Aula Micros

UNIVERSIDADE ESTADUAL VALE DO ACARAÚ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E BIOLÓGICAS -

CURSO: ZOOTECNIA
DISCIPLINA: BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
Profa. Solange Damasceno Sousa

Zootecnista, DSc.
Sobral – CE
Abril de 2022 1
 Introdução
 Microscopia
• Microscopia ótica ou de luz

• Microscopia eletrônica
• Confecção de cortes para estudo nos microscópios
óptico e eletrônico
2
• Conhecimentos sobre as células  progridem
paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de
investigação.
- Microscópio  possibilitou o descobrimento das células e

a elaboração da teoria celular.
3
- Técnicas citoquímicas  identificação e localização de
moléculas constituintes das células.
- Advento dos microscópios eletrônicos e aperfeiçoamento

de métodos para a separação de organelas celulares e
estudo in vitro de suas moléculas e funções.
4
A microscopia consiste num conjunto de técnicas
sequenciais e complementares que visam não só a
observação de células ou tecidos de seres vivos mas,
também a preparação prévia desses materiais, e ainda a
captura de imagens para posterior observação.
5
Microscópio
Mikrós (do grego, pequeno) + scoppéoo (observar, ver

através).
- Hans Janssem e seu filho Zacharias Janssem,

descobriram no final do século XVI (em 1591), que
sobrepondo uma lente sobre outra conseguiriam ampliar
a imagem.
6
Antonie Von Leeuwenhoek  microscópio primitivo
construído em 1674.
- Permitia aumento de percepção visual de até 300 vezes e
com razoável nitidez.
- Conseguiu-se observar bactérias de 1 a 2 micra
(equivalente a um milésimo de milímetro)
7
• Microscópio primitivo de Leeuwenhoek foi
aprimorado por Robert Hooke.
• As primeiras observações de Hooke e os estudos de
Antony van Leeuwenhoek levaram à descoberta das
células.
8
• Em 1665  Hooke escreveu um livro com desenhos
detalhados de suas descobertas microscópicas 
Micrographia
• Hooke foi o primeiro a usar o termo célula
9
10
Existem basicamente duas famílias de microscópios:
• Microscópios ópticos
• Microscópios eletrônicos
11
 Microscópio óptico ou de
luz
Compõe-se de uma parte

mecânica e uma parte óptica
12
 Microscópio óptico ou de luz
Parte mecânica
Suporte do microscópio
Consiste de:
• Base  estabilizar o microscópio
• Coluna ou canhão (se estende da base para cima) 
sustentação das lentes
• Platina  onde se coloca o objeto a ser examinado
13
14
15
16
 Microscópio óptico
ou de luz
Parte óptica
Produz imagens
ampliadas do material
observado.
17
O esquema do microscópio óptico
mostra o trajeto dos raios
luminosos.
(1) base do microscópio
(2) Condensador
(3) lente objetiva
(4) cristalino do globo ocular;
(A) sistema de iluminação

(B) Platina
(C) tubo binocular
(D) globo ocular do observador.
Fonte: Junqueira - Ilustração cedida pela
empresa Carl Zeiss.
18
 Microscópio óptico ou de
luz
Formação da imagem e
aumento
1ª lente do um microscópio
de luz  mais próxima do
objeto sendo examinado
(amostra)  objetiva
19
Formação da imagem e aumento
- A luz da fonte luminosa passa pelo

condensador que forma um cone de luz
bem definido, concentrando a luz em
direção à amostra;
20

- A luz passa pela amostra e em
seguida pela objetiva que projeta
uma imagem real, invertida e
aumentada da amostra em um
plano fixo dentro do microscópio
(plano intermediário da imagem).
21
- Lente ocular, mais distante componente

óptico da amostra, aumenta a imagem
real projetada pela objetiva.
- A ocular produz uma imagem secundária
aumentada que é captada pelo olho do
observador.
22
Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular

Cálculo da ampliação total (At)  At = Aobjetiva x Aocular
23
Especificações das lentes objetivas
As lentes objetivas geram a imagem real, invertida e em

uma dimensão maior do material contido na amostra,
permitindo que a lente ocular possa ampliar a imagem
real gerando uma imagem virtual e maior - o que permite
a visualização de detalhes.
24
25
Tipos de objetivas de acordo com a qualidade óptica
a) Acromáticas  mais simples e baratas, presentes em

microscópios comuns.
b) Semi-apocromáticas  construídas com fluorita, um

material que proporciona alguma correção para aberrações.
c) Apocromáticas: fornecem correção ampla para as

aberrações.
26
Tipos de objetivas de acordo com a qualidade óptica
d) Planacromáticas  proporciona correção, o campo fica

todo em foco.
e) Planapocromáticas: melhores e mais caras, combinam as

correções das apocromáticas e planacromáticas resulta
em grande resolução.
27
28
Escala microscópica
Dimensões da célula  expressas em micrômetros (μm),

unidade que representa a milésima parte do milímetro
(mm).
Estruturas intracelulares  medida utilizada é o nanômetro
(nm) que significa um milésimo do micrômetro.
29
30
Escala microscópica
31
Resolução
Mede a nitidez da imagem;
Distância mínima na qual dois pontos podem ser

separados e ainda serem distinguidos como dois pontos.
- Poder de resolução de um microscópio óptico é de cerca

de 225 nm e do eletrônico é de até 0,5 nm.
32
Poder de resolução
- Capacidade de separar detalhes
- Nitidez da imagem
Expresso pelo limite de resolução  menor distância que

deve existir entre dois pontos para que eles apareçam
individualizados.
33
Limite de Resolução
- Menor distância entre dois pontos para que

eles apareçam separados;
- Capacidade de separar detalhes;
- Produz imagens separadas de partículas muito
próximas.
34
Poder de resolução x limite de Resolução
- Quanto melhor for a capacidade de individualizar 2 pontos

distintos do objeto (< LR) maior será a definição da imagem
formada no aparelho ( > PR)
Quanto menor o limite de resolução  maior o poder de

resolução.
35
Microscópio de polarização
- Modificação simples do microscópio óptico:

Filtro polarizante (polarizador)  localizado entre a fonte de
luz e o condensador
Segundo polarizador (analisador)  localizado entre a lente
objetiva e a ocular.
 Informações bem detalhadas sobre a estrutura e a

composição dos materiais, pois melhora a qualidade da
imagem.
36
Microscópio de polarização
Utilizado no estudo de paredes

celulares, moléculas de DNA,
células musculares estriadas,
espermatozoides, colágenos,
detecção de substâncias minerais
em tecidos diferentes, etc.
37
Microscópio de contraste de Fase
Variante do microscópio óptico, dotado de um sistema óptico

especial que transforma diferenças de fase dos raios
luminosos em diferenças de intensidade.
 A fase da luz de um microscópio pode ser alterada,

ocasionando um contraste maior e facilitando a sua melhor
visualização em um microscópio.
38
Microscopia de contraste
de fase) na observação de
uma célula epitelial sem
coloração.
Fonte: Junqueira/
Professor Raul Machado
39
• Possibilita o exame de células e tecidos não corados;

• Muito usado para análise de células vivas, microrganismos,
seções de tecidos finos, fibras, partículas subcelulares;
• Diagnóstico de células tumorais, hematologia, virologia,
bacteriologia, parasitologia e biologia marinha.
40
Microscópio de fluorescência
- Microscópio usado para examinar amostras

com propriedades luminescentes ou
amostras que foram preparadas com
substâncias que criam propriedades
luminescentes.
41
Microscópio confocal
Baseia-se no uso de compostos fluorescentes que, ligados a

estruturas específicas, determinam sua localização celular.
A fonte de luz do microscópio confocal é constituída por

diversas linhas de lasers que se movem através de um scanner
de modo a focalizar a amostra linha por linha.
42
Após a excitação pelo laser, a amostra emite fluorescência em

outro comprimento de onda, que é então lido pelos diferentes
detectores.
43
• Permite o aumento do contraste da

imagem microscópica e a construção de
imagens tridimensionais.
• Fornece alta resolução.
• Possibilita a eliminação de informações
fora de foco da imagem.
44
Cristais de açúcar com crescimento radial.
Imagem gerada com microscopia de
polarização.
Fonte: Leica Microsystems.
Fonte: REECE, URRY, CAIN, WASSERMAN,

MINORSKY & JACKSON (2015)
Endósporos de Bacillus anthracis

Fonte: CDC/Larry Stauffer 45
Fonte: REECE, URRY, CAIN,
WASSERMAN, MINORSKY & JACKSON
46
(2015)
 Microscópio eletrônico
Década de 1930  Ernest Ruska construiu o primeiro

microscópio eletrônico  em 1986, recebeu o prêmio
Nobel de Física por sua invenção.
Durante os anos 1940 e 1950, Albert Claude, Keith Porter e

George Palade usaram pela primeira vez o ME em análises
de amostras biológicas.
47
- Ao contrário do MO, que se utiliza da radiação de ondas

luminosas refratadas através de lente de vidro, no ME a
radiação empregada é a de feixe de elétrons refratados por
meio de lentes eletromagnéticas.
- O comprimento de onda dos elétrons é cerca de 100.000

vezes menor do que o da luz, garantindo, assim, uma
melhoria na resolução que pode chegar a 0,2 nm.
48
- Possibilitou a visualização de
estruturas celulares não visíveis ao
microscópio óptico por contar com
poder resolutivo muito maior.
- Produz aumentos úteis de 200.000
a 400.000X, sendo seu poder
resolvente cerca de 100 vezes maior
que o do microscópio de luz.
49
50
Trajeto dos elétrons no microscópio
eletrônico.
• O corte de tecido é colocado logo

acima da bobina ou lente objetiva.
• A imagem, já aumentada pela
objetiva, é novamente ampliada
por outra bobina, que a projeta
em uma tela fluorescente.
51
• Não se pode examinar células vivas, apenas fixadas e

completamente secas;
• Cortes histológicos precisam ser finos  uso de
micrótomos.
52
• Seções ultrafinas do espécime são necessárias para que

o feixe de elétrons atravesse a amostra e uma imagem
seja formada.
53
Para o estudo de estruturas biológicas, existem dois tipos

de microscópios eletrônicos amplamente empregados:
54
55
- Microscópio eletrônico de transmissão (MET)
A imagem é formada simultaneamente à

passagem do feixe de elétrons através do
espécime.
Como os feixes de elétrons são imperceptíveis ao

olho humano, a imagem final é vista através de
uma tela fosforescente ou sobre uma placa
fotográfica.
56
Ideal na definição de imagens intracelulares (permite estudos

de morfologia celular, aspectos gerais das organelas)
Interação de parasitas com as células (fornece informações

sobre alterações ocasionadas por vírus, bactérias e outros
organismos diminutos de impossível visualização na
microscopia de luz).
57
58
Diagrama esquemático dos
componentes mais importantes do
microscópio eletrônico de transmissão
(YOUNG, FREEDMAN, 2009) 59
- Microscópio eletrônico de transmissão

(MET)
 Componentes
Formado por:
• Sistema de iluminação composto pelo
canhão eletrônico, lente condensadora;
• Sistema de imagens constituído pelas
lentes objetivas, intermediárias e
projetoras.
60
 Componentes
- Canhão eletrônico
Fonte de iluminação composta por um filamento de
tungstênio, em forma de “V”, que funciona como um catodo
composto de íons e elétrons livres.
Ao fluir uma corrente através do filamento, ele é aquecido por

incandescência, fazendo com que emita elétrons.
61
(MET)
 Componentes
Filamento de tungstênio  envolvido por
uma caixa carregada negativamente
(escudo de Wehnelt).
No escudo há um furo central de abertura
(2 a 3 mm), por onde passam os elétrons
que são atraídos por um ânodo
posicionado logo abaixo e direcionado para
as lentes eletromagnéticas. 62
- Microscópio eletrônico de
transmissão (MET)
 Componentes
Uma alta voltagem (entre 50 e 120
ou mais KV) é aplicada sobre o
filamento de tungstênio, gerando
uma corrente que flui através dele
e o incandesce, emitindo elétrons.
63
 Componentes
- Lentes
São de natureza eletromagnética e constituídas por uma
bobina cilíndrica chamada solenoides, formada por milhares
de voltas de fio, através da qual passa uma corrente elétrica e
será utilizada para focalizar a imagem de um espécime.
64

(MET)
 Componentes
- Lentes
As primeiras lentes são as condensadoras,
situadas abaixo do ânodo, cuja função é
focar o feixe eletrônico sobre o material
estudado.
65

(MET)
 Componentes
- Lentes
Lentes objetivas  ampliação da imagem.
A imagem será subsequentemente
ampliada pelas lentes intermediárias e
projetoras.
66
 Aplicações
Análise de materiais biológicos

- Permite a definição de imagens intracelulares, possibilitando
observar a morfologia celular, aspectos gerais das organelas;
- Organização molecular de vírus ou constituintes
subcelulares;
- Interação de parasitas-células (fornece informações sobre
alterações celulares ocasionados por vírus, bactérias, etc.).
67
- Microscópio eletrônico de varredura (MEV)
• Complementar à microscopia de transmissão
• Maior poder de resolução
• Fornece imagens tridimensionais
68
• Criado a partir do MET
• Principal característica  o feixe de elétrons não

atravessa a preparação, mas, ao invés disso, varre a
superfície da amostra, fornecendo uma imagem
tridimensional.
69
• Atinge resoluções que na ordem de 2 a 3.0 nm e grande

profundidade de foco, da ordem de 300 vezes melhor que
a do microscópio óptico.
70
Fonte: Xavier (2018) 71
• Um feixe de elétrons é produzido no
topo do microscópio pelo
aquecimento de um filamento de
energia;
• O feixe de elétrons segue através da
coluna do microscópio, passando por
lentes magnéticas, que focam e
direcionam o feixe em direção da
amostra com um foco de 0,4 a 5 nm.
• Uma vez que o feixe atinge a amostra,
outros elétrons (retroespalhados e
secundários) são ejetados da amostra.
• Os detectores coletam esses elétrons
e os convertem em sinais
reproduzidos na tela de visualização.
72
Componentes
• Canhão eletrônico
• Coluna composta de uma série de lentes eletrônicas
• Uma câmara para amostra
• Detectores e sistema de vácuo
73
Componentes
• Canhão eletrônico
Mesmo descrito para o MET.

Há um filamento de tungstênio que emite elétrons ao ser
aquecido até o ponto de emissão termoiônica.
74
Componentes
• Lentes
Ficam imediatamente abaixo do canhão, perfazendo um

total de três: condensadoras C1, C2, e C3 (objetiva).
Função  contribuir para a focalização do feixe de
elétrons sobre a amostra.
75
Fonte: Dedavid, Gomes & Machado, 2007. 76
Microscópio eletrônico de Microscópio eletrônico de
transmissão varredura
77
78
Princípio de funcionamento
Um feixe de elétrons de pequeno diâmetro explora a

superfície da amostra, ponto a ponto, por varredura em linhas
sucessivas, onde o sinal é transmitido a um detector e este a
uma tela.
79
As bobinas de exploração eletromagnéticas, alimentadas por

um gerador de varredura, fazem com que o feixe explore a
superfície da amostra aproximadamente de 10 em 10nm.
80
O sinal de imagem resulta da interação do feixe de elétrons

incidente com a superfície da amostra.
O detector é quem recebe o sinal e modula o brilho do

monitor, permitindo a observação.
81
Esquema geral do microscópio

eletrônico de varredura.
Na parte inferior do aparelho estão
localizadas as bombas de vácuo, pois
a coluna percorrida pelos elétrons
deve ser mantida em alto vácuo.
Fonte: Junqueira
82
- Microscópio eletrônico de varredura

(MEV)
Aplicações
Análises de grãos de pólen, esporos de

fungos, superfícies de folhas, ornamentação
superficial de sementes de frutos, cutícula e
ovos de insetos, diatomáceas, pequenos
fósseis, etc.
83
84
Microscopia
Microscopia de Microscopia
ótica transmissão de varredura
85
Microscopia de Microscopia de
Microscopia ótica transmissão varredura
86
 Confecção de cortes para estudo nos microscópios
Para análise em microscopia é necessária a preparação de

lâminas com corte de tecidos.
- Células preservadas  fixadas e coradas  melhor

demonstração dos seus componentes.
87
Fixação
- Consiste no tratamento de células com soluções

específicas que causam sua morte, conservando-se
suas propriedades físicas e químicas.
- Estabilização das estruturas celulares e intercelulares.
88
Fixação
- Finalidades:
• Evitar a autólise (degradação) das amostras;
• Impedir a contaminação por bactérias e fungos;
• Endurecer as células para que elas resistam melhor às
etapas seguintes da técnica;
89
Fixação
- Finalidades:
• Aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos
corantes utilizados na microscopia óptica e aumentar
o contraste na microscopia eletrônica.
90
Fixação
Agentes fixadores
• Microscopia óptica  formol e glutaraldeído

• Microscopia eletrônica  tetróxido de ósmio e
glutaraldeído.
91
Microtomia
As células fazem parte de tecidos que precisam ser

cortados em fatias finas para exame no microscópio.
Esses cortes são feitos em um aparelho denominado
micrótomo .
92
Microtomia
Para ser cortado no micrótomo, o fragmento de tecido

fixado é geralmente impregnado com uma substância de
consistência firme que permita, posteriormente, seccioná-
lo em camadas delgadas.
93
94
Fragmentos de tecido emblocados em parafina.
Fonte: Dorigan Neto. Caderno de referência 3 (2012)

95
Microtomia (corte)
Cortes para o microscópio eletrônico muito finos  0,02 a

0,1 mm.
Os micrótomos que cortam tecidos incluídos em parafina

utilizam navalhas de aço, e os que cortam tecidos incluídos
em resinas usam navalhas de vidro ou de diamante.
96
Microtomia (corte)
Fonte: http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/ 97
Microtomia (corte)
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/ Fonte: Curso de técnicas histológicas

98
• https://www.youtube.com/watch?v=CVAUcN8
NDto
99
 Confecção de cortes para estudo nos microscópios óptico
e eletrônico
Coloração
- Consistem em mergulhar a célula numa substância

(corante), capaz de tingir diferencialmente uma ou mais
partes celulares.
Melhor distinção de estruturas internas e contrastes em

amostras celulares;
Estudo de componentes específico dentro das células.
100
Coloração
Corantes  maioria comporta-se como base ou como

ácido.
- Afinidade depende de carga elétrica e pH
101
 Confecção de cortes para estudo nos microscópios óptico
e eletrônico
Coloração
- Hematoxilina
CORANTE BÁSICO (grupamento cromofórico é catiônico +)
afinidade por elementos ácidos dentro das células –
moléculas basófilas)
- Eosina
CORANTE ÁCIDO (grupamento cromofórico é aniônico -)
afinidade por elementos básicos dentro das células –
moléculas acidófilas)
102
Coloração
Imagem histológica da
glândula tireoide,
corada por
hematoxilina – eosina.
Em roxo vemos os
núcleos das células
foliculares. Em rosa
vemos o citoplasma
dessas células
103
Coloração
104
105
106
107
Para observação de amostras sob o microscópio de luz

também podem ser realizados esfregaços de sangue e
sêmen, por exemplo.
108
Esfregaço
- Consiste em espalhar um fragmento

de tecido ou de uma colônia sobre
uma lâmina de vidro, o que provoca a
dissociação de alguns elementos
celulares e a sua aderência ao vidro.
- Forma-se assim uma fina camada de
células.
Fonte: http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/
109
Esfregaço
110
Esfregaço
Fonte: https://www.ufrgs.br/lacvet/
111
Esfregaço
Fonte: http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/
112
Distribuição das células no esfregaço
Fonte: https://www.ufrgs.br/lacvet/ 113
Esfregaço
Fonte: https://www.ufrgs.br/lacvet/
114

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• Microscopia ótica ou de luz

- Microscópio  possibilitou o descobrimento das células e

- Advento dos microscópios eletrônicos e aperfeiçoamento

Mikrós (do grego, pequeno) + scoppéoo (observar, ver

- Hans Janssem e seu filho Zacharias Janssem,

• Hooke foi o primeiro a usar o termo célula

Compõe-se de uma parte

(A) sistema de iluminação

Formação da imagem e aumento

- A luz da fonte luminosa passa pelo

Formação da imagem e aumento

Formação da imagem e aumento

- Lente ocular, mais distante componente

Formação da imagem e aumento

Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular

Especificações das lentes objetivas

As lentes objetivas geram a imagem real, invertida e em

Especificações das lentes objetivas

Especificações das lentes objetivas

Tipos de objetivas de acordo com a qualidade óptica

a) Acromáticas  mais simples e baratas, presentes em

b) Semi-apocromáticas  construídas com fluorita, um

c) Apocromáticas: fornecem correção ampla para as

Especificações das lentes objetivas

Tipos de objetivas de acordo com a qualidade óptica

d) Planacromáticas  proporciona correção, o campo fica

e) Planapocromáticas: melhores e mais caras, combinam as

Dimensões da célula  expressas em micrômetros (μm),

Mede a nitidez da imagem;

Distância mínima na qual dois pontos podem ser

- Poder de resolução de um microscópio óptico é de cerca

Expresso pelo limite de resolução  menor distância que

- Menor distância entre dois pontos para que

Poder de resolução x limite de Resolução

- Quanto melhor for a capacidade de individualizar 2 pontos

Quanto menor o limite de resolução  maior o poder de

- Modificação simples do microscópio óptico:

 Informações bem detalhadas sobre a estrutura e a

Utilizado no estudo de paredes

Microscópio de contraste de Fase

Variante do microscópio óptico, dotado de um sistema óptico

 A fase da luz de um microscópio pode ser alterada,

Microscópio de contraste de Fase

Microscópio de contraste de Fase

• Possibilita o exame de células e tecidos não corados;

- Microscópio usado para examinar amostras

Baseia-se no uso de compostos fluorescentes que, ligados a

A fonte de luz do microscópio confocal é constituída por

Após a excitação pelo laser, a amostra emite fluorescência em

• Permite o aumento do contraste da

Fonte: REECE, URRY, CAIN, WASSERMAN,

Endósporos de Bacillus anthracis

Década de 1930  Ernest Ruska construiu o primeiro

Durante os anos 1940 e 1950, Albert Claude, Keith Porter e

- Ao contrário do MO, que se utiliza da radiação de ondas

- O comprimento de onda dos elétrons é cerca de 100.000

• O corte de tecido é colocado logo

• Não se pode examinar células vivas, apenas fixadas e

• Seções ultrafinas do espécime são necessárias para que

Para o estudo de estruturas biológicas, existem dois tipos