable de inhibir la dihidrofolato reductasa, porque reduce la produccin de interleuquinas y prostaglandinas. En 1996 se public un trabajo elaborado en el Departamento de Bioqumica de la Universidad de Oxford, en el cual los autores atribuyen esta accin del propleos a un ster del cido cafeico (CAPE), al cido cafeico y a la quercetina. Actuando a nivel de los macrfagos, suprime la produccin de prostaglandinas y leucotrienos. Empleando modelos "in vivo" e "in vitro" constataron que el propleos suprime la va de la lipooxigenasa del cido araquidnico. Capacidad inmunomoduladora: Diversos trabajos demuestran que el propleos estimula la inmunidad inespecfica y la inmunidad especfica; y tanto la inmunidad celular (mediada por los linfocitos T) como la humoral (mediada por los linfocitos B). En ratones infectados con el virus influenza tipo A y tratados con propleos, se constat un aumento de los linfocitos T, un mayor nivel de fagocitosis y una menor mortalidad, en comparacin con animales testigo no tratados. Los autores determinaron que se estimula la liberacin del factor inhibidor de la migracin de los leucocitos. Capacidad antioxidante: En los ltimos aos ha ganado importancia el consumo de antioxidantes, en especial los de origen natural, para la prevencin de enfermedades de gran trascendencia como la arterioesclerosis, el reuma e incluso el cncer. Los antioxidantes, como la vitamina E (alfa tocoferol), impiden la oxidacin lipdica (por transformacin del colesterol LDL en colesterol HDL), reduciendo el riesgo de enfermedades cardiovasculares, y adems neutralizan los radicales libres, que son los responsables del envejecimiento celular. El propleos posee una potente capacidad antioxidante. El propleos ha ganado espacios importantes en el tratamiento de heridas, por su capacidad antibacteriana y por su notable capacidad cicatrizante y antiinflamatoria. Posee una potente capacidad antioxidante, que le permite adquirir insospechables perspectivas de desarrollo [2]. Para mantener sus propiedades requiere que se lo preserve de la luz y de las altas temperatura, dada las delicadas caractersticas biolgicas de sus componentes. A

pesar de que la temperatura de la colmena es de 34-35C, extremadamente favorable para la reproduccin de microorganismos, el propleos permite que permanezca estril. 1.3.3. Formas de propleos Las principales formas de encontrar este producto apcola en el mercado son: Propleos en bruto: es el obtenido directamente de la colmena, sin purificar. Productos con agregados de propleos: spray de propleos, caramelos, miel con propleos y tintura de propleos. Extracto de propleos: es el producto semielaborado, que se obtiene procesando el propleos en bruto con alcohol etlico, de manera de extraer los componentes biolgicamente activos. A partir del extracto obtenido se pueden desarrollar una gran variedad de productos, como tinturas y cremas [2].

Fuente: Lpez del Villar y Ubills Celi (2004)

Figura 1-5. Extracto alcohlico de propleos

En la actualidad, existe en el mercado farmacutico internacional una infinita gama de productos que usan el propleos y cada vez adquiere ms importancia en las farmacopeas y cosmtica moderna debido a sus valiosas propiedades teraputicas [7]. Se le puede encontrar en tres formas de presentacin: Slida: en pasta para masticar, granulado o en polvo. Semislida: pomadas y ungentos. Lquida: solucin alcohlica o acuosa.

1.4.

CARACTERIZACIN Y CALIDAD DEL PROPLEOS

1.4.1. Caracterizacin del propleos de acuerdo a normas Los estndares oficiales de calidad, utilizados para su caracterizacin y la evaluacin de su calidad, existen para el propleos en varios pases del este europeo y en otros lugares del mundo, la mayora de estndares se refieren al producto en bruto y a veces, a sus extractos. Los lmites mximos y mnimos para ciertos compuestos qumicos estn determinados, pero son pocas las pruebas estandarizadas que estn disponibles para determinar la actividad biolgica de varios componentes. En algunos pases existen normas que permiten caracterizar y avaluar la calidad del propleos:
Norma Rusa RST-RSFSR-317-77. Norma Hngara MSZ 08/0184-79.

Norma Ramal Blgara ON 25 72 483-84.

Norma Ramal Cubana NRAG 1135-94. Reglamentacin del Ministerio de Agricultura de Brasil: Reglamento tcnico

para fijar la identidad y calidad de propleos. 1999.

Norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008.

En Brasil, la Instruccin Normativa N 3/01, establece las inspecciones fsicoqumicas y metodologa de anlisis para el propleos en bruto y su extracto, en Blgica y Grecia poseen normativa para productos apcolas que incluyen el propleos [8]. Cada regin presenta condiciones de flora diversa, dependiente de fenmenos locales, influenciados por la temperatura, las precipitaciones, el tipo de suelo, la humedad relativa, brillo solar y la evapotranspiracin. En este sentido es indispensable considerar la similitud en algunos componentes bsicos de algunos vegetales, cuyas caractersticas particulares vendrn dadas por las diversas combinaciones de los elementos que las constituyen. Esto se comprender mejor al analizar la relacin entre la composicin qumica de los propleos y sus propiedades medicinales. Los componentes identificados en muestras de propleos analizados permiten establecer relaciones directas con las propiedades medicinales que se le han atribuido [12]. Los compuestos identicados en propleos de colmenas ubicadas en emplazamientos cercanos entre s no dieren signicativamente, aunque desde el punto de vista cuantitativo pueden ser variables. Ello implica que los propleos deban ser

estudiados y caracterizados en funcin de la zona geogrca de ubicacin de las colmenas, para determinar sus propiedades, compuesto qumicos presentes y caractersticas fsicas y organolpticas. Para caracterizar el propleos hay que determinar: el porcentaje de cera , las impurezas mecnicas, los compuestos fenlicos, el ndice de oxidacin, flavonoides totales, el ndice de yodo, la humedad, la cenizas, las resinas, el aspecto externo, color, sabor, estructura, consistencia a temperatura ambiente e impurezas visibles. La caracterizacin de este producto de la colmena es fundamental para la diferenciacin del producto y conlleva una mejor ubicacin a nivel comercial. 1.4.1.1. Norma Rusa RST-RSFSR-317-77 Esta norma establece los requisitos tcnicos, organolpticos y fisicoqumicos que deben cumplir el propleos para ser utilizado como materia prima en el desarrollo de productos relacionados. Requisitos tcnicos segn la norma a. El propleos debe corresponder con las exigencias de la presente norma. b. Los ndices organolpticos y fisicoqumicos deben corresponder con las exigencias sealadas (ver tabla 1-3). c. No se permite el calentamiento del propleos en su procesamiento primario.

Tabla 1-3. ndices organolpticos y fisicoqumicos, segn norma Rusa

DENOMINACIN DE LOS INDICES Aspecto externo Color Olor

VALORES ACEPTADOS Pelotas granos o briquetas Verde oscuro, pardo o gris con matices verde, amarillo, Castao oscuro o rojo Caracterstico, resinoso, aromtico ( la mezcla de olores de la miel ) de las hierbas aromticas, del pino y del lamo

Sabor Estructura Cera ndice de oxidacin Reaccin cualitativa ante los compuestos flavonoides Impureza mecnica Compuestos fenlicos ndice de yodo

Amargo, algo fuerte Espesa. Con deformaciones Heterogneas No ms del 30 % No mayor de 22 s Positiva No ms del 20 % No menos de 30 % No menor de 35 %

1.4.1.2. Norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008 Esta norma establecen los requisitos organolpticos y fisicoqumicos que deben cumplir el propleos en bruto, para ser utilizado como materia prima en el desarrollo de productos relacionados. Esta norma se aplica al propleos en bruto, a granel y fraccionado. Requisitos tcnicos segn norma a. Los ndices organolpticos y fisicoqumicos deben corresponder con las exigencias sealadas (ver tabla 1-4). b. El propleos en bruto no debe contener sustancias extraas a sus procesos de produccin y elaboracin. c. No se admite el agregado de aditivos.

d. Los materiales de los utensilios que se utilicen para la recoleccin del propleos en bruto (por ejemplo, esptulas, mallas y trampas) deben ser bromatolgicamente aptos. e. Debe ser envasado en envases de material bromatolgicamente apto, almacenados en un sitio fresco y oscuro. El envase debe ser tal que le confiera al producto una proteccin adecuada respecto de la humedad, la luz y la temperatura excesiva.

Tabla 1-4. ndices organolpticos y fisicoqumicos, segn norma Argentina

DENOMINACIN DE LOS INDICES Aspecto externo Color

VALORES ACEPTADOS Homogneo o heterogneo, de Preferencia en trozos no comprimidos. Amarillo, pardo, verdoso, marrn, rojizo, negro y otros similares, variando conforme a su origen botnico y/o geogrfico Resinoso o balsmico, segn su origen botnico y/o geogrfico. Variable, de suave y balsmico a fuerte y picante, segn su origen botnico y/o geogrfico. Maleable o rgido, segn su origen botnico y/o geogrfico. Mximo 10% Mximo 5% Mximo 35% Mximo 22 s Mximo 25% Mnimo 5% Mnimo 35% Mnimo 1,0% Mximo de absorcin entre 270 y 315 nm.

Olor Sabor

Consistencia a T ambiente Prdida por calentamiento Cenizas Sustancias extrables en n-hexano ndice de oxidacin Impurezas mecnicas Compuestos fenlicos Resinas solubles en etanol Flavonoides Espectrograma UV-VIS

Fuente: Norma Argentina IRAM-INTA N15935-1:2008

1.4.2. Calidad del propleos La calidad de los propleos est directamente relacionada con los mtodos de recoleccin, almacenamiento y conservacin [6].Si bien la calidad del propleos depende del tipo de flora y del ambiente; es decisivo en este sentido el trabajo del apicultor. La calidad del producto resultante estar directamente relacionada con: Almacenamiento y conservacin. Lugar de procedencia.

 Flora predominante en la zona. Zona de la colmena desde donde se extrajo. Mtodo de recoleccin utilizado. La calidad de propleos va a estar bsicamente determinada por la cantidad de principios activos que puedan extraerse de ellos, si el propleos se conserva por ms de un ao, su actividad biolgica comienza a decrecer. Una forma simple de determinar la calidad de una muestra, consiste en oprimir una pequea parte entre los dedos ndice y pulgar, si sentimos consistencia terrosa la muestra es de poca calidad por la presencia de un exceso de mezclas mecnicas, si es demasiado maleable tendr una cantidad excesiva de cera por lo tanto su calidad ser tambin inferior. Para que las propiedades del propleos recogido no se pierdan o alteren, es recomendable acopiarlo en frascos de vidrio color mbar, hasta que se entregue para su utilizacin. Se debe tener la precaucin de no almacenar grandes volmenes, para evitar que se compacte desmereciendo significativamente la calidad del propleos. Es muy difcil establecer lineamientos para el propleos, ya que presenta diferentes colores, olores y composicin. La mayora de propleos fresco tiene un olor resinoso agradable. Deber tener el menor contenido de cera posible y estar libre de residuos contaminantes que se puedan ver a simple vista. Las mltiples y variadas propiedades del propleos, dependen de sus componentes, y justifican la necesidad de una correcta evaluacin de su calidad, y si bien distintos pases disponen de parmetros oficiales para dicha evaluacin, son escasos los ensayos de que se disponen para medir su actividad biolgica [5]. Para que la calidad de un propleos se considere buena debe cumplir los siguientes requisitos: a. Estar libre de contaminantes txicos. b. Contener bajos porcentajes de cera, materia insoluble y cenizas. c. Definir su procedencia botnica para determinar el tipo de compuestos activos. d. Tener contenidos elevados de principios activos. Para evaluar la calidad del propleos adems de la inspeccin visual y de sus caractersticas fsicas y organolpticas (aspecto, consistencia, sabor, color y olor), que proporcionan una apreciacin subjetiva del producto y cierta relacin con su calidad real, se deben determinar los contenidos de principios activos que permiten una

evaluacin real y objetiva [5]. Por tanto es necesario determinar los contenidos de: fenoles, flavonoides, cera, cenizas, entre otros.

Fuente: Farr, Frasquet y Snchez (2004)

Figura 1-6. Caractersticas organolpticas que permiten evaluar la calidad del propleos

Un anlisis primario de cualquier muestra de propleos permitir determinar en lneas generales la presencia cera, que siempre estar ntimamente mezclada a los mismos, en proporciones relativamente altas (20-30%). Las muestras obtenidas por raspado de cuadros presentan mayores cantidades; resinas y blsamos aromticos (4050%), aceites esenciales (5-10%), polen (4-5%) y mezclas mecnicas (10-30%), que se encuentran en los propleos empleados con fines constructivos, donde al parecer han sido acondicionados para aumentar su consistencia [12]. La cera y las mezclas mecnicas constituyen casi siempre entre el 40 al 50% de la masa total, no habindose podido demostrar su actividad teraputica; se debe sealar que los microelementos detectados se encuentran en su mayor parte en las mezclas mecnicas, siendo precisamente el resto lo que corresponde a la parte biolgicamente activa, la calidad de los propleos estar determinada por su presencia y ser inversamente proporcional a las cantidades de materias insolubles.

CAPTULO 2: PARTE EXPERIMENTAL

2.

PARTE EXPERIMENTAL

2.1.

TOMA DE MUESTRA

Se toma una muestra de propleos a travs del mtodo de raspado del apiario seleccionado, de distintas colmenas que conforman el apiario, previa enumeracin de las colmenas y seleccin de algunas de ellas de forma aleatoria a travs de la NCh (norma chilena) oficial 43.Of61, seleccin de muestras al azar, INN-Chile; para formar un muestra compuesta (no menor de 200g) representativa del apiario, que se denomin: MP- A. Recolectada en el mes de Noviembre del ao 2008 (ver anexo A), a la muestra se le consignan los siguientes datos, tabulados en una ficha entregada previamente: Ubicacin del apiario: localidad de Tapihue, Casablanca. Quinta Regin de Chile. Tamao del apiario: 300m2. Identificacin del apicultor: Fredy Valds lvarez. Mtodo de recoleccin: raspado. poca de cosecha: primavera. Cantidad de colmenas: 126. Cantidad de colmenas seleccionadas para la toma de muestra: 20. 2.1.1. Tamao de la muestra Se determina el tamao de la muestra a travs de un plan de muestreo simple, utilizando un nivel de inspeccin normal para usos generales, considerando las colmenas como lotes y seleccionando las colmenas a travs de la tabla de nmeros al azar: Tamao del lote (N) = 126. Letra-cdigo del tamao de la muestra: F. Tamao de la muestra(n): 20. Punto de partida (fila, columna): 15,11. Colmenas seleccionadas: 1,17,19,21,23,29,40,42,53,55,67,71,76,77,104,110,119,120, 122,124. 2.1.2. Acondicionamiento de la muestra

Antes de iniciar las determinaciones en el laboratorio, hay que acondicionar la muestra eliminando las impurezas visibles que acompaan al propleos, tales como virutas de madera, partes de abejas, restos de pintura, restos vegetales, etc. La muestra de propleos en bruto se mantiene refrigerada para su conservacin adecuada; a bajas temperatura el propleos se vuelve rgido, lo cual favorece su molienda. Una vez congelado, debido a su consistencia y en algunos casos a su heterogeneidad, la muestra de propleos en bruto se fracciona mecnicamente en tres trozos, un trozo se utiliza para realizar las determinaciones organolpticas, el otro para realizar las determinaciones fisicoqumicas, este se muele en un mortero de porcelana, manualmente, y el ltimo se guarda en el laboratorio para realizar anlisis de arbitraje. Despus de la molienda deben conservarse refrigerados, protegidos de la luz en recipientes de vidrio color mbar, hasta que se lleve acabo los anlisis.

2.2.

DETERMINACIONES ORGANOLPTICAS

Las determinaciones organolpticas de la muestra de propleos, como materia prima, se lleva a cabo analizando cualitativamente los parmetros sensoriales descriptivos, utilizando el protocolo de la UNSE-INTA (ver anexo B), realizadas por un grupo de diez apicultores semientrenados que califican los atributos a travs de un anlisis descriptivo de categorizacin cuantitativa relativa. Este anlisis consiste bsicamente en realizar la descripcin de las caractersticas organolpticas del propleos asignndole valores cuyo orden creciente o decreciente se ajusta al carcter de ms intenso o aceptable para el propleos; hasta obtener las caractersticas que ms se ajustan a la realidad de la muestra analizada (ver anexo C). Descriptores organolpticos: color, aspecto externo, estructura, olor, sabor, consistencia a temperatura ambiente e impurezas visibles. 2.2.1. Procedimiento Para determinar el color, se coloca la muestra sobre una superficie blanca y se compara el color con una escala de colores, en un ambiente con buena iluminacin. Calificando el color segn tonalidades predominantes en la muestra.

Color: negro , marrn, marrn oscuro, marrn claro, verde oscuro, verde, verde claro, gris, amarillo, tintes castaos, tintes rojizos, tintes naranjas, marrn verdoso, verde amarillento, tintes castao rojizo, tintes castao naranja, marrn amarillento, amarillo verdoso, marrn verdoso amarillento. La determinacin del color, constituye una de las caractersticas organolpticas ms importantes para clasificar los propleos de orgenes diversos [3]. Para determinar el aspecto externo y estructura, se compara con las referencias grficas de un propleos estndar actualmente comercializado. Determinando el aspecto externo y estructura por observacin. Aspecto externo: Polvo, granulado, masa irregular con brillo, masa irregular opaca, trozos irregulares opacos, trozo irregulares con brillo. Estructura: Homognea o heterognea. Para la evaluacin del olor y sabor, se retira una porcin de la muestra a fin de que el envase no interfiera en la percepcin olfativa. Posteriormente, la muestra se coloca en la parte media de la lengua por unos segundos y se compara el sabor con un propleos estndar actualmente comercializado. Para determinar el olor, se huele la muestra y se compara el olor con un propleos estndar actualmente comercializado. Olor: Inodoro, levemente reinoso, resinoso, resinoso aromtico, resinoso muy aromtico. Sabor: Inspido, dulce, salado, amargo, picante. Para determinar su consistencia a temperatura ambiente, se retira una porcin de la muestra y se coloca en un vidrio reloj, hasta que alcance la temperatura ambiente en el laboratorio. Determinando la consistencia por opresin de la muestra con los dedos y comparndola con un propleos estndar actualmente comercializado. Consistencia a temperatura ambiente: Muy blando, blando, poco blando o duro. Para determinar las impurezas visibles, se retira una porcin de la muestra y se coloca en un vidrio reloj, y con la ayuda de pinzas se determinan las impurezas por observacin. 2.3. DETERMINACIONES FISICOQUMICAS

2.3.1. Determinaciones fisicoqumicas, por norma Rusa 2.3.1.1. Determinacin del porcentaje de cera La cera de abejas corresponde a una secrecin natural, producida por dos pares de glndulas, ubicadas en la zona central del abdomen de las abejas jvenes. Esta secrecin est compuesta principalmente por steres de cidos grasos y alcoholes, siendo una sustancia insoluble en agua. Fundamento terico Determinacin del contenido de cera presente en la muestra, por gravimetra sobre el residuo de cera, obtenido por calentamiento del propleos en solucin acuosa, ya que este es insoluble en agua, posterior filtracin y secado en estufa a 80C. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Procedimiento - Pesar al 0,1 mg, 3 g de muestra en un vaso precipitado de 250 ml, agregar 200 ml de agua destilada y mezclar. - Hervir por 15 a 20 min. - Cumplido el tiempo, enfriar con un chorro de agua, si es que no ha alcanzado la temperatura ambiente y filtrar. - Tarar un papel filtro, colocar en la estufa a 80C y pesar cada cierto tiempo hasta obtener un peso constante. Se considerar peso constante, cuando la diferencia entre dos pesadas sucesivas no exceda de 0,5 mg. Expresin de clculo

% Cera = A x 100 B Donde:

A= B=

masa del residuo, en g. masa inicial de la muestra, en g.

2.3.1.2. Determinacin del porcentaje de impurezas mecnicas Las impurezas mecnicas son todos los elementos ajenos al propleos, que han sido incorporados durante el proceso de recoleccin y manipulacin de ste, por ejemplo: patas de abejas o parte de ellas, residuos de papel, plstico, madera, resto de pinturas, etc. Fundamento terico Determinar el contenido de impurezas mecnicas presentes en la muestra, a travs de un anlisis gravimtrico del residuo obtenido, al adicionar solucin de cloroformo-acetona 2:1 a 1g de propleos, posterior filtracin de l y donde las impurezas son insolubles en esta solucin. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones - Cloroformo, PM = 119,38 g/mol, grado p.a., Vimaroni. - Acetona, PM= 58,08, grado p.a., Winkler. - Solucin de cloroformo-acetona (2:1): mezclar en un matraz de 250 ml con tapa esmerilada 20 ml de cloroformo y 10 ml de acetona. Procedimiento - Pesar 1g de muestra en un vaso precipitado de 250ml. - Adicionar 15 ml de solucin de cloroformo-acetona 2:1, agitar y mantener en descanso durante 1h a temperatura ambiente y posteriormente filtrar. - Guardar el filtrado para la determinacin de compuestos fenlicos (2.3.1.3.). - Lavar el papel filtro con el residuo, con 15 ml de solucin de cloroformoacetona 2:1. Colocar el papel filtro sobre un vidrio reloj.

- Secar a temperatura ambiente, llevar a desecador y pesar cada cierto tiempo hasta obtener peso constante. Se considerar peso constante, cuando la diferencia entre dos pesadas sucesivas no exceda de 0,5 mg. Expresin de clculo % Impurezas mecnicas = (M3 M2) x 100 M1 Donde: M1 = M2 = M3 = masa de la muestra inicial en g. masa del papel filtro, en g. masa del papel filtro conteniendo el residuo, en g.

2.3.1.3. Determinacin de los compuestos fenlicos Los compuestos fenlicos son cidos aromticos, poseen en comn un anillo aromtico con uno o ms sustituyentes hidroxilos, junto a los flavonoides, le confieren al propleos sus mltiples aplicaciones farmacuticas; los principales compuestos fenlicos del propleos son: cido cafeico, cido ferlico, cido cinmico y cido benzoico, entre otros. Fundamento terico Determinar los compuestos fenlicos en la muestra de propleos, a travs de un anlisis gravimtrico del residuo obtenido, al tratar el filtrado obtenido en la determinacin de impurezas mecnica con xido de aluminio, posterior filtrado y lavado con cloroformo-acetona 2:1. Se basa en la adsorcin de los compuestos fenlicos del propleos, sobre el xido de aluminio activado, y la mxima capacidad de dilucin en la solucin cloroformo-acetona.

Equipos y materiales

- Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones - xido de aluminio, grado p.a., May and Baker, lote: 6155. - Cloroformo, PM = 119,38g/mol, grado p.a., Vimaroni. - Acetona, PM= 58,08, grado p.a., Winkler. - Solucin de cloroformo-acetona (2:1): mezclar en un matraz de 250 ml con tapa esmerilada, 10 ml de cloroformo y 5 ml de acetona. Procedimiento - Tomar el filtrado obtenido en la determinacin de impurezas mecnica (2.3.1.2) y agregar 15 g de xido de aluminio. - Agitar y filtrar. - Lavar el papel filtro con la solucin cloroformo-acetona 2:1 hasta eliminar todo el xido de aluminio. Registrar como A. - Paralelamente, tomar otro papel filtro, a este ltimo agregar 15 g de oxido de aluminio ms 5 ml de la solucin cloroformo-acetona 2:1. Registrar como B. - Colocar ambos papeles filtro en la estufa a una temperatura de 80 C por 30 min. - Enfriar en el desecador y pesar ambos papeles filtro hasta obtener peso constante. Expresin de clculo % Compuestos fenlicos = (B A) x 100 M Donde: A= B= M= masa del papel filtro A, en g. masa del papel filtro B, en g. masa de la muestra inicial, en g.

2.3.1.4. Determinacin del ndice de oxidacin (segn norma Rusa)

Este ndice se define como el tiempo de decoloracin, medido en segundos, de una solucin de KMnO4 0.1000N, se basa en el poder oxidante del KMnO4, sobre compuestos fenlicos del propleos (fenoles y compuestos insaturados). Depende de los compuestos fenlicos y en menor medida de los cidos grasos insaturados de cadena larga. Fundamento terico Determinacin del ndice de oxidacin, para verificar las propiedades antioxidantes, midiendo el tiempo de decoloracin de 0,05 ml de KMnO4 0,1000N. Agregado a 2 ml de una suspensin acuosa de propleos (obtenida mediante una extraccin de 0,2 g de propleos con 5 ml de alcohol etlico 95, posterior agregado de 100 ml de agua destilada y filtrado) y 1 ml de solucin de H2SO4 al 20 % (V/v). Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. - Cronmetro. Reactivos y soluciones - H2SO4 al 20% (V/v). - Alcohol etlico 95, Oxiquim S.A., artculo N1010080000, lote: 61190257213. - KMnO4 0,1000 N: disolver 3,16 g de KMnO4 con 1000 ml de agua destilada y mantener a ebullicin suave por aproximadamente 30 min. Dejar reposar por 24 h protegido de la luz, filtrar a travs de filtro Gooch G4 y guardar en botella mbar. Estandarizar el KMnO4 con una solucin estndar de Na2C2O4 0,1000N. Procedimiento - Pesar 0,2 g de muestra en un vaso de precipitado de 250 ml, agregar 5 ml de alcohol etlico. - Dejar reposar aproximadamente 1 h a temperatura ambiente y agregar 100 ml de agua destilada, filtrar. - Tomar una alcuota de 10 ml del filtrado y llevar a un matraz aforado de 100 ml. Aforar con agua destilada. - De esta solucin tomar una alcuota de 2 ml y llevar a un tubo de ensayo, adicionar 1 ml de H2SO4 al 20% (V/v).

- Agitar por 1 min y agregar 1 gota de KMnO4 0,1000 N, con un cronmetro, registrar el tiempo en el que ocurre el cambio de color. Expresin de clculo El tiempo en que desaparece el color rosado de la solucin, corresponde al ndice de oxidacin que esta dado en segundos (s). 2.3.1.5. Determinacin cualitativa de los compuestos flavonoides Los flavonoides son pigmentos provenientes de exudados vegetales, con mltiples aplicaciones biolgicas: antibacteriana, antimictico, antiviral, antioxidante, cicatrizante, entre otras. Contienen quince tomos de carbono en su ncleo bsico y estn configurados bajo un sistema C6-C3-C6, en el cual dos anillos aromticos llamados A y B estn unidos por una unidad de tres tomos de carbono, que pueden formar o no un tercer anillo, que en caso de existir es llamado anillo C. Fundamento terico Determinar la presencia de compuestos flavonoides en el propleos, basado en la formacin de compuestos coloreados, por reaccin de los flavonoides con el acetato de plomo y el hidrxido de sodio. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio.

Reactivos y soluciones - Acetato de plomo II, grado p.a., Merck, lote: 107375. - Acetato de plomo al 10% (P/v): pesar 10g de acetato de plomo, traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml disolver con 40 ml de agua destilada y aforar. - NaOH, grado p.a., Loba Chemie, artculo: 5900, lote: N A023706. - NaOH al 20% (P/v): pesar 20g de NaOH en balanza granataria, traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml disolver con 40 ml de agua destilada y aforar.

- Alcohol etlico 95, Oxiquim S.A., articulo N1010080000, lote: B11081. Procedimiento - Pesar 0,2 g de muestra en un vaso de precipitado y agregar 5 ml de alcohol etlico. - Colocar el vaso de precipitado en bao mara por 3 min. Enfriar y filtrar la solucin. - Tomar una alcuota de 1 ml del filtrado, llevar a un vaso precipitado de 100 ml y aadir 10 ml de alcohol etlico. - De esta solucin tomar una alcuota de 1 ml, llevar a un tubo de ensayo (tubo A), y adicionar 1 gota de NaOH al 20% (P/v). - Paralelamente, en otro tubo de ensayo (tubo B) tomar 1 ml de la solucin y agregar 0,5 ml (10 gotas) de acetato de plomo al 10% (P/v). - Observar el cambio de color resultante. Expresin de clculo La solucin del tubo A debe colorearse rpidamente de un color anaranjadoamarillento, y oscurecerse. La solucin del tubo B dar un color amarillo-verdoso y precipitar. 2.3.1.6. Determinacin del ndice de yodo Se define el ndice de yodo como el nmero de gramos de yodo que pueden ser absorbidos por 100 g de grasa. El ndice de yodo representa el verdadero grado de insaturacin de las grasas o cidos grasos, solamente cuando los enlaces dobles de los cidos grasos no son conjugados (en los que los dobles enlaces de la cadena carbonada estn siempre separados, por lo menos, por dos enlaces sencillos); en caso contrario la absorcin del halgeno no es cuantitativa.

Fundamento terico

Determinar los gramos de yodo que pueden ser absorbidos, bajo condiciones determinadas por 100g de grasa a travs de la valoracin del yodo liberado con Na2S2O3*5H2O 0,1000N, utilizando como indicador almidn al 5% (P/v). Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones - cido actico glacial, grado p.a., Merck, lote: A968192823. - KI 10 %: pesar 10 g de KI, traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml disolver con 40 ml de agua destilada y aforar. - Na2S2O3*5H2O 0,1000 N: pesar en balanza granataria 12,6 g de Na2S2O3*5H2O, agregar 5 gotas de cloroformo, traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 500 ml y aforara con agua destilada; estandarizar la solucin con cobre electroltico. - Solucin bromoyodo: pesar 13,2 g de yodo cristalizado en un vaso precipitado, disolver con mnima cantidad de cido actico glacial, colocar a bao mara hasta disolucin a una temperatura entre 60 y 70C, enfriar y aadir 3 ml de bromo p.a.; traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 1000 ml y aforar con cido actico glacial. - Almidn al 5% (P/v): disolver 5 g de almidn soluble p.a., con agua destilada caliente en un vaso precipitado (hacer una pasta) hasta transparencia y traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml. Procedimiento - Pesar 0,05 g de muestra de propleos en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapa esmerilada. - Agregar 2,5 ml de cloroformo y 6,25 ml de la solucin bromo-yodo. Tapar el matraz y colocar en la oscuridad por 1 h. - Agregar 5 ml de KI 10 %, 50 ml de agua destilada y 4 a 7 gotas de la solucin de almidn al 5% (P/v). - Agitar y valorar con la solucin de Na2S2O3*5H2O 0,1000N, hasta observar decoloracin de la solucin.

- Hacer un blanco de reactivos en las mismas condiciones experimentales de la muestra. Expresin de clculo ndice de yodo = (B - A) x N x 0,1269 x 100 = [gI2 /100g de muestra] M Donde: A: B: M: N: ml de del Na2S2O3*5H2O gastado en la muestra. ml de del Na2S2O3*5H2O gastado en el blanco. masa de la muestra, en g. normalidad del Na2S2O3*5H2O.

2.3.2. Determinaciones fisicoqumicas, por norma Argentina

2.3.2.1. Prdida por calentamiento Fundamento terico Determinar la prdida de masa por calentamiento, expresadas en g/100g de propleos, a travs de un anlisis gravimtrico, secando una porcin de muestra en estufa a 105C, y pesando la muestra seca hasta obtener peso constante. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Procedimiento - Tarar una cpsula de porcelana limpia, previamente secada en estufa a 100C 2C, y en mufla a 550C 25C. - Pesar al 0,1 mg, en una cpsula de porcelana, aproximadamente 4 g de propleos. - Calentar en estufa regulada a 100C 2C durante 2 h. Luego retirar la cpsula, colocarla en un desecador hasta que llegue a temperatura ambiente, y pesar la cpsula con la muestra. - As tratada, reservar la cpsula para la determinacin de cenizas (2.3.2.2.). Expresin de clculo H (A B) x 100 C

Donde: H= A= B= C= prdida por calentamiento, en g/100g de muestra. masa de la cpsula con la muestra hmeda, en g. masa de la cpsula con la muestra seca, en g. masa de la muestra inicial, en g.

2.3.2.2. Determinacin de cenizas

Fundamento terico Determinar la materia inorgnica, expresadas en gramos de cenizas por 100 g de propleos, por gravimetra, calcinando una porcin de muestra en mufla a 500C, y pesando las cenizas obtenidas hasta conseguir peso constante. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Procedimiento - Colocar en un horno de mufla la cpsula de porcelana con la muestra seca provenientes de (2.3.2.1.), previamente quemada en mechero bajo campana. - Incinerar a 550C 25C, hasta obtener cenizas sin residuos carbonosos. - Retirar cuidadosamente la cpsula, del horno de mufla y dejar enfriar en un desecador hasta que se alcance la temperatura ambiente. - Pesar hasta obtener peso constante, lo cual se verifica cuando dos pesadas sucesivas no difieren entre s en ms de 5 mg. Expresin de clculo C (A B) x 100 D

Donde: C= A= B= D= contenido de cenizas, en g/100g de muestra. masa de la cpsula con las cenizas, en g. masa de la cpsula, en g. masa de la muestra hmeda, en g.

2.3.2.3. Determinacin de sustancias extrables en n-hexano

Si bien otras normativas denominan este requisito como ceras, el mtodo aplicado determina otras sustancias extrables en n-hexano distintas de las ceras. Fundamento terico Determinacin de sustancias extrables en n-hexano por un anlisis gravimtrico, sobre el residuo obtenido mediante una extraccin con n-hexano, en un equipo Soxhlet, durante el tiempo necesario para extraccin total, comprobable, de la cera, posterior destilacin del n-hexano, secado de las sustancial extrables en estufa a 105C y obtencin de peso constante de las sustancias extrables. Equipos y materiales - Equipo para extraccin (Soxlhet). - Equipo de destilacin. - Cartuchos de celulosa o papel de filtro, secados en estufa a 80C. - Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones n-hexano, grado p.a., Merck, Artculo: 1043672500.

Procedimiento - Pesar aproximadamente 2 g de la muestra al 0,1 mg, colocar en un cartucho de celulosa seco, o bien envolver en un papel de filtro seco, ambos previamente tarados, y colocar en el cuerpo de un extractor de Soxlhet. - Tarar el baln del extractor de Soxlhet, previamente secado en estufa a 80C. - Colocar en l, un volumen adecuado de n-hexano, (aproximadamente una vez y media el volumen del sifn), conectar al extractor y comenzar a calentar hasta que el solvente entre en ebullicin. - Mantener en esas condiciones durante 6 h, a una velocidad de aproximadamente 120 gotas a 150 gotas de condensado por minuto. - Sacar el remanente de la muestra del extractor, secar y reservar para las determinaciones de resinas solubles en etanol e impurezas mecnicas (segn 2.3.2.4. y 2.3.2.5. respectivamente). En el baln queda la cera disuelta en nhexano.

- Evaporar el solvente por destilacin. Despus de evaporado el n-hexano, colocar el baln en la estufa de 80C por lo menos 30 min. - Colocar el baln en un desecador hasta temperatura ambiente y pesar. Repetir el ltimo procedimiento hasta lograr peso constante, lo cual se verifica cuando dos pesadas sucesivas no difieren entre s en ms de 5 mg. Expresin de clculo SE (A B) x 100 M

Donde: SE = A = B = M = contenido de sustancias extrables en n-hexano, en g/100g de muestra. masa del baln con sustancias extrables, en g. masa del baln vaco, en g. masa de la muestra, en g.

2.3.2.4. Determinacin de resinas solubles en etanol Fundamento terico Determinacin de resinas en propleos, por gravimetra del residuo obtenido mediante una extraccin con alcohol etlico 95, en un equipo Soxhlet, con posterior destilacin del alcohol ,secado de la resina en estufa a 80C y obtencin de peso constante. Las resinas representan la fraccin til del propleos. Equipos y materiales - Equipo para extraccin (Soxlhet). - Equipo de destilacin. - Cartuchos de celulosa o papel de filtro, secados en estufa a 80C. - Material usual de laboratorio.

Reactivos y soluciones

- Alcohol etlico 95, Oxiquim S.A., artculo N1010080000, lote: 611902640. - Tricloruro de fierro, grado p.a., Scharlau, lote: Hi0336 - Solucin de FeCl3 al 10% (P/v): pesar 10 g de FeCl3 p.a., transvasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, disolver y aforar con agua destilada. Procedimiento - Colocar el remanente de cada una de las muestras, resultantes de la extraccin de sustancias extrables (segn 2.3.2.3), en el cuerpo de un extractor Soxlhet. - Colocar en el baln del extractor Soxlhet un volumen adecuado de alcohol etlico 95, armar el equipo para la extraccin y comenzar a calentar hasta que el solvente entre en ebullicin. Mantener en esas condiciones durante 6 h como mnimo, a una velocidad de aproximadamente 120 gotas a 150 gotas de condensado por minuto. - Continuar la extraccin, hasta que el lquido en contacto con la muestra se encuentre incoloro. El punto final de la extraccin se controla agregando una gota de este alcohol, a un tubo de ensayo que contenga una solucin de FeCl 3 al 10% (P/v). - Si el color de la solucin cambia de amarillento a verdoso, ello indica la presencia de sustancias fenlicas y por lo tanto es necesario continuar con la extraccin. En caso contrario se da por finalizada la extraccin. - Transvasar cuantitativamente el contenido del baln a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con alcohol etlico 95. Tomar una alcuota de 50 ml y colocar en un baln de destilacin previamente pesado. Eliminar completamente el alcohol etlico mediante el equipo de destilacin. - Coloca en un frasco color mbar, con tapa y con capacidad adecuada, el volumen restante (50 ml), reservar para la determinacin de fenoles totales, flavonoides y espectro de absorcin UV (segn 2.3.2.7., 2.3.2.6. y 2.3.2.9., respectivamente). - Sacar del extractor el remanente de la muestra y reservar para la determinacin de impurezas mecnicas (segn 2.3.2.5.). - Las resinas quedan en el baln de destilacin, el cual se coloca en una estufa a 80C, para evaporar los restos de alcohol etlico 95. Despus de evaporado el alcohol, retirar de la estufa, colocar en un desecador hasta temperatura ambiente y pesar. Repetir el ltimo procedimiento hasta lograr peso constante, lo cual se verifica cuando dos pesadas sucesivas no difieren entre s en ms de 5 mg.

Expresin de clculo
ml , Aforo [ A B] 100 ml , Alcuota R= M

Donde: R= A= B= M= Aforo = contenido de resinas, en g/100g de muestra. masa del baln con resinas, en g. masa del baln vaco, en g. masa de la muestra, en g. volumen al cual se diluye el extracto etlico total de resinas, en ml.

Alcuota = volumen tomado para evaporar el alcohol etlico, en ml. 2.3.2.5. Determinacin de impurezas mecnicas La impureza mecnica es todo resto de madera, metales, mallas, hilos, insectos y materiales que pudieran encontrarse en el propleos en bruto[8]. Fundamento terico Determinacin de impurezas mecnicas por gravimetra del residuo insoluble que queda en el cartucho del Soxhlet luego de la determinacin de resinas segn 2.3.2.4, empleando alcohol etlico 95, posterior secado del cartucho en estufa a 105C y obtencin de peso constante. Equipos y materiales Material usual de laboratorio.

Procedimiento

- Secar en la estufa a 80C los remanentes de cada una de las muestras provenientes de la determinacin de resinas, segn 2.3.2.4. (en cartucho o encerrada en papel). - Retirar de la estufa, colocar en un desecador hasta temperatura ambiente y pesar. - Repetir el ltimo procedimiento hasta lograr peso constante, lo cual se verifica cuando dos pesadas sucesivas no difieren entre s en ms de 5 mg. Expresin de clculo IM (A B) x 100 M

Donde: IM = A= B= M= contenido de impurezas mecnicas, en g/100g de muestra. masa del cartucho o papel filtro con el remanente, en g. masa del cartucho o papel filtro, en g. masa de la muestra, en g.

2.3.2.6. Determinacin de compuestos fenlicos totales El mtodo empleado permite cuantificar los compuestos fenlicos totales presentes en el propleos, y se expresan como equivalentes de cido glico. Se basa en la reaccin de oxidacin de los fenoles, por accin del reactivo fosfotngstico, y la aparicin de una coloracin azul por la reduccin del reactivo a xidos azules de tungstenos y molibdenos. Fundamento terico Determinacin de compuestos fenlicos totales por espectrofotometra, con el reactivo de Folin-Ciocalteu, trabajando a 765 nm sobre los extractos alcohlicos obtenidos segn 2.3.2.4, y empleando cido glico como patrn.

Equipos y materiales

- Material usual de laboratorio. - Espectrofotmetro UV-visible Secoman, modelo Anthelie light. Rango: 199900 nm. - Bao de agua que opere a una temperatura de 50C. Reactivos y soluciones - cido glico monohidratado, grado p.a., Sigma, lote: WE8343. - Solucin patrn de cido glico de 0,5 mg/ml (500ppm): Disolver 0,05 g de cido glico p.a. en agua destilada y llevar a un matraz aforado de 100ml. Mantener la solucin refrigerada a 4C y utilizar despus de 48 h de haberla preparado. - Alcohol etlico al 10% (V/v): tomar 10 ml de alcohol etlico p.a. y llevar a un matraz aforado de 100 ml, aforar con agua destilada. - Reactivo de Folin-Ciocalteu, Merck, lote: 80300769, artculo: 1.09001.0100. Nota: el reactivo de Folin-Ciocalteu se puede preparar a partir de los siguientes componentes: 100 g de wolframato de sodio hidratado p.a. 25 g de molibdato de sodio hidratado 50 ml de cido fosfrico de 85 ml/100 ml p.a. 100 ml de cido clorhdrico de 36 ml/100 ml p.a. 150 g de sulfato de litio hidratado. Bromo (ampollas). Mezclar los reactivos mencionados dentro de un baln de 1000 ml y se calienta a reflujo suave, durante 10 h. Dejar enfriar, y luego se lava el condensador con 50 ml de agua destilada, la que se escurre sobre el baln. Aadir 150 g de sulfato de litio hidratado y una o dos gotas de bromo. Llevar a ebullicin, sin el condensador, dentro de una campana de extraccin de gases, hasta que la solucin quede libre de bromo (lo que se evidencia porque el color verde se torna amarillo brillante). - Carbonato de sodio anhidro, grado p.a., Merck, artculo: 1.06392.1000, lote: A968192823 - Solucin de carbonato de sodio 1,5 N: Disolver 159 g de carbonato de sodio anhidro p.a. en 700 ml de agua destilada caliente, enfrar traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 1000 ml y completar con agua destilada.

Procedimiento - Tomar una alcuota de 5 ml de cada uno de los extractos alcohlicos obtenidos en la determinacin de resinas (segn 2.3.2.4.) y colocar en un matraz aforado de 100 ml. completar con agua destilada y agitar. - Tomar una alcuota de 1 ml de la solucin anterior y colocar en un matraz aforado de 25 ml, agregar 10 ml de agua destilada y 1 ml del reactivo de FolinCiocalteu, agitar suavemente y dejar reposar durante 2 min. - Aadir 4 ml de la solucin de carbonato de sodio y completar el volumen con agua destilada, sin agitar. Finalmente, calentar en un bao de agua a 50C durante 5 min, y enfrar hasta temperatura ambiente. - Homogeneizar el contenido de los matraces antes de efectuar la medicin. - Colocar la solucin en una cubeta de vidrio y leer la absorbancia en un espectrofotmetro a 765 nm, contra un blanco preparado en las mismas condiciones conteniendo los reactivos, y utilizando 1 ml de agua destilada en lugar de la muestra. - Con el valor de absorbancia obtenido interpolar en la curva de calibracin. Preparacin de la curva de calibracin - Tomar alcuotas de 5 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml y 25 ml de la solucin patrn de acido glico y colocar en matraces aforados de 25 ml. Completar el volumen con una solucin de alcohol etlico al 10% (V/v). Las diluciones as preparadas contendrn 0,1 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,4 mg/ml y 0,5 mg/ml, respectivamente, de cido glico. - Tomar 1 ml de cada una de las soluciones patrn diluidas y colocar en matraces aforados de 25 ml, agregar 10 ml de agua destilada y 1 ml del reactivo de FolinCiocalteu, agitar suavemente y dejar en reposo durante 2 min. - Aadir 4 ml de la solucin de carbonato de sodio y completar el volumen con agua destilada, sin agitar. Finalmente, calentar en un bao de agua a 50C durante 5 min y enfrar hasta temperatura ambiente. - Colocar las soluciones en cubetas de vidrio y leer la absorbancia en un espectrofotmetro a 765 nm, contra un blanco preparado en las mismas condiciones conteniendo los reactivos, y utilizando 1 ml de agua destilada en lugar de la solucin patrn diluida (stock).

- Las diluciones as preparadas contendrn 0 mg/ml (blanco); 0,004 mg/ml; 0,008 mg/ml; 0,012 mg/ml; 0,016 mg/ml y 0,020 mg/ml, respectivamente, de cido glico. Expresin de clculo Tener en cuenta que el extracto alcohlico (normalmente de 100 ml) se obtuvo a partir de 50 ml del extracto alcohlico provenientes de la determinacin de resinas al procesar la muestra. FE (ABS a) x 5000 b M

Donde: FE = contenido de fenoles totales, expresado como su equivalente en cido glico, en g/100g de muestra. ABS = absorbancia leda a 765 nm en la muestra. b= a= M= pendiente de la recta obtenida en la curva de calibracin. intercepto de la recta obtenido en la curva de calibracin. masa de la muestra utilizada en la determinacin de sustancias extrables en nhexano, en g. 5000 = factor de dilucin para expresar la concentracin, en g/100g de muestra. 2.3.2.7. Determinacin de flavonoides totales Las flavonas y flavonoles, desde el punto de vista reactivo, forman complejos estables con el tricloruro de aluminio y son susceptibles de analizar mediante espectrofotometra UV- visible. Fundamento terico Determinacin de flavonoides totales por espectrofotometra del complejo flavonoides-AlCl3, de color amarillo formados especficos para flavonas y flavanoles (3,5-hidroxiflavonas y 3,5-hidroxiflavonoles) en medio metanlico, a 425 nm, sobre los extractos alcohlicos obtenidos en la determinacin de resinas (segn 2.3.2.4), empleando quercetina dihidratada como patrn.

Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. - Espectrofotmetro UV-visible Secoman, modelo Anthelie light. Rango: 199900 nm. Reactivos y soluciones Observacin: Debido a la peligrosidad de los reactivos utilizados en esta tcnica se debe utilizar propipeta en todas las mediciones de volumen. - Quercetina dihidratada, grado HPLC, 99,0% de pureza, Calbiochem, lote: D00047624, artculo: 551600. - Solucin stock de quercetina de 1 mg/ml: Disolver 100 mg de quercetina dihidratada en 100 ml de metanol. Conservar en la oscuridad y refrigerada. - Solucin patrn de quercetina de 100 g/ml (100ppm): Tomar 10 ml de la solucin stock y disolver en matraz aforado de 100 ml con metanol. Se debe conservar en la oscuridad y refrigerada. - Alcohol metlico, grado HPLC, J. T. Baker, lote: B38E2. - Solucin de tricloruro de aluminio al 5% (P/v): Pesar 10g de tricloruro de aluminio p.a. y disolver en 200 ml de metanol. Observacin: trabajar bajo campana con mucho cuidado, empleando guantes, ya que el tricloruro de aluminio es muy corrosivo e higroscpico. Procedimiento - A partir de los extractos alcohlicos obtenidos en la determinacin de resinas (segn 2.3.2.4), pipetear 0,1 ml de cada uno de ellos en sendos matraces de 25 ml, agregar 0,5 ml de solucin de tricloruro de aluminio y aforar con alcohol metlico. - Preparar un blanco con 0,1 ml de alcohol etlico y 0,5 ml de solucin de tricloruro de aluminio, y aforar con alcohol metlico en un matraz aforado de 25 ml. - Dejar los matraces 30 min en la oscuridad, colocar en una cubeta de vidrio y leer la absorbancia a 425 nm. Si la absorbancia es mayor que 0,400 repetir la

determinacin tomando un volumen menor de extracto alcohlico. Del mismo modo, si se obtiene una lectura muy baja, aumentar el volumen de dicho extracto Preparacin de la curva de calibracin - Para realizar la curva de calibracin: preparar soluciones de 2 g/ml, 4 g/ml, 6 g/ml, 8 g/ml y 10 g/ml de quercetina, respectivamente. - En sendos matraces aforados de 25,0 ml pipetear 0,0 ml; 0,5 ml; 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml y 2,5 ml de la solucin patrn de quercetina. Agregar 0,5 ml de la solucin de tricloruro de aluminio a cada una de ellas y al blanco. Aforar a 25 ml con alcohol metlico. - Dejar los matraces 30 min en la oscuridad, y leer las absorbancias a 425 nm. Expresin de clculo Tener en cuenta que el extracto alcohlico (normalmente de 100 ml) se obtuvo a partir de 50 ml de cada uno de los extractos alcohlicos provenientes de la determinacin de resinas al procesar la muestra. FlT (ABS a) x 2,5 b M

Donde: FlT = contenido de flavonoides totales de propleos, expresado como su equivalente en quercetina dihidratada, en g/100 g. ABS = absorbancia leda a 425 nm en la muestra. b= a= M= 2,5 = pendiente de la recta obtenida en la curva de calibracin. intercepto de la recta obtenido en la curva de calibracin. masa de la muestra utilizada en la determinacin de sustancias extrables en n-hexano, en g. factor de dilucin para expresar la concentracin, en g/100 g. 2.3.2.8. Determinacin del ndice de oxidacin (segn norma Argentina) Fundamento terico

Determinacin del ndice de oxidacin, en segundos, midiendo el tiempo de decoloracin de 0,05 ml de KMnO4 0,1000N. Agregado a 2 ml de una suspensin acuosa de propleos (obtenida mediante una extraccin de 0,2 g de propleos con 5 ml de alcohol etlico al 95 durante 1 hora, con posterior agregado de 100 ml de agua destilada y filtrado), y 1ml de solucin de H2SO4 al 20 % (V/v). Se basa en el poder oxidante del KMnO4, sobre compuestos fenlicos del propleos (fenoles y compuestos insaturados). Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. - Cronmetro. Reactivos y soluciones - H2SO4 al 20% (V/v). - Alcohol etlico 95, Oxiquim S.A., artculo N1010080000, lote: 61190257213. - KMnO4 0,1000 N: disolver 3,16 g de KMnO4 con 1L de agua destilada y mantener a ebullicin suave por aproximadamente 30 min. Dejar reposar por 24 h protegido de la luz, filtrar a travs de filtro Gooch G4 y guardar en botella mbar. Estandarizar con Na2C2O4 0,1000 N (previamente seco a 110C por 2 h). Procedimiento - Pesar 0,2 g de la muestra de propleos y colocar en un Erlenmeyer de 125 ml, aadir 5 ml de alcohol etlico 95 y dejar en reposo durante 1 h. - Agregar 100 ml de agua destilada, agitar, filtrar a travs de un papel de filtro y recoge el filtrado en un vaso precipitado. - Colocar 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo, aadir 1 ml de solucin de H2SO4 al 20% (V/v) y agitar durante 1 min. Finalmente, agregar en el tubo 0,05 ml (1 gota) de la solucin de permanganato de potasio 0,1000 N. - Poner en marcha el cronmetro en el preciso momento en que la gota entra en contacto con la solucin acidulada de propleos, agitando constantemente. La gota debe caer directamente sobre la solucin y no sobre las paredes del tubo. - Registra el tiempo, en segundos, que la solucin tarda en decolorarse. Expresin de clculo

El tiempo en que desaparece el color rosado de la solucin, corresponde al ndice de oxidacin que esta dado en segundos. 2.3.2.9. Determinacin del espectro de absorcin UV- visible Dada la naturaleza aromtica, los compuestos fenlicos importante para su identificacin. Fundamento terico Determinar el espectro de absorcin UV- visible del extracto alcohlico obtenido en la determinacin de resinas, para comprobar la presencia de compuestos fenlicos al registra un mximo de absorbancia entre 270 nm y 315 nm. Equipos y materiales - Espectrofotmetro UV-visible Secoman, modelo Anthelie light. Rango: 199900 nm. - Cubetas de cuarzo, de 1cm de paso ptico, para trabajar en la regin UV del espectro. - Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones - Alcohol etlico 95, Oxiquim S.A., artculo N1010080000, lote: 611902640. muestran intensa

absorcin en la regin UV del espectro, siendo ste mtodo espectral especialmente

Procedimiento - A partir del extracto alcohlico obtenido en la determinacin de resinas (segn 2.3.2.4), efectuar una dilucin de 1 en 1000 con alcohol etlico. - Realizar un barrido completo de longitudes de onda desde 240 nm hasta 420 nm.

- Graficar los valores de absorbancia medidos en funcin de la longitud de onda de la radiacin. Expresin de clculo La presencia de compuestos fenlicos resulta positiva si se registra un mximo de absorbancia entre 270 nm y 315 nm.

CAPTULO 3: RESULTADOS

3.

RESULTADOS

3.1.

RESULTADOS DE LOS ANLISIS ORGANOLPTICOS

El anlisis sensorial de las caractersticas organolpticas, permiti establecer los atributos ptimos para la muestra de propleos analizado.

Tabla 3-1. Caractersticas organolpticas del propleos analizado

Caracterstica organolptica Color Aspecto externo Sabor Estructura Olor Consistencia a temperatura ambiente Impurezas visibles

Resultado Marrn verdoso Trozos irregulares con brillo Amargo Heterogneo Resinoso aromtico Poco blando Virutas de madera, restos de pintura y partes de abejas

3.2.

RESULTADOS DE LOS ANLISIS FISICOQUMICOS

3.2.1. Resultados de los anlisis fisicoqumicos, realizados segn norma Rusa

Tabla 3-2. Resultados de la determinacin del porcentaje de cera Media aritmtica 38,34 Desviacin estndar 2,10

Anlisis 1 2 3

% Cera 39,36 39,73 35,92

Valor aceptado No ms del 30 %

Tabla 3-3. Resultados de la determinacin del porcentaje de impurezas mecnicas %Impurezas mecnicas 35,90 37,71 35,10 Media aritmtica 36,24 Desviacin estndar 1,34 Valor aceptado No ms del 20 %

Anlisis 1 2 3

Tabla 3-4. Resultados de la determinacin de los compuestos fenlicos %Compuestos fenlicos 8,09 7,62 10,17 Media aritmtica 8,62 Desviacin estndar 1,36 Valor aceptado No menos de 30 %

Anlisis 1 2 3

Tabla 3-5. Resultados de la determinacin del ndice de oxidacin (segn norma Rusa) ndice de oxidacin(s) 9,05 7,80 7,91 Media aritmtica 8,25 Desviacin estndar 0,69 Valor aceptado No mayor de 22 s

Anlisis 1 2 3

Tabla 3-6. Resultados de la determinacin cualitativa de los compuestos flavonoides

Anlisis 1 2 3

Compuestos flavonoides + + +

Resultado aceptado +

Tabla 3-7. Resultados de la determinacin del ndice de yodo g de I2/100g de propleos 60,56 63.09 62,06 Media aritmtica 61,90 Desviacin estndar 1,27 Valor aceptado No menos de 35 g de I2/100g

Anlisis 1 2 3

Tabla 3-8. Caractersticas fisicoqumicas del propleos analizado, segn norma Rusa

Caractersticas fisicoqumicas (*) %Cera ndice de oxidacin( s) (*) %impurezas mecnica (*)%Compuestos fenlicos Compuestos flavonoides (*)ndice de yodo(gI2 /100g de muestra)

Resultado 38,34 2,10 8,25 0,69 36,24 1,34 8,62 1,36 + 61,90 1,27

Valor aceptado No ms del 30 % No mayor de 22 s No ms del 20 % No menos de 30 % + No menos de 35 gI2/100g

(*) = resultado expresado en la media aritmtica y la desviacin estndar.

3.2.2. Resultados de los anlisis fisicoqumicos, realizados segn norma Argentina

Tabla 3-9. Resultados de la prdida por calentamiento g /100g de propleos 2,51 2,06 2,22 Media aritmtica 2,26 Desviacin estndar 0,23 Valor aceptado Mximo 10,0g/100g

Anlisis 1 2 3

Tabla 3-10. Resultados de la determinacin de cenizas g /100g de propleos 1,66 1,36 1,51 Media aritmtica 1,51 Desviacin estndar 0,15 Valor aceptado Mximo 5,0g /100g

Anlisis 1 2 3

Tabla 3-11. Resultados de la determinacin de sustancias extrables en n-hexano g /100g de propleos 22,60 28,47 26,03 Media aritmtica 25,7 Desviacin estndar 2,95 Valor aceptado Mximo 35,0g /100g

Anlisis 1 2 3

Tabla 3-12. Resultados de la determinacin de resinas solubles en etanol g /100g de propleos 49,67 48,13 46,24 Media aritmtica 48,01 Desviacin estndar 1,72 Valor aceptado Mnimo 35,0g /100g

Anlisis 1 2 3

Tabla 3-13. Resultados de la determinacin de impurezas mecnicas

Anlisis 1 2 3

g /100g de propleos 10,38 9,95 11,08

Media aritmtica 10,47

Desviacin estndar 0,57

Valor aceptado Mximo 25,0g /100g

Tabla 3-14. Resultados de la determinacin de compuestos fenlicos totales g /100g de propleos 10,35 9,84 9,96 Media aritmtica 10,05 Desviacin estndar 0,27 Valor aceptado Mnimo 5,0g /100g

Anlisis 1 2 3

Tabla 3-15. Resultados de la determinacin de flavonoides totales g /100g de propleos 2,75 2,77 2,75 Media aritmtica 2,76 Desviacin estndar 0,01 Valor aceptado Mnimo 1,0g /100g

Anlisis 1 2 3

Tabla 3-16. Resultados de la determinacin del ndice de oxidacin ( segn norma Argentina) ndice de oxidacin (s) 7,83 7,62 7,56 Media aritmtica 7,67 Desviacin estndar 0,14 Valor aceptado Mx. 22s

Anlisis 1 2 3

Tabla 3-17. Resultados determinacin del espectro de absorcin UV-visible Mximo de absorbancia 290nm 300nm Media aritmtica 293,93 Desviacin estndar 5,77 Valor aceptado (Mx. de absorbancia) entre 270-315nm

Anlisis 1 2

290nm

Tabla 3-18.Caractersticas fisicoqumicas del propleos analizado, segn norma Argentina

Caractersticas fisicoqumicas (*)Prdida por calentamiento (*)Cenizas (*)Sustancias extrables en n-hexano (*)Resinas solubles en etanol (*) Impurezas mecnicas (*)Compuestos fenlicos totales (*)Flavonoides totales ndice de oxidacin(s) Espectro de absorcin UV- visible(nm)

Resultado 2,26 0,23 1,51 0,15 25,7 2,95 48,01 1,72 10,47 0,57 10,05 0,27 2,76 0,01 7,670,14 293,93 5,77

Valor aceptado Mximo 10,0g/100g Mximo 5,0g /100g Mximo35,0g/100g Mnimo 35,0g/100g Mximo 25,0g/100g Mnimo 5,0g/100g Mnimo1,0g/100g Mximo 22s Mx. de absorbancia entre 270-315nm

(*) = resultado expresado en g/100g de propleos.

DISCUSIN

Con respecto a las caractersticas organolpticas del propleos analizado (tabla 3-1), determinadas por un grupo de diez apicultores semientrenados a travs de un anlisis descriptivo de categorizacin cuantitativa relativa, utilizando el protocolo de la UNSE-INTA (anexo B); el color marrn verdoso que presenta el propleos, se debe al tipo de vegetacin existentes en cercana del apiario y la flora predomnate en la zona. El aspecto externo (trozos irregulares con brillo) y estructura (heterognea) no difieren en forma significativa con otros propleos nacionales e internacionales, que se presentan en trozos irregulares, el brillo se debe a la cera de abeja presente en el propleos. Su heterogeneidad se debe a que el propleos es una mezcla compleja que se vuelve ms heterognea utilizando el mtodo de recoleccin de raspado. El olor del propleos (muy aromtico), demuestra que el propleos es un producto natural aromtico, a pesar de su baja concentracin en aceites esenciales [3]. El sabor que presenta el propleos (amargo) es atribuido a las resinas y algunos compuestos qumicos presentes en el propleos. La consistencia a T ambiente del propleos (poco blando a los 20C) tiene directa relacin con caractersticas geogrficas y climticas de la zona de la cual se tom la muestra, ya que Casablanca se caracteriza por ser un valle prelitoral que presenta un clima ms bien fro, neblinas matinales y una amplitud trmica entre el da y la noche. La temperatura media del verano es de 25C y la anual es de 14,4C, los meses amenazantes con heladas son Agosto y Octubre, de Noviembre (mes de recoleccin del propleos) a Abril se considera ms bien seco. En cuanto a las impurezas visibles presentes en el propleos (virutas de madera, restos de pintura y partes de abejas) principalmente se debe al mtodo de recoleccin utilizado.

Segn los resultados de los anlisis realizados a travs de la norma Rusa (tabla 3-8), el propleos presenta un ndice de oxidacin de 8,25 0,69 s, atribuido a los compuestos fenlicos presentes en el propleos, este resultado depende de la subjetivada y criterio analtico por parte del analista, ya que se estima el tiempo en que desaparece el color rosado de la solucin, cumpliendo con el valor exigido en la norma; un ndice de yodo de 61,90 1,27 gI2/100g de muestra, representando el grado de insaturacin de las grasas o cidos grasos presentes en el propleos, cumpliendo con el valor exigido en la norma; a dems presenta reaccin positiva ante la presencia de compuestos fenlicos, cumpliendo con los parmetros de calidad exigidos para estos anlisis; no as el porcentaje de impurezas mecnicas obtenido (36,24 1,34%), el porcentaje de cera (38,34 2,10%) y porcentaje de compuestos fenlicos (8,62 1,36%). El no cumplimiento de estos parmetros de calidad se debe al mtodo de raspado utilizado para la recoleccin del propleos, lo que determin la incorporacin al producto de distintos tipos de impurezas: astillas de madera, cera, partes de abejas, restos de pinturas, etc. que en algunos casos se pueden separar del propleos y en otros casos quedan incorporadas, disminuyendo la calidad del mismo. Los resultados obtenidos a travs de las metodologas estipuladas en la norma Rusa, pueden estar condicionados por una serie de factores analticos, como la falta de experiencia por parte del analista en el desarrollo de estos anlisis; perdidas de muestras en el desarrollo de los anlisis, etc. Ya que la mayora de las determinaciones se realizaron a travs de anlisis gravimtricos. De acuerdo a los resultados obtenidos de los anlisis fisicoqumicos realizados al propleos, segn la norma Argentina (tabla 3-18) el propleos presenta un 2,26 0,23% de prdida por calentamiento; 1,51 0,15% de cenizas, que representa la materia inorgnica presente en el propleos; 25,7 2,95% de sustancias extrables en n-hexano, obtenindose un menor porcentaje con respecto al porcentaje de cera obtenido segn la norma Rusa, ya que las metodologas analticas utilizadas son distintas; 48,01 1,72% de resinas solubles en etanol, representando la fraccin til del propleos; 10,47 0,57% de impurezas mecnica, obtenindose un porcentaje menor en comparacin al obtenido a travs de la norma Rusa, ya que la metodologa analtica utilizada es distinta; 10,05 0,27% de compuestos fenlicos totales, expresado como su equivalente en cido glico, que le otorgan las propiedades biolgicas al propleos; 2,76 0,01% de flavonoides totales, expresado como su equivalente en quercetina dihidratada, este anlisis junto con la determinacin de fenoles totales constituyen las determinaciones ms importantes ya que los flavonoides junto a los fenoles le otorgan al propleos sus propiedades biolgicas y teraputicas. Segn los resultados de ambos anlisis (determinacin de compuestos fenlicos y flavonoides totales), el propleos en estudio

cumple satisfactoriamente con los parmetros de calidad exigidos en la norma, otorgndole al propleos grandes posibilidades de comercializacin a nivel nacional e internacional.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Despus de llevar acabo los anlisis organolpticos y fisicoqumicos, realizados al propleos, en el Laboratorio de Qumica de la Universidad Tcnica Federico Santa Mara, Sede Via del Mar, Jos Miguel Carrera, se puede llegar a las siguientes conclusiones: El propleos recolectado de localidad de Tapihue, Casablanca, Quinta Regin de Chile, presenta un aspecto de trozos irregulares con brillo, una estructura heterognea, un color marrn verdoso, un olor resinoso aromtico, un sabor amargo, con una consistencia poco blanda a temperatura ambiente (20C). Adems de presentar virutas de madera, restos de pintura y partes de abejas. De acuerdo a la norma Rusa RST-RSFSR-317-77 que establece e identifica los requisitos organolpticos y fisicoqumicos mnimos exigidos, que debe cumplir el propleos para ser utilizado como materia prima en el desarrollo de productos relacionados; los resultados de las caractersticas organolpticas se sitan dentro de los parmetros de calidad exigidos por la norma mencionada. Los resultados de las propiedades fisicoqumicas, generalmente se sitan dentro de los parmetros de calidad exigidos, a excepcin del porcentaje de cera, impurezas mecnicas y compuestos fenlicos, ya que los valores de calidad exigidos en estos anlisis son muy elevados en comparacin con la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008. Segn la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008, los resultados de las propiedades organolpticas y fisicoqumicas se sitan dentro de los parmetros de calidad exigidos por la norma mencionada, sin excepcin alguna, superando en todos los casos los valores de calidad mnimos exigidos, por tanto el propleos cumple con los parmetros de calidad estipulados en esta norma internacional, y puede ser utilizado a nivel industrial y competir en el mercado externo.

Se puede concluir que realizando una adecuada recoleccin del propleos a travs del mtodo de raspado, utilizando una esptula de acero inoxidable, es posible obtener propleos que cumplan satisfactoriamente con los requisitos de calidad mnimos exigidos por la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008, a pesar de que en algunos casos no se pueden separar las impurezas mecnicas del propleos, disminuyendo la calidad del mismo.

Recomendaciones: Para analizar organolpticamente el propleos se recomienda utilizar el protocolo de la UNSE-INTA, de la Argentina, ya que los descriptores organolpticos estipulados en este protocolo, permiten una buena y completa caracterizacin organolptica del propleos, a travs de anlisis sensoriales. Se recomienda analizar y caracterizar fisicoqumicamente el propleos por la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008, ya que al comparar esta con la norma Rusa, esta permite una mayor cuantificacin de los compuestos qumicos presentes en el propleos; las tcnicas y mtodos analticos empleados en esta norma, son mas actualizados que los empleados en la norma Rusa RST-RSFSR-317-77, y permiten la cuantificacin ms precisa de los compuestos qumicos del propleos (compuestos fenlicos, flavonoides, resinas totales, sustancias extrables en n-hexano, etc.) que son muy importantes para determinar su calidad . Se considera conveniente el uso de mallas en la colmena para la recoleccin de propleos, ya que no solamente se evita la incorporacin de impurezas por raspado, sino tambin se obtiene un producto con mayor cantidad de resinas totales y compuestos fenlicos, y menor cantidad de cera, proporcionndole una mayor calidad al propleos recolectado. Este producto apcola est incrementando su demanda externa es por ello que se debe mejorar las prcticas apcolas llevadas a cabo en Chile, tanto para su recoleccin, almacenamiento y transporte; para contar con un producto de buena calidad que pueda competir a nivel internacional y al que pueda asignrsele un valor agregado .

BIBLIOGRAFA

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<http://www.ceniap.gov.ve/pbd/RevistasCientificas/ZootecniaTropical/zt2502/arti/ salamanca.htm>

ANEXOS

ANEXO A:

FOTOGRAFAS EXPERIMENTALES

Apiario seleccionado: localidad de Tapihue, Casablanca Quinta Regin de Chile

Recoleccin del propleos, por el mtodo de raspado

Muestra de propleos recolectado

ANEXO B:

PROTOCOLO DE LA UNSE-INTA

RECEPCIN DE MUESTRAS PROPLEOS EN BRUTO Nmero Identificacin Peso Remitente Observaciones Fecha Origen Recoleccin

CARACTERIZACIN ORGANOLPTICA Aspecto externo Polvo Granulado Masa irregular con brillo Masa irregular opaca Trozos irregulares opacos Trozo irregulares con brillo

Estructura
Homognea

Heterognea Consistencia a T ambiente Muy blando Blando Poco blando

Color Duro Negro Marrn Sabor Marrn oscuro Inspido Marrn claro Dulce Verde oscuro Salado Verde Amargo Verde claro Picante Gris Amarillo Olor Tintes castaos Inodoro Tintes rojizos Levemente Reinoso Tintes naranjas Resinoso Marrn verdosoResinoso aromtico Verde amarillento Resinoso muy aromtico Tintes castao rojizo Tintes castao naranja Marrn amarillento Amarillo verdoso Marrn verdoso amarillento

ANEXO C:

DETERMINACIN DE LOS ANLISIS ORGANOLPTICOS

Tabla C-1. Determinacin del color

Color Negro Marron(, Marron oscuro Marron claro Verde oscuro

Analista 5 6

10

% 0 0 0 0 0

Verde Verde claro Gris Amarillo Tintes castaos Tintes rojizos Tintes naranjas Marrn verdoso Verde amarillento Tintes castao rojizo Tintes castao naranja Marrn amarillento Amarillo verdoso Marrn verdoso Amarillento

0 0 0 0 40 0 0 60 0 0 0 0 0 0

Tabla C-2. Determinacin del sabor Analista 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % Inspido Dulce Salado Amargo X X X X X X X X 20 0 0 X 80 0 Picante

Tabla C-3. Determinacin del aspecto externo

Masa irregular con brillo

Analista

Polvo

Granulado

Masa irregular opaca

Trozos irregulares opacos

Trozo irregulares con brillo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

X X X X X X X X X X

20

80

Tabla C-4. Determinacin de la estructura Analista 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % Homognea Heterognea X X X X X X X X X X 100

Tabla C-5. Determinacin del olor Resinoso muy aromtico

Analista 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 %

Inodoro

Levemente resinoso

Resinoso X

Resinoso aromtico X X X

X X X X X 0 0 10 70 X 20

Tabla C-6. Determinacin del sabor Analista 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % Inspido Dulce Salado Amargo X X X X X X X X 20 0 0 X 80 0 Picante

Tabla C-7. Determinacin de la consistencia a temperatura ambiente Muy blando Poco blando X X X X X X X X X 80

Analista 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 %

Blando

Duro

10

10

ANEXO D:

GRFICOS PARA CURVAS DE CALIBRACIN

Ecuacin de regresin lineal fenoles totales y = bx + a Donde: a = -0,018 b = 115,9 r = 0,9990 y = 115,9x + (-0,018)

Curva de calibrado ajustada fenoles

2,50 2,00

absorbancia

1,50 1,00 0,50 0,00 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025

Concentracin (mg/ml)

Grfico D-1. Absorbancia v/s concentracin (mg/ml) de fenoles

Ecuacin de regresin lineal flavonoides totales

y = bx + a Donde: a = -0,0014 b = 0,0790 r = 0,9997 y = 0,0790x + (-0,0014)

Curva de calibrado flavonoides

0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0,00

Absorbancia

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

Concentracin (ppm)

Grfico D-2. Absorbancia v/s concentracin (ppm) de flavonoides