UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

ESCOLA DE VETERINÁRIA
COLEGIADO DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

Clostridium difficile: padronização e avaliação de métodos de

diagnóstico, ocorrência em seres humanos e animais e desenvolvimento
de um modelo experimental em hamsters

Rodrigo Otávio Silveira Silva

BELO HORIZONTE – MG
ESCOLA DE VETERINÁRIA DA UFMG
2014

1
 Rodrigo Otávio Silveira Silva

Clostridium difficile: padronização e avaliação de métodos de

diagnóstico, ocorrência em seres humanos e animais e desenvolvimento
de um modelo experimental em hamsters.

Tese apresentada à Escola de Veterinária da Universidade

Federal de Minas Gerais como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor em Ciência Animal.

Área de Concentração: Medicina Veterinária Preventiva

Orientador: Prof. Dr. Francisco Carlos Faria Lobato

Co-orientador: Prof. Dr. Roberto M. Carvalho Guedes

Belo Horizonte
UFMG – Escola de Veterinária
2014

2
3
4
5
 DEDICATÓRIA

Aos meus pais, a minha irmã, amigos e familiares que

me apoiaram durante essa jornada

6
"Education is the most powerful weapon which you can use to change the
world"

Nelson Mandela (1918-2013)

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 AGRADECIMENTOS

A minha mãe e a minha irmã, pelo apoio incondicional. Ao meu pai, pelo exemplo de
garra.

Aos meus amigos Gabriel Furtado, Alessandra Dias, Filipe Silvano e Rachel Maia que,
muitas vezes sem perceber, me fazem perseverar.

Aos meus primos e amigos Paulo França, Paulo Fernando e Gustavo Silva. Aos meus
avós Maria, Marta, Ostiana e França.

A todos amigos da Tasingegade 29 e tantos outros que conheci durante o período em

Copenhagen, em especial ao Phillip R., Marta Merino, Katie Hofstchen, Zlatko e
Girhidar.

Á Gry Persson e ao Prof. Anders Miki Bojesen, da University of Copenhagen.

À Ida Just, pelo acolhimento, paciência e carinho.

À Profa Maja Rupnik e toda sua equipe da Public Health Institut Maribor (Eslovênia).

Aos parceiros do ICB-UFMG Dra. Marcelle Almeida, Dra. Flávia Siqueira e Prof
Evanguedes Kalapothakis.

Aos parceiros da Clínica de Pequenos Animais da UFMG, em especial a Silvia

Trindade e Marina Coroa.

Aos pessoal da Clínica de Equinos: Jackeline Resende, Felipe Moreira, Ana Luisa e
Profa Renata Maranhão. Um agradecimento especial a Profa Maristela Palhares que
tanto me incentivou durante o doutorado.

Ao Prof Márcio Garcia Ribeiro, da UNESP-Botucatu.

Aos parceiros e colegas veterinários que se dedicam aos animais silvestres: Mirella
D´Ellia, Francisco Ferreira e Marcus Romero.

Cláudia Pimenta, Ana Flávia Michel, Amanda Vasconcellos, Eliana Paladino pelo
apoio, conselhos e, principalmente, pelo carinho.

Dr. Andrea Blanc, da University of the Republic (Uruguai), Prof Marcos Bryian e Profa
Danielle Magalhães.

Ás empresas Medivax, Alere e Vencofarma, apoiadores do presente projeto.

Prof Roberto Guedes, por toda a ajuda mas, sobretudo, por sua contagiante
empolgação com o meio acadêmico.

Aos patologistas Michelle Gabardo e Profa. Rosenele Ecco pelas discussões valiosas
durante a execução do projeto.

Ao pessoal do Laboratório Nacional Agropecuário (LANAGRO-Pedro Leopoldo, MG),

em especial ao Dr. Ronnie Antunes de Assis e Dr. Antônio Augusto Fonseca Junior.

8
Ao Prof Dr. Eduardo Garcia Vilela e a todos os residentes do Hospital das Clínicas da
UFMG que acreditaram no projeto e doaram seu tempo para sua execução. É
indispensável também agradacer aos pacientes que voluntariamente aceitaram
participar do estudo.

Aos orgãos de fomento que tornaram possível a execução desse projeto de doutorado:
CNPq, Fapemig, CAPES (em especial á bolsa de doutorado sanduíche) e INCT-
Pecuária.

Aos colegas do Laboratório de Anaeróbios da UFMG: Prhiscylla Sadanã, Carlos

Oliveira, Felipe Masiero, Luciana Aramuni, Bruna Alves, Laura Bernardes, Amanda
Diniz, Isabella Moreira, Guilherme Guerra, Lucas Queiroz.

A todos os colegas e vizinhos de laboratório do DMVP, em especial a Ana Carolina

Diniz e Profa Zélia Lobato.

E finalmente ao Prof Francisco Lobato pela orientação acadêmica e, ainda mais

importante, pelo apoio, paciência e conselhos fraternais no dia-a-dia.

9
 SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................................11
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................12
LISTA DE FIGURAS....................................................................................................13
RESUMO........................................................................................................................14
ABSTRACT ...................................................................................................................15
1. INTRODUÇÃO .....................................................................................................16
2. OBJETIVOS ..........................................................................................................16
3. LITERATURA CONSULTADA .............................................................................16
3.1 Histórico............................................................................................................................ 16
3.2 Patogenia........................................................................................................................... 17
3.3 A Doença Em Seres Humanos .......................................................................................... 18
3.3 A Doença Em Animais Domésticos ................................................................................. 20
3.3.1 Suínos ........................................................................................................................ 20
3.3.2 Equinos ...................................................................................................................... 22
3.3.3 Cães ........................................................................................................................... 22
3.4 Clostridium difficile como agente zoonótico .................................................................... 23
3.5 Diagnóstico ....................................................................................................................... 24
3.5.1 Detecção das toxinas ................................................................................................. 24
3.5.2 Isolamento e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ............................................. 25
3.6 Tratamento e controle ....................................................................................................... 27
4. CAPÍTULO 1: Padronização e avaliação de métodos de diagnóstico para
infecção por Clostridium difficile ..................................................................................35
4.1 Padronização da soroneutralização celular para detecção das toxinas A/B de Clostridium
difficile em fezes. .................................................................................................................... 35
4.2 Avaliação de kits comerciais de ELISA e da cultura toxigênica frente a citotoxicidade
celular para o diagnóstico de C. difficile em suínos e equinos. .............................................. 42
4.3 Avaliação de kits comerciais de ELISA para o diagnóstico de infecção por Clostridium
difficile em pacientes internados no Hospital das Clínicas da UFMG. ................................... 50
5. CAPÍTULO 2: Ocorrência da infecção por Clostridium difficile ..........................59
5.1 Detecção das toxinas A/B e isolamento de Clostridium difficile em potros diarréicos e
saudáveis. ................................................................................................................................ 59
5.2 Isolamento de Clostridium difficile de fezes de espécies de carnívoros silvestres no Brasil.
................................................................................................................................................ 65
5.3 Surto de diarreia por Clostridium difficile em uma granja de suínos no Brasil ................ 69
5.4 Primeiro relato de diarreia por Clostridium difficile em potros no Brasil......................... 74
5.5 Diarreia por Clostridium difficile associada a candidíase em um potro............................ 78
5.6 Diarreia por Clostridium difficile em uma jaguatirica (Leopardus pardalis) ................... 84
5.7 Susceptibilidade antimicrobiana de estirpes de Clostridium difficile isoladas de animais e
seres humanos no Brasil. ........................................................................................................ 89
5.8 Ribotipagem de estirpes de Clostridium difficile isoladas de seres humanos e animais no
Brasil. ...................................................................................................................................... 96
6. CAPÍTULO 3: Desenvolvimento de um modelo de infecção por Clostridium
difficile em hamsters sírios (Mesocricetus auratus)...................................................103
COMENTÁRIOS FINAIS ..........................................................................................113
PESPECTIVAS FUTURAS ........................................................................................113
CONCLUSÕES............................................................................................................114
ANEXOS: Versão original dos artigos publicados ...................................................114

10
 LISTA DE ABREVIATURAS

ATCC - American Type Culture Collection

BHI – “Brain Heart Infusion” ou meio Infusão-Cérebro-Coração
BID – "bis in die", ou administração duas vezes ao dia
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CCFA - Ágar Cicloserina-Cefoxitina-Frutose
CDI – Clostridium difficile infection.
CETEA – Comissão de Ética em Experimentação Animal
CEUA - Comissão de Ética em Experimentação Animal
CHO – Linhagem celular “Chinese Hamster Ovary”
CIM - Concentração inibitória mínima
CLSI – “Clinical and Laboratory Standards Institute”
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CRAS - Centro de Reabilitação de Animais Silvestres
CTA - “Cell citotoxicity assay”
CTAm - CTA em células em monocamada
CTAn – CTA em células não-aderidas (ou em suspensão)
DL50 - Dose letal para 50%
DMM - Dose mínima mortal
DNA – Ácido desoxirribonucléico
EC/ml – Efeito citotóxico por mililitro
ELISA - “Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay”
EUA – Estados Unidos da América
FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do estado de Minas Gerais
HCUFMG – Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais
HE – Coloração com hematoxilina e eosina
HV - Hospital Veterinário
ICD - Infecções por C. difficile
IM – Via de inoculação intramuscular
kDa – Quilodaltons
MEM – Meio essencial mínimo
MIC – Minimal inhibitory concentration
NAAT - Nucleic acid amplification test ou testes de amplificação de ácidos nucléicos
NIBSC – National Institute for Biological Standards and Control
PAS - Coloração Ácido Periódico-Schiff
PCR – “Polimerase chain reaction” ou Reação em cadéia da polimerase
PRPq-UFMG – Pró-reitoria de pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais
QD – "quaque die" ou administração medicamentosa uma vez ao dia
rPCR – PCR em tempo real
RPM – Rotações por minuto
SFB – Soro fetal bovino
TC – “Toxigenic culture” ou cultura toxigênica.
TCCFA – Ágar Cicloserina-Cefoxitina-Frutose suplementado com Taurocolate.
TCCFB - Caldo de cefoxitina-cicloserina suplementado com taurocolate
UFC – Unidades formadoras de colônias
UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais
UI – Unidade Internacional
UNESP - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
UTIs – Unidades de tratamento intensivo
VERO – Linhagem ceular “African Green Monkey Kidney”
VPN - Valor preditivo negativo
VPP – Valor preditivo positivo

11
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Resultado de títulos obtidos, em efeito citotóxico por mililitro (EC/ml), no

ensaio de citotoxicidade celular em monocamada (CTAm) e em células não-aderidas
(CTAn) para amostras de fezes de seres humanos, leitões, hamsters e equinos
sabidamente positivas para as toxinas A/B de Clostridium difficile...............................39

Tabela 2: Resultados obtidos nos três testes imunoenzimáticos (ELISAs), na cultura

toxigênica e no teste de citotoxicidade celular para o diagnóstico da infecção por
Clostridium difficile em potros e
leitões...............................................................................................................................44

Tabela 3: Comparação de três ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e cultura toxigênica

frente a soroneutralização como “padrão ouro” para o diagnóstico da infecção por
Clostridium difficile em leitões........................................................................................44

Tabela 4: Comparação de três ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e cultura toxigênica

frente a soroneutralização como “padrão ouro” para o diagnóstico da infecção por
Clostridium difficile em potros........................................................................................45

Tabela 5: Resultados obtidos nos três testes imunoenzimáticos, na cultura toxigênica

(TC) e no teste de citotoxicidade celular (CTA) para o diagnóstico da infecção por
Clostridium difficile em pacientes internados no Hospital das Clínicas da UFMG........52

Tabela 6: Avaliação de três kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) frente a

citotoxicidade celular (CTA) e cultura toxigênica (TC) como padrão “ouro” para o
diagnóstico de infecção por Clostridium difficile em pacientes do Hospital das Clínicas
da UFMG, Brasil, 2013 (n=84).......................................................................................52

Tabela 7: Resultados de detecção das toxinas A/B e isolamento de Clostridium difficile

de potros diarreicos e não-diarreicos (n=154).................................................................61

Tabela 8: Número de estirpes de Clostridium difficile utilizadas para avaliação da

susceptibilidade antimicrobiana por espécie e histórico clínico......................................90

Tabela 9: Concentração inibitória mínima (CIM) em µg/ml classificação quanto a

susceptibilidade antimicrobiana de 54 estirpes de Clostridium difficile isoladas de fezes
de seres humanos e animais.............................................................................................90

Tabela 10: Ribotipos, hospedeiro e histórico de estirpes de Clostridium difficile

isoladas de seres humanos e animais no Brasil...............................................................98

Tabela 11: Identificação, espécie e histórico das estirpes de Clostridium difficile

utilizadas para indução experimental em hamsters sírios (Mesocricetus auratus).......104

Tabela 12: Ocorrência de diarreia, morte, lesões intestinais e resultado de isolamento e

detecção das toxinas A/B por CTA nos grupos inoculados (G1 a G4) e nos grupos
controles (C1 e C2) com diferentes estirpes toxigênicas de Clostridium
difficile...........................................................................................................................106

12
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: (A) – Coloração de Gram de uma cultura de Clostridium difficile. Bastonetes

Gram-positivos com esporos. (B) – Detalhe de um esporo subterminal de C. difficile
ainda com o corpo celular. (C) – Leitão: edema de mesocolon em um leitão acometido
por C. difficile. (D) – Leitão. Colon. Redução severa das células caliciformes e enterite
neutrofílica necrozante com intensa infiltração de neutrófilos da lamina própria para o
lumen intestinal (400X). Figuras 1C e 1D foram adaptadas de Cruz-Junior et al. (2013)
e Silva et al. (2013b)........................................................................................................21

Figura 2: (A) - Ceco, potro. A pseudomembrana de fibrina foi retirada e revelou a

mucosa intestinal edemaciada e com pequenas áreas de ulceração. (B): Mucosa
estomacal edemaciada e revelando a presença de uma pseudomembrana de aspecto
acinzentado e fracamente aderida....................................................................................80

Figura 3: (A1) Cavidade abdominal de um hamster do grupo C1. Ceco sem alterações
macroscópicas visíveis; (B1) Cavidade abdominal de um hamster do grupo G1. Alças
cecais tumefeitas com serosa intensamente e difusamente congesta, apresentando
líquido serosanguinolento no lúmen, sugestivo de tiflite hemorrágica; (A2) Micrografia
do ceco de um animal do grupo controle (C1), mostrando as vilosidades com aspecto
normal (aumento de 100X). (B2) Micrografia do ceco de um animal do grupo G1. Nota-
se a extensa destruição da mucosa intestinal, infiltrado inflamatório difusamente
distribuído na mucosa e intensa quantidade de células eritrocíticas, caracterizando uma
tiflite necro-hemorrágica (aumento de 100X)...............................................................107

Figura 4: Lâminas coradas pelo técnica de coloração de esporos (Wirtz-Conklin). (A)

Cultura após 72 horas de incubação. Observar a presença de células vegetativas
(bastonetes rosados) e esporo livres ou ainda ligados a célula mãe (corados pelo verde-
malaquita). (B) Suspensão de esporos. Observar a presença apenas de esporos livres do
corpo celular (aumento de 1000X)...............................................................................108

Figura 5: Sobrevivência de hamsters durante o período de observação de 30 dias dos

grupos de animais inoculados com diferentes concentraçoes de esporos da estirpe
ATCC9689 (A1 a A4) de Clostridium difficile e do grupo
controle..........................................................................................................................110

13
 RESUMO

O objetivo do presente estudo foi: (1) padronizar um protocolo de detecção das toxinas
A/B em cultura de célula; (2) avaliar kits comerciais de ensaio imunoenzimático
(ELISAs) para diagnóstico da infecção por Clostridium difficile (ICD) em humanos,
potros e suínos; (3) avaliar a ocorrência de ICD em potros, leitões e carnívoros
silvestres; (4) avaliar os ribotipos e a susceptibilidade antimicrobiana de estirpes de C.
difficile isoladas de diversas origens; (5) padronizar um modelo de ICD em hamsters
sírios. O teste de citotoxicidade celular padronizado permitiu a detecção das toxinas
A/B em amostas de fezes, tornando-se uma opção para o diagnóstico e permitindo a
avaliação de outros métodos de diagnóstico. Todos os ELISAs testados apresentaram
baixa sensibilidade (<61%) e especificidade acima de 90% para amostras de seres
humanos. Dessa forma, aproximadamente um em cada três pacientes com ICD seriam
erroneamente indicados como negativos por tais testes no hospital avaliado. De forma
semelhante, para amostras de suínos os kits de ELISA também apresentaram uma baixa
sensibilidade (<60%), sugerindo que tais testes não seriam adequados para o
diagnóstico individual em leitões. Já para potros, a alta sensibilidade e especificidade
(acima de 90 e 94%, respectivamente) apresentada pelos kits sugere que esses possam
ser uma boa opção para o diagnóstico de diarreia por C. difficile nessa espécie. A ICD
foi diagnosticada, pela primeira vez no Brasil, em potros e leitões. Mais de 50% das
granjas de suínos avaliadas possuiam pelo menos um leitão diagnosticado com ICD,
sugerindo uma grande disseminação da doença. Em potros, foi possível perceber que a
pouca familiaridade dos clínicos com a ICD levava a uma antibioticoterapia errônea
com consequente agravamento dos sinais clínicos. Pela primeira vez no mundo a doença
foi confirmada em um felino silvestre. Foram encontrados 13 ribotipos de C. difficile,
sendo que, em vários casos, o mesmo ribotipo foi encontrado em seres humanos e
animais. Todas as estirpes avaliadas apresentaram alta susceptibilidade ao metronidazol,
vancomicina e florfenicol, enquanto 7,4%, 9,3%, 25,9% e 37,0% foram consideradas
resistentes a oxitetraciclina, penicilina, tilosina e eritromicina, respectivamente. O
modelo de ICD foi padronizado em hamsters sírios, tornando-se uma opção para
estudos futuros sobre patogenia da doença e métodos de tratamento e prevenção. Como
conclusão, o presente estudo confirma a ICD como uma importante causa de diarreia em
animais e humanos no Brasil e reforça a necessidade de mais trabalhos focando em
novos métodos de diagnóstico e de controle da doença em animais domésticos e
humanos.

Palavras-chave: Clostridium difficile, nosocomial, diarréia, zoonose

14
 ABSTRACT

The aim study was to: (1) develop the detection of A/B toxins in cell culture assay; (2)
evaluate three commercial enzyme immunoassays (EIAs) for diagnosis of CDI in
humans, foals and piglets; (3) evaluate the frequency of CDI in humans, in piglets, in
foals and in wild carnivores; (4) evaluate the ribotypes and antimicrobial susceptibility
of C. difficile strains from various sources; (5) develop an model of CDI in Syrian
hamsters. The standardized cell culture assay was able to detect A/B toxins from stool
samples, becoming an option for the diagnosis of CDI and allowing the evaluation of
other diagnostic methods. All EIAs tested showed a high sensitivity and specificity
(always above 90 and 94%, respectively) for foals’ samples, whereas for humans´ and
piglets´ samples the low sensitivity (under 60%) of all EIAs tested suggest that they are
not a good option for individual diagnosis in this species. In piglets and foals, the
disease was confirmed for the first time in Brazil and more than 50% of sampled farms
had at least one positive piglet, suggesting a great dissemination of the disease in swine.
A marked unfamiliarity of disease in foals was seen by clinicians, commonly leading to
worsening of clinical status of animals by wrong antibiotic therapy. For the first time,
the disease was confirmed in wild felids. Thirteen different ribotypes were found and
the commonly the same ribotype was isolated from animals and humans. All C. difficile
strains were susceptible to metronidazole, vancomycin, florfenicol, whereas 7.4%,
9.3%, 25.9% and 37.0% were considered resistant to oxytetracyclin, penicillin, tylosin
and erythromicyn, respectively. An animal model of ICD was developed in hamsters
(Mesocricetus auratus) and now can be used for future pathogenesis, treatment and
prevention CDI studies. As a conclusion, the present study confirms ICD as a important
cause of diarrhea in animals and humans in Brazil. In addition, it highlighted the need of
more studies about diagnosis and control methods of this disease.

Keywords: Clostridium difficile, nosocomial, diarrhea, zoonosis

15
 1. INTRODUÇÃO
Clostridium difficile é um bastonete
Gram-positivo, anaeróbio obrigatório e
pode esporular em condições adversas.
Considerado um patógeno emergente, é
atualmente responsável pela maioria dos
casos de diarreia nosocomial e colite
pseudomembranosa em seres humanos
(Balassiano et al., 2011). Em animais
domésticos, a infecção por C. difficile é
comum em suínos e equinos, ocorrendo
também em cães, bovinos e animais de
laboratório como cobaios, coelhos e
hamsters (Bartlett, 2009). Em leitões,
com a melhoria no controle de agentes
clássicos causadores de diarreia, C.
difficile emergiu como um importante
patógeno entérico. Hoje, este é
considerado a principal causa não
controlada de diarreia neonatal nos
Estados Unidos da América (EUA) e
Europa (Songer, 2010).
No Brasil, até o ano de 2011 inexistiam
relatos da doença em animais
domésticos. Desde então, estudos
comprovaram a infecção por C. difficile
em suínos, potros e cães (Silva et al.,
2011; Preis et al., 2012; Silva et al.,
2012; Silva et al., 2013a; Silva et al.,
2013b). Além disso, estudos recentes
também mostraram que as estirpes
isoladas de seres humanos com infecção
por C. difficile apresentam grande
semelhança genética com as estirpes
isoladas de animais (Jhung et al., 2008;
Norman et al., 2011), levantando a
hipótese de uma zoonose. Apesar da
importância crescente da infecção por
C. difficile, existe um forte
desconhecimento com relação aos
métodos de diagnóstico tanto para seres
humanos quanto para animais,
dificultado decisões clínico-
epidemiológicas. Além disso, inexistem
imunoprofiláticos disponíveis para
prevenção e controle da doença para
animais domésticos.
2. OBJETIVOS
Os objetivos do presente estudo foram:
(1) padronizar um protocolo de
detecção das toxinas A/B em cultura de
célula; (2) avaliar três kits comerciais de
ensaio imunoenzimático (ELISAs) para
diagnóstico de infecção por Clostridium
difficile (ICD) em seres humanos
internados no Hospital das Clínicas da
UFMG, em potros e em suínos; (3)
avaliar a ocorrência de ICD em potros,
leitões e carnívoros silvestres no Brasil;
(4) avaliar os ribotipos e a
susceptibilidade antimicrobiana de
estirpes de C. difficile isoladas de
diversas origens; (5) padronizar um
modelo de ICD em animais de
laboratório.
3. LITERATURA CONSULTADA
3.1 Histórico
C. difficile foi isolado pela primeira vez
a partir de fezes e mecônio de bebês
recém-nascidos por Hall e O´Tolle em
1935. Pela dificuldade encontrada no
isolamento e pela morfologia do
microrganismo, os autores o chamaram
inicialmente de Bacillus difficilis. Como
aquele microrganismo ainda não era
reconhecido como um patógeno, poucos
estudos foram publicados até a década
de 70. A partir desse período, a
clindamicina passou a ser extremamente
utilizada em seres humanos no combate
a infecções por microorganismos
anaeróbicos e, concomitante ao seu uso,
relatos de diarreia e colite
pseudomembranosa surgiram (Lyerly et
al., 1988). Iniciou-se uma intensa busca
pelo agente causal, sendo então
demonstrado que C. difficile estava
presente em grande quantidade nas
fezes de pacientes com colite
pseudomembranosa e diarreia
nosocomial (George et al., 1978). A
partir desta constatação, C. difficile tem
sido incriminado como o principal
16
agente causador de diarreia associada a
antibioticoterapia em seres humanos.
Relatos recentes sugerem um aumento
da morbimortalidade em diversos países
(Samie et al., 2008). Dados com relação
ao impacto da doença ainda são
escassos, mas estima-se que apenas nos
Estados Unidos ocorram cerca de três
milhões de casos anualmente,
implicando em um custo de 1,1 bilhão
de dólares no tratamento (Gellad et al.,
2007).
Trabalhos com C. difficile em seres
humanos e animais são escassos em
toda a América Latina (Balassiano et
al., 2012). No Brasil, destacam-se um
relato de um surto hospitalar
(Balassiano et al., 2010) e um recente
levantamento de prevalência de diarreia
nosocomial em um hospital
universitário no Rio de Janeiro
(Balassiano et al., 2011). Tais trabalhos
confirmam a importância da doença e
reforçam a necessidade de mais estudos
para elucidar a real situação da infecção
por C. difficile em seres humanos no
Brasil.
Em animais, a infecção por C. difficile
foi relatada pela primeira vez em
cobaios (Cavia porcellus) por Hambre
et al. (1943) em um estudo onde o
objetivo inicial era avaliar o potencial
do tratamento com penicilina em casos
de mionecroses clostridiais, doença
comum na época devido a ferimentos
em soldados na segunda guerra
mundial. Para esta avaliação, induzia-se
mionecrose com inoculação de C.
perfringens nos animais e testava-se o
tratamento com diferentes doses de
penicilina. Porém, para surpresa dos
pesquisadores, a administração de
penicilina tornou-se mais letal que
própria mionecrose por C. perfringens
devido a quadros de enterocolite grave.
Estudos posteriores indicaram que
vários outros antimicrobianos causavam
o mesmo efeito em cobaios e em outras
espécies de roedores (Green, 1974). Já
em suínos e equinos, o isolamento de C.
difficile foi relatado pela primeira vez
na década de 80 (Jones e Hunter, 1983;
Ehrlich et al., 1984), mas somente em
meados da década de 90 este
microrganismo ganhou maior
repercusão como um causador de
diarreia nestas duas espécies (Songer,
2010).
Relatos de infecções por C. difficile já
foram descritos em várias outras
espécies domésticas como coelhos,
bovinos e até felinos (Martins et al.,
2001; Weese et al., 2001; Bano et al.,
2008). Porém, nestas espécies a
ocorrência de desordens
gastrointestinais relacionadas a este
agente parecem incomuns. Atualmente,
inúmeros trabalhos visam a
padronização de métodos de diagnóstico
e avaliação da hipótese de C. difficile
ser um agente zoonótico, enquanto
outras pesquisas têm buscado
imunoprofiláticos para a prevenção da
diarreia causada por este microrganismo
emergente.
3.2 Patogenia
A patogenia da diarreia por C. difficile
ainda é bastante obscura na maioria dos
animais. Acredita-se que a infecção
inicia-se pela ingestão dos esporos
oriundos principalmente de animais
infectados ou portadores saudáveis. Em
geral, a microbiota intestinal impede o
estabelecimento do agente, sendo que a
infecção ocorre na ausência de uma
microbiota capaz de inibir a colonização
pelo microrganismo. Dessa forma,
comumente C. difficile coloniza o
intestino após uma depleção dos
microrganismos intestinais causada pela
antibioticoterapia, ou previamente ao
estabelecimento completo da
microbiota, como ocorre em leitões nas
primeiras horas de vida (Båverud,
2002). Em seres humanos, equinos e
17
cães existe também a possibilidade da
exacerbação do crescimento de estirpes
já presentes no organismo dos
portadores saudáveis, ainda pelo mesmo
mecanismo de comprometimento da
microbiota intestinal (Båverud, 2002;
Hopman et al., 2011).
Uma vez no intestino, estirpes
toxigênicas de C. difficile produzem
duas toxinas: a toxina A (enterotoxina)
e toxina B (citotoxina). A lesão no
intestino parece ser iniciada pela toxina
A, que possui receptores na lâmina
basal das células epiteliais. Ocorre
quebra das junções celulares,
permitindo a ação da toxina B, cujos
receptores, acredita-se, encontram-se na
região baso-lateral do epitélio,
amplificando a lesão. Ambas, depois de
internalizadas por endocitose, causam
condensação da actina culminando com
a desorganização do citoesqueleto,
arrendondamento celular e eventual
apoptose (Lyerly et al., 1988). Com a
lesão do epitélio intestinal, as toxinas
podem ganhar a circulação sistêmica,
agindo também em outros órgãos.
Ainda como conseqüência da destruição
das junções celulares, há uma intensa
migração leucocitária intestinal que
resulta na formação da
pseudomembrana característica da
doença em seres humanos (Hookman et
al., 2009).
Uma terceira toxina, a toxina binária,
vem chamando a atenção dos
pesquisadores e clínicos, sendo muito
semelhante às outras toxinas binárias
produzidas por bactérias do gênero
Clostridium, como a toxina iota,
produzida pelo C. perfringens tipo E, e
a toxina C2, produzida pelo C.
botulinum tipo C (Samie et al., 2008).
Muito tem sido discutido com relação à
importância clínica da toxina binária,
mas o real significado deste fator de
virulência ainda é desconhecido. Em
seres humanos, estudos relatam uma
maior gravidade da doença em
pacientes infectados por estirpes
produtoras da toxina binária (Rupnik et
al., 2005). De acordo com Gonçalves et
al. (2004), a toxina binária pode agir
sinergicamente com as toxinas A/B,
aumentando a despolimeralização do
citoesqueleto por um mecanismo
complementar, agravando o quadro
clínico e exacerbando os sintomas.
Além da desorganização celular, esta
toxina parece formar protusões nas
células alvos com consequente
extravasamento de material do citosol,
formando uma malha densa na
superfície celular que facilitaria a
adesão e multiplicação de C. difficile no
intestino (Schwan et al., 2009).
3.3 A Doença Em Seres Humanos
Apesar de ter sido isolado pela primeira
vez em 1935, somente na década de 70
C. difficile foi reconhecido como um
patógeno para seres humanos. Desde
então C. difficile passou a ser a principal
causa bacteriana de diarreia associada a
antibioticoterapia prolongada com
morbimortalidade crescente em diversos
países (Samie et al., 2008).
Durante a década de 90, a incidência
dessa infecção nos EUA permaneceu
estável, tendo sido registrados cerca de
30-40 casos por 100.000 indivíduos.
Porém, em 2001, esse número
aumentou para 50 e, em 2005, já se
observava 84 casos por 100.000
indivíduos. De acordo com Gellad et al.
(2007), ocorrem cerca de três milhões
de casos anualmente neste país,
implicando em um custo de 1,1 bilhões
de dólares para o tratamento. A
mortalidade associada à infecção
também tem aumentado, assim como
maior resistência ao tratamento
antimicrobiano convencional. Em dois
levantamentos epidemiológicos sobre a
causa de óbitos de pacientes internados
em hospitais na Inglaterra, a colite
18
pseudomembranosa foi a principal
causa de óbito em 499 pacientes no ano
de 1999 e em mais de três mil pacientes
no ano de 2006 (Kelly e Lamont, 2008),
sugerindo novamente a crescente
importância da doença.
Acredita-se que o aumento do número
de casos registrados deve-se ao uso,
muitas vezes indiscriminado, de drogas
antimicrobianas, considerado o amostrados dividiam o ambiente com
principal fator de risco para essa
infecção. Outros fatores predisponentes
reconhecidos são idade avançada,
hospitalização ou a permanência em
instituições de cuidados de saúde
(Bartlett, 2009).
Nos últimos anos, tem sido relatado o
surgimento de estirpes altamente
virulentas de C. difficile, destacando-se
a estirpe NAP1/027. O uso disseminado
de fluoroquinolonas parece estar
relacionado ao surgimento de tal estirpe
e o isolamento dessa tem sido cada vez
mais relacionada a surtos graves
sobretudo em países desenvolvidos,
com uma frequência de isolamento de 8
e 36% nos EUA e na Europa,
respectivamente (Cheknis et al., 2009).
Ainda não existem evidências desta
estirpe no Brasil, e em toda a America
Latina esta estirpe foi, até o momento,
encontrada apenas na Costa Rica
(Balassiano et al., 2012). De acordo
com Balassiano et al., (2012), o
potencial de propagação mundial da
infecção por C. difficile demonstra a
necessidade de estudos epidemiológicos
com intuito de se caracterizar as estirpes
circulantes. Outros autores destacam a
necessidade de uma maior
sensibilização e vigilância dos
profissionais de saúde mesmo em países
onde surtos com a estirpe NAP1/027
ainda não ocorreram.
No Brasil, são raros estudos sobre a
infecção por C. difficile em seres
humanos e, em geral, os trabalhos são
pouco robustos. O primeiro trabalho
focado em diarreia nosocomial em
adultos foi realizado em 2002 por
Marcon et al. (2006), com um total de
49 pacientes que desenvolveram
diarreia em unidades de tratamento
intensivo (UTIs). Desses, 22 (44,8%)
foram diagnosticados com infecção por
C. difficile. É interessante observar,
ainda, que 86% dos pacientes
outro paciente que também apresentou
anteriormente diarreia nosocomial,
sugerindo o alto potencial de
disseminação da doença.
Em 2009, Balassiano et al. publicaram
um estudo avaliando 21 pacientes com
diarreia nosocomial após
antibioticoterapia de largo espectro. A
infecção por C. difficile foi confirmada
em 6 dos 21 pacientes (28,5%), sendo
possivel isolar o agente em quatro
desses. As quatro estirpes isoladas
foram positivas para os genes das toxina
A (tcdA) e B (tcdB), mas negativo para
o gene da toxina binária (cdtB). Duas
estirpes pertenciam ao ribotipo 014,
enquanto outras duas foram
caracterizadas como ribotipo 106. Até
então, a detecção de estirpes do ribotipo
106 nunca tinha ocorrido fora do Reino
Unido, o que novamente sugere a
disseminação das estirpes de C. difficile.
Recentemente, um levantamento mais
completo e de longa duração foi
relatado por Balassiano et al. (2010) em
uma UTI de um hospital universitário
no Rio de Janeiro. Durante o período de
2006 a 2009, ocorreram 218 casos de
diarreia nosocomial, sendo que 43
(19,7%) foram confirmados como
infecção por C. difficile. O período mais
crítico foi entre 2007 e 2008, quando o
hospital vivenciou um surto. Neste
período, 101 amostras foram coletadas e
em 32 (31,5%) delas foram detectadas
as toxinas A/B. Aproximadamente 80%
dos pacientes infectados possuiam mais
19
de 65 anos, todos encontravam-se com
algum grau de imunocomprometimento
e sob antibioticoterapia. Quatro estirpes
foram isoladas, três de pacientes e uma
do ambiente hospitalar. Todas as quatro,
pertencentes aos ribotipos 038 e 135,
foram positivas para os genes tcdA e
tcdB e negativas para o gene relativo a
toxina binária (cdtB).
O último trabalho, até o momento, no
Brasil foi conduzido por Balassiano et
al. (2011). Todos os pacientes recebiam
antibioticoterapia de largo espectro e
eram considerados imunodeprimidos.
Dos 70 pacientes com diarreia
nosocomial, 19 (27,1%) foram
confirmados com C. difficile. Desses,
foram isoladas oito estirpes de C.
difficile dos seguintes ribotipos: 010,
020, 133 e 233. É interessante observar
que quatro das oito (50%) estirpes
isoladas pertenciam ao ribotipo 133,
descrito somente no Brasil até o
momento. Novamente nenhuma estirpe
foi positiva para o gene relativo a toxina
binária, algo até então inédito no Brasil.
3.3 A Doença Em Animais
Domésticos
3.3.1 Suínos
As infecções por C. difficile (ICD) em
suínos ocorrem quase exclusivamente
em leitões com até sete dias de idade.
Ao contrário de seres humanos, o
desenvolvimento da doença nesta
espécie pode não estar necessariamente
correlacionada com a utilização de
antibióticos (Songer e Uzal, 2005).
C. difficile encontra-se disseminado no
ambiente, é potencialmente eliminado
nas fezes pelas porcas e a colonização
do intestino dos leitões ocorre nas
primeiras horas de vida (Hopman et al.,
2011). Clinicamente, a infecção por C.
difficile em leitões é caracterizada pelo
baixo desenvolvimento corporal e
edema de mesocólon. Raramente podem
ser observados outros sinais, como
hidrotórax, dificuldade respiratória,
edema escrotal, facial e até ocorrência
de morte súbita (Songer e Uzal, 2005).
Em granjas acometidas, cerca de 30%
dos animais apresentam-se positivos
para a presença das toxinas A/B,
podendo chegar a 100% em alguns
casos (Songer et al., 2004). É
importante salientar que apenas parte
dos animais infectados apresentam
diarreia, com consistência pastosa a
aquosa. A simples ausência de conteúdo
diarréico no cólon não descarta a
possibilidade de infecção, sendo a
doença comumente subclínica nesta
espécie (Yaeger et al., 2007)
Colite e edema de mesocólon (Figura
1C), principalmente quando este último
é grave, são as alterações macroscópicas
que melhor se correlacionam com a
ocorrência de infecções por C. difficile
em leitões (Yaeger et al. 2002). Deve-se
enfatizar porém que, em uma granja
afetada, é comum encontrar vários
leitões aparentemente saudáveis porém
positivos para detecção das toxinas A/B
e com lesões intestinais típicas quando
submetidos a uma avaliação
histopatológica (Songer e Uzal, 2005;
Yaeger et al., 2007). Em razão disso, a
avaliação microscópica é extremamente
valiosa para a confirmação do
diagnóstico epidemiológico em suínos.
Em animais positivos comumente é
possível observar supuração na lâmina
própria do cólon, edema, infiltrado de
células inflamatórias mononucleares e
neutrófilos na serosa e mesentério,
redução marcante do número de células
caliciformes, além da lesão típica
conhecida como “forma de vulcão”
(Figura 1D), devido ao extravazamento
de neutrófilos por pequenas ulcerações
na mucosa (Keel e Songer, 2006)
20
Figura 1(A) – Coloração de Gram de uma cultura de Clostridium difficile. Bastonetes Gram-positivos
com esporos. (B) – Detalhe de um esporo subterminal de C. difficile ainda com o corpo celular. (C) –
Leitão: edema de mesocolon em um leitão acometido por C. difficile. (D) – Leitão. Colon. Redução
severa das células caliciformes e enterite neutrofílica necrozante com intensa infiltração de neutrófilos da
lamina própria para o lumen intestinal (400X). Figuras 1C e 1D foram adaptadas de Cruz-Junior et al.
(2013) e Silva et al. (2013b).

Nos Estados Unidos, o exame de 1000 sugerindo uma grande disseminação da

leitões com enterite revelou a presença
das toxinas A/B em 34,1% dos animais
sem o envolvimento de outro patógeno
(Songer e Anderson, 2006). Em outros
24,3% foi possível identificar as toxinas
A/B em associação a detecção de outro
patógeno, tais como rotavirus, C.
perfringens e Escherichia coli
enterotoxigênica, demonstrando a toxinas A/B e/ou lesões histológicas
possibilidade de coinfecção com outros
agentes. No Brasil, um levantamento
realizado no Rio Grande do Sul
encontrou aproximadamente 16% de
animais positivos para as toxinas A/B
(Lippke et al., 2011), resultado
semelhante ao relatado em Minas
Gerais (Silva et al., 2011). Neste último
estudo, 53% das granjas amostradas
tiveram pelo menos um animal positivo,
doença. Em um trabalho realizado por
Cruz-Junior et al. (2013) em Minas
Gerais, avaliou-se a presença dos
principais agentes causadores de
diarreia neonatal em suínos (rotavírus,
Escherichia coli enterotoxigenica,
Isospora suis, Clostridium perfringens e
C. difficile) foram encontradas as
características de C. difficile em 50%
dos animais. Estes resultados sugerem,
de forma semelhante ao relatado no
EUA e Europa, uma queda na
prevalência dos agentes clássicos
causadores de diarreia e uma crescente
importância de C. difficile como
patógeno entérico, confirmando a
infecção por este agente como uma das

21
principais causas de diarreia neonatal
em suínos na atualidade.
3.3.2 Equinos
Em equinos, a infecção por C. difficile
acomete principalmente potros com até
cinco meses de idade, sendo
caracterizada por uma diarreia pastosa a
aquosa, com enterocolite necrotizante
(Keel e Songer, 2006). Acredita-se que,
assim como em seres humanos, nesta
espécie raramente a infecção ocorre de
forma espontânea, sendo normalmente
associada a algum desequilíbrio da
microbiota gastrointestinal,
principalmente pela utilização de
antibióticos (Weese et al., 2000). Os
antimicrobianos comumente
relacionados ao desenvolvimento da
infecção por C. difficile em equinos
incluem a eritromicina, ceftiofur,
norfloxacino, florfenicol, lincomicina e
os beta-lactâmicos em geral (Båverud,
2002; Preis et al., 2012; Silva et al.,
2012). É interessante ressaltar que a
utilização de múltiplos antibióticos têm
sido associada a um maior risco de
desenvolvimento da infecção por C.
difficile em potros (Magdesian et al.,
2002; Preis et al., 2012). Clinicamente
os animais infectados apresentam-se
com diarreia, comumente profusa,
desidratados, depremidos e com
presença marcante de gás no intestino
grosso (Båverud, 2002).
No Brasil, até o presente momento
trabalhos sobre a infecção por C.
difficile em potros limitam-se a duas
descrições de diagnóstico (Preis et al.,
2012; Silva et al., 2012), embora a
prevalência da doença, nesta espécie,
permaneça obscura pela ausência de
levantamentos epidemiológicos. Silva et
al. (2012) relataram a ocorrência de
diarreia em três animais de cinco meses
de idade, dois dias após a administração
de penicilina para tratamento de uma
possível pneumonia. Já Preis et al.
(2012) descreveram um caso de enterite
por C. difficile em um animal de 12 dias
de vida, associada a candidíase e
antibioticoterapia prolongada. Em
ambos relatos, houve uma suspeita
inicial de salmonelose, sendo que
apenas no primeiro relato houve
diagnóstico laboratorial ante mortem, o
que permitiu a alteração da
antibioticoterapia com foco na infecção
por C. difficile e restabelecimento dos
animais. Já no relato descrito por Preis
et al. (2012), a ausência de diagnóstico
laboratorial pode ter sido um agravante
uma vez que a escolha dos antibióticos
foi baseada na suspeita de salmonelose,
levando o animal a óbito.
Estes trabalhos confirmaram a
ocorrência da doença em equinos no
país e demonstram a necessidade do
diagnóstico diferencial para as diarreias
em potros, especialmente quando o
início dos sinais clínicos ocorreram
poucos dias após antibioticoterapia ou
em casos onde antimicrobianos
comumente utilizados para salmonelose,
como ceftiofur, norfloxacina ou
florfenicol, não resultam em melhora
clínica significativa.
Em equinos adultos, C. difficile tem
sido relatado como um agente
nosocomial causador de diarreia aguda
ou cólica durante a internação e após a
antibioticoterapia prévia para alguma
outra doença (Båverud et al. 2002).
Porém, até o presente momento
inexistem relatos de infecção por C.
difficile em equinos adultos no Brasil.
3.3.3 Cães
A importância de C. difficile em cães
diarréicos ainda não é totalmente
conhecida. Inicialmente, acreditava-se
ser este agente responsável apenas por
raros casos de diarreia crônica
reicidivante (Berry e Levett, 1986;
Marks e Kather, 2003). Porém, o risco
22
de colonização cresce
significativamente com a hospitalização
e a infecção com estirpes toxigênicas de
C. difficile está correlacionada com o
desenvolvimento de diarreia (Struble et
al., 1994; Clooten et al., 2008). Estes
fatos, associados á administração de
antibióticos e imunosupressivos,
parecem favorecer a colonização
intestinal por C. difficile em cães
internados. De forma semelhante ao que
ocorre em seres humanos, sugere-se que
o uso destes medicamentos, associado a
internação, são os principais fatores de
risco para desenvolvimento de diarreia
associada a C. difficile em cães,
tornando-o um patógeno nosocomial
também nessa espécie (Vaishnavi,
2009).
No Brasil, existe apenas um trabalho
sobre C. difficile que confirma a
ocorrência da doença em cães (Silva et
al., 2013a), onde foi realizado o
isolamento e detecção das toxinas A/B
em cães diarréicos oriundos de um
hospital veterinário e em animais
aparentemente saudáveis, fora do
ambiente hospitalar. De forma
semelhante ao relatado em outros
trabalhos, Silva et al. (2013a)
encontraram uma associação
significativa entre a ocorrência de
diarreia e a presença das toxinas A/B,
sugerindo a participação de C. difficile
em quadros entéricos nesta espécie
(Struble et al., 1994, Clooten et al.,
2008). Os autores chamam atenção para
a possibilidade de doença subclínica,
uma vez que parte dos animais
aparentemente saudáveis foram
positivos para as toxinas A/B.
Apesar dos avanços dos estudos nos
últimos anos, mais pesquisas são
necessárias para esclarecer algumas
questões relacionadas à infecção por C.
difficile em cães, destacando-se o papel
deste agente como causador de diarreia
em animais não-internados e sem
antibioticoterapia prévia.
3.4 Clostridium difficile como agente
zoonótico
A hipótese de animais como
reservatórios e transmissores de C.
difficile para seres humanos foi
levantada pela primeira vez em 1983
por Borriello et al. ao realizarem o
isolamento do agente em fezes de cães e
gatos. Desde então, essa hipótese
permaneceu pouco lembrada. Com o
desenvolvimento e maior aplicação das
técnicas de biologia molecular, estudos
com as estirpes de C. difficile de
diversas origens tornaram-se comuns.
Entre essas técnicas, a mais utilizada
atualmente é a ribotipagem, proposta
inicialmente por Gurtler et al. (1993). A
técnica permitiu a criação de uma
biblioteca de mais de 160 padrões
(ribotipos) a partir de estirpes de C.
difficile isoladas de animais, seres
humanos e do ambiente (Stubbs et al.,
2000).
Através da técnica da ribotipagem,
estudos recentes relataram que estirpes
de C. difficile isoladas a partir de
produtos cárneos compartilhavam
grande semelhança com os isolados de
seres humanos com colite
pseudomembranosa, sugerindo uma
possível transmissão do agente por
alimentos de origem animal (Rodriguez-
Palácios et al., 2007; Songer et al.,
2009). A partir desses resultados,
alguns trabalhos foram conduzidos com
o objetivo de avaliar a similaridade
entre estirpes isoladas de seres humanos
e de animais domésticos, sendo
observado que muitos ribotipos isolados
de bovinos, suínos e cães eram os
mesmos encontrados em seres humanos
com infecção por C. difficile (Arroyo et
al., 2005; Jhung et al., 2008).
Recentemente um estudo relatou que a
23
exposição ocupacional a suínos aumenta
significativamente a chance de
colonização pelo agente em seres
humanos e as estirpes isoladas dos
trabalhadores e dos animais tinham o
mesmo ribotipo, reforçando a hipótese
de transmissão entre espécies (Norman
et al., 2011). Outro ponto que tem
chamado a atenção é o grande aumento
do isolamento do ribotipo 078 em seres
humanos nos EUA e na Inglaterra. Essa
estirpe é comumente isolada de bezerros
e corresponde a 83% dos isolados de
suínos no EUA (Keel et al., 2007).
Estes resultados reforçaram a hipótese
de transmissão de C. difficile entre
animais e seres humanos. Em paralelo a
esta suspeita, eventos recentes indicam
mudanças na epidemiologia das
infecções causadas por C. difficile, com
ocorrência da doença em seres humanos
saudáveis, sem prévia exposição a
ambiente hospitalar e até mesmo na
ausência de antibioticoterapia (Samie et
al., 2008). Mais estudos são necessários
para confirmar a hipótese de infecção
por C. difficile como zoonose. Se
confirmada tal suspeita, a prevenção da
doença (e até mesmo da colonização)
em animais domésticos poderá passar a
ser uma prioridade (Songer, 2010).
Estudos de ribotipagem de C. difficile
no Brasil são escassos e restritos a
estirpes isoladas de seres humanos
(Balassiano et al., 2009). Até o presente
momento, inexistem trabalhos
brasileiros avaliando a ribotipagem de
isolados de C. difficile de animais
domésticos, impedindo a avaliação da
similaridade entre as cepas isoladas de
seres humanos e de animais no Brasil.
3.5 Diagnóstico
3.5.1 Detecção das toxinas
A detecção da presença das toxinas A/B
pela visualização do efeito citopático
em cultura celular (“cell citotoxicity
assay”- CTA) é considerado pela
maioria dos pesquisadores como o
“método padrão-ouro” para o
diagnóstico de infecções causadas por
C. difficile. Várias linhagens celulares
podem ser utilizadas para detecção das
citotoxinas, sendo a Chinese Hamster
Ovary (CHO) a mais comumente
utilizada e a African Green Monkey
Kidney (VERO) considerada a mais
sensível (Delmeé, 2001).
Este método consiste na inoculação do
filtrado de fezes em um cultivo celular e
a observação do efeito citopático,
causado principalmente pela toxina B,
que é 1000 vezes mais citotóxica que a
toxina A (Ciesla e Bobak, 1998). A
leitura é realizada em 24 a 48 horas e a
confirmação é dada pela
soroneutralização do efeito citopático
por anticorpos específicos contra as
toxinas A/B de C. difficile ou de C.
sordellii (Delmeé, 2001).
A CTA tem como principal vantagem a
alta sensibilidade e específicidade para
detecção das toxinas A/B em fezes
(Doern et al., 1992). Por outro lado o
resultado é demorado e permite
processar apenas poucas amostras por
vez, quando comparado com outras
técnicas como os kits comerciais de
ensaio imunoenzimático (ELISA) ou
imunocromatografia. Outro ponto
desfavorável é a necessidade de
manutenção de linhagens celulares, o
que consome tempo, possui um custo
relativamente elevado e necessita de
pessoal treinado (Post et al., 2002).
Os kits comerciais para detecção das
toxinas A/B são de fácil execução e o
resultado é rápido, sendo dado em
poucas horas. Infelizmente todos os kits
disponíveis no mercado brasileiro são
importados, aumentando o custo do
diagnóstico, além de serem
padronizados para a detecção das
24
toxinas A/B a partir de fezes de seres
humanos, fazendo com que a
sensibilidade e especificidade sejam
extremamente variáveis entre eles e por
espécie animal. Deve ser ressaltado,
ainda, que alguns kits disponívels são
padronizados apenas para detecção da
toxina A. A pesquisa de ambas as
toxinas é essencial uma vez que são
comuns relatos de infecção por C.
difficile, incluindo grandes surtos em
seres humanos, causados por estirpes
variantes, produtoras apenas da toxina B
(Alfa et al., 2000; Kuijper et al., 2001).
Trabalhos avaliando o desempenho de
kits de ELISA para detecção das toxinas
A/B sugerem que tais produtos seriam
de baixa eficiência para suínos
(Anderson e Songer, 2008; Keessen et
al., 2011). Em geral, os kits testados
apresentam sensibilidade ou
especificidade baixas. Porém, uma
exceção é relatada por Post et al.
(2002), ao encontrarem 91% de
sensibilidade e 86% de especificidade
em um kit avaliado com fezes suínas.
Para fezes de cães, Couicha e Marks
(2006) avaliaram cinco kits comerciais
ELISA e também concluíram que todos
eram inadequados devido a baixa
sensibilidade, que variou de 7 a 33%
(Chouicha e Marks, 2006). Dessa
forma, tanto para suínos quanto para
cães, a utilização de kits comerciais
parece ser inadequada para o
diagnóstico. Especula-se, para ambas as
espécies, que a sensibilidade e
especificidade dos kits de ELISA sejam
comprometidas pela presença de
inibidores e de proteases fecais que
diminuiriam a especificidade da ligação
e/ou causariam a degradação das
toxinas nas fezes (Couicha e Marks,
2006).
Para equinos, apenas um kit foi avaliado
até o momento e a performance foi
considerada adequada, com
sensibilidade de 84% e especificidade
de 96% (Medina-Torres et al., 2010).
Porém mais trabalhos são necessários
para elucidar o desempenho dos kits
comerciais para aplicação em espécimes
clínicos de equinos, incluindo a
avaliação entre amostras de potros e de
animais adultos, algo que não ocorreu
no relato de Medina-Torres et al.
(2010).
Não existem estudos avaliando os kits
comerciais presentes no mercado
brasileiro frente a amostras clínicas de
equinos, suínos ou cães, dificultando o
diagnóstico das infecções por C.
difficile nas espécies domésticas no
país. Tendo em vista a confirmação de
uma prevalência significativa da doença
na suinocultura e ainda a confirmação
da infecção também em cães e equinos,
a avaliação de tais kits e a padronização
do diagnóstico da infecção por C.
difficile em cada espécie doméstica será
crucial para uma avaliação
epidemiológica mais completa e
implementação de medidas de controle
e tratamento mais efetivos.
3.5.2 Isolamento e Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR)
Após o estabelecimento do papel do C.
difficile como principal causador de
colite pseudomembranosa e diarreia
nosocomial em seres humanos, George
et al. (1979) relataram a utilização de
um agar específico para isolamento:
Ágar CCFA (Cefoxitina-Cicloserina-
Frutose-Ágar). Desde então, é o meio
mais utilizado para isolamento de C.
difficile a partir de fezes (Delmeé,
2001). Várias modificações do ágar
CCFA foram propostas ao longo dos
anos, entre essas, a adição de
taurocolate ao CCFA (TCCFA)
demonstrou melhorar a recuperação de
C. difficile. O taurocolate é um sal
presente na bile de seres humanos e de
animais, sendo encontrado no intestino.
Segundo Sorg e Sonenshein (2008),
25
esporos de C. difficile parecem ter
receptores para taurocolate, que
sinalizariam ao esporo o momento
adequado para a germinação,
aumentando assim o índice de
isolamento do agente (Ramirez et al.,
2010).
Outra estratégia comumente utilizada
para melhorar o isolamento de C.
difficile é o choque com alcool absoluto,
onde volumes iguais de álcool e fezes
são misturados por aproximadamente 30
minutos antes do plaqueamento. O
choque com álcool aumenta a
sensibilidade do isolamento por
eliminar formas vegetativas e outras
bactérias presentes nas fezes,
permanecendo os esporos de C. difficile
(Borriello e Honour, 1981). Ainda de
acordo com Songer e Uzal (2005),
algumas estirpes podem não crescer no
ágar TCCFA devido à susceptibilidade
a um ou a ambos antibióticos utilizados
no meio seletivo.
Colônias de C. difficile podem ser
reconhecidas por sua morfologia típica,
aspecto conhecido como “vidro moído”:
colônias rizóides, irregulares de
coloração acinzentada e odor
característico, semelhante ao de fezes de
equinos (Delmeé, 2001). Na coloração
de Gram é possível observar bastonetes
Gram-positivos com esporos
subterminais (Figura 1A e 1B)
(Vaishnavi, 2009). Porém, além do
diagnóstico presumptivo pela
morfologia colonial e tinturial, é
necessária uma confirmação da
identidade, sendo a PCR a técnica mais
utilizada para este fim. Além de
confirmar a identidade, a maioria das
técnicas combina a detecção dos genes
codificadores da toxina A (tcdA), toxina
B (tcdB) e, eventualmente, a detecção
de outros fatores de virulência
adicionais, como a toxina binária (cdtB
e cdtA) (Lemée et al., 2004; Silva et al.,
2011). A pesquisa destes genes é
importante uma vez que alguns
trabalhos sugerem uma alta correlação
entre alguns tipos toxigênicos de C.
difficile e uma maior gravidade da
doença em seres humanos e algumas
espécies de animais (Voth e Ballard,
2005; Arroyo et al., 2007).
Como C. difficile pode ser um habitante
normal da microbiota intestinal, apenas
o isolamento não confirma a doença
tanto em seres humanos quanto em
animais domésticos (Ferreira et al.,
2003; Arroyo et al., 2007; Yaeger et al.,
2007; Clooten et al., 2008). Em razão
disso, o isolamento era utilizado apenas
na condução de investigações
epidemiológicas e avaliação da
sensibilidade do microrganismo a
antibióticos. Porém, estudos recentes
demonstraram que o isolamento seguido
da detecção dos genes tcdA e/ou tcdB
por PCR ou da avaliação da produção in
vitro das toxinas A/B pela estirpe
(técnica conhecida como toxigenic
culture, ou TC) seria um teste com
correlação relativamente alta com a
ocorrência da doença.
Com isso, muito têm-se pesquisado com
relação ao potencial da TC como
“método ouro” para o diagnóstico em
algumas espécies (Keessen et al., 2011).
Em geral, a técnica apresenta alta
sensibilidade, mas sua especificidade é
variada. Ao que tudo indica, seria um
teste interessante para triagem mas,
assim como a CTA, o TC é laborioso e
necessita de um tempo relativamente
grande (no mínimo 72 horas) para a
obtenção do resultado. Além disso,
inexiste um padrão de TC, dificultando
comparações de estudos sobre o
desempenho desse método.
Uma outra opção relatada para o
dignóstico, ainda pouco conhecida no
Brasil, seriam kits comerciais de PCR
em tempo real (rPCR), também
conhecidos como testes de amplificação
26
de ácidos nucléicos (nucleic acid
amplification test – NAAT), para
detecção do gene tcdB diretamente das
fezes. Inexistem estudos avaliando a
rPCR em amostras de equinos, mas
relatos sugerem que a rPCR apresenta
grande sensibilidade para seres
humanos e suínos (Schmidt e Gilligan,
2009; Keesen et al., 2011). Por outro
lado, muito têm-se discutido com
relação a especificidade, uma vez que
existe a possibilidade de portador
assintomático, o que geraria resultados
falso-positivos. Até o presente
momento, a proposta seria a utilização
da rPCR como um primeiro teste de
triagem, sendo resultados positivos
confirmados por CTA, TC ou kits
comerciais de ELISA de alta
especificidade (Keessen et al., 2011).
No Brasil atualmente o diagnóstico
laboratorial das infecções por C.
difficile em humanos e animais é dado
pela detecção das toxinas A/B por
ELISA. Além disso, a avaliação
histopatológica tem-se mostrado uma
ferramenta auxiliar essencial para
confirmação em suínos ou em casos de
óbito de equinos. Para suínos, quando
utilizado kits de ELISA de baixa
sensibilidade mas alta especificidade, há
ainda a possibilidade de múltipla
amostragem na granja suspeita, o que
parece aumentar significativamente a
sensibilidade do teste (Keessen et al.,
2011). Trabalhos avaliando os kits
comerciais de ELISA são essenciais
para verificar quais são adequados para
o diagnóstico e quais os mais indicados
para cada espécie doméstica.
3.6 Tratamento e controle
O controle das infecções por C. difficile
nas espécies domésticas é baseado em
medidas gerais de manejo, uma vez que
inexistem vacinas disponíveis no
mercado brasileiro. Como os esporos de
C. difficile podem permanecer viáveis
por grandes períodos e resistir à maioria
dos desinfetantes, estes possuem alto
potencial de contaminação ambiental,
especialmente em hospitais (Buggy et
al., 1983). A diminuição da
contaminação e disseminação ambiental
são essenciais, sendo o uso correto de
produtos contendo cloro ativo e a
higienização das mãos duas estratégias
de extrema importância (Båverud et al.,
2003). Em equinos e cães, de forma
semelhante ao que é feito na maioria
dos hospitais humanos, o isolamento de
animais suspeitos também é essencial. É
interessante salientar ainda que a
aplicação de álcool nas mãos para
eliminação dos esporos desse
microrganismo é ineficiente (Macleod-
Glover e Sadowski, 2010).
Estudos com camundongos e hamsters
demonstraram que anticorpos contra as
toxinas A/B induzidos por imunização
são capazes de prevenir a doença
(Corthier et al., 1991; Siddiqui et al.,
2012). Em seres humanos, um toxóide
para prevenção das diarreias por C.
difficile encontra-se em fase final de
teste, tendo grande potencial para
utilização (Greenberg et al., 2012).
Entretanto, o mesmo não pode ser dito
para as espécies domésticas, uma vez
que são raros estudos avaliando a
imunidade de equinos e suínos ao C.
difficile e suas toxinas. Em um futuro
próximo, a produção de um toxóide A/B
poderá ser um ponto essencial para o
controle das doenças associadas a C.
difficile em animais.
Outra alternativa que poderá ser
utilizada futuramente para prevenção e
tratamento é a administração de estirpes
não-toxigênicas de C. difficile. Tal
possibilidade foi levantanda por
trabalhos ao demonstrarem que seres
humanos e animais, previamente
colonizados por essas estirpes,
possuiam uma menor chance de serem
infectados por uma estirpe toxigência e
27
de desenvolverem diarreia (Shim et al.,
1998; Clooten et al., 2008; Silva et al.,
2011; Silva et al., 2013a). Desde então,
estudos avaliando o potencial da
administração oral de estirpes não-
toxigênicas para prevenção e tratamento
das infecções por C. difficile tem sido
desenvolvidos e um efeito protetivo foi
relatado em um trabalho com seres
humanos e com suínos (Songer et al.,
2007; Songer et al., 2010).
Inexistem trabalhos sobre a apenas em humanos, é o transplante de
susceptibilidade antimicrobiana de
estirpes de C. difficile isoladas de
animais domésticos no Brasil. Estudos
com estirpes de C. difficile isoladas de
suínos nos EUA sugerem que tiamulina,
virginiamicina e tilosina, incluídos na
alimentação dos animais, podem ser
úteis na profilaxia ou terapia (Songer e
Anderson, 2006). Já em equinos e cães,
além da terapêutica básica de suporte de
animais diarréicos, preconiza-se a
imediata substituição do antibiótico que
precedeu a infecção por metronidazol,
primeira droga de escolha, ou
vancomicina (Tabaqchali, 1995; Jang et
al., 1997; Båverud, 2004).
Em aproximadamente 20% dos casos de
seres humanos com ICD ocorre
recorrência do quadro clínico após o
término do tratamento com
metronidazol ou vancomicina. Muitas
vezes a recorrência da doença persiste
por longos períodos, sempre após a
retirada do antimicrobiano, sendo
necessário tratamentos alternativos para
recuperação da microbiota (Kaur et al.,
2011). Entre as alternativas, estudos
experimentais sugerem que alguns
probióticos podem auxiliar no
tratamento das infecções por C. difficile
por facilitar o restabelecimento da
microbiota, aumentar a resposta imune e
combater diretamente o patógeno e suas
toxinas no intestino (Toothaker e Elmer,
1984; Kaur et al., 2011). Entre os
microrgarnismos mais estudados
destacam-se o Lactobacillus rhamnosus
e a levedura Saccharomyces boulardii,
ambos com efeitos positivos
comprovados tanto em modelos de ICD
em roedores quanto em estudos clínicos
com seres humanos. Já em equinos e
suínos são raros os trabalhos avaliando
o efeito de probióticos em casos de ICD
(Toothaker e Elmer, 1984; Kaur et al.,
2011; Zilberberg e Shorr, 2013).
Outra opção, usada até o momento
microbiota fecal. Nesse caso, um
doador saudável, comumente um
parente próximo do paciente, cede o
conteúdo fecal que será transplantado
por sonda nasogástrica ou colonoscopia
para o paciente com ICD. Com isso,
ocorre uma rápida recuperação da
microbiota, que por sua vez inibe o
crescimento e produção de toxinas de C.
difficile (Rubin et al., 2012).
REFERÊNCIAS
ALFA, M.J.; KABANI, A.; LYERLY,
D. et al. Characterization of a toxin A-
negative, toxin B-positive strain of
Clostridium difficile responsible for a
nosocomial outbreak of Clostridium
difficile-associated diarrhea. J Clinic
Microbiol., v.38, n.7, p.2706-2714,
2000.
ANDERSON, M. A; SONGER, J. G.
Clostridium difficile: an important
pathogen of food animals. Anaerobe.,
v.128, p.204-206, 2008.
ARROYO, L.G.; KRUTH, S.A.;
WILLEY, B.M. et al. PCR ribotyping of
Clostridium difficile isolates originating
from human and animal sources. J Med
Microbiol., v.54, p.163-6, 2005.
ARROYO, L.G.; STAEMPFLI, H.;
WEESE, J.S. Molecular analysis of
Clostridium difficile isolates recovered
28
from horses with diarrhea. Vet
Microbiol., v.120, p.179-183, 2007.
BALASSIANO, I.T.; DOS SANTOS-
FILHO, J.; DE OLIVEIRA, M.P. et al.
An outbreak case of
Clostridium difficile-associated diarrhea
among elderly inpatients of an intensive
care unit of a tertiary hospital in Rio de
Janeiro, Brazil. Diagn Microbiol Infect
Dis., v.68, n.4, p.449-55, 2010.
BALASSIANO, I.T.; DOS SANTOS-
FILHO, J.; VITAL-BRAZIL, J.M. et al.
Detection of cross-infection associated
to a Brazilian PCR-ribotype of
Clostridium difficile in a university
hospital in Rio de Janeiro, Brazil.
Antonie Van Leeuwenhoek, v.99, n.2,
p.249-55, 2011.
BALASSIANO, I.T.; MIRANDA,
K.R.; BOENTE, R.F. et al.
Characterization of
Clostridium difficile strains isolated
from immunosuppressed inpatients in a
hospital in Rio de Janeiro, Brazil.
Anaerobe, v.15, n.3, p. 61-64, 2009.
BALASSIANO, I.T.; YATES, E.A.;
DOMINGUES, R.M. et al.
Clostridium difficile: a problem of
concern in developed countries and still
a mystery in Latin America. J Med
Microbiol, v.61, n.2, p.169-79, 2012.
BANO, L. Prevalence and Molecular
Characterization of Clostridium difficile
isolated from rabbits and detection of its
main toxins. In: WORLD RABBIT
CONGRESS, 9, 2008, Verona.
Proceedins of the… Verona: [s.n],
2008. p. 911-914. Disponível em: <
http://world-rabbit-science.com/WRSA-
Proceedings/Congress-2008-
Verona/Papers/P-Bano.pdf >. Acesso
em: 3 fev. 2013.
BARTLETT, J. G.
Clostridium difficile infection: historic
review. Anaerobe, v.15, n.6, p.227-9,
2009.
BÅVERUD, V. Clostridium difficile
diarrhea: infection control in horses. Vet
Clinic North Am Eq Pract, v.20, n.3,
p.615-630, 2004.
BÅVERUD, V. Clostridium difficile
infections in animals with special
reference to the horse: a review. Vet Q.,
v.24, n.4, p.203-219, 2002.
BÅVERUD, V.; GUSTAFSSON, A.;
FRANKLIN, A. et al.
Clostridium difficile: prevalence in
horses and environment, and
antimicrobial susceptibility. Equine Vet
J, v.35, n.5, p.465-71, 2003.
BERRY, A. P; LEVETT, P. N. Chronic
diarrhea in dogs associated with
Clostridium difficile infection. Vet Rec.,
v.118, p.102-103, 1986.
BORRIELLO, S.P. HONOUR, P.;
TURNER, T. et al. Household pets as a
potential reservoir for
Clostridium difficile infection. J Clin
Pathol., v. 36, n.1, p.84-7, 1983.
BORRIELLO, S. P; HONOUR, P.
Simplified procedure for the routine
isolation of Clostridium difficile from
faeces. J Clin Pathol., v.34, n.10,
p.1124-7, 1981.
BUGGY, B.P., WILSON, K.H.,
FEKETY, R. et al. Comparison of
methods for recovery of Clostridium
difficile from an environmental surface.
J Clin Microbiol., v.18, n.2, p.348-52
1983.
CHEKNIS, A.K.; SAMBOL, S.P.;
DAVIDSON, D.M. Distribution of
Clostridium difficile strains from a
North American, European and
Australian trial of treatment for C.
29
difficile infections: 2005-2007.
Anaerobe, v.15, n.6, p.230-3, 2009.
CHOUICHA, N; MARKS, S.L.
Evaluation of five enzyme
immunoassays compared with the
cytotoxicity assay for diagnosis of
Clostridium difficile-associated diarrhea
in dogs. J Vet Diagn Investig., v.18,
n.182-188, 2006.
CIESLA, W.P.Jr; BOBAK, D.A.
Clostridium difficile toxins A and B are
cation-dependent UDP-glucose
hydrolases with differing catalytic
activities. J Biol Chem., v.273, n.26,
p.16021-16026, 1998.
CLOOTEN, J., KRUTH, S., ARROYO,
L. et al. Prevalence and risk factors for
Clostridium difficile colonization in
dogs and cats hospitalized in an
intensive care unit. Vet Microbiol.,
v.129, p.209-14, 2008.
CORTHIER, G.; MULLER, M.C.;
WILKINS, T.D. et al. Protection against
experimental pseudomembranous colitis
in gnotobiotic mice by use of
monoclonal antibodies against
Clostridium difficile toxin A. Infect
Immun., v.59, n.3, p.1192-5, 1991.
CRUZ-JUNIOR, E.C.; SALVARANI,
F.M.; SILVA, R.O.S. et al. A
surveillance of enteropathogens in
piglets from birth to seven days of age
in Brazil. Pesq Vet Bras, no prelo, 2013.
DELMÉE, M. Laboratory diagnosis of
Clostridium difficile disease. Clin
Microbiol Infect., v.7, n.8, p.411-416,
2001.
DOERN, G.V.; COUGHLIN, R.T.;
WU, L. Laboratory diagnosis of
Clostridium difficile-associated
gastrointestinal disease: comparison of a
monoclonal antibody enzyme
immunoassay for toxins A and B with a
monoclonal antibody enzyme
immunoassay for toxin A only and two
cytotoxicity assays. J Clin
Microbiol., v.30, n.8, p.2042-6, 1992.
EHRICH, M.; PERRY, B.D.; TROUTT,
H.F. et al Acute diarrhea in horses of
the Potomac River area: examination
for clostridial toxins. J Am Vet Med
Assoc., v.185, n.4, p.433-5, 1984.
FERREIRA, C.E.; NAKANO, V.;
DURIGON, E.L. et al. Prevalence of
Clostridiumspp. and Clostridium
difficile in Children with Acute
Diarrhea in São Paulo City, Brazil. Mem
Inst Oswaldo Cruz, v.98, n.4, p.451-
455, 2003.
GELLAD, Z.F.; JOHNSON, J.L.;
MUIR, A.J. et al. Severity of
Clostridium difficile-associated diarrhea
in solid organ transplant patients.
Transpl Infect Dis., v.9, n.4, p.276-280,
2007.
GEORGE, R.H.; SYMONDS, J.M.;
DIMOCK, F. et al. Identification of
Clostridium difficile as a cause of
pseudomembranous colitis. Br Med J.,
v.18, n.1, p.695, 1978.
GEORGE, W.L.; SUTTER, V.L;
CITRON, D. et al. Selective and
differential medium for isolation of
Clostridium difficile. J Clin
Microbiol., v.9, n.2, p.214-9, 1979.
GONÇALVES, C.; DECRÉ, D.;
BARBUT, F. et al. Prevalence and
characterization of a binary toxin (actin-
specific ADP-ribosyltransferase) from
Clostridium difficile. J Clin Microbiol.,
v.42, n.5, p.1933-1939, 2004.
GREEN, R.H. The association of viral
activation with penicillin toxicity in
guinea pigs and hamsters. Yale J Biol
Med., v.47, n.3, p.166-81, 1974.
30
GREENBERG, R.N.; MARBURY,
T.C.; FOGLIA, G. et al. Phase I dose
finding studies of an adjuvanted
Clostridium difficile toxoid vaccine.
Vaccine, v.30, n.13, p.2245-9, 2012.
GÜRTLER, V. Typing of Clostridium
difficile strains by PCR-amplification of
variable length 16S-23S rDNA spacer
regions. J Gen Microbiol., v.139, n.12,
p.3089-97, 1993.
HALL, I.C.; O´TOOLE, E. Intestinal
flora in new-born infants. Am J Dis
Child., v.49, p.390-402, 1935.
HAMBRE, D. M. et al. The toxicity of
penicillin as prepared for clinical use. J
Am Med Associat., v.206, p.642, 1943.
HOOKMAN, P.; BARKIN, J.S.
Clostridium difficile associated
infection, diarrhea and colitis. World J
Gastroenterol., v.15, n.13, p.1554-80,
2009.
HOPMAN, N.E.; KEESSEN, E.C.;
HARMANUS, C. et al. Acquisition of
Clostridium difficile by piglets. Vet
Microbiol., v.149, n.1, p.186-92, 2011.
JANG, S.S; HANSEN, L.M.; BREHER,
J.E. et al. Antimicrobial susceptibilities
of equine isolates of Clostridium
difficile and molecular characterization
of metronidazole-resistant strains. Clin
Infect Dis., v.25, p.266-7, 1997.
JHUNG, M.A.; THOMPSON, A.D.;
KILLGORE, G.E. et al. Toxinotype V
Clostridium difficile in humans and
food animals. Emerg Infect Dis., v.14,
n.7, p.1039-45, 2008.
JONES, M.A; HUNTER, D. Isolation
of Clostridium difficile from pigs. Vet
Rec., v.112, n.11: p.253.
KAUR, S.; VAISHNAVI, C.;
PRASAD, K.K. et al. Effect of
Lactobacillus acidophilus & epidermal
growth factor on experimentally
induced Clostridium difficile infection.
Indian J Med Res, v.133, p.434-441,
2011.
KEEL, K.; BRAZIER, J.S.; POST,
K.W. Prevalence of PCR ribotypes
among Clostridium difficile isolates
from pigs, calves, and other species. J
Clin Microbiol., v.45, n.6, p.1963-4,
2007.
KEEL, M.K; SONGER, J.G. The
comparative pathology of Clostridium
difficile-associated disease. Vet Pathol.,
v.43, n.3, p.225-240, 2006.
KEESSEN, E.C.; HOPMAN, N.E.;
VAN LEENGOED, L.A. et al.
Evaluation of four different diagnostic
tests to detect Clostridium difficile in
piglets. J Clin Microbiol., v. 49, n.5,
p.1816-21, 2011.
KELLY, C.P.; LAMONT, J.T.
Clostridium difficile: more difficult than
ever. N Engl J Med, v.359, n.18,
p.1932-40. 2008.
KUIJPER, E.J.; DE WEERDT, J.;
KATO, H. et al. Nosocomial outbreak
of Clostridium difficile-associated
diarrhea due to a clindamycin-resistant
enterotoxin A-negative strain. Eur J
ClinMicrobiol Infect Dis., v.20, n.8,
p.528-534, 2001.
LEMEE, L.; DHALLUIN, A.;
TESTELIN, S. et al. Multiplex PCR
targeting tpi (triose phosphate
isomerase), tcdA (Toxin A), and tcdB
(Toxin B) genes for toxigenic culture of
Clostridium difficile. J Clin Microbiol.,
v.42, n.12, p.5710-5714, 2004.
LIPPKE, R.T.; BOROWSKI, S.M.;
MARQUES, S.M.T. et al. Matched
case-control study evaluating the
frequency of the main agents associated
31
with neonatal diarrhea in piglets. Pesq
Vet Bras., n.31, v.6, p.505-510, 2011.
LYERLY, D.M.; KRIVAN, H.C.;
WILKINS, T.D. Clostridium difficile:
its disease and toxins. Clin Microbiol
Rev., v.1, n.1, p.1-18, 1988.
MACLEOD-GLOVER,
N.; SADOWSKI, C. Efficacy of
cleaning products for C. difficile:
environmental strategies to reduce the
spread of Clostridium difficile-
associated diarrhea in geriatric
rehabilitation. Can Fam
Physician., v.56, n.5, p.417-23, 2010.
MAGDESIAN, K.G.; HIRSH, D.C.;
JANG, S.S. et al. Characterization of
Clostridium difficile isolates from foals
with diarrhea: 28 cases (1993-1997). J
Am Vet Med Assoc., v.220, n.1, p.67-73,
2002.
MARCON, A.P.; GAMBA, M.A.;
VIANNA, L.A. Nosocomial diarrhea in
the intensive care unit. Braz J Infect
Dis, v.10, p. 384–389, 2006.
MARKS, S.L.; KATHER, E.J..
Bacterial-associated diarrhea in the dog:
a critical appraisal. Vet Clinic North
Am: Small Animal Practic, v.33, n.5,
p.1029-60, 2003.
MARTINS, A.M.C.R.P.F.; LEME,
M.C.M.; HIPOLITO, M. et al.
Descrição de um caso de enterocolite
pseudomembranosa em bovino. Arq Inst
Biol., v.68, n.1, p.119-121, 2001.
MEDINA-TORRES, C.E.; WEESE,
J.S.; STAEMPFLI, H.R. Prevalence of
Clostridium difficile in horses. Vet
Microbiol., 152, 212-215, 2010.
NORMAN, K.N.; SCOTT, H.M.;
HARVEY, R.B. et al. Prevalence and
genotypic characteristics of
Clostridium difficile in a closed and
integrated human and swine population.
App Environm Microbiol., v.77, n.16,
p.5755-60, 2011.
POST, K.W.; JOST, B.H.; SONGER,
J.G. et al. Evaluation of a test for
Clostridium difficile toxins A and B for
the diagnosis of neonatal swine
enteritis. J Vet Diagn Invest., v.14, n.3,
p.258-259, 2002.
PREIS, I.S.; SILVA, R.O.S.; PIRES,
P.S. et al. Enteritis associated with
Clostridium difficile and opportunistic
candidiasis in a foal. Braz J Vet Pathol.,
v.5, n.1, p.7-11, 2012.
RAMIREZ, N.; LIGGINS, M.; ABEL-
SANTOS, E. Kinetic evidence for the
presence of putative germination
receptors in Clostridium difficile spores.
J Bacteriol., v.192, n.16, p.4215-22,
2010.
RODRIGUEZ-PALACIOS, A.;
STAEMPFLI, H.R.; DUFFIELD, T. et
al. Clostridium difficile in retail ground
meat, Canada. Emerg Infect Dis J.,
v.13, n.3, p.485-487, 2007.
RUBIN, T.A.; GESSERT, C.E.; AAS,
J. et al. Fecal microbiome
transplantation for recurrent
Clostridium difficile infection: Report
on case series. Anaerobe, v.56, p.1-5,
2012.
RUPNIK, M.; DUPUY, B.;
FAIRWEATHER, N.F. et al. Revised
nomenclature of Clostridium difficile
toxins and associated genes. J Med
Microbiol, v.54, p.113-117, 2005.
SAMIE, A.; OBI, C.L.; FRANASIAK,
J. et al. PCR detection of Clostridium
difficile triose phosphate isomerase
(tpi), toxin A (tcdA), toxin B (tcdB),
binary toxin (cdtA, cdtB), and tcdC
genes in Vhembe District, South Africa.
32
Am J Trop Med Hyg, v.78, n.4, p.577-
585, 2008.
SCHMIDT, M.L.; GILLIGAN, P.H.
Clostridium difficile testing algorithms:
what is practical and feasible?
Anaerobe, v.6, p.270-3, 2009.
SCHWAN, C.; STECHER, B.;
TZIVELEKIDIS, T. et al. Clostridium
difficile toxin CDT induces formation of
microtubule-based protrusions and
increases adherence of bacteria. PLos
Pathog, v.5, n.10, 2009.
SHIM, J.K.; JOHNSON, S.; SAMORE,
M.H. et al. Primary symptomless
colonisation by Clostridium difficile and
decreased risk of subsequent diarrhoea.
Lancet, v.351, n.9103, p.633-6, 1998.
SIDDIQUI, F.; O'CONNOR, J.R.;
NAGARO, K. et al. Vaccination with
parenteral toxoid B protects hamsters
against lethal challenge with toxin A-
negative, toxin B-positive
Clostridium difficile but does not
prevent colonization. J Infect Dis.,
v.205, n.1, p.128-33, 2012.
SILVA, R.O.S.; GUEDES, R.M.C.;
LOBATO, F.C.F. Clostridium difficile
infection: main features and occurrence
in domestic species in Brazil. Ciência
Rural, v43, n.1, p.73-80, 2013b.
SILVA, R.O.S.; MOREIRA, F.M.;
REZENDE, J.V. et al. First confirmed
case of Clostridium difficile-associated
diarrhea in foals in Brazil. Ciência
Rural, v.42, n.3, p. 498-500, 2012.
SILVA, R.O.S.; SALVARANI, F.M.;
CRUZ JUNIOR, E.C.C. et al. Detection
of toxins A/B and isolation of
Clostridium difficile from piglets in
Brazil. Ciência Rural, v.41 n.8 p.1130-
1135, 2011.
SILVA, R.O.S.; SANTOS, R.L.R.;
PIRES, P.S. et al. Detection of toxins
A/B and isolation of Clostridium
difficile and Clostridium perfringens
from dogs in Brazil. Braz J Microbiol,
v.44, n1. 133-137, 2013a.
SONGER, J. G. Clostridia as agents of
zoonotic disease. Vet Microbiol, v.140,
p.399-404, 2010.
SONGER, J.G.; JONES, R.;
ANDERSON, M.A. et al. Prevention of
porcine Clostridium difficile-associated
disease by competitive exclusion with
nontoxigenic organisms. Vet Microbiol.,
v.124, n.4, p.358-361, 2007.
SONGER, J.G.; TRINH, H.T.;
KILLGORE, G.E. et al. Clostridium
difficile in retail meat products, USA,
2007. Emerg Infect Dis, v.15, n.5,
p.819-821, 2009.
SONGER, J.G.; UZAL, F.A.
Clostridial enteric infections in pigs. J
Vet Diagn Investig., v.17, n.6, p.528-
536, 2005.
SONGER, J.G. The emergence of
Clostridium difficile as a pathogen of
food animals. Anim Health Res Rev,
n.2, p.321-6, 2004.
SONGER, J.G.; ANDERSON, M.A.
Clostridium difficile: an important
pathogen of food animals.
Anaerobe, v.12, n.1, p.1-4, 2006.
SORG, J.A.; SONENSHEIN, A.L.
Chenodeoxycholate is an inhibitor of
Clostridium difficile spore germination.
J Bacteriol., v.191, n.3, p.1115-7, 2009.
STRUBLE, A.L.; TANG, Y.J.; KASS,
P.H. et al. Fecal shedding of
Clostridium difficile in dogs: a period
prevalence survey in a veterinary
medical teaching hospital. J Vet Diagn
Invest, v.6, p.342-7, 1994.
33
STUBBS, S.; RUPNIK, M.; GIBERT, Clostridium difficile and its toxins in
M. et al. Production of actin-specific equine feces: implications for diagnostic
ADP-ribosyltransferase (binary toxin) test selection and interpretation. J Vet
by strains of Clostridium difficile. Diagn Invest, v. 12, n.4, p.332-6, 2000.
FEMS Microbiol Lett, v.186, p.307-312,
2000. WEESE, J.S.; WEESE, H.E.;
BOURDEAU, T.L. et al. Suspected
TABAQCHALI, S.; JUMAA, P. Clostridium difficile-associated diarrhea
Diagnosis and management of in two cats. J Am Vet Med Assoc, v.218,
Clostridium difficile infection. n.9, p.1436-9, 1421, 2001.
BMJ, v.310, n.6991, p.1375-80, 1995.
YAEGER, M.; FUNK, N.; HOFFMAN,
TOOTHAKER, R.D.; ELMER, G.W. L. A survey of agents associated with
Prevention of Clindamycin-induced neonatal diarrhea in Iowa swine
Mortality in Hamsters by including Clostridium difficile and
Saccharomyces boulardii. Antimicrob porcine reproductive and respiratory
Agents Chemother, v.26, p.552-556, syndrome virus. J Vet Diagn Invest,
1984. v.14, n.4, p.281-7, 2002.

VAISHNAVI, C. Established and YAEGER, M.J.; KINYON, J.M.;

potential risk factors for Clostridum
difficile infection. Indian J Med
Microbiol., v.27, n.4, p.289-300, 2009.
VOTH, D.E.; BALLARD J.D.
Clostridium difficile toxins: mechanism
of action and role in disease. Clinic
Microbiol Reviews., v.18, n.2, p.247-
263, 2005.
WEESE, J.S.; STAEMPFLI, H.R.;
PRESCOTT, J.F. Survival of
GLENN, SONGER, J. A prospective,
case control study evaluating the
association between Clostridium
difficile toxins in the colon of neonatal
swine and gross and microscopic
lesions. J Vet Diagn Invest, v.19, n.1,
p.52-59, 2007.
ZILBERBERG, M.D.; SHORR, A.F.
Preventing Clostridium difficile
infection in the intensive care unit. Crit
Care Clin, v.29, p.11-18, 2013.

34
4. CAPÍTULO 1: Padronização e avaliação de métodos de diagnóstico para
infecção por Clostridium difficile

4.1 Padronização da soroneutralização celular para detecção das toxinas A/B de

Clostridium difficile em fezes.

RESUMO

O diagnóstico da infecção causada por Clostridium difficile é baseado na detecção das

toxinas diretamente nas fezes, sendo a detecção do efeito citotóxico causado pelas
toxinas A/B em cultura de células (CTA) considerado o método “ouro”. O objetivo do
presente trabalho foi padronizar um protocolo de CTA em células em monocamada
(CTAm) ou não-aderidas (CTAn) para detecção das toxinas A/B em fezes. Pool de
fezes inoculadas com as toxinas A/B foram submetidas a variadas concentrações de
células VERO e de antitoxinas de C. sordellii, sendo ambos os métodos padronizados
com 8x103 células por poço e 0,1UI de antitoxina por poço. Após a padronização,
amostras sabidamente positivas foram submetidas a CTAm e CTAn e títulos idênticos
foram obtidos em ambos os métodos. Os protocolos padronizados de CTAm e CTAn
mostraram-se eficientes para detecção das toxinas A/B em amostras de fezes, tornando-
se uma opção para o diagnóstico das infecções por C. difficile em seres humanos e
animais.

Palavras-chave: diarreia, soroneutralização celular.

INTRODUÇÃO doença na rotina laboratorial (Silva et

Clostridium difficile é um bastonete
Gram-positivo, anaeróbio obrigatório
comumente encontrado no intestino de
mamíferos. Hoje, C. difficile é o
principal causador de colite
pseudomembranosa em seres humanos,
ocorrendo cerca de três milhões de
casos anualmente nos EUA, implicando
em um custo de 1,1 bilhão de dólares no
tratamento (Gellad et al., 2007).
Em medicina veterinária, C. difficile é
um importante agente causador de
diarreia em potros e equinos adultos
(Båverud et al., 1998). Em suínos a
infecção por este agente é hoje a
principal causa não-controlada de
diarreia neonatal nos EUA e Europa
(Songer e Anderson, 2006). No Brasil,
estudos recentes comprovaram a
ocorrência da doença em suínos e
equinos, demonstrando a necessidade de
implementação do diagnóstico da
al., 2011; Silva et al., 2012)
O diagnóstico da infecção causada por
C. difficile é baseada na detecção das
toxinas diretamente nas fezes por
ensaios imunoenzimáticos (ELISA) ou
pela detecção do efeito citotóxico
causado pelas toxinas A/B em cultura
de células, método conhecido como
citotoxicidade celular (CTA) (Ciesla e
Bobak, 1998). A CTA tem como
principal vantagem a alta sensibilidade
e específicidade, sendo por isso
considerado o “padrão-ouro” (Doern et
al., 1992). Existem diversos protocolos
de CTA, com variações na linhagem
celular, concentração total de células
utilizadas, tempo de incubação e
diluição dos espécimes clínicos. A
grande maioria dos protocolos de CTA
utilizam a inoculação de diluições do
filtrado fecal na monocamada celular
(CTAm), enquanto para outros agentes
clostridiais comumente a inoculação

35
ocorre diretamente nas células em
suspensão, não aderidas (CTAn)
(Schleupner et al., 1995; Delmée, 2001;
van der Berg et al., 2005; Salvarani et
al., 2010). Como vantagem, a CTAm
permite a armazenagem de placas já
com a monocamada, aumentando a
velocidade do processamento quando da
chegada de amostras. Porém, o
consumo de reagentes e de materiais é
maior, elevando o custo do diagnóstico.
Já a CTAn, possui um custo um pouco
mais baixo e um protocolo mais
simples, sendo mais adequado para uma
rotina laboratorial onde poucas amostras
são processadas por semana.
Por outro lado, independente do
protocolo de CTA utilizado, o resultado
é relativamente demorado (24 a 48
horas) e a técnica exige manutenção de
linhagens celulares (Delmeé, 2001; Post
et al., 2002). Já o ELISA, método mais
comumente empregado para o Heart
diagnóstico em seres humanos e
animais, permite um processamento de
várias amostras simultaneamente e o
resultado é dado em poucas horas
(Delmée, 2001). Todos os kits de
ELISA disponíveis no mercado
brasileiro foram padronizados para
utilização a partir de fezes humanas,
sendo necessários estudos para
avaliação da sensibilidade e Pellicon3 com membrana de retenção de
especificidade para o diagnóstico a
partir de espécimes clínicos de animais.
Até o presente momento, nenhum dos
kits disponíveis no mercado brasileiro
foi avaliado com fezes de animais
domésticos, permanecendo a dúvida
com relação à adequação desses
produtos para utilização no diagnóstico
das infecções por C. difficile nestas
espécies.
O presente estudo tem como objetivo
padronizar uma soroneutralização
celular para detecção das toxinas A e B
de C. difficile, disponibilizando-a para o
diagnóstico em diversas espécies e para
futuras avaliações do desempenho de
kits comerciais de ELISA.
MATERIAL E MÉTODOS
Produção das toxinas A/B
Para a produção do sobrenadante
contendo as toxinas A/B, foi utilizado
um biorreator de bancada1 com volume
da dorna de 7,5L. O biorreator é
provido de uma turbina do tipo pitched-
blade, com controle programável de
velocidade de agitação, mantida a 200
rpm, temperatura, mantida a 37°C e pH,
mantido a 7,0. Para estabelecimento de
um ambiente de anaerobiose,
borbulhou-se gás nitrogênio durante 30
minutos antes do início da fermentação.
Para produção do inóculo e para
fermentação bacteriana (produção das
toxinas A/B), utilizou-se meio Brain
Infusion (BHI)2. Após
crescimento por 24 horas, o inóculo foi
transferido na proporção de 10% (v/v)
para o meio BHI no biorreator e a
fermentação foi realizada de acordo
com Popoff (1987). Após crescimento,
os cinco litros da cultura foram
centrifugados a 10.000 x g por 40
minutos e o sobrenadante concentrado
50 vezes por ultrafiltração em sistema
100 KDa, até obtenção de um volume
final de aproximadamente 10 mL. A
toxina concentrada foi submetida a um
ELISA4 nas diluições 1:10, 1:100 e
1:200 para confirmação da presença das
toxinas A/B.
A dosagem protéica do concentrado
contendo as toxinas A/B foi realizada
por dois métodos: em equipamento
1
BioFlo 110 - New Brunscwick Scientifc CO.,
Inglaterra.
2
Difco Laboratories, EUA.
3
Millipore CO., EUA.
4
C. difficile Tox A/B II - Techlab Inc, EUA
36
Nanovue5 com leitura a 280nm e
utilizando volume de 5 µl da toxina e
pelo método de Bradford6 com leitura
em espectofotômetro7 a 595nm.
Inoculação das toxinas A/B em
amostras de fezes
Foram coletadas amostras de dez leitões
com sete dias de vida e de fezes de
quatro equinos adultos e um potro de
cinco meses de idade. Todos os animais
encontravam-se aparentemente
saudáveis e os equinos não possuiam
histórico de desordens gastrointestinais
nos últimos dois meses. As amostras
foram negativas para as toxinas A/B por
ELISA e para o isolamento de C.
difficile. Para formação do pool de
suínos (pool 1) e de equinos (pool 2),
quantidades iguais de fezes dos animais
foram misturadas e homogeneizadas.
Para o pool 1, adicionou-se dois gramas
de fezes de cada suíno, enquanto que
para o pool 2, adicionou-se 4 gramas de
fezes de cada equino, totalizando 20
gramas para cada. Metade do volume de
ambos os pools foram separados para
utilização como controle negativo,
sendo aliquotados em microtubos e
armazenados a -20°C. A outra metade
foi utilizada para inoculação das toxinas
A/B. Os pools para controle positivo
foram inoculados com 5 ml da cultura
contendo as toxinas A/B,
homogeneizados, aliquotados em
microtubos e armazenados a -20°C.
Para extração das toxinas, as fezes
foram diluídas na proporção de 1:5 com
salina tamponada e, após centrifugação
a 3000 x g por 20 minutos a 4°C, o
sobrenadante foi filtrado em membrana
de 0,22µm (Delmée, 2001).
5
General Eletric Company, EUA
6 8
Proteoquant, Proteobras, Brasil
7 9
Modelo E225-D, CELM, Brasil
Padronização da citotoxicidade
celular em monocamada (CTAm) e
em células não aderidas (CTAn)
Foi utilizada a linhagem celular VERO
(ATCC CCL-81) cultivada no meio
essencial mínimo (MEM)8,
suplementado com 5% (v/v) de soro
fetal bovino (SFB)8, penicilina
(40.000UI/mL) e estreptomicina
(20.000UI/mL) (Salvarani et al., 2010).
A linhagem celular foi cultivada em até
a confluência mínima de 90%, em
estufa úmida com atmosfera controlada
de 5% CO2 a 37°C. Para ambos os
métodos, foram avaliadas as seguintes
concentrações celulares: 1,0x103,
4,0x10 , 8,0x10 , 1,0x10 , 1,5x104,
3 3 4
2,0x104, 3,0x104 , 4,0x104, células por
poço. Os anticorpos anti-toxinas de
Clostidium sordellii9 foram testados nas
seguintes concentrações: 0,01; 0,02;
0,04; 0,08; 0,1; 0,2; 0,3 UI por poço.
Para o teste CTAn, baseado em
Salvarani et al. (2010), uma placa de 96
poços recebeu 100µl de sobrenadante
fecal filtrado nos quatro primeiros
poços e o restante recebeu 50µl de
MEM. Procedeu-se a diluição seriada
do material na base 2. Ao final,
adicionou-se 50µl de MEM nas duas
primeiras colunas e 50µl de MEM com
antitoxina de C. sordellii nas duas
colunas restantes. Após 60 minutos a
37°C, adicionou-se 50µl de cultivo
contendo a quantidade celular adequada
por poço. As placas foram incubadas a
37°C em estufa úmida com 5% de CO2
por 24 horas.
Para o teste CTAm, baseado em van der
Berg et al. (2005), uma placa de 96
poços recebeu, nos quatro primeiros
poços, 100µl de cultivo contendo a
quantidade celular adequada por poço.
Após incubação overnight para
estabelecimento da monocamada, o
MEM - Gibco laboratories, EUA
NIBSC, Inglaterra
37
meio de cultivo foi retirado e adicinou-
se 50 µl de MEM. Em outra placa de 96
poços, realizou-se a diluição seriada na
base 2 do sobrenadante fecal filtrado.
Ao final, adicionou-se 50µl de MEM
nas duas primeiras colunas e 50µl de
MEM com antitoxina de C. sordellii nas
duas colunas restantes. Após incubação
a 37°C por 60 minutos, o conteúdo foi
transferido para a placa contendo a
monocamada celular e incubado a 37°C
em estufa úmida com 5% de CO2 por 24
horas.
O título, adaptado do relato de
Schleupner et al. (1995) e expressado
em efeito citotóxico por mililitro
(EC/ml), foi considerado como a maior
diluição onde houve 90% ou mais de
arredondamento celular, seguido de, no
mínimo, 90% de neutralização desse
efeito na mesma diluição onde houve
adição de antitoxina
Avaliação da CTAm e CTAn em
amostras positivas
Para avaliação do protocolo
padronizado de CTAn e CTAm,
amostras sabidamente positivas para as
toxinas A/B foram submetidas a
extração e simultaneamente a CTAn e
CTAm. Foram utilizadas oito amostras
positivas no ELISA10, sendo duas de
seres humanos, quatro de leitões e duas
de potros naturalmente infectados.
Além dessas, foram incluídas quatro
amostras de hamsters sírios
(Mesocricetus auratus)
experimentalmente infectados por C.
difficile, como preconizado por Sambol
et al. (2002).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A toxina concentrada apresentou
resultados positivos nas três
concentrações testadas no ELISA,
10
C. difficile ToxA/B, Techlab, EUA
confirmando a presença das toxinas
A/B. A dosagem protéica do
concentrado foi de 30,2 e 25,6 µg/ml
pela leitura em equipamento Nanovue
(General Eletric Company, EUA) com
leitura a 280nm e pelo método de
Bradfor, respectivamente.
Na padronização da concentração
celular, a sensibilidade foi idêntica para
as concentrações de 1x103 a 4x104
células por poço, porém concentrações
menores que 8x103 células por poço
dificultavam a visualização do
arredondamento celular, aumentando a
chance de erro na interpretação do
resultado. Com isso, a concentração
escolhida foi a de 8x103 células por
poço, menor quantidade de células que
permitia uma fácil leitura e apresentava
a maior sensibilidade no teste.
Diversas linhagens celulares são
relatadas para o diagnóstico de infecção
por C. difficile por CTA. Em geral, as
linhagens Chinese Ovary Hamster,
HeLa e VERO tem sido as mais
utilizadas. No presente estudo optou-se
pela VERO por ser sabidamente a
linhagem mais sensível às toxinas A/B
(Delmée et al., 2001; van der Berg et
al., 2005). Além da linhagem celular, a
concentração de células por poço
também é um parâmetro extremamente
varíavel entre autores e trabalhos. A
concentração celular foi padronizada
pela observação da sensibilidade da
linhagem frente a amostras de fezes
inoculadas com as toxina A/B
produzidas in vitro e com amostras de
infecção natural em várias espécies. É
interessante observar que houve pouca
variação dentro de um intervalo
considerável de concentração celular,
uma vez que a linhagem Vero
apresentou a mesma sensibilidade
quando utilizou-se 1x103 até 4x104
células por poço. Dessa forma, mesmo
com uma concentração celular 40 vezes
maior, o efeito de arredondamento
38
celular observado foi o mesmo após
incubação a 24 ou 48 horas,
confirmando a alta sensibilidade da
linhagem celular as toxinas A/B de C.
difficile.
Em concentrações de 0,01 a 0,08 UI por
poço, alguns espécimes clínicos
apresentaram neutralização do efeito
citotóxico menor que 90% na última
diluição de leitura. A partir de 0,1
UI/por poço, todas as amostras
trabalhadas apresentaram ponto de corte
onde foi possível observar 90% ou mais
de arredondamento celular e, na mesma
diluição, 90% ou mais de proteção
quando da adição de antitoxina anti-C.
sordellii. A grande maioria dos
trabalhos não descrevem a quantidade
de anticorpo utilizada, dificultando
comparações. Alguns autores utilizam
anticorpos comerciais para diagnóstico
de C. difficile, informando apenas o
volume utilizado (Van der Berg et al.,
2005) enquanto em outros trabalhos os
autores apenas relatam a utilização de
antitoxina de C. sordellii ou C. difficile
produzida in house (Schleupner et al.,
1995; Delmée, 2001; Keessen et al.,
2011).
Outro ponto que chama atenção é a
grande variação de parâmetros
utilizados para a determinação de
positividade das amostras. Em alguns
relatos, a quantidade de arredondamento
e de proteção varia entre 10, 30 e 50%,
enquanto alguns autores citam até
mesmo que qualquer diferença de
proteção é considerada positividade
(Schleupner et al., 1995; Delmée, 2001;
Van den Berg et al., 2005; Keessen et
al., 2011). No presente estudo, o ponto
de corte foi padronizado como a
diluição onde correu arredondamento
maior que 90% seguido de proteção
também maior que 90%, o que na visão
do autor diminui a subjetividade do
diagnóstico e, consequentemente, a
possibilidade de resultados falso-
positivos.
A tabela 1 resume os resultados de
títulos encontrados na CTAn e CTAm
para os controles e para as amostras
sabidamente positivas.

Tabela 1: Resultado de títulos obtidos, em efeito citotóxico por mililitro (EC/ml), no ensaio de
citotoxicidade celular em monocamada (CTAm) e em células não-aderidas (CTAn) para
amostras de fezes de seres humanos, leitões, hamsters e equinos sabidamente positivas para as
toxinas A/B de Clostridium difficile.

Título (EC/ml) x 103

Amostra Espécie
CTAm CTAn
S1 20,5 20,5
S2 5,1 5,1
Suínos
S3 20,5 20,5
S4 1,3 1,3
HAM1 20,5 20,5
HAM2 >81,9 >81,9
Hamsters1
HAM3 >81,9 >81,9
HAM4 >81,9 >81,9
PO1 10,2 10,2
Potros
PO2 10,2 10,2
H1 5,1 5,1
Seres humanos
H2 1,3 1,3
Pool 1 Suínos2 20,5 20,5
Pool 2 Equinos2 20,5 20,5
Controle Negativo 1 Suínos Negativo Negativo
Controle Negativo 2 Equinos Negavito Negativo
1
amostras de animais com infecção por C. difficile induzida experimentalmente. 2Amostras de fezes
inoculadas com toxinas A/B produzidas in vitro.

39
O título (EC/ml) foi o mesmo em todas
as amostras testadas, sugerindo que
ambos os protocolos são adequados
para a detecção das toxinas A/B em
amostras de fezes. Não houve diferença
de resultados na leitura com 24 ou 48
horas.
A grande maioria dos trabalhos para
detecção das toxinas A/B relata a
utilização da CTAm (Delmée et al
2001; van der Berg et al., 2005),
protocolo mais demorado e mais
complexo quando comparado com a
CTAn. O presente estudo sugere ambos
protocolos como aceitáveis para
detecção das toxinas A/B e, de forma
semelhante ao relatado por Keessen et
REFERÊNCIAS
ANDERSON, M.A; SONGER, J.G.
Evaluation of two enzyme
immunoassays for detection of
Clostridium difficile toxins A and B in
swine. Vet Microbiol, v.128, p.204-6,
2008.
BÅVERUD, V.; FRANKLIN, A.;
GUNNARSSON, A. et al. Clostridium
difficile associated with acute colitis in
mares when their foals are treated with
erythromycin and rifampicin for
Rhodococcus equi pneumonia. Equine
Vet J, v.30, n.6, p.482-8, 1998.
CIESLA, W.P.Jr; BOBAK, D.A.
Clostridium difficile toxins A and B are
cation-dependent UDP-glucose
hydrolases with differing catalytic
activities. J Biol Chem., v.273, n.26,
p.16021-16026, 1998.
DELMÉE, M. Laboratory diagnosis of
Clostridium difficile disease. Clin
Microbiol Infect., v.7, n.8, p.411-416,
2001.
DOERN, G.V.; COUGHLIN, R.T.;
WU, L. Laboratory diagnosis of
al. (2011), os resultados encontrados
indicam que a leitura pode ser realizada
com apenas 24 horas.
A CTA padronizada torna-se uma opção
para o diagnóstico das infecções por C.
difficile em seres humanos e animais
domésticos. Além disso, a técnica será
útil para avaliações do desempenho de
kits comerciais de ELISA.
AGRADECIMENTOS
CNPq, Fapemig, CAPES, PRPq-UFMG
e INCT. Agradecimentos á Profa Zélia
Inês P. Lobato pelo auxílio na
padronização do teste.
Clostridium difficile-associated
gastrointestinal disease: comparison of a
monoclonal antibody enzyme
immunoassay for toxins A and B with a
monoclonal antibody enzyme
immunoassay for toxin A only and two
cytotoxicity assays. J Clin
Microbiol., v.30, n.8, p.2042-6, 1992.
GELLAD, Z.F.; JOHNSON, J.L.;
MUIR, A.J. et al. Severity of
Clostridium difficile-associated diarrhea
in solid organ transplant patients.
Transpl Infect Dis., v.9, n.4, p.276-280,
2007.
KEESSEN, E.C.; HOPMAN, N.E.;
VAN LEENGOED, L.A. et al.
Evaluation of four different diagnostic
tests to detect Clostridium difficile in
piglets. J Clin Microbiol., v. 49, n.5,
p.1816-21, 2011.
POPOFF, M. R. Purification and
characterization of Clostridium sordellii
lethal toxin and cross-reactivity with
Clostridium difficile cytotoxin. Infect
Immun, v.55, n.1, p.35-43, 1987
POST, K.W.; JOST, B.H.; SONGER,
J.G. et al. Evaluation of a test for
40
Clostridium difficile toxins A and B for
the diagnosis of neonatal swine
enteritis. J Vet Diagn Invest., v.14, n.3,
p.258-259, 2002.
SALVARANI, F.M.; LOBATO, Z.I.P.;
ASSIS, R.A. et al. In vitro evaluation of
Clostridium septicum alpha toxoid. Arq
Bras Med Vet Zootec, v.62, n.4, p.778-
783, 2010.
SAMBOL, S.P.; MERRIGAN, M.M.;
TANG, J.K. et al. Colonization for the
prevention of Clostridium difficile
disease in hamsters. J Infect Dis, v.186,
n.12, p.1781-9, 2002.
SCHLEUPNER, M.A.; GARNER,
D.C.; SOSNOWSKI, K.M. et al.
Concurrence of Clostridium difficile
toxin A enzyme-linked immunosorbent
assay, fecal lactoferrin assay, and
clinical criteria with C. difficile
cytotoxin titer in two patient cohorts. J
Clinl Microbiol, v.33, p.1755-1759,
1995.
SILVA, R.O.S.; MOREIRA, F.M.;
REZENDE, J.V. et al. First confirmed
case of Clostridium difficile-associated
diarrhea in foals in Brazil. Ciência
Rural, v.42, n.3, p. 498-500, 2012.
SILVA, R.O.S.; SALVARANI, F.M.;
CRUZ JUNIOR, E.C.C. et al. Detection
of toxins A/B and isolation of
Clostridium difficile from piglets in
Brazil. Ciência Rural, v.41 n.8 p.1130-
1135, 2011.
VAN DEN BERG, R.J.;
BRUIJNESTEIJN VAN
COPPENRAET, L.S.; GERRITSEN,
H.J. et al. Prospective multicenter
evaluation of a new immunoassay and
real-time PCR for rapid diagnosis of
Clostridium difficile-associated diarrhea
in hospitalized patients. J Clin
Microbiol, v.43, p.5338-40, 2005.
41
4.2 Avaliação de kits comerciais de ELISA e da cultura toxigênica frente a
citotoxicidade celular para o diagnóstico de C. difficile em suínos e equinos.

RESUMO

Clostridium difficile é considerado uma das principais causas de diarreia em leitões e

potros. Apesar da crescente importância de C. difficile como enteropatógeno nestas
espécies, não existe consenso com relação ao diagnóstico laboratorial das infecções por
este agente em animais domésticos e o desempenho da maioria dos testes
comercialmente disponíveis é ainda desconhecido. O objetivo do presente trabalho foi
comparar o desempenho de três testes de ELISA e da cultura toxigênica frente a
citotoxicidade celular como “padrão ouro” para o diagnóstico da infecção por C.
difficile em leitões e potros. Com relação as amostras de leitões, todos os ELISAs
testados e a cultura toxigênica apresentaram baixa sensibilidade (entre 50 e 60%),
enquanto a especificidade variou entre 82 e 98%. Já para amostras de potros, os ELISAs
apresentaram 100% de sensibilidade e especificidade acima de 95%, enquanto que a
cultura toxigência apresentou 43% e 99% de sensibilidade e especificidade,
respectivamente. Esses resultados sugerem que os ELISAs e o protocolo de cultura
testados são de baixa sensibilidade para o diagnóstico da infecção por C. difficile em
leitões, se considerado o animal de forma individual. Já para potros, os kits de ELISA
parecem se uma boa opção diagnóstica devido a alta sensibilidade e especificadade
encontrados.

Palavras-chave: colite, enterite, zoonose.

INTRODUÇÃO comerciais são os testes mais

C. difficile é hoje considerado como a
principal causa não controlada de
diarreia neonatal em suínos (Songer e
Anderson, 2006) e um dos principais
causadores de diarreia em potros
(Båverud, 2002). Além disso, estudos
recentes demonstraram que estirpes
isoladas de seres humanos, com
infecção por C. difficile (ICD), têm uma
alta semelhança genética com as
estirpes isoladas de origem animal
(Jhung et al., 2008; Norman et al.,
2011), levantando a hipótese de uma
zoonose.
Para a maioria dos autores, o "padrão
ouro" para o diagnóstico da ICD é o
ensaio de citotoxicidade celular (CTA).
Porém trata-se de uma técnica
demorada, trabalhosa e que exige
pessoal treinado. Dessa forma,
imunoensaios enzimáticos (ELISA)
comumente utilizados para o
diagnóstico de ICD em seres humanos e
animais (Medina-Torrez et al., 2010;
René et al., 2012). Recentemente, a
cultura toxigênica também foi descrita
como uma técnica sensível para os seres
humanos (Peterson et al., 2010), mas
pouco se sabe da sua aplicação para as
amostras de fezes de animais
domésticos.
Apesar da importância da C. difficile
como enteropatógeno de leitões e potros
e até mesmo como um agente potencial
zoonótico, inexistem padrões para o
diagnóstico de infecção por este agente
e o desempenho da maioria dos métodos
de detecção disponíveis comercialmente
são desconhecidos (Keessen et al.,
2011). À luz disto, o objetivo do
presente estudo foi comparar os
desempenhos de três ELISA e da
cultura toxigênica frente a

42
citotoxicidade celular como o “padrão
ouro” para o diagnóstico da infecção
por C. difficile em leitões e potros.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras
As amostras de fezes de suínos
incluídas neste estudo foram de animais
com idade entre um a sete dias de vida,
encaminhados à Escola de Veterinária
da Universidade Federal de Minas
Gerais (UFMG) para diagnóstico
etiológico de diarreia neonatal. Foram
obtidas 73 amostras, 62 de animais
diarréicos e 11 de animais não-
diarréicos, de 32 granjas diferentes e
localizadas nos estados de Minas
Gerais, Santa Catarina, Rio Grande do
Sul, Mato Grosso do Sul e São Paulo.
De potros, um total de 106 amostras, de
animais com idade variando entre um
dia e seis meses, foram coletadas em
haras e de animais apresentados ao
Hospital Veterinário da UFMG (HV).
Em haras, foram coletadas 98 amostras
de fezes de 15 diferentes propriedades,
sendo 53 amostras de animais diarréicos
e 38 de animais não diarréicos
(aparentemente saudáveis). Já no HV
foram coletadas 15 amostras de potros
diarréicos no momento da internação.
Todos os espécimes clínicos de suínos e
equinos foram recolhidos em recipientes
estéreis e mantidos a -20 °C até a
execução dos testes, por um período
máximo de até sete dias.
Ensaios imunoenzimáticos (ELISA),
Citotoxicidade celular (CTA) e
Cultura toxigênica (CT)
Os ensaios de CTA para a detecção das
toxinas A/B de C. difficile foram
realizados com células Vero (VERO-
ATCC CCL 81) como descrito
anteriormente no item 4.1 deste
trabalho. Para o isolamento, as amostras
de fezes foram submetidas a um choque
com álcool absoluto (Avbersek et al.,
2009) e alíquotas de 50 µl foram
inoculadas em placas contendo agar
cicloserina-cefoxitina-frutose11
suplementada com 7% de sangue
equino e 0,1% de sódio taurocolate12.
Após a incubação em ambiente de
anaerobiose, em jarras com mistura
gasosa (10% H2, 10% CO2, 80% N2) a
37 °C por 72 horas, todas as colônias
com morfologia sugestiva e coloração
de Gram característica foram
submetidas a uma PCR para
confirmação da identidade pela
detecção do gene (tpi) e tipificação pela
detecção dos genes das toxinas A
(tcdA), B (tcdB) e binária (cdtB) (Silva
et al., 2011). Todos os isolados
toxigênicos em PCR foram testados por
CTA para produção in vitro de toxina
como descrito anteriormente por
Medina-Torrez et al. (2010).
Três ELISAs comerciais para detecção
das toxinas A/B foram avaliados: C.
difficile Tox A/B II13, Remel Prospect
C. difficile Toxins A/B14 e Clostridium
difficile Ridascreen15. As reações foram
realizadas de acordo com as
recomendações dos fabricantes e a
sensibilidade, especificidade, valor
preditivo positivo (VPP) e valor
preditivo negativo (VPN) foram
calculados para cada ELISA e para a
TC, com seus respectivos intervalos de
confiança a 95% de probabilidade16 e
considerando o CTA como “padrão-
ouro” (Delmeé, 2001).
RESULTADOS
Para as amostras de suínos, as toxinas
A/B foram detectadas pelo CTA em 22
(30,1%) amostras (tabela 2). Todos os
11
Hi-media, Mumbai, Índia.
12
Sigma-Aldrich Co., EUA.
13
Techlab Inc., EUA
14
Oxoid, Inglaterra
15
R-Biopharm, Alemanha
16
STATA, College Station, Texas, EUA
43
kits de ELISA testados apresentaram
sensibilidade abaixo de 64% e
especificidade entre 80 e 98% (tabela
3). Estirpes de C. difficile foram
isoladas a partir de 10 (13,7%) leitões,
sendo nove estirpes classificadas como
toxigênicas por PCR. Todas as estirpes
toxigenicas por PCR foram capazes de
produzir toxina in vitro. Com isso, a TC
apresentou 40,9% de sensibilidade e
especificidade de 98%.

Tabela 2: Resultados obtidos nos três testes imunoenzimáticos (ELISAs), na cultura toxigênica
e no teste de citotoxicidade celular para o diagnóstico da infecção por Clostridium difficile em
potros e leitões
Amostras de Potros Amostras de Leitões
Método Positivos Negativos Positivos Negativos
V F V F V F V F
Citotoxicidade celular 9 - 97 - 22 - 51 -
Cultura Toxigênica 6 1 96 3 9 1 50 13
Ridascreen C. difficile toxins A/B (R-Biopharm) 9 4 93 0 12 6 45 10
C. difficile Tox A/B II (Techlab) 9 1 96 0 13 1 50 9
Remel ProSpecT C. difficile Toxin A/B (Oxoid) 9 4 93 0 14 10 41 8
Legenda: V – verdadeiro, F - Falso

Tabela 3: Comparação de três ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e cultura toxigênica frente a

soroneutralização como “padrão ouro” para o diagnóstico da infecção por Clostridium difficile
em leitões.
Amostras de leitões (n=73)
Método % (intervalo de confiança de 95%)
Sens Espec VPP VPN
40,9 98,0 90,9 79,7
Cultura toxigênica
(23,3-61,3) (89,7-99,7) (59,6-98,2) (67,8-87,5)
54,5 88,2 76,7 81,8
Ridascreen C. difficile toxins A/B (R-Biopharm)
(34,7-73,1) (76,7-94,4) (43,8-83,7) (69,7-89,8)
59,1 98,0 92,9 84,7
C. difficile Tox A/B II (Techlab)
(38,7-76,7) (89,7-99,6) (68,5-98,7) (73,5-91,8)
63,6 80,3 58,3 83,6
Remel ProSpecT C. difficile Toxin A/B (Oxoid)
(42,9-80,2) (67,5-88,9) (38,8-75,5) (70,9-91,5)
Legenda: Sens=Sensibilidade; Espec=Especificidade; VPP=valor preditivo positivo; VPN= valor
preditivo negativo.

As toxinas A/B foram detectadas em de C. difficile foram isoladas de sete

nove amostras de potros (8,5%), todos
de animais com diarreia. Os ELISAs
testados detectaram os oito animais
positivos (100% de sensibilidade),
enquanto a especificidade dos testes
ficou acima de 95% (tabela 4). Estirpes
potros (6,2%), sendo seis dessas
toxigências por PCR e por cultura
toxigênica. Frente a este resultado, a
cultura toxigênica apresentou
sensibilidade de 55% e espeficidade de
99% para amostras de fezes de potros.

44
Tabela 4: Comparação de três ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e cultura toxigênica frente a
soroneutralização como “padrão ouro” para o diagnóstico da infecção por Clostridium difficile
em potros.
Amostras de potros (n=106)
Método % (interval de confiança de 95%)
Sens Espec VPP VPN
Cultura toxigênica 50 99 85.7 94.3
(25.4-74.6) (94.6-99.8) (48.7-97.4) (88.1-97.4)
Ridascreen C. difficile toxins A/B (R-Biopharm) 100 99 92.3 99.9
(75-100) (94.6-99.8) (66.7-98.6) (96.1-100)
C. difficile Tox A/B II (Techlab) 100 97 80 99
(75-100) (91.5-99) (54.8-93) (96-100)
Remel ProSpecT C. difficile Toxin A/B (Oxoid) 100 97 80 99
(75-100) (91.5-99) (54.8-93) (96-100)
Legenda: Sens=Sensibilidade; Espec=Especificidade; VPP=valor preditivo positivo; VPN= valor
preditivo negativo.

DISCUSSÃO resultados encontrados por Medina-

Todos os ELISAs testados apresentaram
baixa sensibilidade para as amostras de
fezes de suínos. Desempenho
semelhante também foi relatado em
outros trabalhos anteriores com outros
kits comerciais (Anderson e Songer,
2008; Keessen et al., 2011). Alguns
autores atribuíram esta baixa
sensibilidade a uma possível presença
de inibidores nas fezes, mas até agora
não há nenhum trabalho que confirme
essa hipótese (Chouicha e Marks, 2006;
Keessen et al., 2011). Por outro lado,
semelhante ao relatado por Keessen et
al. (2011), resultados falsos-positivos
variaram entre os kits (dados não
mostrados), sugerindo que os resultados
incorretos foram devido ao teste, e não
devido a presença de alguma substância
nas amostras.
Também é interessante notar que uma
versão mais antiga do kit da marca
Techlab® foi previamente testada por
Post et al. (2002) para amostras de fezes
de suínos, sendo relatada uma
sensibilidade de 91% e especificidade
de 86%. No presente estudo, a nova
versão do teste Techlab® mostrou uma
sensibilidade mais baixa (55%), mas a
especificidade foi de 98%.
Já para amostras de potros, a alta
sensibilidade dos ELISAs corrobora os
Torrez et al. (2010), que testaram um kit
e encontraram sensibilidade de 84% e
espeficidade de 96%. Este resultado
sugere que os kits de ELISA podem ser
uma boa opção para o diagnóstico das
infecções por C. difficile nesta espécie.
É interessante salientar, ainda, que
nenhum animal não-diarréico foi
positivo para as toxinas A/B, como
relatado anteriormente (Weese et al.,
2001; Båverud et al., 2003). Embora
seja uma informação conhecida,
pesquisas recentes demonstraram que é
comum, por parte de clínicos e
patologistas, a solicitação da detecção
das toxinas A/B a partir de fezes potros
não diarreicos (Medina-Torrez et al.,
2010). A inclusão desses espécimes
clínicos pode levar a uma diminuição do
valor preditivo positivo se o teste não é
100% específico, principalmente em
uma baixa prevalência da doença. É
importante citar ainda que a maioria dos
laboratórios relatam o uso de
imunoensaios enzimáticos comerciais
(ELISAs) para detecção de toxinas em
amostras de fezes de eqüinos, um teste
mais rápido e econômico que a detecção
em cultura de células, mas comumente
de menor sensibilidade e especificidade
(Medina-Torrez et al., 2010).
A TC apresentou uma sensibilidade
baixa tanto para amostras de potros
quanto para amostras de suínos (50 e

45
40,9%, respectivamente), contrastando
com o relatos anteriores (Medina-Torrez
et al., 2010; Keessen et al., 2011).
Entretando, não há nenhum método
padrão para a cultura toxigênica de C.
difficile, tornando difícil comparar
resultados de TC com outros autores.
Uma grande variedade de meios e
também diferenças no protocolo de
isolamento são comuns, tais como a
utilização de choque com álcool e
variações no tempo de incubação. No
presente trabalho, optou-se por um
método de isolamento simples que seria
mais aplicável para o diagnóstico
quando comparado com metodos
anteriores (Medina-Torrez et al., 2010;
Sharp et al., 2010; Keessen et al., 2011).
Neste protocolo, as amostras foram
submetidas a um choque de álcool e
plaqueadas em ágar um TCCFA,
seguido por um tempo de incubação de
72 horas. Porém, sabe-se que algumas
estirpes de C. difficile podem não
crescer devido a susceptibilidade a um
ou a ambos antibióticos utilizados no
meio (Songer e Uzal, 2005). Além
disso, a utilização de CCFA, mesmo
com a suplementação de taurocolate,
pode ter uma sensibilidade variável para
recuperação de esporos de C. difficile
quando comparado com meios líquidos,
como por exemplo o TCCFB (caldo de
cefoxitina-cicloserina suplementado
com taurocolate) (Thitaran et al., 2011).
Todos esses fatores podem ter
contribuido para a baixa sensibilidade
encontrada no protocolo testado de TC.
Deve-se destacar ainda que a TC não
parece ser uma boa opção para o
diagnóstico em potros devido ao
elevado tempo para obtenção dos
resultados. No presente estudo, mesmo
com um método simplificado de cultura,
os resultados de TC levaram pelo menos
seis dias. Considerando que a infecção
por C. difficile apresenta um curso
agudo nessa espécie, a TC torna-se uma
opção pouco interessante para
diagnóstico em equinos.
Todos os isolados de C. difficile
toxigênicos por PCR foram capazes de
produzir toxinas in vitro. Estes
resultados sugerem uma boa correlação
entre a detecção dos genes
codificadores das toxinas A/B por PCR
e produção in vitro das toxinas A/B
pelas estirpes de C. difficile isoladas de
suínos e equinos. Sugere-se que, com a
detecção por PCR dos genes tcdA e
tcdB das estirpes isoladas, o teste de
produção de toxina in vitro não seja
necessário, o que economizaria tempo e
custo do diagnóstico. Entretanto,
estudos com um maior número de
estirpes são necessários para confirmar
essa hipótese.
No presente trabalho, estirpes
toxigênicas foram isoladas de dois
animais negativos para toxinas A/B: um
leitão diarréico e de um potro
aparentemente saudável com dois dias
de vida. Um estado de portador
assintomático deve ser considerado
neste caso. De forma semelhante ao
presente trabalho, Båverud (2002)
demonstraram que para potros com
idade inferior a 14 dias de vida, o estado
de portador assintomático é comum.
Outra possibilidade para explicar a
presença de uma estirpe toxigênica mas
sem a presença das toxinas A/B é a
degradação dessas proteínas por
proteases fecais. Para Chouicha e Marks
(2006), a presença de uma atividade de
protease em amostras de fezes animais
também poderia levar à degradação das
toxinas fazendo com que estas não
cheguem aos níveis mínimos de
detecção do teste, mas até agora não há
nenhum estudo confirmando esta
hipótese. Deve-se ressaltar porém que o
tempo entre coleta e processamento de
amostras no presente trabalho foi de no
máximo uma semana. Além disso,
trabalhos anteriores com amostras dos
suínos e equinos demonstrou que a
toxina permanece detectável por pelo
46
menos um mês quando armazenada a -
20 °C (Weese et al., 2000; Keessen et
al., 2011). Estes achados sugerem que a
não detecção das toxinas A/B pelos kits
de ELISAs no presente estudo não foi
devido ao tempo e forma de
armazenamento das amostras.
É também importante notar que não
existe um protocolo padrão para a CTA,
havendo diferenças na linhagens de
células, na concentração utilizada e
também na diluição inicial das amostras
de fezes. Todos esses parâmetros podem
influenciar diretamente na sensibilidade
do método. No presente trabalho optou-
se pela linhagem celular Vero,
considerada a mais sensível ás toxinas
A/B (Delmée, 2001), e por um
protocolo de CTA amplamente utilizado
com sucesso em outros estudos
similares (van den Berg et al., 2005;
Medina-Torrez et al., 2010 Keessen et
al., 2011).
Para potros, os kits de ELISA testados
apresentaram alta sensibilidade e
espeficidade, sugerindo que são
adequados para o diagnóstico de
infecção por C. difficile nesta espécie.
Já para leitões, tais testes não
apresentaram bom desempenho para
diagnóstico individual de leitões entre
zero e sete dias de vida. Para seres
humanos, resultados semelhantes foram
relatados e alguns estudos sugerem que
pelo menos um algorítmo de duas
etapas é necessário para um diagnóstico
REFERÊNCIAS
ANDERSON, M.A; SONGER, J.G.
Evaluation of two enzyme
immunoassays for detection of
Clostridium difficile toxins A and B in
swine. Vet Microbiol. v.128, p.204-6,
2008.
seguro de C. difficile (Peterson et al.,
2011). Porém, até o momento, não há
consenso sobre quais testes devem ser
usados em cada passo do diagnóstico. A
abordagem em duas fases também foi
relatada por Keessen et al. (2011) para
suínos. Os autores sugerem um PCR em
tempo real como o primeiro teste
seguido por TC como teste
confirmatório.
No presente trabalho um dos ELISAs
mostrou uma especificidade de 98%
para as amostras de leitões, permitindo
que um grande grau de confiança nos
resultados positivos, com uma VPP de
92% e um VPN de 85%. À luz desses
resultados, sugere-se que esse teste
poderia ser útil para pesquisar a
presença da doença em um rebanho de
suínos quando múltiplas amostras são
colhidas. De acordo com Cameron e
Baldock (1998) e considerando a
prevalência encontrada
(aproximadamente 30%), seriam
necessárias 20 e 30 amostras para
confirmar, com 95% de certeza, a
ausência da doença em um plantel de
até 600 matrizes e >600 matrizes,
respectivamente.
APROVAÇÃO EM COMITÊ DE
ÉTICA
Protocolo 102/10 CEUA-UFMG
(amostras de leitões) e 150/2010
CETEA-UNESP (amostras de potros).
AVBERSEK, J.; JANEZIC, S.; PATE,
M. et al. Diversity of Clostridium
difficile in pigs and other animals in
Slovenia. Anaerobe, v.15, n.6, p.252-5,
2009.
BÅVERUD, V. Clostridium difficile
infections in animals with special
reference to the horse: a review. Vet Q
Journal, v.24, n.4, p.203-219, 2002.
47
BÅVERUD, V.; GUSTAFSSON, A.;
FRANKLIN, A. et al.
Clostridium difficile: prevalence in
horses and environment, and
antimicrobial susceptibility. Equine Vet
J, v.35, n.5, p.465-71, 2003.
CAMERON, A.R.; BALDOCK, F.C. A
new probability formula for surveys to
substantiate freedom from disease.
Prev. Vet. Med, v.34, p.1-17, 1998.
CHOUICHA, N; MARKS, S.L.
Evaluation of five enzyme
immunoassays compared with the
cytotoxicity assay for diagnosis of
Clostridium difficile-associated diarrhea
in dogs. J Vet Diagn Investig., v.18,
n.182-188, 2006.
DELMÉE, M. Laboratory diagnosis of
Clostridium difficile disease. Clinic
Microbiol Infect, v.7, n.8, p.411-416,
2001.
JHUNG, M.A.; THOMPSON, A.D.;
KILLGORE, G.E. et al. Toxinotype V
Clostridium difficile in humans and
food animals. Emerg Infect Dis., v.14,
n.7, p.1039-45, 2008.
KEESSEN, E.C.; HOPMAN, N.E.;
VAN LEENGOED, L.A. et al.
Evaluation of four different diagnostic
tests to detect Clostridium difficile in
piglets. J Clin Microbiol., v. 49, n.5,
p.1816-21, 2011.
MEDINA-TORRES, C.E.; WEESE,
J.S.; STAEMPFLI, H.R. et al.
Validation of a commercial enzyme
immunoassay for detection of
Clostridium difficile toxins in feces of
horses with acute diarrhea. J Vet Intern
Med, v.24, n.3, p.628-32, 2010.
NORMAN, K.N.; SCOTT, H.M.;
HARVEY, R.B. et al. Prevalence and
genotypic characteristics of
Clostridium difficile in a closed and
integrated human and swine population.
App Environm Microbiol., v.77, n.16,
p.5755-60, 2011.
PETERSON, L.R.; MEHTA, M.S.;
PATEL, P.A. et al. Laboratory testing
for Clostridium difficile infection: light
at the end of the tunnel. Am J Clin
Pathol, v.136, n.3, p.372-80, 2011.
POST, K.W.; JOST, B.H.; SONGER,
J.G. et al. Evaluation of a test for
Clostridium difficile toxins A and B for
the diagnosis of neonatal swine
enteritis. J Vet Diagn Invest., v.14, n.3,
p.258-259, 2002.
RENÉ, P.; FRENETTE, C.P.;
SCHILLER, I. et al. Comparison of
eight commercial enzyme
immunoassays for the detection of
Clostridium difficile from stool samples
and effect of strain type. Diagn
Microbiol Infect Dis, v.73, n.1, p.94-6,
2012.
SHARP, S.E.; RUDEN, L.O.; POHL,
J.C. et al. Evaluation of the C.Diff Quik
Chek Complete Assay, a new glutamate
dehydrogenase and A/B toxin
combination lateral flow assay for use
in rapid, simple diagnosis of
Clostridium difficile disease. J Clin
Microbiol, v.48, n.6, p.2082-6, 2010.
SILVA, R.O.S.; D'ELIA, M.L.;
SOUZA, D.F.M. et al. Clostridium
difficile-associated diarrhea in an ocelot
(Leopardus pardalis). Anaerobe, v.20,
p.82-4. 2013a
SILVA, R.O.S.; RIBEIRO, M.G.;
PALHARES, M.S. et al. Detection of
A/B toxin and isolation of Clostridium
difficile and Clostridium perfringens
from foals. Eq Vet J, 2013b.
SILVA, R.O.S.; SALVARANI, F.M.;
CRUZ JUNIOR, E.C.C. et al. Detection
of toxins A/B and isolation of
48
Clostridium difficile from piglets in prevalence. J Food Prot, v.74, p.130-3,
Brazil. Ciência Rural, v.41 n.8 p.1130- 2011.
1135, 2011.
WEESE, J.S.; STAEMPFLI, H.R.;
SONGER, J.G; UZAL, F.A. Clostridial PRESCOTT, J.F. Survival of
enteric infections in pigs. J Vet Clostridium difficile and its toxins in
Diagnostic Invest, v.17, n.6, p.528-536, equine feces: implications for diagnostic
2005. test selection and interpretation. J Vet
Diagn Invest, v. 12, n.4, p.332-6, 2000.
SONGER, J.G.; ANDERSON, M.A.
Clostridium difficile: an important WEESE, J.S; STAEMPFLI, H.R;
pathogen of food animals. PRESCOTT, J.F. et al. A prospective
Anaerobe, v.12, n.1, p.1-4, 2006. study of the roles of Clostridium
difficile and enterotoxigenic
THITARAM, S.N.; FRANK, J.F.; Clostridium perfringens in equine
LYON, S.A. et al. diarrhoea. Equine Vet J, v.33, n.4,
Clostridium difficile from healthy food p.403-9, 2001.
animals: optimized isolation and

49
4.3 Avaliação de kits comerciais de ELISA para o diagnóstico de infecção por
Clostridium difficile em pacientes internados no Hospital das Clínicas da UFMG.

RESUMO

O objetivo do presente trabalho foi comparar o desempenho de três testes comerciais de

ELISA frente a citotoxicidade celular (CTA) e a cultura toxigênica (TC) para o
diagnóstico de pacientes internados no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de
Minas Gerais (HCUFMG) com suspeita de infecção por C. difficile (ICD). Foram
coletadas 92 amostras de fezes. Dessas, 29 (34,5%) foram positivas por CTA ou TC,
ambos considerados “padrão ouro” para o diagnóstico de ICD. Os kits de ELISAs
testados apresentaram sensibilidade entre 52,4% e 60,9%, enquanto que a especificidade
foi superior a 90%. O presente estudo reforça a necessidade de mais estudos focando na
padronização de novos métodos de diagnóstico de ICD em humanos.

Palavras-chave: nosocomial, colite pseudomembranosa.

INTRODUÇÃO pesquisadores o método “ouro” para

Clostridium difficile foi isolado pela
primeira vez em 1935, mas somente no
final da década de 70 foi reconhecido
como um patógeno para seres humanos.
Hoje, a infecção pelo C. difficile (ICD)
passou a ser reconhecida como a
principal causa bacteriana de diarreia
associada a antibioticoterapia
prolongada e como patógeno
nosocomial de grande importância
(Samie et al., 2008). Nos Estados
Unidos da América, ocorrem cerca de
três milhões de casos anualmente, com
aumento da mortalidade e da resistência
do microrganismo ao tratamento
antimicrobiano convencional,
representando um custo de 1,1 bilhões
de dólares anualmente (Oldfield, 2004;
Kelly e Lamont, 2008). Além disso, tem
sido relatado o surgimento de estirpes
altamente virulentas de C. difficile em
diversos países (Balassiano et al., 2012)
e de casos em pacientes não internados
e sem histórico de antibioticoterapia,
demonstrando a necessidade de mais
estudos relacionados ao diagnóstico e
controle desse patógeno.
Atualmente a detecção das toxinas A/B
nas fezes é considerada por muitos
diagnóstico de ICD, sendo a
citotoxicidade celular (CTA)
reconhecida como a técnica mais
sensível. Recentemente, alguns autores
têm sugerido a cultura toxigênica (TC)
como um método mais sensível e,
portanto, como possível substituto da
CTA como “método ouro”, entretanto,
ambas as técnicas são demoradas,
trabalhosas e exigem pessoal treinado.
Dessa forma, os imunoensaios
enzimáticos (ELISA) comerciais são,
até o momento, os testes mais utilizados
para o diagnóstico de ICD em seres
humanos (René et al., 2012).
Outra opção que têm sido citada como
possível método de diagnóstico são os
kits comerciais de PCR em tempo real,
também conhecidos como testes de
amplificação de ácidos nucléicos
(NAAT- Nucleic acid amplification
tests). Estudos investigando tais testes
relatam uma alta sensibilidade para
detecção de C. difficile em amostras de
fezes, sugerindo que tais testes podem
ser úteis para a triagem de pacientes
com suspeita de ICD (Viala et al., 2012;
Silva Junior, 2012; Humphries, 2012).
Porém, até o momento, o maior entrave
para a utilização de NAAT para o

50
diagnóstico de ICD é o alto custo, em
média mais caro que os testes de ELISA
comerciais (Humphries, 2012).
Apesar da crescente importância de C.
difficile como patógeno nosocomial, no
Brasil são raros estudos sobre CDI e, até
o momento, não foram encontrados
estudos avaliando os testes de
diagnóstico presentes no mercado
brasileiro Dessa forma, o objetivo do
presente estudo foi comparar os
desempenhos de três ELISA comerciais
e um NAAT frente a citotoxicidade
celular e cultura toxigênica para o
diagnóstico da infecção por C. difficile
em pacientes internados no Hospital das
Clínicas da Universidade Federal de
Minas Gerais (HCUFMG).
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras
Foram coletadas 92 amostras de fezes
de pacientes com suspeita de infecção
por C. difficile, todos com idade
superior a 18 anos de idade, sem
distinção racial ou de sexo, e sempre
após a assinatura do “Termo de
consentimento livre e esclarecido”. Os
espécimes clínicos foram recolhidos em
recipientes estéreis e mantidos a -20 °C
até a execução dos testes, por um
período máximo de até dez dias.
Citotoxicidade celular (CTA) e Calculou-se a concordância entre o
Cultura toxigênica (TC)
Os ensaios de CTA para a detecção das
toxinas A/B de C. difficile foram
realizados com células de rim de
macaco verde (VERO-ATCC CCL 81)
(Capítulo 4, item 4.1). Para o
isolamento, as amostras de fezes foram
submetidas a um choque com álcool
absoluto (Avbersek et al., 2009) e
alíquotas de 50 µl foram plaqueadas em
agar cicloserina-cefoxitina-frutose17
suplementada com 7% de sangue
equino e 0,1% de taurocolate sódico18.
Após a incubação em jarras de
anaerobiose com mistura gasosa (10%
H2, 10% CO2, 80% N2) a 37°C por 72
horas, todas as colônias com morfologia
coloração de Gram sugestivas foram
submetidas a uma PCR para
confirmação da identidade pela
detecção do gene (tpi) e tipificação pela
detecção dos genes das toxinas A
(tcdA), B (tcdB) e binária (cdtB) (Silva
et al., 2011). Todas as estirpes que
possuiam pelo menos um dos dois
principais genes de virulência (tcdA ou
tcdB) foram consideradas toxigênicas.
Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)
comerciais
Três ELISAs comerciais para detecção
das toxinas A/B foram testados: C.
difficile Tox A/B II19, Remel Prospect
C. difficile Toxins A/B20 e Clostridium
difficile Ridascreen21. Além dos
ELISAs, um kit de NAAT22 foi
avaliado. Todas as reações foram
realizadas de acordo com as
recomendações dos fabricantes e a
sensibilidade, especificidade, valor
preditivo positivo (VPP) e negativo
(VPN) foram calculados com seus
respectivos intervalos de confiança a
95% de probabilidade e considerando o
CTA ou TC como “padrão-ouro”.
CTA e TC teste Kappa23.
RESULTADOS
Dos pacientes amostrados, 25 (27,2%)
foram positivos para detecção das
17
Himedia, Mumbai, Índia
18
Sigma-Aldrich Co., Sto Louis, EUA
19
Techlab Inc., EUA
20
Oxoid, Inglaterra
21
R-Biopharm, Alemanha
22
Simplexa™ C. difficile Universal Direct Kit,
Focus Diagnosticis, EUA
23
STATA, College Station, Texas, EUA
51
toxinas A/B por CTA. C. difficile foi
isolado em 29 (31,5%) amostras, sendo
seis estirpes não-toxigênicas e 23 (25%)
consideradas toxigênicas (tabela 5).
Dessas, 15 (65,2%) possuiam os genes
tcdA e tcdB (A+B+CDT-), seis (26,1%)
possuiam os genes tcdA, tcdB e cdtB
(A+B+CDT+) e duas (8,7%) possuiam os
genes tcdB e cdtB, mas eram negativas
para o gene tcdA (A-B+CDT-). A
concordância (kappa) entre os
resultados de CTA e TC foi de 0.61,
variando de 0,41 a 0,81 em um intervalo
de confiança de 95%. Todos os ELISAs
testados e o NAAT apresentaram
sensibilidade entre 59 e 68% e
especificidade acima de 91% (tabela 6).

Tabela 5: Resultados obtidos nos três testes imunoenzimáticos, na cultura toxigênica (TC) e no
teste de citotoxicidade celular (CTA) para o diagnóstico da infecção por Clostridium difficile em
pacientes internados no Hospital das Clínicas da UFMG.

CTA TC
Método
R+ R- F+ F- R+ R- F+ F-
Citotoxicidade celular (CTA) 25 67 - - 17 61 8 6
Cultura Toxigênica (TC) 17 61 6 8 23 69 - -
C. difficile Tox A/B II (Techlab) 17 65 2 8 15 68 1 8
Remel ProSpecT C. difficile Toxin A/B (Oxoid) 16 63 4 9 14 63 6 9
Ridascreen C. difficile toxins A/B (R-Biopharm) 16 67 0 9 14 67 2 9
Simplexa™ C. difficile Universal Direct Kit
13 58 1 8 13 57 1 9
(Focus Diagnosticis)
Legenda: R+ real positivo; R- real negativo; F- falso negativo; F+ falso positivo

Tabela 6: Avaliação de kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) e um de amplificação de ácidos

nucléicos (NAAT) frente a citotoxicidade celular e cultura toxigênica como padrão “ouro” para
o diagnóstico de infecção por Clostridium difficile em pacientes (n=92) do Hospital das Clínicas
da UFMG.

Citotoxicidade celular (CTA) Cultura toxigênica (TC)

Método % (IC) % (IC)
SE ES VPP VPN SE ES VPP VPN
73,9 88,4 68 91
Citotoxicidade
- - - - (53,5- (78.8- (48,4- (81,8-
celular (CTA)
87,5) 94) 82,8) 95,8)
68 91 73,9 88,4
Cultura toxigênica
(48,4 - (81,8- (53,5- (78,8- - - - -
(TC)
82,8) 95,8) 87,5) 94)
68 97 89,5 89 65,2 98,5 93.8 89
C. difficile Tox
(48,4- (89,8 - (68,6 - (79,8- (44,9- (91,9- (71,7 - (79,8 -
A/B II (Techlab)
82,8) 99,2) 97,1) 94,3) 81,2) 99,7) 98,9) 94,3)
Remel ProSpecT 64 94 80 87,5 60,9 91,3 70 87.5
C. difficile Toxin (44,5- (85,6- (58,4- (77,9- (40,8- (82,3- (48,1- (77,9-
A/B (Oxoid) 79,8) 97,7) 91,9) 93,3) 77,8) 96) 85,5) 93,3)
Ridascreen C.
64 100 99,9 88,2 60,9 97,1 87,5 88,2
difficile toxins
(44,5- (94,5- (80,5- (79 - (40,8- (90- (64 - (79-
A/B (R-
79,8) 100) 100) 93,6) 77,8) 99,2) 65) 93,6)
Biopharm)
Simplexa™ C.
59.1 98,3 92,9 86,4 61,9 98,3 92,9 87,9
difficile Universal
(38,7 - (90,9- (68,5- (76,1- (40,9- (91- (68,5- (77,9-
Direct Kit (Focus
76,7) 99,7) 98,7) 92,7) 79,2) 99,7) 98,7) 93,7)
Diagnosticis)
Legenda: SE=sensibilidade; ES=especificidade; VPP=valor preditivo positive; VPN=valor preditivo
negative; IC=Intervalo de confiança de 95%.

52
 DISCUSSÃO
A porcentagem de pacientes
confirmados com ICD no presente
estudo (aproximadamente 25%) é
semelhante ao relatado em trabalhos
recentes no Brasil, que encontraram
entre 19,7% e 28,5% de pacientes
positivos (Balassiano et al., 2009;
Balassiano et al., 2010; Balassiano et
al., 2011). Deve-se enfatizar, porém,
que além de diferenças relativas ao
hospital estudado, os trabalhos
anteriores utilizaram kits comerciais de
ELISA para o diagnóstico, o que pode
ter substimado porcentagem de
positivos devido a baixa sensibilidade
comumente apresentada por estes testes.
Pela primeira vez no Brasil, o
diagnóstico foi confirmado por CTA
e/ou TC, ambos considerados como
“padrão-ouro” para o diagnóstico de
diarreia nosocomial por C. difficile em
seres humanos (Humphries, 2012; Silva
Junior, 2012).
Outro ponto que chama atenção é que
mais de 63% dos pacientes
considerados “suspeitos” de ICD pelos
clínicos foram negativos em todos os
testes realizados. A proporção
encontrada é semelhante ao relatado em
outros países (Samra et al. 2008;
Eastwood et al., 2009; Litvin et al.,
2009; Shin et al., 2009; Wilcox, 2011) e
sugere uma dificuldade de identificação
clínica da diarreia nosocomial causada
por C. difficile. Essa característica
peculiar torna ainda mais importante a
utilização de teste rápido de diagnóstico
laboratorial, o que poderia diminuir a
frequência de antibioticoterapia
empírica nesses pacientes. Além disso,
um teste rápido e de alta sensibilidade
permitiria a triagem dos indivíduos
suspeitos e evitaria o isolamento
desnecessário dos negativos, o que
eleva drasticamente os gastos na
instituição de cuidado devido ao grande
número de suspeitos que são negativos
para ICD (Alcalá, 2012; Strachan et al.,
2012).
Até aproximadamente dez anos atrás,
acreditava-se que o CTA possuia
sensibilidade e especificidade acima de
99%, sendo considerada portanto como
a principal técnica para diagnóstico de
ICD em humanos e animais (Delmée,
2001; Wilcox, 2011). Porém, nos
últimos anos, verificou-se que a
sensibilidade dos protocolos de CTA
apresentavam, frente a cultura
toxigênica, sensibilidade entre 65 e 86%
e especificidade acima de 90%
(Humphries, 2012). Corroborando tais
achados, a sensibilidade do protocolo
CTA utilizado foi de 73,9%, no presente
estudo. É também importante notar que,
apesar dos diversos estudos sobre
diagnóstico de CDI em humanos, ainda
não existe um protocolo padrão para a
CTA, havendo diferenças na linhagens
de células, na concentração utilizada e
também na diluição inicial das amostras
de fezes. No presente trabalho optou-se
pela linhagem celular Vero, considerada
a mais sensível às toxinas A/B (Delmée,
2001), e por um protocolo de CTA
utilizado com sucesso em estudos
similares (van den Berg et al., 2005;
Medina-Torrez et al., 2010 Keessen et
al., 2011; Silva et al., 2012; Silva et al.,
2013a; Silva et al., 2013b).
Por outro lado, o protocolo de TC
apresentou uma sensibilidade bastante
inferior ao esperado (68%) em
comparação com trabalhos anteriores
que relatam sensibilidade próxima a
100% (Shin et al., 2009; Silva Junior,
2012). Ainda não há nenhum método
padrão para a cultura toxigênica de C.
difficile, tornando difícil comparar
resultados de TC com outros autores.
Uma grande variedade de meios e
53
também diferenças no protocolo de
isolamento são comuns, tais como a
utilização de choque com álcool e
variações no tempo de incubação
(Delmée, 2001). No presente trabalho,
optou-se por um protocolo de
isolamento simples, que seria mais
aplicável para o diagnóstico quando
comparado com metodos anteriores
(Sharp et al., 2010). Sabe-se que
algumas estirpes de C. difficile podem
não crescer devido a susceptibilidade
aos antibióticos utilizados no meio
(Songer e Uzal, 2005). Recentemente,
Malik et al. (2013) demonstraram que a
presença de antimicrobianos no meio de
cultura causam um estresse capaz de
diminuir a taxa de isolamento do
agente.
Além disso, a utilização de CCFA,
mesmo com a suplementação de
taurocolate, pode ter uma sensibilidade
variável para recuperação de esporos de
C. difficile quando comparado com
protocolos que preconizam utilização de
meios líquidos para um pré-
enriquecimento antes do plaqueamento
em ágar seletivo (Thitaran et al., 2011).
Todos esses fatores podem ter
contribuido para a baixa sensibilidade
encontrada no protocolo testado de TC.
Mesmo com a sensibilidade de TC
inferior ao relatado em estudos
anteriores, a concordância entre os
resultados de CTA e TC foi de 0,61,
resultado semelhante ao relatado em
outros estudos (Keessen et al., 2011) e
que, de acordo com Landis e Koch
(1977), pode ser classificado como uma
concordância substancial. De qualquer
forma, deve-se destacar ainda que a TC
não parece ser uma boa opção para o
diagnóstico devido ao elevado tempo
para obtenção dos resultados. No
presente estudo, mesmo com um
método simplificado, os resultados de
TC necessitaram de pelo menos de seis
dias para conclusão.
Um outro ponto que deve ser citado é a
possibilidade de resultados falso-
positivos no TC. A colonização
assintomática por C. difficile é um
evento raro em adultos saudáveis,
porém pode alcançar entre 9 e 20% em
alguns grupos, especialmente pacientes
internados em hospitais por longos
períodos (Humphries, 2012; Silva
Junior, 2012). Uma medida essencial
para diminuir o número de resultados
falso-positivos é a diferenciação entre
estirpes toxigênicas e não toxigênicas
após o isolamento. No presente estudo,
quatro (4,3%) pacientes com suspeita de
diarréia por C. difficile foram negativos
para as toxinas A/B e amostras não
toxigênicas foram obtidas das amostras
de fezes. Um protocolo de isolamento
sem confirmação da toxigenicidade do
agente indicaria tais pacientes como
positivos para ICD, o que poderia
culminar com a administração
desnecessária de antibióticos. De acordo
com Peterson et al (2007), mesmo com
a confirmação da toxigenicidade da
estirpe isolada, a TC ainda indicaria
aproximadamente 10% de resultados
falso-positivos. No presente estudo, oito
pacientes (8,7%) foram positivos para
TC mas negativos para toxinas A/B por
CTA e por todos ELISAs utilizados.
Nesses casos, um resultado falso-
positivo deve ser considerado. Uma vez
que ambos testes “ouro” possuem
pontos falhos, a avaliação de novos
métodos de diagnóstico para ICD deve
ser realizada considerando
simultaneamente CTA e TC como
padrão “ouro”.
A baixa sensibilidade apresentada pelos
kits comerciais de ELISA no presente
estudo (entre 59 e 68%) corrobora
trabalhos anteriores que relatam entre
50 e 77%, enquanto a especificidade
permanece acima de 90% (Alcalá, 2012;
Humphries, 2012). Em razão da
facilidade de execução, velocidade de
54
obtenção dos resultados e baixo custo,
os kits de ELISA comerciais ainda são
os testes mais utilizados para o
diagnóstico de ICD em seres humanos
em todo o mundo (Wilcox, 2011; René
et al., 2012). No presente trabalho,
considerando o kit que apresentou
melhor desempenho (68% de
sensibilidade), um em cada três
pacientes com ICD seriam
erroneamente indicados como
negativos, o que poderia culminar com
agravamento clínico por interrupção da
antibioticoterapia. Além disso, no
HCUFMG, de forma semelhante a
muitos outros hospitais, pacientes com
suspeita de ICD são isolados no intuito
de diminuir a disseminação do agente
no ambiente (Alcalá, 2012; Zilberberg e
Shorr, 2013). Dessa forma, outro ponto
negativo relativo a baixa sensibilidade
dos kits de ELISA seria a potencial de
disseminação de esporos de C. difficile
devido a não permanência desses
indivíduos no isolamento.
Por outro lado, a baixa sensibilidade
apresentada pelo NAAT (menos de
62%) foi surpreendente uma vez que
trabalhos anteriores com outros kits
relataram sensibilidade e especificidade
superiores a 90% (Eastwood et al.,
2009; Humphries, 2012; Viala et al.,
2012). Em comparação com outros
testes disponíveis no mercado, o NAAT
testado no presente trabalho teria como
vantagem a extração térmica do DNA
bacteriano direto das fezes, sem
posterior purificação. De forma
resumida, toma-se um swab da amostra
fecal, realiza-se a imersão deste em uma
solução de lise, seguido de um ciclo de
aquecimento e centrifugação. O
sobrenadante obtido após a falso-positivos (Litvin et al., 2009;
centrifugação desse material é utilizado
como molde de DNA para a reação.
Alguns autores relatam que a principal
causa de resultados falso-negativos em
NAATs seria a obtenção de um material
com quantidade insuficiente de DNA
(Stamper et al., 2009; Novak-Weekley
et al., 2010; Viala et al., 2012). Com
isso, pode-se hipotetizar que pelo menos
parte do grande número de resultados
falso-negativos obtidos com o NAAT
testado tenha relação com a ausência de
um protocolo mais refinado de extração
de DNA, o que aumentaria o número de
cópias do gene buscado (tcdB, no caso)
e diminuiria ainda a quantidade de
inibidores da reação.
Uma das amostras testadas apresentou
resultado indeterminado no NAAT.
Como recomendado pelo fabricante,
uma outra alíquota do espécime clínico
foi descongelada para repetição do teste,
mas novamente um resultado
indeterminado foi obtido. Resultados
indeterminados em NAATs são
causados principalmente pela presença
de inibidores de PCR nas fezes
(Eastwood et al., 2009; Humpshire,
2012). De qualquer forma, tal evento
não parece ser frequente uma vez que
apenas uma amostra (1,2%) dos 81
espécimes testados apresentou resultado
indeterminado, frequência similar ao
relatado anteriormente por outros
autores (Eastwood et al., 2009;
Humpshire, 2012).
Diversas alternativas tem sido propostas
para melhorar o diagnóstico de ICD em
humanos. Em instituições que utilizam
kits de ELISA, o envio de mais de uma
amostra do mesmo paciente foi sugerido
por alguns autores, mas estudos
revelaram que, além de onerar o
diagnóstico, tal medida não aumenta
significativamente o valor preditivo
positivo do teste e pode ainda
influenciar negativamente na taxa de
Gade e Turett, 2009; Humphries, 2012).
Alguns autores sugerem que um
algorítmo de pelo menos duas etapas é
necessário para um diagnóstico seguro
de ICD em seres humanos, mas ainda
55
não há consenso sobre quais testes
devem ser usados em cada passo do
diagnóstico (Shin et al., 2009; Peterson
et al., 2011; Alcalá, 2012; Humphries,
2012). Com isso, o presente estudo
reforça a necessidade urgente de mais
APROVAÇÃO EM COMITÊ DE
ÉTICA
REFERÊNCIAS
ALCALÁ L. Laboratory tests for
diagnosis of Clostridium difficile
infection: past, present, and future.
Enferm Infecc Microbiol Clin, v.31, p.
65-7, 2013.
AVBERSEK, J.; JANEZIC, S.; PATE,
M. et al. Diversity of Clostridium
difficile in pigs and other animals in
Slovenia. Anaerobe, v.15, n.6, p.252-5,
2009.
BALASSIANO, I.T.; DOS SANTOS-
FILHO, J.; DE OLIVEIRA, M.P. et al.
An outbreak case of
Clostridium difficile-associated diarrhea
among elderly inpatients of an intensive
care unit of a tertiary hospital in Rio de
Janeiro, Brazil. Diagn Microbiol Infect
Dis., v.68, n.4, p.449-55, 2010.
BALASSIANO, I.T.; DOS SANTOS-
FILHO, J.; VITAL-BRAZIL, J.M. et al.
Detection of cross-infection associated
to a Brazilian PCR-ribotype of
Clostridium difficile in a university
hospital in Rio de Janeiro, Brazil.
Antonie Van Leeuwenhoek, v.99, n.2,
p.249-55, 2011.
BALASSIANO, I.T.; MIRANDA,
K.R.; BOENTE, R.F. et al.
Characterization of
Clostridium difficile strains isolated
from immunosuppressed inpatients in a
hospital in Rio de Janeiro, Brazil.
Anaerobe, v.15, n.3, p. 61-64, 2009.
estudos para padronização e avaliação
de métodos de diagnósticos para ICD,
permitindo assim um controle mais
eficiente da infecção por C. difficile em
hospitais.
Aprovado no COEP-UFMG (CAAE -
0710.0.203.0000.11)
BALASSIANO, I.T.; YATES, E.A.;
DOMINGUES, R.M. et al.
Clostridium difficile: a problem of
concern in developed countries and still
a mystery in Latin America. J Med
Microbiol, v.61, n.2, p.169-79, 2012.
DELMÉE, M. Laboratory diagnosis of
Clostridium difficile disease. Clin
Microbiol Infect., v.7, n.8, p.411-416,
2001.
EASTWOOD, K.; ELSE, P.;
CHARLETT, A. et al. Comparison of
nine commercially available
Clostridium difficile toxin detection
assays, a real-time PCR assay for C.
difficile tcdB, and a glutamate
dehydrogenase detection assay to
cytotoxin testing and cytotoxigenic
culture methods. J Clin Microbiol, v.47,
p.3211-3217, 2009.
GADE, R.; TURETT G. The utility of
repeated stool toxin testing for
diagnosing Clostridium difficile colitis.
South Med J, v.102, p.1007-1009, 2009.
HUMPHRIES, R.M. Laboratory Tests
for the Diagnosis of Clostridium
difficile Infections. Clinic Microbiol
Newsletter, v.34, pages 151-157, 2012.
KEESSEN, E.C.; HOPMAN, N.E.;
VAN LEENGOED, L.A. et al.
Evaluation of four different diagnostic
tests to detect Clostridium difficile in
piglets. J Clin Microbiol., v. 49, n.5,
p.1816-21, 2011.
56
KELLY, C.P.; LAMONT, J.T.
Clostridium difficile: more difficult than
ever. N Engl J Med, v.359, n.18,
p.1932-40. 2008.
LANDIS, J.R.; KOCH, G.G. The
measurement of observer agreement for
categorical data. Biometrics, v.33,
p.159-174, 1977.
LITVIN, M.; RESKE, K.A.;
MAYFIELD, J. et al. Identification of a
pseudo-outbreak of Clostridium difficile
infection (CDI) and the effect of
repeated testing, sensitivity, and
specificity on perceived prevalence of
CDI. Infect Control Hosp Epidemiol,
v.30, p.1166-1171, 2009.
MALIK, DJ..; PATEL, K.V.; CLOKIE,
M.R. et al. On the difficulties of
isolating Clostridium difficile from
hospital environments. J Hosp Infect,
84, p.181-3, 2013.
MEDINA-TORRES, C.E.; WEESE,
J.S.; STAEMPFLI, H.R. et al.
Validation of a commercial enzyme
immunoassay for detection of
Clostridium difficile toxins in feces of
horses with acute diarrhea. J Vet Intern
Med, v.24, n.3, p.628-32, 2010.
NOVAK-WEEKLEY SM, MARLOWE
EM, MILLER JM. Clostridium difficile
testing in the clinical laboratory by use
of multiple testing algorithms. J Clin
Microbiol, v.48, p.889-93, 2010.
OLDFIELD, E.C. Clostridium difficile-
associated diarrhea: risk factors,
diagnostic methods, and treatment. Rev
Gastroenterol Disord, v.4, n.4, p.186-
195, 2004
PETERSON, L.R.; MEHTA, M.S.;
PATEL, P.A. et al. Laboratory testing
for Clostridium difficile infection: light
at the end of the tunnel. Am J Clin
Pathol, v.136, p.372-380, 2011.
RENÉ, P.; FRENETTE, C.P.;
SCHILLER, I. et al. Comparison of
eight commercial enzyme
immunoassays for the detection of
Clostridium difficile from stool samples
and effect of strain type. Diagn
Microbiol Infect Dis, v.73, n.1, p.94-6,
2012.
SAMIE, A.; OBI, C.L.; FRANASIAK,
J. et al. PCR detection of Clostridium
difficile triose phosphate isomerase
(tpi), toxin A (tcdA), toxin B (tcdB),
binary toxin (cdtA, cdtB), and tcdC
genes in Vhembe District, South Africa.
Am J Trop Med Hyg, v.78, n.4, p.577-
585, 2008.
SAMRA, Z.; LUZON, A.; BISHARA,
J. Evaluation of two rapid
immunochromatography tests for the
detection of Clostridium difficile toxins.
Dig Dis Sci. v.53, p.1876-9, 2008.
SHARP, S.E.; RUDEN, L.O.; POHL,
J.C. et al. Evaluation of the C.Diff Quik
Chek Complete Assay, a new glutamate
dehydrogenase and A/B toxin
combination lateral flow assay for use
in rapid, simple diagnosis of
Clostridium difficile disease. J Clin
Microbiol, v.48, n.6, p.2082-6, 2010.
SHIN, B.M.; KUAK, E.Y.; LEE, E.J. et
al. Algorithm combining toxin
immunoassay and stool culture for
diagnosis of Clostridium difficile
infection. J Clin Microbiol, v.47,
p.2952-2956, 2009.
SILVA JÚNIOR, M. Recent changes in
Clostridium difficile infection. Einstein,
v.10, p.105-109, 2012.
SILVA, R.O.; RIBEIRO, M.G.;
PALHARES, M.S. et al. Detection of
A/B toxin and isolation of Clostridium
difficile and Clostridium perfringens
from foals. Equine Vet J, ahead of print,
doi: 10.1111/evj.12046, 2013a.
57
SILVA, R.O.S.; D'ELIA, M.L.; DE
MAGALHÃES SOARES, D.F. et al.
Clostridium difficile-associated diarrhea
in an ocelot (Leopardus pardalis).
Anaerobe. v.20, p.82-44, 2013b
SILVA, R.O.S.; MOREIRA, F.M.;
REZENDE, J.V. et al. First confirmed
case of Clostridium difficile-associated
diarrhea in foals in Brazil. Ciência
Rural, v.42, n.3, p. 498-500, 2012.
SILVA, R.O.S.; SALVARANI, F.M.;
CRUZ JUNIOR, E.C.C. et al. Detection
of toxins A/B and isolation of
Clostridium difficile from piglets in
Brazil. Ciência Rural, v.41 n.8 p.1130-
1135, 2011.
SONGER, J.G; UZAL, F A. Clostridial
enteric infections in pigs. J Vet Diagn
Invest, v.17, n.6, p.528-536, 2005.
STAMPER, P.D.; ALCABASA, R.;
AIRD, D. et al. Comparison of a
commercial real-time PCR assay for
tcdB detection to a cell culture
cytotoxicity assay and toxigenic culture
for direct detection of toxin-producing
Clostridium difficile in clinical samples.
J Clin Microbiol. v.47, p.373-8, 2009.
STRACHAN, A.J.; EVANS, N.E.;
WILLIAMS, O.M. et al. Comparison of
a frozen human foreskin fibroblast cell
assay to an enzyme immunoassay and
toxigenic culture for the detection of
toxigenic Clostridium difficile. Diagn
Microbiol Infect Disv, 75, p.42-45,
2013.
THITARAM, S.N.; FRANK, J.F.,
LYON, S.A. et al. Clostridium difficile
from healthy food animals: optimized
isolation and prevalence. J Food Prot,
v.74, p.130-133, 2011.
VAN DEN BERG, R.J.;
BRUIJNESTEIJN VAN
COPPENRAET, L.S.; GERRITSEN,
H.J. et al. Prospective multicenter
evaluation of a new immunoassay and
real-time PCR for rapid diagnosis of
Clostridium difficile-associated diarrhea
in hospitalized patients. J Clin
Microbiol, v.43, p.5338-5340, 2005.
VIALA, C.; LE MONNIER, A.;
MAATAOUI, N. et al. Comparison of
commercial molecular assays for
toxigenic Clostridium difficile detection
in stools: BD GeneOhm Cdiff, XPert C.
difficile and illumigene C. difficile. J
Microbiol Methods. v.90, p.83-85,
2012.
WILCOX, M.H. Laboratory diagnosis
of Clostridium difficile infection: in a
state of transition or confusion or both?
J Hosp Infect, v.79, p.1-3, 2011.
ZILBERBERG, M.D.; SHORR, A.F.
Preventing Clostridium difficile
infection in the intensive care unit. Crit
Care Clin, v.29, p.11-18, 2013.
58
5. CAPÍTULO 2: Ocorrência da infecção por Clostridium difficile

5.1 Detecção das toxinas A/B e isolamento de Clostridium difficile em potros

diarréicos e saudáveis.

RESUMO

O objetivo deste estudo foi detectar as toxinas A/B e isolar C. difficile de amostras de
fezes de potros diarréicos e não diarréicos. Um total de 154 amostras de potros foram
coletadas, sendo 139 amostras de haras (63 de potros diarréicos e 76 de não-diarréicos)
e 15 amostras de potros com diarreia internados em um hospital veterinário. A toxinas
A/B foram detectadas pelo ensaio de citotoxicidade celular (CTA). Todas as colónias
sugestivas foram submetidas a PCR para detecção dos genes das toxinas A, B e toxina
binária. Na detecção das toxinas A/B de C. difficile, oito das 154 (5,2%) amostras foram
positivas, todas oriundas de animais diarréicos. Dentre os positivos, 6/15 (40%) eram de
potros hospitalizados e apenas 2/63 (3,2%) de amostrados em haras, com diferença entre
esses grupos (p=0,002). Um animal positivo para as toxinas A/B foi negativo no
isolamento de C. difficile e duas estirpes toxigênicas foram isoladas a partir de potros
diarreicos negativo na CTA.

Palavras-chave: colite, equinos, antibioticoterapia.

INTRODUÇÃO transmissão e fatores de risco, ajudando

C. difficile é um bacilo Gram-positivo,
formador de esporos e reconhecido
como responsável pela maioria dos
casos de diarreia associada a
antibioticoterapia em seres humanos
(Schwan et al., 2009). Em equinos, é
responsável pela colite em animais
adultos (Songer et al., 2009) e diarreia
em potros, que pode ocorrer de forma
espontânea ou associada ao uso de
antimicrobianos (Båverud et al., 2004;.
Silva et al., 2012). Recentemente,
estudos demonstraram que os isolados
de seres humanos com infecção por C.
difficile (ICD) têm alta correlação
genética com as estirpes isoladas de
animais, levantando a hipótese de uma
doença zoonótica (Jhung et al., 2008;
Norman et al., 2011).
A detecção de toxinas e o isolamento do
agente seguido das detecção de genes
codificadores de fatores de virulência
podem levar a uma melhor
compreensão dos padrões de
a elucidar a epidemiologia da C.
difficile em equinos (Silva et al., 2011).
Com isso, o objetivo deste estudo foi
detectar as toxinas A/B, isolar estirpes
de C. difficile e identificar os genes
relativos aos principais fatores de
virulência dos isolados a partir de
amostras de fezes de potros diarréicos e
não diarréicos.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras
Um total de 154 amostras foram
coletadas em haras ou de potros
atendidos no Hospital Veterinário (HV)
da UFMG. De haras, foram obtidas 139
amostras de fezes de 17 propriedades
rurais diferentes, sendo 63 de potros
diarréicos e 76 de não-diarréicos. Os
espécimes de potros do HV totalizaram
15 amostras de fezes diarréicas, todas
obtidas no momento da chegada ao HV
e de animais em que a principal
motivação para a consulta foi a

59
ocorrência de diarreia. Todos os
espécimes foram coletados diretamente
da ampola retal e acondicionados em
frascos esterilizados e mantidos a -20°C
até o processamento.
Detecção das toxinas A/B e
Isolamento de Clostridium difficile
O teste de citotoxicidade celular (CTA)
para a detecção das toxinas A/B de C.
difficile foi realizado em células African
Green Monkey Kidney (Vero-ATCC
CCL 81) (Capítulo 4, item 4.1). Para o
isolamento, volumes iguais de amostras
de fezes e etanol a 96% (v/v) foram
misturados e, após incubação por 30
minutos à temperatura ambiente,
alíquotas de 50 µL foram inoculadas em
placas de agar cicloserina-cefoxitina-
frutose24 suplementada com sangue de
equino a 7% e taurocolato de sódio25 a
0,1%. Após a incubação em jarras de
anaerobiose com mistura gasosa (10%
H2, 10% CO2, 80% N2) a 37 °C por 72
horas, todas as colônias com morfologia
sugestiva foram submetidos a uma PCR
para detecção simultânea de um gene
constitutivo (tpi) e os genes
codificadores das toxinas A (tcda), B
(tcdB) e toxina binária (cdtB) de C.
difficile (Silva et al., 2011).
(3,2%) eram de potros diarréicos
amostrados em haras, havendo
diferença significativa (p=0,002) entre
os dois grupos. Com relação ao
histórico dos animais, três dos potros
positivos desenvolveram diarreia após
tratamento prévio com antibióticos para
outra infecção, enquanto que quatro
animais aparentemente tiveram início
espontâneo da doença. Não há histórico
com relação a um dos potros positivos,
amostrado em um haras. No presente
estudo, não foi detectada as toxinas A/B
em potros não-diarréicos.
Estirpes de C. difficile foram isoladas de
13 animais, 11 diarréicos (sete deles
positivos para as toxinas A/B) e dois de
aparentemente saudáveis. Dez estirpes
foram toxigênicas por PCR, enquanto as
três restantes eram não-toxigênicas. Um
animal positivo para as toxinas A/B foi
negativo para isolamento de C. difficile,
ao passo que estirpes toxigênicas foram
isoladas de três potros negativos para as
toxinas A/B, dois deles diarréicos e um
aparentemente saudável.

Análise estatística

O teste exato de Fisher26 foi utilizado

para avaliar as associações entre
variáveis. O nível de significância foi
fixado em p <0,05.

RESULTADOS

Na detecção das toxinas A/B de C.

difficile, oito amostras foram positivas
(5,2%), todas de potros com diarreias
(tabela 7). Destes, 6/15 (40%) eram de
potros hospitalizados e apenas 2/63

24
Hi-media, Mumbai, Índia
25
Sigma-Aldrich Co., Sto Louis, EUA
26
STATA, College Station, Texas, EUA.

60
Tabela 7: Resultados de detecção das toxinas A/B e isolamento de Clostridium difficile de
potros diarreicos e não-diarreicos (n=154).
Potros
Método
Resultados Saudáveis Diarréicos
Total
(Haras) Hospital Haras
6/15 2/63
Positivo 0/76 (0%) 8/154 (5,2%)
Detecção toxinas (40%)a (3,2%)b
A/B 61/63 146/154
Negativo 76/76 (100%) 9/15 (60%)
(96,8%) (94,8%)
14/153
Positivo 3/76 (3,9%) 9/15 (60%) 2/63 (3,2%)
(9,5%)
7/15 10/154
A+B+ 2/76 (2,6%) 1/63 (1,6%)
Isolamento de C. (46,7%) (6,5%)
difficile 2/15
A-B- 1/76 (1,3%) 1/63 (1,6%) 4/153 (2,6%)
(13,3%)
61/63 140/154
Negativo 73/76 (96,1 %) 6/15 (40%)
(96,8%) (90,1%)
Letras minúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença (p<0,05)

A maior positividade de animais

DISCUSSÃO
Em contraste com o relatado em estudos
com cães e leitões (Clooten et al., 2008;
Keessen et al., 2011; Silva et al., 2011),
a ausência de potros não-diarréicos
positivos para as toxinas A/B sugere
que a doença subclínica não seja
importante nesta espécie, resultado que
corrobora relatos anteriores (Weese et
al., 2001; Båverud et al., 2003).
No grupo diarréico, oito dos 78 potros
(10,2%) foram positivos para a detecção
de toxina A/B, sendo quatro com cinco
meses de idade, um com três meses, um
com dois meses e dois animais com 13
dias de idade. A prevalência encontrada
é maior do que os 5% relatados por
Frederick (2009) nos EUA, mas inferior
aos 16,7% relatado por Weese et al.,
(2001) no Canadá. Também é
interessante notar que houve uma
diferença (p=0,002) entre o número de
animais positivos oriundos do HV e de
haras. Animais amostrados no HV
possuiam 16 vezes mais probabilidade
de ser positivos para as toxinas A/B do
que animais diarréicos amostrado em
haras.
amostrados no HV não pode ser
interpretada como infecção nosocomial
pois todas as amostras foram coletadas
no momento da entrada dos animais.
Por outro lado, uma hipótese para essa
diferença tem relação com o fato de
que, comumente, potros admitidos no
HV são previamente tratados no haras,
mas sem resposta efetiva. De fato, no
presente estudo todos os animais
positivos no HV foram inicialmente
diagnosticados por clínicos com outra
causa de diarreia diferente de C.
difficile. Assim, uma hipótese para a
alta positividade em potros amostrados
no HV pode ser o desconhecimento
sobre a diarreia por C. difficile por
veterinários, levando a um tratamento
ineficiente e piora dos sinais clínicos.
Além disso, tendo em vista a
semelhança clínica entre as diarreias de
diferente etiologia em potros, o presente
estudo destaca a necessidade de
diagnóstico laboratorial para
diferenciação dos enteropatógenos
nesses animais, o que permitiria uma
administração mais adequada de
antibióticos.
Dois potros positivos para as toxinas
A/B desenvolveram diarreia após
administração de penicilina G devido a

61
suspeita clínica de pneumonia (caso
descrito com mais detalhes no item 5.3
desta tese ou na publicação Silva et al.,
2012). Outros quatro animais positivos
(três hospitalizados e um de haras)
possuiam histórico de desenvolvimento
espontâneo da diarreia. Também é
interessante notar que em todos esses
quatro casos houve agravamento dos
sinais clínicos após a administração de
antimicrobianos que não metronidazol,
ou seja, compostos não específicos para
a infecção por C. difficile. Nestes casos,
acredita-se que ocorra pouco efeito
direto sobre C. difficile e uma
considerável agressão a microbiota,
permitindo um ambiente favorável a
continuidade da infecção e,
consequentemente, a produção das
toxinas pelo microrganismo.
Outro aspecto interessante deste estudo
foi o isolamento de uma estirpe não-
toxigênica seguido de, alguns dias mais
tarde, isolamento de uma estirpe
toxigénica. Neste caso, uma fêmea de
dois meses de idade foi apresentada a
um clínico com histórico de dois dias de
diarréia pastosa. Até essa altura,
nenhum antibiótico havia sido
administrado. Amostras de fezes foram
submetidas a um diagnóstico diferencial
de vários enteropatógenos (pesquisa de
oocistos, rotavírus, Salmonella spp,
Escherichia coli, C. perfringens,
Lawsonia intracellularis, detecção das
toxinas A/B e isolamento de C .
difficile). Somente E. coli foi detectada,
mas o isolado foi negativo para fatores
de virulência por PCR (Macêdo et al.,
2007). Uma estirpe não-toxigênica de
C. difficile também foi isolada.
Mesmo sem a detecção de um agente
etiológico, o animal recebeu
antibioticoterapia (sulfa-trimetropim).
Quatro dias após o início do tratamento,
o potro apresentou um agravamento do
estado clínico, com uma diarreia
profusa esverdeada e com presença de
gás nos intestinos. Novas amostras de
fezes foram coletadas e submetidas ao
diagnóstico diferencial de
enteropatógenos. Neste momento, uma
estirpe toxigénica de C. difficile foi
isolada e o espécime foi positivo para as
toxinas A/B.
Neste caso, uma hipótese a ser
considerada seria o comprometimento
da microbiota administração de
antimicrobianos. Inicialmente a diarreia
pode não ter sido causada por C.
difficile e, uma vez que não foram
detectados enteropatógenos, pode-se
sugerir inclusive que a causa era não-
infecciosa. Dessa forma, a
administração de antimicrobianos pode
ter facilitado a colonização por uma
estirpe toxigênica de C. difficile
adquirida no ambiente ou favorecido o
crescimento exarcebado de uma estirpe
pre-existente no intestino. Nesse caso,
considera-se a possibilidade de que este
animal foi pré-colonizados por mais de
uma estirpe simultaneamente, uma
toxigénica e uma não-toxigénica. A
colonização por mais de um tipo de C.
difficile foi previamente descrita em
humanos e leitões e recentemente
confirmada em equinos (Schoster et ai.,
2012). Este é o primeiro relatório desta
situação atípica em um potro e pode
alertar para a necessidade de retestes de
animais negativos quando esses
apresentarem um agravamento da
diarreia após o uso de antimicrobianos.
Seis dos potros positivos receberam
metronidazol após a confirmação da
infecção e houve recuperação da
doença, enquanto um dos animais, que
foi tratado com florfenicol e ceftiofur,
veio a óbito. Tais achados sugerem a
eficácia clínica de metronidazol para
ICD em potros como já relatado
anteriormente (Båverud, 2004).
Dez estirpes toxigênicas do C. difficile
foram isoladas, nove de potros com
62
diarreia e uma de um animal
aparentemente saudável. Sete desses
animais foram positivos para as toxinas
A/B e três foram negativos. Um estado
de portador deve ser considerado nesse
caso (Båverud et al., 2003). Outra
possibilidade de uma estirpe toxigênica
em potro negativo para as toxinas A/B é
a degradação da toxina pelas proteases
intestinais e fecais (Clooten et al.,
2008). Porém, esta hipótese deve ser
analisada com cuidado já que estudos
mostraram uma grande estabilidade das
toxinas A/B em fezes de equinos
(Weese et al., 2000; Båverud et al.,
2003).
Três estirpes não-toxigênicas também
foram isoladas de dois potros não-
diarréicos (um com sete dias e outro
com 12 meses de idade) e de um potro
diarréico (com cinco meses). É notável
observar que C. difficile foi isolado
apenas de um animal entre 68 (2,9%)
não-diarréicos e com mais de um mês
de idade. Esse resultado corrobora
estudos anteriores ao demostrarem que
o isolamento em potros saudáveis com
mais de 30 dias de vida é raro, mas pode
ocorrer, principalmente após tratamento
com antibióticos (Båverud et al., 2002;
Båverud, 2004). Infelizmente, não há
dados sobre a administração do
REFERÊNCIAS
ARROYO, L.G.; STAEMPFLI, H.;
WEESE, J.S. Molecular analysis of
Clostridium difficile isolates recovered
from horses with diarrhea. Vet Microbiol.,
v.120, p.179-183, 2007.
BÅVERUD, V. Clostridium difficile
diarrhea: infection control in horses. Vet
Clinic North Am Eq Pract, v.20, n.3, p.615-
630, 2004.
BÅVERUD, V. Clostridium difficile
infections in animals with special reference
to the horse: a review. Vet Q., v.24, n.4,
p.203-219, 2002.
antibiótico deste potro aparentemente
saudável.
Um animal foi positivo para as toxinas
A/B mas negativo para o isolamento do
agente. Não existe um protocolo padrão
de isolamento de C. difficile a partir de
amostras de fezes, o que dificulta
comparações entre trabalhos. De
qualquer forma, resultados similares
foram previamente descritos em potros
(Båverud et al., 1997; Weese et al.,
2001; Båverud et al., 2003; Arroyo et
al., 2007) e em estudos com outras
espécies como cães e suínos (Clooten et
al., 2008; Silva et al., 2011). Entre as
causas possíveis, destaca-se a possível
susceptibilidade de algumas estirpes de
C. difficile a um ou a ambos antibióticos
utilizados no meio de isolamento
(Songer e Uzal, 2005). Além disso, o
uso de agar, mesmo com a adição de
taurocolate, pode ter uma sensibilidade
menor para recuperação de esporos de
C. difficile quando comparado com
caldos seletivos (Thitaran et al., 2011).
APROVAÇÃO EM COMITÊ DE
ÉTICA ANIMAL
Protocolo número 150/2010 CETEA-
UNESP
BÅVERUD, V.; GUSTAFSSON, A.;
FRANKLIN, A. et al. Clostridium difficile
associated with acute colitis in mature
horses treated with antibiotics. Equine Vet
J, v.29, n.4, p.279-84, 1997.
BÅVERUD, V.; GUSTAFSSON, A.;
FRANKLIN, A. et al. Clostridium difficile:
prevalence in horses and environment, and
antimicrobial susceptibility. Equine Vet
J, v.35, n.5, p.465-71, 2003.
CLOOTEN, J., KRUTH, S., ARROYO, L.
et al. Prevalence and risk factors for
Clostridium difficile colonization in dogs
and cats hospitalized in an intensive care
unit. Vet Microbiol., v.129, p.209-14, 2008.
63
JHUNG, M.A.; THOMPSON, A.D.;
KILLGORE, G.E. et al. Toxinotype V
Clostridium difficile in humans and food
animals. Emerg Infect Dis., v.14, n.7,
p.1039-45, 2008.
KEESSEN, E.C.; HOPMAN, N.E.; VAN
LEENGOED, L.A. et al. Evaluation of four
different diagnostic tests to detect
Clostridium difficile in piglets. J Clin
Microbiol., v. 49, n.5, p.1816-21, 2011.
MACÊDO, N.R.; MENEZES, C.P.L.;
LAGE, A.P. et al. Detecção de cepas
patogênicas pela PCR multiplex e avaliação
da sensibilidade a antimicrobianos de
Escherichiacoliisoladas de leitões
diarréicos. Arq Bras Med Vet Zoo, v.59,
p.1117-1123, 2007.
MAGDESIAN, K.G.; LEUTENEGGER,
C.M. Real-time PCR and typing of
Clostridium difficile isolates colonizing
mare-foal pairs. Vet J, v.190, p.119-123,
2011.
NORMAN, K.N.; SCOTT, H.M.;
HARVEY, R.B. et al. Prevalence and
genotypic characteristics of
Clostridium difficile in a closed and
integrated human and swine population.
App Environm Microbiol., v.77, n.16,
p.5755-60, 2011.
SCHOSTER ,A.; ARROYO, L.G.;
STAEMPFLI, H.R. et al. Presence and
molecular characterization of Clostridium
difficile and Clostridium perfringens in
intestinal compartments of healthy horses.
BMC Vet Res, v.8, p.94, 2012.
SCHWAN, C.; STECHER, B.;
TZIVELEKIDIS, T. et al. Clostridium
difficile toxin CDT induces formation of
microtubule-based protrusions and
increases adherence of bacteria. PLos
Pathog, v.5, n.10, 2009.
SILVA, R.O.S.; MOREIRA, F.M.;
REZENDE, J.V. et al. First confirmed case
of Clostridium difficile-associated diarrhea
in foals in Brazil. Ciência Rural, v.42, n.3,
p. 498-500, 2012.
SILVA, R.O.S.; SALVARANI, F.M.;
CRUZ JUNIOR, E.C.C. et al. Detection of
toxins A/B and isolation of Clostridium
difficile from piglets in Brazil. Ciência
Rural, v.41 n.8 p.1130-1135, 2011.
SONGER, J.G.; TRINH, H.T.; DIAL, S.M.
et al. Equine colitis X associated with
infection by
Clostridium difficile NAP1/027. J Vet
Diagn Invest, v.21, n.3, p.377-380, 2009.
SONGER, J.G; UZAL, F.A. Clostridial
enteric infections in pigs. J Vet Diagn
Invest, v.17, n.6, p.528-36, 2005.
THITARAM, S.N.; FRANK, J.F.; LYON,
S.A. et al. Clostridium difficile from healthy
food animals: optimized isolation and
prevalence. J Food Prot, v.74, p.130-3,
2011.
WEESE, J. S; STAEMPFLI, H. R;
PRESCOTT, J. F. et al. A prospective study
of the roles of Clostridium difficile and
enterotoxigenic Clostridium perfringens in
equine diarrhoea. Equine Vet J, v.33, n.4,
p.403-9, 2001.
WEESE, J.S.; STAEMPFLI, H.R.;
PRESCOTT, J.F. Survival of Clostridium
difficile and its toxins in equine feces:
implications for diagnostic test selection
and interpretation. J Vet Diagn Invest, v.
12, n.4, p.332-6, 2000.
64
5.2 Isolamento de Clostridium difficile de fezes de espécies de carnívoros silvestres
no Brasil.

RESUMO

Apesar da crescente importância de Clostridium difficile como enteropatógeno para

seres humanos e animais domésticos, o papel desse agente como causador de doença em
espécies silvestres ou mesmo a importância desses animais como reservatórios de
estirpes de C. difficile permanecem obscuros. O objetivo deste trabalho foi isolar e
identificar estirpes de C. difficile em amostras de fezes de carnívoros silvestres no
Brasil. Foram coletadas 31 amostras de fezes de carnívoros de diversas espécies em
centros de reabilitação e triagem de animais silvestres localizados nos estados de Minas
Gerais, Mato Grosso do Sul, São Paulo e Espírito Santo. Realizou-se o isolamento de C.
difficile e avaliou-se a toxigenicidade das estirpes por PCR e pelo teste de citotoxicidade
celular (CTA) a partir da cultura do isolado. Amostras de fezes positivas para o
isolamento foram ainda submetidas a detecção das toxinas A/B por CTA e por um
ELISA comercial. Foi possível isolar C. difficile em duas (6,4%) amostras, sendo uma
toxigência, isolada de uma jaguatirica (Leopardus pardalis) e uma não toxigênica,
isolada de um Lobo-Guará (Chrysocyon brachyurus). Ambos animais encontravam-se
sob antibioticoterapia no momento da coleta, sendo a jaguatirica positiva também para
as toxinas A/B nas fezes, confirmando tratar-se de um quadro de diarreia por C.
difficile. O presente estudo sugere que carnívoros silvestres não possuem grande
importância como reservatório de estirpes de C. difficile. Por outro lado, demonstra que
este agente pode ser um causador de diarreia nessas espécies, principalmente em
animais em cativeiro e sob antibiótico terapia.

Palavras-chave: jaguatirica, lobo, zoonose, nosocomial, cativeiro, felinos.

INTRODUÇÃO apenas poucos estudos sobre o assunto,

Clostridium difficile é atualmente
reconhecido como um importante
agente causador de diarreia e
enterocolite em seres humanos e
animais domésticos (Silva Junior et al.,
2012; Silva et al., 2013a). Estudos
demonstraram ainda que os isolados de
seres humanos com infecção por C.
difficile (ICD) têm alta correlação
genética com as estirpes isoladas de
animais, levantando a hipótese de uma
doença zoonótica (Jhung et al. 2008;
Songer, 2010; Norman et al., 2011).
Apesar da crescente importância de C.
difficile como enteropatógeno para seres
humanos e animais domésticos e até
mesmo como possível agente zoonótico,
o papel da ICD na maioria das espécies
selvagens permanece obscuro, existindo
a maioria limitando-se a descrições de
casos clínicos (Bojesen et al., 2006).
Recentemente, levantou-se a hipótese
de animais silvestres como possíveis
reservatórios de estirpes de C. difficile
para seres humanos e animais
domésticos, porém a existência de
poucos trabalhos sobre o tema impedem
qualquer conclusão a respeito (Jardine
et al., 2010; Bandelj et al., 2011).
Isolamento e detecção de genes
relativos a fatores de virulência em
estirpes de C. difficile podem auxiliar
no conhecimento de fatores de risco e
epidemiologia da doença (Silva et al.,
2011). Com isso, o objetivo deste
trabalho foi isolar e identificar estirpes
de C. difficile em amostras de fezes de
carnívoros silvestres no Brasil.

65
 MATERIAL E MÉTODOS
Amostras
Um total de 31 amostras de carnívoros
silvestres foram coletadas, sendo 11 de
Cerdocyon thous (cachorro-do-mato),
oito de Puma concolor (onça parda),
quatro de Leopardus tigrinus (gato do
mato pequeno), três de Leopardus
pardalis (jaguatirica), dois de
Chrysocyon brachyurus (lobo-guará) e
um de Puma yagouaroundi
(jaguarundi). As amostras foram obtidas
de animais recolhidos por centros de
triagem e de recolhimento de animais
silvestres localizados nos estados de
Minas Gerais, Espírito Santo, Mato
Grosso do Sul e São Paulo. Todas as
amostras coletadas foram aliquotadas
em microtubos estéreis e armazenadas a
-20°C até a realização dos testes.
Isolamento e PCR de C. difficile e
detecção das toxinas A/B
Para selecionar esporos de C. difficile,
volumes iguais de amostras de fezes e
etanol a 96% (v/v) foram misturados e,
após incubação por 30 minutos à
temperatura ambiente, alíquotas de 50
µL foram inoculadas em placas de agar
cicloserina-cefoxitina-frutose27,
suplementada com sangue de equino a
7% e taurocolate sódico28 a 0,1%. Após
a incubação em jarras de anaerobiose
contendo mistura gasosa (10% H2, 10%
CO2, 80% N2) a 37 °C por 72 horas,
todas as colônias com morfologia
sugestiva foram submetidos a uma PCR
para detecção simultânea de um gene
constitutivo (tpi) e os genes
codificadores das toxinas A (tcda), B
(tcdB) e toxina binária (cdtB) de C.
difficile (Silva et al., 2011). As estirpes
isoladas foram testadas quanto a
produção de toxinas A/B in vitro, como
previamente descrito por Medina-Torres
27
Hi -media, Mumbai, Índia
28
Sigma-Aldrich Co., Sto Louis, EUA.
et al. (2010) e utilizando a técnica de
CTA (Capítulo 4, item 4.1).
Alíquotas de fezes de amostras positivas
no isolamento de C. difficile foram
submetidas a detecção das toxinas A/B
por CTA (Capítulo 4, item 4.1) e por
um kit comercial de ELISA29.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
C. difficile foi isolado de apenas duas
amostras (6,4%), oriundas de uma
jaguatirica (macho, adulto, diarréico) e
de um lobo-guará (fêmea, adulto, não-
diarréico). A estirpe isolada do C.
brachyurus foi negativa para todos os
fatores de virulência pesquisados por
PCR (A-B-CDT-) e nenhum efeito
citotóxico foi detectado na cultura in
vitro do isolado, indicando que a estirpe
era não-toxigênica. Corroborando esse
achado, as amostras de fezes desse
animal foram negativas para as toxinas
A/B por CTA e ELISA. Com isso,
acredita-se que a estirpe encontrada faça
parte da microbiota, não sendo,
portanto, associada a nenhum quadro
entérico nesse caso. É interessante
observar que esse lobo-guará
encontrava-se sob antibioticoterapia no
momento da coleta devido a uma
infecção secundária de uma miíase na
orelha esquerda.
Por outro lado, a estirpe isolada da
jaguatirica foi positiva para os genes da
toxina A/B, negativa para o gene da
toxina binária por PCR (A+B+CDT-) e
positiva para o teste de produção in
vitro das toxinas A/B. Além do
isolamento, as toxinas A/B foram
encontradas nas fezes da jaguatirica por
CTA e ELISA. Sabe-se que esse animal
desenvolveu diarreia durante o uso de
uma cefalosporina para prevenção de
infecções secundárias após uma cirurgia
ortopédica. De posse desse histórico, e
29
C. difficile Tox A/B II - Techlab Inc., EUA.
66
considerando que o diagnóstico das
infecções por C. difficile é baseado na
detecção das toxinas A/B e no
isolamento de estirpes toxigênicas
(Silva et al., 2012), conclui-se que o
caso em questão tratou-se de um quadro
de diarreia associada a C. difficile. Esse
foi o primeiro relato de infecção por
este agente em um carnívoro silvestre e
é descrito com maiores detalhes no
capítulo 5 (item 5.6) ou na publicação
Silva et al., 2013b.
O conhecimento sobre a importância de
C. difficile como causador de diarreia
em espécies selvagens é extremamente
limitado, existindo relatos em javalis,
roedores, avestruzes, primatas e
lagomorfos (Frazier et al., 1993;
Shivaprasad, 2003; Keel e Songer,
2006). Em 2006, Bojesen et al.
relataram ainda um surto de ICD em
elefantes asiáticos mantidos em
cativeiro na Dinamarca. Nesse caso, não
houve administração prévia de
antibióticos mas os autores sugerem que
a ingestão de grande quantidade de
brócolis pode ter influenciado a
ocorrência da doença. Esse alimento é
conhecido por conter alta concentração
de sulfuranos, que possuem a
capacidade de inibir o crescimento de
uma variedade de microrganismos. Com
isso, acredita-se que a ingestão de
grande quantidade de brócolis tenha
causado o comprometimento da
microbiota intestinal, seguido do
crescimento e produção de toxinas de C.
difficile.
REFERÊNCIAS
BANDELJ, P.; TRILAR, T.; RACNIK,
J. et al. Zero prevalence of Clostridium
difficile in wild passerine birds in
Europe. FEMS Microbiol Letters, v.321,
p.183-185, 2011.
BOJESEN, A.M.; OLSEN, K.E.;
BERTELSEN, M.F. Fatal enterocolitis
.
Além do pontencial como patógeno
para animais silvestres, recentemente
alguns autores levantaram a hipótese
dessas espécies selvagens atuarem como
reservatórios de estirpes de C. difficile
para seres humanos e animais
domésticos, estimulando estudos nessa
área (Jardine et al., 2010). Miller et al.
(2010) observaram um baixo índice de
isolamento (4%) de C. difficile em
lontras de vida livre (Enhydra lutris
nereis), no Canadá. Já em um estudo
com 465 amostras de pássaros de vida
livre, na Eslovênia, relatou-se
prevalência zero, sugerindo que
pássaros migratórios dificilmente teriam
um papel como reservatório do agente
(Bandelj et al., 2011). Em outro estudo
realizado com pequenos mamíferos
comuns nas regiões urbanas do Canadá,
tais como roedores e pequenos
marsupiais, Jardine et al. (2010)
também relataram uma baixa
prevalência de C. difficile.
Com os resultados obtidos no presente
estudo é possível concluir que, de forma
semelhante a estudos com outros grupos
de animais de vida livre, os carnívoros
silvestres também parecem não possuir
grande importância como reservatório
de estirpes de C. difficile. Por outro
lado, sugere-se que este agente possa
ser um causador de diarreia nessas
espécies, principalmente em animais em
cativeiro e sob antibioticoterapia.
in Asian elephants (Elephas maximus)
caused by Clostridium difficile. Vet
Microbiol, v.116, p.329-335, 2006.
FRAZIER, K.S.; HERRON, A.J.;
HINES, M.E. et al. Diagnosis of
enteritis and enterotoxemia due to
Clostridium difficile in captive ostriches
(Struthio camelus). J Vet Diagn Invest,
v.5, p.623-625, 1993.
67
JARDINE, C.; REID-SMITH, R.J.;
FLOCKHART, L. et al. Clostridium
difficile in wild small mammals. 3rd
International Clostridium difficile
Symposium. Bled, Eslovênia, Setembro,
p.22-24, 2010.
JHUNG, M.A.; THOMPSON, A.D.;
KILLGORE, G.E. et al. Toxinotype V
Clostridium difficile in humans and
food animals. Emerg Infect Dis, v.14,
p.1039-45, 2008.
KEEL, M. K; SONGER, J. G. The
comparative pathology of Clostridium
difficile-associated disease. Vet Pathol,
v.43, p.225-240, 2006.
MEDINA-TORRES, C.E.; WEESE,
J.S.; STAEMPFLI, H.R. Validation of a
commercial enzyme immunoassay for
detection of Clostridium difficile toxins
in feces of horses with acute diarrhea. J
Vet Intern Med, v.24, p.628-632, 2010.
MILLER, M.A.; BYRNE, B.A.; JANG,
S.S. et al. Enteric bacterial pathogen
detection in southern sea otters
(Enhydra lutris nereis) is associated
with coastal urbanization and freshwater
runoff. Vet Res, v.41, p.1-3, 2010.
NORMAN, K.N.; SCOTT, H.M.;
HARVEY, R.B. et al. Prevalence and
genotypic characteristics of Clostridium
difficile in a closed and integrated
human and swine population. Appl
Environ Microbiol, v.77, p.5755-60,
2011.
SHIVAPRASAD, H.L. Hepatitis
associated with Clostridium difficile in
an ostrich chick. Avian Pathol, v.32,
p.57-62, 2003.
SILVA JÚNIOR, M. Recent changes in
Clostridium difficile infection. Einstein,
v.10, n.1, p.105-109, 2012.
SILVA, R.O.S.; GUEDES, R.M.C.;
LOBATO, F.C.F. Clostridium difficile
infection: main features and occurrence
in domestic species in Brazil. Ciência
Rural, v.43, n.1, p.73-80, 2013a.
SILVA, R.O.S.; MOREIRA, F.M.;
REZENDE, J.V. et al. First confirmed
case of Clostridium difficile-associated
diarrhea in foals in Brazil. Ciência
Rural, v.42, p.498-500, 2012.
SILVA, R.O.S.; D'ELIA, M.L.;
SOUZA, D.F.M. et al. Clostridium
difficile-associated diarrhea in an ocelot
(Leopardus pardalis). Anaerobe, v.20,
p.82-4. 2013b
SILVA, R.O.S.; SALVARANI, F.M.;
CRUZ JÚNIOR, E.C.C. et al. Detection
of toxins A/B and isolation of
Clostridium difficile from piglets in
Brazil. Ciência Rural, v.41, p.1130-35,
2011.
SONGER, J.G. Clostridia as agents of
zoonotic disease. Vet Microbiol, v.140,
p.399-404, 2010.
68
5.3 Surto de diarreia por Clostridium difficile em uma granja de suínos no Brasil

RESUMO

Apesar da importância de C. difficile como agente causador de diarreia em leitões

neonatos, inexistem relatos de surtos por este agente em suínos no Brasil. Este trabalho
teve como objetivo descrever um surto de enterite neonatal por C. difficile em uma
granja de suínos localizada no estado do Rio Grande do Sul, Brasil. O índice de diarreia
aumentou de 2% para aproximadamente 20% em leitões de 1 a 7 dias de idade. Animais
necropsiados apresentaram edema de mesocolon e uma grave colite neutrofílica
necrotizante foi observada em cortes histológicos. Sete dos animais amostrados foram
positivos para as toxinas A/B de C. difficile e negativos para outros patógenos
pesquisados. A associação do quadro clínico, achados macro e microscópicos post-
mortem e exames laboratoriais confirmaram o diagnóstico de colite por C. difficile. O
presente trabalho confirma a ocorrência de diarreia causada por C. difficile em suínos no
Brasil e reforça a necessidade do diagnóstico na rotina laboratorial.

Palavras-chave: diarreia neonatal, enterite, colite.

NOTA

O Brasil atualmente é o terceiro maior epidemiológicos (Lippke et al., 2011;

produtor de carne suína no mundo, com
um rebanho de aproximadamente 39
milhões de animais (IBGE, 2010).
Entretanto, pouco se sabe da
importância de C. difficile como
causador de diarreia em leitões no país.
Atualmente, nos EUA esse
microrganismo é considerado como a
principal causa não controlada de
diarreia (Songer e Anderson, 2006). Até
2010, não existiam relatos no Brasil
sobre a infecção por C. difficile em
suínos. A doença foi confirmada nos
estados de Minas Gerais e Rio Grande
do Sul por dois levantamentos
por C. difficile em uma granja de suínos
localizada em Gaurama, Rio Grande do
Sul, Brasil.
A propriedade, uma granja comercial de
larga escala, possuia 2000 matrizes e
com sistema “all-in-all-out”. Os animais
eram acomodados em baias que eram
limpas e desinfetadas após a saída de
cada lote. Em dezembro de 2011, o
proprietário relatou um aumento de
ocorrência de diarreia, principalmente
em leitões com até três dias de vida,
Silva et al., 2011). Em um estudo sobre
diagnóstico diferencial de causas de
diarreia em leitões de maternidade, C.
difficile foi considerado a principal
causa de enterite infecciosa (Cruz
Junior et al., 2013).
Mesmo com a crescente importância de
C. difficile como causador de desordens
entéricas na suinocultura brasileira,
inexistem descrições de surtos da
doença. Dessa forma, o objetivo do
presente trabalho é descrever um surto
de diarreia.
com aparente redução do ganho de
peso, mas baixa mortalidade
(aproximadamente 1,5%). De acordo
com os registros da granja, a ocorrência
de diarreia em leitões com até sete dias
de vida subiu de uma média de 2% para
em torno de 19 a 23% nos últimos três
meses. Apesar do uso de uma vacina
contendo toxóide alfa de C. perfringens
e Escherichia coli enterotoxigênica, não
houve alteração na frequência de
diarreia.

69
Em visita a granja, 18 leitões diarréicos
e dois aparentemente saudáveis (n=20),
de leitegadas diferentes e com idade
variando de um a sete dias de vida,
foram eutanasiados por eletrocussão,
sangrados e necropsiados. Todas lesões
macroscópicas foram anotadas e
amostras de fezes de sete animais,
sendo dois aparentemente saudáveis e
cinco diarréicos, foram coletadas
diretamente do reto e armazenadas a
4°C por 48 horas. Dois dos animais
diarréicos foram selecionados e
amostras do jejuno, íleo, ceco e colon
foram fixadas em formalita tamponada
10% para avaliação histológica.
As amostras de fezes foram submetidas
a pesquisa de oocistos pelo método de
flutuação (Hoffman, 1987), pesquisa de
rotavirus pelo eletroforese em gel de
poliacrilamida seguida de coloração
pela prata (Herring et al., 1982),
isolamento e genotipagem de C.
perfringens (Vieira et al., 2008) e C.
difficile (Silva et al., 2011) e para
bacteriologia de enteropatógenos
aeróbios em ágar MacConkey (Biobrás,
Prodimol Biotechnology) e Muller-
Hinton suplementado com 5% de
sangue equino (Difco Laboratories,
Detroit, USA). Para detecção das
toxinas A/B de C. difficile, as amostras
foram submetidas ao teste de
citotoxicidade celular em células Vero
(ATCC CCL 81) (como descrito no
Capítulo 4, item 4.1 deste trabalho).
No exame post mortem, 18 dos 20
leitões (16 diarréicos e dois
aparentemente saudáveis) apresentaram
edema de mesocolon, uma alteração
post mortem comumente associada a
infecção por C. difficile (Yaeger et al.,
2007). Além de edema de mesocolon e
diarreia, nenhuma outra alteração
marcante foi observada, algo também
comum em casos de diarreia por C.
difficile em leitões. Outros sinais como
hidrotórax, dificuldade respiratória,
edema escrotal e facial podem ocorrer,
mas são raros (Songer e Uzal, 2005).
Além da lesão macroscópica, dois dos
animais diarréicos foram submetidos a
avaliação histológica, apresentando
colite necrotizante neutrofílica severa
com intensa infiltração de neutrófilos da
lâmina própria para o lúmen intestinal,
alteração microscópica também
considerada típica das infecções por C.
difficile (Yaeger et al., 2007).
O exame parasitológico foi negativo
para oocistos e apenas colônias de E.
coli foram obtidas na rotina
bacteriológica de aeróbios. Em uma
PCR para detecção dos fatores de
virulência de E. coli (Macêdo et al.,
2007), todos os isolados foram
caracterizados como não toxigênicos. C.
perfringens tipo A foi isolado de dois
leitões, um diarréico e outro não
diarréico. Ambas as estirpes foram
negativas para o gene relativo a
produção da toxina beta-2 (cpb2),
considerado o principal fator de
virulência associado a diarreia por C.
perfringens em leitões (Schotte et al.
2004). Dessa forma, acredita-se que tais
estirpes faziam parte da microbiota
residual, não estando portanto
envolvidas na diarreia.
Todas as sete amostras de fezes foram
positivas para as toxinas A/B de C.
difficile no teste de citotoxicidade
celular. Isolados de C. difficile foram
obtidos de três amostras, sendo duas de
leitõs diarréicos e uma de um não-
diarréico, e todas as estirpes foram
positivas para os genes das toxinas A
(tdcA) e B (tcdB), mas negativa para o
gene da toxina binária (cdtB) por PCR.
Apesar das alterações macro e
microscópicas serem fortemente
sugestivas de infecção por C. difficile, a
doença não poderia ser confirmada sem
a detecção das toxinas A/B (Delmeé,
2001). Em alguns casos, a associação de
70
isolamento e confirmação da
toxigenicidade da estirpe também é útil
para o diagnóstico. No presente
trabalho, todas estas pesquisas
laboratoriais foram realizadas, com a
detecção das toxinas A/B em todas as
amostras de fezes avaliadas e
isolamento de estirpes toxigênicas de C.
difficile a partir de três desses espécimes
clínicos.
Pode-se observar que alguns leitões
foram positivos para as toxinas A/B mas
negativos para o isolamento do agente.
Este resultado corrobora o encontrado
em outros trabalhos em leitões e outras
espécies domésticas (Båverud et al.,
2003; Clooten et al., 2008; Silva et al.,
2011) e, provavelmente, é causado pela
susceptibilidade de algumas estirpes de
C. difficile a um ou a ambos os
antibióticos presentes no meio de
cultura empregado para o isolamento
(Songer e Uzal, 2005). A detecção das
toxinas A/B em leitões não diarréicos é
também um evento conhecido. Segundo
Yaeger et al (2007), a ausência de
conteúdo diarréico no intestino não
exclui a possibilidade de infecção, uma
vez que a colite por C. difficile é
comumente subclínica e pode ocorrer
inclusive constipação em alguns casos.
No presente trabalho, uma grande
parcela dos leitões necropsiados
apresentavam edema de mesocolon e
todos as amostras testadas foram
positivas para as toxinas A/B. De
acordo com Songer (2004), em granjas
com diarreia por C. difficile, 30% dos
leitões são positivos para as toxinas
A/B, mas essa proporção pode chegar a
100% em alguns casos. Considerando
que a infecção por C. difficile é
frequentemente subclínica (Yaeger et
al., 2007), a alta incidência de diarreia
(aproximadamente 20%) é uma
característica marcante nesse caso. É
importante salientar ainda que nenhum
outro enteropatógeno foi encontrado.
Dessa forma, a alta incidência de
diarreia, a grande proporção de animais
com alterações post-mortem e positivos
para as toxinas A/B sugerem um surto
de diarreia por C. difficile na granja em
questão.
Apesar da infecção por C. difficile ser
considerada a principal causa de diarreia
neonatal em suínos nos EUA (Songer e
Anderson, 2006), pouco se sabe com
relação a importância dessa doença em
toda a América Latina, existindo apenas
dois levantamentos realizados no Brasil,
onde ambos demonstraram uma
prevalência de aproximadamente 16%
em leitões (Lippke et al., 2011; Silva et
al., 2011). É importante salientar que,
segundo Silva et al (2011), 53% das
granjas testadas tiveram pelo menos um
animal positivo para as toxinas A/B,
sugerindo uma grande disseminação da
doença. Como já relatado nos EUA e
Europa, estes trabalhos confirmam C.
difficile como um dos principais
enteropatógenos de suínos no Brasil e
demonstram a necessidade de mais
estudos sobre prevalência e controle
dessa doença.
Como vacinas contra C. difficile não
estão comercialmente disponíveis no
Brasil, o controle de infecções por este
agente em animais domésticos é
baseada em medidas gerais de manejo
(Silva et al., 2012). Recentemente,
alguns trabalhos levantaram a
possibilidade de C. difficile ser um
agente zoonótico (Arroyo et al., 2007).
Mais estudos são necessários para
confirmação sendo que, até o momento,
nenhuma evidência de transmissão entre
animais e seres humanos foi encontrada
(McNamara et al., 2011).
A associação das alterações post-
mortem e os resultados laboratoriais
confirmaram o diagnóstico de diarreia
por C. difficile. Este estudo revela a
possibilidade de uma incidência
71
subestimada de diarreia causada por
AGRADECIMENTOS
Fapemig, Capes, CNPq, INCT e HOFFMANN, R.P. Diagnóstico de
PRPq/UFMG.
REFERÊNCIAS
ARROYO, L.G.; STAEMPFLI, H.;
WEESE, J.S. Molecular analysis of
Clostridium difficile isolates recovered
from horses with diarrhea. Vet
Microbiol., v.120, p.179-183, 2007.
BÅVERUD, V.; GUSTAFSSON, A.;
FRANKLIN, A. et al.
Clostridium difficile: prevalence in
horses and environment, and
antimicrobial susceptibility. Equine Vet
J, v.35, n.5, p.465-71, 2003.
BRASIL. Ministério do Planejamento,
Orçamento e Gestão. Instituto Brasileiro
de Geografia e Estatística. Produção
Pecuária Nacional. Rio de Janeiro,
v.38, p.1-65. 2010.
CLOOTEN, J., KRUTH, S., ARROYO,
L. et al. Prevalence and risk factors for
Clostridium difficile colonization in
dogs and cats hospitalized in an
intensive care unit. Vet Microbiol.,
v.129, p.209-14, 2008.
CRUZ-JUNIOR, E.C.; SALVARANI,
F.M.; SILVA, R.O.S. et al. A
surveillance of enteropathogens in
piglets from birth to seven days of age
in Brazil. Pesq Vet Bras, no prelo, 2013.
DELMÉE, M. Laboratory diagnosis of
Clostridium difficile disease. Clin
Microbiol Infect., v.7, n.8, p.411-416,
2001.
HERRING, A.J.; INGLIS, N.F.; OJEH,
C.K. et al. Rapid diagnosis of rotavirus
infection by direct detection of viral
nucleic acid in silver-stained
este agente em leitões no Brasil.
polyacrylamide gels. J. Clinic.
Microbiol,v.16, p.473-477, 1982.
Parasitismo Veterinário. Porto Alegre:
Editora Sulina, 1987.156p.
LIPPKE, R.T.; BOROWSKI, S.M.;
MARQUES, S.M.T. et al. Matched
case-control study evaluating the
frequency of the main agents associated
with neonatal diarrhea in piglets. Pesq
Vet Bras., n.31, v.6, p.505-510, 2011.
MACÊDO, N.R.; MENEZES, C.P.L.;
LAGE, A.P. et al. Detecção de cepas
patogênicas pela PCR multiplex e
avaliação da sensibilidade a
antimicrobianos de
Escherichiacoliisoladas de leitões
diarréicos. Arq Bras Med Vet Zoo, v.59,
p.1117-1123, 2007.
MCNAMARA, S.E.;
ABDUJAMILOVA, N.; SOMSEL, P. et
al. Carriage of Clostridium difficile and
other enteric pathogens among a 4-H
avocational cohort. Zoonoses Public
Health, v.58, n.3, 192-9, 2011.
SCHOTTE, U.; TRUYEN, U.;
NEUBAUER, H. Significance of beta
2-toxigenic Clostridium perfringens
infections in animals and their
predisposing factors--a review. J Vet
Med B Infect Dis Vet Public Health,
v.51, n.10, p.423-6, 2004.
SILVA, R.O.S.; GUEDES, R.M.C.;
LOBATO, F.C.F. Clostridium difficile
infection: main features and occurrence
in domestic species in Brazil. Ciência
Rural, v43, n.1, p.73-80, 2013.
SILVA, R.O.S.; MOREIRA, F.M.;
REZENDE, J.V. et al. First confirmed
case of Clostridium difficile-associated
diarrhea in foals in Brazil. Ciência
Rural, v.42, n.3, p. 498-500, 2012.
72
SILVA, R.O.S.; SALVARANI, F.M.;
CRUZ JUNIOR, E.C.C. et al. Detection
of toxins A/B and isolation of
Clostridium difficile from piglets in
Brazil. Ciência Rural, v.41 n.8 p.1130-
1135, 2011.
SONGER, J.G.; ANDERSON, M.A.
Clostridium difficile: an important
pathogen of food animals. Anaerobe,
v.12, n.1, p.1-4, 2006.
SONGER, J.G; UZAL, F A. Clostridial
enteric infections in pigs. J Vet Diagn
Invest, v.17, n.6, p.528-536, 2005.
SONGER, J.G. The emergence of
Clostridium difficile as a pathogen of
food animals. Anim Health Res Rev,
n.2, p.321-6, 2004.
VIEIRA, A.A.S.; GUEDES, R.M.C.;
SALVARANI, F.M. et al. Genotipagem
de Clostridium perfringens isolados de
leitões diarréicos. Arq Instit Biol, v.75,
p.513-6, 2008.
YAEGER, M.J.; KINYON, J.M.;
GLENN, SONGER, J. A prospective,
case control study evaluating the
association between Clostridium
difficile toxins in the colon of neonatal
swine and gross and microscopic
lesions. J Vet Diagn Invest, v.19, n.1,
p.52-59, 2007.
73
5.4 Primeiro relato de diarreia por Clostridium difficile em potros no Brasil

RESUMO

Apesar da importância de C. difficile como agente causador de diarreia e colite em

potros, inexistem relatos confirmados de tal doença no Brasil. O objetivo deste trabalho
foi descrever dois casos confirmados de diarreia causada por C. difficile em potros,
ocorridos em Minas Gerais, Brasil. Os animais, com cinco meses de idade, foram
encaminhados ao Hospital Veterinário da Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG) com histórico de cinco dias de diarreia após antibioticoterapia com penicilina
para uma possível pneumonia. Ambos os animais foram positivos para detecção das
toxinas A/B de C. difficile e estirpes toxigênicas de C. difficile foram isoladas de
amostras de fezes. Os animais apresentaram melhora gradual com o tratamento baseado
em metronidazol e fluidoterapia e receberam alta após sete dias. A associação do quadro
clínico, exames laboratoriais e o sucesso terapêutico permitem confirmar o diagnóstico
de colite por C. difficile. O presente trabalho chama a atenção para a possibilidade de
diarreia causada por C. difficile em equinos no Brasil e reforça a necessidade do
diagnóstico para tal infecção na rotina laboratorial.

Palavras-chave: colite, equinos, diarreia nosocomial.

RELATO DE CASO histórico de cinco dias de diarreia foram

C. difficile é um anaeróbio, bastonete
Gram-positivo que tem sido
reconhecido como um importante
patógeno bacteriano tanto em seres
humanos quanto em animais.
Atualmente, é responsável por 95% de
todos os casos de colite
pseudomembranosa e a maioria dos
casos de diarreia associada a
antibióticos em seres humanos (Schwan
et al., 2009). Em cavalos adultos, este
agente pode causar colite comumente
nosocomial e associada a potros foram então encaminhados para
antibioticoterapia (Songer et al., 2009).
Em potros, C. difficile é responsável por
diarreia e enterocolite em animais com
até 5 meses de idade (Båverud et al.,
2004). Apesar da importância de C.
difficile como patógeno em equinos, não
há diagnósticos confirmados dessa
doença em potros no Brasil. Portanto, o
objetivo deste artigo é descrever o
primeiro caso confirmado de colite por
C. difficile em dois potros no Brasil.
Dois potros, com cinco meses de idade,
da raça Mangalarga Marchador e com
examinados no Hospital Veterinário da
Universidade Federal de Minas Gerais
(HV). O proprietário informou que três
animais que compartilharam a mesma
baia iniciaram o quadro de diarreia no
segundo dia após o tratamento com
penicilina para uma suspeita clínica de
pneumonia. Com o início da diarreia,
suspeitou-se de salmonelose e o
tratamento com penicilina foi
substituído por florfenicol. Quatro dias
após o início da diarreia, um dos
animais veio a óbito. Os outros dois
o HV.
No dia da admissão, os dois animais
encontravam-se desidratados e foi
possível observar a evacuação de
diarreia verde aquosa. Os animais não
apresentavam hipertermia. As duas
principais suspeitas clínicas foram
salmonelose e diarreia por C. difficile.
Sangue de ambos os potros foram
coletados para um hemograma completo
e para a avaliação bioquímica sérica. As
amostras de fezes foram colhidas para
exame parasitológico, cultura

74
bacteriológica de rotina, detecção de
Lawsonia intracellularis por PCR
(Jones et al., 1993), isolamento de C.
difficile (Silva et al., 2011) e detecção
das toxinas A/B por dois métodos:
utilizando um kit comercial de ensaio
imunoenzimático (ELISA - Ridascreen
Clostridium difficile toxins A/B, R-
Biopharm, Alemanha); e pelo método
de citotoxicidade celular, realizado
utilizando células VERO (ATCC CCL
81) e com soroneutralização do efeito
citotóxico através de antitoxinas de C.
sordellii (NIBSC, Inglaterra).
Inicialmente, o tratamento consistiu em
fluidoterapia com solução composta de
ringer lactato, solução salina e glicose
(proporção 3:2:1 - 130 ml kg-1 dia-1,
com um total de 1,5 g de glicose kg-1
dia-1), omeprazol (4mg kg-1 SID) e
antibióticos (metronidazol: BID 20 mg
kg-1, IV, e ceftiofur: 4.4mg kg-1 de SID,
IM).
Ambos animais encontravam-se com
uma anemia inicial, com um
hematócrito de 24 e 20% e de 9,2 e 8,8
g dL-1 de hemoglobina,
respectivamente. Ambos os potros
tiveram também uma diminuição da
proteína total (4,7 e 4,0 g dL-1) e de
albumina (1,5 e 1,3 g dL-1). Todos estes
resultados são frequentemente
encontrados em casos de diarreia
associada a C. difficile (Båverud, 2004).
O exame parasitológico foi negativo, e
apenas algumas colônias de E. coli
foram obtidos da cultura bacteriológica
de rotina de amostras de fezes.
Descartando a suspeita inicial,
Salmonella sp. não foi isolada.
L.intracellularis não foi detectada por
PCR. Por outro lado, ambas amostras de
fezes foram positivas para toxinas A/B
por ELISA e no ensaio de
citotoxicidade celular. Além disso, C.
difficile foi isolado a partir de ambos os
potros, e as duas amostras foram
positivas por PCR para os genes da
toxina A (tcdA) e B (tcdB), mas
negativo para o gene da toxina binária
(cdtB). Ambas amostras isoladas foram
capazes de produzir toxina in vitro,
comprovando sua toxigenicidade.
No segundo dia após a admissão, os
potros encontravam-se hidratados e
mais ativos, apresentando um menor
número de episódios de diarreia mas
ainda com fezes líquidas. A consistência
do material fecal mudou gradualmente
de líquido a pastoso entre os terceiro e
quarto dias de hospitalização,
retornando ao sólido e com o odor
característico a partir do quinto dia. Os
animais receberam alta do HV sete dias
após a admissão.
O diagnóstico laboratorial da infecção
por C. difficile é baseado na detecção
das toxinas A/B pelo ensaio de CTA,
considerado por muitos o "padrão de
ouro", ou por ELISA (Delmeé, 2001).
Em alguns casos, a associação entre o
isolamento e produção de toxinas in
vitro também podem ser úteis. No
presente relato, todos estes ensaios
foram conduzidos. Em ambas amostras,
as toxinas A/B foram detectadas por
ELISA comercial e no ensaio de
citotoxicidade, e isolados de C. difficile
toxigênicos foram obtidos a partir de
ambos os animais.
De acordo com Båverud et al. (2003), a
diarreia associada a C. difficile em
potros pode ocorrer expontaneamente,
mas é sabido que o tratamento com
antibióticos também podem levar à
excreção do microrganismo. Sob estas
circunstâncias, os antimicrobianos
levam a um desequilíbrio da microbiota
residente, permitindo a colonização por
C. difficile (Båverud et al., 2002). Os
potros do presente relato desenvolveram
diarreia dois dias após tratamento com
penicilina, sugerindo que a
antibioticoterapia foi um fator
predisponente para a infecção por C.
difficile. Uma observação semelhante
75
foi descrito por Båverud (2004), ao
sugerir que a penicilina predispõe
estabelecimento de C. difficile no
intestino de equinos.
É também importante notar que em
animais adultos, C. difficile é a principal
causa de colite associada a antibióticos
e pode mesmo ser um agente
nosocomial, como reportado para os
seres seres humanos (Songer et al.,
2009). Estes resultados reforçam a
necessidade de incluir C. difficile no
diagnóstico diferencial da diarreia em
potros e de colite após antibioticoterapia
em cavalos adultos, especialmente nos
casos em que a doença se desenvolveu
após internação em um hospital
veterinário.
No momento, não existem produtos
comerciais disponíveis para
imunoprofilaxia contra infecções por C.
difficile em animais domésticos. O
tratamento é baseado na interrupção da
administração do antibiótico que iniciou
o quadro, seguido por fluidoterapia para
manutenção do equilíbrio hidro-
eletrolítico. Em casos onde a
antibioticoterapia é necessária,
metronidazol é a droga de primeira
escolha (Båverud, 2004). Testes de
susceptibilidade antimicrobiana de
isolados de C. difficile de equinos não
são realizados rotineiramente, mas
estudos demostraram que a maioria das
estirpes foram sensíveis ao
metronidazol. Até o momento, isolados
de C. difficile de equinos foram
encontrados apenas em cavalos
americanos (Jang et al., 1997) e, nesses
casos, a vancomicina é a opção
recomendada (Båverud et al., 2004).
A associação dos achados clínicos,
resultados laboratoriais e resultado do
tratamento confirma o diagnóstico de
diarreia por C. difficile. Este relato
revela a possibilidade de uma incidência
subestimada de diarreia causada por
este agente em potros no Brasil e sugere
que a detecção das toxinas A/B de C.
difficile deve ser considerada um exame
importante na análise de rotina de casos
de diarreia.
AGRADECIMENTOS
Fapemig, Capes, CNPq, PRPq-UFMG.
REFERÊNCIAS
BÅVERUD, V. Clostridium difficile
diarrhea: infection control in horses. Vet
Clinic North Am Eq Pract, v.20, n.3,
p.615-630, 2004.
BÅVERUD, V. Clostridium difficile
infections in animals with special
reference to the horse: a review. Vet Q.,
v.24, n.4, p.203-219, 2002.
BÅVERUD, V.; GUSTAFSSON, A.;
FRANKLIN, A. et al.
Clostridium difficile: prevalence in
horses and environment, and
antimicrobial susceptibility. Equine Vet
J, v.35, n.5, p.465-71, 2003.
DELMÉE, M. Laboratory diagnosis of
Clostridium difficile disease. Clinic
Microbiol Infect, v.7, n.8, p.411-416,
2001.
JANG, S.S; HANSEN, L.M.; BREHER,
J.E. et al. Antimicrobial susceptibilities
of equine isolates of Clostridium
difficile and molecular characterization
of metronidazole-resistant strains. Clin
Infect Dis., v.25, p.266-7, 1997.
JONES, G.F.; WARD, G.E.;
MURTAUGH, M.P. et al. Enhanced
detection of intracellular organism of
swine proliferative enteritis, ileal
symbiont intracellularis, in feces by
polymerase chain reaction. J Clinic
Microbiol, v.10, p.2611-2615, 1993.
76
SCHWAN, C.; STECHER, B.;
TZIVELEKIDIS, T. et al. Clostridium
difficile toxin CDT induces formation of
microtubule-based protrusions and
increases adherence of bacteria. PLos
Pathog, v.5, n.10, 2009.
SILVA, R.O.S.; SALVARANI, F.M.;
CRUZ JUNIOR, E.C.C. et al. Detection
of toxins A/B and isolation of
Clostridium difficile from piglets in
Brazil. Ciência Rural, v.41 n.8 p.1130-
1135, 2011.
SONGER, J.G.; TRINH, H.T.; DIAL,
S.M. et al. Equine colitis X associated
with infection by
Clostridium difficile NAP1/027. J Vet
Diagn Invest, v.21, n.3, p.377-380,
2009.
77
5.5 Diarreia por Clostridium difficile associada a candidíase em um potro

RESUMO

C. difficile é uma bactéria Gram-positiva, anaeróbia, responsável por quadros de

enterocolite espontânea ou após antibioticoterapia em potros. Já as infecções fúngicas
por membros do gênero Candida são comumente associadas a falhas na transferência de
imunidade passiva ou ao uso prolongado de antimicrobianos. O objetivo deste relato foi
descrever um caso de infecção fúngica oportunista em um potro com enterite causada
por C. difficile. Um fêmea com 18 dias de idade da raça Mangalarga Marchador foi
apresentado a um veterinário local com histórico de quatro dias de conjuntivite, diarreia
e hipópio. O diagnóstico clínico foi de salmonelose mas, mesmo com o tratamento
baseado em fluidoterapia, antibióticos (enrofloxacina e norfloxacina) e anti-inflamatório
(flunixina-meglumina), não houve melhora clínica e o animal foi eutanasiado. No
exame post-mortem e na histologia, foi possível visualizar uma infecção por Candida
albicans com ulcerações na mucosa oral, da língua, esofágica e estomacal. A avaliação
intestinal revelou uma tiflocolite com formação de pseudomembrana. O conteúdo
intestinal foi positivo para detecção das toxinas A/B, sugerindo que a infecção por C.
difficile tenha sido a causa da diarreia. O presente relato chama a anteção para a
possibilidade de ocorrência de infecções graves por Candida albicans associado a
administração de antibióticos de largo espectro e por períodos prolongados. Além disso,
sugere-se a necessidade de implementação da detecção das toxinas A/B de C. difficile
na rotina laboratorial para diagnóstico diferencial das diarreias em potros.

Palavras-chave: candidíase, tiflocolite, Candida albicans.

NOTA

A diarreia é uma das afecções clínicas espécies de animais e em seres humanos

mais comuns em potros, sendo que
aproximadamente 80% deles têm pelo
menos um episódio de diarreia durante
os primeiros seis meses de vida. Muitos
agentes infecciosos têm sido relatados
como causa de diarreia em potros,
incluindo principalmente C. difficile e
Salmonella spp. (Frederick et al., 2009).
C. difficile é uma bactéria Gram-
positiva, anaeróbia, responsável por
quadros de enterocolite, principalmente
após antibioticoterapia, em várias
(Ginn et al., 2007). Candida spp. são
fungos dimórficos, leveduras ovóides
que se reproduzem por brotamento,
sendo a Candida albicans a espécie
mais comumente isolada de seres
humanos e animais. A candidíase oral
ocorre com relativa frequência em
potros, porcos e cães e envolve a
proliferação de leveduras e hifas nas
(Thean et al., 2011).
As infecções fúngicas são
frequentemente oportunista e podem
surgir a partir de microbiota normal
(Byrne, 2007). Os membros do gênero
Candida são fungos ubíquos
encontrados em diversas espécies de
plantas e como parte da microbiota
normal do aparelho digestivo, do trato
respiratório superior e mucosa genital
de mamíferos
camadas de paraqueratose superficiais
do epitélio oral, apresentando-se como
uma pseudomembrana de material
cinza-claro, irregular
predominantemente na mucosa oral e na
parte inferior da língua (Brown et al.,
2007; AFIP, 2010). Já infecções mais
graves por C. albicans podem gerar
ulcerações gástrica e esofágica,

78
ocorrendo relatos em seres humanos,
suínos, cangurus e até em golfinhos
(Gross e Mayhew, 1983). O objetivo
deste relato foi descrever um caso de
infecção fúngica oportunista em um
potro com enterite causada por C.
difficile.
Um potro, fêmea, com 18 dias de idade
e da raça Mangalarga Marchador foi
apresentado a um veterinário com
histórico de quatro dias de conjuntivite,
diarreia e hipópio. O animal foi tratado
com colírio a base de sulfato de
condroitina e ciprofloxacina. Além
disso, o potro recebeu antibióticos
(florfenicol e enrofloxacina), anti-
inflamatório (flunixina-meglumina),
anti-espasmódico (N-
butilescopolamina) e foram
administrados suplementos alimentares.
Cinco dias depois, sem melhora clínica,
o potro foi internado no Hospital
Veterinário da UFMG. Clinicamente o
animal encontrava-se apático e com
baixo desenvolvimento corporal. Além
disso, hipertermia (40°C), desidratação
grave, hipermotilidade intestinal e
diarreia profusa de cor esverdeada
foram observados. Iniciou-se
fluidoterapia, administrou-se
antibióticos (enrofloxacino e coalescentes, fracamente aderidas e de
norfloxacino), anti-inflamatório
(flunixina-meglumina), anti-
espasmódicos (N-butilescopolamina),
adsorvente (carvão ativado), vitamina
B1 (cobalamina) e probióticos. Apesar
do tratamento, não houve melhora
clínica. Onze dias após o início da
doença, o animal encontrava-se
hiportérmico e defecou grande
quantidade de um conteúdo cilíndrico
acinzentado, sugestivo de
pseudomembrana de fibrina. Devido ao
prognóstico desfavorável, realizou-se a
eutanásia seguida de necropsia do
animal.
Amostras de tecidos e conteúdo
intestinal foram coletados para exame
histopatológico e bacteriológico. Para
histologia, amostras de tecido foram
fixados em formalina a 10%,
rotineiramente processado e corados
com hematoxilina e eosina (HE) e
coloração Ácido Periódico-Schiff
(PAS). O conteúdo intestinal foi
submetido a pesquisa das toxinas A/B
por ensaio imunoenzimático (ELISA,
Ridascreen C. difficile toxin A/B, R-
Biopharm, Darmstadt, Alemanha) e por
citotoxicidade celular (CTA) (Capítulo
4, item 4.1).
Na necropsia, o potro apresentava má
condição corporal. Na câmara anterior
do globo ocular direito havia uma
pequena quantidade de fibrina. Na
superfície dorsal e ventral da língua e na
mucosa do esófago, era possível
observar placas brancas multifocais ou
aspecto friável. Além disso, haviam
áreas multifocais de ulceração sobre a
mucosa do esófago. A mucosa
estomacal encontrava-se difusamente
espessada, caracterizada por um
membranosa branco-acinzentada e
friável facilmente separados (Figura
2A).
79
Figura 2(A): Ceco, potro. A pseudomembrana de fibrina foi retirada e revelou a mucosa
intestinal edemaciada e com pequenas áreas de ulceração. (B): Mucosa estomacal edemaciada e
revelando a presença de uma pseudomembrana de aspecto acinzentado e fracamente aderida.

As mucosas do intestino delgado, ceco e O conteúdo intestinal foi positivo para a

cólon encontrava-se hiperemicas,
edemaciadas e algumas úlceras agudas
multifocais (0,5 cm de diâmetro) foram
observados na mucosa do ceco e cólon
maior. No lúmen do ceco e cólon, havia
grande quantidade pseudomembrana de
fibrina (Figura 2A).
detecção das toxinas A/B de C. difficile
por ELISA e por CTA. Uma estirpe de
C. difficile foi isolada em ágar TCCFA
(ágar composto de cicloserina-
cefoxitina-frutose e suplementado com
5% de sangue de cavalo e 0,1% de
taurocolato). Por meio da PCR

80
multiplex (Silva et al., 2011) foi
possível detectar os genes codificadores
das toxinas A (tcdA) e B (tcdB),
enquanto o gene da toxina binária
(cdtB), um factor de virulência adicional
de C. difficile, não foi detectado. Não
foi possível isolar Salmonella spp. e C.
perfringens a partir do conteúdo
intestinal.
No exame histopatológico, observou-se
hiperqueratose moderada com grande
presença de blastoconídeos e os relatos onde a antibioticoterapia
pseudohifas aderidos ao epitélio da
língua. Além disso, havia uma área
extensa de ulceração focal associada
com uma intensa infiltração de
neutrófilos, restos celulares e numerosas
colônias bacterianas. Houve também
uma acentuada esofagite com presença
de pseudomembrana friável. A porção
não glandular do estômago encontrava-
se espessadas devido a hiperplasia do
epitélio escamoso, com marcante
hiperplasia paraqueratótica e infiltração
de neutrófilos. Em algumas áreas do
epitélio escamoso, foi possível observar
queratinização circunferencial e entérica. No entanto, a possibilidade de
lamelar. Além disso, foram observados
grande número de blastoconídeos e
pseudohifas aderidos ao epitélio a as
áreas ulceradas. Em muitas seções
desprendimento do epitélio ulcerado,
detritos, neutrófilos e leveduras podiam
ser vistos. No PAS, os blastoconídios,
pseudohifas e leveduras sugestivas de
Candida spp foram corados
positivamente.
No colon e ceco, uma tiflocolite
multifocal ulcerativa foi observada.
Nesta área, leveduras positivas no PAS
também foram visualizadas. Houve
ainda vasculite e trombose associada
com as pseudohifas. Lesões compatíveis
com infecção por C. difficile foram
caracterizados por moderada a As lesões no ceco e colon encontradas
acentuada de necrose superficial do
epitélio com infiltração neutrofílica e
grande quantidade de bacilos
intralesionais, especialmente no cólon
maior e ceco.
Infecções causadas por Candida spp.
estão geralmente relacionadas com
fatores predisponentes, principalmente
imunodeficiência ou terapia com
antibióticos e/ou corticóides (McClure
et al., 1985). Quandos de
imunodeficiência em potros jovens são
comuns quando há falha de
colostragem. Além disso, não são raros
suprime a microbiota normal e favorece
a proliferação de leveduras (McClure et
al., 1985; Bruijn e Wijnberger, 2004).
Em um indivíduo saudável, a presença
de uma microbiota intestinal normal
mantém espécies de Candida sob
controle por competição pela glicose
disponível (Bruijn e Wijnberger, 2004,
Brown et al., 2007). As lesões graves
por C. albicans neste potro
provavelmente ocorreram devido
alterações na microbiota pela
administração intensa de antibióticos
para tentativa de controle da doença
imunodeficiência não pode ser excluída
uma vez que não havia informações
sobre a quantidade e qualidade do
colostro ingerido por este animal.
Fatores de virulência de espécies de C.
albicans incluem, entre outros, a
produção de diferentes enzimas
hidrolíticas e adesinas. Estes permitem
sua adesão à superfície do epitélio
escamoso (Karkowski-Kuleta et al.,
2009). Algumas espécies de C.
albicans, principalmente C. albicans,
podem digerir a queratina in vitro o que
possivelmente auxilia a invasão do
epitélio e o alcance do estrato córneo
(Gross e Mayhew, 1983).
na necropsia e relatadas na histologia
foram sugestivas de infecção por C.
difficile. Para o diagnóstico laboratorial
81
de enterite causada por este agente é
necessário detectar as toxinas A/B no
conteúdo intestinal (Post e Songer,
2006). Assim, a lesão compatível
combinada com a visualização de
bacilos intralesionais e a detecção das
toxinas A/B permitiu o diagnóstico de
tiflocolite difusa por C. difficile, sendo
essa possivelmente a causa da diarreia
neste potro.
Os principais fatores de virulência de
C. difficile são toxina A e toxina B, que
agem diretamente sobre as células da
mucosa epitelial. As toxinas promovem
o comprometimento da adesão entre os
enterócitos e iniciam uma cascata
inflamatória que amplifica o dano aos
tecidos hospedeiros e culmina com a
exsudação de fluidos e formação da
pseudomembrana característica da
doença (Anderson e Songer, 2008).
A ocorrência de candidíase severa no
potro em questão chama atenção para a
necessidade de cuidados na
transferência da imunidade passiva por
colostragem. Além disso, a antibiotic-associated diarrhea in a foal.
administração de antibióticos de largo
espectro e por períodos prolongados
deve ser acompanhada de um
acompanhamento clínico cuidadoso,
lembrando sempre da possibilidade de
ocorrência de infecções oportunistas por
C. albicans nestes pacientes.
Finalmente, a ausência de diagnóstico
etiológico precoce de diarreia por C.
difficile impediu a mudança na conduta
clínica, culminando com a infectious diseases. St. Louis: Saunders,
administração contínua de
antimicrobianos ineficazes para
infecção tal agente. Tal fato
provavelmente favoreceu a manutenção
da infecção por C. difficile e a
disseminação da candidíase pelo
comprometimento da microbiota
indígena. Com isso, o presente trabalho
reforça a necessidade de implementação
da detecção das toxinas A/B na rotina
laboratorial para diagnóstico diferencial
das diarreias em potros.
AGRADECIMENTOS
CAPES, Fapemig, INCT, PRPq-UFMG
e CNPq.
REFERÊNCIAS
ARMED FORCES INSTITUTE OF
PATHOLOGY. Departament of
Veterinary Pathology. Conference 7,
case 3. Wednesday Slide Conference
2010-2011. Disponível em:
http://www.afip.org/. Acesso em: mai.
2011.
BROWN, C. C; BAKER, D. C;
BAKER, I. K. Alimentary system. In:
MAXIE, M. G. (ed). Jubb, Kennedy and
Palmer's Pathology of Domestic
Animals. 5. ed. Toronto: Saunders
Elsevier, 2007, pp. 01-296.
BRUIJN, C. M; WIJNBERG, I. D.
Potential role of Candidaspecies in
Vet Rec, v.135, p.26-28, 2004.
BYRNE, B. A. Laboratory diagnosis of
fungal diseases. In: SELLON, D. C;
LONG, M. T. Equine infectious
diseases. St. Louis: Saunders, p385-393.
2007.
CARRILLO, N. A. Candidiasis. In:
SELLON, D.C; LONG, M.T. Equine
2007, p.406-408.
GINN, P.E.; MANSELL, J.E.K.L.;
RAKICH, P.M. Skin and appendages.
In: MAXIE, M.G. (Ed). Jubb, Kennedy
and Palmer's Pathology of Domestic
Animals. 5. ed. Toronto: Saunders
Elsevier, 2007, pp.553-781.
GROSS, T.L.; MAYHEW, I.G.
Gastroesophageal ulceration and
82
candidiasis in foals. J Am Vet Med
Assoc, v.182, p.1370-1373, 1983.
JONES, R.L.; ADNEY, W.S.;
ALEXANDER, A.F. et al. Hemorrhagic
necrotizing enterocolitis associated with
Clostridium difficile infection in four
foals. J Am Vet Med Assoc, v.193, p.76-
79, 1988.
KEEL, M. K; SONGER, J. G. The
comparative pathology of Clostridium
difficile-associated disease. Vet Pathol,
v.43, p.225-240, 2006.
MCCLURE, J. J; ADDISON, J. D;
MILLER, R. I. Immunodeficiency
manifested by oral candidiasis and
bacterial septicemia in foals. J Am Vet
Med Assoc, v.186, p.1195-1197, 1985.
MEDINA-TORRES, C.E.; WEESE,
J.S.; STAEMPFLI, H.R. Prevalence of
Clostridium difficile in horses. Vet
Microbiol., 152, 212-215, 2011.
MUELLER, R.S; BETTENAY, S.V;
SHIPSTONE, M. Cutaneous candidiasis
in a dog caused by Candida
guilliermondii.Vet Rec, v.150, p.728-
730, 2002.
REILLY, L. K; PALMER, J. E.
Systemic candidiasis in four foals. J Am
Vet Med Assoc, v.205, p.464-466, 1994.
SCHLEUPNER, M.A.; GARNER,
D.C.; SOSNOWSKI, K.M. et al.
Concurrence of Clostridium difficile
toxin A enzyme-linked immunosorbent
assay, fecal lactoferrin assay, and
clinical criteria with C. difficile
cytotoxin titer in two patient cohorts. J
Clinl Microbiol, v.33, p.1755-1759,
1995.
SILVA, R.O.S.; SALVARANI, F.M.;
CRUZ JUNIOR, E.C.C. et al. Detection
of toxins A/B and isolation of
Clostridium difficile from piglets in
Brazil. Ciência Rural, v.41 n.8 p.1130-
1135, 2011.
THEAN, S.; ELLIOTT, B.; RILEY, T.
Clostridium difficile in horses in
Australia: a preliminary study. J Med
Microbiol, 2011.
83
 5.6 Diarreia por Clostridium difficile em uma jaguatirica (Leopardus pardalis)

RESUMO

O objetivo deste trabalho é relatar um caso de diarreia por C. difficile em uma

jaguatirica (Leopardus pardalis) ocorrido no estado do Mato Grosso do Sul, Brasil. O
animal, um macho com aproximadamente dois anos de idade, foi enviado ao Centro de
Reabilitação de Animais Silvestres com histórico de atropelamento e fratura de tíbia e
fíbula. Após a cirurgia para redução da fratura, iniciou-se antibioticoterapia com duas
doses de cefovecina sódica intervaladas de 8 dias. Durante o tratamento, o animal
apresentou diarreia. A amostra de fezes coletada para exames laboratorias foi positiva
para as toxinas A/B no ensaio de citotoxicidade celular e uma estirpe toxigênica de C.
difficile foi isolada. Nenhum outro patógeno pesquisado foi encontrado. A associação de
histórico, sinais clínicos e exames laboratoriais confirmam o diagnóstico de diarreia por
C. difficile. O presente relato aponta C. difficile como um possível enteropatógeno de
felinos silvestres e sugere que este agente deve ser considerado em casos de diarreia
nestas espécies, principalmente quando os sinais clínicos iniciaram após
antibioticoterapia.

Palavras-chave: zoonose, enterocolite, felinos, nosocomial

RELATO DE CASO et al., 2005; Arroyo et al., 2007;

Jaguatiricas (Leopardus pardalis) é o
maior felino entre os pequenos felídeos
tropicais da América do sul (Trolle et
al., 2003). Apesar de ser uma das
espécies mais comuns de felídeos
silvestres, estudos recentes indicam que
algumas subpopulações encontram-se
em risco sobretudo devido a
fragmentação de habitat e caça esportiva
(Laurenson et al., 2005).
C. difficile é um bacilo, Gram-positivo,
anaeróbio obrigatório e responsável pela
maioria dos casos de diarreia associada
ao uso de antimicrobianos em humanos,
além de um importante enteropatógeno
para diversas espécies de animais
domésticos, como equinos, suínos e
cães (Songer et al., 2010; Silva et al.,
2013a). Recentemente, a infecção por
C. difficile (ICD) tornou-se um ponto de
discussão em saúde pública uma vez
que estirpes isoladas de animais
apresentam grande semelhança com os
isolados encontrados em seres humanos
com colite pseudomembranosa (Arroyo
Rodriguez-Palacios et al., 2007).
Apesar da importância de C. difficile
como enteropatógeno para seres
humanos e animais e até mesmo como
possível agente zoonótico, a
importância da ICD para a maioria das
espécies silvestres permanece obscura,
limitando-se a alguns poucos estudos e
relatos de caso (Bojesen et al., 2006;
Bandelj et al., 2011). Dessa forma, o
presente trabalho tem como objetivo
descrever um caso de diarreia por C.
difficile em uma jaguatirica (Leopardus
pardalis) ocorrido no Brasil.
Em julho de 2012, uma jaguatirica
macho com aproximadamente 24 meses
de idade e pesando 11,6 kg foi
apresentada no Centro de Reabilitação
de Animais Silvestres (CRAS) em
Campo Grande, Mato Grosso do Sul,
após ter sido atropelada em uma rodovia
na cidade de Corumbá, Mato Grosso do
Sul. Após um raio-x, o animal foi
diagnosticado com uma fratura de tíbia
e fíbula. Realizou-se a redução cirúrgica
da fratura e iniciou-se antibioticoterapia

84
com duas doses de cefovecina sódica
(8mg/kg, via subcutânea) com intervalo
de oito dias entre as doses. Durante o
tratamento, o animal apresentou diarreia
de consistência pastosa.
Dois dias após a administração da
última dose de antibiótico, a jaguatirica
continuava a apresentar episódios de
diarreia, sendo então coletado conteúdo
fecal para exames laboratoriais. Os
seguintes exames foram realizados:
detecção de rotavirus em gel de
poliacrilamida seguido de coloração
pela prata (Herring et al., 1982);
detecção de celulas vegetativas e cistos
de Giardia sp. por ELISA (Ridascreen
Giardia, R-Biopharm, Alemanha);
isolamento de C. perfringens (Vieira et
al., 2008) e de C. difficile (Silva et al.
2011); e rotina bacteriológica para
bactérias aeróbias em ágar MacConkey
(Biobrás®, Prodimol Biotechnology,
Brasil) e Muller-Hinton suplementado
com 5% de sangue equino (Difco
Laboratories, Detroit, EUA). Além
disso, pesquisou-se as toxinas A/B de C.
difficile por meio de um kit de ELISA
(C. difficile Tox A/B II - Techlab Inc.,
Blacksburg, USA) e pelo método da
citotoxicidade celular (Capítulo 4, item
4.1).
Colônias de Escherichia coli foram
obtidas a partir da cultura bacteriológica
de aeróbios, mas nenhum fator de
virulência foi encontrado na PCR
(Macêdo et al. 2007). C. perfringens
tipo A também foi isolado, o que pode
ser considerado normal uma vez que
essa bactéria comumente participa da
microbiota indígena de mamíferos e
aves (Siqueira et al., 2012). De quaquer
forma, é importante notar que a estirpe
de C. perfrigens isolada não possuia o
gene (cpe), fator de virulência
comumente associado a casos de
diarreia em cães e gatos (Weese et al.,
2001; Marks et al., 2002; Silva et al.,
2013a). Dessa forma, tanto a estirpe de
E. coli quanto a estirpe de C.
perfringens foram consideradas como
parte da microbiota, não envolvidas no
quadro de diarreia.
A amostra de fezes foi positiva para as
toxinas A/B de C. difficile por ELISA e
por CTA. Além disso, foi possível isolar
uma estirpe de C. difficile, sendo essa
positiva por PCR para os genes da
toxina A (tdcA) e B (tcdB) e negativa
para o gene da toxina binária (cdtB). Em
um teste de produção in vitro de
toxinas, realizado de acordo com
Brazier et al. (1993), confirmou-se a
toxigenicidade de estirpe isolada.
O diagnóstico laboratorial das infecções
por C. difficile é baseado na detecção
das toxinas A/B e, em alguns casos, o
isolamento de estirpes toxigências
também pode auxiliar o diagnóstico
(Silva et al., 2012). No presente relato,
todos esses métodos foram realizados.
A partir de uma amostra de fezes do
animal, as toxinas A/B foram detectadas
por CTA e ELISA, e uma estirpe
toxigênica foi isolada, confirmando o
diagnóstico de diarreia associada a C.
difficile no animal em questão.
O felino do presente relato desenvolveu
diarreia após o uso de cefovecina
sódica, uma cefalosporina, sugerindo
que a administração deste
antimicrobiano tenha sido um ponto
relevante na patógenese da doença
nesse animal. A administração de
antimicrobianos é um fator de risco
conhecido para as infecções por C.
difficile em humanos e algumas
espécies domésticas, principalmente
cães e equinos (Balassiano et al., 2012;
Silva et al., 2013b). Em gatos
domésticos, infecções por C. difficile já
foram relatadas mas a doença parece
rara (Weese et al., 2001). É importante
lembrar ainda que as cefalosporinas são
comumente citadas como responsáveis
por casos de ICD em seres humanos e
85
equinos, corroborando o achado no
presente relato (Båverud, 2002).
Outro ponto a ser destacado é a dose de
cefovecina utilizada. Para cães e gatos,
é indicada a administração de uma dose
única de 8mg/kg para um tratamento de
14 dias (Murphy et al., 2012). Em
felinos silvestres, o uso desse
antimicrobiano é pouco estudado, mas
existem relatos de tratamentos eficazes
em leões e tigres (Schrader et al., 2012;
Steeil et al., 2012). De qualquer forma,
a dose utilizada na jaguatirica do
presente relato foi maior que a dose
recomendada para gatos domésticos e a
dose descrita nos poucos relatos de uso
de cefovecina sódica em felinos
silvestres. Dessa forma, pôde-se
levantar a hipótese de que a dose
utilizada tenha agravado o efeito
deletério na microbiota, facilitando a
colonização de C. difficile. Por ultimo, é
importante lembrar ainda que, de acordo
com o US Food and Drug
Administration (2008), ocorrência de
diarreia foi um dos efeitos adversos
mais comuns durante a avaliação da
utilização de cefovecina sódica em cães
e gatos. Infelizmente não foi relatada a
realização de nenhum exame de
diagnóstico para avaliar se essa diarreia
era de origem infecciosa e se havia a
presença das toxinas A/B nessas fezes.
A importância de C. difficile como
causador de diarreia em espécies
selvagens é limitado, existindo relatos
em javalis, roedores, avestruzes,
primatas, lagomorfos e a descrição de
um surto da doença em elefantes de um
zoológico dinamarquês (Frazier et al.,
1993; Shivaprasad, 2003; Bojesen et al.
2006; Keel e Songer, 2006).
Recentemente alguns trabalhos
levantaram também a hipótese de
animais silvestres como possíveis
reservatórios de estirpes de C. difficile
para seres humanos e animais
domésticos, porém os estudos
realizados até o momento abordaram
poucas espécies: apenas lontras, aves
migratórias e pequenos mamíferos
presentes no meio urbano (Jardine et al.,
2010; Miller et al. 2010; Bandelj et al.,
2011). De forma geral, todos esses
estudos encontraram uma baixa
prevalência de C. difficile, sugerindo
que tais espécies não possuem grande
importância como reservatórios e
disseminadores de estirpes de C.
difficile.
A associação do histórico, achados
clínicos e resultados laboratoriais
confirmam o diagnóstico de diarreia
associada a C. difficile na jaguatirica.
Este é o primeiro relato de infecção por
C. difficile em um felino silvestre.
Sugere-se que a detecção das toxinas
A/B deva ser considerada em casos de
diarreia nesses animais, especialmente
quando os sinais clínicos iniciaram após
a administração de antimicrobianos.
AGRADECIMENTOS
CNPq, Fapemig, CAPES e PRPq-
UFMG.
REFERÊNCIAS
ARROYO, L.G.; KRUTH, S.A.;
WILLEY, B.M. et al. PCR ribotyping of
Clostridium difficile isolates originating
from human and animal sources. J Med
Microbiol., v.54, p.163-6, 2005.
ARROYO, L.G.; STAEMPFLI, H.;
WEESE, J.S. Molecular analysis of
Clostridium difficile isolates recovered
from horses with diarrhea. Vet
Microbiol., v.120, p.179-183, 2007.
BALASSIANO, I.T.; YATES, E.A.;
DOMINGUES, R.M. et al.
Clostridium difficile: a problem of
concern in developed countries and still
a mystery in Latin America. J Med
Microbiol, v.61, n.2, p.169-79, 2012.
86
BANDELJ, P.; TRILAR, T.; RACNIK,
J. et al. Zero prevalence of Clostridium
difficile in wild passerine birds in
Europe. FEMS Microbiol Letters, v.321,
p.183-185, 2011.
BÅVERUD, V. Clostridium difficile
infections in animals with special
reference to the horse: a review. Vet Q.,
v.24, n.4, p.203-219, 2002.
BOJESEN, A.M.; OLSEN, K.E.;
BERTELSEN, M.F. Fatal enterocolitis
in Asian elephants (Elephas maximus)
caused by Clostridium difficile. Vet
Microbiol, v.116, p.329-335, 2006.
BRAZIER, J.S. Role of the laboratory
in investigations of Clostridium difficile
diarrhea. Clin Infect Dis., v.4, p.228-
233, 1993.
FRAZIER, K.S.; HERRON, A.J.;
HINES, M.E. et al. Diagnosis of
enteritis and enterotoxemia due to
Clostridium difficile in captive ostriches
(Struthio camelus). J Vet Diagn Invest,
v.5, p.623-625, 1993.
HERRING, A.J.; INGLIS, N.F.; OJEH,
C.K. et al. Rapid diagnosis of rotavirus
infection by direct detection of viral
nucleic acid in silver-stained
polyacrylamide gels. J. Clinic.
Microbiol,v.16, p.473-477, 1982.
JARDINE, C.; REID-SMITH, R.J.;
FLOCKHART, L. et al. Clostridium
difficile in wild small mammals. 3rd
International Clostridium difficile
Symposium. Bled, Eslovênia, Setembro,
p.22-24, 2010.
KEEL, M.K; SONGER, J.G. The
comparative pathology of Clostridium
difficile-associated disease. Vet Pathol.,
v.43, n.3, p.225-240, 2006.
LAURENSON, M.K. Aproaches to
disease control in domestic canids for
the conservation of endangered wild
carnivores. In: CLEAVELAND, S. et al
Conservation and development
Interventions at the Wildlife: Lifestock
interface: Implications for Wildlife,
Livestock and Human Health. Gland
and Cambridge: IUCN Publications
Services Unit, 2005.
MACÊDO, N.R.; MENEZES, C.P.L.;
LAGE, A.P. et al. Detecção de cepas
patogênicas pela PCR multiplex e
avaliação da sensibilidade a
antimicrobianos de
Escherichiacoliisoladas de leitões
diarréicos. Arq Bras Med Vet Zoo, v.59,
p.1117-1123, 2007.
MARKS, S.L.; KATHER, E.J.; KASS,
P.H. et al. Genotypic and phenotypic
characterization of Clostridium
perfringens and Clostridium difficile in
diarrheic and healthy dogs. J Vet Intern
Med, v.15, p. 533-40, 2002.
MILLER MA, BYRNE BA, JANG SS.
et al. Enteric bacterial pathogen
detection in southern sea otters
(Enhydra lutris nereis) is associated
with coastal urbanization and freshwater
runoff. Vet Res, v.41, n.1, 2010.
MURPHY, C.P.; REID-SMITH, R.J.;
BOERLIN, P. et al. Out-patient
antimicrobial drug use in dogs and cats
for new disease events from community
companion animal practices in Ontario.
Can Vet J, v.53, n.3, p.291-8, Mar,
2012.
RODRIGUEZ-PALACIOS, A.;
STÄMPFLI, H.R.; STALKER, M.
Natural and experimental infection of
neonatal calves with Clostridium
difficile. Vet Microbiol., v.124, n.2,
p.166-172, 2007.
SCHRADER, G.M.; WHITESIDE,
D.P.; SLATER, OM. Conservative
management of pyothorax in an Amur
87
tiger (Panthera tigris altaica). J Zoo
Wildl Med, v.43, n.2, p.425-9, Jun,
2012.
SHIVAPRASAD, H.L. Hepatitis
associated with Clostridium difficile in
an ostrich chick. Avian Pathol, v.32,
p.57-62, 2003.
SILVA, R.O.S.; GUEDES, R.M.C.;
LOBATO, F.C.F. Clostridium difficile
infection: main features and occurrence
in domestic species in Brazil. Ciência
Rural, v43, n.1, p.73-80, 2013a.
SILVA, R.O.S.; MOREIRA, F.M.;
REZENDE, J.V. et al. First confirmed
case of Clostridium difficile-associated
diarrhea in foals in Brazil. Ciência
Rural, v.42, n.3, p. 498-500, 2012.
SILVA, R.O.S.; SALVARANI, F.M.;
CRUZ JUNIOR, E.C.C. et al. Detection
of toxins A/B and isolation of
Clostridium difficile from piglets in
Brazil. Ciência Rural, v.41 n.8 p.1130-
1135, 2011.
SILVA, R.O.S.; SANTOS, R.L.R.;
PIRES, P.S. et al. Detection of toxins
A/B and isolation of Clostridium
difficile and Clostridium perfringens
from dogs in Brazil. Braz J Microbiol,
v.44, n1. Ahead of print, 2013b.
SIQUEIRA, F.F.; ALMEIDA, M.O.;
BARROCA, T.M. Characterization of
polymorphisms and isoforms of the
Clostridium perfringens phospholipase
C gene (plc) reveals high genetic
diversity. Vet Microbiol., 2012.
SONGER, J. G. Clostridia as agents of
zoonotic disease. Vet Microbiol, v.140,
p.399-404, 2010.
STEEIL, J.; SCHUMACHER, J.;
SEIBERT, R. et al. Cefovecin
(Convenia) for the treatment of septic
peritonitis in a female lion (Panthera
leo). J Zoo Wildl Med, v.43, n.3, p.678-
81, 2012.
TROLLE, M.VIERI; KERY, M.
Estimation of ocelot density in the
Pantanal using capture-recapture
analysis of camera-trapping data.
JMammalogy, v.84, n.2, p.607-614,
2003.
UNITED NATIONS. Food and Drug
Administration. Freedom of information
summary: NADA. p. 141-285. 2008.
Disponível em:
http://www.fda.gov/downloads/Animal
Veterinary/Products/ApprovedAnimalD
rugProducts/FOIADrugSummaries/ucm
062340.pdf. Acesso em: 12 fev 2013.
VIEIRA, A.A.S.; GUEDES, R.M.C.;
SALVARANI, F.M. et al. Genotipagem
de Clostridium perfringens isolados de
leitões diarréicos. Arq Instit Biol, v.75,
p.513-6, 2008.
WEESE, J.S.; STAEMPFLI, H.R.;
PRESCOTT, J.F. et al. The roles of
Clostridium difficile and
enterotoxigenic Clostridium perfringens
in diarrhea in dogs. J Vet Intern Med,
v.15, p. 374-8, 2001.
88
5.7 Susceptibilidade antimicrobiana de estirpes de Clostridium difficile isoladas de
animais e seres humanos no Brasil.

RESUMO

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a susceptibilidade antimicrobiana de estirpes

de C. difficile isoladas de animais e seres humanos no Brasil. Foram utilizadas 54
estirpes de C. difficile isoladas de amostras de fezes de leitões (n=16), cães (n=13), seres
humanos (n=13), potros (n=8), bezerros (n=2), jaguatirica (n=1) e lobo-guará (n=1). A
susceptibilidade antimicrobiana foi determinada pelo método da diluição seriada em
ágar para penicilina, florfenicol, oxitetraciclina, eritromicina, vancomicina,
metronidazol e tilosina. Todas as estirpes de C. difficile avaliadas foram sensíveis ao
metronidazol e vancomicina. Não foi observada resistência ao florfenicol e 52 (96,4%)
estirpes foram sensíveis a esse antimicrobiano. Cinco (9,3%), cinco (9,3%), 14 (25,9%)
e 20 (37%) estirpes foram resistentes a oxitetraciclina, penicilina, tilosina e eritromicina,
respectivamente.

Palavras-chave: diarreia nosocomial, colite pseudomembranosa, tratamento,

resistência.

INTRODUÇÃO domésticos, levantando à hipótese da

C. difficile é um bacilo Gram-
positivo, formador de esporos e
reconhecido como responsável pela
maioria dos casos de diarreia associada
a antibioticoterapia em seres humanos
(Silva Junior, 2012). Em Medicina
Veterinária, é responsável por quadros
de diarreia e colite em diversas
espécies, acomentendo principalmente
animais domésticos e, em relatos
recentes, algumas espécies silvestres
(Silva et al., 2013a; Silva et al., 2013b;
Bojensen et al., 2006). De forma
semelhante ao que ocorre em seres
humanos, a infecção por C. difficile
(ICD) em animais é comumente
associada ao uso de antimicrobianos
(Båverud et al., 2004; Songer et al.,
2009; Hopman et al., 2011; Silva et al
2012).
Recentemente, estudos
demonstraram que os isolados de seres
humanos com colite
pseudomembranosa por C. difficile
possuem grande semelhança genética
com as estirpes isoladas de animais
doença ser uma zoonose (Jhung et al.,
2008; Norman et al., 2011). Mesmo
com a crescente importância de C.
difficile como causador de desordens
entéricas em seres humanos e animais e
até como possível agente zoonótico, são
escassos os estudos avaliando a
susceptibilidade antimicrobiana de
estirpes de C. difficile no Brasil, sendo a
maioria dos relatos pouco robustos e
limitados a isolados de seres humanos.
Desta forma, o objetivo do presente
trabalho foi avaliar a susceptibilidade
antimicrobiana de estirpes de C. difficile
isoladas de animais e seres humanos no
Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas 54 estirpes de
C. difficile isoladas de leitões (n=16),
cães (n=13), seres humanos (n=13),
potros (n=8), bezerros (n=2), jaguatirica
(n=1) e lobo-guará (n=1). A tabela 8
resume o número de estirpes por espécie
e o histórico clínico resumido delas.

89
Tabela 8: Número de estirpes de Clostridium difficile utilizadas para avaliação da
susceptibilidade antimicrobiana por espécie e histórico clínico.
Espécie Histórico Clínico Número de Estirpes Total
Diarréicos (outra causa) 5
Cães 13
Aparentemente saudáveis 8
ICD confirmada 8
Leitões Diarréicos (outra causa) 4 16
Aparentemente saudáveis 4
ICD confirmada 4
Potros Diarréicos (outra causa) 2 8
Aparentemente saudáveis 2
Bezerros Diarréicos (outra causa) 2 2
Jaguatirica ICD confirmada 1 1
Lobo-guará Diarréicos (outra causa) 1 1
Seres humanos ICD confirmada 13 13
TOTAL 54

A concentração inibitória mínima equino, hemina e vitamina K (CLSI,

(CIM) foi determinada pelo método da
diluição seriada em ágar, como
recomendado pelo Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI,
2011). Testou-se os seguintes
antimicrobianos: penicilina, florfenicol,
oxitetraciclina, eritromicina,
vancomicina, metronidazol e tilosina.
Para o controle do teste, foi utilizada
uma amostra de referência de
Bacteroides fragilis (ATCC 25285).
Para todos os antimicrobianos, foram
testadas as concentrações 0,25; 0,5;
1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0; 32,0; 64,0;
128,0; 256,0 µg/mL, em ágar Brucella
(Difco Laboratories, EUA)
suplementado com 5% de sangue
2011).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados da CIM obtidos
para as 54 estirpes de C. difficile
trabalhadas podem ser encontrados na
tabela 9. Todas as estirpes foram
sensíveis ao metronidazol e à
vancomicina. A susceptibilidade ao
florfenicol e à oxitetraciclina foi de
96,3% e 81,5 respectivamente. Cinco
(9,3%), cinco (9,3%), 14 (25,9%) e 20
(37,0%) estirpes foram resistentes a
oxitetraciclina, penicilina, tilosina e
eritromicina, respectivamente.

Tabela 9: Concentração inibitória mínima (CIM) em µg/ml classificação quanto a

susceptibilidade antimicrobiana de 54 estirpes de Clostridium difficile isoladas de fezes de seres
humanos e animais.
Número de estirpes e CIM (µg/ml) Classificação (%)
Antimicrobiano
0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 >256 S1 SM2 R3
Metronidazol 20 30 3 1 100 0 0
Vancomicina 28 19 7 100 0 0
Florfenicol 10 42 2 96,3 3,7 0
Oxitetraciclina 34 7 2 6 5 79,6 11,1 9,3
Penicilina 3 24 22 5 50,0 40,7 9,3
Tilosina 7 29 1 1 1 1 3 11 72.2 1.9 25.9
Eritromicina 13 10 7 4 2 2 4 12 63,0 0 37,0
Legenda: 1S: susceptível, 2SM: susceptibilidade moderada. R3 resistente (R). Classificação de acordo
com o CLSI (2011); European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST, 2011).

Todas as estirpes de C. difficile antimicrobianos comumente utilizados

avaliadas foram sensíveis ao para o tratamento de ICD em seres
metronidazol e à vancomicina, humanos, equinos e cães (Båverud et

90
al., 2002; Marks e Kather, 2003;
Båverud, 2004; Spigaglia et al 2011;
Silva et al., 2013c). Este resultado é
similar ao relatado em estudos
anteriores em diversas espécies de
animais domésticos (Båverud et al.,
2003; Marks e Kather, 2003; Post e
Songer, 2004; Fry et al., 2012) sendo
que, até o momento, estirpes resistentes
ao metronidazol só foram encontradas
em equinos nos EUA (Jang et al., 1997;
Magdesian et al., 2006). De forma
semelhante ao que ocorre em animais,
estirpes de C. difficile isoladas de seres
humanos resistentes ao metronidazol
são incomuns (Shah et al., 2010;
Spigaglia et al., 2011).
Isolados de C. difficile resistentes à
vancomicina são extremamente raros,
tanto em estirpes isoladas de animais
quanto de pacientes humanos. Além
disso, a vancomicina é considerada
clinicamente mais efetiva e sabidamente
leva a menos casos de reincidiva no
tratamento de ICD em seres humanos
(Shah et al., 2010), considerada a
melhor opção por muitos clínicos. Além
do presente estudo, no Brasil existe
apenas um trabalho que avaliou a
susceptibilidade antimicrobiana de seis
estirpes de C. difficile isoladas de seres
humanos com CDI onde todos os
isolados foram sensíveis ao
metronidazol e vancomicina
(Balassiano et al., 2009).
Nenhuma estirpe foi resistente ao
florfenicol, enquanto cinco isolados
(9,3%), sendo dois de suínos, dois de
seres humanos e um de jaguatirica,
foram resistentes à oxitetraciclina. Em
geral, uma grande variação nos valores
de CIM para as tetraciclinas é relatada
em estudos com estirpes de C. difficile
isoladas de suínos e seres humanos,
mas, em geral, quase todos os isolados
são sensíveis (Delmeé e Avesani, 1988;
Post e Songer 2004; Shah et al., 2010).
Comumente, a resistência a essa classe
de antimicrobianos é associada com a
presença de genes do grupo tet,
especialmente tetM (Huang et al.,
2009). A alta susceptibilidade de C.
difficile às tetraciclinas difere de outras
espécies de Clostridium, especialmente
C. perfringens, sendo a resistência à
tetraciclina um evento comum nessa
espécie (Slavić et al., 2011).
As cinco estirpes resistentes à penicilina
foram isoladas de três potros, todos com
diagnóstico confirmado de ICD, e de
dois leitões. É interessante observar que
em dois desses potros, a diarreia por C.
difficile iniciou-se após administração
de penicilina G devido a uma suspeita
clínica de pneumonia (Silva et al.,
2012). Esse resultado corrobora com o
descrito por Båverud (2002), que
relatou que beta-lactâmicos são
comumente associados a ocorrência de
ICD em potros e equinos adultos. Em
contraste com relatos em outros países
(Huang et al., 2009; Shah et al., 2010),
nenhum isolado de seres humanos
apresentou resistência à penicilina no
presente trabalho, sendo que apenas
uma das 13 amostras testadas (7,7%)
apresentou susceptibilidade moderada a
esse composto.
Os macrolídeos testados, tilosina e
eritromicina, foram os antimicrobianos
que apresentaram maior número de
estirpes resistentes. A detecção de
resistência de C. difficile a estes
compostos já foi anteriomente relatada
em estirpes de várias origens, incluindo
isolados de equinos (Båverud et al.,
2003) e seres humanos (Delmée e
Avesani, 1988; Spigaglia et al., 2011).
No presente estudo, das 20 (37%)
estirpes resistentes a eritromicina, dez
(18,5%) eram de leitões, quatro (7,4%)
de cães, três (5,6%) de humanos, duas
(3,7%) de equinos e uma (1,9%) de
bezerro. Destas, 16 (80%) apresentaram
CIM maior ou igual a 256,0 µg/µL. Em
seres humanos, alguns macrolídeos são
91
listados como antimicrobianos
comumente envolvidos em casos de
ICD (Zilberberg e Shorr, 2013).
Infelizmente, existem poucos trabalhos
na literatura com estirpes de animais,
porém a eritromicina já foi relatada
como uma importante causadora de
colite em éguas (Båverud, 2002). É
interessante notar que a ocorrência de
estirpes de C. difficile isoladas de seres
humanos resistentes à eritromicina
parece variar muito entre países, com
relatos de variando de 87% de isolados
resistentes na Inglaterra a 0% na Suíca
(Huang et al., 2009).
O comportamento bimodal apresentado
pelos isolados frente à eritromicina
sugere a presença de algum fator
genético de resistência. De fato, estudos
demonstram que a resistência de
estirpes do gênero Clostridium a esse
antimicrobiano tem relação
principalmente com a presença de genes
do grupo erm (erythromycin ribosomal
methylase), responsáveis pela
codificação de uma metilase que inibe a
ação da eritromicina (Slavić et al.,
2011). Estudos pesquisando a presença
de genes de resistência a oxitetraciclina na alimentação dos
antimicrobianos são raros em estirpes
de C. difficile isoladas de animais.
Recentemente Fry et al. (2012)
relataram uma alta correlação entre a
resistência à eritromicina e a presença
do gene ermB em estirpes de C. difficile
isoladas de suínos, confirmando essa
hipótese. É importante citar, porém, que
nem todas as estirpes com alta
resistência à eritromicina apresentam
genes do grupo erm, sugerindo a
existência de outros mecanismos
envolvidos ainda desconhecidos (Huang
et al., 2009).
Alguns trabalhos relatam uma alta
susceptibilidade de estirpes de C.
difficile à tilosina, sugerindo que esse
antimicrobiano poderia ser usado na
alimentação de suínos com o objetivo
de diminuir a eliminação de C. difficile
nas fezes dos animais (Post e Songer,
2004; Songer e Anderson, 2006). Em
contraste, no presente estudo, 14
estirpes (25,9%) foram resistentes à
tilosina, oito delas isoladas de leitões.
Além dessas, três isoladoss de cães, dois
de humanos e um de bovino foram
resistentes a esse macrolídeo, sugerindo
que esse antimicrobiano não seria
efetivo para a profilaxia, controle e
tratamento da ICD nas espécies
avaliadas no presente trabalho.
É interessante citar que a tilosina é um
antimicrobiano comumente utilizado na
suinocultura brasileira, sendo que todas
as estirpes incluídas no presente estudo
foram originárias de granjas que
relataram o uso desse antimicrobiano
em alguma fase de vida dos animais.
Diferentemente, a oxitetraciclina é um
composto cuja adição na alimentação
animal é proibida no Brasil desde 1998
(Brasil, 1998). Duas das amostras
resistentes à oxitetraciclina foram
isoladas de dois leitões de uma mesma
granja, ambos com CDI. Na granja em
questão, o proprietário relatou o uso de
animais, apesar da proibição.
Seis estirpes (11,1%) foram
consideradas multirresistentes por
apresentarem elevada CIM
simultaneamente a três antimicrobianos
(tilosina, eritromicina e oxitetraciclina),
sendo cinco amostras provenientes de
suínos e uma de ser humano. Uma
dessas estirpes, isolada de um leitão
com ICD, apresentou ainda resistência a
penicilina. A detecção de C. difficile
multirresistentes de animais chama a
atenção no presente estudo. Sabe-se que
a antibioticoterapia possui um papel
central no desenvolvimento de ICD,
sendo que o risco aumenta
consideravelmente quando C. difficile é
resistente ao antimicrobiano utilizado
(Owens et al., 2008). Somando este
92
aspecto à hipótese da ICD como REFERÊNCIAS
possível zoonose, o presente estudo
aponta para a necessidade do uso BALASSIANO, I.T.; MIRANDA,
racional de antimicrobianos, K.R.; BOENTE, R.F.; et al.
especialmente na suinocultura. Além Characterization of Clostridium difficile
disso, são necessários mais estudos que strains isolated from immunosuppressed
busquem métodos alternativos para a inpatients in a hospital in Rio de
profilaxia, controle e tratamento da ICD Janeiro, Brazil. Anaerobe, v.15, n.3, p.
em animais domésticos, o que poderia 61-64, 2009.
diminuir a necessidade de utilização de
antimicrobianos nestas espécies. BÅVERUD, V. Clostridium difficile
Resultados de susceptibilidade diarrhea: infection control in horses. Vet
antimicrobiana devem ser interpretados Clinic North Am Eq Pract, v.20, n.3,
com cautela uma vez que resultados in p.615-630, 2004.
vitro nem sempre refletem o
comportamento in vivo da droga BÅVERUD, V. Clostridium difficile
avaliada. Além disso, estudos infections in animals with special
demonstraram que a maioria dos reference to the horse. A review. Vet Q
isolados de C. difficile de casos de ICD Journal, v.24, 203-219, 2002.
induzida por antibióticos em seres
humanos eram sensíveis in vitro a droga BÅVERUD, V.; GUSTAFSSON, A.;
empregada (Dzink e Bartlett 1980), FRANKLIN, A. et al. Clostridium
sugerindo que o sucesso do tratamento é difficile: prevalence in horses and
dependente não apenas da environment, and antimicrobial
susceptibilidade de C. difficile ao susceptibility. Equine Vet J, v.35, n.5.
antimicrobiano, mas também de outros p.465-71, 2003.
fatores relativos a microbiota (Båverud
et al., 2003). De qualquer forma, como BOJESEN, A.M.; OLSEN, K.E.;
não é relizado rotineiramente, a BERTELSEN, M.F. Fatal enterocolitis
avaliação da susceptibilidade in Asian elephants (Elephas maximus)
antimicrobiana de estirpes de C. difficile caused by Clostridium difficile. Vet
isoladas de seres humanos e animais, Microbiol, v. 116, n.4, p.329-35, 2006.
incluindo duas estirpes isoladas de
animais silvestres, pode ser útil para o BRASIL, MINISTÉRIO DA
tratamento das desordens entéricas AGRICULTURA E DA REFORMA
causadas pelo agente. Este é o primeiro AGRÁRIA, PORTARIA N.º 193, DE
trabalho a avaliar a susceptibilidade 12 DE MAIO DE 1998.
antimicrobiana de estirpes de C. difficile <http://www3.servicos.ms.gov.br/iagro_
de animais no Brasil. A próxima etapa ged/pdf/610_GED.pdf> Acesso em
do presente estudo é realizar a 23/03/2013.
ribotipagem e avaliar a presença de
genes de resistência das estirpes aqui CLSI - Clinical and Laboratory
utilizadas. Standards Institute. Performance
standards for Antimicrobial
AGRADECIMENTOS Suceptibility Test. Twenty-first
Information Supplement v.31, n.1,
CNPq, Fapemig, CAPES, INCT e January, 2011.
PRPq-UFMG.
DELMÉE, M.; AVESANI, V.
Correlation between serogroup and

93
susceptibility to chloramphenicol,
clindamycin, erythromycin, rifampicin
and tetracycline among 308 isolates of
Clostridium difficile. J Antimicrob
Chemother, v.22, p.325-31, 1988.
DZINK, J.; BARTLETT, J.G. In vitro
susceptibility of Clostridium difficile
isolates from patients with antibiotic-
associated diarrhea or colitis.
Antimicrob Agents Chemother, v.17,
p.695-8, 1980.
EUCAST - European Committee on
Antimicrobial Susceptibility Testing
(2011). Breakpoint tables for
interpretation of MICs and zone
diameters. v.3.1, 2011.
FRY, P.R.; THAKUR, S.; ABLEY, M;
et al. Antimicrobial resistance,
toxinotype, and genotypic profiling of
Clostridium difficile isolates of swine
origin. J Clin Microbiol. v.50, n.7,
p.2366-72, 2012.
HOPMAN, N.E.; KEESSEN, E.C.;
HARMANUS, C. et al. Acquisition of
Clostridium difficile by piglets. Vet
Microbiol, v.149, n.1, p.186-192, 2011.
HUANG, H.; WEINTRAUB, A.;
FANG, H, et al. Antimicrobial
resistance in Clostridium difficile. Int J
Antimicrob Agents. v.34, n.6, p.516-22,
2009.
JANG, S.S.; HANSEN, L.M.;
BREHER, JE. et al. Antimicrobial
susceptibilities of equine isolates of
Clostridium difficile and molecular
characterization of metronidazole-
resistant strains. Clin Infect Dis, v.25,
S266-7, 1997.
JHUNG, M.A.; THOMPSON, A.D.;
KILLGORE, G.E. et al. Toxinotype V
Clostridium difficile in humans and
food animals. Emerg Infect Dis, v.14,
n.7, p.1039-1045, 2008.
MAGDESIAN, K.G.; DUJOWICH, M.;
MADIGAN, JE. et al. Molecular
characterization of Clostridium difficile
isolates from horses in an intensive care
unit and association of disease severity
with strain type. J Am Vet Med Assoc,
v.228, p.751-5, 2006.
MARKS, S.L.; KATHER, E.J.
Antimicrobial susceptibilities of canine
Clostridium difficile and Clostridium
perfringens isolates to commonly
utilized antimicrobial drugs. Vet
Microbiol, v.94, p.39-45, 2003.
NORMAN, K.N.; SCOTT, H.M.;
HARVEY, R.B. et al. Prevalence and
genotypic characteristics of Clostridium
difficile in a closed and integrated
human and swine population. App
Environ Microbiol, v.77, n.16, p.5755-
5760, 2011.
OWENS, R.C. JR.; DONSKEY, C.J.;
GAYNES, R.P. Antimicrobial-
associated risk factors for Clostridium
difficile infection. Clin Infect Dis, v.15,
p.S19-31, 2008.
POST, K.W.; SONGER, J.G.
Antimicrobial susceptibility of
Clostridium difficile isolated from
neonatal pigs with enteritis. Anaerobe.
v.10, p.47-50, 2004.
SHAH, D.; DANG, M.D.; HASBUN,
R. et al. Clostridium difficile infection:
update on emerging antibiotic treatment
options and antibiotic resistance. Expert
Rev Anti Infect Ther, v.5, p.555-64,
2010.
SILVA JÚNIOR M. Recent changes in
Clostridium difficile infection. Einstein,
v.10, n.1, p.105-9, 2012.
SILVA, R.O.S.; D'ELIA, M.L.;
SOUZA, D.F.M. et al. Clostridium
difficile-associated diarrhea in an ocelot
94
(Leopardus pardalis). Anaerobe, v.20,
p.82-4. 2013a.
SILVA, R.O.S.; MOREIRA, F.M.;
REZENDE, J.V. et al. First confirmed
case of Clostridium difficile-associated
diarrhea in foals in Brazil. Ciência
Rural, v.42, n.3, p. 498-500, 2012.
SILVA, R.O.S.; RIBEIRO, M.G.;
PALHARES, M.S. et al. Detection of
A/B toxin and isolation of Clostridium
difficile and Clostridium perfringens
from foals. Eq Vet J, 2013c.
SILVA, R.O.S.; GUEDES, R.M.C.;
LOBATO, F.C.F. Clostridium difficile
infection: main features and occurrence
in domestic species in Brazil. Ciência
Rural, v.43, n.1, p.73-80, 2013b.
SLAVIĆ, D.; BOERLIN, P.; FABRI,
M. et al. Antimicrobial susceptibility of
Clostridium perfringens isolates of
bovine, chicken, porcine, and turkey
origin from Ontario. Can J Vet Res,
v.75, p.89–97, 2011.
SONGER, J.G.; TRINH, H.T.; DIAL,
S.M. et al. Equine colitis X associated
with infection by Clostridium difficile
NAP1/027. J Vet Diagn Invest, v.21,
n.3, p.377-380, 2009.
SONGER, J.G.; ANDERSON, M.A.
Clostridium difficile: an important
pathogen of food animals. Anaerobe,
v.12, n.1, p.1-4, 2006.
SPIGAGLIA, P.; BARBANTI, F.;
MASTRANTONIO, P. et al. European
Study Group on Clostridium difficile
(ESGCD). Multidrug resistance in
European Clostridium difficile clinical
isolates. J Antimicrob Chemother, v.66,
p.2227-34, 2011.
ZILBERBERG, M.D.; SHORR, A.F.
Preventing Clostridium difficile
infection in the intensive care unit. Crit
Care Clin, v.29, p.11-18, 2013.
95
5.8 Ribotipagem de estirpes de Clostridium difficile isoladas de seres humanos e
animais no Brasil.

RESUMO

Apesar da reconhecida importância de Clostridium difficile em seres humanos e

animais, estudos de ribotipagem do agente no Brasil são escassos e restritos a poucas
estirpes isoladas de seres humanos. O objetivo do estudo foi avaliar os ribotipos das
amostras de C. difficile isoladas de seres humanos e animais no Brasil. Foram utilizadas
38 estirpes de C. difficile isoladas de seres humanos hospitalizados (n=13), cães (n=8),
leitões (n=6), potros (n=5), bezerros (n=5) e jaguatirica (n=1). A ribotipagem foi
realizada por PCR utilizando dois pares de iniciadores para a região espaçadora
intergénica 16S-23S. O produto da PCR foi concentrado e submetido a eletroforese em
gel de agarose a 3%. Os ribotipos encontrados foram comparados com a biblioteca de
estirpes do Institute of Public Health Maribor (Eslovênia). Foram encontrados 13
ribotipos diferentes, sendo os ribotipos SLO 064, 014/20 e 106 os mais comuns,
correspondendo por 11 (28,9%), nove (23,7%) e seis (15,8%) amostras respectivamente.
Nove ribotipos diferentes foram detectados entre os isolados de seres humanos, sendo
três inéditos e cinco encontrados em ao menos uma espécie animal. Este estudo revela
uma grande diversidade de ribotipos em isolados de C. difficile de seres humanos e
animais no Brasil e reforça a necessidade de mais estudos para confirmar a hipótese de
C. difficile como agente zoonótico.

Palavras-chave: diarréia nosocomial, zoonose.

INTRODUÇÃO Europa, porém trabalhos de tipagem de

Clostridium difficile é um patógeno
emergente responsável pela maioria dos
casos de diarréia nosocomial e colite
pseudomembranosa em humanos
(Balassiano et al., 2011). Em animais, a
infecção é comum em suínos e equinos,
ocorrendo também em cães, bovinos e
espécies silvestres (Bartlett, 2009).
Trabalhos com seres humanos têm
relatado aumento da morbidade e
mortalidade da doença, assim como
maior resistência ao tratamento
antimicrobiano convencional e (Rodriguez-Palácios et al., 2007; Songer
ocorrência da doença em seres humanos
saudáveis, sem prévia exposição a
ambiente hospitalar (Gellad et al., 2007;
Samie et al., 2008).
Acredita-se que o aumento do número
de casos registrados deve-se ao
surgimento de estirpes altamente
virulentas de C. difficile nos EUA e
isolados de C. difficile são escassos em
toda a América Latina (Balassiano et
al., 2012), impedindo o conhecimento
das estirpes circulantes em seres
humanos e animais nessa região.
Concomitante ao aumento dos casos e
da gravidade das infecções por C.
difficile, estudos demonstraram a
presença de ribotipos semelhantes em
amostras animais e de seres humanos
com colite pseudomembranosa,
sugerindo uma possível transmissão do
agente entre homem e animais
et al., 2009).
Apesar da reconhecida importância do
agente em todo o mundo, estudos de
ribotipagem de C. difficile no Brasil são
escassos e restritos a poucas estirpes
isoladas de seres humanos (Balassiano
et al., 2012), permanecendo a dúvida
com relação aos ribotipos que circulam

96
em nosso meio. Dessa forma, o objetivo
deste estudo foi avaliar os ribotipos das
amostras de C. difficile isoladas de seres
humanos e animais no Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS
Estirpes
Foram utilizadas 38 estirpes de C.
difficile isoladas de seres humanos
(n=13), cães (n=8), leitões (n=6), potros
(n=5), bezerros (n=5) e jaguatirica
(n=1). Todas as estirpes pertencem a
bacterioteca de isolados do Laboratório
de Bacteriose e Pesquisa da Escola de
Veterinária da UFMG.
Ribotipagem
A ribotipagem foi realizada como
preconizado por Bidet et al. (1999). Os
liofilizados foram reconstituídos em
caldo BHI (Brain Heart Infusion, Difco
Laboratories, EUA) e incubados em
tubo rosca por 48 horas a 37°C em
ambiente de anaerobiose. Para obtenção
de colônias isoladas, as estirpes foram
plaqueadas em ágar BHI (Difco
Laboratories, EUA) suplementando com
5% de sangue equino, e incubadas a
37°C em anaerobiose por 48 horas.
Uma colônia de cada estirpe foi
adicionada a 100 µl de água ultrapura e
fervida por 12 minutos. Após
centrifugação a 15.000 x g por 10
minutos, 5 µl do sobrenadante foram
utilizados como molde para uma PCR
de 50 µl PCR contendo 1 µM de
primers 5´-
CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGG-
3´ e 5´-
GCGCCCTTTGTAGCTTGACC-3´, 2
U de taq polimerase (Pharmacia, União
Britânica), 2.25 mM MgCl2. O mix foi
submetido a 35 ciclos de desnaturação a
94°C por 1 min, anelamento a 55°C por
1 min e extensão a 72°C for 2 min
(Stubbs et al., 1999).
Após a reação, o produto foi
concentrado para um volume final de
aproximadamente 25 µl por
aquecimento a 75°C por 105 min e
então submetido a eletroforese por 6
horas a 8°C com 150 mA e em gel de
agarose a 3%. Para facilitar a leitura, o
marcador de peso molecular foi
adicionado a cada cinco canaletas de
amostras (100 bp; Advanced
Biotechnologies, Epsom, União
Britânica). As bandas resultantes foram
observadas após coração com brometo
de etídio por 20 min (0.5 µg/µl) e
comparadas com a biblioteca de
ribotipos do Institute of Public Health
Maribor (Maribor, Eslovênia) por meio
do software Bionumerics (Applied
Maths NV, Bélgica).
RESULTADOS
Foram encontrados 13 ribotipos
diferentes, sendo os ribotipos SLO 064,
014/020 e 106 os mais comuns,
correspondendo por 11 (28,9%), nove
(23,7%) e seis (15,8%) amostras
respectivamente (tabela 10). Nove
ribotipos diferentes foram detectados
entre os isolados de seres humanos, três
deles desconhecidos até então. Cinco
ribotipos encontrados em seres humanos
foram também isolados em pelo menos
em uma espécie animal.
97
Tabela 10: Ribotipos, hospedeiro e histórico de estirpes de Clostridium difficile isoladas de
seres humanos e animais no Brasil.

Ribotipo Espécie (n° de isolados) Histórico Clínico

SLO 199* Humano (1) ICD
SLO 197* Humano (1) ICD
SLO 198* Humano (1) ICD
Leitão (1) Não diarréico
001/072
Humano (1) ICD
011/049 Leitão (1) Diarréia ND
Leitão (2) ICD
Cão (1) Não diarréico
Leitão (1) Não diarréico
014/020 Humano (1) ICD
Potro (1) ICD
Cão (1) ICD
Humano (2) Diarréia ND
046 Jaguatirica (1) ICD
Cão (2) Não diarréico
Humano (1) Diarréia ND
SLO 064 Bezerro (5) Diarréia ND
Cão (2) Diarréia ND
Potro (1) Diarréia ND
078 Potro (2) ICD
Cão (1) Não diarréico
106 Humano (4) ICD
Cão (1) Diarréia ND
126 Leitão (1) Não diarréico
Potro (1) Diarréia ND
SLO 147
Humano (1) ICD
Legenda: ICD – Infecção por C. difficile confirmada por detecção das toxinas A/B; Diarréia ND –
Diarréia por causa diferente de C. difficile. * - Novo ribotipo.

DISCUSSÃO outros países (Keel et al., 2007;

Estudos de ribotipagem de C. difficile
no Brasil são escassos e restritos a
estirpes isoladas de seres humanos
(Balassiano et al., 2012). O presente
estudo permite, pela primeira vez, a
avaliação da similaridade entre as cepas
isoladas de seres humanos e de animais
no Brasil, além de revelar os ribotipos
circulantes em nosso meio.
Em contraste com o relatado em estudos
anteriores no Brasil (Balassiano et al.,
2010; Balassiano et al., 2011), os
ribotipos 010, 038, 133, 135 e 233 não
foram encontrados. Em conjunto, tais
resultados sugerem uma alta diversidade
de ribotipos em seres humanos e
animais no país, similar a relatos em
Avbersek et al., 2009; Janezic et al.,
2012; Rodriguez et al., 2012). Por outro
lado, a prevalência de cada ribotipos
parece variar em diferentes regiões
geográficas. O perfil brasileiro de
ribotipos de C. difficile parece diferir
dos relatos de países no hemisfério
norte, com a ausência ou menor dos
ribotipos 002, 078, 027, 015, 066
(Avbersek et al., 2009; Hopman et al.,
2011; Janezic et al. 2012; Rodriguez et
al., 2012). Resultados semelhantes
foram relatados recentemente na
Austrália (Knight et al., 2013) e,
novamente, demonstram a necessidade
de estudos regionais para o melhor
entedimento da epidemiologia da
infecção por C. difficile.

98
Dos nove ribotipos encontrados em
seres humanos, cinco também foram
encontrados em alguma espécie animal
como canina, suína, bovina e equina.
Dessa forma, o presente relato reacende
a discussão com relação ao potencial
zoonótico de C. difficile, como relatado
em trabalhos anteriores (Rodriguez-
Palácios et al., 2007; Songer et al.,
2009; Janezic et al., 2012; Schneeberg
et al., 2012). Mais estudos são
necessários para avaliar tal hipótese e,
se confirmada, a prevenção da doença e
até mesmo da colonização em animais
domésticos poderá passar a ser uma
prioridade (Songer, 2010).
O ribotipo isolado com maior
frequência foi o SLO 064, também
conhecido como 53-like, tendo sido
encontrado em 11 (28,9%) estirpes entre
isolados de seres humanos, bovinos,
cães e potros. Todas as amostras de
bezerros isoladas pertenciam ainda ao
ribotipo SLO 064, demonstrando uma
baixa diversidade de isolados dessa
espécie se comparado com as demais
espécies avaliadas ou com estudos
anteriores com estirpes de bovinos
(Janezic et al., 2012; Zidaric et al.,
2012; Knight et al., 2013).
Ressalta-se que todas as estirpes não
toxigênicas submetidas a ribotipagem
pertenciam ao ribotipo SLO 064, o que
sugere uma grande capacidade de
colonização de diferentes espécies,
incluindo seres humanos. Outros
trabalhos também relataram a detecção
de estirpes do ribotipo SLO 064 em
diferentes espécies, reforçando tal
hipótese (Zidaric et al., 2010; Janezic et
al., 2012). Estudos têm demonstrado
que a colonização por estirpes não
toxigênica é capaz de prevenir a diarréia
por C. difficile em seres humanos e
suínos, tendo potencial como um
produto para profilaxia da doença
(Sambol et al., 2002; Songer et al.,
2007; Villano et al., 2012). Dessa
forma, considerando que as estirpes do
ribotipo SLO 064 possuem alta
capacidade de colonizar diferentes
espécies, esta pode ser o foco de estudos
futuros sobre a prevenção da doença
pela colonização com estirpes não-
toxigênicas.
O ribotipo 078 tem chamado a atenção
de pesquisadores pelo aumento de sua
frequência em casos em seres humanos,
especialmente nos EUA e Europa, e por
estar relacionado a casos de maior
severidade da doença (Goorhuis et al.,
2008; Walk et al., 2012). No Brasil,
porém, tal ribotipo ainda não foi
encontrado em seres humanos. Além
disso, estudos no EUA relatam ainda o
ribotipo 078 como o mais prevalente em
bovinos e suínos (Keel et al., 2007;
Zidaric et al. 2012; Rodriguez et al.
2012), contrastando novamente com os
resultados encontrados no presente
estudo onde apenas duas estirpes
isoladas de animais foram caraterizadas
como 078, ambas de potros com
diarréia por C. difficile.
Até 2009, o ribotipo 106 havia sido
relatado apenas na Reino Unido, quando
então Balassiano et al. (2009) relataram
o isolamento desse ribotipo no Brasil
em seres humanos com diarréia por C.
difficile. Neste estudo, o ribotipo 106 foi
novamente isolado em seres humanos e
de dois cães. O ribotipo 014/020,
também previamente relatado em seres
humanos no Brasil (Balassiano et al.,
2011), foi novamente detectado em três
pacientes com diarréia, sendo um deles
com infecção por C. difficile confirmada
por detecção das toxinas A/B. Além
disso, estirpes caracterizadas como
014/020 foram encontradas ainda em
três suínos, dois cães e em um potro,
sugerindo uma alta frequência e
disseminação desse ribotipo. É
importante salientar que o ribotipo
014/020 é considerado o principal
causador de ICD na comunidade
99
européia (Bauer et al., 2011), tendo sido
relatado ainda em animais na
Alemanha, Holanda e Eslovênia
(Schneeberg et al., 2012; Koene et al.,
2011; Janezic et al., 2012).
Nos últimos anos, diversos países têm
relatado o surgimento de estirpes
altamente virulentas de C. difficile,
destacando-se ribotipo 027 (Barbut e
Rupnik, 2012). O isolamento tem sido
relacionado a surtos graves, sobretudo
em países desenvolvidos, com uma
frequência de isolamento de 8 e 36%
nos EUA e na Europa, respectivamente
(Cheknis et al., 2009). Neste estudo não
foram encontradas estirpes do ribotipo
027, sendo que, até o momento, na
AGRADECIMENTOS
CNPq, Fapemig, CAPES (Bolsa
doutorado sanduíche, PDSE-18983/12-
0), PRPq-UFMG e INCT-Pecuária. Prof
Anders Miki Bojesen (Copenhagen
University, Dinamarca) e a Prof Maja
Rupnik (Institute of Public Health
Maribor, Eslovênia) pelo auxílio na
realização da ribotipagem e
interpretação dos resultados.
REFERÊNCIAS
AVBERSEK, J.; JANEZIC, S.; PATE,
M. et al. Diversity of Clostridium
difficile in pigs and other animals in
Slovenia. Anaerobe, v.15, n.6, p.252-5,
2009.
BALASSIANO, I.T.; DOS SANTOS-
FILHO, J.; DE OLIVEIRA, M.P. et al.
An outbreak case of
Clostridium difficile-associated diarrhea
among elderly inpatients of an intensive
care unit of a tertiary hospital in Rio de
Janeiro, Brazil. Diagn Microbiol Infect
Dis., v.68, n.4, p.449-55, 2010.
BALASSIANO, I.T.; DOS SANTOS-
FILHO, J.; VITAL-BRAZIL, J.M. et al.
Detection of cross-infection associated
America Latina tal estirpe foi relata
apenas na Costa Rica e no Chile
(Balassiano et al., 2012; Hernández-
Rocha et a., 2012).
O presente estudo revela uma grande
diversidade de ribotipos em isolados de
C. difficile de seres humanos e animais
no Brasil, com presença de ribotipos
comuns entre seres humanos e animais.
Mais estudos são indicados para
confirmar a importância dos animais
domésticos como reservatórios de
estirpes de C. difficile para seres
humanos.
to a Brazilian PCR-ribotype of
Clostridium difficile in a university
hospital in Rio de Janeiro, Brazil.
Antonie Van Leeuwenhoek, v.99, n.2,
p.249-55, 2011.
BALASSIANO, I.T.; MIRANDA,
K.R.; BOENTE, R.F. et al.
Characterization of
Clostridium difficile strains isolated
from immunosuppressed inpatients in a
hospital in Rio de Janeiro, Brazil.
Anaerobe, v.15, n.3, p. 61-64, 2009.
BALASSIANO, I.T.; YATES, E.A.;
DOMINGUES, R.M. et al.
Clostridium difficile: a problem of
concern in developed countries and still
a mystery in Latin America. J Med
Microbiol, v.61, n.2, p.169-79, 2012.
BARBUT, F.; RUPNIK, M. Editorial
commentary: 027, 078, and others:
going beyond the numbers (and away
from the hypervirulence). Clin Infect
Dis, v.55, p.1669-72, 2012.
BARTLETT, J.G.
Clostridium difficile infection: historic
review. Anaerobe, v.15, n.6, p.227-9,
2009.
100
BAUER, M.P.; NOTERMANS, D.W.;
VAN BENTHEM, B.H. et al.
Clostridium difficile infection in
Europe: a hospital-based survey.
Lancet, v.377, p.63-73.
BIDET, P.; BARBUT, F.; LALANDE,
V. et al. Development of a new PCR-
ribotyping method for Clostridium
difficile based on ribosomal RNA gene
sequencing. FEMS Microbiol Lett.,
v.176, n.2, p.261-6, 1999.
GELLAD, Z.F.; JOHNSON, J.L.;
MUIR, A.J. et al. Severity of
Clostridium difficile-associated diarrhea
in solid organ transplant patients.
Transpl Infect Dis., v.9, n.4, p.276-280,
2007.
GOORHUIS, A.; DEBAST, S.B.; VAN
LEENGOED, L.A. et al. Clostridium
difficile PCR ribotype 078: an emerging
strain in humans and in pigs? J Clin
Microbiol., v.46, p.1157, 2008.
HERNÁNDEZ-ROCHA, C.; BARRA-
CARRASCO, J.; PIZARRO-
GUAJARDO, M. et al. Epidemic
Clostridium difficile ribotype 027 in
Chile. Emerg Infect Dis, v.18, p.1370-2,
2012.
HOPMAN NE, OORBURG D,
SANDERS I. et al. High occurrence of
various Clostridium difficile PCR
ribotypes in pigs arriving at the
slaughterhouse. Vet Q, v.31, p.179-81,
2011.
JANEZIC, S.; OCEPEK, M.;
ZIDARIC, V. et al. Clostridium difficile
genotypes other than ribotype 078 that
are prevalent among human, animal and
environmental isolates. BMC
Microbiol, v.12, p.48, 2012 2012.
KEEL, K.; BRAZIER, J.S.; POST,
K.W. Prevalence of PCR ribotypes
among Clostridium difficile isolates
from pigs, calves, and other species. J
Clin Microbiol., v.45, n.6, p.1963-4,
2007.
KNIGHT, D.R.; THEAN, S.;
PUTSATHIT, P. et al. Cross-sectional
study reveals high prevalence of
Clostridium difficile non-PCR ribotype
078 strains in australian veal calves at
slaughter. Appl Environ Microbiol.,
v.79, p.2630-5, 2013.
KOENE, M.G.; MEVIUS, D.;
WAGENAAR, J.A. et al. Clostridium
difficile in Dutch animals: their
presence, characteristics and similarities
with human isolates. Clin Microbiol
Infect, v.18, p. 778-784, 2011.
RODRIGUEZ, C.; TAMINIAU, B.;
VAN BROECK, J. et al. Clostridium
difficile in young farm animals and
slaughter animals in Belgium.
Anaerobe, v.18, p.621-625, 2012
RODRIGUEZ-PALACIOS, A.;
STAEMPFLI, H.R.; DUFFIELD, T. et
al. Clostridium difficile in retail ground
meat, Canada. Emerg Infect Dis J.,
v.13, n.3, p.485-487, 2007.
SAMBOL, S. P. et al. Colonization for
the Prevention of Clostridium difficile
Disease in Hamsters. The Journal of
Infectious Diseases; 186: 1781–1789,
2002
SAMIE, A.; OBI, C.L.; FRANASIAK,
J. et al. PCR detection of Clostridium
difficile triose phosphate isomerase
(tpi), toxin A (tcdA), toxin B (tcdB),
binary toxin (cdtA, cdtB), and tcdC
genes in Vhembe District, South Africa.
Am J Trop Med Hyg, v.78, n.4, p.577-
585, 2008.
SCHNEEBERG, A.; RUPNIK, M.;
NEUBAUER, H. et al. Prevalence and
distribution of Clostridium difficile PCR
ribotypes in cats and dogs from animal
101
shelters in Thuringia, Germany.
Anaerobe, v.18, p.484-488, 2012.
SONGER, J.G.; JONES, R.;
ANDERSON, M.A. et al. Prevention of
porcine Clostridium difficile-associated
disease by competitive exclusion with
nontoxigenic organisms. Vet Microbiol.,
v.124, n.4, p.358-361, 2007.
SONGER, J.G.; TRINH, H.T.;
KILLGORE, G.E. et al. Clostridium
difficile in retail meat products, USA,
2007. Emerg Infect Dis, v.15, n.5,
p.819-821, 2009.
SONGER, J.G. Clostridia as agents of
zoonotic disease. Vet Microbiol, v.140,
p.399-404, 2010.
STUBBS, S.L.; BRAZIER, J.S.;
O'NEILL, G.L. et al. PCR targeted to
the 16S-23S rRNA gene intergenic
spacer region of Clostridium difficile
and construction of a library consisting
of 116 different PCR ribotypes. J Clin
Microbiol v.37, p.461-3, 1999.
VILLANO, S.A.; SEIBERLING, M.;
TATAROWICZ, W. et al. Evaluation of
an Oral Suspension of VP20621, Spores
of Nontoxigenic Clostridium difficile
Strain M3, in Healthy Subjects.
Antimicrob. Agents and Chemother,
v.56, p. 5224–5229, 2012.
WALK, S.T.; MICIC, D.; JAIN, R. et
al. Clostridium difficile ribotype does
not predict severe infection. Clin Infect
Dis, v.55, p.1661-8, 2012.
ZIDARIC, V.; BEIGOT, S.; LAPAJNE,
S. et al. The occurrence and high
diversity of Clostridium difficile
genotypes in rivers. Anaerobe, v.16,
p.371-5, 2010.
ZIDARIC, V.; PARDON, B.; DOS
VULTOS, T. et al. Different antibiotic
resistance and sporulation properties
within multiclonal Clostridium difficile
PCR ribotypes 078, 126, and 033 in a
single calf farm. Appl Environ
Microbiol., v.78, p.8515-8522, 2012
102
6. CAPÍTULO 3: Desenvolvimento de um modelo de infecção por Clostridium
difficile em hamsters sírios (Mesocricetus auratus).

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi padronizar um modelo de infecção por Clostridium

difficile (ICD) em hamsters sírios (Mesocricetus auratus). Para seleção dos isolados
capazes de causar letalidade, cinco animais por grupo receberam uma dose de
clindamicina (30mg/kg) por gavagem. Após 48 horas, administrou-se 107 unidades
formadoras de colônia (UFC), por animal, de quatro diferentes isolados toxigênicos de
C. difficile. Selecionou-se um dos isolados capazes de causar diarreia e letalidade e
administrou-se 4x102; 4x104; 4x106; 4x108 UFC por animal, novamente com cinco
hamsters por grupo. Em todas as diluições testadas, foi possível observar a ocorrência
de diarreia e morte. A maior concentração testada (4x108 UFC por animal) causou óbito
de 100% dos hamsters do grupo. Todos os animais que vieram a óbito apresentaram
tiflite hemorrágica, foram positivos para as toxinas A/B e foi possível isolar C. difficile
do conteúdo intestinal, confirmando a reprodução experimental da doença. A dose letal
para 50% da população foi estabelecida em 6,3x104 UFC por animal. O modelo de
indução de ICD em hamsters descrito no presente estudo passa a ser uma ferramenta
valiosa para estudos relativos a patogenia, tratamento e controle dessa doença.

Palavras-chave: Clostridium difficile, diarréia nosocomial, modelo animal, infecção

hospitalar.

INTRODUÇÃO Apesar da crescente importância de C.

Considerado um patógeno emergente,
Clostridium difficile é responsável pela
maioria dos casos de diarreia
nosocomial e colite pseudomembranosa
em seres humanos (Balassiano et al.,
2011). Em animais, a infecção por C.
difficile (ICD) foi recentemente
confirmada no Brasil em potros, cães e
descrita em uma jaguatirica criada em
cativeiro (Silva et al., 2013a; Silva et
al., 2013b; Silva et al., 2013c). Em
suínos, estudos recentes sugerem uma
grande disseminação da doença em
granjas brasileiras com elevado número
de matrizes (Lippke et al., 2011; Silva
et al., 2011), dado semelhante ao
relatado nos últimos anos em países da
Europa e nos Estados Unidos, onde a
ICD é considerada a principal causa não
controlada de diarreia em leitões
(Songer, 2010).
difficile como enteropatógeno para
animais domésticos e seres humanos,
não existem produtos imunoprofiláticos
para a doença. Em animais, somado aos
prejuízos causados pelo agente
especialmente na suinocultura e
equinocultura, pesquisas sugerem que a
infecção por C. difficile seja uma
possível zoonose (Arroyo et al., 2005;
Jhung et al., 2008). Caso essa hipótese
seja confirmada, a prevenção da doença
e até mesmo da colonização por C.
difficile no trato gastrointestinal de
animais domésticos passará a ser uma
prioridade (Silva et al., 2013d). Além
disso, desde o reconhecimento de C.
difficile como patógeno, pouco foi
mudado nos protocolo de
antibióticoterapia em seres humanos e
animais, permanecendo o metronidazol
e a vancomicina como as principais
opções (Spigaglia et al., 2011). Tais
relatos reforçam a necessidade de mais

103
estudos focando na avaliação de novos
métodos de tratamento da ICD.
Para o desenvolvimento e avaliação de
métodos de controle e tratamento da
infecção por C. difficile, faz-se
necessário a utilização de modelos
animais de indução da doença. A
principal espécie utilizada para tal são
os hamsters sírios (Mesocricetus
auratus) devido a sua alta sensibilidade
a ICD, possibilitando a indução com
diversas classes de antimicrobianos e
sem a necessidade de obtenção de
animais livres de patógenos (Best et al.,
2012). Porém, a maioria dos trabalhos
sobre modelos animais de ICD são
pouco descritivos e deixam em aberto
pontos essenciais para reprodução do
protocolo de indução, tais como estirpe
utilizada, dose de antimicrobiano e
forma de administração (Best et al.,
2012). Além disso, a maioria dos
estudos relatam o uso de amostras de C.
difficile não disponíveis no Brasil,
dificultando a reprodução em nosso
meio (Howerton et al., 2013; Nagaro et
al., 2013). Dessa forma, o objetivo do
presente trabalho foi padronizar um
protocolo de infecção por C. difficile em
hamsters sírios, disponibilizando-o para
futuros estudos sobre patogenia,
tratamento e métodos de controle da
ICD no Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais utilizados
Foram utilizados cinco fêmeas de
hamsters sírios (Mesocricetus auratus),
com quatro a oito semanas de idade, por
grupo experimental. Água, maravalha,
ração e gaiolas foram esterilizadas por
autoclavação (121°C por 20 minutos).
Os animais foram mantidos em gaiolas
individuais e acondicionados em
estantes ventiladas, equipadas com
filtros absolutos (Alesco Co., Inglaterra)
para minimizar a contaminação do
ambiente e entre os grupos
experimentais.
Estirpes avaliadas
Quatro estirpes toxigênicas (A+B+) de
C. difficile, pertencentes a bacterioteca
do Laboratório de Anaeróbios da Escola
de Veterinária da UFMG, foram pré-
selecionadas para avaliação quanto a
toxigenicidade in vivo (Tabela 11),
sendo elas: ATCC 9689, oriunda do
banco de amostras do American Type
Culture Collection e gentilmente cedida
pela Fundação Oswaldo Cruz; EQ5,
estirpe isolada de um potro com ICD
(Preis et al., 2012); Z14, estirpe isolada
de um cão aparentemente saudável; I4,
estirpe isolada de um suíno com ICD.

Tabela 11: Identificação, espécie e histórico das estirpes de C. difficile utilizadas para indução
experimental em hamsters sírios (Mesocricetus auratus).

Identificação Origem Histórico

ATCC 9689 N/A Banco de amostras do American Type Culture Collection
EQ5 Equino Animal com infecção confirmada por C. difficile (Preis et al. 2012)
Z14 Cão Animal aparentemente saudável com 12 anos de idade.
I4 Suíno Animal com infecção confirmada por C. difficile.

Produção dos esporos das estirpes de
C. difficile.
Os esporos de C. difficile foram
produzidos de acordo com YANG et al.
(2009). As estirpes foram inoculadas em
erlenmeyer contendo 250 mL de BHI
(Brain Heart Infusion Broth, Difco
Laboratories, EUA), seguindo de
incubação a 37°C por 72 horas em
ambiente de anaerobiose. Após esse
período, as culturas foram mantidas por
cinco dias em temperatura ambiente
para induzir a esporulação. O conteúdo

104
foi centrifugado a 10.000 x g por 20
minutos e ressuspendido com 10 mL de
salina esterilizada 0,85% por duas
vezes. Posteriormente, a suspensão foi
submetida ao aquecimento de 80°C por
30 minutos, e repetição do protocolo de
centrifugação. As soluções foram
aliquotadas em microtubos
esterilizados, contendo 300µl, e
armazenadas a -20°C até a utilização.
Uma semana após a produção, as
soluções de esporos foram avaliadas por
meio de coloração de Gram, coloração
de esporos (Wirtz-Conklin) e teste
respiratório em ágar sangue constituído
de agar Muller-Hinton suplementado
com 5% de sangue ovino (Difco
Laboratories, EUA). Para determinação
da concentração de unidades
formadoras de colônia por mL,
diluições seriadas na base 10 (variando
de 10-3 a 10-8) foram inoculadas em ágar
sangue. Após incubadas por 48 horas
em ambiente de anaerobiose produzido
por mistura gasosa (10% H2, 10% CO2,
80% N2), placas com 30 a 300 colônias
foram contadas e calculou-se a média de
UFC/mL. As contagens obtidas ao
longo do período de avaliação foram
comparadas pelo teste do qui-quadrado
e pelo teste de Fisher, em um nível de
significância de 95% (p<0,05).
(STATA, College Station, Texas,
EUA).
Para determinação da viabilidade da
solução de esporos armazenadas a -
20°C, uma alíquota da solução da
estirpe ATCC9689 foi descongelada
mensalmente, durante um período total
de seis meses, e submetida a contagem
de UFC/mL, como descrito
anteriormente.
Avaliação da toxigenicidade in vivo
das estirpes de C. difficile.
O objetivo desta etapa foi avaliar quais
estirpes eram capazes de infectar os
hamsters e, consequentemente, causar
diarréia e óbito. A avaliação de
toxigenicidade in vivo foi realizada
segundo Sambol et al. (2002). Dois dias
após uma dose de clindamicina (30
mg/kg), administrou-se 100 µL de
solução de esporos contendo 107 UFC
das estirpes toxigênicas em cada animal.
As administrações foram realizadas por
gavagem. Os grupos, constituídos por
cinco hamsters, foram divididos da
seguinte forma: no grupo 1 (G1) os
animais receberam esporos da estirpe
ATCC9689; no grupo 2 (G2) foram
administrados esporos da estirpe EQ5;
no grupo 3 (G3) os animais receberam
esporos da estirpe Z14; no grupo 4 (G4)
administrou-se a estirpe I4; no grupo 5
(C1) os animais receberam apenas a
dose de clindamicina e, 48 horas depois,
uma dose de 100 µL de salina
esterilizada 0,85%; no grupo 6 (C2) os
animais receberam apenas esporos da
estirpe toxigênica ATCC9689, sem a
administração prévia de clindamicina.
Os animais foram observados
diariamente por 30 dias quanto a
ocorrência de diarreia (presença de
fezes amolecidas na gaiola, cauda e
focinho com sujidades indicativas) e
morte. Após o término do experimento
ou quando ocorria o óbito, os animais
eram necropsiados e fragmentos do
ceco eram coletados e fixados em
formalina tamponada a 10%.
Posteriormente, foi feito o
processamentos pela técnica de
desidratação, diafanização, inclusão,
secção de 5 micras e coloração pela
hematoxilina e eosina (LUNA, 1968) e
avaliação histológica realizada em
microscópio de luz clara. Coletou-se
ainda o conteúdo intestinal para
detecção das toxinas A/B pelo teste de
citotoxicidade celular (CTA) e
isolamento de C. difficile, como descrito
por SILVA et al. (2013d).
105
Determinação da dose mínima mortal
(DMM) e da dose letal para 50%
(DL50)
Dentre as estirpes capazes de causar
infecção e letalidade, selecionou-se uma
para avaliação da DMM e cálculo da
DL50. Foram formados cinco grupos
contendo cinco hamsters em cada.
Administrou-se uma solução de esporos
contendo 4x102 (grupo A1), 4x104
(grupo A2), 4x106 (grupo A3) e 4x108
(grupo A4) UFC por animal. No quinto
grupo (grupo controle), houve
administração de apenas 100 µL de
salina esterilizada 0,85%. Utilizou-se
mesmo esquema de indução e
acompanhamento descrito para a
avaliação da toxigenicidade in vivo. O
total de óbitos ocorridos em cada grupo
ao final do período de avaliação foram
comparados pelo teste teste de Fisher,
em um nível de significância de 95%
(p<0,05). (STATA, College Station,
Texas, EUA).
RESULTADOS
Na produção das soluções de esporos, a
contagem de unidades formadoras de
colônia variou de 2,0x108 a 4,0x109
UFC/mL entre as estirpes trabalhadas.
A contagem inicial da estirpe
ATCC9689 foi de 2,2x109 UFC/mL,
sendo que a média das sete contagens
foi de 2,1x109 UFC/mL e o desvio
padrão de ±1,2x108 UFC/mL, não
havendo alteração da contagem
bacteriana ao longo do tempo testado
(p=0,91).
Na avaliação da toxigenicidade in vivo
das estirpes de C. difficile, todas as
amostras testadas foram consideradas
toxigênicas uma vez que foram capazes
de causar diarreia e morte dos animais
(Tabela 12).

Tabela 11: Ocorrência de diarreia, morte, lesões intestinais e resultado de isolamento e detecção
das toxinas A/B por CTA nos grupos inoculados (G1 a G4) e nos grupos controles (C1 e C2)
com diferentes estirpes toxigênicas de Clostridium difficile.

Ocorrência n (%)
Grupo (Estirpe) Lesões1 Isolamento2 Toxinas A/B
Diarreia Morte
G1 (ATCC) 4/5 (80) 5/5 (100) Sim Positivo Positivo
G2 (EQ5) 3/5 (60) 4/5 (80) Sim Positivo Positivo
G3 (Z14) 4/5 (80) 4/5 (80) Sim Positivo Positivo
G4 (I4) 3/5 (60) 4/5 (80) Sim Positivo Positivo
C1 (Nenhuma) 0/5 (0) 0/5 (0) Não Negativo Negativo
C2 (ATCC) 0/5 (0) 0/5 (0) Não Negativo Negativo
1
Presença de lesões macroscópicas e histopatológicas nos animais que vieram a óbito. 2Isolamento de
estirpes de C. difficile toxigênicas.

No exame post mortem, a observar uma extensa destruição da

mucosa e serosa do ceco encontravam- mucosa intestinal com infiltrado
se extensamente hemorrágicas e com inflamatório difusamente distribuído na
conteúdo líquido de aspecto mucosa e intensa quantidade de células
sanguinolento (Figura 3: B1). Na eritrocíticas, caracterizando uma tiflite
avaliação histopatológica, foi possível necro-hemorrágica (Figura 3: B2).

106
Figura 3: (A1) Cavidade abdominal de um hamster do grupo C1. Ceco sem alterações
macroscópicas visíveis; (B1) Cavidade abdominal de um hamster do grupo G1. Alças cecais
tumefeitas com serosa intensamente e difusamente congesta, apresentando líquido
serosanguinolento no lúmen, sugestivo de tiflite hemorrágica; (A2) Micrografia do ceco de um
animal do grupo controle (C1), mostrando as vilosidades com aspecto normal (aumento de
100X). (B2) Micrografia do ceco de um animal do grupo G1. Nota-se a extensa destruição da
mucosa intestinal, infiltrado inflamatório difusamente distribuído na mucosa e intensa
quantidade de células eritrocíticas, caracterizando uma tiflite necro-hemorrágica (aumento de
100X).

A partir do conteúdo intestinal, coletado pós-desafio e nenhuma alteração post

durante a necropsia dos hamsters que
vieram expontaneamente a óbito, foi
possível detectar as toxinas A/B e isolar
C. difficile de todos os animais
avaliados (Tabela 12). Já nos grupos
controle (C1 e C2), nenhum animal
desenvolveu diarreia ou veio a óbito
durante o período de observação. Tais
hamsters foram eutanasiados 30 dias
mortem significativa foi observada
(Figura 3: A1 e A2). O conteúdo do
ceco encontrava-se com consistência
pastosa a sólida e não foi possível
detectar as toxinas A/B ou isolar C.
difficile de nenhum animal dos grupos
controle (Tabela 12).

107
Figura 4: Lâminas coradas pelo técnica de coloração de esporos (Wirtz-Conklin). A: Cultura
após 72 horas de incubação. Observar a presença de células vegetativas (bastonetes rosados) e
esporo livres ou ainda ligados a célula mãe (corados pelo verde-malaquita). B: Suspensão de
esporos. Observar a presença apenas de esporos livres do corpo celular (Aumento de 1000X)

Optou-se por prosseguir o trabalho com esporos de Clostridium sporogenes e

a estirpe ATCC9689. A figura 5 mostra
o tempo de sobrevivência nos 30 dias de
observação dos animais inoculados com
diferentes concentrações da estirpe
ATCC9689, durante a determinação da
DMM e DL50. Comparando com o
grupo controle, foi possível perceber
diferença na ocorrência de morte nos
grupos A2, A3 (p=0,038) e no grupo A4
(p=0,001). Todos os hamsters que
vieram a óbito possuiam lesões
hemorrágicas no ceco e foram positivos
para as toxinas A/B de C. difficile,
confirmando novamente a indução da
doença.
DISCUSSÃO
O protocolo de produção de esporos
permitiu a obtenção de uma suspensão
rica de esporos livres (sem a presença
do corpo celular), com alto grau de
pureza e sem contaminação no teste
respiratório (Figura 4).
Resultados semelhantes de pureza e
concentração foram relatados por
YANG et al. (2009) para obtenção de
Clostridium hungatei, sugerindo que
esse protocolo, apesar de simples, é
suficiente para a obtenção de uma
solução de esporos de alta concentração
e de elevada pureza.
Enquanto alguns trabalhos com modelos
de ICD em hamsters não especificam a
forma bacteriana administrada (Anton et
al., 2004), outros autores relatam o uso
de apenas células vegetativas (Mcvay e
Rolfe, 2000; Kokkotou et al., 2008),
apenas esporos (Sambol et al., 2002;
Nagaro et al., 2013) ou proporções
estimadas de ambos (Ochsner et al.,
2009). No presente estudo optou-se por
trabalhar com soluções de esporos livres
que por sofrem menos alterações na
concentração de UFC após
armazenamento devido a alta resistência
típica dessa forma bacteriana. Como
esperado, as contagens seguintes à
inicial apresentaram resultados
semelhantes em todos os sete tempos
avaliados, totalizando seis meses de
armazenagem sem alteração
significativa da contagem. Tal resultado
demonstra a resistência dos esporos de

108
C. difficile armazenados a -20°C e
confirma a possibilidade de
armazenamento da solução nessas
condições, facilitando o protocolo de
indução devido a não necessidade de
contínua produção e dosagem da estirpe
a ser utilizada.
Na avaliação da toxigenicidade in vivo
das estirpes de C. difficile, as lesões
observadas foram similares às
comumente relatadas em infecções por
C. difficile em hamsters e outros
roedores de laboratório (Sambol et al.,
2002; Best et al., 2012; Howerton et al.,
2013; Nagaro et al., 2013). Tais
alterações foram encontradas em todos
animais que vieram a óbito durante o
experimento, incluindo aqueles que não
apresentaram diarréia previamente.
Além das lesões características, o
isolamento e detecção das toxinas A/B
nesses animais confirmam a indução da
doença (Tabela 12).
Nos grupos controle (C1 e C2) não
foram observados indícios de
colonização ou infecção por C. difficile
(Tabela 12). Tais resultados confirmam
que não houve infecção cruzada no
grupo C1, uma vez que tais animais
receberam antimicrobiano e estariam
susceptíveis a colonização por C.
difficile. No grupo C2, a ausência de
infecção demonstra que não houve
colonização pela estirpe ATCC9689,
provavelmente devido ao “efeito
barreira” da microbiota íntegra
(Båverud, 2002).
Três animais, dos grupos G1, G2 e G4,
vieram a óbito antes que o quadro
clínico de diarreia pudesse ser
observado. A infecção por C. difficile
em hamsters é comumente fulminante,
culminando com um quadro hiperagudo
da doença que é caracterizado por
extensa necrose intestinal e toxemia,
podendo ocorrer óbito dos animais antes
mesmo da visualização do quadro
clínico de diarreia (Chen et al., 2008;
Best et al., 2012; Howerton et al.,
2013).
Nos três animais que sobreviveram, dos
grupos G2, G3 e G4, não foram
observadas alterações post mortem
significativas e não foi possível detectar
as toxinas A/B. Além disso, C. difficile
não foi isolado do conteúdo intestinal,
semelhante aos animais dos dois grupos
controles. Acredita-se que a falha de
indução possa ter ocorrido pela
administração de uma dose insuficiente
de esporos de C. difficile ou a
microbiota não ter sido suficientemente
agredida pela dose de antibiótico
administrada, permanecendo o efeito
barreira (Båverud, 2002).
Como todas as estirpes trabalhadas
foram capazes de induzir a diarreia,
optou-se por prosseguir o trabalho com
a estirpe ATCC9689 por tratar-se de
uma estirpe de referência certificada,
internacionalmente reconhecida e
fornecida gratuitamente pela Fundação
Oswaldo Cruz (Fiocruz, Rio de Janeiro,
Brasil) ás universidades e orgãos de
pesquisa brasileiros. Na figura 5,
percebe-se que os óbitos iniciaram 24
horas após a administração dos esporos
mas concentraram-se principalmente
entre 72 e 96 horas pós-desafio,
resultado semelhante ao relatado em
trabalhos anteriores com hamsters
(Sambol et al., 2002; Nagaro et al.,
2013).
109
Figura 5: Sobrevivência de hamsters durante o período de observação de 30 dias dos grupos de
animais inoculados com diferentes concentraçoes de esporos da estirpe ATCC9689 (A1 a A4)
de Clostridium difficile e do grupo controle.
Além da utilização de diferentes
estirpes de C. difficile, o grande número
de diferentes protolocos de
administração em modelos de ICD
dificulta comparações. Em geral, as
doses variam de 107 a 104 UFC por
animal, porém a via de administração
(gavagem, via oral), o tempo após
antibióticoterapia que a estirpe é
administrada e até mesmo a forma
bacteriana utilizada (esporos, células
vegetativas) variam, impedindo
conclusões. Por outro lado,
independente da forma e estirpe
utilizada, a grande maioria dos trabalhos
utilizam doses que causam entre 60 e
100% de letalidade (Sambol et al.,
2002; Chen et al., 2008; Best et al.,
2012; Howerton et al., 2013; Nagaro et
al., 2013).
Considerando a diferença apresentada
entre os grupos desafiados quando
comparados com o grupo controle,
poderia-se utilizar qualquer dose entre
4x104 e 4x108 UFC da estirpe
ATCC9689, por animal, para estudos de
avaliação de métodos de proteção ou de
tratamento. Alguns trabalhos de indução
de infecções para outros micro-
organismos utilizam também a DL50.
No presente estudo, a DL50 calculada
segundo Reed e Muench (1938) foi de
6,3x104 UFC por animal.
O protocolo padronizado no presente
estudo permitiu a utilização de hamsters
sírios (Mesocricetus auratus) como
modelo de indução da infecção por C.
difficile, disponibilizando-o como uma
ferramenta valiosa para estudos
relativos à patogenia, tratamento e
controle dessa doença no Brasil.
APROVAÇÃO NO COMITÊ DE
ETICA
Protocolo número 142/2012, CEUA-
UFMG.
AGRADECIMENTOS
CNPq, FAPEMIG, CAPES e INCT.
110
REFERÊNCIAS
ANTON, P.M.; O'BRIEN. M.;
KOKKOTOU, E et al. Rifalazil treats
and prevents relapse of Clostridium
difficile-associated diarrhea in hamsters.
Antimicrob Agents Chemother, v.48,
n.10, p.3975-9, 2004.
ARROYO, L.G.; KRUTH, S.A.;
WILLEY, B.M. et al. PCR ribotyping of
Clostridium difficile isolates originating
from human and animal sources. J
Medic Microbiol , v.54, p.163-6, 2005.
BALASSIANO, I.T.; DOS SANTOS-
FILHO, J.; VITAL-BRAZIL, J.M. et al.
Detection of cross-infection associated
to a Brazilian PCR-ribotype of
Clostridium difficile in a university
hospital in Rio de Janeiro, Brazil.
Antonie Van Leeuwenhoek, v.99, n.2,
p.249-55, 2011.
BÅVERUD, V. Clostridium difficile
infections in animals with special
reference to the horse: a review. Vet
Quarterly, v.24, n.4, p.203-219, 2002.
BEST, E.L.; FREEMAN, J.; WILCOX,
M.H. Models for the study of
Clostridium difficile infection. Gut
Microbes, v.2, p.145-167, 2012.
CHEN, X.; KATCHAR, K.;
GOLDSMITH, J.D. et al. A mouse
model of Clostridium difficile-
associated disease. Gastroenterology,
v.135, p.1984-1992, 2008.
HOWERTON, A.; PATRA, M.; ABEL-
SANTOS, E. A new strategy for the
prevention of Clostridium difficile
infection. J Infect Dis, v.207, p.1498-
504, 2013.
JHUNG, M.A.; THOMPSON, A.D.;
KILLGORE, G.E. et al. Toxinotype V
Clostridium difficile in humans and
food animals. Emerg Infect Dis, v.14,
n.7, p.1039-45, 2008.
KOKKOTOU, E.; MOSS, A.C.;
MICHOS, A. et al. Comparative
efficacies of rifaximin and vancomycin
for treatment of Clostridium difficile-
associated diarrhea and prevention of
disease recurrence in hamsters.
Antimicrob Agents Chemother, v.52,
n.3, p.1121-6, 2008.
LIPPKE, R.T.; BOROWSKI, S.M.;
MARQUES, S.M.T. et al. Matched
case-control study evaluating the
frequency of the main agents associated
with neonatal diarrhea in piglets. Pesq
Vet Bras, v.31, n.6, p.505-510, 2011.
LUNA, L.G. Routine Staining
Procedures. In: Luna, L. G. (Ed).
Manual of Histologic Staining Methods
of The Armed Forces Institute of
Pathology. New York: McGraw- Hill
Book Co, 1968.
MCVAY, C.S.; ROLFE, R.D. In vitro
and in vivo activities of nitazoxanide
against Clostridium difficile. Antimicrob
Agents Chemother, 2000 v.44, p.2254-
8, 2000.
NAGARO, K.J.; PHILLIPS, S.T.;
CHEKNIS, A.K. et al. Nontoxigenic
Clostridium difficile protects hamsters
against challenge with historic and
epidemic strains of toxigenic
BI/NAP1/027 C. difficile. Antimicrobial
Agents Chemother, v.57, p.5266-70,
2013.
OCHSNER, U.A.; BELL SJ.;
O'LEARY AL. et al. Inhibitory effect of
REP3123 on toxin and spore formation
in Clostridium difficile, and in vivo
efficacy in a hamster gastrointestinal
infection model. Antimicrob Agents
Chemother, v.63, p.964-71, 2009.
111
PREIS, I.S.; SILVA, R.O.S.; PIRES,
P.S. et al. Enteritis associated with
Clostridium difficile and opportunistic
candidiasis in a foal. Braz J Vet Pathol,
v.5, n.1, p.7-11, 2012.
REED, L.J; MUENCH, H.A. Simple
method of determining fifty percent
endpoints. Am J Hyg, v. 27, p.494–497.
1938.
SAMBOL, S.P.; MERRIGAN, M.M.;
TANG, J.K. et al. Colonization for the
prevention of Clostridium difficile
disease in hamsters. J Infect Dis, v.186,
n.12, p.1781-9, 2002.
SILVA, R.O.S.; SANTOS RL.; PIRES
PS. et al. Detection of toxins A/B and
isolation of Clostridium difficile and
Clostridium perfringens from dogs in
Brazil. Braz J of Microbiol, v.44, n1,
p.131-137, 2013a.
SILVA, R.O.S.; D'ELIA, M.L.; DE
MAGALHÃES SOARES, D.F. et al.
Clostridium difficile-associated diarrhea
in an ocelot (Leopardus pardalis).
Anaerobe, v.20, p.82-4. 2013b.
SILVA, R.O.S.; RIBEIRO, M.G.;
PALHARES, M.S. et al. Detection of
A/B toxin and isolation of Clostridium
difficile and Clostridium perfringens
from foals. Eq Vet J, v.45, p.671-675,
2013c.
SILVA, R.O.S.; GUEDES, R.M.C.;
LOBATO, F.C.F. et al. Clostridium
difficile infection: main features and
occurrence in domestic species in
Brazil. Ciência Rural, v43, n.1, p.73-80,
2013d.
SILVA, R.O.S.; SALVARANI, F.M.;
CRUZ JUNIOR, E.C.C. et al. Detection
of toxins A/B and isolation of
Clostridium difficile from piglets in
Brazil. Ciência Rural, v.41 n.8, p.1130-
1135, 2011.
SONGER, J.G. Clostridia as agents of
zoonotic disease. Vet Microbiol, v.140,
p.399-404, 2010.
SPIGAGLIA, P.; BARBANTI, F.;
MASTRANTONIO, P. et al. Multidrug
resistance in European Clostridium
difficile clinical isolates. J Antimicrob
Chemother, v.66, p.2227-34, 2011.
YANG, W.; CROW-WILLARD, E.N.;
PONCE, A. et al. Production and
characterization of pure Clostridium
spore suspensions. J Applied Microbiol,
v.106, p-27-33, 2009.
112
 COMENTÁRIOS FINAIS
Os kits de ELISA testados revelaram
baixa sensibilidade para avaliação
individual de amostras de fezes de
leitões. Porém, devido a alta
especificidade apresentada por um dos
kits testados, uma opção seria a
avaliação simultânea de várias amostras
de leitões da mesma granja. Deve-se
enfatizar, porém, que mais estudos são
necessários para avaliar o impacto dessa
alteração no desempenho do teste em
questão.
Acredita-se que a baixa sensibilidade
dos kits de ELISA para amostras de
fezes de seres humanos podem ser um
dos principais resposáveis pela
dificuldade de controle da diarreia
nosocomial por C. difficile no
HCUFMG. A ausência de um método
de triagem, com alta sensibilidade e
com resultados rápidos, dificulta a
identificação segura de pacientes a
serem isolados e tratados, aumentando
simultaneamente o risco de
disseminação da doença e o uso
empírico de antimicrobianos nesses
pacientes. Com isso, o presente estudo
reforça a necessidade urgente de mais
trabalhos buscando métodos
alternativos para diagnóstico tanto para
suínos quanto para seres humanos.
Revelou-se, pela primeira vez, a
ocorrência ICD em potros no Brasil.
Apesar dos resultados encontrados
sugerirem uma baixa prevalência da
doença nessa espécie, o presente estudo
destaca a pouca familiaridade dos
clínicos e proprietários com a diarreia
por C. difficile em potros, comumente
levando a uma antibioticoterapia
errônea com consequente agravamento
dos sinais clínicos e prognóstico dos
animais. Em suínos, destaca-se uma
frequência da doença superior a
trabalhos anteriores no país. Revelou-se
ainda, pela primeira vez no mundo, que
a doença também pode ocorrer em
felinos silvestres, sugerindo que tais
animais também possam estar em risco
quando submetidos a antibioticoterapia.
A padronização de um modelo
experimental de infecção por C. difficile
em hamsters sírios pode ser o primeiro
passo para o desenvolvimento de
estudos relativos a novos métodos de
tratamento e, principalmente,
imunoprofiláticos para prevenção da
diarreia em animais domésticos.
PESPECTIVAS FUTURAS
O presente trabalho demonstra a
necessidade de mais estudos relativos a
métodos de diagnóstico para diarreia
causada por C. difficile sobretudo em
seres humanos e suínos. Uma vez que
nenhum dos testes disponíveis
comercialmente parecem apresentar
desempenho aceitável quando utilizados
sozinhos, torna-se necessário avaliar a
combinação de vários métodos no inuito
de criar um algorítmo que permita um
valor preditivo mais aceitável para o
diagnóstico. Considerando que todos os
kits de ELISA e NAAT presente no
mercado brasileiro são importados,
torna-se importante o desenvovimento
de métodos nacionais, diminuindo a
dependência da importação e,
consequentemente, o custo do
diagnóstico.
Até o momento, inexistem vacinas
comerciais para prevenção da enterite
por C. difficile em seres humanos e
animais domésticos. Com crescimento
da importância de C. difficile em
diversas espécies, o desenvolvimento de
imunoprofiláticos e/ou de outros
métodos de prevenção torna-se um
ponto chave para futuras pesquisas.
113
 CONCLUSÕES
A técnica padronizada de citotoxicidade
celular permitiu a detecção das toxinas
A/B a partir de amostras de fezes de
animais e seres humanos, além de
possibilitar a avaliação dos testes
comerciais de ensaio imunoenzimático.
Os resultados encontrados sugerem que
os kits de ELISA testados são
adequados para diagnóstico de ICD em
potros, mas possuem sensibilidade
baixa para amostras de fezes de seres
humanos e leitões, dificultando o
diagnóstico nessas espécies.
As estirpes de C. difficile avaliadas
apresentaram alta susceptibilidade aos
ANEXOS: Versão original dos artigos
publicados
SILVA, R.O.S.; GUEDES, R.M.C.;
LOBATO, F.C.F. Clostridium difficile
infection: main features and occurrence
in domestic species in Brazil. Ciência
Rural, v43, n.1, p.73-80, 2013.
SILVA, R.O.S.; GUEDES, R.M.C.;
SILVA, M.X.; LOBATO, F.C.F.
Evaluation of three enzyme
immunoassays and toxigenic culture for
diagnosis of Clostridium difficile-
associated enteritis in piglets. J Swine
Health Product., v.21, n.6, p.261-264,
2013.
SILVA, R.O.S.; RIBEIRO, M.G.;
PALHARES, M.S. et al. Detection of
A/B toxin and isolation of Clostridium
difficile and Clostridium perfringens
from foals. Eq Vet J, 2013. doi:
10.1111/evj.12046.
SILVA, R.O.S.; MOREIRA, F.M.;
REZENDE, J.V. et al. First confirmed
case of Clostridium difficile-associated
diarrhea in foals in Brazil. Ciência
Rural, v.42, n.3, p. 498-500, 2012.
dois antimicrobianos comumente
utilizados no tratamento para ICD:
metronidazol e vancomicina. Por outro
lado, o estudo revelou a ocorrência de
estirpes resistentes a tilosina, penicilina,
eritromicina e oxitetraciclina. A
ribotipagem das estirpes de C. difficile
isoladas de animais e seres humanos
revelou uma grande variedade de
ribotipos, sendo parte deles comuns
entre homens e animais. Por último, o
modelo padronizado de ICD em
hamsters torna-se uma opção
interessante para futuros estudos
relativos a patogenia, prevenção e
controle da infecção por C. difficile.
PREIS, I.S.; SILVA, R.O.S.; PIRES,
P.S. et al. Enteritis associated with
Clostridium difficile and opportunistic
candidiasis in a foal. Braz J Vet Pathol.,
v.5, n.1, p.7-11, 2012.
SILVA, R.O.S.; D'ELIA, M.L.;
SOUZA, D.F.M. et al. Clostridium
difficile-associated diarrhea in an ocelot
(Leopardus pardalis). Anaerobe, v.20,
p.82-4. 2013.
SILVA, R.O.S.; NEVES, M.S.;
OLIVEIRA JUNIOR, C.A. et al. An
outbreak of Clostridium difficile-
associated diarrhea in piglets in Brazil.
Semina, v.34, n.6, p.3923-28, 2013.
SILVA, R.O.S.; OLIVEIRA JUNIOR,
C.A.; DINIZ, A.N. et al. Antimicrobial
susceptibility of Clostridium difficile
isolated from animals and humans in
Brazil. Ciência Rural, v.44, p.841-846,
2014.
SILVA, R.O.S.; D´Ellia, M.L. et al.
Clostridium difficile and C. perfringens
from wild carnivore species in Brazil.
114
Anaerobe, 2014. doi:
10.1016/j.anaerobe.2014.06.012

SILVA, R.O.S.; NEVES, M.S.;

RIBEIRO, M.G. et al. Evaluation of
three enzyme immunoassays for
diagnosis of Clostridium difficile-
associated diarrhea in foals. J Eq Vet
Science, 2014. doi:
10.1016/j.jevs.2014.05.012.

SILVA, R.O.S.; RUPNIK, M.;

LOBATO, F.C.F. et al. Padronização de
um modelo de infecção por Clostridium
difficile em hamsters sírios
(Mesocricetus auratus). Ciência Rural,
2014.

SILVA, R.O.S.; VILELA, E.G.;

NEVES, M.S. et al. Evaluation of three
enzyme immunoassays and a nucleic
acid amplification test for diagnosis of
Clostridium difficile-associated diarrhea
at a University Hospital in Brazil. Rev
Soc Bras Med Trop, 2014. doi:
10.1590/0037-8682-0100-2014.

115
 n3103gjgjfk •g¾•q

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..2 .**;  ".:=(> *"4341*. *
A.**-12*1*R":=(> *&@<:* $A:;< .***1&2. . * *   
 43412** .* 2*1*R&,$O " -*  -* 1R&;
".> :'GV/ ('GW/  *  R". &
>  'GW/;<  45X4G2E> 1 *1"- `abcdefagdbfhihjf
 .-."(?8T9.** *.
&>"" C *"2 & ? & A..*..&.R  k*" *;
7E2144 >  Y- .. * * 2*
> ;
A.& **"4341 " ** . lembanohpqrhbfj
 "> *: =(&@<:*;< *-**
.** 2 *  45X4G2E> 1 -& A.*2%2**11&" *"-[:,@#<s$:,@9$J,t
*"8TT;< .1* *1".***&*2 <J$A!,) ,O,5!8[#s;
 Z.:=(> *2&--@<: 
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 Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 47(4):, Jul-Aug, 2014
http://dx.doi.org/10.1590/0037-8682-0100-2014 Major
Case Report
Article

Evaluation of three enzyme immunoassays and

a nucleic acid amplification test for the
diagnosis of Clostridium difficile-associated
diarrhea at a university hospital in Brazil
Rodrigo Otávio Silveira Silva[1], Eduardo Garcia Vilela[2], Monique Silva Neves[1]
and Francisco Carlos Faria Lobato[1]

[1]. Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG. [2]. Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas
Gerais, Belo Horizonte, MG.

ABSTRACT
Introduction: Despite the known importance of Clostridium difficile as a nosocomial pathogen, few studies regarding Clostridium
difficile infection (CDI) in Brazil have been conducted. To date, the diagnostic tests that are available on the Brazilian market
for the diagnosis of CDI have not been evaluated. The aim of this study was to compare the performances of four commercial
methods for the diagnosis of CDI in patients from a university hospital in Brazil. Methods: Three enzyme immunoassays (EIAs)
and one nucleic acid amplification test (NAAT) were evaluated against a cytotoxicity assay (CTA) and toxigenic culture (TC).
Stool samples from 92 patients with suspected CDI were used in this study. Results: Twenty-five (27.2%) of 92 samples were
positive according to the CTA, and 23 (25%) were positive according to the TC. All EIAs and the NAAT test demonstrated
sensitivities between 59 and 68% and specificities greater than 91%. Conclusions: All four methods exhibited low sensitivities
for the diagnosis of CDI, which could lead to a large number of false-negative results, an increased risk of cross-infection to other
patients, and overtreatment with empirical antibiotics.
Keywords: Nosocomial. Pseudomembranous colitis. Diagnosis. ELISA.

trained personnel. Thus, commercial enzyme immunoassays

INTRODUCTION
Clostridium difficile was first isolated in 1935, but this
microorganism was only recognized as a human pathogen in
the late 1970s. Currently, Clostridium difficile infection (CDI)
is recognized as the main cause of nosocomial diarrhea. In
the last few years, the emergence of highly virulent strains of
C. difficile in several countries1 and cases in outpatients with no
history of antibiotic therapy have been reported, demonstrating
the need for further studies related to the diagnosis and control
of this pathogen2.
For many years, the detection of A/B toxins in feces via a
cell cytotoxicity assay (CTA) was considered the gold standard
method for the diagnosis of CDI2. More recently, studies have
shown that toxigenic culture (TC) is more sensitive; therefore,
it has been used as the new gold standard method3. However,
both techniques are time consuming, laborious, and require
(EIA) are currently the most widely used techniques for the
diagnosis of CDI3.
Other potential options that have been widely cited include
commercial real time polymerase chain reaction (PCR) kits and
nucleic acid amplification tests (NAATs). Studies investigating
these assays found that they exhibit high sensitivity, suggesting
that they could be useful for screening patients with CDI2,4.
Currently, the main limitation of these kits is their high cost,
which is typically up to ten times more expensive than EIAs5.
Despite the known importance of C. difficile as a nosocomial
pathogen, few studies have been conducted regarding CDI
in Brazil. To date, the diagnostic tests that are available on
the Brazilian market for the diagnosis of CDI have not been
evaluated. Therefore, the aim of this study was to compare the
performance of three commercial EIAs and one NAAT for the
diagnosis of diarrhea attributed to C. difficile versus cytotoxicity
and toxigenic culture assays.

METHODS

Address to: Dr. Rodrigo Otávio Silveira Silva. EV/UFMG. Av. Antônio Carlos 6627, Between December 2011 and June 2013, 92 stool samples
31270-901 Belo Horizonte, MG, Brasil.
Phone/Fax: 55 31 3409-2103
were collected from patients at the University Hospital of the
e-mail: rodrigo.otaviosilva@gmail.com Federal University of Minas Gerais. All samples were obtained
Received 8 May 2014 from inpatients with suspected C. difficile-associated diarrhea.
Accepted 31 July 2014 Specimens were collected in sterile containers, and aliquots

1
Silva ROS et al. - Evaluation of EIAs and NAAT for Clostridium difficile infection

were held at -20°C until all tests were performed. All procedures

TABLE 1 - Evaluation of three immunoassays and RT-PCR compared with a cell cytotoxicity assay and toxigenic culture assay as the gold standards for the diagnosis of Clostridium difficile

70 (48.1-85.5) 87.5 (77.9-93.3)

61.9 (40.9-79.2) 98.3 (91-99.7) 92.9 (68.5-98.7) 87.9 (77.9-93.7)

65.2 (44.9-81.2) 98.5 (91.9-997) 93.8 (71.7 -98.9) 89 (79.8 -94.3)
91 (81.8-95.8)

88.2 (79-93.6)
were previously approved by the Research Ethics Committee of

NPV
the School of Medicine of Federal University of Minas Gerais

-
(CAAE - 0710.0.203.0000.11).
Cytotoxicity assays were performed using Vero (African
green monkey kidney) cells (ATCC CCL 81)6. Briefly, fecal

RT-PCR: real-time polymerase chain reaction; SE: sensitivity; SPE: specificity; PPV: positive predictive value; NPV: negative predictive value; CI: confidence interval of 95%.
68 (48.4-82.8)

87.5 (64 -65)

samples were diluted 1:4 in phosphate-buffered saline (pH

PPV
7.0) and centrifuged at 3,000 x g for 5min at 4°C. The resulting

-
Toxigenic culture
supernatants were filtered through a 0.22-µm pore size filter and
subject to 2fold dilutions until a dilution of 1:1024 was achieved.

% (CI)
Serial dilutions and parallel samples with Clostridium sordellii

73.9 (53.5-87.5) 88.4 (78.8-94)

60.9 (40.8-77.8) 91.3 (82.3-96)

60.9 (40.8-77.8) 97.1 (90-99.2)

antitoxin were added onto Vero cell monolayers. The cells were

SPE
examined after 24 h of incubation at 37°C in a 5% CO2 incubator.

-
A specimen was considered positive by the CTA if at least 90%
of cells were rounded and if the effects were neutralized by an
antitoxin at the same dilution in a parallel sample.
For toxigenic culture, equal volumes of stool samples and

SE
96% ethanol (v/v) were mixed. After incubation for 30min at

-
room temperature, 50µl aliquots were inoculated on plates
containing cycloserine-cefoxitin fructose agar supplemented
with 7% horse blood and 0.1% sodium taurocholate6. After

87.5 (77.9-93.3)

86.4 (76.1-92.7)
88.4 (78.8-94)

89 (79.8-94.3)

88.2 (79 -936)

anaerobic incubation at 37°C for 96h, all colonies with

NPV
suggestive morphologies were subjected to a previously

-
described multiplex-PCR protocol involving a housekeeping
gene (tpi), toxins A (tcdA) and B (tcdB), and a binary toxin
gene (cdtB)7. All strains positive for tcdA or/and tcdB were
considered toxigenic. In addition, all toxigenic isolates from

89.5 (68.6 -97.1)

73.9 (53.5-87.5)

92.9 (68.5-98.7)
99.9 (80.5-100)
80 (58.4-91.9)
the PCR were tested by CTA for in vitro toxin production as
PPV

previously described8.
-
Cytotoxicity assay

The following three commercial EIAs for A/B toxin

detection were tested: C. difficile Tox A/B II (Techlab Inc.,
% (CI)

USA), Remel ProSpecT C. difficile Toxin A/B (Oxoid, UK),

59.1 (38.7 -76.7) 98.3 (90.9-99.7)

97 (89.8 -99.2)

100 (94.5-100)
91 (81.8-95.8)

94 (85.6-97.7)

and Ridascreen Clostridium difficile toxins A/B (R-Biopharm,

Germany). In addition, one commercial NAAT kit (Simplexa™
SPE
-

C. difficile Universal Direct Kit, Focus Diagnostics, USA) that

directly detects the tcdB gene in stool samples was also tested.
All EIAs and the NAAT were performed according to the
manufacturers’ recommendations. The sensitivity, specificity,
68 (48.4 -82.8)

68 (48.4-82.8)

64 (44.5-79.8)

64 (44.5-79.8)

positive predictive value (PPV), negative predictive value

infection in patients at a university hospital in Brazil.

SE

(NPV), and 95% confidence interval were calculated for

-

each EIA and NAAT versus CTA and TC. Additionally, the
kappa coefficient9 was calculated to compare the CTA and TC
(Stata 12, College Station, Texas, USA).
Universal Direct Kit (Focus Diagnostics)

results
Remel ProSpecT C. difficile

From the 92 sampled patients, 25 (27.2%) were positive

Toxins A/B (R-Biopharm)
Cytotoxicity assay (CTA)

according to CTA. C. difficile was isolated from 29 (31.5%)

Toxigenic culture (TC)

Simplexa™ C. difficile
Ridascreen C. difficile
Tox A/B II (Techlab)

samples, of which six isolates were considered non-toxigenic

Clostridium difficile

Toxin A/B (Oxoid)

and 23 (25%) were toxigenic according to PCR. The kappa

concordance between TC and CTA was 0.71 (95% confidence
interval, 0.51-0.9). The three tested EIAs and the NAAT
Method

exhibited sensitivities between 59 and 68% and specificities

greater than 91% (Table 1).

2

DISCUSSION
Approximately ten years ago, it was believed that the CTA
demonstrated sensitivity and specificity values greater than 99%
and was thus considered the primary technique to diagnose
CDI10,11. However, when compared with toxigenic culture, the
sensitivities of CTA protocols range between 60 and 86% with
specificities greater than 90%5. Corroborating these findings,
the CTA protocol used in the present study demonstrated a
sensitivity of 73.9% (Table 1). It is also important to note that
no standard protocol exists for CTAs. In this study, Vero cells
were used; this cell line is considered to be the most sensitive to
A/B toxins, and a similar CTA protocol was used successfully
in previous studies6,8,12-15.
In the TC assay, 23 (25%) patients were positive for
toxigenic strains. Of these patients, 15 (65.2%) were A+B+CDT-,
six (26.1%) were A+B+CDT+, and two (8.7%) were A-B+CDT-.
All of the C difficile isolates considered to be toxigenic by
PCR produced toxins A and B in vitro. Conversely, the TC
protocol had a sensitivity that was lower (73.9%) than the
values commonly reported in previous studies, which have
recorded sensitivities close to 100%2,16. No standard method
for TC assays with C. difficile is available, making it difficult
to compare results from other studies. A wide variety of media
and differences in isolation protocols, such as the use of shock
alcohol and variations in incubation time, are common5,10. In this
study, we opted for a simple isolation protocol, which would
be more applicable for diagnosis when compared with previous
methods17. It is well known that some strains of C. difficile may
not grow due to susceptibility to either one or both antibiotics
used in the medium18. Recently, Malik et al.19 demonstrated
that antibiotics used in selective media are responsible for the
addition of stress in the recovery of C. difficile spores, which
might reduce isolation rates. In addition, the use of CCFA,
even with supplemental taurocholate, can result in a variable
sensitivity for the recovery of C. difficile spores compared
with protocols that use pre-enrichment broth before plating on
selective agar19. All of these factors potentially contributed to
the sensitivity exhibited in the TC assay in this study. It should
be noted that, even with a TC protocol with sensitivity slightly
lower than commonly reported, the concordance (kappa)
between TC and CTA was 0.71. This value could be considered
reflective of substantial agreement9 and is similar to that reported
by Keessen et al.13
It also important to note that asymptomatic colonization
by toxigenic or non-toxigenic C. difficile is considered rare
in healthy adults. However, asymptomatic colonization is
estimated to occur in approximately 9 to 20% in some groups,
such as residents of long-term care facilities2,5,20. The detection
of the tcdA and tcdB genes by PCR may decrease the occurrence
of false-positive results by TC after patients with non-toxigenic
strains have been identified as not positive; in the present study,
four (4.3%) patients who were suspected of having nosocomial
diarrhea caused by C. difficile were negative for A/B toxins and
carried non-toxigenic strains. Conversely, eight (8.7%) patients
Rev Soc Bras Med Trop
were positive for TC but negative for A/B toxins by CTA and
the three EIAs tested. In this case, a false-positive result should
be considered a possibility. According to Peterson et al.20, the
false-positive rate for TC is approximately 10%. Therefore,
comparisons of tests for the diagnosis CDI should be performed
in parallel with CTA and TC as the gold standard methods.
Due to its ease of use, low cost and the fast turnaround
for results, EIA remains the most commonly used test for the
diagnosis of CDI in humans and animals worldwide10,12,20.
However, the three EIAs tested in this study demonstrated
low sensitivities ranging from 61 to 68%. This result is similar
to previous studies with EIA kits and rapid tests, which
reported sensitivities between 50 and 77% and specificities of
approximately 90%5,21,22.
The NAAT tested in this study also exhibited a low sensitivity
(less than 62%). This result contrasts with previous studies that
have used other NAAT tests, which reported specificities and
sensitivities greater than 90%5,21-23. Compared with other kits
on the market, the main advantage of the NAAT tested in this
study is the lack of a protocol for deoxyribonucleic acid (DNA)
extraction from stool samples, which could save time and
labor. Briefly, in this test, the contents of a clinical specimen
swab are immersed in a lysis solution, followed by heating and
centrifugation. The resulting supernatant is directly used as a
DNA template in a PCR reaction. Some authors have stated that
false-negative results in the NAAT are primarily caused by the
presence of gene copy numbers below the detection limits of
the test20-24. Considering the number of false negative results
obtained in the present work, the potential use of a more accurate
extraction protocol should be considered for better performance
of diagnostic tests; this modification might increase the number
of gene copies and also reduce the presence of inhibitors in the
sample reactions.
One sample exhibited an undetermined result in the NAAT.
An additional unfrozen aliquot of this sample was retested, but
an undetermined result was obtained. Thus, this sample was
not considered when calculating the sensitivity, specificity,
and positive and negative predictive values for the NAAT
test. This stool sample was also positive in TC (A-B+CDT-)
but negative for A/B toxins in the CTA and in all three EIAs
tested. Undetermined results are mainly caused by the presence
of inhibitors in the stool sample5. It appears that this is not a
common event, given that it occurred in only one sample out of
81 (1.2%) stool samples tested in the NAAT. This rate is similar
to previous reports with other NAATs5,21.
Several alternatives have been proposed to improve the
diagnosis of CDI. In contrast to our results, the vast majority
of commercial NAATs demonstrated high sensitivities in
previous studies, but their high costs prevent their wide use2,5,21.
At institutions where EIAs are still used for the diagnosis of
CDI, some authors have suggested the submission of more than
one sample from the same patient, but this practice remains
controversial given that some studies have demonstrated that
multiple samples do not significantly increase the positive
predictive value of the test and may even increase the rate of
false positives5,25,26. Some authors have also suggested that an
3
Silva ROS et al. - Evaluation of EIAs and NAAT for Clostridium difficile infection
algorithm with at least two steps is required for the accurate
diagnosis of CDI in humans, but there is still no consensus on
which tests should be used in each step5,16,22,27.
In conclusion, all four methods tested in this study
demonstrated low sensitivities for the diagnosis of CDI under
the conditions tested. This might lead to a large number of
false-negative results, which could increase the risk of cross-
infection to other patients and also overtreatment with empirical
antibiotics21. The present study reinforces the need for research
focusing on new methods or algorithms for the diagnosis of
C. difficile, given that control of CDI is nearly impossible and
the risk of its dissemination is high without a secure diagnosis.
CONFLICT OF INTEREST
The authors declare that there is no conflict of interest.
FINANCIAL SUPPORT
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado
de Minas Gerais (FAPEMIG) and Pró-Reitoria de Pesquisa-
Universidade Federal de Minas Gerais (PRPq-UFMG).
references
1. Balassiano IT, Yates EA, Domingues RM, Ferreira EO. Clostridium
difficile: a problem of concern in developed countries and still a mystery
in Latin America. J Med Microbiol 2012; 61:169-179.
2. Silva Júnior M. Recent changes in Clostridium difficile infection.
Einstein 2012; 10:105-109.
3. René P, Frenette CP, Schiller I, Dendukuri N, Brassard P, Fenn S,
et al. Comparison of eight commercial enzyme immunoassays for the
detection of Clostridium difficile from stool samples and effect of strain
type. Diagn Microbiol Infect Dis 2012; 73:94-96.
4. Viala C, Le Monnier A, Maataoui N, Rousseau C, Collignon A, Poilane I.
Comparison of commercial molecular assays for toxigenic Clostridium
difficile detection in stools: BD GeneOhm Cdiff, XPert C. difficile and
illumigene C. difficile. J Microbiol Methods 2012; 90:83-85.
5. Humphries RM. Laboratory Tests for the Diagnosis of Clostridium
difficile Infections. Clinic Microbiol Newsletter 2012; 34:151-157.
6. Silva RO, Ribeiro MG, Palhares MS, Borges AS, Maranhão RP, Silva MX,
et al. Detection of A/B toxin and isolation of Clostridium difficile and
Clostridium perfringens from foals. Equine Vet J 2013; 45:671-675.
7. Silva ROS, Salvarani FM, Cruz Junior ECC, Pires PS, Santos RLR,
Assis RA, et al. Detection of toxins A/B and isolation of Clostridium
difficile from piglets in Brazil. Ciênc Rural 2011; 41:1130-1135.
8. Medina-Torres CE, Weese JS, Staempfli HR. Validation of a commercial
enzyme immunoassay for detection of Clostridium difficile toxins in
feces of horses with acute diarrhea. J Vet Intern Med 2010; 24:628-632.
9. Landis JR, Koch GG. The measurement of observer agreement for
categorical data. Biometrics 1977; 33:159-174
10. Delmée M. Laboratory diagnosis of Clostridium difficile disease.
Clin Microbiol Infect 2001; 7:411-416.
4
11. Wilcox MH. Laboratory diagnosis of Clostridium difficile infection: in
a state of transition or confusion or both? J Hosp Infect 2011; 79:1-3.
12. van den Berg RJ, Bruijnesteijn van Coppenraet LS, Gerritsen HJ,
Endtz HP, van der Vorm ER, Kuijper EJ. Prospective multicenter
evaluation of a new immunoassay and real-time PCR for diagnosis
of Clostridium difficile-associated diarrhea in hospitalized patients.
J Clin Microbiol 2005; 43:5338-5340.
13. Keessen EC, Hopman NE, van Leengoed LA, van Asten AJ, Hermanus C,
Kuijper EJ, et al. Evaluation of four different diagnostic tests to detect
Clostridium difficile in piglets. J Clin Microbiol 2011; 49:1816-1821.
14. Silva ROS, Moreira FM, Rezende JV, Pires PS, Maranhão RPA,
Palhares MS, et al. First confirmed case of Clostridium difficile-
associated diarrhea in foals in Brazil. Ciência Rural 2012; 42:498-500.
15. Silva RO, D'elia ML, Magalhães Soares DF, Cavalcanti ÁR, Leal RC,
Cavalcanti G, et al. Clostridium difficile-associated diarrhea in an ocelot
(Leopardus pardalis). Anaerobe 2013; 20:82-84.
16. Shin BM, Kuak EY, Lee EJ, Songer JG. Algorithm combining toxin
immunoassay and stool culture for diagnosis of Clostridium difficile
infection. J Clin Microbiol 2009; 47:2952-2956.
17. Sharp SE, Ruden LO, Pohl JC, Hatcher PA, Jayne LM, Ivie WM.
Evaluation of the C.Diff Quik Chek Complete Assay, a new glutamate
dehydrogenase and A/B toxin combination lateral flow assay for use in
rapid, simple diagnosis of Clostridium difficile disease. J Clin Microbiol
2010; 48:2082-2086.
18. Songer JG, Uzal FA. Clostridial enteric infections in pigs. J Vet Diagn
Invest 2005; 17:528-536.
19. Malik DJ, Patel KV, Clokie MR, Shama G. On the difficulties of isolating
Clostridium difficile from hospital environments. J Hosp Infect 2013;
84:181-183.
20. Peterson LR, Manson RU, Paule SM, Hacek DM, Robicsek A, Thomson Jr RB,
et al. Detection of toxigenic Clostridium difficile in stool samples by
real-time polymerase chain reaction for the diagnosis of C. difficile-
associated diarrhea. Clin Infect Dis 2011a; 45:1152-1160.
21. Eastwood K, Else P, Charlett A, Wilcox M. Comparison of nine
commercially available Clostridium difficile toxin detection assays, a
real-time PCR assay for C. difficile tcdB, and a glutamate dehydrogenase
detection assay to cytotoxin testing and cytotoxigenic culture methods.
J Clin Microbiol 2009; 47:3211-3217.
22. Alcalá L. Laboratory tests for diagnosis of Clostridium difficile
infection: past, present, and future. Enferm Infecc Microbiol Clin 2013;
31:65-67.
23. Stamper PD, Alcabasa R, Aird D, Babiker W, Wehrlin J, Ikpeama I,
et al. Comparison of a commercial real-time PCR assay for tcdB
detection to a cell culture cytotoxicity assay and toxigenic culture for
direct detection of toxin-producing Clostridium difficile in clinical
samples. J Clin Microbiol 2009; 47:373-378.
24. Novak-Weekley SM, Marlowe EM, Miller JM, Cumpio J, Nomura JH,
Vance PH, et al. Clostridium difficile testing in the clinical laboratory by
use of multiple testing algorithms. J Clin Microbiol 2010; 48:889-893.
25. Litvin M, Reske KA, Mayfield J, McMullen KM, Georgantopoulos P,
Copper S, et al. Identification of a pseudo-outbreak of Clostridium
difficile infection (CDI) and the effect of repeated testing, sensitivity,
and specificity on perceived prevalence of CDI. Infect Control Hosp
Epidemiol 2009; 30:1166-1171.
26. Gade R, Turett G. The utility of repeated stool toxin testing
for diagnosing Clostridium difficile colitis. South Med J 2009; 102:
1007-1009.
27. Peterson LR, Mehta MS, Patel PA, Hacek DM, Harazin M, Nagwekar
PP, et al. Laboratory testing for Clostridium difficile infection: light at
the end of the tunnel. Am J Clin Pathol 2011; 136:372-380.
 Journal of Equine Veterinary Science xx (2014) 1–4

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Journal of Equine Veterinary Science

journal homepage: www.j-evs.com

Short Communication

Evaluation of Three Enzyme Immunoassays for Diagnosis

of Clostridium difficile–Associated Diarrhea in Foals
Rodrigo Otávio Silveira Silva PhD a, *, Monique Silva Neves M.Sc. a, Márcio Garcia Ribeiro PhD b,
Maristela Silveira Palhares PhD a, Renata de Pino Albuquerque Maranhão PhD a,
Francisco Carlos Faria Lobato PhD a
a
Veterinary School, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil
b
Department of Veterinary Hygiene and Public Health, School of Veterinary Medicine and Animal Sciences, Universidade Estadual PaulistadUNESP, Botucatu,
Sao Paulo, Brazil

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: The aim of the present study was to compare the test performances of three commercial
Received 26 January 2014 enzyme immunoassays (EIAs) against the toxigenic culture using the cytotoxicity assay as
Received in revised form 2 May 2014 the gold standard. All EIAs showed >78% sensitivity, and the lowest specificity was 92.6%.
Accepted 9 May 2014
These results suggest that EIAs could be useful for the diagnosis of Clostridium difficile
Available online xxxx
infection in foals.
Ó 2014 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords:
Colitis
Enteritis
Diarrhea
Zoonosis
Equine

1. Introduction and, more recently, toxigenic culture (TC) are considered to

Clostridium difficile is a spore-forming, anaerobic, gram-
positive bacillus responsible for most cases of antibiotic-
associated diarrhea in humans [1]. In veterinary medicine,
this bacterium is the major cause of diarrhea and colitis in
several domestic animals and some wildlife [2,3]. In foals, C.
difficile causes diarrhea, ranging from a mild, self-limiting
form to a peracute and fatal disease [4]. In addition,
studies have also shown that strains isolated from humans
suffering from C. difficile infection (CDI) exhibit high genetic
relatedness with strains isolated from animals, suggesting
the possibility of a zoonotic disease [5].
There is no “gold standard” for the diagnosis of CDI in
foals. In contrast, for humans, the cytotoxicity assay (CTA)
* Corresponding author at: Rodrigo Otávio Silveira Silva, PhD, Veteri-
nary School, Universidade Federal de Minas Gerais, Antônio Carlos
Avenue, 6627, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil.
E-mail address: rodrigo.otaviosilva@gmail.com (R.O.S. Silva).
be “gold-standard” diagnostic assays [1]. Both assays are
labor intensive and time consuming. Thus, commercial
enzyme immunoassays (EIAs) remain the most common
method used for the diagnosis of CDI in humans [6,7].
However, only one study has evaluated the use of a single
EIA for equine stool samples, thus the performance of most
commercially available detection methods remains un-
known [6]. Therefore, the aim of the present study was to
compare the test performances of three commercial EIAs to
the performances of the gold-standard CTA and TC for the
diagnosis of C. difficile in foal stool samples.
2. Methods and Materials
A total of 104 samples were obtained from foals aged
between 1 day and 6 months; 68 of these samples were
obtained from diarrheic foals submitted to the Veterinary
Hospital of Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
for the routine diagnosis of diarrhea, and 36 were normal

0737-0806/$ – see front matter Ó 2014 Elsevier Inc. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jevs.2014.05.012
2 R.O.S. Silva et al. / Journal of Equine Veterinary Science xx (2014) 1–4

stool samples collected from clinically healthy foals. All Table 1

specimens were collected at the time of clinical examina- Details of all foals positive for toxin detection and/or toxigenic culture.

tion in sterile containers and were stored at
20 C until Foal Age Clinical Status Toxin Toxigenic Culture
further analysis up to 7 days. Detectiona
The CTA for the detection of C. difficile A/B toxins was 20 d Mild diarrhea
Nontoxigenic (A
B
CDT
)
performed using Vero cells (Vero–ATCC CCL 81) as previ- 2d Nondiarrheic
Toxigenic (AþBþCDT
)
2 mo Nondiarrheic
Nontoxigenic (A
B
CDT
)
ously described [8]. Briefly, the fecal samples were diluted
5d Profuse diarrhea þ Toxigenic (AþBþCDT
)
1:4 in phosphate-buffered saline (pH 7.0) and centrifuged 15 d Profuse diarrhea þ Toxigenic (AþBþCDT
)
at 3,000  g for 5 minutes at 4 C. The resulting supernatant 15 d Profuse diarrhea þ Toxigenic (AþBþCDTþ)
was filtered through a 0.22-mm pore size filter and diluted 27 d Profuse diarrhea þ Toxigenic (AþBþCDT
)
twofold until a dilution of 1:1,024 was achieved. The serial 30 d Profuse diarrhea þ Negative
2 mo Profuse diarrhea þ Negative
dilutions and parallel samples containing Clostridium sor- 2 mo Profuse diarrhea þ Negative
dellii antitoxins (National Institute for Biological Standards 3 mo Profuse diarrhea þ Toxigenic (AþBþCDT
)
and Control, England) were applied onto the Vero cell 5 mo Profuse diarrhea þ Toxigenic (AþBþCDTþ)
monolayers. The cells were examined after 24 hours of 5 mo Profuse diarrhea þ Toxigenic (AþBþCDTþ)
incubation at 37 C in a 5% CO2 incubator. A specimen was a
Toxin detection by cytotoxicity assay and three commercial enzyme
considered positive if at least 90% of the cells were immunoassays.
rounded, and the effect was neutralized with antitoxin at
the same dilution in a parallel sample. Medina-Torrez et al [6], who examined a single EIA and
For isolation, the stool samples were submitted to reported a sensitivity and specificity of 84% and 96%,
alcohol shock, and 50 mL of aliquots were inoculated respectively. These results suggest that EIAs could be useful
onto plates containing cycloserine-cefoxitin fructose agar for diagnosis of C. difficile–associated diarrhea in foals.
(TCCFA-Hi-media, Mumbai, India) supplemented with 7% The TC showed a sensitivity of 70% compared with CTA;
horse blood and 0.1% sodium taurocholate (Sigma-Aldrich three samples were negative by TC but positive by CTA.
Co, St. Louis) [9]. After anaerobic incubation at 37 C for These samples were also positive in the three EIAs tested,
72 hours, all colonies with morphology and Gram staining suggesting that the absence of isolation was associated
suggestive of C. difficile were subjected to a multiplex po- with the TC protocol and did not result from a false-positive
lymerase chain reaction for a housekeeping gene (tpi), result by CTA. This result might have underestimated the
toxins A (tcdA) and B (tcdB), and a binary toxin gene (cdtB) sensitivity of the EIAs tested. Compared with CTA, all EIAs
as previously described [10]. A toxigenic C. difficile strain showed 100% sensitivity, but showed 77.8% sensitivity
(ATCC 9689) was used as a control for the TC method. compared with TC. Notably, even with this potential
Three commercial EIAs for A/B toxin detection were underestimation, the resulting sensitivity of the tested EIAs
tested: C. difficile Tox A/B II (Techlab Inc), Remel ProSpecT C. could be considered high. Unfortunately, there is no stan-
difficile Toxin A/B (Oxoid, UK), and Ridascreen C. difficile dard method for the TC of C. difficile, making it difficult to
toxins A/B (R-Biopharm, Germany). The EIAs were per- compare the results of TC from similar studies. Various
formed according to the manufacturer’s instructions. The mediums have been reported, and differences in the
sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), isolation protocols, such as the use of alcohol shock, and
negative predictive value, and 95% confidence interval were differences in incubation time have also been proposed.
calculated for each EIA against CTA and TC, and kappa Thus, the present study reported a simple isolation method,
coefficient was calculated to compare CTA and TC (STATA which would be faster and easier to perform compared
12, College Station, TX). with previous studies [6,11,12]. In this protocol, the samples
were submitted to an alcohol shock and were directly
3. Results plated onto TCCFA agar, followed by 72-hour incubation.
Some C. difficile strains did not grow, reflecting a suscepti-
The A/B toxins were detected by CTA in 10 foals (14.7%) bility to one or both of the antibiotics used on this medium
from the diarrheic group. Clostridium difficile strains were [13]. Recently, Malik et al [14] also showed that the anti-
recovered from 12 (11.5%) animals, of which nine strains biotics used in the selective media are responsible for an
were considered toxigenic and three were nontoxigenic additional stress to the recovery of C. difficile spores,
(A
B
CDT
) by polymerase chain reaction. Three toxigenic potentially reducing the isolation rates. In addition, the use
strains were AþBþCDTþ, whereas the remaining six strains of TCCFA, even with the supplementation of taurocholate,
were AþBþCDT
. The clinical status and age of the animals could have a variable sensitivity compared with enrich-
that were positive for A/B toxins or/and TC are summarized ment medium, such as TCCFB (cefoxitin-cycloserine broth,
in Table 1. The kappa concordance between TC and CTA was supplemented with taurocholate) [14,15]. These factors
0.71 (0.51–0.9 in a 95% confidence interval). All EIAs showed might have influenced the low sensitivity observed by TC
sensitivities of 77.8% and 100% compared with TC and CTA, for the foal samples. However, even with this slightly lower
respectively, whereas the specificity was >92.6% (Table 2). sensitivity, the concordance (kappa) between TC and CTA
was 0.71, which could be considered a substantial agree-
4. Discussion ment [16]. Anyway, the results of TC took at least 6 days to
obtain, even with the simple protocol used in the present
The high sensitivity and specificity of the EIAs for the study. Considering that CDI in foals is commonly a clinical
foal stool samples were consistent with the results of emergency [4], TC might not applicable for diagnosis.
 R.O.S. Silva et al. / Journal of Equine Veterinary Science xx (2014) 1–4 3

Although the absence of A/B toxins in nondiarrheic foals

97.9 (92.6–99.4)

97.8 (92.5–99.4)
97.8 (92.3–99.4)
97.8 (92.3–99.4)
has been previously reported [8,17,18], a recent survey
showed that clinicians and pathologists commonly request

Comparison of the three commercial enzyme immunoassays to cytotoxicity assay and toxigenic culture as gold standards for the diagnosis of Clostridium difficile–associated diarrhea in foals (n ¼ 104).
the inclusion of normal stool samples from foals for the
laboratory diagnosis of CDI [6]. Similar to previous studies

NPV

d
reported for human samples, the inclusion of normal
samples might lead to a decrease in the PPV [1,6,19]. A total

(39.7–89.2)

(35.4–84.8)
(26.8–73.2)
(26.8–73.2)
of 36 nondiarrheic samples were included in the present
study, and none of these samples were positive by CTA.
However, four nondiarrheic samples showed false-positive
63.6
70

50
50
PPV

d
results in the EIAs tested. Similar to a previous report by
Medina-Torres et al [6], our findings suggest that non-
diarrheic samples should not be tested when using an EIA
(91.1–98.9)

(89.7–98.4)
(85.6–96.4)
(85.6–96.4)
for the diagnosis of CDI in foals.
Specificity

In the present study, a toxigenic strain was isolated from

Toxigenic Culture % (95% CI)

a nondiarrheic 2-day-old foal, negative for A/B toxins by

96.8

95.8
92.6
92.6

CTA and all EIAs tested. The main hypothesis in this case is
d

related to an asymptomatic carrier status. This possibility

(45.3–93.7)

(45.3–93.7)
(45.3–93.7)
(45.3–93.7)

was already reported for equines, particularly for animals

younger than 14-days-old [20]. The asymptomatic carrier
Sensitivity

status is a known event in human, although it is considered

rare in healthy adults; however, asymptomatic carrier sta-
77.8

77.8
77.8
77.8

tus could account for approximately 9%–20% in some

d

groups, such as residents of long-term care facilities [1,21].

(91.1–98.9)

(95.9–100)
(95.9–100)
(96–100)

Acknowledgments
NPV

96.8
100
100
100

This work was supported by funds from FAPEMIG,

d

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Abbreviations: CI, confidence interval of 95%; NPV, negative predictive value; PPV, positive predictive value.
(45.3–93.7)
(62.3–98.4)
(45.4–88.3)
(45.4–88.3)

Superior, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico, INCT-Pecuária, and PRPq-UFMG.
77.8
90.9
71.4
71.4
PPV
d

References
(92.6–99.4)
(94.2–99.8)
(89.6–98.3)
(89.6–98.3)

[1] Silva Júnior M. Recent changes in Clostridium difficile infection.

Einstein 2012;10:105–9.
Specificity
Cytotoxicity Assay % (95% CI)

[2] Silva RO, Guedes RM, Lobato FC. Clostridium difficile infection: main
features and occurrence in domestic species in Brazil. Ciênc Rural
97.9
98.9
95.7
95.7

2013;43:73–80.
d

[3] Silva RO, DÉllia ML, de Magalhães Soares DF, Cavalcanti AR, Leal RC,
Cavalcanti G, Pereira PL, Lobato FC. Clostridium difficile-associated
(39.7–89.2)

diarrhea in an ocelot (Leopardus pardalis). Anaerobe 2013;20:82–4.

(72.1–100)
(72.1–100)
(72.1–100)

[4] Diab SS, Songer G, Uzal FA. Clostridium difficile infection in horses: a
review. Vet Microbiol 2013. http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.
Sensitivity

2013.03.032. pii: S0378–1135(13)00205-8.

[5] Songer JG. Clostridia as agents of zoonotic disease. Vet Microbiol
70
100
100
100

2010;140:399–404.
d

[6] Medina-Torres CE, Weese JS, Staempfli HR. Validation of a com-

mercial enzyme immunoassay for detection of Clostridium difficile
Ridascreen C. difficile toxins A/B (R-Biopharm)
Remel ProSpecT C. difficile Toxin A/B (Oxoid)

toxins in feces of horses with acute diarrhea. J Vet Intern Med 2010;
24:628–32.
[7] René P, Frenette CP, Schiller I, Dendukuri N, Brassard P, Fenn S,
Loo VG. Comparison of eight commercial enzyme immunoassays for
the detection of Clostridium difficile from stool samples and effect of
strain type. Diagn Microbiol Infect Dis 2012;73:94–6.
C. difficile Tox A/B II (Techlab)

[8] Silva RO, Ribeiro MG, Palhares MS, Borges AS, Maranhão RP,
Silva MX, Lucas TM, Olivo G, Lobato FC. Detection of A/B toxin and
isolation of Clostridium difficile and Clostridium perfringens from
foals. Equine Vet J 2013;45:671–5.
[9] Avbersek J, Janezic S, Pate M, Rupnik M, Zidaric V, Logar K,
Cytotoxicity assay
Toxigenic culture

Vengust M, Zemljic M, Pirs T, Ocepek M. Diversity of Clostridium

difficile in pigs and other animals in Slovenia. Anaerobe 2009;15:
252–5.
Method

[10] Silva RO, Salvarani FM, Cruz-Junior EC, Pires PS, Santos RL,
Table 2

Assis RA, Lobato FC. Detection of toxins A/B and isolation of

Clostridium difficile from piglets in Brazil. Cienc Rural 2011;41:
1130–5.
4 R.O.S. Silva et al. / Journal of Equine Veterinary Science xx (2014) 1–4
[11] Sharp SE, Ruden LO, Pohl JC, Hatcher PA, Jayne LM, Ivie WM.
Evaluation of the C.Diff Quik Chek Complete Assay, a new
glutamate dehydrogenase and A/B toxin combination lateral flow
assay for use in rapid, simple diagnosis of Clostridium difficile
disease. J Clin Microbiol 2010;48:2082–6.
[12] Keessen EC, Hopman NE, van Leengoed LA, van Asten AJ,
Hermanus C, Kuijper EJ, Lipman LJ. Evaluation of four different
diagnostic tests to detect Clostridium difficile in piglets. J Clin
Microbiol 2011;49:1816–21.
[13] Songer JG, Uzal FA. Clostridial enteric infections in pigs. J Vet Diagn
Investig 2005;17:528–36.
[14] Malik DJ, Patel KV, Clokie MR, Shama G. On the difficulties of
isolating Clostridium difficile from hospital environments. J Hosp
Infect 2013;84:181–3.
[15] Thitaram SN, Frank JF, Lyon SA, Siragusa GR, Bailey JS, Lombard JE,
Haley CA, Wagner BA, Dargatz DA, Fedorka-Cray PJ. Clostridium
difficile from healthy food animals: optimized isolation and preva-
lence. J Food Prot 2011;74:130–3.
[16] Landis JR, Koch GG. The measurement of observer agreement for
categorical data. Biometrics 1977;33:159–74.
[17] Weese JS, Staempfli HR, Prescott JF. A prospective study of the roles
of Clostridium difficile and enterotoxigenic Clostridium perfringens in
equine diarrhoea. Equine Vet J 2001;33:403–9.
[18] Båverud V, Gustafsson A, Franklin A, Aspán A, Gunnarsson A. Clos-
tridium difficile: prevalence in horses and environment, and anti-
microbial susceptibility. Equine Vet J 2003;35:465–71.
[19] Delmée M. Laboratory diagnosis of Clostridium difficile disease. Clin
Microbiol Infect 2001;7:411–6.
[20] Båverud V. Clostridium difficile infections in animals with special
reference to the horse. A review. Vet Q J 2002;24:203–19.
[21] Humphries RM. Laboratory tests for the diagnosis of Clostridium
difficile infections. Clinic Microbiol Newsl 2013;34:151–7.
Ciência Rural, Santa Maria, v.44,
Padronização n.8,modelo
de um p.1415-1421, ago, 2014
de infecção http://dx.doi.org/10.1590/0103-8478cr20131344
por Clostridium difficile em hamsters sírios Mesocricetus auratus. 1415
ISSN 0103-8478

Padronização de um modelo de infecção por Clostridium

difficile em hamsters sírios Mesocricetus auratus

Standardization of a model of Clostridium difficile infection in syrian hamsters Mesocricetus auratus

Rodrigo Otávio Silveira SilvaI* Roberto Maurício Carvalho GuedesI

Michelle de Paula GabardoI Carlos Augusto Oliveira JuniorI Felipe Masiero SalvaraniI
Prhiscylla Sadanã PiresI Guilherme Guerra AlvesI Francisco Carlos Faria LobatoI

RESUMO typhlitis in all death animals. In addition, all intestinal contents

O objetivo do presente trabalho foi padronizar um
modelo de infecção por Clostridium difficile (ICD) em hamsters
sírios (Mesocricetus auratus). Para seleção dos isolados capazes
de causar letalidade, cinco animais por grupo receberam uma
dose de clindamicina (30mg kg-1) por gavagem. Após 48 horas,
administraram-se 107 unidades formadoras de colônia (UFC), por
animal, de quatro diferentes isolados toxigênicos de C. difficile.
Selecinou-se um dos isolados capazes de causar diarreia e
letalidade e administrou-se 4x102; 4x104; 4x106; 4x108UFC por
animal, novamente com cinco hamsters por grupo. Em todas as
diluições testadas, foi possível observar a ocorrência de diarreia
e morte. A maior concentração testada (4x108UFC por animal)
causou óbito de 100% dos hamsters do grupo. Todos os animais que
vieram a óbito apresentaram tiflite hemorrágica, foram positivos
para as toxinas A/B e foi possível isolar C. difficile do conteúdo
intestinal, confirmando a reprodução experimental da doença. A
dose letal para 50% da população foi estabelecida em 6,3x104UFC
por animal. O modelo de indução de ICD em hamsters descritos no
presente estudo passa a ser uma ferramenta valiosa para estudos
relativos à patogenia, tratamento e controle dessa doença.
Palavras-chave: Clostridium difficile, diarreia nosocomial,
modelo animal, infecção hospitalar.
ABSTRACT
The aim of this study was to standardize a model
of Clostridium difficile infection (CDI) in Syrian hamsters
(Mesocricetus auratus). In order to evaluate strains capable of
causing lethality, five hamsters per group received clindamycin
(30mg kg-1) by gavage. After 48 hours, 107 colony forming units
(CFU) of spores’ solution of four strains were administered per
animal. One strain capable of causing diarrhea and death was
selected and administered at the following concentrations: 4x102;
4x104; 4x106; 4x108 CFU per animal. All dilutions tested were able
to cause diarrhea and death. The highest concentration showed
100% of mortality. Post mortem evaluation revealed hemorrhagic
were positive for A/B toxins, and toxigenic C. difficile strains
were isolated, confirming the induction of infection by this
microorganism. The dose lethal to 50% of the population was
calculated: 6.3x104 CFU per animal. The standardized model
of CDI in hamster is now available for studies on pathogenesis,
treatment and control of this disease.
Key words: Clostridium difficile, nosocomial diarrhea, animal
model, hospital infection.
INTRODUÇÃO
Considerando um patógeno
emergente, Clostridium difficile é responsável
pela maioria dos casos de diarreia nosocomial
e colite pseudomembranosa em seres humanos
(BALASSIANO et al., 2011). Em animais, a infecção
por C. difficile (ICD) foi recentemente confirmada no
Brasil em potros, cães e descrita em uma jaguatirica
criada em cativeiro (SILVA et al., 2013a; SILVA et
al., 2013b; SILVA et al., 2013c). Em suínos, estudos
recentes sugerem uma grande disseminação da
doença em granjas brasileiras com elevado número
de matrizes (LIPPKE et al., 2011; SILVA et al., 2011),
dado semelhante ao relatado nos últimos anos em
países da Europa e nos Estados Unidos, onde a ICD
é considerada a principal causa não controlada de
diarreia em leitões (SONGER, 2010).
Apesar da crescente importância de
C. difficile como enteropatógeno para animais
domésticos e humanos, não existem produtos

I
Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Avenida Antônio Carlos, 6627, 31270-901, Belo Horizonte, MG,
Brasil. E-mail: rodrigo.otaviosilva@gmail.com. *Autor de correspondência.
Recebido 10.10.13 Aprovado 24.01.14 Devolvido pelo autor 23.05.14
CR-2013-1344.R2 Ciência Rural, v.44, n.8, ago, 2014.
1416 Silva et al.
imunoprofiláticos para a doença. Em animais, somado
aos prejuízos causados pelo agente, especialmente
na suinocultura e equinocultura, pesquisas sugerem
ainda que a infecção por C. difficile seja uma possível
zoonose (ARROYO et al., 2005; JHUNG et al., 2008).
Caso essa hipótese seja confirmada, a prevenção da
doença e até mesmo da colonização por C. difficile no
trato gastro intestinal de animais domésticos passará
a ser uma prioridade (SILVA et al., 2013d).
Para o desenvolvimento e avaliação de
métodos de controle e tratamento da infecção por C.
difficile, faz-se necessário a utilização de modelos
animais de indução da doença. A principal espécie
utilizada para tal são os hamsters sírios (Mesocricetus
auratus), devido a sua alta sensibilidade a ICD,
fazendo com que seja possível realizar a indução
com diversas classes de antimicrobianos e sem
a necessidade de obtenção de animais livres de
patógenos. Porém, a maioria dos trabalhos sobre
modelos animais de ICD são pouco descritivos e
deixam em aberto pontos essenciais para reprodução
do protocolo de indução, tais como estirpe utilizada,
dose de antimicrobiano e forma de administração
(BEST et al., 2012). Além disso, a maioria dos
estudos relata o uso de amostras de C. difficile não
disponíveis no Brasil, dificultando a reprodução em
nosso meio (HOWERTON et al., 2013; NAGARO
et al., 2013). Dessa forma, o objetivo do presente
trabalho foi padronizar um protocolo de infecção por
C. difficile em hamsters sírios, disponibilizando-o
para futuros estudos sobre patogenia, tratamento e
métodos de controle da ICD no Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais utilizados
Foram utilizados cinco fêmeas de hamsters
sírios (Mesocricetus auratus), com quatro a oito
semanas de idade, por grupo experimental. Água,
maravalha, ração e gaiolas foram esterilizadas por
autoclavação (121°C por 20 minutos). Os animais
foram acondicionados em estantes ventiladas,
equipadas com filtros absolutos (Alesco Co.,
Inglaterra) para minimizar a contaminação do
ambiente e entre os grupos experimentais.
Estirpes avaliadas
Quatro estirpes toxigênicas (A+B+) de C.
difficile, pertencentes à bacterioteca do Laboratório
de Anaeróbios da Escola de Veterinária da UFMG,
foram pré-selecionadas para avaliação quanto à
toxigenicidade in vivo, sendo elas: ATCC 9689,
gentilmente cedida pela Fundação Oswaldo Cruz;
EQ5, estirpe isolada de um potro com ICD (PREIS
et al., 2012); Z14, estirpe isolada de um cão
aparentemente saudável; I4, estirpe isolada de um
suíno com ICD.
Produção dos esporos das estirpes de C. difficile
Os esporos de C. difficile foram produzidos
de acordo com YANG et al. (2009). As estirpes de C.
difficile foram inoculadas em erlenmeyer contendo
250mL de BHI (Difco Laboratories, EUA), seguindo
de incubação a 37°C por 72 horas em ambiente de
anaerobiose. Após esse período, as culturas foram
mantidas por cinco dias em temperatura ambiente para
induzir a esporulação. O conteúdo foi centrifugado
a 10.000 x g por 20 minutos e ressuspendido com
10mL de salina esterilizada 0,85% por duas vezes.
Posteriormente, a suspensão foi submetida ao
aquecimento de 80°C por 30 minutos, e repetição
do protocolo de centrifugação. As soluções foram
aliquotadas em microtubos esterilizados, contendo
300μl, e armazenadas a -20°C até a utilização.
Uma semana após a produção, as soluções
de esporos foram avaliadas por meio de coloração de
Gram, coloração de esporos (Wirtz-Conklin) e teste
respiratório em ágar sangue, constituído de ágar Muller-
Hinton (Difco Laboratories, EUA) suplementado
com 5% de sangue ovino. Para determinação da
concentração de unidades formadoras de colônia
por mL, diluições seriadas na base 10 (variando de
10-3 a 10-8) foram inoculadas em ágar sangue. Após
incubadas por 48 horas em ambiente de anaerobiose
produzido por mistura gasosa (10% H2, 10% CO2, 80%
N2), placas com 30 a 300 colônias foram contadas e
calculou-se a média de UFC/mL.
Para determinação da viabilidade da
solução de esporos armazenada à -20°C, uma alíquota
da solução da estirpe ATCC9689 foi descongelada
mensalmente, durante um período total de seis meses,
e submetida à contagem de UFC/mL, como descrito
anteriormente. As contagens obtidas ao longo do
período de avaliação foram comparadas pelo teste
do qui-quadrado e pelo teste de Fisher, em um nível
de significância de 95% (P<0,05) (STATA, College
Station, Texas, EUA).
Avaliação da toxigenicidade in vivo das estirpes de
C. difficile
O objetivo desta etapa foi avaliar quais
estirpes eram capazes de infectar os hamsters e,
consequentemente, causar diarreia e óbito desses.
A avaliação de toxigenicidade in vivo foi realizada
segundo SAMBOL et al. (2002). Dois dias após
uma dose de clindamicina (30mg kg-1), administrou-
Ciência Rural, v.44, n.8, ago, 2014.
 Padronização de um modelo de infecção por Clostridium difficile em hamsters sírios Mesocricetus auratus.
se 100μL de solução de esporos contendo 107UFC
das estirpes toxigênicas em cada animal. As
administrações foram realizadas por gavagem. Os
grupos, contendo cinco hamsters em cada, foram
divididos da seguinte forma: no grupo 1 (G1), os
animais receberam esporos da estirpe ATCC9689; no
grupo 2 (G2), foram administrados esporos da estirpe
EQ5; no grupo 3 (G3), os animais receberam esporos
da estirpe Z14; no grupo 4 (G4), administrou-se a
estirpe I4; no grupo 5 (C1), os animais receberam
apenas a dose de clindamicina e, 48 horas depois,
uma dose de 100μL de salina esterilizada 0,85%; no
grupo 6 (C2), os animais receberam apenas esporos da
estirpe toxigênica ATCC9689, sem a administração
prévia de clindamicina.
Os animais foram observados diariamente
por 30 dias quanto à ocorrência de diarreia (presença
de fezes amolecidas na gaiola, cauda e focinho com
sujidades indicativas) e morte. Após o término do
experimento ou quando ocorria o óbito, os animais
eram necropsiados e fragmentos do ceco eram
coletados e fixados em formalina tamponada a 10%.
Posteriormente, foi feito o processamento pela técnica
de desidratação, diafanização, inclusão, secção
de 5 micras e coração pela hematoxilina e eosina
(LUNA, 1968) e avaliação histológica, realizada em
microscópio de luz clara. Coletou-se ainda o conteúdo
intestinal para detecção das toxinas A/B pelo teste
de citotoxicidade celular (CTA) e isolamento de C.
difficile, como descrito por SILVA et al. (2013d).
Determinação da dose mínima mortal (DMM) e da
dose letal para 50% (DL50)
Dentre as estirpes capazes de causar
infecção e letalidade, selecionou-se uma para
avaliação da DMM e cálculo da DL50. Foram formados
Tabela 1 - Ocorrência de diarreia, morte, lesões intestinais e resultado de isolamento e detecção das toxinas A/B por CTA nos grupos
inoculados (G1 a G4) e nos grupos controle (C1 e C2) com diferentes estirpes toxigênicas de Clostridium difficile.
------------------Ocorrência (%)-----------------
Grupo (Estirpe)
Diarreia
G1 (ATCC) 4/5 (80)
G2 (EQ5) 3/5 (60)
G3 (Z14) 4/5 (80)
G4 (I4) 3/5 (60)
C1 (Nenhuma) 0/5 (0)
C2 (ATCC) 0/5 (0)
1
Presença de lesões macroscópicas e microscópicas nos animais que vieram a óbito. 2Isolamento de estirpes de C. difficile toxigênicas.
1417
cinco grupos contendo cinco hamsters em cada.
Administrou-se uma solução de esporos contendo
4x102 (grupo A1), 4x104 (grupo A2), 4x106 (grupo
A3) e 4x108 (grupo A4) UFC por animal. No quinto
grupo (grupo controle), houve administração de
apenas 100μL de salina esterilizada 0,85%. Utilizou-
se mesmo esquema de indução e acompanhamento
descrito para a avaliação da toxigenicidade in vivo.
O total de óbitos ocorridos em cada grupo ao final do
período de avaliação foi comparado pelo teste teste de
Fisher, em um nível de significância de 95% (P<0,05)
(STATA, College Station, Texas, EUA).
RESULTADOS
Na produção das soluções de esporos, a
contagem de unidades formadoras de colônia variou
de 2,0x108 a 4,0x109UFC mL-1 entre as estirpes
trabalhadas. A contagem inicial da estirpe ATCC9689
foi de 2,2x109UFC mL-1, sendo que a média das
sete contagens foi de 2,1x109UFC mL-1 e o desvio
padrão de ±1,2x108UFC mL-1, não havendo alteração
significativa da contagem bacteriana ao longo do
tempo testado.
Na avaliação da toxigenicidade in vivo
das estirpes de C. difficile, todas as amostras testadas
foram consideradas toxigênicas, uma vez que foram
capazes de causar diarreia e morte dos animais
(Tabela 1). No exame post mortem, a mucosa e a serosa
do ceco dos animais que vieram a óbito encontravam-
se extensamente hemorrágicas e com conteúdo
líquido de aspecto sanguinolento (Figura 1: B1). Na
avaliação histopatológica, foi possível observar uma
extensa destruição da mucosa intestinal com infiltrado
inflamatório difusamente distribuído na mucosa e intensa
quantidade de células eritrocíticas, caracterizando uma
tiflite necro-hemorrágica (Figura 1: B2).
Lesões1 Isolamento2 Toxinas A/B
Morte
5/5 (100) Sim Positivo Positivo
4/5 (80) Sim Positivo Positivo
4/5 (80) Sim Positivo Positivo
4/5 (80) Sim Positivo Positivo
0/5 (0) Não Negativo Negativo
0/5 (0) Não Negativo Negativo
Ciência Rural, v.44, n.8, ago, 2014.
1418 Silva et al.

Figura 1 - (A1) Cavidade abdominal de um hamster do grupo C1. Ceco sem alterações
macroscópicas visíveis; (B1) Cavidade abdominal de um hamster do grupo
G1. Alças cecais tumefeitas com serosa intensamente e difusamente congesta,
apresentando líquido serosanguinolento no lúmen, sugestivo de tiflite
hemorrágica; (A2) Micrografia do ceco de um animal do grupo controle
(C1), mostrando as vilosidades com aspecto normal (aumento de 10X). (B2)
Micrografia do ceco de um animal do grupo G1. Nota-se a extensa destruição
da mucosa intestinal, infiltrado inflamatório difusamente distribuído na
mucosa e intensa quantidade de células eritrocíticas, caracterizando uma tiflite
necro-hemorrágica (aumento de 10X).

A partir do conteúdo intestinal, coletado DISCUSSÃO

durante a necropsia dos hamsters que vieram
expontaneamente a óbito, foi possível detectar as
toxinas A/B e isolar C. difficile de todos os animais
avaliados (Tabela 1). Já nos grupos controle (C1 e
C2), nenhum animal desenvolveu diarreia ou veio a
óbito durante o período de observação. Tais hamsters
foram eutanasiados 30 dias pós-desafio e nenhuma
alteração post mortem significativa foi observada
(Figura 1: A1 e A2). O conteúdo do ceco encontrava-
se com consistência pastosa a sólida e não foi
possível detectar as toxinas A/B ou isolar C. difficile
de nenhum animal dos grupos controle (Tabela 1).
Selecionou-se a estirpe ATCC9689 para
prosseguimento do trabalho. A figura 2 mostra o
tempo de sobrevivência nos 30 dias de observação
dos animais inoculados com diferentes concentrações
da estirpe ATCC9689 durante a determinação da
DMM e DL50. Comparando com o grupo controle,
foi possível perceber uma diferença significativa na
ocorrência de morte nos grupos A2, A3 (P=0,038)
e no grupo A4 (P=0,001). Todos os hamsters que
vieram a óbito possuiam lesões hemorrágicas no ceco
e foram positivos para as toxinas A/B de C. difficile,
confirmando novamente a indução da doença.
O protocolo de produção de esporos
permitiu a obtenção de uma suspensão rica de esporos
livres (sem a presença do corpo celular), com alto grau
de pureza e sem contaminação no teste respiratório.
Resultados semelhantes de pureza e concentração
foram relatados por YANG et al. (2009) para obtenção
de esporos de Clostridium sporogenes e Clostridium
hungatei, sugerindo que esse protocolo, apesar de
simples, é suficiente para a obtenção de uma solução
de esporos de alta concentração e de elevada pureza.
Enquanto alguns trabalhos com modelos
de ICD em hamsters não especificam a forma
bacteriana administrada (ANTON et al., 2004), outros
autores relatam o uso de apenas células vegetativas
(MCVAY & ROLFE, 2000; KOKKOTOU et al.,
2008), apenas esporos (SAMBOL et al., 2002;
NAGARO et al., 2013) ou proporções estimadas de
ambos (OCHSNER et al., 2009). No presente estudo,
optou-se por trabalhar com soluções de esporos livres
que, devido à alta resistência típica dessa forma
bacteriana, sofrem menos alterações na concentração
de UFC após armazenamento. Como o esperado, as

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 Padronização de um modelo de infecção por Clostridium difficile em hamsters sírios Mesocricetus auratus.
Figura 2 - Sobrevivência de hamsters durante o período de observação de 30 dias dos grupos de animais inoculados com
diferentes concentrações de esporos da estirpe ATCC9689 (A1 a A4) de Clostridium difficile e do grupo controle.
contagens seguintes à inicial apresentaram resultados
semelhantes em todos os sete tempos avaliados,
totalizando seis meses de armazenagem sem alteração
significativa da contagem. Tal resultado demonstra a
resistência dos esporos de C. difficile armazenados a
-20°C e confirma a possibilidade de armazenamento
da solução nessas condições, facilitando o protocolo
de indução, devido à não necessidade de contínua
produção e dosagem da estirpe a ser utilizada.
Na avaliação da toxigenicidade in vivo das
estirpes de C. difficile, as lesões observadas foram
similares às comumente relatadas em infecções
por C. difficile em hamsters e outros roedores de
laboratório (SAMBOL et al., 2002; BEST et al., 2012;
HOWERTON et al., 2013; NAGARO et al., 2013).
Tais alterações foram ainda encontradas em todos os
animais que vieram a óbito durante o experimento,
incluindo aqueles que não apresentaram diarreia
previamente. Além das lesões características, o
isolamento e detecção das toxinas A/B nesses animais
confirmam a indução da doença (Tabela 1).
Nos grupos controle (C1 e C2), não foram
observados indícios de colonização ou infecção por
C. difficile (Tabela 1). Tais resultados confirmam
que não houve infecção cruzada no grupo C1, uma
vez que tais animais receberam antimicrobiano e
estariam susceptíveis à colonização por C. difficile.
No grupo C2, a ausência de infecção demonstra
que não houve colonização pela estirpe ATCC9689,
provavelmente, devido ao “efeito barreira” da
microbiota íntegra (BÅVERUD, 2002).
Três animais, dos grupos G1, G2 e G4,
vieram a óbito antes que o quadro clínico de diarreia
1419
pudesse ser observado. A infecção por C. difficile em
hamsters é comumente fulminante, culminando com
um quadro hiperagudo da doença, que é caracterizado
por extensa necrose intestinal e toxemia, podendo
ocorrer óbito dos animais antes mesmo da visualização
do quadro clínico de diarreia (CHEN et al., 2008;
BEST et al., 2012; HOWERTON et al., 2013).
Nos três animais que sobreviveram, dos
grupos G2, G3 e G4, não foram observadas alterações
post mortem significativas e não foi possível detectar
as toxinas A/B. Além disso, C. difficile não foi isolado
do conteúdo intestinal, semelhante aos animais dos
dois grupos controle. Acredita-se que a falha de
indução possa ter ocorrido pela administração de
uma dose insuficiente de esporos de C. difficile ou a
microbiota não tenha sido suficientemente agredida
pela dose de antibiótico administrada, permanecendo
o efeito barreira (BÅVERUD, 2002).
Como todas as estirpes trabalhadas foram
capazes de induzir a diarreia, optou-se por prosseguir o
trabalho com a estirpe ATCC9689, por tratar-se de uma
estirpe de referência certificada, internacionalmente
reconhecida e fornecida gratuitamente pela Fundação
Oswaldo Cruz (Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil),
as universidades e orgãos de pesquisa brasileiros.
Na figura 2, percebe-se que os óbitos iniciaram
24 horas após a administração dos esporos, mas
concentraram-se principalmente entre 72 e 96 horas
pós-desafio, resultado semelhante ao relatado em
trabalhos anteriores com hamsters (SAMBOL et al.,
2002; NAGARO et al., 2013). Além da utilização de
diferentes estirpes de C. difficile, o grande número de
Ciência Rural, v.44, n.8, ago, 2014.
1420
diferentes protolocos de administração em modelos
de ICD dificulta comparações. Em geral, as doses
variam de 107 a 104 UFC por animal, porém a via
de administração (gavagem, via oral), o tempo após
antibioticoterapia que a estirpe é administrada e até
mesmo a forma bacteriana utilizada (esporos, células
vegetativas) variam, impedindo conclusões. Por
outro lado, independente da forma e estirpe utilizada,
a grande maioria dos trabalhos utilizam doses que
causam entre 60 e 100% de letalidade (SAMBOL
et al., 2002; CHEN et al., 2008; BEST et al., 2012;
HOWERTON et al., 2013; NAGARO et al., 2013).
Considerando a diferença estatística apresentada
entre os grupos desafiados, quando comparados com
o grupo controle, seria possível utilizar qualquer
dose entre 4x104 e 4x108UFC da estirpe ATCC9689,
por animal, para estudos de avaliação de métodos
de proteção ou de tratamento. Alguns trabalhos de
indução de infecções para outros micro-organismos
utilizam também a DL50. No presente estudo, a DL50
calculada segundo REED & MUENCH (1938) foi de
6,3x104UFC por animal.
O protocolo padronizado no presente estudo
permitiu a utilização de hamsters sírios (Mesocricetus
auratus) como modelo de indução da infecção por
C. difficile, disponibilizando-o como uma ferramenta
valiosa para estudos relativos à patogenia, tratamento e
controle dessa doença no Brasil.
APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ETICA
Protocolo número 142/2012, CEUA-UFMG.
AGRADECIMENTOS
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do estado
de Minas Gerais (FAPEMIG), Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Institutos Nacionais de
Ciência e Tecnologia (INCT). FCFL e RMCG possuem bolsa de
produtividade em pesquisa do CNPq.
REFERÊNCIAS
ANTON, P.M. et al. Rifalazil treats and prevents relapse
of Clostridium difficile-associated diarrhea in hamsters.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.48, n.10, p.3975-
3979, 2004. Avaliable from: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
pubmed/15388461>. Accessed: May 04, 2013. doi: 10.1128/
AAC.48.10.3975-3979.2004.
ARROYO, L.G. et al. PCR ribotyping of Clostridium difficile isolates
originating from human and animal sources. Journal of Medical
Microbiology, v.54, p.163-6, 2005. Avaliable from: <http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15673511>. Accessed: May 04, 2013.
doi: 10.1099/jmm.0.45805-0.
Silva et al.
BALASSIANO, I.T. et al. Detection of cross-infection associated
to a Brazilian PCR-ribotype of Clostridium difficile in a university
hospital in Rio de Janeiro, Brazil. Antonie Van Leeuwenhoek,
v.99, n.2, p.249-255, 2011. Avaliable from: <http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/pubmed/20623188>, Accessed: May 04, 2013. doi:
10.1007/s10482-010-9483-8.
BÅVERUD, V. Clostridium difficile infections in animals with
special reference to the horse: a review. Veterinary Quarterly,
v.24, n.4, p.203-219, 2002. Avaliable from: <http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/pubmed/12540137>. Accessed: May 04, 2013.
BEST, E.L. et al. Models for the study of Clostridium difficile
infection. Gut Microbes, v.2, p.145-167, 2012. doi: 10.4161/
gmic.19526.
CHEN, X. et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated
disease. Gastroenterology, v.135, p.1984-1992, 2008. Avaliable
from: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18848941>. Accessed:
May 04, 2013.
HOWERTON, A. et al. A new strategy for the prevention of
Clostridium difficile infection. Journal of Infectious Diseases,
v.207, p.1498-504, 2013. Avaliable from: <http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/pubmed/23420906>. Accessed: Dec. 04, 2013. doi:
10.1093/infdis/jit068.
JHUNG, M.A. et al. Toxinotype V Clostridium difficile in humans
and food animals. Emerging Infectious Diseases, v.14, n.7,
p.1039-1045, 2008. Avaliable from: <http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/pubmed/18598622>. Accessed: May 04, 2013.
KOKKOTOU, E. et al. Comparative efficacies of rifaximin and
vancomycin for treatment of Clostridium difficile-associated diarrhea
and prevention of disease recurrence in hamsters. Antimicrobrial
Agents Chemotherapy, v.52, n.3, p.1121-1126, 2008. Avaliable
from: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18598622>. Accessed:
May 04, 2013. Doi: 10.1128/AAC.01143-07.
LIPPKE, R.T. et al. Matched case-control study evaluating the
frequency of the main agents associated with neonatal diarrhea in
piglets. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.31, n.6, p.505-510,
2011. doi: 10.1590/S0100-736X2011000600008.
LUNA, L.G. Routine staining procedures. In: LUNA, L.G. (Ed).
Manual of histologic staining methods of the armed forces institute
of pathology. New York: McGraw- Hill Book, 1968. p.32-29.
MCVAY, C.S.; ROLFE, R.D. In vitro and in vivo activities of
nitazoxanide against Clostridium difficile. Antimicrobial Agents
and Chemotherapy, v.44, p.2254-2258, 2000. Avaliable from:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC90054>. Accessed:
May 04, 2013.
NAGARO, K.J. et al. Nontoxigenic Clostridium difficile protects
hamsters against challenge with historic and epidemic strains of
toxigenic BI/NAP1/027 C. difficile. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v.57, p.5266-5270, 2013. Avaliable from: <http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23939887>. Accessed: Dec. 01,
2013. doi: 10.1128/AAC.00580-13.
OCHSNER, U.A. et al. Inhibitory effect of REP3123 on
toxin and spore formation in Clostridium difficile, and in vivo
efficacy in a hamster gastrointestinal infection model. Journal
of Antimicrobial and Chemotherapy, v.63, p.964-971, 2009.
doi:10.1093/jac/dkp042.
Ciência Rural, v.44, n.8, ago, 2014.
 Padronização de um modelo de infecção por Clostridium difficile em hamsters sírios Mesocricetus auratus.
PREIS, I.S. et al. Enteritis associated with Clostridium difficile
and opportunistic candidiasis in a foal. Brazilian Journal of
Veterinary Pathology, v.5, n.1, p.7-11, 2012.
REED, L.J; MUENCH, H.A. Simple method of determining fifty
percent endpoints. American Journal of Hygiene, v.27, p.494-
497, 1938.
SAMBOL, S.P. et al. Colonization for the prevention of Clostridium
difficile disease in hamsters. Journal of Infection Diseases, v.186,
n.12, p.1781-1789, 2002. Avaliable from: <http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/pubmed/12447764>. Accessed: May 04, 2013.
SILVA, R.O.S. et al. Detection of toxins A/B and isolation of
Clostridium difficile and Clostridium perfringens from dogs in
Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v.44, n1, p.131-137,
2013a. doi:10.1590/S1517-83822013005000008.
SILVA, R.O.S. et al. Clostridium difficile-associated diarrhea
in an ocelot (Leopardus pardalis). Anaerobe, v.20, p.82-
84, 2013b. Avaliable from: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
pubmed/23467074>. Accessed: May 04, 2013. doi: 10.1016/j.
anaerobe.2013.02.007.
1421
SILVA, R.O.S. et al. Detection of A/B toxin and isolation of
Clostridium difficile and Clostridium perfringens from foals. Equine
Veterinary Journal, v.45, p.671-675, 2013c. Avaliable from: <http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23452044>. Accessed: May 04,
2013. doi: 10.1111/evj.12046.
SILVA, R.O.S. et al. Clostridium difficile infection: main features
and occurrence in domestic species in Brazil. Ciência Rural, v43,
n.1, p.73-80, 2013d. doi:10.1590/S0103-84782012005000137.
SILVA, R.O.S. et al. Detection of toxins A/B and isolation of
Clostridium difficile from piglets in Brazil. Ciência Rural, v.41
n.8, p.1130-1135, 2011. doi:10.1590/S0103-84782011005000100.
SONGER, J.G. Clostridia as agents of zoonotic disease.
Veterinary Microbiology, v.140, p.399-404, 2010. doi: 10.1016/j.
vetmic.2009.07.003.
YANG, W. et al. Production and characterization of pure
Clostridium spore suspensions. Journal of Applied
Microbiolology, v.106, p-27-33, 2009. Avaliable from: <http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19120612>. Accessed: May 04,
2013. doi:10.1111/j.1365-2672.2008.03931.x.
Ciência Rural, v.44, n.8, ago, 2014.