Assimilao de nitrognio: N2, NO3 - e NH4+

Objetivos:
Identificao das formas de N que efetivamente entram no sistema vegetal. Reconhecimento das enzimas chaves dos processos de fixao e assimilao de N nas plantas. Formas de mobilizao de N entre os tecidos. Mecanismos de controle do processo.

KEGG PATHWAY Database

http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html

NO3nitrate

NO2nitrite

N2 NH3/NH4+

KEGG PATHWAY Database

http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html

NO3nitrate

NO2nitrite

N2 NH3/NH4+

Formas de entrada no metabolismo de plantas Bacteria Anabaena

NO3nitrate 2 nitrite

Planta Arabidopsis

NO

NH3/NH4+

N2

Shinorhizobium

Oryza

Demais organismos?

Formas de entrada no metabolismo de animais

Homo sapiens

trigo

trigo

trigo

gramado

p h e r e

Nitrognio; formas e estados de oxidao TEIS?????

Espcies NH3, NH4+ N2H4 NH2OH N2 N2O NO Nome Ammonia, ion amnio Hidrazina Hidroxilamina Nitrognio molecular xido nitroso xido ntrico cido nitroso, on nitrito Dixido de nitrognio cido ntrico, on nitrato Nvel de Oxidao -3 -2 -1 0 +1 +2 +3 +4 +5

C HNO2, NO2r NO 2 u HNO3, NO3s t

Tamanho dos reservatrios globais de Nitrognio

TEIS?????
Reservatrio/Tipo de Biosfera Hidrosfera Atmosfera Geosfera Crosta Solos e Sedimentos Mantle and Core Metric Tons 2.8 x 1011 2.3 x 1013 3.86 x 1015 1.636 x 1017 0.13 - 1.4 x 1016 0.35 - 4.0 x 1015 1.6 x 1017 % do Total 0.0002 0.014 2.3 97.7 0.78-8.4 0.21-2.4 95.6

Ciclo do nitrognio
%: fixao natural

2% reaes fotoqumicas

8%

nitrificao

nitrificao

90% fixaobiolgica: LIVRES E SIMBIONTES

Patgenos

Interaes essenciais

Simbiontes vs nutrio

tomate : nemtodo Azolla : Anabaena (ciano)

tomate : Cladosporium

FIXAO BIOLGICA DE NITROGNIO!

tomate : Pseudomonas

soja : Bradirhizobium

feijo : Rhizobium

videira : Xylella

raz : micorriza

soja : Bradirhizobium Anaerobiose Gunnera : Nostoc

-bact

+ bact

Azolla : Anabaena (ciano)

cana : Acetobacter

Anabaena
(arroz)
Anaerobiose

Nostoc

Anaerobiose

Organismos fixadores de N2
Fixadores de vida livre
Eubacteria (cianobactrias) Archaebacteria

Fixadores em associao com plantas (ou livre)

cooperao metablica
NeC

Eubacteria
cianobactrias alfa-proteobactrias dos grupos Rhizobiales e Rhodospirillales

Distribuio filogentica das bactrias fixadoras de N2 (Buchanan, 2000).

Fixadores em associao com plantas

Simbiose extracelular Simbiose intracelular

Azolla : Anabaena

Glicine : Bradyrhizobium

Simbiose intracelular Rhizobium

Glicine : Bradyrhizobium Ndulos em Sesbania

Nosso objeto de estudo

Ciclo do Nitrognio
Ex: molculas com N em plantas

nitrificao desnitrificao

[N2 + 16 ATP + 8e- + 8H+2NH3 + 16 ADP + 16 Pi + H2] NITROGENASE

Fixao do N2 atmosfrico
O N disponvel para plantas > 90% provm da fixao biolgica > ~80% gerado por associaes simbiticas. A forma atmosfrica NN no est disponvel para a maioria dos organismos. Quebra da tripla ligao envolve alto gasto energtico. [16 ATP ] Atividade da nitrogenase inibida pela presena de oxignio. Evoluo de processos simbiticos (interao eucariotoprocarioto).

Fixao industrial
Fertilizao qumica Processo de Haber-Bosch
1913, os trabalhos de Fritz Haber e Carl Bosch na Alemanha permitiram a sntese qumica de amnia (NH3). Produo anual de 80x1012g/ano - NN quebra da tripla ligao

Um grupo singular... Alpha-proteobacteria

rvore filogentica das alfa-proteobactrias estimada pela comparao da seqncia do 16S RNA
patgenos
Rhizobium Sinorhizobium Mesorhizobium Bradyrhizobium Associao simbitica formadora de ndulos

Rhizobium

Sinorhizobium

Mesorhizobium

Bradyrhizobium

Simbiose intracelular: formao de ndulos

Como se inicia o processo? Que respostas so produzidas nas plantas? Quais so os genes envolvidos? Onde esto os genes de fixao de nitrognio? Quais so os sinalizadores?

Ndulo > Medicago : Sinorhizobium

Como se inicia o processo?

1. Razes liberam substncias: flavonides, betana que so reconhecidos pelo produto do gene NodD na bactria que induz a expresso dos genes Nod que iro sintetizar fatores Nod. 2. Bactrias liberam os fatores Nod: oligossacardeos de lipoquitina (particularidades entre diferentes interaes) 3. As razes receptam os fatores Nod, com lectinas e apresentam alterao no fluxo inico, expressam as nodulinas, so infectadas, e seguem o programa para a morfognese do ndulo.

oligossacardeos de lipoquitina

Fatores Nod

enzimas

1 3 Receptor?

Flutuaes de Clcio nos pelos radiculares quando expostos aos Fatores Nod.

Alteraes provavelmente devidas a influncia sobre os canais ou bombas de Ca2+...

?
...inicia-se a curvatura do plo radicular.

simbiossomo

Que respostas so induzidas na planta? Expresso de nodulinas.

Ndulo meristemtico (crescimento indeterminado)
regio meristemtica (1) regio madura, bacterides (4) regio de senescncia (5) barreira para oxignio

Ndulo cilndrico (crescimento determinado)

regio madura, bacterides (cinza) regio de senescncia (preto) barreira para oxignio

Tecidos afetados pela formao do ndulo: epiderme, cortex e periciclo

Fatores Nod
ativao gnica na planta (nodulinas) induo de diviso celular (18-30 hrs)

Local de formao do ndulo (regio cortical na frente dos polos xilemticos

Quais so os genes envolvidos?

Fator Nod induz a curvatura Nodulinas auxiliam a invaso

Na planta:
Nodulinas precoces ENOD11 ENOD12 ENOD40 genes dim genes sym tardias leghemoglobina (Lb) Transportadores do simbiossomo

Ndulo ativo
Simbiossomos Leghemoglobina Citocromo oxidase de alta afinidade: gerador do ATP necessrio para fixao. Clulas vazias formam barreira para o oxignio. Respirao bacteriana usa O2, e o ATP produzido utilizado na fixao de N2 (citocromo oxidase de alta afinidade). A nitrogenase sempre est funcionando em condies subtimas. Se O2, aumenta a respirao, e consequentemente o ATP, a fixao tambm pode aumentar (consome o ATP) . Se O2, a inativao da nitrogenase faz aumentar muito o ATP, a respirao inibida, menos O2 e consumido e a nitrogenase mais inibida..colapso do metabolismo.

Quais so os genes envolvidos?

Na bactria:
Expresso precoce Genes nod, nol, noe (sntese e secreo de fatores nod) especificidade hospeiro Expresso tardia Genes nif (nitrogenase) Genes fix (regulatrios)

Complexo enzimtico da nitrogenase (Heterohexmero)

Polipeptdeo MoFe 4 subunidades (2 e 2) totalizando 200kDa Polipeptdeo Fe 2 subunidades idnticas totalizando 68 kDa

Notrogenase: Controle da expresso gnica O2

Via NOD

Fatores de transcrio

nif: nitrogenase

fixN: ambiente microaerbico (?)

Assimilao do NH4+

Assimilao de NO3 - e NH4+

Absoro do solo
transportador do tipo simporte (alta afinidade,
induzida e baixa afinidade, constitutivo)

Que vias enzimticas so utilizadas?

NR/NiR GS/GOGAT GDH
Arabidospsis mutante para transportador de nitrato.

Localizao nos tecidos

NO3- a NH4+: duas reaes Reaes dependentes de NR e NiR ocorrem em folhas e raze
Cofatores: Mo, HemoFe, FAD

2e-/NO2 NO2

Citoplasma de folhas e razes

Dependendo da espcie: folha ou raz Dependendo da disponibilidade de NO3: extenso da expresso

NR NiR
NR regula NiR impede amulo de NO2

Cofatores: FeS, siroheme

6e-/NH4

Platdios de folhas e razes

Regulao da atividade da Nitrato redutase

Transcricional: nitrato , ritmo circadiano sacarose glutamina luz (fitocromo)

Plntulas de cevada (exp. NO3)

nia mRNA (tomate)

Regulao da atividade da Nitrato redutase

Ps-transcricional (rpida e reversvel) fosfolirao: inativa defosforilao: ativa

Escuro Baixo CO2

cinase

Fosfatase

Resumindo...
Citocinina
Gene nir transcricional ps-transcricional

Gene nr

sacarose

ABA

mRNA da NR

luz Baixo CO2 escuro

mRNA NiR

NR inativa

NR ativa

NiR ativa

degradao NO3NO2NH4+

Assimilao de NH4+
GS GOGAT Folha: (cp e cit) (cp) Raiz: (cit) (plastos)
Carbohidratos Luz + trans

Luz + trans + atividade

Alfa-cetoglutarato

transaminao

Carbohidratos Luz -Trans - atividade

Assimilao de NH4+
GS GOGAT Folha: (cp e cit) (cp) Raiz: (cit) (plastos)

X X X X

Interao NO3- e metabolismo de C:

1- NO3- desvia C de amido aa

2- luz e carbohidratos: Ativa GC-GOGAT e inibe AS para acumular N em compostos ricos em carbono: glutamina (1/4) e glutamato (a partir dos quais muitas outras rotas surgem) Baixa Energia: Acumulo de N em compostos com alta relao N/C e estvel para o transporte: asparagina(2/4)

Translocao de esqueletos contendo N a partir das razes pode variar entre diferentes plantas:

Amidas: gln, asp, purinas (ndulos de alfafa, ervilha e outras espcies) Uredas: derivados de cido rico como c. Alantico e alantoina (feijo, soja e vigna) Nitrato Aminocidos

RAZ

Comparao dos processos de incorporao de N ao metabolismo

Planta no nodulada
Assimilao N em raiz e folha N translocado preferencialmente como nitrato Altos teores de nitrato no solo

Planta nodulada (feijo, soja)

Assimilao N em raiz. N translocado Gln, Asn ou uredes Baixos teores de Nitrato no solo

Referncias bibliogrficas e stios

Buchanan, Gruismen and Jones (2000) Captulo 16 pg: 786824. Kerbauy (2004) Captulos 3 e 4. Taiz (2002) Captulos 12 pg: 260-272. Forde (2002) Annu. Rev. Plant Biol. 53: 203-224. Geurts and Bisseling (2002) The plant Cell, Supplement: S239-S249. Kistner and Parniske (2002) Trends in Plant Science, 7: 511518. http://academic.reed.edu/biology/Nitrogen/ http://www.genome.ad.jp/kegg/metabolism.html