DETERMINAO DA CINTICA DE CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS INTRODUO No processo geral de diviso das bactrias, uma clula se divide produzindo duas

novas clulas. Assim, se iniciarmos com uma clula, o aumento na populao se verifica em progresso geomtrica: 1-2-4-8-16-32,etc O intervalo de tempo necessrio para uma clula se dividir ou a populao duplicar chama-se tempo de gerao e especfico para cada microrganismo. Para melhor representar o crescimento microbiano convencionou-se dividi-lo em 4 fases a saber: fase lag; fase logartmica; fase estacionria;

fase de declnio.

OBJETIVO Definir a curva de crescimento do microrganismo e determinar as velocidades especficas de crescimento. MATERIAL Suspenso de Saccharomyces cerevisiae . Erlenmeyer com meio a ser preparado. Tubos de ensaio. Pipetas de 1 mL esterilizadas gua esterilizada (150 mL) 2 provetas esterilizadas. (50 mL) Mecanismo de filtrao vcuo.

PROCEDIMENTO MEIO DE CULTURA Composio do meio de cultura: Dextrose (40 g/L) NaH2PO4.4H2O (1,0 g/L) MgSO4.7H2O (0,25 g/L) Extrato de levedura (1,0 g/L) SUSPENSO DAS CLULAS DE Saccharomyces cerevisae 0,5 g de Saccharomyces cerevisiae em 5 mL de H2O destilada e esterilizada. MONTAGEM DA PRTICA

1. Esterilizam-se o meio (em erlenmeyer), as vidrarias (pipetas para a coleta de amostras) 2. Em condies asspticas, mistura-se a suspenso de clulas de Saccharomyces contendo o meio. 3. Ajusta-se shaker para 150 rpm e a temperatura para 30C. 4. Com o auxlio de uma pipeta estril e em condies asspticas, coleta-se a amostra referente a tempo zero (t = 0). 5. Procede-se com a coleta de amostras durante as 30 horas de fermentao a cada 2 horas. As amostras so conservadas em geladeira. 6. PREPARO DAS CLULAS IMOBILIZADAS A imobilizao das clulas ser conduzida preparando-se 35 mL de soluo de alginato de sdio a 3%, em banho maria. Nesta soluo, adicionacerevisae preparada anteriormente ao erlenmeyer

se uma suspenso feita com 5 g de levedura e 15 mL de gua destilada estril. Esta suspenso ser gotejada de uma altura de 10 cm em 500 mL de soluo de CaCl2 0,1M utilizando uma bureta. As esferas assim obtidas devero permanecer por 1 hora na soluo de cloreto de clcio. FERMENTAO O meio de cultura deve ter a mesma composio do meio para clulas livres. Aps esterilizao dos meios e das vidrarias, ser misturada ao meio as clulas imobilizadas. A fermentao ser realizada em incubador rotativo (shaker), numa rotao de 150 rpm, temperatura de 37C, durante 30 horas. A coleta das amostras (2 mL), ser feita a cada hora. Cada amostra coletada dever ser armazenada em geladeira para posterior dosagem analticas e retirar 10 esferas de alginato de clcio da soluo de fermentao

CONTAGEM DAS CLULAS Para a determinao da concentrao celular durante a fermentao,

ser utilizado o mtodo de Turbidimetria, j visto anteriormente. Entretanto as esferas de imobilizao devem ser dissolvidas da seguinte forma: Dissoluo das esferas de alginato A dissoluo das esferas de alginato de clcio se d em tampo citrato 0,2 M e pH 5. Tampo citrato: Para preparar 500 mL: Dissolver 21,12 g de cido ctrico em 300 mL de gua destilada e ajustar o pH para 5 com NaOH 4N e completar o volume para 500 mL em balo volumtrico.

DETERMINAO DA CONCENTRAO CELULAR A concentrao celular ser determinada pelos mtodos de Peso Seco

e da Turbidimetria. 1. Peso Seco

Pesa-se uma membrana e anota-se seu peso e em seguida submete-se a

mesma ao microondas em potncia de descongelamento at peso constante (aproximadamente 4 minutos), anotando este valor. Determina-se o teor de umidade da membrana (H);
Prepara-se o sistema de vcuo com a membrana; Filtra-se 2 mL de amostra no sistema montado com a membrana, lavando o

sedimento com gua destilada;

A membrana, com o sedimento, acomodada num vidro de relgio e levada

ao microondas pelo mesmo tempo utilizado para a membrana, na mesma potncia;

Retira-se a membrana imediatamente do microondas e coloca-se no

dessecador por 15 minutos;

Decorrido este tempo, pesa-se a membrana com o sedimento e determina-

se a massa do microrganismo (MM) na amostra: Massa do microrganismo(MM) = Massa1(membrana+microrganismo) Massa2(membrana seca)

(massa da membrana - massa da membrana seca) 100 massa da membrana

Umidade da membrana (H) =

A concentrao celular da amostra presente no meio de cultivo determinada pela seguinte expresso:

XM =
Onde:

( MM ) (1 H100)
Va

XM = concentrao celular no meio (g/L) MM = massa do microrganismo H = teor de umidade da membrana (%) Va = volume de amostra (L) O teor de umidade determinado para uma membrana e este valor utilizado em todos os clculos. Presume-se, neste experimento, que o teor de umidade igual para todas as membranas. 2. Mtodo da Turbidimetria Neste mtodo, necessrio construir uma curva padro para relacionar os valores de absorbncia com a concentrao celular em g/L. a. Construo da Curva Padro
Pesa-se 0,1 g de clulas de Saccharomyces cerevisae, transferindo-as para

um balo volumtrico de 100 mL;

Completa-se o volume do balo com gua destilada; Agita-se o balo vigorosamente at obter uma suspenso turva e

homognea;
Com esta soluo, prepara-se a curva padro conforme Tabela 1; Procede-se a leitura da absorbncia da cada um dos padres em

espectrofotmetro a 600 nm, contra um branco de gua destilada;

Com os valores da absorbncia correspondente a cada soluo de

concentrao conhecida constri-se uma curva padro, linear, com correlao no inferior a 0,99.
y = ax + b

Onde: Y = absorbncia X = concentrao celular (mg/L) a = coeficiente angular da reta b = coeficiente linear da reta

A partir desta equao, calcula-se a concentrao celular nas amostras provenientes da fermentao, fazendo diluies das mesmas, se necessrio.

Tabela 1. Dados para construo da curva padro da concentrao celular Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Volume da soluo padro (mL) 1,0 2,0 2,5 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10 Volume de gua (mL) 9,0 8,0 7,5 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 Concentrao da soluo obtida (mg/L) 100 200 250 300 400 500 600 700 800 900 1000

CLCULO DAS VELOCIDADES ESPECFICAS

1. Velocidade especfica de crescimento microbiano A determinao da velocidade especfica de crescimento feita com base na seguinte equao:
ln X t = ln X0 + x t

Onde: X = concentrao celular (g/L) AUTOCLAVE Coloca-se gua na autoclave at cobrir a serpentina. No cesto, acomoda-se o material a ser esterilizado, fechando o aparelho. Liga-se, com a chave seletora no

mximo e a vlvula de segurana totalmente aberta. Com o incio de sada do vapor, fecha-se a vlvula e espera-se a autoclave atingir a presso de trabalho, 1,1 atm (manomtrica). Ajusta-se a chave seletora para o mdio e conta-se o tempo de esterilizao. Passado este tempo, desliga-se a autoclave e abre-se a vlvula de segurana. Aps sada total do vapor e com o aparelho frio, abre-se e retira-se o material esterilizado. Em todos os demais procedimentos, o manuseio dos materiais feito sempre por trs da chama do bico de Bunsen, de preferncia em cmara de fluxo laminar.