PRATICA 4: MÉTODO OU COLORAÇÃO SIMPLES

I-INTRODUÇÃO

No método ou coloração simples deve-se fazer a coloração de microrganismo com

uma única solução de corante consistindo em avaliar as estruturas gerais de microrganismos por

meio de microscópio óptico e através de corantes que reagem quimicamente a fim de tornar a

forma e estrutura básica das células mais visíveis.

A maioria dos corantes são sais constituídos de cátions e ânions. As bactérias por

sua vez, possuem uma pequena carga elétrica negativa, quando o pH do meio é

aproximadamente neutro. A combinação dos cátions dos sais com as células bacterianas resulta

em sua coloração.

Antes da coloração tem de se fazer um esfregaço, e fixá-lo pelo calor. Um

esfregaço faz-se espalhando uma suspensão de bactérias numa lâmina limpa e deixando-a secar

ao ar. O esfregaço é então levado à chama de um bico de Bunsen, para fixar as bactérias pelo

calor. Este passo desnatura as enzimas bacterianas, evitando que digiram partes das células,

provocando a sua autólise. O calor também promove a aderência das células à lâmina.

A identificação das leveduras, assim como a identificação das bactérias, envolve

testes bioquímicos. Entretanto, fungos multinucleados são identificados considerando seu

aspecto, incluindo características da colônia e dos esporos reprodutivos. (GERARD et.al, 2012,

p.331)

O talo (corpo) de um fungo filamentoso consiste de filamentos longos das células

conectadas; esses filamentos são denominados hifas, que podem crescer até imensas

proporções. Na maioria dos fungos filamentosos, as hifas contem paredes cruzadas

denominadas septos, que dividem as hifas em distintas unidades celulares uninucleadas (um

único núcleo). Essas hifas são chamadas de hifas septadas. Em algumas poucas classes de

fungos, as hifas não contem septos e se apresentam como células longas e continuas com muitos

núcleos. Elas são chamadas de hifas cenocíticas. (GERARD et.al, 2012, p.331)
 As leveduras são fungos unicelulares , não filamentosos, tipicamente esféricos ou

ovais. Da mesma forma que os fungos filamentosos, as leveduras são amplamente distribuídas

na natureza: com frequência são encontradas como um pó branco cobrindo frutas e folhas.

(GERARD et.al, 2012, p.332)

II-OBJETIVOS

 Confeccionar laminas coradas

 Avaliar a morfologia de microrganismos

 Manusear o microscópio optico

III-MATERIAL

 Laminas de vidro

 Alça de inoculação

 Bico de Bunsen

 Alcool 70 %

 Papel toalha

 Azul de metileno

 Óleo de imersão

 Microscópio

IV-PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Através do bico de Bunsen, flamba-se a ponta da alça de inoculação para que os

possíveis contaminantes sejam extinguidos. Em seguida, para a preparação do esfregaço,

coloca-se uma gota de água destilada no centro de uma lamina de vidro e usando a alça de
inoculação adiciona-se a cultura microbiana a ser analisada (que no caso refere-se a levedura e

fungo filamentoso).

Espalha-se a cultura no centro da lamina com os devidos movimentos circulares

intercalando a passagem da lamina na chama no bico de Bunsen de modo que a amostra fixe

pelo calor na lamina e por conseguinte a aplicação do azul de metileno sobre o esfregaço

durante um minuto.

Logo após lava-se o esfregaço com agua da torneira e depois enxuga-se a lamina

entre papel de filtro sem que seja atritado. Em seguida, leva-se a lamina ao microscópio optico,

adiciona-se uma gota de óleo de imersão para o caso onde deve-se examinar a morfologia do

microrganismo em zoom de 100X em microscópio optico.

V- RESULTADOS E DISCUSSÃO

Figura-1: Partes de um microscópio óptico

Figura-2:Fungo Filamentoso ampliação 20X

Figura-3:Fungo Filamentoso ampliação 40X

Figura-4:Fungo Filamentoso ampliação 100X

Figura-5:Levedura ampliação 10X

Figura-6:Levedura ampliação 20X

FIG-7:Levedura ampliação 40X

 Figura-8:Levedura ampliação 100X

Para a realização deste experimento foi necessário a utilização do microscópio

óptico com seus devidos cuidados (Ver figura -1 ):

1- Verificação da voltagem;

2- Sistema de iluminação acesa;

3- Abrir o diafragma totalmente colocando o sistema condensador diafragma na

posição mais elevada;

4- Movimentação do revólver, colocando em posição a objetiva de menor

aumento (10X) ;

5- Colocar a lamina na platina, com a preparação para cima, fixando-a a platina;

6- Movimentar o charriot, fazendo com que o esfregaço fique em baixo da

objetiva ;

7- Com o parafuso macrométrico, elevar a platina ao máximo, observando que a

platina não toque na lâmina ou lamínula, pois poderá quebra-la;

8- Focalizar a preparação para a obtenção de uma imagem nítida, movimentando

o botão macrométrico para baixo até que se possa visualizar a imagem;

 9- Limpar a objetiva de maior aumento (100X) a qual foi utilizada com óleo de

imersão usando álcool e um papel macio ou algodão.

A partir do experimento realizado no laboratório, observou-se através do

microscópio optico nas figuras 2,3 e 4 a estrutura de um fungo filamentoso. Mais

precisamente nas figuras 2 e 3 pode-se ser notado as colônias dos fungos filamentosos

evidenciados pela presença das hifas. Na figura-4 pode-se ver com maior clareza a presença

dos esporos fungicos filamentosos, característica esta de importância especial uma vez que é a

forma mais frequente de reprodução e principal veiculo de disseminação.

Nas figuras 5,6,7 e 8 evidenciou-se as características das leveduras através de sua

estrutura esférica e elíptica. Nas figuras 5,6 e 7 pôde-se ver a formação de colônias em uma

certa desuniformidade de diâmetros das leveduras; na figura 8 observa-se com maior nitidez a

absorção da coloração da levedura em um verde claro ja que o azul de metileno penetrou no

citoplasma do mesmo.

VI-CONCLUSÃO

Pôde-se através dos experimentos laboratoriais alcançar os objetivos a que se

esperava possibilitando a identificação de microrganismos fúngicos tal como o manuseio de

microscópio óptico.
 Referencias

GERARD,J.Tortora. et.al. Microbiologia. 10ªed.Porto Alegre: Artmed Editora AS,2012.