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FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DO PORTO

Estudos sobre Nitrificação em biofilmes de um biofiltro do tipo

MBBR (Moving Bed Biofilm Reactor) operando em água salgada

Hugo Manuel da Silva Ribeiro

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Porto, Outubro de 2008

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FACULDADE DE CIÊNCIAS
UNIVERSIDADE DO PORTO

FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DO PORTO

Estudos sobre Nitrificação em biofilmes de um Biofiltro do tipo

MBBR (Moving Bed Biofilm Reactor) operando em água salgada

Hugo Manuel da Silva Ribeiro

Dissertação submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto para obtenção do

grau de Mestre em Ciências e Tecnologia do Ambiente

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Trabalho realizado sob a orientação de cala
Professora Doutora Maria Teresa Borges Ï
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«Depart. Química
e a co-orientação de
Professora Doutora Paula M. Lima Castro

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Porto, Outubro de 2008
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 Dedico este trabalho,
À memória da minha avó Leopoldina.
 AGRADECIMENTOS

Quero deixar aqui registados os meus sinceros agradecimentos e profundo reconhecimento a todos aqueles que directa
ou indirectamente contribuíram para a realização deste trabalho, nomeadamente:

À Professora Maria Teresa Borges o meu profundo agradecimento pela confiança depositada em mim no inicio deste
trabalho, pela orientação científica, pelos conhecimentos que me proporcionou, pelas ideias durante a realização da parte
experimental do trabalho, pela disponibilidade e crítica ao longo de todo o trabalho em especial durante a escrita e revisão final da
Dissertação.

À Professora Paula Castro agradeço a disponibilidade de co-orientar esta Dissertação, assim como a oportunidade de
usufruir das instalações na Escola Superior de Biotecnologia da Universidade Católica Portuguesa para a realização da parte
experimental em Microbiologia e pela revisão final da Dissertação.

À CE, 6o Programa-Quadro, Projecto COOP-CT - n° 016869, 2006 - 2008: "Raceways - A hyperintensive fish farming
concept for lasting competitiveness and superior production", agradeço o financiamento sem o qual a realização deste trabalho
não teria sido possível.

À Direcção da piscicultura agradeço a autorização de obter material de estudo das suas instalações, e agradeço

também aos funcionários a colaboração durante as amostragens.

À Dra. Ana Matos do Laboratório de Microbiologia Aplicada - CIIMAR agradeço a transmissão dos conhecimentos e
métodos de trabalho em Microbiologia, o rigor científico imposto na transmissão desses conhecimentos, a ajuda na avaliação das
UFC de bactérias heterótroficas, a disponibilidade, e a amizade e bom ambiente de trabalho.

À Dra. Carla Peixe do Laboratório de Microbiologia Aplicada - CIIMAR agradeço os ensinamentos que me transmitiu
sobre os métodos analíticos, as preciosas dicas de como estar num laboratório de Química, a quantificação do CO2 nas amostras
de água da piscicultura, a disponibilidade e a amizade e agradável convívio.

Ao Mestre Hugo Santos do BOGA - CIIMAR agradeço o material e ferramentas que disponibilizou para a montagem
das instalações experimentais, bem como a sua amizade e companheirismo.

À Mestre Francisca Cavaleiro do Laboratório de Parasitologia (DZA-FCUP) agradeço a obtenção das fotos do
"Biofouling", simpatia e boa disposição.

À Doutora Rosário Martins e à Dra. Viviana Lopes do LEAN - CIIMAR, agradeço a ajuda na identificação das
cianobactérias existentes no "Biofouling", bem como a sua disponibilidade e simpatia.

Ao Eng.° Pedro Reis do Laboratório de Química - CIIMAR agradeço a ajuda e disponibilização de equipamento e
instalações, a boa disposição, o companheirismo e amizade.

Às alunas Anabela, Cláudia, Daniela e Sara da disciplina de Laboratório de Tecnologia Aplicada ao Ambiente -
Mestrado em Biologia 2007/2008, agradeço a ajuda no processamento das amostras de 24 horas ao Biofiltro

Ao Miguel Ângelo e Bruno Marcos, alunos do Mestrado em CTA, agradeço a disponibilidade e grande ajuda no
processamento dos dados no Statistica, bem como a amizade e companheirismo.
 À Professora Doutora Maria Eduarda Silva da FCUP, agradeço a disponibilidade e ajuda na escolha do teste para a
análise estatística dos dados.

À Doutora Sónia Dias, Dra. Leonor Araújo e ao Dr. Benjamin Costa do Laboratório de Imunobiologia - CIIMAR agradeço
a ajuda e disponibilização de equipamento e instalações.

Ao Mestre Pedro Leão do LEAN - CIIMAR agradeço a ajuda e disponibilização de equipamento e instalações.

À Dra. Alexandra do Laboratório de Ecotoxicologia - CIIMAR agradeço a ajuda e disponibilização de equipamento e

instalações.

A Dra. Filipa Mendes da ESB-UCP agradeço a disponibilização de material e equipamento

A Professora Doutora Ana Maria Delgado do Departamento de Botânica da FCUP agradeço a permissão de frequentar
as aulas de Microbiologia da disciplina de Microbiologia e Biologia dos Fungos, que colmataram uma importante lacuna
académica e que ajudaram bastante na fase inicial deste estudo.

A Professora Doutora Regina Nogueira da Universidade do Minho agradeço a disponibilização de equipamento.

Ao João Francisco e Dr. José António Macedo do CIBIO agradeço a disponibilização de vários livros de análise
estatística, e o seu companheirismo.

Ao Dr. Nuno Santos do IBMC agradeço pelo transporte de algumas amostras.

À Tânia Fonseca e à Sofia Gonçalves da RUÇA agradeço a disponibilidade e ajuda na etiquetagem dos tubos de
amostragem.

Ao Eng° Pedro Rodrigues, à D. Lurdes, à Marta, ao Jorge e aos restantes elementos do CIIMAR agradeço o convívio e
disponibilidade que apresentaram ao longo deste ultimo ano.

Aos elementos da E.S.B. agradeço o acolhimento, disponibilidade e convívio que apresentaram ao longo da minha
estadia na Universidade Católica Portuguesa.

Aos meus pais, à minha irmã, à "Bia" e restante família peço desculpa por estar "sempre" ausente, e como é óbvio não
existem palavras que descrevam o meu agradecimento à disponibilidade, ao apoio e ajuda que me deram ao longo da minha
existência.

Aos meus amigos Nelson, Vladimiro, César, Vera, Sofia, Daniel, Márcia, Sandrina, Alberto, Bruno, Abílio, João, Zé
António, Patrícia, Robi, Mariana, Hugo, Joana, Graça, Sara, Jesica, Tânia, Nevena, Ana, Marija, Sandra, Dragana, Paula, Renata,
Olávio, Jerónimo, Jean, Samuel, Sandra, Mara, sr. Álvaro, sr. Adelino, Nuria, António, Marco, João, Liliana, Sérgio, Luciana,
Ângela, Orquídea, Dora, Emma, entre outros, aos quais peço desculpa por não os referir pessoalmente, agradeço o convívio e
apoio que ao longo da execução desta Dissertação me ajudou imenso a descontrair, de forma a enfrentar o árduo trabalho com
um espírito revigorado.

BÍPORTO K T 11 Ribeiro HL 2008

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 SUMARIO

Sendo a descarga de efluentes uma preocupação ambiental premente, uma gestão eficiente da água deve incluir
o seu tratamento e também a sua reutilização. Sendo assim, é necessário estudar os sistemas de tratamento de forma a
melhorar a sua performance. Em Aquacultura com sistemas de recirculação de água, há um aumento da concentração de
Amónia e Nitritos, que são prejudiciais aos peixes. A sua eliminação faz-se por biofiltração, através da conversão de
Amónia a Nitritos e Nitritos a Nitratos via Nitrificação, mas estudos sobre tratamento biológico de efluentes salinos são
raros.

Tendo em conta este enquadramento, o trabalho efectuado baseou-se na caracterização da água de uma
piscicultura marinha com recirculação (durante um ciclo de pré-engorda e posteriormente durante 24 horas) e na avaliação
da carga de bactérias heterotróficas existentes nos suportes e na água do Biofiltro (do tipo MBBR), através da contagem de
unidades formadoras de colónias (UFC) em Marine Agar.

De forma a aumentar a carga de bactérias nitrificantes em suportes do Biofiltro, efectuou-se um enriquecimento

com o objectivo de obter suportes enriquecidos de Bactérias Oxidantes da Amónia (AOB) e Bactérias Oxidantes de Nitrito
(NOB). Foram também efectuados estudos laboratoriais em "Batch" sobre a Nitrificação, usando suportes provenientes do
biofiltro com o objectivo de avaliar as taxas de remoção de Amónia, testando o efeito da variação da percentagem de
volume de enchimento (39, 58, 78%); concentração de N-NH4+ (0.3,1.2, 3.0 mg L 1 , em Cloreto de Amónio) e salinidade
(15,20,30%o).

Na caracterização da água da piscicultura foram efectuadas análises "in situ", concretamente pH, temperatura,
oxigénio dissolvido e salinidade. Foram recolhidas amostras de água para análise laboratorial de CO2, sólidos suspensos
totais (SST); N-NH4+; N-NOr; N-NO3- entre outros parâmetros. Na amostragem de 24 horas, apenas foram retiradas
amostras para análise laboratorial de SST; N-NHr; N-NOr; N-NO3-.

Face aos resultados obtidos, verificou-se que os processos de tratamento da água aplicados na piscicultura
mantinham uma boa qualidade de água para o cultivo de peixe.

O Biofiltro apresentava boas condições de Oxigénio dissolvido, Alcalinidade e pH para a Nitrificação, embora as
concentrações de substrato, azoto sob a forma de amónia (TAN) e Nitrito, fossem muito inferior aos níveis desejados para o
desenvolvimento óptimo de bactérias nitrificantes. O valor de UFC registado era superior aos descritos na literatura
consultada, indiciando uma forte competição entre bactérias heterotróficas e bactérias nitrificantes.

Durante os estudos de Nitrificação, apareceu um biofilme não usual, designado por "Biofouling". Amostras de
"Biofouling" foram observadas ao microscópio, e foram identificados diversos microrganismos, entre os quais,
cianobactérias marinhas.

Verificou-se que existiram variações significativas na velocidade de remoção da Amónia quando se variou o
volume de enchimento e a concentração de substrato, mas não com a variação da salinidade. Isto vem corroborar a
hipótese de que o biofiltro poderá estar a operar com concentrações de substrato baixas, e que se deveria aumentar o
volume de enchimento de suportes.
 ABSTRACT

Effluent discharge is a main environmental concern and an efficient water management policy must include not
only wastewater treatment but also wastewater recycling. So, it is of outmost importance the study and development of more
performing wastewater treatment systems.

In Aquaculture facilities using water recycling, there is a build-up of ammonia and nitrite, which are harmful to fish
health. The elimination of these pollutants is achieved by biofiltration, through the conversion of ammonia to nitrite and nitrite
to nitrate via nitrification, but studies on biological treatment of saline effluents are rare.

Having in mind this background, the present work addressed the characterization of the water used in a marine fish
farm with water recycling (during a production cycle, and later during 24 hours) and the evaluation of heterotrophic bacterial
load in the carriers and in the Biofilter (MBBR) water by CFU counting of Marine Agar plates.

To increase the autotrophic load in the carriers of the studied biofilter, enrichment protocols were elaborated aiming
at obtained AOB and NOB enriched carriers. Controlled Nitrification experiments with biofilter carriers focused on the effects
of the percentage of biofilter carrier filling (39, 58, 78%), ammonia concentration (0.3,1.2, 3.0 mg L-1 NH4-N, as Ammonium
Chloride) and salinity (15,20,30%o) on the ammonium removal rates.

In the characterization of the fish farm water, some analyses were carried out in situ, such as pH, temperature,
dissolved oxygen and salinity. Specific samples were collected for CO2, TSS, NHr-N, NO2--N, NO3--N and others
parameters laboratory analysis. In the 24 hours study, samples here taken only for TSS, NHr-N, NOr-N, NO3--N analysis.

Given the results obtained, it appeared that the water treatment processes applied in the fish farm maintained a
good water quality for fish growing.

The biofilter had good conditions of dissolved oxygen, alkalinity and pH for nitrification, but the substrate
concentration, TAN and Nitrite, was much lower than the levels for the optimal development of nitrifying bacteria. The
number of CFU was superior to those described in the literature and it suggests a strong competition between nitrifying and
heterotrophic bacteria.

During this studies, a not common biofilm showup, labelled as "Biofouling". "Biofouling" samples were observed
under the microscope, and several microorganisms were identified, including, marine cyanobacteria.

It was found that there were significant variations in the Ammonia removal rate when carrier filling percentage and
the substrate concentration were varied, but not with salinity change. This corroborates the hypothesis that the biofilter could
be operating with low substrate concentrations, and that the carriers filling percentage should increased.

DiPORTO E H iv Ribeiro H.. 2008

 ÍNDICE
l
AGRADECIMENTOS

m
SUMARIO

ABSTRACT IV

1 INTRODUÇÃO "1-

1.1 ENQUADRAMENTO -1 -

1.2 ESTADO DA ARTE -2-

1.2.1 Qualidade da água para os peixes -2-

1.2.2 Nitrificação - ^-

1.2.2.1 Processo global e Microbiologia -4 -

1.2.2.2 Considerações bioquímicas -5 -

1.2.3 Reactor de Biofilme de Leito Móvel ("Moving Bed Biofilm Reactor") - 6-

1.2.4 Biofilme -7-

1.2.5 Factores que afectam a Dinâmica do Biofiltro -8-

1.2.5.1 Concentração de TAN e Nitrito -8-

1.2.5.2 Oxigénio -9-

1.2.5.3 Carbono orgânico - 10-

1.2.5.4 Temperatura -H-

1.2.5.5 pH -11-

1.2.5.6 Alcalinidade -12-

1.2.5.7 Salinidade - 13-

1.2.5.8 Tipo de suporte e Área especifica de superfície - 14 -

1.2.5.9 Outros parâmetros que podem afectar a performance do Biofiltro - 14 -

1.3 OBJECTIVOS -15-

1.4 ORGANIZAÇÃO DA DISSERTAÇÃO -16-

2 METODOLOGIA USADA -17-

2.1 CARACTERÍSTICAS DA PISCICULTURA -17-

2.2 METODOLOGIA E MATERIAIS -18-

2.2.1 Amostragem e análise à água da piscicultura -18 -

2.2.1.1 Metodologia de cálculo da Eficiência do Biofiltro - 19-

2.2.2 Avaliação das UFC de Bactérias Heterotróficas no Biofiltro -19 -

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 2.2.3 Enriquecimento em AOB e NOB -20 -

2.2.3.1 Enriquecimento sem bomba de arejamento - 20 -

2.2.3.2 Enriquecimento com bomba de arejamento - 20 -

2.2.4 Estudos sobre Nitrificação -22 -

2.2.4.1 Ensaio preliminar e ensaios sem aclimatação - 23 -

2.2.4.2 Período de "Starvation" para remoção do "Biofouling" - 23 -

2.2.4.3 Avaliação da Taxa de Remoção de Amónia - 24 -

2.2.4.4 Metodologia de cálculo de k, rNH4 e %NT - 25 -

2.2.4.5 Análise Estatística de k - 26 -

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO - 27 -

3.1 ANÁLISE À ÁGUA DA PISCICULTURA -27-

3.1.1 Ciclo depré-engorda - 27 -

3.1.2 Actividade do Biofiltro em Vinte e quatro horas - 30 -

3.2 CONTAGEM DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS - 32 -

3.3 ENRIQUECIMENTO EM AOB E NOB -33-

3.4 ESTUDOS SOBRE NITRIFICAÇÃO -35-

3.4.1 Ensaio preliminar - 35 -

3.4.2 Interferência do "Biofouling" - 36 -

3.4.3 Taxas de Remoção de Amónia. - 39 -

3.4.3.1 Efeito do Volume de Enchimento - 39 -

3.4.3.2 Efeito da Concentração do Substrato - 41 -

3.4.3.3 Efeito da Salinidade -43-

4 CONCLUSÕES E SUGESTÕES DE TRABALHO FUTURO - 45 -

4.1 CONCLUSÕES -45-

4.2 SUGESTÕES DE TRABALHO FUTURO - 46 -

5 BIBLIOGRAFIA -47-

ANEXOS A

ANEXO 1 B

ANEXO 2 c

ANEXO 3 D

HPORTO vi Ribeiro H.. 2008

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 ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1: Parâmetros gerais da qualidade da água para a cultura de peixe em RAS -2-

Tabela 2: Parâmetros analisados nas amostragens efectuadas na piscicultura -18-

Tabela 3: Desenvolvimento temporal do processamento dos suportes desde amostragem ao Ensaio Laboratorial- 22 -

Tabela 4: Valores de Fosfatos, Alcalinidade Total e Salinidade naRC-E (AC) e na água nova - 27 -

Tabela 5: Valores de Fosfatos, Alcalinidade Total e Salinidade no Biofiltro (Entrada e Saída), AC. - 29 -

Tabela 6: Valores dos parâmetros ambientais nos ensaios para avaliação das taxas de Remoção de Amónia - 39 -

Tabela 7: Resultados relativos ao Teste de Kruskal-Wallis aplicado aos dados referentes à variável VE - 40 -

Tabela 8: Valores de k, rNH4 e %NTno ensaio referente à variável Volume de Enchimento - 40 -

Tabela 9: Resultados relativos ao Teste de Kruskal-Wallis aplicado aos dados referentes à variável CS - 41 -

Tabela 10: Valores de k, rNH4 e %NTno ensaio referente à variável Concentração de Substrato - 42 -

Tabela 11: Resultados relativos ao Teste de Kruskal-Wallis aplicado aos dados referentes à variável Salinidade- 43 -

Tabela 12: Valores de k, rNH4e %NTno ensaio referente à variável Salinidade - 44 -

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 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Ciclo do Azoto num RAS equipado com um Biofiltro -1 -

Figura 2: Estados de oxidação do Azoto no processo de Nitrificação -4-

Figura 3: a) A forma do suporte Kaldnes Kl. b) O princípio de um "Moving Bed Biofilm Reactor" - 6-

Figura 4: Crescimento das bactérias nitrificantes e bactérias heterotróficas no Biofilme - 7-

Figura 5: Taxa de remoção de Amónia num Biofiltro a operar com água salina e varias concentrações de TAN... -8 -

Figura 6: Perfis de variação da concentração de substrato em biofilmes heterotróficos-autotróficos -9-

Figura 7: Influência da concentração de OD e TAN na remoção de TAN num MBBR a 15°C. -10 -

Figura 8: Efeito da concentração de MOP na eficiência da Nitrificação de um Biofiltro -10 -

Figura 9: Influência da Alcalinidade epH na taxa de remoção de TAN num MBBR. Salinidade 23%o -13 -

Figura 10: Taxa de remoção de N-NH/ em função da concentração de NH/ em água doce e do mar. -13 -

Figura 11: Representação esquemática da piscicultura estudada e dos pontos amostrados -17 -

Figura 12: ilustração esquemática para contagem de bactérias pelo Método por espalhamento -19 -

Figura 13: Esquema da Instalação experimental para o Enriquecimento sem bomba de arejamento - 20 -

Figura 14: Esquema da Instalação experimental para o Enriquecimento com bomba de arejamento - 21 -

Figura 15: Esquema da Instalação experimental utilizada para remoção do "Biofouling" - 23 -

Figura 16: Esquema da Instalação experimental utilizada para avaliação das taxas de Remoção de Amónia - 25 -

Figura 17: Perfis de concentração dos parâmetros na RC-E e água nova, AC. - 27 -

Figura 18: Perfis de concentração dos parâmetros das amostras no Biofiltro (Entrada e Saída), AC. - 28 -

Figura 19: Perfis de concentração dos parâmetros no RC-E e Biofiltro (DC) -29 -

Figura 20: Perfis de concentração de N-NH/ e N-N02~ nas amostras de 24 horas ao Biofiltro - 30 -

Figura 21: Eficiência na remoção de N-NH/ e N-N02~ no Biofiltro durante as 24 horas amostradas - 31 -

Figura 22: Perfis de concentração de N-N03~ e SSTnas amostras de 24 horas ao Biofiltro - 31 -

Figura 23: Eficiência na remoção de N-N03~ e SSTno Biofiltro durante as 24 horas amostradas - 32 -

HPORTO |££T viii Ribeiro IL 2008

Figura 24: Perfis do número de UFC de BH em suspensão na água e nos suportes do Biofiltro - 32 -

Figura 25: Perfis dos valores de inibição e variação dopHno meio de enriquecimento - 34 -

Figura 26: Perfis de UFC de BH inoculados em MAuA a partir dos suportes do meio de enriquecimento - 35 -

Figura 27: Perfis da concentração de N-NH/ e N-N02' no ensaio preliminar. - 36-

Figura 28: Perfis da concentração de N-NH/ e N-N02~ nos ensaios influenciados pelo "Biofouling" - 36 -

Figura 29: Observação ao microscópio de preparações afresco de amostras de "Biofouling" em 05 de Junho.. - 37 -

Figura 30: Observação ao microscópio de preparações afresco de "Biofouling" em 15 de Setembro - 38 -

Figura 31: Perfis da concentração de N-NH/; N-N02' e N-NO{ variando o Volume de Enchimento - 39 -

Figura 32: Perfis da concentração de N-NH/; N-N02~ e N-N03' variando a Concentração de Substrato - 41 -

Figura 33: Perfis da concentração de N-NH/; N-N02~ eN-N03~ variando a Salinidade -43 -

Anexo 1.1: Gráfico de Caixa e Bigodes para grupos referentes ao ensaio da variável Volume de Enchimento b

Anexo 1.2: Linhas de Tendência da variável Volume de Enchimento utilizadas para efectuar os cálculos de Taxas.. b

Anexo 2 . 1 : Gráfico de Caixa e Bigodes para grupos referentes ao ensaio da variável Concentração de substrato.... c

Anexo 2.2: Linhas de Tendência da variável Concentração de Amónia utilizada para efectuar os cálculos de Taxas, c

Anexo 3 . 1 : Gráfico de Caixa e Bigodes para grupos referentes ao ensaio da variável Salinidade d

Anexo 3. 2: Linhas de Tendência da variável Salinidade utilizadas para efectuar os cálculos de Taxas d
 ABREVIATURAS I SÍMBOLOS

Abreviaturas
AC - Antes da alimentação dos peixes

AMO - Enzima amónio-monoxigenase

AOB - Bactérias Oxidantes de Amónio ("Ammonia Oxidizing Bactéria")

BH - Bactérias Heterotróficas

BN - Bactérias Nitrificantes

C/N - Razão Carbono / Azoto

CS - Concentração do Substrato

DC - Depois da alimentação dos peixes

EPS - Substancias Poliméricas Extracelulares ("Extracellular Polymeric Substances")

Ho - Hipótese nula

HAO - Enzima hidroxilamina oxidoreductase

HDX - Hidroxilamina

K-W - Kruskal-Wallis

MAuA - Meio Autotrófico com Agar

MBBR - "Moving Bed Biofilm Reactor" (Reactor de Biofilme de Leito Móvel)

MO - Matéria Orgânica

MOP - Matéria Orgânica Particulada

MSG - Meio de Sílica Gel

NOB - Bactérias Oxidantes de Nitrito ("Nitrite Oxidizing Bactéria")

NOR - Enzima nitrito-oxidoreductase

OD - Oxigénio Dissolvido

RAS - Sistemas de Aquacultura com Recirculação ("Recirculating Aquaculture Systems")

RC-E - Água recirculada à entrada do "Raceway"

S - Salinidade

SST - Sólidos Suspensos Totais

T - Temperatura

Ribeiro H.. 2008

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 TAN - Azoto sob a forma de Amónia Total ("Total Ammonia Nitrogen")

TOC - Carbono Orgânico Total ("Total Organic Carbon")

TRH - Tempo de Retenção Hidráulico

UFC - Unidades Formadoras de Colónias

VE - Volume de Enchimento

Símbolos

P - Área de superfície efectiva do suporte

k - Coeficiente da equação

% NT - Percentagem de Amónia removida por Nitrificação.

V - Rendimento celular

rc -Taxa de conversão

umax - Taxa específica máxima de crescimento

rNhU - Taxa de Remoção de Amónia

14J - Volume de meio utilizado

XI
/ ^ @
 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

1 INTRODUÇÃO
1.1 Enquadramento
Sendo a descarga de efluentes uma preocupação ambiental premente, aliada a uma diminuição da disponibilidade
de recursos hídricos com qualidade, sejam superficiais ou subterrâneos, é aconselhado que uma gestão eficiente da água
deva incluir para além do seu tratamento, a sua reutilização.

Os impactos produzidos no Ambiente, a legislação sobre a descarga de efluentes, bem como a necessidade de
conservar os recursos hídricos e energia, impeliu a Industria de Aquacultura a estudar os sistemas de tratamento da água de
forma a melhorar a sua performance, com foco no desenvolvimento e refinamento de tecnologias de recirculação, aplicadas
principalmente aos Sistemas de Aquacultura com Recirculação de água (RAS). Os RAS oferecem soluções para a cultura
intensiva de peixe, controlando a qualidade da água que é continuamente tratada e recirculada (Piedrahita, 2003),
providenciando condições adequadas para um crescimento optimizado (Losordo et ai., 1999).

Os processos de tratamento da água aplicados em Aquacultura são classificados em físicos, químicos e biológicos
(Crab et ai., 2007). O tratamento físico (com sedimentadores e filtro mecânico) remove partículas sólidas que podem
colmatar as guelras dos peixes, entre outros aspectos. O método químico refere-se geralmente à utilização de ozono, que
remove por oxidação vários compostos que influenciam a qualidade da água e ajuda na desinfecção da mesma, O
tratamento biológico ocorre, em geral, num Biofiltro, onde as bactérias (normalmente na forma de um Biofilme) realizam
principalmente o processo de Nitrificação, que consiste na remoção do Azoto sob a forma de Amónia Total (TAN), composto
pela soma de NhU* e do NH3, e do NO2- formado a partir da oxidação biológica do TAN, Fig. 1. O TAN é um subproduto do
metabolismo das proteínas do alimento assimilado pelos peixes, sendo também produzido pela decomposição bacteriana de
produtos sólidos orgânicos presentes no sistema de cultura.

No Biofiltro ocorre a formação de Biofilme, geralmente em suportes apropriados (fixos ou móveis, dependendo do
tipo de Biofiltro) que vai metabolizar o TAN formando NOr, e de seguida NO3-. O NOy tende a acumular-se na água do RAS,
sendo considerado menos tóxico para os peixes do que o NOr e o NH3.
Alimento

Peixe
Bactérias num
Biofiltro

« •
TAN

Alimento não
Fezes
ingerido

H,0 RAS

Figura 1: Ciclo do Azoto num RAS equipado com um Biofiltro.

Adaptado de Crab et ai., 2007.

A maioria dos RAS tem prevista uma renovação diária da água usada de 5 a 10% do volume total de água do
sistema, isto de forma a prevenir a acumulação de NOr e Matéria Orgânica (MO) solúvel que podem eventualmente causar

^ @ -1
INTRODUÇÃO

problemas ao sistema (Masser et ai., 1999). Alguns RAS podem ainda estar equipados com sistemas de Desinfecção,
geralmente UV ou Ozonização, para controlar o crescimento de agentes patogénicos e de bactérias heterotróficas (BH)
(Sharrer & Summerfelt, 2007).

Os RAS reduzem as suas necessidades de água usando sistemas de tratamento complexos após a passagem da
água pelos tanques de cultura (Losordo et ai., 1998). Das várias tecnologias de tratamento existentes, o tratamento biológico
é considerado o método mais económico para aquacultura (Rijn, 1996), mais concretamente os bioreactores com biofilme
fixo pois são mais estáveis do que os sistema de biofilme em suspensão (Malone & Pfeiffer, 2006). A utilização dos Biofiltros,
particularmente em ambientes marinhos, necessita de pesquisas adicionais para melhorar o seu desempenho, mais
concretamente quanto a identificação bacteriana e a dinâmica populacional (Gutierrez-Wing & Malone, 2006).

Sabendo que estudos sobre tratamento biológico de efluentes salinos são raros, esta Dissertação recaiu em
estudos sobre Nitrificação, utilizando material de estudo proveniente duma Piscicultura que emprega um Biofiltro do tipo
Moving Bed Biofilter Reactor (MBBR) como tratamento biológico, e que opera em água salgada.

1.2 Estado da Arte

Neste sub-capítulo efectuou-se uma revisão bibliográfica que permitiu clarificar alguns conceitos fundamentais para
a compreensão deste trabalho. Recaiu sobre factores que afectam a qualidade da água necessária ao cultivo de peixes; a
Nitrificação (o processo, a microbiologia e a bioquímica desse mesmo processo); o MBBR; o Biofilme; e os factores que
influenciam o processo de Nitrificação num Biofiltro.

1.2.1 Qualidade da água para os peixes

Existem vários parâmetros que devem ser considerados na avaliação da qualidade da água recirculada, como a
concentração de oxigénio dissolvido (OD), TAN, NO2-, dióxido de carbono (CO2), a Temperatura (T), sólidos suspensos totais
(SST), Salinidade, pH, compostos de Fósforo, entre outros (Masser et al„ 1999; Colt, 2005). O controlo de TAN e NOr, que
mesmo a baixas concentrações são prejudiciais aos peixes, deve ser um dos principais objectivos do sistema de tratamento
do RAS (Losordo, et ai. 1999), pois muitas vezes o TAN é o parâmetro chave que vai limitar a qualidade da água (Zhu &
Chen, 1999). O Biofiltro deve estar dimensionado de forma a serem atingidos eficientemente os limites seguros dos
parâmetros de qualidade da água (Tab. 1), de forma a evitar o stress, doenças e mortalidade dos peixes (Wheaton et ai.,
1994).

Tabela 1: Parâmetros gerais da qualidade da água para a cultura de peixe em RAS

Parâmetro Intervalo Referância
N-Nhb (mg/L) < 0.0125 Meade,1985

N-NO2- (mg/L) <1.0 Losordo et ai, 1998

N-NO3- (mg/L) <300 Masser et ai, 1999

OD (mg/L) >6.0 Losordo e tal, 1999

Temperatura (°C) Depende da espécie cultivada Masser et ai, 1999

C02(mg/L) <20 Losordo e tal, 1998

PH 6-9.5 Masser et ai, 1999

HPORTO c r -2- Ribeiro H.. 2008

 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

Não existe uma concentração de NH3 que seja segura, e, em muitos casos esta deve ser inferior a 0.0125 mgL-1
(Meade, 1985). O NH3 é extremamente tóxico devido à sua capacidade de se mover através da membrana das células (Colt,
2005), não estando ainda definidos os seus efeitos sub-letais (Losordo et ai., 1998). Contudo, a sua concentração no RAS
depende do pH, Temperatura e da salinidade (Huguenin & Colt, 1989; Chen et al., 2006). Ou seja, a fracção de NH3 no TAN
aumenta com o acréscimo da temperatura e/ou pH (Masser et ai., 1999); no entanto, a sua toxicidade diminui com o aumento
da Salinidade da água (Colt, 2005), pois a concentração decresce ligeiramente devido à maior força iónica (Constable et ai.,
2003).

O NO2- deve permanecer abaixo de 1 mgL-1, e nunca deverá exceder pontualmente os 10 mgL-1, e a sua
perigosidade reporta-se ao facto de ele se combinar no sangue com a hemoglobina, obtendo-se metahemoglobina que não
tem capacidade para fixar o oxigénio, e por conseguinte, de o transportar (Losordo et ai., 1998). Uma das formas para reduzir
a sua perigosidade em sistemas de água doce é aumentando a concentração de Cl- na água (Masser et ai., 1999; Colt,
2005).

O NO3- é o produto final da Nitrificação, que se acumula no RAS, e é relativamente não tóxico para os peixes,
excepto a concentrações muito elevadas, superiores a 300 mgL-1 (Masser et ai., 1999).

Os RAS devem manter concentrações adequadas de OD, geralmente superiores a 6 mgL 1 , para uma melhor taxa
de crescimento dos peixes. Estas concentrações são geralmente obtidas por Arejamento ou Oxigenação à entrada dos
tanques de cultura (Losordo et ai., 1999). Pode haver um rápido declínio no OD durante a digestão, isto porque a taxa de
respiração dos peixes aumenta dramaticamente, processo que leva também à produção de CO2. Este CO2 pode acumular-se
no RAS, e para concentrações superiores a 20 mgL-1 interfere no consumo de Oxigénio; contudo não é muito tóxico quando
existem elevadas concentrações de OD (Losordo et ai., 1998). O CO2 formado pode baixar o pH do RAS, reduzindo também
a fracção de NH3 (Eshchar et ai., 2006); no entanto, esta alteração depende da Alcalinidade Total existente no sistema (Colt,
2005).

Os peixes geralmente toleram um pH entre 6 a 9.5, embora uma mudança drástica de duas ou mais unidades de pH
seja nociva (Masser et ai., 1999); níveis de pH inferiores a 4.5 são extremamente perigosos para os peixes (Losordo et ai.,
1998). Um valor baixo de pH aliado a uma Alcalinidade Total baixa pode ser importante na deposição de Alumínio nas
guelras (Colt, 2005). O pH da água pode também afectar outros parâmetros da qualidade da água e, como já foi referido,
levar à formação de NH3, sendo por isso um parâmetro importante a monitorizar, assim como a Alcalinidade Total, devido à
sua capacidade tampão (Losordo et ai., 1998).

Um dos problemas mais complicados de gerir no RAS é a matéria particulada. Estima-se que 60 % do alimento
introduzido no sistema acabe como material particulado (SST), que deve ser removido dos tanques de cultura o mais
rapidamente possível, de forma a providenciar uma adequada qualidade da água (Masser et ai., 1999). A remoção de SST
pode efectuar-se por decantação ou por filtração mecânica, e a sua não remoção do RAS pode limitar a quantidade de peixe
que se pode cultivar no sistema ou irritar as guelras dos peixes, o que resulta em stress e aumenta a susceptibilidade a
doenças (Rijn, 1996).

A «
INTRODUÇÃO

0 Ozono (O3) é utilizado para melhorar a qualidade da água por redução de carbono orgânico total (TOC), NOy,
cor, SST, Turbidez, TAN e NO2­ (Krumins et ai., 2001; Tango & Gagnon, 2003). Contudo, o uso de O3 em RAS está limitado
devido ao seu preço e ao potencial tóxico que o Bromato, formado pela oxidação do Brometo natural da água salina, tem nos
Humanos e peixes, devendo existir em concentrações inferiores a 10 |jgL 1 (Tango & Gagnon, 2003). A desinfecção da água
recirculada por O3 é também uma forma alternativa ao tratamento das doenças com químicos e antibióticos (Losordo et ai.,
1999).

1.2.2 Nitrificação

1.2.2.1 Processo global e Microbiologia

O processo de Nitrificação consiste na oxidação biológica de NH4" a NO3­ em condições aeróbias, e na Figura 2 é
apresentada a sequência normal do processo e as respectivas alterações no estado de oxidação do azoto.

­3 0 +3 +5

N H 4 + ■► [ N H 2 O H ] ­ » ­ [ H N O ] ? — ► N 0 2 " —*■ N 0 3 "

Figura 2: Estados de oxidação do Azoto no processo de Nitrificação.

Adaptado de Hagopian e Riley, 1998 e Metcalf & Eddy, 2003.

Existem dois grupos de bactérias aeróbias quimiolitoautotróficas da família Nitrobacteraceae, filogeneticamente

distintos, que conjuntamente efectuam a Nitrificação em duas etapas sequenciais: as bactérias oxidantes da amónia (AOB) e
as bactérias oxidantes do nitrito (NOB). Na Natureza estas bactérias são o grupo mais importante de organismos que
produzem NO2­ e NO3­ a partir de TAN, embora algumas BH e fungos tenham sido reportados como produtores de NOr e
NO3­, mas em baixas concentrações e geralmente utilizando fontes de azoto orgânico em vez de TAN (Watson et al., 1989).
As bactérias nitrificantes (BN) obtêm energia a partir da oxidação de compostos inorgânicos de azoto e utilizam CO2 como
fonte de carbono para produção de biomassa (Hagopian & Riley, 1998).

A Nitrificação é um processo lento, facto que está relacionado com a baixa taxa específica máxima de crescimento
(umax) das BN e o seu baixo Rendimento celular (Yj. Sob condições ideais, o tempo de duplicação poderá ser 7 a 8 horas,
muito inferior ao das BH (Hagopian & Riley, 1998); no entanto, nos RAS, as BN podem chegar a representar 20% do rRNA
eubacteriano total (Hovanec & Delong, 1996).

A primeira etapa do processo de Nitrificação é designada por Nitritação, Eq. (1), e é mediada por AOB do género
Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus, e Nitrosovibrio, que têm sido isoladas a partir do solo, oceanos,
rios, e sistemas de tratamento de efluentes, ou seja, de muitos ambientes aeróbios onde a MO está a ser mineralizada
(Watson et ai., 1989). Como estas bactérias têm um prolongado tempo de geração, é bastante difícil obter culturas puras a
partir de meios de enriquecimento, podendo ser necessário esperar vários meses. Estas culturas devem ser mantidas na
escuridão, pois as BN são fotossensíveis (Watson et ai., 1989; Aakra et ai., 1999; Tomiyama et ai., 2001).

A segunda etapa é designada por Nitratação, Eq. (2), e é mediada por NOB do género Nitrobacter, Nitrococcus,
Nitrospira e Nitrospina, que são encontradas nos mesmos ambientes que as AOB; no entanto, têm um tempo de geração

HPORTO F 3 -4- Ribeiro H.. 2008

 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE:

maior, pelo que poderá demorar mais de um ano a obtenção de culturas puras nas mesmas condições que as AOB (Watson
et al., 1989).

As Equações estequiométricas que descrevem a oxidação de NH4+ e oxidação de NO2" (Chen et ai., 2006) são:

NH*+Y202 >N02~ +H20 + 2H+ (1)

N02~ + Y2 02 > NO,' (2)

Desde o século XIX que microbiólogos, cientistas ambientais e engenheiros contribuíram para um vasto
conhecimento sobre o processo de Nitrificação global; contudo, informação descrevendo a Fisiologia, Bioquímica e
comportamento ecológico das AOB e NOB continua escasso (Arp & Bottomley, 2006).

1.2.2.2 Considerações bioquímicas

A reacção química comummente referida na literatura como descrição da Nitritação, Eq. (1), é uma simplificação do
processo catabólico real que envolve reacções bioquímicas de oxidação-redução.

A maior parte dos estudos sobre o metabolismo das AOB foram realizados com Nitrosomonas e sugerem que o
NH3, e não o N I V , é utilizado como substrato (Suzuki et ai., 1974; Watson et ai., 1989). Para este género de bactérias, a
oxidação de NH3 a NO2- ocorre em duas fases. Numa primeira fase, Eq. (3), a Nitritação é iniciada na membrana
citoplasmática onde o NH3 é oxidado a hidroxilamina (HDX) pela enzima da membrana, a amónio-monoxigenase (AMO).
Depois, a HDX é transportada para o periplasma, e vai dar origem ao complexo HNO, um intermediário de vida curta, Eq. (4).
Na primeira fase, Eq. (3), é necessário directamente oxigénio (O2), mas na segunda fase, Eq. (4), o O2 não participa
directamente na formação de NOr, em vez disso a H2O é dissociada (desidrogenação) pelo complexo enzimático
hidroxilamina oxidoreductase (HAO), produzindo a energia necessária para a reacção global (Watson et ai., 1989; Hagopian
& Riley, 1998). Note-se que a acidificação do meio é apenas devida á segunda fase da Nitritação, Eq. (4), o que torna
imperativo que a Alcalinidade Total no RAS seja elevada, de forma a evitar a formação de Acido Nitroso (HNOr), Eq. (5), que
é inibidor da Nitratação (Hagopian & Riley, 1998).

mo
NH3 +Y202 >NH2OH (3)

HAO
NH2OH + H20 >(HNO) + 2[H+ +e~]+H20 >N02~ + H+ +4[fí+ +e~j (4)

N02~ +H+ +A[H+ +<r]< >HN02+4[H+ +e~] (5)

As AOB são quimiolitotróficas obrigatórias, e o crescimento óptimo ocorre para uma concentração de substrato
entre 2 a 10 mM, embora a maioria destas bactérias possam crescer em condições mixotróficas, utilizando piruvato, glucose
ou o acetato, como fonte de carbono. O crescimento heterotrófico nunca foi demonstrado (Watson et ai., 1989).

AA ©;
INTRODUÇÃO

Na segunda etapa, Nitratação, a maioria dos estudos fisiológicos e bioquímicos sobre o metabolismo das NOB
foram efectuados com as bactérias do género Nitrobacter. Para além da via clássica Eq. (2) baseada numa oxidação, a
Nitratação pode acontecer através de uma série de reacções de Desidrogenação, de acordo com a Eq.(6) e Eq. (7). Para
este género de bactérias, a oxidação de NOr a NOy é realizada pela enzima nitrito-oxidoreductase (NOR) (Watson et al.,
1989; Hagopian & Riley, 1998).

NO; +H20-
NOlt
>NO; +2H+ + 2e' (6)

H20- ->2H+ +2e~ +Y202 (7)

A maioria das NOB cresce mais rapidamente em condições quimioautotróficas na presença de uma concentração
de N-NO2- compreendida entre 2 a 30 mM, e algumas NOB crescem em condições mixotróficas, utilizando piruvato ou
acetato, como fonte de carbono. Comparativamente ao crescimento em condições autotróficas, observa-se uma diminuição
do tempo de duplicação e um aumento do rendimento celular nestas condições. Apenas as bactérias do género Nitrobacter
são quimioautotróficas facultativas e podem crescer heterotroficamente, utilizando acetato, formato e piruvato como fonte de
carbono e energia. Contudo, enquanto que o tempo de duplicação em condições mixotróficas varia entre 8 h e 14 h, em
condições heterotróficas varia entre 70 h e 100h (Watson et ai., 1989).

1.2.3 Reactor de Biofilme de Leito Móvel ("Moving Bed Biofilm Reactor)

Existem vários tipos de Biofiltros em uso em aquacultura, mas este estudo incidiu concretamente no tipo Reactor de
Biofilme de Leito Móvel ("Moving Bed Biofilm Reactor", MBBR), que foi desenvolvido na Noruega no final da década de 80,
inicio da de 90. Este tipo de Biofiltro consiste num reservatório no qual o efluente do RAS vai passar, e utiliza suportes de
polietileno em suspensão, geralmente com uma forma de roda dentada (Fig. 3 a), que maximiza a área de superfície para o
biofilme se fixar e crescer, e que se movimentam livremente em toda a massa de efluente devido á agitação provocada pela
injecção de ar no fundo do reactor (Fig. 3 b).

a) 0 suporte do biofilme (Kl) b) Reactor Aérabio

Figura 3: a) A forma do suporte Kaldnes Kl. b) O princípio de um "Moving Bed Biofilm Reactor".
Adaptado de 0degaard, 2000.

Mais de 50 MBBR estão operacionais em pisciculturas, tendo como principal objectivo a Nitrificação, e a maioria
utiliza os suportes Kaldnes K1 (Rusten et ai., 2006), com uma densidade de 0.95 g/cm3, uma área superficial total de 500
m2/m3e uma área de superfície efectiva (P) para o desenvolvimento do biofilme de 410 mm2 / peça (Odegaard, 2000). São
estes, K1, os suportes utilizados no presente estudo.

HPORTO Ribeiro H.. 2008

t —
 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

Uma importante vantagem do MBBR é que a percentagem do volume de enchimento do reactor pode ser ajustada
consoante as preferências ou necessidades; contudo, deve ser inferior a 70% para se obter uma livre movimentação, de tal
forma que os choques entre os suportes provocados pelo movimento dentro do reactor impeçam a sua colmatação, mesmo
com grandes cargas de partículas (Rusten et ai., 2006; Leiknes & 0degaard, 2007).

O MBBR não necessita de reciclo de lamas, pois as bactérias ao aderirem a um suporte permanecem mais
protegidas de lavagem ("wash-out") do sistema (Metcalf & Eddy, 2003), logo a utilização de suportes é uma excelente opção
para o tratamento biológico de um RAS, pois um sistema com lamas activadas inevitavelmente entraria em colapso, e
resultando numa severa perda de peixe (Hagopian & Riley, 1998).

Estudos mostram que um MBBR, tendo como objectivo a Nitrificação, é afectado principalmente pelos seguintes
factores: a carga de Matéria Orgânica, a concentração de Amónia e a concentração de Oxigénio (Odegaard, 2000).

1.2.4 Biofilme
Reactores para Nitrificação, como o MBBR, são caracterizados por terem BN aderidas a um suporte sólido
formando o biofilme, que não é mais do que uma elevada concentração de populações microbianas embebidas numa matriz
polimérica, que aderem entre si e/ou a superfícies ao excretar substâncias poliméricas extracelulares (EPS). Numa reduzida
área de superfície podem desenvolver agregados, chamados de Zoogleias, que proporcionam estabilidade e efeito protector,
aumentando assim a resistência a tóxicos, predadores e condições hidrodinâmicas (Hagopian & Riley, 1998).

Vários factores não biológicos afectam o processo inicial de adesão das BN (Liu, 1995), sendo que a concentração
e difusão dos substratos no interior do biofilme vai influenciar a sua estruturação (Wijeyekoon et ai., 2004). Com efeito, o
biofilme de um Biofiltro de um RAS é constituído por populações bacterianas de crescimento bastante diferenciado, com uma
camada interior geralmente formada por uma população rica em microrganismos nitrificantes, de crescimento mais lento, e
com os microrganismos heterotróficos, de crescimento mais rápido, a dominar a camada exterior (Malone & Pfeiffer, 2006),
Fig. 4.
Biofilme

' ' N ^ S J V * ' " " Bactérias Heteroti óficas (Superfície)

Figura 4: Crescimento das bactérias nitrificantes e bactérias heterotróficas no Biofilme

Adaptado de Golz, 1995.

A formação e estrutura do biofilme dependem também de factores físico-químicos como o Tempo de Retenção
Hidráulico (TRH) e taxa de desprendimento de biomassa ("dettachment") (Wijeyekoon et ai., 2004). A espessura do Biofilme
varia geralmente entre 1 e 100um, dependendo da velocidade e viscosidade da água e da temperatura (Wheaton et ai.,

-7-
AA ©
INTRODUÇÃO

1994), e aumenta com o aumento da carga de amónia e com o TRH (Sandu et ai., 2002). É possível recuperar o biofilme
nitrificante que está coberto com BH ou que de alguma forma foi danificado (Lee et ai., 2004).

Embora sejam conhecidos os processos de formação do biofilme, o conhecimento sobre as comunidades

nitrificantes em Biofiltros de RAS a operar com água salina é escasso (Hovanec & Delong, 1996; Leonard et ai., 2000; Tal et
ai., 2003; Chen et ai., 2006; Borges et al„ 2008).

1.2.5 Factores que afectam a Dinâmica do Biofiltro

Independentemente do tipo de Biofiltro, a Nitrificação é um processo biológico de conversão de Amónia a Nitrato.
Processo que é condicionado por uma grande variedade de factores físico­químicos e biológicos do meio em que ocorre,
salientando­se a importância da concentração do Substrato, Oxigénio Dissolvido, Matéria Orgânica, Alcalinidade,
Temperatura, pH, Salinidade, 0¾ entre outros que de seguida se apresentam:

1.2.5.1 Concentração de TAN e Nitríto

Devido às características do sistema de cultura, o Biofiltro de um RAS vai operar com concentrações de TAN e NO2­
muito mais baixas do que as das ETAR convencionais. No entanto, existe uma concentração mínima necessária para
suportar o biofilme nitrificante numa situação de equilíbrio ("steady­state"). Para uma temperatura de 27.2°C, este valor é de
0.07 mgL 1 de TAN (Zhu & Chen, 1999), o que é bastante inferior aos níveis tóxicos para os peixes.

A concentração de TAN como substrato para a Nitrificação no biofiltro do RAS pode tornar­se no parâmetro que
limita o processo, porque geralmente numa piscicultura a sua concentração será normalmente inferior a 1 mgL 1 N­NH4*
(Wheaton et ai., 1994; Rusten et ai., 2006). A taxa de Nitrificação é descrita como uma reacção de ordem zero para
concentrações superiores a 2.5 mgL­1 de TAN, e para concentrações inferiores é descrita pela Eq. (8), de primeira ordem
(Greiner & Timmons, 1998):
R = klCi (8)

onde: R = taxa de oxidação da Amónia, g m­2d­1; C,= concentração de Amónia, mgL­1; ki - coeficiente de regressão
linear.
Em reactores de biofilme de leito fixo a relação entre a concentração do substrato e a taxa de remoção pode
também ser traduzida numa cinética que varia de V2 ordem a ordem zero, Fig. 5 (Nijhof & Bovendeur, 1990; Eding et al„
2006). _ ft4

E
D> ­•­•—

• 0.2­
o
m
o»
o
E

. — ■ — 1 — • — 1 ■ « ■

^ 0 2 4 6 8
Concentração de N­NH4 (gm3)

Figura 5: Taxa de remoção de Amónia num Biofiltro a operar com água salina e varias concentrações de TAN.
Adaptado de Nijhof & Bovendeur, 1990.

I PORTO ­8 Ribeiro H.. 2008

t =
 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

Porém, uma análise rigorosa da cinética do processo de Nitrificação em função da concentração do substrato deve
considerar a variação da concentração do substrato no interior do biofilme, e não na solução, Fig. 6 (Chen et al., 2006).

10
Superfície
1
^/^°
9
8
o-7
î
Base

S
O 6 I NHi-N
a. Biofilme
3
w
C 4
<D
£ 3
O
O 2-

1- NOf-N a

0-
-300 -200 -100 0 100 200 300 400
Distância (M m)
Figura 6: Perfis de variação da concentração de substrato em biofilmes heterotróficos-autotróficos.
Adaptado de Chen et ai., 2006.

Por outro lado, a Nitrificação é inibida pelas formas não ionizadas de Amónio e Nitrito. A Nitritação é inibida pela
presença de NH3, enquanto a Nitratação é inibida tanto pelo NH3, como pelo HNO2 (Hagopian & Riley, 1998). No início de
funcionamento do Biofiltro, o efeito inibitório do amoníaco depende da concentração de microrganismos presentes no
biofilme, e diminui com a aclimatação das NOB ao meio (Villaverde et ai., 2000).

Estudos mostram que a concentração de Amónia vai determinar qual a estirpe de AOB dominante no Biofiltro
(Princic et ai., 1998; Burrell et al„ 2001 ; Wijeyekoon et ai., 2004).

1.2.5.2 Oxigénio
A concentração de OD é função de diversas variáveis, que incluem a concentração de compostos orgânicos, a
temperatura e a biomassa bacteriana presente no biofiltro (Wheaton et ai., 1994). O OD constitui um requisito para a
oxidação de TAN, como foi demonstrado na Eq.(3), e é um substrato limitante quando presente em baixas concentrações,
sabendo-se que para concentrações inferiores a 0.2 mgL 1 a taxa de Nitrificação é nula (Chen et ai., 2006). É importante que
concentrações de OD no Biofiltro estejam sempre acima de 2 mgL 1 de forma as BN não ficarem inoperantes (Wheaton et ai.,
1994; Masser et ai., 1999), sendo que as NOB são mais sensíveis a baixas concentrações de O2 do que as AOB (Ciudad et
al„ 2006).

Para uma remoção optimizada do TAN são consumidos 4.25 mg O2 por mg de N-NHr oxidado a Nitrato (Metcalf &
Eddy, 2003), e num MBBR a operar a cerca de 6 mgL 1 , o OD só se torna factor limitante para concentrações de TAN
superiores a 1.7 mgL 1 , (Fig. 7, Rusten et ai., 2006).

&® -9-
INTRODUÇÃO

1.4
OD: = 6 mg/L
f 1.2
%
3 LO
/ OD:= 4mgfL
î
<u 0.8
■a
y/
0,6..
yr OD =: 2 mg/L
« 0.4
•o
IS
y
S 0.2
Z 1 1 1 1 ­H
0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
concentração de TAN (mg/L)

Figura 7: Influência da concentração de OD e TAN na remoção de TAN num MBBR a 15°C.

Adaptado de Rusten et al., 2006.

A presença de BH prejudica as BN pois vão competir pelo OD presente, especialmente em processos de biofilme
fixo (Zhu & Chen, 2001), sendo que o O2 é primeiramente usado pelas BH, em seguida pelas Nitrosomonas e por fim, pelas
Nitrobacter (Wheaton et ai., 1994). Esta competição é agravada pelos gradientes de concentração de O2 ao longo da
espessura do biofilme (Fig. 6).

1.2.5.3 Carbono orgânico

O material fecal excretado pelos peixes e os restos de alimento não ingeridos constituem principalmente a Matéria
Orgânica Particulada (MOP) existente num RAS, e a sua decomposição vai consumir oxigénio e produzir TAN adicional
(Masser et ai., 1999). Contudo, a concentração que vai existir no RAS depende da quantidade de alimento que não é ingerido
e da quantidade de água nova utilizada (Leonard et ai., 2002).

A existência de MOP num sistema de recirculação tende a reduzir a eficiência da Nitrificação (Fig. 8), e isto porque
fornece substrato às BH que competem com as nitrificantes por oxigénio e espaço (Zhu & Chen, 2001; Wijeyekoon et ai.,
2004; Michaud et ai., 2006).

y = -10.148Ui(x) +90.345
R2 = 0.8099

IO 15 20 25 30 35 40 55
Matéria Orgânica Particulada (mg/L)

Figura 8: Efeito da concentração de MOP na eficiência da Nitrificação de um Biofiltro.

Adaptado de Chen et ai., 2006.

Ribeiro H.. 2008

HPORTO -10-
 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

Efluentes com altos valores de razão Carbono/Azoto (C/N) retardam o desenvolvimento das BN, retardando o início
do processo de Nitrificação. A composição do substrato (razão C/N) pode posteriormente influenciar a dinâmica populacional
e a sua actividade (Okabe et ai., 1996). Os Biofiltros dos RAS geralmente operam sob condições de aproximadamente
CBO5/TAN = 4 (Zhu & Chen, 2001), e há estudos que mostram que com uma razão de CQO/N abaixo de 4, se atinge um
processo de Nitrificação estável e com uma eficiência acima de 95% (Kaufman et ai., 2006).

Pode verificar-se que a densidade de células nos Biofilmes que crescem a razões de C/N = 0 e 0,25 (Biofilmes
Nitrificantes), é três vezes superior à dos Biofilmes que crescem com razão C/N = 1.0 e 1.5, ou seja, Biofilmes Heterotróficos
(Okabe et ai., 1996). Contudo, os Biofiltros de pisciculturas operam a baixas cargas orgânicas (Rusten et ai., 2006).

A MOP deve ser removida o mais rápido possível do RAS (Chen et al., 2006), e pode ser reduzida por filtração
mecânica e por uma boa taxa de conversão do alimento por parte dos peixes (Leonard et ai., 2002).

1.2.5.4 Temperatura
A temperatura é um parâmetro que interfere fortemente na eficiência de um Biofiltro (Masser et ai., 1999), e a sua
influência na taxa de remoção de TAN pode ser estimada utilizando a equação de van't Hoff-Arrhenius, Eq. (9) (Rusten et ai.,
2006). O valor óptimo é de 25°C, e há uma resposta linear entre 7 e 35°C. Contudo, para temperaturas inferiores a 5°C e
superiores a 42°C a taxa de Nitrificação decresce rapidamente (Hagopian & Riley, 1998); no entanto já foram isoladas BN de
oceanos profundos onde a temperatura é inferior a 5°C (Watson et ai., 1989).

M=/½^2° O)

Onde (j é o coeficiente da taxa; P20 é o valor de M a 20 °C; 9 é coeficiente de temperatura e T é a temperatura do

sistema. Para um MBBR o coeficiente de temperatura, 0= 1.09 (Rusten et al„ 2006).

Estudos demonstram que o impacto da temperatura na taxa de Nitrificação em processos que utilizam biofilme fixo,
comparativamente aos processos de crescimento em suspensão, é mais reduzido do que o previsível pela equação de van't
Hoff-Arrhenius, e que a sua influência na taxa de nitrificação depende do parâmetro (Oxigénio Dissolvido ou Amónia) que
limita a reacção (Zhu & Chen, 2002). Foi observado que a temperatura tem mais influência na taxa de Nitrificação quando há
uma limitação de TAN.

As BN são sensíveis a variações de temperatura, e é bem aceite que o biofilme estabiliza mais rapidamente a
temperaturas mais altas do que a temperaturas mais baixas (Chen et ai., 2006).

1.2.5.5 pH
O pH é outro parâmetro que afecta a Nitrificação, e tende a diminuir no RAS à medida que as BN metabolizam o
TAN e produzem H+ consumindo alcalinidade, bem como pela geração de CO2 pelos peixes e pelos microrganismos (Masser
et al., 1999).
O intervalo óptimo para o processo de Nitrificação encontra-se compreendido entre 7.0 e 9.0, podendo no entanto
ocorrer num intervalo mais amplo (Chen et ai., 2006), pois já foram isoladas BN de solos com pH 4 (Watson et ai., 1989);
INTRODUÇÃO

contudo, o valor de pH considerado óptimo para o desenvolvimento das BN é 7.80 (Hagopian & Riley., 1998). O intervalo
óptimo é determinado pelos seguintes efeitos que o pH pode exercer nas BN: i) Activação e desactivação das BN; ii) efeito
nutricional, relacionado com a Alcalinidade; iii) inibição devido ao NH3 e HN02(Villaverde et ai., 1997).

Estudos mostram que pode haver inibição total da Nitrificação num intervalo de pH inferior a 6.45 e superior a 9.05
(Ruiz et ai., 2003). Outros referem um intervalo 5.0 ­ 9.0 e que o aumento de uma unidade de pH pode provocar um aumento
de 13% na eficiência da Nitrificação (Villaverde et ai., 1997). A inibição causada pelo NH3 e HNO2 está dependente do pH,
pois estes são formados, respectivamente, a partir de N I V a pH alto, Eq. (10) e a partir do NO2­ a pH baixo, Eq. (11) (Eding
et ai., 2006).

NHA+ + OH- < >NH3 + H20 (10)

NH2' + H+ < > HN02 (11)

A utilização de valores extremos de pH selecciona e altera irreversivelmente a estrutura da comunidade de BN

(Princic et ai., 1998). Quando ocorre uma rápida variação no pH, de 0.5 ou 1 unidade em poucos minutos, a eficiência da
nitrificação é reduzida até as bactérias se adaptarem às novas condições (Wheaton et ai., 1994), e são as NOB que exibem
uma maior sensibilidade a esta variação (Park et ai., 2007).

Um pH baixo nos tanques de cultura (dentro do intervalo de valores óptimos para os peixes) é óptimo para
minimizar a quantidade de NH3; no entanto, no Biofiltro, é necessário um pH próximo do limite mínimo do intervalo óptimo de
modo a melhorar a eficiência da Nitrificação (Chen et ai., 2006).

1.2.5.6 Alcalinidade
Os compostos responsáveis pela Alcalinidade são principalmente os iões hidrogenocarbonato (HCO3­), carbonato
(CO32­) e hidróxido (OH­), embora outros compostos possam contribuir também (Manahan, 1999). A Alcalinidade sob a forma
de CO32­ e HCO3­ é um nutriente para as BN, e, adicionalmente, também evita mudanças de pH devido à produção de H + no
processo de Nitrificação, Eq. (1) (Wheaton et ai., 1994). A capacidade tampão que Alcalinidade tem no meio aquático quando
há uma produção de H+descreve­se pela Eq. (12) (Manahan, 1999).

CO32" "* >HC03~ H+

>H2C03 (12)

Geralmente, quando se avalia a Alcalinidade Total quantificam­se as concentrações das espécies de carbonatos
referidos na Eq. (13), exprimindo­se o resultado final como mgL.­1 de Carbonato de Cálcio (Wolf­Gladrow et ai., 2007).

[AT]= [HC03-\+2[C0Í\+[0H-]-[H+] (13)

Há uma correlação linear entre a Alcalinidade e a eficiência da Nitrificação, obtendo­se um coeficiente

estequiométrico de 7.1 mg de CaCÛ3 consumidos por mg N­NHr oxidado (Villaverde et al„ 1997), ou seja, uma diminuição
de 2 moles de Alcalinidade Total por mole de Nitrato formado (Wolf­Gladrow et al„ 2007).

HPORTO ■*' 12- Ribeiro H.. 2008

 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMB IENTE

A taxa de Nitrificação é afectada pela Alcalinidade (Fig. 9) e é reduzida quando a alcalinidade é inferior a 40 mgL 1
(Chen et ai, 1989), e por vezes são necessários 75 mgL 1 de CaCÛ3 para se manter uma taxa de Nitrificação máxima (Gujer
& Boiler, 1986). Considerando uma possível estratificação da Alcalinidade no biofilme, são recomendadas, para água doce,
concentrações superiores a 200 mgL 1 de CaC03, principalmente em RAS onde a taxa de renovação de água é mínima
(Chen et ai., 2006).
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« A pH 7.3
o 0,2­ OPHí­0
ca ■ pH 6.7
S no­ i­ 1 1— —t­ 1
0.9 1.2 1.5 1.8 2.1 2.4 2.7

Alcalinidade no MBBR (mmol/L)

Figura 9: Influência da Alcalinidade e pH na taxa de remoção de TAN num MBBR. Salinidade 23%o.
Adaptado de Rusten et ai., 2006.

1.2.5.7 Salinidade
A salinidade é outro parâmetro que afecta a nitrificação, mas existem poucos estudos sobre o processo de
Nitrificação em sistemas de recirculação de Aquacultura a operar com água salina (Chen et ai., 2006).

A capacidade máxima de Nitrificação num RAS a operar em água salina é consideravelmente inferior aos sistemas
de água doce, Fig. 10 (Nijhof & Bovendeur, 1990; Rusten et ai., 2006). Acresce a isto um arranque ("start­up") mais lento no
Biofiltro de RAS salinos, que podem demorar semanas ou meses a ser colonizados e estabilizar, afectando principalmente a
Nitratação, o que leva à acumulação de nitrito nos primeiros meses de funcionamento (Nijhof & Bovendeur, 1990).

água doce

2 k
Concentração NH4 (mg/L)

Figura 10: Taxa de remoção de N-NH4+ em função da concentração de NH4+ em água doce e do mar.
Adaptado de Nijhof & B ovendeur, 1990

/& © 13
INTRODUÇÃO

É possível encurtar o período de arranque do Biofiltro de um RAS de água salgada adaptando previamente o
biofilme de reactores de água doce a salinidades mais elevadas (Nijhof & Bovendeur, 1990), ou fazendo uma pré-activação
através da inoculação de BN no Biofiltro a partir de meios de enriquecimento (Perfettini & Bianchi, 1990; Masser et ai., 1999;
Gross et ai.,2003).

O efeito da salinidade no crescimento e fisiologia das AOB foi demonstrado, sendo que algumas AOB necessitam
de sal para crescerem, enquanto que para outras o sal é inibitório (Rysgaard, 1999; Burrell et ai., 2001). Contudo, as
Bactérias responsáveis pela Nitrificação em água doce são diferentes das de água salina, e rápidas mudanças na salinidade
podem reduzir a taxa de nitrificação por algum tempo (Wheaton et ai., 1994; Colt, 2005).

1.2.5.8 Tipo de suporte e Área especifica de superfície

O suporte é o material sólido no Biofiltro que providencia uma área superficial na qual vai ocorrer o crescimento
bacteriano (biofilme). Existem muitos tipos de suportes que podem ser utilizados em Biofiltros para Nitrificação, desde areia e
rochas até suportes de plástico, ou seja, qualquer material sólido que não seja tóxico para as BN e para os peixes pode ser
utilizado (Wheaton et ai.,1994).

Os suportes de plástico são muito utilizados por terem grande razão de vazios, são leves e se não forem expostos à
luz solar podem durar indefinidamente; contudo são caros (Wheaton et ai., 1994; Timmons et ai., 2006). Por outro lado, a
taxa de adesão bacteriana a suportes de Polietileno, Polipropileno e Poliestireno depende da concentração de bactérias em
suspensão, do pH e da força tónica do meio (Liu, 1995).

A área especifica de superfície (m2/m3) depende do tipo de suporte escolhido, e quanto maior for, mais biofilme se
pode formar por unidade de volume, logo maior será a taxa de remoção do TAN, o que permite ter reactores com um menor
volume (Wheaton et ai., 1994).

A eficiência de um determinado biofiltro varia com o tipo de suporte que utiliza, obtendo-se taxas de nitrificação
diferentes (Lekang & Kleppe, 2000), o que leva a crer que Biofiltros equipados com suportes adequados são capazes de
melhorar a qualidade da água dos RAS, e que por vezes são mais importantes na eficácia do sistema de tratamento do que a
direcção e intensidade do fluxo (Yang, 2001).

1.2.5.9 Outros parâmetros que podem afectar a performance do Biofiltro

Existem muitos outros parâmetros físico-químicos que podem afectar o desempenho do Biofiltro. Como já
verificamos, o NH3 o NHO2- podem ser tóxicos para o processo de Nitrificação; contudo, existem outros inibidores químicos
do processo como a Tiureia, Cianeto, Fenóis, Anilina, Aliltiureia, Acetileno e Azida (Watson et al„ 1989; Ginestet et ai., 1998;
Pollard, 2006; Kim et al., 2008).

Um outro aspecto importante é que as BN são fotoinibidas por intensidades da luz solar inferiores a 1% (Watson et
ai., 1989; Wheaton et ai., 1994; Hagopian & Riley, 1998), e há uma grande influência da turbulência, carga hidráulica e
profundidade do biofiltro no processo de Nitrificação e nas comunidades nitrificantes (Wheaton et ai., 1994; Nijhoh., 1995;
Chen et ai., 2006).

HPORTO -14- Ribeiro H.. 2008

 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

0 ozono é utilizado nos RAS para desinfecção e controlo do crescimento de patogénicos e de outras BH na água
(Sharrer & Summerfelt, 2007). Devido aos elevados níveis de materiais orgânicos suspensos no sistema, o efeito do O3 na
população de bactérias do Biofiltro é questionável (Losordo et ai., 1999); no entanto a sua utilização durante alguns períodos
do dia pode ajudar a manter uma população de BN estável, possivelmente pela eliminação desses compostos (Krumins et
ai., 2001). O ozono reduz também a concentração de TAN e Nitrito (Summerfelt et ai., 1997; Krumins et ai., 2001), substratos
utilizados pelas BN.

Um aspecto a ter em conta na performance de um Biofiltro é a colonização não esperada dos suportes por uma
variedade de microrganismos. Isto geralmente acontece em biofilmes de suportes submergidos que podem promover o
estabelecimento de larvas de invertebrados e de esporos de macroalgas, e uma vez estabelecidos, estes organismos podem
modificar a composição das espécies microbianas do biofilme, e assim alterar a dinâmica e propriedades deste (Qian et ai.,
2007).

Microalgas podem ser utilizadas em Biofiltros como agentes coagulantes, pois também sintetizam EPS,
estabilizando e mantendo o Biofilme (Delahaye et ai., 2005). Contudo, a presença de microalgas pode aumentar o número de
rotíferos e protozoários no Biofiltro, isto devido ao aumento do nível de predação, que juntamente com as bactérias
desempenham um papel importante no consórcio do biofilme (Shipin et al„ 1999).

Como se pode verificar, poderá ser difícil prever taxas de Nitrificação num Biofiltro devido às inúmeras variáveis
envolvidas neste complexo processo. Por isso deve ser feita uma avaliação caso a caso, efectuando-se previamente um
estudo exaustivo das condições em que o Biofiltro opera de forma a ter uma base de conhecimento que permita melhorar e
sustentar qualquer operação.

1.3 Objectivos
O trabalho efectuado teve como principal objectivo contribuir para o conhecimento dos processos de conversão do
TAN a NO3- em Biofiltros a operar em água salina, já que existem poucos trabalhos publicados nesta área de estudo.

O estudo incidiu concretamente num Biofiltro do tipo MBBR, utilizado num sistema de recirculação de água de uma
piscicultura marinha. O estudo foi efectuado na expectativa de obter resultados que poderão melhorar a sua eficiência global
através da optimização das condições de funcionamento, diminuindo os custos inerentes ao tratamento e aumentando a
capacidade de produção e de reutilização da água. Este era um dos aspectos a desenvolver no projecto "Raceways",
financiado pela UE, no qual esta dissertação se integrou como extensão da actividade desenvolvida.

Para atingir o objectivo principal foi necessário alcançar objectivos específicos, referindo-se os seguintes:

• Amostragem e análise dos parâmetros físico-químicos da água do Biofiltro, da água recirculada e da água de
renovação diária da piscicultura, para obter conhecimento dos valores reais e compará-los com os encontrados na
literatura, constituindo uma ferramenta auxiliar na análise do processo e previsão de resultados a obter. Os dados
obtidos permitiram também avaliar a eficiência do biofiltro da piscicultura.

1 5
& • - - ra
INTRODUÇÃO

Tendo em conta que a Nitrificação deve ser o processo mais importante a ocorrer no Biofiltro, neste trabalho
procurou-se promover o desenvolvimento das BN através da elaboração de um enriquecimento de AOB e NOB,
com o intuito de se poderem obter isolados bacterianos para futura identificação, e para posterior inoculo de um
Biofiltro laboratorial.

Com a finalidade de construir uma plataforma de conhecimento que permita a optimização do desempenho do
Biofiltro na transformação do TAN em NOr e deste em NO3-, procedeu-se à realização de experiências à escala
laboratorial para avaliação das taxas de remoção de amónia. Estas experiências foram efectuadas variando alguns
parâmetros que afectam o Biofiltro, como o volume de meio de enchimento usado para suporte do biofilme, a
concentração da NIV, e a Salinidade. Pretendeu-se com esta abordagem adquirir informação sobre a Nitritação, e
sobre a Nitratação em água salgada. Os dados obtidos permitirão avaliar, bem como identificar, alguns parâmetros
críticos no funcionamento do Biofiltro.

1.4 Organização da Dissertação

Esta Dissertação encontra-se organizada em cinco capítulos onde se descreve o trabalho de investigação realizado.

No presente capítulo efectuou-se uma abordagem geral ao tema desenvolvido na Dissertação, fazendo-se uma
revisão bibliográfica que permitiu clarificar alguns conceitos fundamentais para a elaboração deste trabalho. Por fim, foram
descritos os objectivos do presente trabalho.

A metodologia experimental foi organizada no capítulo 2, que reflecte, de certo modo, o percurso do trabalho
efectuado para cumprimento dos seus objectivos, que foram: caracterização do efluente em pontos de interesse para
avaliação do sistema; avaliação do grau de colonização dos suportes do Biofiltro por bactérias heterotróficas; estimulação do
desenvolvimento de populações microbianas nitrificantes, AOB e NOB; estudos de Nitrificação, com foco na avaliação das
Taxas de Remoção de Amónia em descontinuo ("Batch"). Foi descrita a metodologia utilizada na amostragem, a instalação
laboratorial utilizada durante este trabalho de investigação, bem como as técnicas de análise adoptadas e equipamentos
inerentes a todo o processo, reportando-se para as diversas referências bibliográficas consultadas.

No Capítulo 3 foram apresentados os principais resultados obtidos experimentalmente para os objectivos propostos
no capítulo anterior efectuando-se ao mesmo tempo uma análise e discussão para cada um deles.

No Capítulo 4 foram apresentadas as principais conclusões obtidas neste estudo, indicando-se um conjunto de
recomendações para estudos futuros sobre este tema.

Por último, no Capitulo 5 foram escritas as principais referências bibliográficas consultadas e que servem de
alicerce a esta Dissertação.

16- Ribeiro H.. 2008

t:~
 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

2 METODOLOGIA USADA
2.1 Características da piscicultura
Este estudo foi efectuado em colaboração com uma piscicultura privada de cultivo de Rodovalho (Scophthalmus
maximus), localizada na costa Atlântica Portuguesa.

O Rodovalho é uma das espécies mais valiosas em aquacultura marinha, com características interessantes para os
cultivadores e consumidores (Foss et ai., 2007). Estas características incluem: alta taxa de crescimento, alta taxa de
conversão alimentar (Imsland et ai., 1995), e grande tolerância ao stress e operações de manuseamento (van Ham, 2003).
Pode ser cultivado num vasto intervalo de salinidade (entre 15 e 33.5 %o) e temperatura (entre 10 e 22 °C), sendo que o
crescimento e eficiência de conversão alimentar são mais elevados a 18°C e a 15%o (Imsland et ai., 2007). O Rodovalho
requer uma qualidade de água moderada, tem grande adaptabilidade às condições ambientais (Person-Le Ruyet et ai., 2003)
e poucos problemas a nível de patologias (Mulcahy, 2002).

A piscicultura referida compreende uma zona de pré-engorda, onde ocorreu este estudo, que funciona como um
RAS, formado por três grupos de dois "raceways" (tanques de cultura compridos e estreitos) em série, com decantadores à
saída, um Biofiltro, Filtro Mecânico e Ozonizador (Fig. 11). Os peixes foram alimentados com ração artificial adaptada ao seu
tamanho. A alimentação era efectuada manualmente às 9h30 e às 14h00. O Biofiltro, do tipo MBBR, utiliza suportes Kaldnes
K1, tem 10% de volume de enchimento e um TRH de 7,8 minutos. Dos sólidos sedimentados nos decantadores dos tanques,
uma grande parte é sifonada para o exterior, uma hora depois da alimentação, e o restante é dirigido para o Filtro Mecânico,
sendo depois o efluente tratado por este órgão introduzido no Biofiltro. O ozonizador só funciona das 9h00 até às 17h00,
tratando uma pequena parte do caudal proveniente do biofiltro.

(3x) Raceways
J =E
Tanque de
Mistura

^
Ozonizador

Filtro Mecânico Biofiltro Biofiltro

X IN OUT X

Legenda :
Ponto de Sentido do . Entrada de agua _» ; Saída de
Amostragem fluxo de água nova do Mar água

Figura 1 1 : Representação esquemática da piscicultura estudada e dos pontos amostrados.

A renovação diária é de 10 %, sendo a água nova bombeada a partir de um furo, depositada em reservatórios para
remoção de óxidos de ferro e dirigida para um filtro de areia, para remoção de eventual matéria sólida, sendo depois
introduzida no RAS. A água recirculada sofria Oxigenação antes de entrar no primeiro tanque de cada conjunto de dois
"raceways".

17
/ & #
METODOLOGIA USADA

2.2 Metodologia e materiais

2.2.1 Amostragem e análise à água da piscicultura
Neste estudo o período de amostragem ocorreu durante um ciclo de pré-engorda de Rodovalho (três meses),
sensivelmente uma vez por mês, desde Dezembro de 2007 a Março de 2008.

As amostragens foram efectuadas à entrada de um grupo de dois "raceways" em série (água recirculada) e no
biofiltro, de forma a monitorizar a evolução das caracteristicas da qualidade da água antes de alimentar os peixes (AC, 9h00)
e, cinco a seis horas depois da alimentação (DC, 14h00) para obter um máximo de excreção de N I V (Person-Le-Ruyet et
ai., 1992). A amostragem, durante o ciclo de pré-engorda, foi efectuada de acordo com os métodos referidos em APHA
(1992), abrangendo a água recirculada à entrada do "raceway" (RC-E), água nova, e água à entrada e à saída do Biofiltro
(Fig. 11). Foi ainda efectuada uma amostragem de vinte e quatro horas, em Maio, no ciclo seguinte de pré-engorda,
utilizando dois amostradores automáticos colocados à entrada (Biofiltro In) e saída (Biofiltro Out) do Biofiltro.

Dos diversos parâmetros estudados (Tab. 2) algumas análises foram realizadas "in situ", nomeadamente os
parâmetros físico-químicos: concentração de O2, Temperatura, pH, através de medidor Multi-Paramétrico 340i WTW,
enquanto a Salinidade foi medida através de um refractómetro YSI.

Tabela 2: Parâmetros analisados nas amostragens efectuadas na piscicultura

Análise dos Parâmetros FQ Análise de BH presentes

"insitu" Laboratório Em suportes Suspensas na água

Água recirculada T; pH; OD; % Todos Não Não

Água nova do furo

T; pH; OD; %o Todos Não Não

Biofiltro Entrada
T; pH; OD; %
Todos Sim Sim

Biofiltro Saída
T; pH; OD; % Todos Sim Sim

Amostragem 24 Horas Nenhum SST; N-NH<+; N-NO2-; N-NO3- Não Não

Foram também recolhidas amostras para a determinação laboratorial (Tab. 2) da concentração dos SST; N-NrV e
N-NO2- segundo os métodos descritos por Aminot and Chaussepied, (1983), APHA (1992) e Borges et ai. (2003). A
concentração de N-NO3- foi avaliada pelo método espectrofotométrico (Merck Kit n° 1. 149442.0001), excepto para a
amostragem de 24 horas, em que foi usado o método da redução por cádmio esponjoso descrito por Jones (1984). A
concentração de PO4 foi determinada pelo teste de Fosfatos em água doce ou do mar (Merck, Kit n° 1.14661.0001), e a
Alcalinidade Total pelo teste espectrofotométrico Alkaphot da Palintest, utilizando um espectrofotómetro 7000 Se.

A concentração de NH3 foi determinada segundo o cálculo apresentado por Huguenin & Colt (1989), em função dos
valores de pH, Temperatura e salinidade obtidos nas análises feitas "in situ".

HPORTO 18 Ribeiro H.. 2008

 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

Nas mesmas datas de amostragem procedeu-se também à recolha de amostras de suportes Kaldnes e de água do
Biofiltro (Tab. 2), segundo os métodos descritos por Leonard et ai. (2000) e Michaud et ai. (2006) para avaliação laboratorial
do número de Unidades Formadoras de Colónias (UFC) de BH presentes.

2.2.1.1 Metodologia de cálculo da Eficiência do Biofiltro

Foi efectuado o cálculo da eficiência do Biofiltro na remoção de N-NH4+; N-NO2-; N-NO3-; SST durante a
amostragem de 24 horas, utilizando a Equação (14) (Metcalf & Eddy, 2003):

(P -P )
%Ef = lJ2 °JLL x l O O (14)
Pi

onde Pm = valor do parâmetro calculado no Biofiltro In, e o Pout = valor do parâmetro calculado no Biofiltro Out.

2.2.2 Avaliação das UFC de Bactérias Heterotróficas no Biofiltro

A recolha de amostras de suportes do biofilme e de água do Biofiltro permitiu determinar o número de UFC e assim
avaliar, em cada amostragem, o grau de colonização dos suportes por BH (representam potenciais situações de competição
com as BN) e as bactérias que estavam em suspensão na água.

A remoção do biofilme dos suportes foi efectuada segundo os métodos descritos por Borges et ai. (2008) e na
inoculação em meio sólido procedeu-se ao método das diluições sucessivas, quer para o biofilme removido dos suportes,
quer para as bactérias em suspensão na água, seguindo-se a inoculação pelo método do espalhamento em placa, em meio
Marine Agar (Difco 2216), procedimento esquematizado na Fig. 12, sempre efectuado à chama. As placas foram de seguida
envolvidas em parafilme (Aakra et ai., 1999) e incubadas à temperatura de 20°C numa sala climatizada e na obscuridade. A
consequente contagem das UFC aconteceu após cinco ou seis dias de incubação. Apenas foram validadas placas contáveis,
consideradas por Pampulha (1998), aquelas contendo entre 30 e 300 colónias, sendo os resultados obtidos apresentados
como UFC g-1 de suporte e UFC ml-1 de água.

Placas contáveis

Figura 12: Ilustração esquemática para contagem de bactérias pelo Método por espalhamento.
Adaptado de Metcalf & Eddy, 2003 e de Pampulha, 1998.

&m -19- Bi
METODOLOGIA USADA

2.2.3 Enriquecimento em AOB e NOB

Foi adaptado um protocolo de enriquecimento na expectativa de obter, a partir destas experiências, suportes
enriquecidos com AOB e NOB para estudos posteriores.
Para aumentar as hipóteses de obter culturas de BN, é importante impedir o crescimento das BH. Para tal devem­se
eliminar todas as fontes de carbono orgânico no meio e impedir o contacto das culturas com a atmosfera (Aakra et ai., 1999).
Deve­se também esterilizar os meios de enriquecimento em autoclave a temperaturas de 121 °C durante 15 a 20 minutos
(Pampulha, 1998; Peixe, 1998).

A estimulação do desenvolvimento de BN foi efectuada através da incubação de um número adequado de suportes

recolhidos no Biofiltro da piscicultura, em dois meios líquidos de enriquecimento, um indicado para as AOB e outro para as
NOB. O meio de enriquecimento escolhido, totalmente inorgânico, descrito por Cote & Gherna (1994), foi alterado pela
utilização de água filtrada Milipore e 28 gL­1 NaCI para simular a salinidade da água do mar (Borges et ai., 2008). O meio de
enriquecimento foi mudado a cada 15 dias, e o pH do meio das AOB foi ajustado com K2CO3 0,5 M de acordo com o
procedimento descrito por Cote & Gherna (1994), sempre que se verificava a alteração da cor do indicador de pH. De referir
que a quantidade de indicador de pH, vermelho de cresol, adicionada ao meio AOB foi alterada para 0.5 x10 3 gL­1.

Foram mantidas e controladas as condições ambientais, nomeadamente a temperatura (22 °C) e a obscuridade
(Tappeetal., 1999).

2.2.3.1 Enriquecimento sem bomba de arejamento

Numa primeira tentativa para estimular o desenvolvimento das BN, foram colocados 300 suportes Kaldnes K1, da
amostragem ao Biofiltro em Janeiro, em 500 ml de meio de enriquecimento esterilizado, e em duplicado. A instalação
experimental compreendia como reactores quatro balões Erlenmeyer de 1000 ml, selados no bucal com "rolha" de gaze e
algodão (Krieg & Gerhardt, 1994), tapados com folha de papel de alumínio, providos de barras magnéticas esterilizadas para
agitação e colocados sobre um agitador magnético (Fig. 13).

[ ■ <ff <ff ■ - <2t <Zf

Figura 13: Esquema da Instalação experimental para o Enriquecimento sem bomba de arejamento.

2.2.3.2 Enriquecimento com bomba de arejamento

Na segunda tentativa para estimular o desenvolvimento das BN, foram colocados 150 Kaldnes K1, da amostragem
ao Biofiltro em Março, em 500ml de meio de enriquecimento esterilizado, e em duplicado. Como instalação experimental
utilizaram­se como reactores novamente balões Erlenmeyer de 1000 ml, com o mesmo tipo de rolha, mas foi utilizado um

[■PORTO R H - 20 - Ribeiro H.. 2008

 MESTRADO HM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

sistema de arejamento (bomba Resun AC-9904, 9 Lm-1; pedras difusoras esterilizadas) de forma a obter condições aeróbias,
e utilizando filtros 0.2um Millex FG50 como meio de filtração do ar de forma a evitar a introdução de contaminações (Fig. 14).

a
| i) r 1

Figura 14: Esquema da Instalação experimental para o Enriquecimento com bomba de arejamento.

A alteração do pH do meio AOB foi monitorizada nos primeiros 15 dias com fitas indicadoras de pH e depois
visualmente pela observação da variação de cor do vermelho de cresol, visto que as bactérias AOB acidificam o meio ao
longo do tempo (Hagopian & Riley, 1998), ao contrário das NOB, que pouco acidificam, e portanto não é justificável a
utilização de um indicador de pH. Depois dos primeiros 15 dias, foram regularmente retirados 2 ml de amostra quer do meio
AOB, quer do meio NOB, para verificação do pH com um medidor de pH 340i WTW. A amostra foi retirada à chama para
evitar contaminação, e depois foi adicionada ao meio uma quantidade adequada de K2CO3 0,5 M para ajustar o pH para 8
(Cote &Ghema, 1994).

Nas amostras retiradas era verificada qualitativamente a formação de nitrito no meio AOB, e nitrato no meio NOB
com adição do reagente de Nitrito Griess-llosvay (Griess-llosvay's Nitrite Reagent, Merck, Cat. N° 1.09023.0500; Hayatsu,
1993). No meio AOB, a presença do Nitrito é indicada pela formação de uma coloração vermelha intensa e no meio NOB, a
presença de nitrato só era verificada depois de se adicionar pó de zinco (Merck, cat. N° 1.08774.1000), que reduzia o nitrato
a nitrito, que reagia com o reagente de Griess-llosvay, e provocava o aparecimento da coloração vermelha intensa (Ehrlich,
1975).

A partir do biofilme retirado dos suportes colocados nos meios de enriquecimento procedeu-se à inoculação
bacteriana em meio de cultura solidificado. Tendo como base o meio de enriquecimento usado, foram preparados dois meios
de cultura diferentes: um meio totalmente inorgânico designado MSG, utilizando Sílica Gel (Grade 923, pore size 30 Â, 100-
200 mesh, Sigma-Aldrich) como agente solidificante, e preparado segundo o método descrito por Krieg & Gerhardt (1994), e
outro meio, Meio Autotrófico com Agar (MAuA), que utilizava como agente solidificante 15 gL 1 de Agar N° 1 (Krieg &
Gerhardt, 1994). Este MAuA foi empregue tendo em conta que o número de BH no meio de enriquecimento seria bastante
reduzido devido ao processo de empobrecimento de fontes nutricionais orgânicas ("starvation") efectuado com os meios de
enriquecimento totalmente inorgânicos (Aakra et ai., 1999).

O procedimento de remoção do biofilme dos suportes e inoculação em meio sólido foi efectuado conforme referido
para a avaliação de UFC de BH no Biofiltro, anteriormente descrito; no entanto, a primeira contagem ocorreu um mês depois
da inoculação (Watson et ai., 1989).

:
&$ BB
M ETODQLOGIA U S A D A

2.2.4 Estudos sobre Nitrificação

Com o objectivo de avaliar a Nitrificação foram recolhidos suportes do Biofiltro estudado para efectuar experiências

laboratoriais de forma a verificar a taxa de remoção de Amónia em função de alguns parâmetros.

Inicialmente foi estabelecido um protocolo de aclimatação às condições laboratoriais para se poder efectuar

posteriormente os ensaios de remoção biológica de Amónia. Contudo, a maturação do Biofiltro pode provocar alterações na

comunidade microbiana, e levar mesmo a uma menor eficiência de tratamento (Masser et ai., 1999). O aparecimento de um

Biofilme não usual, de cor verde-acastanhada (designado por "Biofouling"), provocou a necessidade de uma alteração ao

processamento dos suportes (Tabela 3), isto com o objectivo de remover esse "Biofouling" e promover a recuperação do

Biofilme nitrificante.

Tabela 3: Desenvolvimento temporal do processamento dos suportes desde amostragem ao Ensaio Laboratorial
Período Procedimento Descrição
15 Nov 2007 "Start-up do Biofiltro" Inicio do funcionamento do Biofiltro da Piscicultura

22 Janeiro Amostragem Recolha na piscicultura de Suportes do Biofiltro colonizados

23 Janeiro a Obscuridade; T = 2FC; adição diária de 0.5 mgL"1 N-NH/; troca semanal de
Aclimatação laboratorial
21 Fevereiro meio e reservatório; C>2> 5 mgL"1

22 Fevereiro Ensaio preliminar Válido testar procedimento experimental

3 Março Amostragem Recolha na piscicultura de Suportes do Biofiltro colonizados

4 Março a 3 Obscuridade; T = 21°C; adição diária de 0.5 mgL"1 N-NHV"; troca semanal de
Aclimatação laboratorial
Abril meio e reservatório; 0 2 > 5 mgL'1
Válido para Avaliação da Taxa de Remoção de Amónia: efeito do Volume de
04 Abril Ensaio
Enchimento

14 Maio Amostragem Recolha na piscicultura de Suportes do Biofiltro colonizados

15 Maio Sem aclimatação laboratorial Obscuridade; T = 21°C; Meio natural da piscicultura; 02> 5 mgL'1

16 Maio Ensaio Válido para Avaliação do efeito do "Biofouling" vs Biofilme bacteriano

17 a 19 Maio Sem aclimatação laboratorial Obscuridade; T = 21°C; Meio natural da piscicultura; 02> 5 mgL'1

20 Maio Ensaio Válido para Avaliação do efeito do "Biofouling" vs Biofilme bacteriano

21 a 23 Maio Aclimatação laboratorial Obscuridade; T = 21°C; adição diária de 0.5 mgL"1 N-NH4+; 0 2 > 5 mgL"1

24 Maio a 20 Período de "Starvation" no Obscuridade; T = 21°C; troca semanal de meio e reservatório de forma a
Junho laboratório remover o "Biofouling"; 0 2 > 7 mgL'1
Retiradas amostras do resíduo aderido nas paredes dos reservatórios e
05 Junho Fotos (amostras de Março)
efectuada uma observação a fresco com obtenção de imagens
21 Junho a Obscuridade; T = 21°C; adição diária de 2 mgL"1 N-NFL(+; troca semanal de
Revivificação meio e reservatório; 0 2 > 5 mgL"1
13 Julho
Válido para Avaliação da Taxa de Remoção de Amónia: efeito da
15 Julho Ensaio Concentração de Substrato
16 Julho Revivificação Obscuridade; T = 21°C; adição diária de 2 mgL"1 N-NH,+; 0 2 > 5 mgL"1

17 Julho Ensaio Válido para Avaliação da Taxa de Remoção de Amónia: efeito da Salinidade

18 Julho em Período de "Starvation" no Obscuridade; T = 21°C; troca Quinzenal de meio e reservatório de forma a
diante laboratório remover o "Biofouling"; 0 2 > 7 mgL"1
Retiradas amostras do resíduo aderido nas paredes dos reservatórios e
15 Setembro Fotos (amostras de Maio) efectuada uma observação a fresco com obtenção de imagens

m -22- Ribeiro H.. 2008

 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

2.2.4.1 Ensaio preliminar e ensaios sem aclimatação

De forma a testar todo o procedimento experimental e de análise foi efectuado um ensaio preliminar (22 Fevereiro).
Desta forma foi possível verificar quais os materiais e equipamentos em falta e/ou necessários de forma a melhorar a
performance da experiência de avaliação das taxas de remoção de Amónia.

Foram também efectuados ensaios sem aclimatação ao ambiente laboratorial (16 e 20 Maio) para avaliação da taxa
de remoção de Amónia, isto de forma a conhecer qual a influência da aclimatação no processo de Nitrificação. A instalação e
procedimento experimental foram os mesmos referidos no ponto: 2.2.4.3, para a Avaliação da Taxa de Remoção de Amónia.
A diferença é que a análise do N-NOy foi qualitativa, utilizando o reagente de Nitrito Griess-llosvay.

2.2.4.2 Período de "Starvation" para remoção do "Biofouling"

Como já foi referido, o aparecimento do "Biofouling", especialmente notório nos suportes amostrados em 14 de
Maio, provocou a alteração do protocolo de processamento dos suportes para os ensaios (Tab. 3).

A instalação experimental que passou a ser usada para remover o "Biofouling" está esquematizada na Fig. 15:
colocação de 300 suportes em cada balão Erlenmeyer de 1000 ml (reactores experimentais), e os restantes (stock) em
balões de 6 Litros de fundo redondo e boca estreita. Foi associado um sistema de arejamento (bomba Sonic P-65, 65 Lm-1;
pedras difusoras esterilizadas) com filtros 0.2um Millex FG50. O meio utilizado foi água do mar artificial, preparada com água
Milipore e sal Sera dissolvido (Sera marin basic salt), com salinidade 20%o.

O procedimento experimental adoptado baseou-se no principio de um escumador, fazendo passar bolhas de ar

finas através do meio, para que o "Biofouling" que se pretende remover se ligue a elas e se desloque para a superfície, onde
se acumula sob a forma de espuma, aderindo também às paredes do recipiente, de onde pode ser removido.

- Espuma provocada pelo arejamento

Figura 15: Esquema da Instalação experimental utilizada para remoção do "Biofouling"

& #
METODOLOGIA USADA

Durante 27 dias os suportes foram mudados semanalmente para outros recipientes com novo meio, sem qualquer
adição de substrato ("starvation") e mantidos na obscuridade a 21 °C. As BN podem ficar até três meses sem amónia e nitrito
disponível, contudo a recuperação é mais rápida para as AOB, o que pode explicar a acumulação ocasional de nitrito quando
a amónia é disponibilizada (Tappe et ai., 1999). Procurou-se assim promover o desprendimento do biofilme de cobertura das
BN pela escumação combinada com empobrecimento do substrato disponível e recuperar o Biofilme Nitrificante (Lee et ai.,
2004).

Foram retiradas amostras da parede dos balões Erlenmeyer e colocadas em lâminas para observação a fresco, e
obtenção de imagens usando um Zeiss Axiophot Photomicroscope, para se proceder à identificação possível dos
microrganismos existentes.

Após este período, foram adicionados diariamente, e durante 23 dias, 2mgL-1 de N-NKfo* para revivificar as BN após
a ausência de amónia, preparando-as para os ensaios de avaliação das taxas de Remoção de Amónia.

2.2.4.3 Avaliação da Taxa de Remoção de Amónia

Para avaliar as taxas de Remoção de Amónia em regime descontínuo ("Batch") adaptou-se o protocolo de Tal et ai.
(2003). As variáveis testadas, em triplicado, incluíram a percentagem de volume de enchimento (39, 58, 78%); a
concentração de N-NHr (0.3,1.2,3.0 mgL-1, como Cloreto de Amónia) e a salinidade (15,20,30%o).

Nestes ensaios mantiveram-se constantes os seguintes parâmetros ambientais: concentração de O2, pH,
Temperatura e a obscuridade.

As experiências foram efectuadas em 500 ml de água do mar artificial (água Milipore e sal Sera (Sera marin basic
salt) dissolvido) com a salinidade pretendida para o ensaio, autoclavada a 121°C durante 30 minutos. Foram mantidos
controlos para cada situação, que eram constituídos por suportes Kaldnes K1 autoclavados a 121°C durante 20 minutos
(Gross et ai., 2003). O substrato, na forma de NH4CI, foi adicionado aos reactores a partir de uma solução stock preparada
no dia anterior à realização da experiência.

No primeiro ensaio (variável: volume de enchimento) o período experimental foi de sete horas, sendo as amostras
retiradas de hora em hora, enquanto que no segundo e terceiro ensaios (variável: Concentração do substrato e salinidade,
respectivamente) as amostras foram retiradas de 30 em 30 minutos durante quatro horas, dependendo da performance
esperada nos reactores (Nijhof & Bovendeur, 1990).

Na instalação experimental, esquematizada na Fig. 16, utilizaram-se como reactores doze balões Erlenmeyer de
1000 ml, com um sistema de arejamento (bomba Sonic P-65, 65 Lm-1; pedras difusoras esterilizadas). Este tem duas funções
no reactor: 1) provocar agitação (mistura) e simular o movimento dos suportes Kaldnes K1 no interior de um MBBR; 2)
introduzir condições aeróbias com concentrações de O2 > 5 mgL-1, (Park et al„ 2007), pois o OD em "Batch" é limitante a
concentrações inferiores a 4 mgL 1 (Chen et al„ 2006). Também se utilizaram filtros 0.2um Millex FG50 como instrumento de
filtração do ar de forma a evitar contaminações.

[IPORTO G r -24- Riheiro H.. 2008

 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

Variáveis
39% (200 Kaldnes)
0.3 mgL1 N-NHA*

15*.

58% (300 Kaldnes)

1.2 mgL 1 N-NH4*

20%«

78 % (400 Kaldnes)

3.0 mgL1 N-NhV

30 %9

Controlo Matraz Matraz Matraz

A B C

Figura 16: Esquema da Instalação experimental utilizada para avaliação das taxas de Remoção de Amónia

Durante a amostragem foram ainda registados os valores de pH, Temperatura e OD com um medidor
Paramétrico 340i WTW. As amostras recolhidas foram centrifugadas a 5000 rpm durante 10 minutos e congeladas (Borges et
ai., 2008) para posterior análise dos parâmetros N-NhU* e N-NOr (segundo os métodos descritos em Aminot & Chaussepied,
1983) e N-NO3- (segundo o método descrito por Jones, 1984).

2.2.4.4 Metodologia de cálculo de k, rNH4 e %NT

Calculo da Taxa de Remoção de Amónia:

Para o cálculo da Taxa de Remoção da Amónia (rNHU), função da área de superfície efectiva do suporte, foi
considerada a existência de uma reacção de ordem zero até que se atingisse uma concentração no reactor de sensivelmente
0,5 mgL1. A concentrações mais baixas do que 0,5 mgL1 a reacção define-se como de ordem superior. A expressão de
cálculo da Taxa de Conversão (rc) para uma reacção de ordem zero pode ser dada pela Equação (15) (Metcalf & Eddy,
2003):

dC
rc = = -k (15)
c
dt

onde k = coeficiente da reacção de ordem zero, M L3 T-1

^ ® -25-
METODOLOGIA USADA

A integração desta equação permite obter a equação de uma recta, cujo declive representa o coeficiente da
equação (k) da reacção.

De forma a obter as taxas de remoção de amónia (rNHU) em função da área de superfície efectiva do suporte
disponível para o desenvolvimento de biofilme (B), e considerando o volume de meio utilizado (ip), utilizou-se a Equação (16).

rNH4(ML-2T-') = ^ - (16)

Percentagem d e Nitrificação:
Como as BN têm um crescimento lento, e considerando que a concentração da biomassa se mantém constante
durante as curtas experiências em "Batch" (Li et ai, 2006), ou seja, que não há assimilação de N-NHr pelas BN, pode
calcular-se a percentagem de Amónia que foi removida por Nitrificação (% NT), através da Equação (17).

(N - N02( fmal) +N- N03( fmal) )

3(>,g/)
%NT = — ^ ^ x 100 (17)
(N-NHiiimaal)-N-NH;(fmal))

2.2.4.5 Análise Estatística de k

A análise dos resultados obtidos nos ensaios de avaliação das taxas de Remoção de Amónia, consistiu no
tratamento estatístico dos dados recorrendo ao teste de Kruskal-Wallis (K-W). Este teste, não paramétrico e idêntico a uma
ANOVA a um Factor, foi utilizado para determinar se as observações efectuadas podiam ser provenientes do mesmo grupo
ou de grupos diferentes que possuíssem a mesma mediana, com um nível de confiança de 95% (p <0,05) (Zar, 1996;
Stephens, 1998; Marques de Sá, 2007).

O parâmetro avaliado por este teste foi o coeficiente (k) da equação de cálculo obtida da taxa de Conversão (rc) (ie,
os declives da recta de tendência linear ajustada aos dados, o que corresponde à velocidade de remoção observada). Este
teste permite assim avaliar a influência dos diferentes parâmetros testados na velocidade de remoção do substrato. Este
teste foi escolhido pelo facto de os dados não apresentarem uma distribuição normal.

Esta análise estatística foi realizada com o software Excel 2003 e Statistica versão 8, no sistema operativo Windows
XP. O valor do teste de K-W, H, foi comparado com o valor tabelado (Zar, 1996) para saber se o valor observado está na
região critica, sendo assim rejeitada a Hipótese nula.

HPORTO . 26 - Ribeiro H.. 2008

rï"" UNIvf «itwO! 00 PtWTO
 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMB IENTE

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Análise à água da piscicultura
A caracterização dos diversos parâmetros referentes à qualidade da água da piscicultura permitiu inferir sobre as
condições que os peixes estavam a ser cultivados. Por outro lado, permitiu avaliar a evolução desses parâmetros ao longo do
ciclo de pré­engorda, bem como avaliar em que condições funcionava o Biofiltro.

3.1.1 Ciclo de pré­engorda

Os resultados da caracterização da água, quer recirculada à entrada do "raceway" (RC­E), quer nova, para o
período de pré­engorda, anterior à alimentação (AC), estão sumariados na Fig. 17 e Tab. 4.

RC­E I 19.12.07B 22.01.08D 3.03.08

24.0
0.30
u.uuo ­
0.20 _J~| 0.002 ­ J ~ ~
0.10
0.00 __jBm_LTJML_L_, o.ooo I ' !*■ I-,
02 C02 N­N03­ TSS PH T(°C) N­NH4+ N­N02­ N­NH3
(ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm)

Água nova do furo

0.30 ­ 0.003 ­
24.0 ­
16.0 ­ rm. 0.20 ­ 0.002 ­
8.0 •
m li 0.10 ­
—n
0.001 ­
0.000 ■
02 C02 N­N03­ TSS pH T(°C) N­NH4+ N­N02­ N­NH3
(ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm)

Figura 17: Perfis de concentração dos parâmetros na RC-E e água nova, AC.

Tabela 4: Valores de Fosfatos, Alcalinidade Total e Salinidade na RC - E (AC) e na água nova

po43+ Alcalinidade Total Salinidade
Água recirculada 2.16 ± 0.29 mgL" 1
173.3 ±2.8 mgL CaC0 3-1
21.10±0.85%o
Água nova do furo 0.16 ± 0.28 mg!/ 1
180.0 ±5.0 mgL CaCQ3 -1
20.76 ± 0.40 %o

Desde logo verifica­se que a água nova apresenta concentrações inferiores de N­NO3­; N­NO2­; TAN e SST em
relação à água recirculada, o que permite alguma diluição desses parâmetros aquando da renovação diária. Em relação ao
pH e Temperatura a diferença entre os dois tipos de águas é irrelevante. No entanto, a concentração de CO2 na água nova
era superior à da água recirculada, contrariamente à de O2, que era muito inferior. Este facto poderá explicar­se pela
oxigenação que a água recirculada sofria antes de entrar nos "Raceways", apresentando concentrações de O2 superiores a
15 mgL­1.

­27­
/vN " r
RESULTADOS E DISCUSSÃO

Sabendo que o NH3 é um dos parâmetros mais importantes da qualidade da água, pode dizer­se que os níveis de
N­NH3 na água recirculada, calculados a partir do TAN avaliado, estão dentro dos limites seguros para o cultivo de peixe
referidos por Meade (1985); no entanto, nota­se um claro aumento do TAN ao longo do ciclo de pré­engorda, devido
naturalmente ao crescimento dos peixes. A concentração de N­NOr também se mantém, ao longo de todo ciclo, bem abaixo
do 1 mgL 1 descrito por Losordo et ai. (1998) como limite seguro. A concentração de N­NO3­, que se acumula ao longo do
ciclo, é a menos problemática segundo Masser et ai. (1999), pois este composto só será tóxico a concentrações superiores a
300 mgL­1, pelo que o valor mais alto registado, sensivelmente 8 mgL­1, não representará qualquer risco ao cultivo de peixe.

A concentração de CO2 poderá ser preocupante, pois está bem perto do limite de segurança considerado por
Losordo et ai. (1998); no entanto, e segundo o mesmo autor, os elevados níveis de C^do sistema, quase o triplo do limite
mínimo, atenuam a possível toxicidade do CO2.

A Temperatura, o pH, e a Salinidade não variaram muito, ao longo do ciclo, na água recirculada e na água nova.
Segundo Imsland et ai. (2007), o Rodovalho pode ser cultivado num vasto intervalo de Temperatura (entre 10 e 22 °C) e de
Salinidade (entre 15 e 33.5 %o) pelo que os valores verificados na piscicultura se encontram num intervalo ideal ao seu
cultivo. O pH também se encontra dentro do intervalo ideal referido por Masser et ai. (1999), e o seu valor estável poderá
dever­se à elevada concentração da Alcalinidade Total, muito superior aos 50 mgL 1 de CaCC>3 referidos pelo mesmo autor, e
que actuará como um tampão à acidificação.

Os resultados referentes às características da água no Biofiltro, AC, quer na entrada, quer à saída, estão
sumariados na Fig. 18 e na Tab. 5.

Biofiltro Entrada ­ AC ia 19.12.07» 22.01.080 3.03.08

0.30 0.003

UL
0.20 0.002 -I
0.10 0.001
0.00 0.000
02 C02 N­N03­ TSS PH T (°C) N­NH4+ N­N02­ N­NH3
(ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm)
(PPm)

Biofiltro Saída ­ A C
24.0 ­
0.30 ­,
0.003 ­
16.0 ­ 0.20 0.002 ­
8.0 ■ 0.10 0.001 ­
0.00 ­ 0.000 ­
02 C02 N­N03­ TSS pH T(°C) N­NH4+ N­N02­ N­NH3
(ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm)

Figura 18: Perfis de concentração dos parâmetros das amostras no Biofiltro (Entrada e Saída), AC.

HPORTO ­28­ Ribeiro H.. 2008

■JT.BSSSS,
 MESTRADO EM CIÊNCIAS t: TECNOLOGIA DO AMBIENTE

Tabela 5: Valores de Fosfatos, Alcalinidade Total e Salinidade no Biofiltro (Entrada e Saída), AC.
PO^ Alcalinidade Total Salinidade
Biofiltro Entrada - AC 2.17 ±0.29 mg L' 1
173.3 ±2.8 mg L"'CaC0 3 21.1 ±0.85 96o
Biofiltro Saída - AC 2.33 ± 0.29 mg L" 1
168.3 ±2.8 mg L''CaC0 3 21.1 ±0.85 %o

Sendo, segundo Zhu & Chen (1999), 0.07 mgL 1 de TAN a concentração mínima para suportar o biofilme nitrificante,
os valores verificados no Biofiltro ficarão um pouco acima das necessidades mínimas das BN, isto se não se tiver em conta a
competição por parte das BH (Verhagen & Laanbroek, 1991 ; Joo et ai, 2005). Os valores obtidos são inferiores aos referidos,
em média, 1.1 mgL 1 N-NH-r por Borges et ai. (2003), embora se encontrem no intervalo usual, referido por Rusten et ai.
(2006), para pisciculturas marinhas de cultivo do Rodovalho. Tendo em conta que a concentração de TAN é um dos
parâmetros mais importante para a Nitrificação ocorrer, podemos supor que as AOB estarão sob concentrações de Substrato
muito inferiores às favoráveis ao seu desenvolvimento, que serão de 28 a 140 mgL 1 de N-NhV, de acordo com Watson et ai.
(1989).

Os valores obtidos de N-NOr também são em média inferiores, 0.30 mgL 1 N-NOr, referidos por Borges et ai.
(2003); contudo ainda estão mais afastados do intervalo ideal para o desenvolvimento das NOB, que será de 28 a 420 mgL 1
N-NOr, segundo Watson et ai. (1989). Em relação à concentração de O2, o Biofiltro estará a operar em óptimas condições
para a Nitrificação. Com efeito, segundo Rusten et ai. (2006), e tendo em conta a concentração de TAN verificada no Biofiltro,
a concentração de O2 só se tornaria um parâmetro limitante para valores inferiores a 2 mgL 1 .

A Temperatura variou ligeiramente ao longo do ciclo de pré-engorda, e embora esteja um pouco abaixo do valor
ideal para as BN, de 25°C, referido por Hagopian & Riley (1998), não deverá ter grande impacto na Nitrificação já que o seu
valor é próximo deste (18°C). O pH é outro parâmetro que pouco variou: em Dezembro encontrava-se sensivelmente a 8.60,
e nos restantes meses sensivelmente a 7.50, estando dentro do intervalo considerado óptimo por Chen et ai. (2006) para a
Nitrificação. A ligeira acidificação do meio observada pode ter sido provocada pela Nitrificação, pois a alcalinidade total no
biofiltro também diminuiu ligeiramente da entrada para a saída; contudo o seu valor encontra-se próximo do ideal
considerado por Rusten et ai. (2006), e é muito superior aos 75 mgL 1 de CaCÛ3 necessários para manter a taxa de
Nitrificação máxima, referidos por Gujer & Boiler (1986).

Os resultados da amostragem referente ao período após a alimentação dos peixes (DC) estão patentes na Fig. 19.
Apenas são apresentados os parâmetros que tiveram uma variação importante para o estudo em questão.

S 19.12.07 «22.01.08 D 3.03.08 RC-E Biofiltro Entrada Biofiltro Salda

1.60-, 1 60
- 1.60
1.20- 120 1.20
0.80 0.80 0.80
0.40 - 0.40 0.40
0.00
N-NH4+(ppm) N-N02-(ppm) N-NH4+ (ppm) N-N02- (ppm) N-NH4+(ppm) N-N02-(ppm)

Figura 19: Perfis de concentração dos parâmetros no RC-E e Biofiltro (DC).

A -29
RESULTADOS E DISCUSSÃO

Podemos verificar que, de uma forma geral, existiu um ligeiro aumento de N-NfV depois da alimentação dos
peixes, o que está de acordo com o descrito por Person-Le-Ruyet et ai. (1991). Este facto não justifica os valores anormais
de N-NH4+ e N-NO2- verificado à saída do Biofiltro no dia 03/03/2008. Este aumento no Biofiltro poderá ser consequência de
intensa Amonificação e Nitritação, sem o correspondente incremento da Nitratação.

3.1.2 Actividade do Biofiltro em Vinte e quatro horas

Os valores da concentração de Substrato registada ao longo do ciclo de pré-engorda não constituíram uma
plataforma de conhecimento da sua variação diária. Com o objectivo de obter informação adicional sobre o funcionamento do
biofiltro, já que, como foi referido anteriormente, a concentração de substrato pode ser um factor limitante no Biofiltro
estudado, efectuou-se uma amostragem de 24 horas. Os resultados obtidos estão expostos na Fig. 20, e a partir deles foi
calculada a eficiência de remoção, apresentada na Fig. 21.

Efectivamente existe uma variação diária, Fig. 20, das concentrações dos substratos utilizáveis pelas BN. Podemos
verificar a obtenção, seis horas depois da alimentação, de um máximo de excreção de N-NH-t* como indicam Person-Le-
Ruyet et ai. (1991) e Boeuf et ai. (1999), e um máximo de N-NO2- nove horas depois (Krumins et al„ 2001). Os valores
obtidos continuam dentro do intervalo usual, referido por Rusten et ai. (2006), para as pisciculturas do tipo da que foi
estudada.

_^N-NH4+In —_N-NH4+Out —*-N-N02-ln —«-N-N02-Out

08h 09h 10h 11h 12h 13h 14h 15h 16h 17h 18h 19h 20h 21h 22h 23h OOh 01h 02h 03h 04h 05h 06h 07h
Espaço t e m p o r a l

Figura 20: Perfis de concentração de N-NH4+ e N-N02" nas amostras de 24 horas ao Biofiltro

Um estudo similar realizado por Krumins et ai. (2001) mostrou uma variação semelhante à encontrada neste estudo,
e ainda que a utilização de ozono removia N-NIV. O mesmo referem Summerfelt et ai. (1997) para o NO2-. Efectivamente,
durante o período em que o Ozonizador esteve ligado, a concentração do N-NOr foi bastante inferior à observada no período
em que o ozonizador estava desligado. Da análise à eficiência de remoção, Fig. 21, podemos verificar que a grande
percentagem de remoção de N-NO2- no Biofiltro só aconteceu no horário em que o ozonizador estava desligado, o que pode
significar que durante o dia o Ozonizador poderá estar a fazer o "trabalho" destinado às NOB.

Em relação à eficiência de remoção de N-NH4+ no Biofiltro verifica-se que esta é baixa e muito instável, e que na
maior parte do tempo é acrescentado N-NrV ao efluente. Isto poderá, talvez, dever-se ao Ozonizador que promove a

HPORTO E S - 30 - Ribeiro H.. 2008

 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

degradação de material orgânico azotado presente no efluente (Tango & Gagnon, 2003), e à Amonificação, por parte das BH,
de sólidos orgânicos contidos no Biofiltro (Golz et ai., 1999). Contudo, o pico de acréscimo de N­NtV observado às 04h00
poderá dever­se à excreção nocturna de Ureia por parte dos Rodovalhos, referida por Dosdat et ai. (1996), ureia esta que
depois será transformada em Amónia.

O 50 I Amónia I Nitrito

M
c
«u
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o „
E"10
f f i J ■ JJJJJymfV
S 2-30
S? ­50
08h 09h 10h 11h 12h 13h 14h 15h 16h 17h 18h 19h 20h 21h 22h 23h OOh 01h 02h 03h 04h 05h 08h 07h

Espaço temporal

Figura 2 1 : Eficiência na remoção de N-NH4+ e N-N0 2 " no Biofiltro durante as 24 horas amostradas.

A variação da concentração de N­NOy e SST ao longo das 24 h estão visíveis na Fig. 22. Verificou­se que os
valores de N­NOy obtidos no ciclo de pré­engorda anterior foram inferiores aos verificados nesta analise, 3 mgL 1 e 8 mgL­1,
respectivamente. Isto poderá ser explicado pela acumulação com o amadurecimento do Biofiltro referido por Masser et ai.
(1999), a par da baixa renovação diária da água. Os valores relativos aos SST subiram ligeiramente, 1 mgL 1 , em
comparação com os valores encontrados na amostragem do ciclo de pré­engorda anterior.

­N­N03­ln ■ N­N03­ Out

o 12.0
i«
£ — 10.0
c m 8.0 H
o E
« •=• 6.0
5 4.0
08h 09h 10h 11h 12h 13h 14h 15h 16h 17h 18h 19h 20h 21h 22h 23h OOh 01h 02h 03h 04h 05h 06h 07h

Espaço temporal

­SST In -SST Out

O 12.0
<* _ 10.0
G _J
C O) 8.0
« E
« ­=• 6.0
O
4.0
O
08h 09h 10h 11 h 12h 13h 14h 15h 16h 17h 18h 19h 20h 21h 22h 23h OOh 01h 02h 03h 04h 05h 06h 07h

Espaço temporal

Figura 22: Perfis de concentração de N-N03" e SST nas amostras de 24 horas ao B iofiltro

31
/v\ *Sr
RESULTADOS E DISCUSSÃO

Da análise à eficiência de remoção, Fig. 23, verifica­se que há remoção de SST, o que suporta a ideia referida
anteriormente de que poderá existir uma forte Amonificação. Essa remoção pode também significar uma deposição de
sólidos no Biofiltro, que depois poderão servir de substrato para as BH. Enquanto que os SST à entrada referentes ao
período entre 15h00 e as 19h00 serão produzidos pelo metabolismo natural dos peixes depois da alimentação, os SST
referentes ao período entre as OOhOO e as 09h00 não tem uma explicação plausível; contudo, podem ter­se libertado das
canalizações existentes no sistema.

I Nitrato

08h 09h 10h 11h 12h 13h 14h 15h 16h 17h 18h 19h 20h 21h 22h 23h OOh 01h 02h 03tl 04h 05h 06h 07h

Espaço t e m p o r a l

Figura 23: Eficiência na remoção de N-N03" e SST no Biofiltro durante as 24 horas amostradas.

O acréscimo de N­NO3­ observado no Biofiltro, deveria ser, supostamente, atribuído à Nitrificação e à recirculação
da água (efeito de concentração). No período nocturno, entre as 02h00 e 09h00, esta seria uma explicação óbvia,
corroborada pela remoção de N­NO2'observada, feita certamente pelas NOB, e que ocorre entre as 17h00 e 03h00. Entre as
12h00 e 16h00 podemos verificar uma acumulação de Nitrito, Fig. 21. Possivelmente foi­se transformando em Nitrato,
embora as NOB tenham pouca actividade neste período em virtude da reduzida concentração de N­NO2­, Fig. 20,
possivelmente devido ao Ozonizador como referido por Summerfelt et ai. (1997).

3.2 Contagem de Bactérias Heterotrófícas

Os resultados apresentados na Fig. 24 representam a contagem de bactérias em suspensão na água e nos
suportes do Biofiltro ao longo do ciclo de pré­engorda.

C o n t a g e m d e B H na á g u a Contagem de BH nos suportes

Q 19/12/2007 «22/01/2008 D 3/3/2008

D 19/12/2007 ■ 22/01/2008 D 3/3/2008 3.0B­07
1.0B-06
T 8.0B­05
O, 2.0B­07
g 6.0B -05
O
O 4.0B­05 jj­ 1.0B­07
LL
=> 2.0B­05
0.0D­00 L_Wnn, I ■ L 0.0B­00
Biofiltro In Biofiltro Out Biofiltro h Biofiltro Out

Pontos de A m o s t r a g e m Pontos de A m o s t r a g e m

Figura 24: Perfis do número de UFC de BH em suspensão na água e nos suportes do Biofiltro.

'ORTO 32 Ribeiro H.. 2008

Tç SSK
 MESTRADO EM CIÊNCIAS F. TECNOLOGIA DO AMBIENTE

Verificou-se que a concentração de bactérias, quer em suspensão quer nos suportes, variou ao longo do ciclo
amostrado. Embora os gráficos tenham escalas e unidades diferentes, podemos verificar a existência de uma tendência.
Assim, do 1 o para o 2o mês há uma diminuição de BH em suspensão na água à entrada do Biofiltro, contrastando com um
aumento nos suportes. O mesmo não acontece na contagem das bactérias em suspensão à saida do Biofiltro; no entanto há
um acréscimo de BH do 1 o para o 2° mês nos suportes do biofiltro à saída. Pode ter ocorrido adesão ("attachment") das
bactérias em suspensão aos suportes, tendo quantitativamente aumentado devido à sua proliferação.

Na enumeração referente ao dia 03/03/2008 há uma nítida diminuição do número de UFC nas quatro amostras. Isto
pode ter acontecido por influência directa do "Biofouling" encontrado posteriormente, que quer por competição ou mesmo por
predação tenham reduzido o número de BH, ou pode ter sido provocada pelo desprendimento. Num estudo, Leonard et ai.
(2000) referem que o Biofiltro é a principal fonte de BH no RAS, e que são libertadas, a partir do material de enchimento,
bactérias para o tanque de cultura.

Leonard et ai. (2002) referem a observação de uma concentração estável de bactérias em suspensão e em
suportes. Em suspensão enumeram 3.29x10 3 ± 2.09x103 UFC mL 1 , o que comparativamente com os resultados obtidos
neste estudo é um valor muito inferior, 45x menor tendo em conta o valor encontrado em 03/03/2008 na Entrada do Biofiltro.
Os mesmos autores referem que enumeram 3.13x105 ± 2.6x105 UFC g-1 em meio fixo, valor também inferior ao encontrado
neste estudo. Comparando com o valor obtido neste estudo em 03/03/2008 à saída do Biofiltro, é 10x inferior.

3.3 Enriquecimento em AOB e NOB

No primeiro procedimento experimental para efectuar enriquecimento, o Meio usado ficou anaeróbio ao fim de 3
dias, pelo que se teve de terminar a experiência, e consequentemente delinear outro procedimento experimental. Com o
segundo procedimento experimental foram modificadas as condições de arejamento, e não se verificaram condições
anaeróbias no Meio.

Como referido na metodologia, durante os primeiros 15 dias foram utilizadas fitas indicadoras de pH, que no entanto
não se mostraram adequadas para monitorizar pequenas variações deste parâmetro. Também não se verificou a alteração
da cor do indicador de pH, vermelho de cresol, referido por Cote & Gherna (1994) devido à nitrificação. Procedeu então à
alteração da quantidade de indicador adicionada ao Meio, até se encontrar uma quantidade, 0.5x103 gL 1 , que promoveu a
alteração da cor do indicador.

Ao longo do período de enriquecimento dos suportes em AOB e NOB, foi possível registar alterações de pH nos
meios usados. O pH do Meio de enriquecimento NOB pouco variou ao longo do tempo, apresentando uma variação máxima
de 0.56 unidades de pH entre o 120° e 128° dia. Sempre que o pH do Meio para AOB foi ajustado, registou-se qual o valor
que tinha provocado a inibição da Nitrificação, apresentado na Fig. 25 (A). Após o 65° dia, visualmente observou-se a
alteração diária da cor do indicador de pH, pelo que ao 121° e 122° dia foi registada a variação do pH ao longo de 16 horas,
Fig. 25 (B).

^ ©
RESULTADOS E DISCUSSÃO

A) Valor de inibição de pH atingido no Meio B) Variação do pH no Meio AOB >0B1

6, „ AOB (121° dia e 122° dia) . AQB2

I 4
a

pH 20° dia 41° dia 59° dia 83° dia 105° 119° 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
inicial Espaço temporal dia dia tempo (horas)

Figura 25: Perfis dos valores de inibição e variação do pH no meio de enriquecimento.

Da Fig. 25 (A) observamos que ao 20° dia a Nitrificação era inibida a pH 5.93, e ao fim do 41° dia era inibida a pH
5.05. Esta variação estabilizou a partir do 62° dia, a sensivelmente pH 4.50, embora se tenha obtido no 119° dia valores
ligeiramente inferiores, pH= 4.35. Os valores registados nos dias subsquentes variaram entre pH 4.60 e 4.40.

Da interpretação da Fig. 25 (A) podemos supor que houve uma adaptação fisiológica das BN, faseada ao longo do
tempo, ao valor inibitório de pH, tendo em conta que na piscicultura onde estavam, o valor de pH se mantinha estável (pH =
7.86 ± 0.63). Adaptações fisiológicas das AOB e NOB a valores de pH baixos foram demonstradas por Gieseke et ai. (2006),
e segundo estes autores, a adaptação pode estar relacionada com funções da célula, como por exemplo transportadores de
NhLr. Por outro lado, a variação observada perspectiva um forte indício do desenvolvimento da população bacteriana AOB,
que devido à Nitrificação acidifica cada vez mais o Meio.

O resultado da Fig. 25 (B) representa a variação do valor de pH no Meio, ao longo de 16h horas, depois de se ter
ajustado o seu valor a pH = 8. O valor de pH = 7 aparece como um ponto de mudança no comportamento observado. O
substrato preferencial utilizado pelas AOB é o NH3 (Suzuki et ai., 1974; Watson et ai., 1989) e segundo Starbuck (1998) a
percentagem de NH3 a 20 °C, pH = 8 e a 20 %o de salinidade é de 3.41 %, diminuindo sensivelmente para 0.39 % a pH = 7.
Tendo em conta a linha de raciocinio usada para explicar a Fig. 25 (A), deve ter existido uma adaptação fisiológica no uptake
de substrato, pois a valores de pH inferiores a 7 está disponível, preferencialmente, NH4+, condição a que estas BN não
estavam familiarizadas no Biofiltro.

Segundo Chain et ai. (2003), a espécie Nitrosomonas europaea tem um transportador de NH4+ que a pH baixo
complementa o uptake passivo de NH4"-. Possivelmente o valor de pH = 7 será o ponto em que há uma mudança de
transportadores de substrato, de NH3 para NH4+, e devido a isso, há um decréscimo no processo de Nitrificação, e
consequentemente a acidificação do Meio. No entanto é necessária mais investigação, nomeadamente a nível bioquímico,
para suportar esta hipótese.

A partir da inoculação em meio de cultura solidificado do biofilme retirado dos suportes colocados nos meios de
enriquecimento, não foi possível obter contagens em MSG, isto devido à dificuldade de visualização das UFC. No entanto,
registou-se crescimento no MAuA, estando os valores de UFC apresentados na Fig. 26.

[ | PORTO 34 Ribeiro H.. 2008

 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

A) Contagem de UFC em M Au A com B) Contagem de UFC em MAuA com

45 dias em Meio de enriquecimento 94 dias em Melo de enriquecimento
l.6E+06 ? ^,^^ 1.6E+06

1.2B06 m 1.2E+06

O 8.0E+05 O 8.0E+05

4.0E+05 4.0E+05

O.OE+00 O.OE+00 r-fn QZL

AOB1 AOB2 NOB1 NOB2 AOB1 A0B2 NOB1 N0B2

Figura 26: Perfis de UFC de BH inoculados em MAuA a partir dos suportes do meio de enriquecimento.

Da comparação da Fig. 26 (A e B) podemos constatar uma grande diferença no número de UFC de AOB. Uma das
possíveis explicações para esta situação está relacionada com o tempo de incubação em Meio de enriquecimento. Como os
Meios AOBie2 tem bastante Amónia, haverá BH que também a podem usar como substrato (Verhagen & Laanbroek, 1991;
Joo et ai, 2005), e podem utilizar como fonte de carbono as bactérias que morrem durante o processo de empobrecimento de
fontes nutricionais orgânicas. Jannasch (1967) refere que há várias BH marinhas que crescem com concentrações baixas de
carbono orgânico, situação que pode explicar o facto de aos 45 dias ainda existir um número tão elevado de UFC, ou seja,
provavelmente serão BH. No entanto, aos 95 dias, e após vários "wash-outs" que removem as bactérias mortas do meio e
diminuem o carbono orgânico, a capacidade de multiplicação das restantes BH é diminuída. Esta situação, possivelmente,
terá provocado uma redução substancial de BH no meio AOB.

No meio NOB não existia Amónia, por isso as BH não teriam substrato para se desenvolver, e pelos resultados
obtidos podemos cimentar o raciocínio anterior, que o elevado número de UFC no meio AOB seria devido às BH. Contudo,
faltaria um controlo, em meio de Marine Agar (Difco 2216) para suportar esta hipótese. Este controlo não foi efectuado, pois
esta experiência tinha como principal objectivo a obtenção de colónias para no futuro obter culturas puras para identificação.

3.4 Estudos sobre Nitrifícação

3.4.1 Ensaio preliminar
O ensaio preliminar efectuado para testar todo o procedimento experimental e analítico a usar na avaliação das
taxas de remoção de ámonia, cumpriu esse objectivo.

Os resultados obtidos estão apresentados na Fig. 27, podem-se verificar algumas não conformidades com o
processo a estudar, como o aumento abrupto de N-NHr entre os 180 e 240 minutos no ensaio com 58 % de Volume de
enchimento. Estes erros podem ser resultado de uma falta de familiaridade com os procedimentos; no entanto, o ensaio foi
útil, pois foi possível verificar que existia de facto uma diminuição, em geral, de N-NH-r e um aumento de N-NOr devido à
Nitrificação.

AA © -35-
RESULTADOS E DISCUSSÃO

Enssaio: 39% de Volume de Ensaio: 58% de Volume de Ensaio: 78% de Volume de

Enchi me into _ « _ N ­ NH4 Enchimento —•— N ­ NH4 Enchimento —•— N­NH4
—•— N ­ N02 ­­—N­N02 ­•—N­N02
5­ 51
o 0
S 4­ S 4
c °>2
8^2^ Sê
g 1­ § 1­
° o­___ mr. ■ ■ * —u_j O ni
60 120 180 240
() 60 120 180 240 0 60 120 180 240
tempo (m) tempo (m) t e m p o (m)

Figura 27: Perfis da concentração de N-NH4+ e N-N02" no ensaio preliminar.

3.4.2 Interferência do "Biofouling"

Foram feitos ensaios para avaliar as Taxas de Remoção de Amónia sem aclimatação ao ambiente laboratorial, isto
de forma a conhecer qual a influência da aclimatação no processo de Nitrificação, obtendo­se o exposto na Fig. 28.

A) Ensaio: 0.3 mgL 1 N­NH4 A) Ensaio: 1.2 mgL' 1 N­NH4 A) Ensaio: 3.0 mgL' 1 N­NH4
1 ­ ♦ — N ­ NH4 2 ­, —♦— N­NH4 ■N­NH4
o O
­ * — N ­ N02 f ­ ■ — N ­ N02
a 4 ­ '■\ ­N­N02

8 E 1 Í1 ­
8 I „ .\.
8 \ . —f-~
60 120 180 240 0 60 120 180 240 60 120 180 240
t e m p o (m) tempo (m) t e m p o (m)

B) Ensaio: 20°/ oo Salinidade B ) E nsaio: 30°/oo Salinidade

B) Ensaio: 1S°/00 Salinidade
­♦—N­NH4 o 4 n
—♦— N­NH4
a0 4
<> Ti ­ * — N ­ N02
o 4 ­ —•—N­NH4
. ­ ■ — N ­ N02 G =■ á E =• 3 ­•­N­N02
c O) 2 ­
1 i' 2 ­ 8 * 1 ­ 5*1.
o
O 0 1
0 30 60
0 30 60 () 30 60
tempo (m) tempo (m) tempo (m)

Figura 28: Perfis da concentração de N-NH4+ e N-N02" nos ensaios influenciados pelo "Biofouling".

Podemos verificar no ensaio com a variação das concentrações de N­NIV (Fig. 28 A), 0.3; 1.2 e 3.0 mgL 1 , que ao
fim de 30 minutos, a Amónia já tinha sido removida. No entanto, não houve detecção de Nitrito, nem Nitrato (analisado
qualitativamente com reagente de Griess­llosvay). No ensaio efectuado quatro dias depois, com diferentes salinidades (Fig.
28 B) e com uma concentração de 3.0 mgL­1 de N­NIV, verificou­se que ao fim de uma hora a Amónia já tinha sido

IPORTO 36 Ribeiro H.. 2008

*c =
 MESTRADO EM CIÊNCIAS H TECNOLOGIA DO AMBIENTE

removida. No entanto, verificou-se a acumulação residual de Nitrito. Qualitativamente não foi possível verificar a formação de
Nitrato.

Podemos verificar que não houve Nitrificação, ou que esta foi reduzida, possivelmente devido ao designado
"Biofouling". No entanto, e tendo em conta os resultados obtidos no que se refere aos parâmetros TAN e Nitrito, este
"Biofouling" pode ser considerado benéfico, visto que houve uma rápida remoção da Amónia da água e sem formação de
Nitrito (tóxico para os peixes).

Durante o período de "Starvation" foram retiradas amostras da parede dos balões Erlenmeyer, e a observação ao
microscópio óptico de preparações a fresco de biofilme permitiu detectar a presença de diversos microrganismos, alguns
deles apresentados nas imagens da Fig. 29.

Figura 2 9 : Observação ao microscópio de preparações a fresco de amostras de "Biofouling" em 05 de Junho.

Dos organismos observados podemos referir a presença de cianobactérias marinhas (possivelmente do género:
Lyngbya, Oscillatoria, Phormidium, Leptolyngbya), microalgas, copépodes, protozoários, entre outros.

A remoção rápida da Amónia, sem formação de Nitrito pode ser uma vantagem no que respeita à qualidade final da
água tratada; contudo, existe muito pouca bibliografia que refira qual o papel deste "Biofouling" num RAS, principalmente o
das cianobactérias. Craggs et ai., (1997) descrevem a utilização de dois géneros de cianobactérias (uma do género
Oscillatoria) que removeram 100% da Amónia do efluente de uma ETAR, e referem que os níveis de Nitrito e Nitrato são

37
& • "- Bi
RESULTADOS E DISCUSSÃO

vestigiais à saída do efluente, o que vai de encontro aos resultados obtidos nos ensaios efectuados. Os mesmos autores
referem que ambos os géneros de cianobactérias tinham propriedades aderentes.

A remoção do "Biofouling" presente nos suportes foi morosa, o que se pode explicar pelas propriedades aderentes
das cianobactérias referidas por Craggs et ai. (1997), e pela produção de EPS por microalgas, quer em obscuridade, quer
sob condições de luminosidade, que possibilitam a fixação ao biofilme referidas por Shipin et ai. (1999) e Delahaye et ai.
(2005). Segundo Shipin et ai. (1999), existem várias espécies de microalgas que funcionam heterotroficamente no escuro e
que continuam a produzir clorofila.o que pode também explicar porque é que elas se mantêm no Biofiltro da piscicultura.

Apesar de tudo, Carmichael (1992) refere que as cianobactérias produzem metabolitos secundários, entre outros,
as biotoxinas que têm um efeito negativo em tecidos, células e organismos. Li et ai. (2001) mostraram que uma cianobactéria
marinha, do género Lyngbya, produz uma neurotoxina ATX, Schrader et ai. (1998) referem que cianobactérias do género
Oscillatoria produzem compostos que contaminam o músculo dos peixes, que depois não podem ser vendidos. Logo, a
presença de cianobactérias em biofiltros de RAS poderá não ser aconselhável.

Sensivelmente dois meses depois da obtenção das imagens de "Biofouling" da Fig. 29, e já depois do período de
"Starvation" e de serem efectuados dois ensaios para avaliação de taxas de remoção da Amónia, foi efectuada uma nova
observação microscópica de preparações a fresco de biofilme retirado da parede dos balões Erlenmeyer que permitiu
detectar a presença de "outros" microrganismos peculiares, apresentados nas imagens da Fig. 30.

Figura 30: Observação ao microscópio de preparações a fresco de "Biofouling" em 15 de Setembro.

Estes "novos" microrganismos, os mais curiosos designados inicialmente por "botinhas", conduziram a muitas
dúvidas na sua identificação. Após pesquisa bibliográfica pode dizer-se que poderão corresponder a uma forma evolutiva de
uma das muitas espécies da cianobactéria marinha do género Pleurocapsa, isto tendo em conta as características descritas
por Waterbury (1989).

Presume-se que o aparecimento deste "Biofouling" se deveu aos peixes que foram introduzidos no sistema, no final
de Dezembro, que eram alimentados com "água verde", e que por isso tinham no tracto intestinal microalgas que depois
foram excretadas e se desenvolveram no RAS.

g -38- Ribeiro H.. 2008

 MESTRADO HM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

3.4.3 Taxas de Remoção de Amónia

Neste sub­capítulo apresentam­se os resultados referentes ao principal objectivo traçado para esta Dissertação, ou
seja, avaliação da Taxa de Remoção de Amónia (rNhU), tendo em conta três variáveis: Volume de Enchimento (VE),
Concentração de Substrato (CS) e Salinidade (S). Nos ensaios de cada variável, efectuados na obscuridade, foram mantidos
constantes os parâmetros ambientais referidos na Tab. 6.

Tabela 6: Valores dos parâmetros ambientais nos ensaios para avaliação das taxas de Remoção de Amónia
Volume de Concentração
Variável Temperatura PH o2 enchimento de N-NH4
Salinidade
Volume de 6.1 ±0.1 mg/l 3.5 ±0.1 mg/l 20.0 ± 0.0 96o
21.2 ± 0.3 °C 7.74 ± 0.03
enchimento
Concentração 58% 20.0 ± 0.0 96o
21.6 ± 0.3 °C 7.75 ±0.10 6.3 ± 0.3 mg/l
deN-NH4
Salinidade 21.1 ±0.5 °C 7.73 ± 0.07 6.1 ±0.2 mg/l 58% 2.9 ± 0.2 mg/l

De referir que a taxa de conversão (rc) é descrita como uma reacção de ordem zero até serem obtidas
concentrações de aproximadamente 0.5 mgL 1 , tendo em conta que se consegue ajustar uma linha de tendência linear até
esse valor, com um R2 próximo de 1. Este valor de 0.5 mgL 1 é um pouco inferior ao reportado por Greiner & Timmons (1998),
Nijhof & Bovendeur (1990) e Eding et ai. (2006). Também se considerou a existência de uma reacção de ordem zero para o
grupo de 0.3 mgL 1 N­NIV, pois a linha de tendência linear aplicada tinha R2 = 0.9633, superior ao R2 de uma linha de
tendência exponencial.

3.4.3.1 Efeito do Volume de Enchimento

A primeira variável testada foi o Volume de Enchimento de suportes. O objectivo foi verificar se a variação do VE
teria algum efeito na remoção de amónia. Os resultados obtidos no ensaio, descrevendo a variação da concentração de N­
NH4+; N­NO2­ e N­NO3­ estão apresentados na Fig. 31.

Ensaio : 39% de Volume de Ensaio: 58% de Volume de Ens aio: 78% de Volume de
Enchimento . N . NH4 Enchimento , \\ NH4 Enchimento , M.NH4
41 ­­—N­N02 4 ­ ­•—N­N02 4­ ­■— N­N02
—*— N ­ N03 0 k<v ­*­N­N03 0 1^ —*— N ­ N03
ICO .
0 3­ * 3­
2 IS­ G Ç
ff 2 C' o>
a> ■—■
E
2 ­ e °> 2 ­
cu E
§~1­
u
*

c 1 ­ 0
0
O 0 4 O 0 1
0 60 120 180 () 60 120 180 () 60 120 180
tempo (m) t e m p o (m) t e m p o (m)

Figura 3 1 : Perfis da concentração de N-NH4+; N-N02" e N-N0 3 " variando o Volume de Enchimento.

Foi efectuado um teste de K­W de forma a verificar se havia, estatisticamente, uma variação significativa na
velocidade de remoção de N­NH4+, utilizando para cálculo, como referido anteriormente, os coeficientes da equação (k) de
cada reactor. O resultado do teste está apresentado na Tab. 7. Na mesma tabela estão também os resultados do teste post­
hoc (múltiplas comparações) efectuados para verificar quais os grupos estatisticamente diferentes.

-39-
& #
RESULTADOS E DISCUSSÃO

Tabela 7: Resultados relativos ao Teste de Kruskal-Wallis aplicado aos dados referentes à variável VE

Teste Kruskal-Wallis: H (2, N=9) = 7.322034 -/»=.0257 - *Região Critica: H > 5.600
Valor de p das Múltiplas comparações (teste bilateral)
58% de VE 78% de VE
39% de VE p = 0.539137 p = 0.021871
58% de VE p = 0.539137
♦Região Critica - Valor obtido em ZAR (1996)

Tendo em conta o resultado do Teste K­W, o valor de H é superior ao tabelado pelo que é rejeitada a Hipótese nula
(Ho), e existem grupos estatisticamente diferentes (p = 0.0257). No teste Post­hoc os grupos que diferem estatisticamente (p
= 0.0218) são o 39% e 78% de VE. Tendo em conta o gráfico apresentado no Anexo 1.1, verificamos claramente uma
separação entre grupos, que não se sobrepõem, e que estatisticamente deveriam ser significativamente diferentes, o que só
se verifica para os já referidos. No entanto, o N da população testada poderá não ser suficiente para se verificar essa
significância estatística.

Os resultados obtidos para a Taxa de Remoção de Amónia (rNH4) e para a percentagem de Nitrificação (%NT)
associada a cada grupo estão descritos na Tab. 8. Os resultados referentes à rNH4 foram calculados com o valor do
coeficiente da equação (k) obtido a partir dos valores médios da variação de concentração de N­NH4+ observados em cada
reactor, apresentados no Anexo 1.2. Os resultados da %NT foram calculados tendo em conta os valores observados na Fig.
31.

Tabela 8: Valores de k, rNH4 e %NT no ensaio referente à variável Volume de Enchimento

39% de Volume de 58% de Volume de 78% de Volume de

Enchimento Enchimento Enchimento
K "médias" 0.0156 mg/l/min 0.0240 mg/l/min 0.0275 mg/l/min

rNR,: 5.71mgN-NH4/m /h 2
5.85 mg N-NH4/m /h2
5.03mgN-NH4/m2/h

%NT: 101.7% 92.9% 88.1 %

Os resultados obtidos no ensaio com a variável VE mostram que só há uma diferença significativa na velocidade de
remoção de Amónia (k) entre os grupos 39% e 78% de VE. Naturalmente, o grupo de 78% de VE tem uma maior velocidade
de remoção, pois continha um maior número de suportes, consequentemente mais BN para remover N­NH4+.

Tendo em conta os valores obtidos de rNH4, função da área de superfície efectiva do suporte, o ensaio realizado
concorda com a recomendação para utilização de valores inferiores a 70% de VE em MBBR referida por Odegaard (2000).

Os resultados obtidos mostram a existência de rNH4 inferiores às encontradas no estudo efectuado por Tal et ai.
(2003), 25 mg N­NH4/m2/h, a partir também de experiências em "Batch" com os suportes tipo K1 ; no entanto, o autor não
refere o VE. O mesmo acontece com a comparação com os resultados obtidos, por Rusten et ai. (2006), 39.5 mg TAN/m2/h

HPORTO 40 Ribeiro H.. 2008

r IKuiJiUHOUMr
 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

num teste laboratorial com suportes obtidos numa piscicultura em Portugal, para salinidade de 21 %o, pH = 7.6 e
concentração de OD 6.9 mg/l, no entanto o autor não refere o VE usado.

Na Fig. 31 verifica­se que a concentração de Nitrato e Nitrito aumentam à medida que a concentração de Amónia
diminui, o que é consistente com o desenrolar do processo de Nitrificação, tendo sido obtidas elevadas %NT em todos os
grupos. Resultado curioso é que quanto menor é o VE, maior é a %NT. No entanto, podemos verificar que a concentração de
Nitrito se acumula para valores superiores aos considerados por Losordo et ai. (1999) como seguros para os peixes, o que
poderá fazer supor que ainda não existia uma população de NOB suficientemente desenvolvida no biofiltro estudado. Esta
suposição está de acordo com Nijhof & Bovendeur (1990), que referem que os Biofiltros salinos podem demorar meses a ser
colonizados, sendo principalmente afectada a Nitratação.

3.4.3.2 Efeito da Concentração do Substrato

Este ensaio teve como objectivo investigar o efeito de diferentes intervalos de concentração de substrato, iguais e
superiores aos verificados na piscicultura, na remoção de amónia. Os resultados obtidos, descrevendo a variação da
concentração de N­NrV; N­NO2­ e N­NO3­ estão apresentados na Fig. 32.

Ensaio: 0.3 m g L 1 N­NH4 Ensaio: 1.2 mgL"1 N­NH4 Ensaio: 3.0 mgL' 1 N­NH4
­N­NH4 „ —•— N ­ NH4 , —•— N ­ NH4
­N­N02 0 ­ • — N ­ N02 0 < ——N­N02
Concentraçã

­N­N03 ­ * ­ N ­ N03 S \ . ­«­N­N03

o
Concentra
(mg/t)
(mg/l)

E =•
= !
c
o
o »—­— ■ «■ » ^~í
o*
0 30 60 90 120 0 30 60 90 120 150 0 60 120 180
tempo (m) tempo (m) tempo (m)

Figura 32: Perfis da concentração de N-NH4+; N-N02" e N-N03' variando a Concentração de Substrato.

Foi efectuado um teste de K­W, utilizando para cálculo os coeficientes da equação (k) de cada reactor, de forma a
verificar se havia, estatisticamente, uma variação significativa na velocidade de remoção de N­NhV entre os grupos de CS.
O resultado do teste está apresentado na Tab. 9. Na mesma tabela estão também os resultados do teste post­hoc (múltiplas
comparações) efectuados para verificar quais os grupos que são estatisticamente diferentes.

Tabela 9: Resultados relativos ao Teste de Kruskal-Wallis aplicado aos dados referentes à variável CS

Teste Kruskal-Wallis: H (2, N=8) = 6.250000 -/»=.0439 - *Regifto Critica: H > 5.361
Valor de p das Múltiplas comparações (teste bilateral)
1.2 mgL_1 N-NH,+ 3.0 mgL'1 N-NH,+
0.3 mgL1 N-NH,+ p = 0.400843 p = 0.041719
1 +
1.2 mgL N-NR, p = 0.790657
* Região Critica - Valor obtido em ZAR (1996)
RESULTADOS E DISCUSSÃO

Tendo em conta o resultado do Teste K­W, o valor de H é superior ao tabelado pelo que é rejeitada a Ho, e existem
grupos estatisticamente diferentes (p = 0.0439). No teste Post­hoc os grupos que diferem estatisticamente (p = 0.0417) são
0.3 e 3.0 mgL 1 N­NH4+. Tendo em conta o gráfico apresentado no Anexo 2.1, verificamos claramente uma separação entre
grupos, que não se sobrepõem, e que estatisticamente deveriam ser significativamente diferentes entre si, o que só se
verifica para os já referidos. No entanto, e como referido na análise do teste do efeito do VE, o N da população testada não
será suficiente para se verificar essa significância estatística usando testes post­hoc.

Os resultados obtidos para a Taxa de Remoção de Amónia (rNH4) e para a percentagem de Nitrificação (%NT)
associada a cada grupo estão descritos na Tab. 10. Os resultados referentes à rNH4 foram calculados com o valor do
coeficiente da equação (k) obtido a partir dos pontos médios da variação de concentração de N­NH4+ ao longo do tempo,
observado em cada reactor, apresentado no Anexo 2.2, e os valores da %NT foram calculados tendo em conta os valores da
Fig. 32.

Tabela 10: Valores de k, rNH4 e %NT no ensaio referente à variável Concentração de Substrato

0.3 mgL' 1 N-NH/ 1.2 mgL ' N - N H / 3.0 mgL ' N-NH, +

K "médias" 0.0022 mg/l/min 0.0077 mg/l/min 0.0126 mg/l/min

rNR,: 0.54 mg N-NH4/m /h 2
1.88mgN-NH4/m /h 2
3.07mgN-NH4/m2/h
%NT: 3.7 % 60.1 % 73.4 %

Os resultados obtidos no teste de K­W mostram que só há uma diferença significativa (p = 0.041719) na remoção
de Amónia quando a CS é 3.0 mgL­1 N­NH4+ em relação aos 0.3 mgL 1 N­NH4+ (concentração verificada na piscicultura). Para
além disso, obtiveram­se, aparentemente, melhores rNH4 e %NT no grupo de 3.0 mgL­1 N­NH4+.

Tendo em conta os valores da Tab. 10, verificamos que a rNH4 e a %NT tem uma tendência a aumentar com o
aumento da concentração de Substrato. Sabendo que 0.3 mgL­1 N­NH4+e 1.2 mgL­1 N­NH4+ são sensivelmente o valor
mínimo e máximo que encontramos no Biofiltro da piscicultura, podemos supor que para os valores mínimos de CS as BN
não conseguem produzir energia suficiente para o seu metabolismo.

Os resultados obtidos neste trabalho estão de acordo com o que previamente foi descrito por Lyssenko & Wheaton
(2006), que também revelam que o aumento da concentração de substrato no Biofiltro produz diferenças significativas na
remoção de TAN.

A diferença nos valores obtidos na rNH4 e %NT entre o grupo de 58% VE e 3.0 mgL 1 CS, que supostamente têm as
mesmas características, poderão reflectir a influência da maturação do biofiltro. Com o decorrer do tempo o Biofiltro vai
perdendo a sua eficiência pelo aumento da carga orgânica e partículas, pelo que o resultado obtido vai de encontro ao
demonstrado por Tal et ai. (2003), que refere que os suportes com menor carga orgânica têm maiores rNH4. Contudo, a
formação de Nitrito já é muito inferior ao ensaio realizado com a variável VE, com suportes com mais dois meses no Biofiltro,
o que confirma o pressuposto de Nijhof & Bovendeur (1990) que as NOB têm um maior período de adaptação.

IPOHTO ­42 Ribeiro H.. 2008

■c'
 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMB IENTE

3.4.3.3 Efeito da Salinidade

0 ensaio referente à variação da Salinidade teve como objectivo investigar o efeito de diferentes salinidades na
remoção de amónia, e os valores escolhidos tiveram em conta bibliografia que refere as salinidades a que o Rodovalho pode
ser cultivado. Os resultados obtidos no ensaio descrevendo a variação de N­NIV; N­NOr e N­NOr estão apresentados na
Fig. 33.

Ensaio: 15 °/ 00 Salinidade En:saio: 20 °/ 00 Salinidade Ensaio: 30 °/ 00 Salinidade

—»—N­NH4 ­♦­N­NH4 —•—N­NH4
3 ■ ■i
a ]t ­•—N­N02 ­•—N­N02 . ­•—N­N02
O ­*­N­N03 •"v. _*_N­N03
S N. ­*­N­N03
f­2­ Ã

Concentra
(mg/l)
S =­2­

Ni
1*1­ ll ^ T ­x T
» E .
£Í^T^ I

3 ­»
o o :
*—■ * l * ? ­ ^ = i u
° n 0 í
0 60 120 180 240
0 60 120 180 240
t e m p o (m)
() 60 120
t e m p o (m)
180 240
t e m p o (m)

Figura 3 3 : Perfis da concentração de N-NH4+; N-N0 2 " e N-N0 3 " variando a Salinidade.

O resultado do teste de K­W efectuado de forma a verificar se há, estatisticamente, uma variação significativa na
velocidade de remoção de N­NrU* entre os grupos estão, de uma forma resumida, apresentados na Tab. 11 e graficamente
no Anexo 3.1. Tendo em conta o resultado do Teste K­W, o valor de H, é igual ao tabelado, e supostamente é rejeitada a Ho.
No entanto, efectuados os testes Post­hoc, não se verificaram diferenças significativas entre grupos, o que pode ser
explicado pela baixo N da população testada.

Tabela 1 1 : Resultados relativos ao Teste de Kruskal-Wallis aplicado aos dados referentes à variável Salinidade

Teste Kruskal-Wallis: H (2, N=7) - 4.714286 -/7=.0947 - *Regiâo Critica: H > 4.714
Valor de p das Múltiplas comparações (teste bilateral)
15 X* 30 X.
20%. p = 1.000000 p = 0.127567
15 X* p = 0.384571
* Região Critica - Valor obtido em ZAR (1996)

De referir que embora estatisticamente não haja diferenças, da observação ao gráfico do Anexo 3.1, podemos
verificar que os grupos de 15 e 20 % são bem distintos do grupo 30%o. Apenas existe uma pequena sobreposição entre o
grupo de 15 % e o grupo 20%o.

Os resultados obtidos para a rNHU e para a %NT associada a cada grupo estão descritos na Tab. 12. Os resultados
referentes à rNI­U foram calculados com o valor do coeficiente da equação (k) obtido a partir dos pontos médios da variação
de concentração de N­NIV ao longo do tempo, observado em cada reactor, apresentados no Anexo 3.2, e os valores da
%NT foram calculados tendo em conta os valores da Fig. 33.

­43
^ @
RESULTADOS E DISCUSSÃO

Tabela 12: Valores de k, rNH4 e %NT no ensaio referente à variável Salinidade

15 Xo 20%« 30 X .

K "médias" 0.0157 mg/l/min 0.0213 mg/l/min 0.0092 mg/l/min

rNH4: 3.83mgN-NH 4 /m 2 /h 5.20mgN-NH 4 /m 2 /h 2.24 mg N-NH 4 /m 2 /h

%NT: 79.7 % 37.9 % 68.1 %

Tendo em conta os resultados da Tab. 12, e considerando a adaptação das BN a 20 %o de salinidade,

sensivelmente a salinidade que opera o Biofiltro da piscicultura, poderá ser justificada a maior rNH4 observada. Contudo o
baixo valor da %NT sugere que alguma interferência afectou negativamente esse grupo experimental,

De notar que, se se utilizarem os resultados apresentados na Tab. 10 do grupo 3.0 mgL-1 de CS, que foram obtidos
em condições semelhantes às do grupo 20 %o neste ensaio (só tendo existido uma diferença de 4 dias na sua execução),
vemos um padrão, ou seja, com o aumento da Salinidade, há uma redução na %NT, e consequentemente na rNH4. Este
resultado já vai ao encontro do que foi referido por Lyssenko & Wheaton (2006), que reporta que o aumento da Salinidade no
Biofiltro produz uma diminuição de 10 - 30 % na remoção de Amónia.

Um outro aspecto que transparece da Fig. 33 é o perfil de variação de Nitrato no grupo 30 %o. Verifica-se que o
Nitrato só começa a aparecer quase uma hora depois do ensaio se ter iniciado. Segundo Nijhof & Bovendeur (1990), o
aumento da salinidade afecta principalmente a Nitratação, pois as NOB têm um maior período de adaptação, o que se parece
verificar neste ensaio. Portanto, seria de aceitar a indicação de Masser et ai. (1999) e Gross et ai. (2003) quando referem ser
necessário fazer uma pré-activação de BN no Biofiltro do RAS a operar em água salina, de forma a reduzir o tempo de
activação e não haver formação de Nitrito a niveis preocupantes.

BPORTO |FX Ribeiro HL 2008

FC S S K S . féj
 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

4 CONCLUSÕES E SUGESTÕES DE TRABALHO FUTURO

4.1 Conclusões
0 estudo desenvolvido ao longo desta dissertação pretendeu fornecer uma ferramenta de trabalho preliminar que
poderá ser utilizada para trabalhos futuros nesta área. Encontram­se a seguir expostas as principais conclusões obtidas com
a realização deste trabalho.

■ Os parâmetros da qualidade da água recirculada estão dentro dos limites seguros para o cultivo de peixe, pelo que
se pressupõe que os processos de tratamento da água aplicados ao RAS sejam eficientes, pelo menos nas condições
em que este opera.

■ O estudo efectuado ao Biofiltro permitiu concluir que este funciona em óptimas condições de OD, pH e Alcalinidade,
isto tendo como objectivo a Nitrificação. No entanto, a concentração de TAN e Nitrito existente é muito inferior à ideal
para o desenvolvimento do biofilme nitrificante.

■ As contagens de UFC das BH, na água e nos suportes do Biofiltro estudado, mostraram um valor superior a outros
sistemas referenciados. Tendo em conta este resultado pressupõe­se que a razão C/N do sistema será elevada, isto
atendendo também ao baixo valor de Azoto disponível (N). Isto significa que a competição com as BH é mais um
problema ao desenvolvimento do biofilme nitrificante, pelo que será aconselhável aplicar um sistema de
tratamento/remoção de MO antes do efluente passar pelo Biofiltro.

■ O estudo efectuado, durante 24 horas, ao Biofiltro permitiu verificar que durante o período em que o Ozonizador
está ligado há uma redução da concentração de TAN e Nitrito. Do ponto de vista da qualidade da água para o cultivo de
peixe, esta é uma situação favorável, no entanto, o Ozonizador remove substrato utilizado pelas BN, o que pode impedir
o desenvolvimento destas.

■ A presença do Biofilme não usual ("Biofouling") impediu a existência de Nitrificação nos ensaios laboratoriais
efectuados, obtendo­se uma rápida remoção de Amónia sem formação de Nitrito. No entanto, não se sabe quais as
consequências que o "Biofouling" poderá ter a nível toxicológico num RAS. Pelos resultados das experiências
efectuadas podemos concluir que o "Biofouling" representa um importante competidor das BN, pois pode haver
competição pelo mesmo substrato.

■ Os ensaios laboratoriais de variação do Volume de Enchimento em experiências controladas permitiu verificar

diferenças na velocidade de remoção de Amónia, sendo a remoção mais rápida com maior Volume de Enchimento.
Sabendo que o Biofiltro da piscicultura opera com apenas 10% de VE, será aconselhável aumentar a percentagem de
enchimento.

^ @
CONCLUSÕES E SUGESTÕES DE TRABALHO FUTURO

■ Com o aumento da Concentração de Substrato, a velocidade de remoção aumentou. Verificou­se também um

aumento da rNHU e da %NT à medida que se aumentou a Concentração de Substrato. Os valores de Concentração de
Substrato para os quais se obtiveram os piores resultados de Nitrificação foram os equivalentes aos níveis verificados na
piscicultura. Em valores superiores de Concentração de Substrato obtiveram­se maiores velocidades de remoção, rNHU
e %NT. Estes resultados parecem indiciar que os níveis de Concentração de Substrato na piscicultura não são
favoráveis a um eficiente processo de Nitrificação.

■ A avaliação laboratorial do efeito da variação da salinidade não permitiu verificar diferenças, estatisticamente
significativas, na velocidade de remoção de Amónia. Contudo, os resultados obtidos permitiram verificar que o aumento
de 20 %o para 30 %o reduziu a velocidade da remoção de Amónia e atrasou a formação de Nitrato nos instantes iniciais.
Isto permite concluir que caso haja necessidade de um novo furo para obtenção de água salgada, deverá ter­se em
conta que um aumento de 10 %o na salinidade pode ter consequências negativas na remoção de Nitrito.

4.2 Sugestões de Trabalho Futuro

Ao longo da execução experimental deste trabalho foi­se notando a necessidade e o interesse de aprofundar o
estudo do tema abordado e aproximá­lo da realidade. Contudo, devido a limitações de tempo, não foi possível a sua
concretização. Assim, pensa­se que seria de todo o interesse a realização futura de:

■ Isolamento e identificação das estirpes bacterianas, plaqueadas no MAuA, por técnicas de biologia molecular (PCR
­ Polimerase Chain Reaction e Sequenciação de rDNA 16S).

■ Estudo do efeito de variação de pH nas Bactérias Nitrificantes, mais concretamente, se a pH = 7 há uma mudança
de transportadores de substrato, de NH3 para NhU+.

■ Avaliação do potencial toxicológico do "Biofouling" no RAS, principalmente no que se refere às cianobactérias

marinhas. Como não foi encontrada referência a uma situação deste tipo na bibliografia consultada, a importância deste
estudo acresce.

■ Avaliação laboratorial em "Batch" das taxas de remoção de Amónia variando outros parâmetros, principalmente
estudos isolados de Nitritação e Nitratação, efectuados com recurso a inibidores.

■ Avaliação laboratorial das taxas de remoção de Amónia em continuo, variando os parâmetros testados em "Batch".
Esta deveria ser seguida de uma Avaliação "in situ", na piscicultura, das taxas de remoção de Amónia.

■ Estudos sobre a influência da utilização do Ozono na Nitrificação e nas populações bacterianas.

HPORTO 46 . Ribeiro H.. 2008

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 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

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HPORTO K T
 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMBIENTE

ANEXOS

A
ANEXOS

Anexo 1

Volume de Enchimento
­0.014

­0.016
■

-0.018

­0.020

_>
13 ­0.022
O
i
­0.024 ■
— i —

­0.026

­0.028

­0.030
39% VE 58% VE 78% VE
Reactores
Mean D Mean±SE I Mean±SD
Anexo 1.1: Gráfico de Caixa e Bigodes para grupos referentes ao ensaio da variável Volume de Enchimento.

39% de VE 58% de VE 78% de VE

Taxa de Remoção de N­NH4* Taxa de Remoção de N­NH/

y =­0.0156x +3.4814 0.0275X + 3.4206

R2 = 0.9884 R2 = 0.9772

60 120 180 60 120 60 120 180

tempo (m) tempo (m) tempo (m)

Anexo 1. 2: Linhas de Tendência da variável Volume de Enchimento utilizadas para efectuar os cálculos de Taxas.

HPORTO Ribeiro H.. 2008

 MESTRADO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO AMB IENTE:

Anexo 2

Concentração de Substrato
0.000

­0.002

­0.004

­0.006
4>

"Õ
O ­0.008

-0.010

-0.012

-0.014
0.3 1.2 3.0
N­NH4* N­NH4* N­NH4+

Reactores
Mean D Mean±SE I MeaniSD

Anexo 2 . 1 : Gráfico de Caixa e Bigodes para grupos referentes ao ensaio da variável Concentração de substrato.

0.3 mgL_1 N-NH4+ 1.2 mgL ! N-NH/ 3.0 mgL-1* N-NH4

Taxa de Remoção de N­NH/ Taxa de Remoção de N­NH/ Tax a de Remoção de N­NH,'
y = -0.0022X + 0.2363 y = -0.0077x +1.2915 0 <• s ^ y = ­0.0126x+2.801
R2 = 0.9633 R2 = 0.9989 $ 0 ^ • ^ ^ R2 = 0.9971

» Ê <
0 .5. 1 ■
c
0
° 0­
60 120 0 30 60 90 120 150 t) 60 120 180
t e m p o (m) tempo (m) tempo (m)

Anexo 2. 2: Linhas de Tendência da variável Concentração de Amónia utilizada para efectuar os cálculos de Taxas.

& $
ANEXOS

Anexo 3

Salinidade
­0.006

­0.008

­0.010

­0.012

­0.014
(D
.>
Tj -0.016
O

­0.018

­0.020

­0.022
­0.024 ­

­0.026
15°/oo 20°/oo 30 °/oo
Reactores
■ Mean Q Mean±SE I Mean±SD
Anexo 3 . 1 : Gráfico de Caixa e Bigodes para grupos referentes ao ensaio da variável Salinidade.

15 %o 20 %o 30%»
Taxa de Remoção de N­NH4+ Taxa de Remoção de N­NH/ Taxa de Remoção de N­NHT
y = ­0.0157x + 2.7697 y = -0.0092X + 2.6002
y =-0.0213x+2.8362
R2 = 0.9866 R2 = 0.9961
R2 = 0.9599

60 120 180 240 60 120 180 240 60 120 180 240

tempo (m) tempo (m) tempo (m)

Anexo 3 . 2: Linhas de Tendência da variável Salinidade utilizadas para efectuar os cálculos de Taxas.

fflPORTO |c
" ' Ribeiro H.. 2008