DETERMINAO DE CONDIES IDEAIS PARA PRODUO DE POLIGALACTURONASE POR Kluyveromyces marxianus1

CLAUDIA EUGENIA CASTRO BRAVO2 ELIANA PINHEIRO DE CARVALHO3 ROSANE FREITAS SCHWAN4 RAL J. H. CASTRO GMEZ5 LUCIMEIRE PILON6
RESUMO - Enzimas pectinolticas podem ser sintetizadas por bactrias, fungos e leveduras. Essas enzimas apresentam importncia industrial, principalmente no processamento de suco de frutas e vinhos, tratamento de fibras txteis e na fermentao do cacau e do caf. A otimizao das condies de cultivo, aliada escolha de linhagens apropriadas, podem levar a uma melhor produo enzimtica. Este trabalho foi desenvolvido com a finalidade de definir melhores concentraes dos parmetros ( concentrao de acar no caldo de cana, concentrao de sulfato de amnio e concentrao de pectina ctrica) a serem utilizados nos meios fermentativos. Para tal, foi utilizado um delineamento experimental central composto rotacional de superfcie de resposta de um fatorial 53 e 52. De acordo com modelos de superfcies de respostas utilizados, pode-se estimar que, para se obter uma mxima atividade da enzima poligalacturonase, o caldo de cana-de-acar deve ser utilizado em concentraes entre 9,17 a 14,83o Brix, suplementado com sulfato de amnio e pectina em concentraes entre 0,40 a 0,58 g/100 ml e 0,50 a 1,05g/100 ml, respectivamente. A atividade da enzima poligalacturonase foi expressa em mg de cido galacturnico liberados/ml.

TERMOS PARA INDEXAO: Enzimas, Poligalacturonase, Kluyveromyces marxianus.

DETERMINATION OF SUITABLE CONDITIONS FOR POLYGALACTURONASE PRODUCTION BY Kluyveromyces marxianus.

ABSTRACT: Pectinolytic enzymes can be synthesized by bacteria, fungi and yeasts. They present industrial importance, mainly in the proccessing of fruit juices and wines, textil fiber treatments, in the fermentation of cocoa and coffee. The optimization of growing conditions, associated with the choice of suitable lines can lead to an improved enzyme production.. This work was developed aing at defining better parameter (sugar cane broth, ammonium sulphate and citric pectin) concentrations to be utilized in fermentation media by a switch compost central experimental design of response surface of factorial 53 and 52. According to response surface models employed, it is possible to conclude for maximal activity of polygalacturonase enzyme to be obtained sugar cane broth should be utilized at concentrations between 9,17 to 14,83 0 Brix, supplemented with ammonium sulphate and pectin at concentrations between 0,40 to 0,58 g/100 ml and 0,50 to 1,05 g/100ml, respectively

INDEX TERMS: Enzyme, Polygalacturonase, Kluyveromyces marxianus. INTRODUO As enzimas, de um modo geral, so amplamente utilizadas nos mais diversos processos industriais, em razo da sua especificidade e do seu potencial cataltico. Entretanto, uma enzima torna-se de valor comercial somente se houver demanda ou possuir propriedades que atendam aos requerimentos tcnicos e econmicos do processo em escala industrial.

1. Parte da dissertao apresentada UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS (UFLA), para obteno do ttulo de mestre em Cincia dos Alimentos. 2. Biloga, MS. Departamento de Cincia dos Alimentos/UFLA Caixa Postal.37, 37.200-000 - Lavras-MG 3. Professora Adjunto de Microbiologia de Alimentos, Departamento de Cincia dos Alimentos/UFLA 4. Professora Adjunto de Microbiologia, Departamento de Biologia/UFLA 5. Professor Titular de Microbiologia de Alimentos, Tecnologia de Alimentos e Medicamentos/UEL 6. Estudante do curso de Agronomia/UFLA.

138 Preparaes comerciais de pectinases so normalmente de origem fngica e, especialmente, de Aspergillus e Penicillium, que exibem caractersticas de alta atividade de endopoligalacturonase e de pectina liase. As pectinas produzidas por Aspergillus so de grande importncia por sua aceitabilidade na indstria de processamento de alimentos e a pectina liase a nica enzima capaz de hidrolizar, sem ao prvia de outras enzimas, pectinas altamente esterificadas, como a pectina de frutas. Na indstria de alimentos, essas enzimas atuam na extrao, clarificao e despectinizao de sucos de frutas e extrao de leo vegetal, bem como na produo de alimentos para bebs e em uso simultneo com celulases e hemicelulases no tratamento de biomassa celulsica. Na indstria txtil, pectinases tm sido empregadas na macerao do linho e no tratamento de fibras txteis brutas, como a juta e o rami, e tambm na indstria de fermentados, como, por exemplo, na fermentao do caf, do cacau e do fumo. A escolha do meio de cultura to essencial para o sucesso do processo fermentativo quanto a escolha do microrganismo. Nem sempre o meio que permite o melhor desenvolvimento do microrganismo favorece a formao dessas enzimas. A produo otimizada e os parmetros que afetam a sntese enzimtica devem ser investigados sempre, pois as condies timas variam entre os diferentes microrganismos, assim como para diferentes enzimas. As enzimas pcticas so produzidas principalmente por plantas superiores, fungos filamentosos, leveduras e bactrias. A composio dos complexos enzimticos pectinolticos varia entre as espcies de microrganismos. Portanto, a seleo de isolados capazes de sintetizar enzimas adequadas um processo fundamental para uso industrial (Ueda, Fujio e Lim, 1982; El-Refai, Metwalli e El-Sabaiy, 1984). Nos ltimos anos, bactrias, leveduras e outros fungos despertaram grande interesse de estudo, em virtude das inmeras vantagens apresentadas, destacando-se, dentre outras, as seguintes: - no necessitam de amplos espaos para o seu crescimento e no dependem das condies atmosfricas (Guzman-Juarez, 1982; Ursini, 1974; Falanghe, 1975). - os fatores de crescimento como concentrao de nutrientes, pH, temperatura, concentrao de oxignio e de clulas podem ser manipulados facilmente (Snyder, 1970). - conseguem degradar e crescer em amplos substratos, inclusive em resduos industriais (Falanghe, 1975; Guzman-Juarez, 1982), os quais podem ser aproveitados desde que se escolha o microrganismo apropriado ou adaptado para a finalidade desejada. Como decorrncia desse fato, tem-se a reduo ou o controle dos problemas de poluio causados por esses resduos (Falanghe, 1975). - possuem um crescimento rpido quando as condies so favorveis para o seu crescimento. A populao de fungos chega a dobrar em intervalos de 4 a 12 horas, as leveduras de 1 a 3 horas e as bactrias de 0,5 a 2 horas (Falanghe, 1975; Snyder, 1970). - podem ser manipulados geneticamente para obteno de mutantes desejados (Batt e Sinskey, 1989; Falanghe, 1975). A produo de pectinases em microrganismos influenciada pelas condies de cultivo, em particular, do meio de cultura, tipo e concentrao da fonte de carbono, pH e temperatura do cultivo, alm de outros fatores. Leuchtenberger, Friese e Ruttloff (1989) analisaram a influncia de diferentes fontes de carbono sobre o crescimento de Aspergillus niger e produo de poligalacturonase (PG) e verificaram que a enzima foi produzida em meio contendo combinao de pectina e glicose. A. niger cresceu em vrios acares, incluindo lactose e sacarose, com produo de poligalacturonase (PG) e pectinesterase (PE). O estudo das pectinases tem sido considerado de grande importncia, em razo da aplicao nas indstrias que processam matria-prima vegetal, para remoo de substncias pcticas, as quais inviabilizam o produto desejado (Ghildyal et al., 1981; Whitaker, 1984). Na indstria de alimentos e fermentados, essas enzimas so empregadas na clarificao de sucos de frutas e vinhos (Manachini, Parini e Fortina, 1988; Rombouts e Pilnik, 1986). Na indstria de sucos de frutas, as enzimas pcticas so usadas para promover a degradao da pectina, pois esta se apresenta na forma de suspenso coloidal, mantendo consigo outras substncias tambm suspensas (Ishii e Yokotsuka, 1971). O processo de degradao da pectina presente no suco com as enzimas disponveis no mercado resulta na descaracterizao do sabor da fruta, pois esses produtos so compostos pela mistura das enzimas do complexo pectinoltico, geralmente PG e PE, que promovem, alm da quebra da pectina, a sua desesterificao, ocorrendo volatilizao dos steres responsveis pelo sabor (Alana et al., 1990).

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

139 Alm disso, o uso da mistura que contm PE promove decrscimo da estabilidade do suco de fruta pela precipitao dos derivados da pectina desesterificado com ons de clcio presentes no suco e liberao de metanol (Alana et al., 1989). Se o processo de clarificao for feito apenas com pectina liase (PL), a formao de metanol no detectada no suco (Ishii e Yokotsuka, 1971). As enzimas pectinolticas agem de formas diferentes nos sucos de frutas e vegetais: 1) sucos lmpidos e brilhantes (ma, pra e uva), em que as enzimas aumentam a produo de suco durante a prensagem e a filtrao do suco, promovendo a remoo do material em suspenso; 2) sucos com turbidez (laranja, ameixa, tomate e nctar), a poligalacturonase degrada rapidamente o cido pctico formado, evitando, dessa forma, precipitao e originando uma opacidade estvel; 3) produtos microbianos, em que a inteno preservar a integridade da clula da planta, mediante hidrlise seletiva dos polissacardeos da lamela mdia pelas enzimas conhecidas como macerases (Whitaker, 1984). Considerando o exposto acima, com o presente trabalho objetivou-se definir melhores concentraes dos parmetros (concentrao de acar no caldo de cana, concentrao de sulfato de amnio e concentrao pectina ctrica) a serem utilizados nos meios fermentativos para a produo de poligalacturonase por Kluyveromyces marxianus. MATERIAL E MTODOS 1. Microrganismo Kluyveromyces marxianus foi gentilmente cedida pelo Professor Dr. Ral J.H. Castro Gmez, da Universidade Estadual de Londrina (UEL) A fermentao do meio foi realizada em frascos erlenmeyers de 250 ml de capacidade, contendo 25 ml de meio. Os frascos foram incubados a 280 C com agitao de 150 rpm, em agitador com temperatura controlada, durante 48 horas, com inculo de 2% (v/v). 2. Equipamentos utilizados - Centrfuga refrigerada marca Hitachi Modelo Himac CR21 - Espectrofotmetro marca Femto modelo 482 - Balana analtica Mettler-Toledo modelo AB204 - Estufa para determinao de umidade marca Fanem modelo Retilnea - Incubadora refrigerada Marconi (shaker MA 830/A) 3. Delineamento central composto rotacional de anlise de superfcie de resposta de um fatorial 53 Para determinar as melhores concentraes de acar no caldo de cana, sulfato de amnio e pectina ctrica, visando otimizao do meio de cultura, foi definido um delineamento experimental central composto rotacional para a avaliao de um fatorial 53, ou seja, trs variveis, com cinco nveis de variao, constante de 15 tratamentos iniciais e mais 3 no ponto central, totalizando 18 experimentos. Na Tabela 2 encontram-se as variveis descodificadas e codificadas que foram utilizadas no delineamento central composto rotacional em funo dos tratamentos usados. 4. Delineamento central composto rotacional de anlise de superfcie de resposta de um fatorial 52 Para determinar as melhores concentraes dos nutrientes definidos no experimento anterior, visando a obter o mximo de atividade da poligalacturonase de Kluyveromyces marxianus, conduziu-se um experimento no delineamento central composto rotacional para anlise de superfcie de resposta em experimentos fatoriais 52, conforme os nveis dos parmetros sulfato de amnio e pectina mostrados na Tabela 3. Esse delineamento experimental permite estudar duas variveis em cinco nveis de variao, originando 11 experimentos, dos quais trs deles corresponderam a repeties no ponto central (Box e Drapper, 1987). Os nveis das variveis foram codificadas em 1,414, -1, 0, +1 e +1,414, conforme a equao abaixo: xi = Xi - X q sendo: xi = nmero codificado Xi = valor real dos nveis X = mdia dos nveis q = diferena entre os nveis sucessivos das variveis. As respostas ou variveis dependentes foram: biomassa formada (mg/ml), protenas solveis (mg/ml) e atividade enzimtica da poligalacturonase (mg de cido galacturnico liberado/ml/min). Os fatores, ou variveis independentes, esto especificados na Tabela 4, na qual se pode visualizar tambm os valores codificados e descodificados correspondentes.

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

140 TABELA 1 - Nveis dos parmetros utilizados no delineamento central composto rotacional com 18 pontos. Parmetros Unidade Cdigo -V2 Caldo de cana Sulf. de Amnio Pectina Brix g/100 ml g/100 ml X1 X2 X3 9,172 0,586 1,172 -1 10,0 1,0 2,0 0 12,0 2,0 4,0 Nveis +1 14,0 3,0 6,0 V2 14,83 3,41 6,83

OBS: V2 = Raiz Quadrada de 2 = 1,414

TABELA 2 - Nveis descodificados e codificados das variveis utilizadas no delineamento experimental central composto rotacional. Valores Descodificados X1 X2 10,0 1,0 14,0 1,0 10,0 3,0 14,0 3,0 10,0 1,0 14,0 1,0 10,0 3,0 14,0 3,0 9,172 2,0 14,83 2,0 12,0 0,586 12,0 3,41 12,0 2,0 12,0 2,0 12,0 2,0 12,0 2,0 12,0 2,0 12,0 2,0 Valores Codificados X1 X2 -1 -1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 -1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 -1,414 0 +1,414 0 0 -1,414 0 +1,414 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Exp. N 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18

X3 2,0 2,0 2,0 2,0 6,0 6,0 6,0 6,0 4,0 4,0 4,0 4,0 1,17 6,83 4,0 4,0 4,0 4,0

X3 -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 0 0 0 0 -1,414 +1,414 0 0 0 0

TABELA 3 - Nveis dos parmetros usados no delineamento central composto rotacional com 11 pontos. Nveis Varivel Independente Sulfato de Amnio Pectina -1,414 0,01716 0,09290 -1 0,1 0,3 0 0,3 0,8 +1 0,5 1,3 +1,414 0,58284 1,50711

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

141 TABELA 4 - Nveis e valores descodificados e codificados das variveis utilizadas no delineamento experimental central composto rotacional Valores Descodificados Experim. N 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 Sulfato g/100 ml 0,1 0,1 0,5 0,5 0,01716 0,58284 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Pectina g/100 ml 0,3 1,3 0,3 1,3 0,8 0,8 0,09290 1,50711 0,8 0,8 0,8 Valores Codificados Sulfato g/100 ml -1 -1 +1 +1 -1,41421 +1,41421 0 0 0 0 0 Pectina g/100 ml -1 +1 -1 +1 0 0 -1,41421 +1,41421 0 0 0

5. Determinao de Protena Total A protena total foi determinada pelo mtodo de Lowry et al. (1951), utilizando-se albumina bovina como padro. 6. Determinao de Biomassa Aps a centrifugao, os sobrenadantes foram armazenados em erlenmeyers previamente esterilizados para realizao das anlises de atividade enzimtica e protena total. As massas celulares obtidas foram ressuspensas com gua destilada e colocadas nas placas de Petri previamente preparadas (600C/24 horas) e levadas para estufa. A determinao foi feita pela diferena do peso inicial e o peso final das placas.

7. Determinao da atividade da enzima poligalacturonase Para determinao da atividade de poligalacturonase (PG), utilizou-se o filtrado da cultura. A atividade de PG foi determinada pela dosagem de acar redutor produzido, segundo o mtodo do D.N.S. (3,5 dinitrossalislico) descrito por Miller (1959). 8. Anlise Estatstica Os delineamentos experimentais foram definidos pelo programa Statstica for Windows, Release 5.0. As anlises estatsticas foram realizadas utilizando-se o softwar Statistical Analysis System (S.A.S). O modelo de regresso utilizado foi:

y = a+b1X1+b2X2+b3X3+b4X1X2+b5X1X3+b6X2X3+b7X1X1+b8X2X2+b9X3X3
sendo: y = varivel resposta; a = intercepto bI = coeficiente de regresso associado caracterstica I XI = varivel independente (X1 = caldo de cana, X2 = Pectina e X3 = Sulfato de amnio) RESULTADOS E DISCUSSO 1. Metodologia de anlise de Superfcie de Resposta 53 Na Tabela 5 encontram-se os resultados obtidos em cada um dos experimentos descritos no item 3

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

142 TABELA 5 - Concentrao de cido galacturnico (mg/100ml) obtida aps fermentao e utilizada para a anlise de superfcie de resposta 53. Exp. N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 mg/100 ml 22,783 17,309 4,102 4,086 2,718 5,740 6,125 5,682 1,847 2,515 23,419 6,093 3,215 12,440 1,278 1,257 1,230 1,321 Ln 3,126 2,850 1,410 1,407 1,000 1,747 1,812 1,737 0,613 0,922 3,153 1,807 1,168 2,521 0,245 0,229 0,207 0,278 deve ser dada ao analisar o conjunto dos dados; nesse caso, com o modelo usado, as predies e as tendncias das respostas podem ser obtidas, mas no com muita segurana. De qualquer forma, pode-se verificar na anlise de varincia correspondente que a varivel caldo de cana-de-acar no afetou significativamente a produo da enzima P>0,6746 e 0,9220 no individual e global, respectivamente, e que as interaes das variveis sulfato de amnio e pectina (X3*X2), bem como os efeitos quadrticos delas (X3*X3 e X2*X2) afetam significativamente a produo da enzima (X2*X2 com P> 0,0013; X3*X3 com P> 0,0128 e X3*X2 com P> 0,035). Com este experimento, demonstrou-se, com certas restries, que havia necessidade de definir melhor as concentraes das variveis sulfato de amnio e pectina, para atingir um mximo de atividade enzimtica, j que seu efeito na atividade da enzima poligalacturonase foi significativo, conforme o demonstrado. Por outro lado, nos indicou que o caldo de cana-de-acar, como j foi mencionado, no afetou significativamente a produo da enzima; portanto, pode ser utilizado em qualquer concentrao entre 9,17 e 14,830Brix.

(Tabela 2). Com o objetivo de contornar problemas de heterogeneidade de varincia na anlise de varinia, esses resultados foram transformados em logaritmo natural (Ln): Pelos resultados, constata-se que h necessidade de definir melhor as concentraes das variveis sulfato de amnio e pectina para atingir um mximo de atividade enzimtica, j que seu efeito na atividade da enzima poligalacturonase foi significativo. Por outro lado, os resultados demonstraram que a concentrao de acar no caldo de cana no afetou significativamente a produo da enzima e, portanto, pode ser utilizado em qualquer concentrao entre 9,17 e 14,83Brix (Tabela 1). A anlise de varincia apresentou um coeficiente de variao de 37,87% e um desvio de regresso significativo (P = 0,0001). Esse ltimo valor se explica em funo de que o quadrado mdio do erro puro da anlise de varincia apresentou um valor muito baixo. O R2 apresenta um valor adequado, indicando uma boa relao dos dados com o modelo de regresso definido pela anlise de varincia. Entretanto, o coeficiente de variao considerado e, assim sendo, uma ateno maior

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

143 Grfico 1 - Efeito da suplementao do caldo de cana-de-acar com sulfato de amnio e pectina na produo de poligalacturonase de Kluyveromyces marxianus.

7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

3
P e c tin a

5
S u lfato

10

11

A c G a lacturnico

TABELA 6 - Anlise de varincia para produo da enzima. F.V. Linear Quadrtica Interao Regresso T. Desvio Reg. Erro exp. Erro total G.L. 3 3 3 9 5 3 8 S.Q. 1,597019 10,228104 2,107823 13,932946 2,434736 0,002679 Q.M. 0,0976 0,6248 0,1288 0,8511 0,486947 0,000893 F 0,2347 0,0031* 0,1534 0,0159* 0,0001*

* Significativo com o nvel de 5% de probabilidade pelo teste de F Coeficiente de Determinao (R2) = 0,8511 Coeficiente de Variao (C.V) = 37,87 Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

144 TABELA 7 - Significncia das variveis na produo da enzima. Significncia das Variveis Linear X1 X2 X3 Quadrtica X1*X1 X2*X2 X3*X3 Interao X2*X2 X3*X1 X3*X2 * Significativo com o nvel de 5% de probabilidade pelo teste de F. Probabilidade 0,6746 0,0566 0,7667 0,6789 0,0013* 0,0128* 0,7356 0,5605 0,0350*

TABELA 8 - Significncia das variveis na produo da enzima - Anlise Global. Significncia das Variveis X1 X2 X3 * Significativo com o nvel de 5% de probabilidade pelo teste de F. Probabilidade 0,9220 0,0052* 0,0387*

TABELA 9 - Resultados da anlise de superfcie de resposta 52. EXP.N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Biomassa mg/ml 4,1 5,6 3,9 5,3 3,8 4,2 5,2 7,0 6,6 6,8 6,2 Prot. Sol. mg/ml 4,406 5,926 5,146 5,776 4,756 5,966 4,486 5,946 5,926 5,716 5,846 Ac. Galact. mg/ml 2,3742 2,5247 2,7979 3,0653 2,2938 3,6114 2,6530 2,2967 3,3328 3,2771 2,8313 Ativ. Enz mg/ml/min 0,0594 0,0631 0,0699 0,0766 0,0573 0,0903 0,0663 0,0574 0,0833 0,0819 0,0708

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

145 2. Metodologia de Anlise de Superfcie 52 Os resultados obtidos relativos biomassa, protena solvel, cido galacturnico e atividade enzimtica podem ser vistos na Tabela 10. 2.1. Produo de Massa Celular Quando o caldo de cana-de-acar suplementado com sulfato de amnio numa concentrao de 0,3 g/100 ml e com 1,3 g/100 ml de pectina, obtm-se concentraes de massa celular de Kluyveromyces marxianus acima de 6,610 g/L. medida que o caldo de canade-acar suplementado com concentraes menores desses nutrientes, menor ser a biomassa obtida. Essa situao acontece quando se utilizam concentraes menores que 0,8 g/ml de pectina e menores que 0,1 g/100 ml de sulfato de amnio. H, tambm, uma outra situao que nos fornece essa mesma resposta, quando as concentraes desses nutrientes participam com valores menores que 0,8 g/100 ml de pectina e acima de 0,5 g/100 ml de sulfato de amnio. Na anlise de varincia correspondente produo de massa celular ou biomassa, pode-se observar que o coeficiente de determinao (R2) 0,9620, o coeficiente de variao (C.V) corresponde a 6,24% e a um desvio de regresso de P=0,4595. Esses valores indicam que essa resposta (biomassa) se ajusta ao modelo de regresso adotado. Sabe-se que a medida que o valor do R2 se aproxima da unidade, uma excelente relao dos dados experimentais com a curva estabelecida pelo modelo utilizado, indicada, ou seja, o modelo til em fazer predies da varivel-resposta em funo das variveis independentes usadas. Nesse caso, esse coeficiente de determinao pode ser considerado muito bom. Sabe-se que o coeficiente de variao sofre a influncia das dificuldades de padronizao do inculo, meios e outros parmetros que so de difcil controle. Em ensaios biolgicos, podem ser considerados baixos, quando inferiores a 10%, mdios, quando entre 10 e 20% e altos de 20 a 30% (Pimentel Gomes, 1990). Como pode-se observar, o C.V. obtido na anlise de varincia corresponde a um valor de nvel baixo e, portanto, excelente para sistemas biolgicos. Considerando esses valores e o ndice de desvio de regresso no- significativo (P=0.4595), podemos afirmar que os dados experimentais obtidos se ajustam de modo adequado ao modelo de regresso adotado e que este poder ser empregado para predizer, com segurana, as tendncias da resposta nas condies experimentais em estudo.

GRFICO 2 Biomassa de Kluyveromyces marxianus produzida em caldo de cana-de-acar (120 Brix) suplementado com sulfato de amnio e pectina

7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

6
Sulfato

10 11

Pectina

Biomassa

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

146 Verificando os efeitos das variveis estudadas, observa-se que X1 (sulfato de amnio), no global, afeta significativamente a produo de biomassa (P=0,0012) e muito significativo seu efeito quadrtico (P=0,0002).A concentrao de pectina, no global, afeta de forma significativa a produo de biomassa (P=0,0090). No h, entretanto, uma significncia do efeito quadrtico dessa varivel. A pectina afeta significativamente a produo de biomassa quando atua individualmente, apresentando um valor de P=0,0022, o que no acontece com sulfato de amnio, que apresenta um valor de P=0,9472.

TABELA 10 - Anlise de varincia para produo da biomassa. F.V Linear Quadrtica Interao Regresso T. Desvio Reg. Erro exp. Erro total G.L. 2 2 1 5 3 2 5 S.Q. 3,707373 10,320684 0,002500 14,030557 0,368231 0,186667 0,554898 Q.M. 0,2542 0,7076 0,0002 0,9620 0,122744 0,093333 0,110980 F 0,0061* 0,0006* 0,8866 0,0015* 0,4594

*Significativo ao nvel de 5% de probabilidade pelo teste de F. Coeficiente de Determinao (R2) = 0,9620 Coeficiente de Variao (C.V) = 6,2428 TABELA 11 - Significncia das variveis na produo de biomassa. Significncia das Variveis Linear X1 X2 Quadrtica X1*X1 X2*X2 Interao X2*X1 *Significativo ao nvel de 5% de probabilidade pelo teste de F. TABELA 12 - Significncia das variveis na produo de Biomassa - Anlise Global. Significncia da variveis X1 X2 *Significativo ao nvel de 5% de probabilidade pelo teste de F. Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000 Probabilidade 0,0012* 0,0090* Probabilidade 0,9472 0,0022* 0,0002* 0,0870 0,8866

147 2.2. Produo de Protenas Solveis Quando o caldo de cana-de-acar suplementado com sulfato de amnio numa concentrao entre 0,3 e 0,5 g/100 ml, e 0,8 a 1,5 g/100 ml de pectina, obtm-se concentraes de protenas solveis produzidas por Kluyveromyces marxianus acima de 5,818 g/L. medida que o caldo de cana-de-acar suplementado com concentraes menores de 0,8 g/100 ml de pectina, menor ser a concentrao de protenas solveis obtida, independentemente da concentrao de sulfato de amnio empregada. Na anlise de varincia correspondente produo de protenas solveis, pode-se observar que o coeficiente de determinao (R2) 0,9533, o coeficiente de variao (C.V) corresponde a 3,50% e um desvio de regresso de P=0,1795. Esses valores indicam que essa resposta se ajusta ao modelo de regresso adotado. O valor do R2 se aproxima da unidade e, portanto, indica uma excelente relao dos dados experimentais com a curva estabelecida pelo modelo. O C.V. obtido na anlise de varinia corresponde a um valor de nvel baixo e, portanto, excelente para sistemas biolgicos (Pimentel Gomes, 1990). Considerando esses valores e o ndice de desvio de regresso no-significativo (P=0,1795), podemos afirmar que os dados experimentais obtidos se ajustam de modo adequado ao modelo e que este poder ser empregado para predizer, com segurana, as tendncias da resposta nas condies experimentais em estudo. Verificando os efeitos das variveis estudadas, observamos que X1 (sulfato de amnio), no individual e no global, afeta significativamente a produo de protenas solveis, com valores de P=0,0080 e 0,0132, respectivamente. No caso da pectina, esta tambm se apresenta afetando significativamente a produo de protenas solveis, mostrando valores de P= 0.0006 no individual e de 0,0016 no global. Os efeitos quadrticos das duas variveis tambm afetam significativamente essa produo, indicando valores de P= 0,0362 para o sulfato de amnio e de 0,0134 para a pectina. No h, entretanto, uma significncia da interao dessas variveis ao nvel de P<0,05, mas essa relao se torna significativa a um nvel de P<0,07.

GRFICO 3 - Protena solvel de Kluyveromyces marxianus produzida em caldo de cana-de-acar (120Brix) suplementado com sulfato de amnio e pectina.

7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

6
S u lfato

8
Protena

10

11

Pectina

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

148 TABELA 13 - Anlise de varincia para produo de protena total.

F.V Linear Quadrtica Interao Regresso T. Desvio Reg. Erro exp. Erro total

G.L 2 2 1 5 3 2 5

S.Q 2,882414 0,630033 0,198025 3,710472 0,159352 0,022467 0,181819

Q.M 0,7405 0,1619 0,0509 0,9533

F 0,0009* 0,0237* 0,0669 0,0024* 0,1795

*Significativo com o nvel de 5% de probabilidade pelo teste de F. Coeficiente de Determinao (R2) = 0,9533 Coeficiente de Variao (C.V) = 3,5021

TABELA 14 - Significncia das variveis na produo de protena total. Significncia das Variveis Linear X1 X2 Quadrtica X1*X1 X2*X2 Interao X2*X1 *Significativo com o nvel de 5% de probabilidade pelo teste de F. 0,0669 0,0362* 0,0134* 0,0080* 0,0006* Probabilidade

TABELA 15 - Significncia das variveis na produo de protena total - Anlise Global. Significncia das Variveis X1 X2 *Significativo com o nvel de 5% de probabilidade pelo teste de F. Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000 Probabilidade 0,0132* 0,0016*

149 GRFICO 4 Atividade da enzima poligalacturonase de Kluyveromyces marxianus produzida em caldo de canade-acar (120Brix) suplementado com Sulfato de amnio e Pectina.
1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

3
Pectina

5
S u lfato

10

11

A tiv enzim tica

TABELA 16 - Anlise de varincia para produo da enzima. F.V Linear Quadrtica Interao Regresso T. Desvio Reg. Erro exp. Erro total G.L 2 2 1 5 3 2 5 S.Q. 0,000625 0,000413 0,000002132 0,001040 0,000130 0,000094502 0,000225 Q.M. 0,4943 0,3262 0,0017 0,8226 0,000043418 0,000047251 0,000044951 F 0,0360* 0,0739 0,8362 0,0591 0,5588

*Significativo com nvel de 5% de probabilidade pelo teste de F. Coeficiente de Determinao (R2) = 0,8223 Coeficiente de Variao (C.V) = 9,4980

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

150 TABELA 17 - Significncia das variveis na produo da enzima. Significncia das Variveis Linear X1 X2 Quadrtica X1*X1 X2*X2 Interao X2*X1 0,8362 0,4035 0,0291* 0,01336* 0,9138 Probabilidade

TABELA 18 - Significncia das variveis na produo da enzima - Anlise Global. Significncia das Variveis X1 X2 Probabilidade 0,0593 0,1287

2.3. Atividade enzimtica da poligalacturonase Quando o caldo de cana-de-acar com 12 Brix suplementado com sulfato de amnio numa concentrao entre 0,40 e 0,58 g/100 ml, aproximadamente, e 0,50 a 1,05 g/100 ml de pectina, obtm-se a maior atividade enzimtica da poligalacturonase produzida por Kluyveromyces marxianus, ou seja, atividades acima de 0,082 mg de cido galacturnico/ ml/ min. medida que o caldo de cana-de-acar suplementado com concentraes menores que 0,40 g/100 ml de sulfato de amnio, menor ser a atividade enzimtica obtida, independentemente da concentrao de pectina empregada. Na anlise de varinia correspondente atividade da enzima poligalacturonase, pode-se observar que o Coeficiente de Determinao R2 0,8223, o Coeficiente de Variao (C.V) corresponde a 9,49% e um

desvio de regresso de P=0,5588. Esses valores indicam que essa resposta (atividade enzimtica) se ajusta ao modelo de regresso adotado. O valor do R2 indica uma boa relao dos dados experimentais com a curva estabelecida pelo modelo utilizado.Considerando esses valores e o ndice de desvio de regresso no- significativo (P=0,5588), podemos afirmar que os dados experimentais se ajustam de modo adequado ao modelo de regresso adotado. Assim sendo, este poder ser empregado para predizer, com segurana, as tendncias da resposta, ou seja , da atividade enzimtica nas condies experimentais empregadas. Verificando os efeitos das variveis estudadas, observa-se que X1 (sulfato de amnio), no individual, afeta significativamente a atividade enzimtica da poligalacturonase e que, no global, essa varivel se torna significativa num valor de P<0,06, j que apresenta um

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

151 P=0,0593. No caso da pectina, ela se apresenta como no afetasse de forma significativa a atividade enzimtica da poligalacturonase, mostrando valores de P= 0,9138 no individual e de 0,1287 no global. O efeito quadrtico do sulfato de amnio no afeta de forma significativa, P=0,4035, a atividade da enzima, e esse mesmo efeito da varivel pectina significativo, P=0,0291. No h, entretanto, uma significncia, P=0,8362, da interao dessas duas variveis. CONCLUSO Pode-se concluir pelos resultados apresentados que as condies de cultivo de Kluyveromyces marxianus sero diferentes em funo do produto que se pretenda obter. Os diferentes mecanismos bioqumicos da levedura sero ou no ativados medida que as interaes dos nutrientes presentes favoream ou no uma determinada via metablica, induzindo a produo de vrios produtos. As condies ideais para a produo e atividade da enzima poligalacturonase por Kluyveromyces marxianus esto descritas a seguir: - Tempo de fermentao - 48 horas, - Temperatura - 280C - Agitao 150 rpm - pH 5,0 - Sulfato de amnio em concentraes de 0,40 a 0,58g/100 ml de caldo de cana-de-acar 120Brix. - Pectina em concentraes de 0,50 a 1,05 g/100 ml de caldo de cana-de-acar 120Brix. BATT, C.A.; SINSKEY, A.J. Use of biotechnology in the production of single-cell protein. Food Technology, Baltimore, v.38, n.2, p.108-111, Feb. 1989. BOX, G. E. P.; DRAPPER, N. R. Empirical model-building and response surfaces. New York: J.Wiley, 1987. 669p. EL-REFAI, A.A.; METWALLI,S.M.; EL-SABAIY, L.A. Influence of pH, inoculum concentration, aeration and growth period on production of pectolytic enzymes by Aspergillus amamori 16. Chemistry Microbial Technology, New York, v.8, p.115-117, 1984. FALANGHE, H. Produo de microrganismos. In: LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia: tecnologia das fermentaes. So Paulo: E. Blucher, 1975. v.1, p.246-285. GHILDYAL, N.P.; RMARKRISHNA, S.V.; DEVI, P. N.; LOSANE, B. K.; ASTHANA, H. N. Large scale production of pectolytic enzyme by solid state fermentation. Journal Food Science Technology, Lansing, v.18, p.248-251, 1981. GUZMAN-JUAREZ, M. Yest protein. In: HUDSON, B.J.F. Development in food protein. London: Academic Press, 1982. p.263-291. ISHII, S.; YOKOTSUKA, T. Pectin trans-eliminase with fruit juice clarifying activity. Journal Agricultural Food Chemestry, Washington, v.19,n 5, p.958-961, Sept./Oct. 1971. LEUCHTENBERGER, A.; FRIESE, E.; RUTTLOFF, H. Variation of polygalacturonase and pectinesterase synthesis by aggregated mycelium of Aspergillus mycelium of Aspergillus niger in dependence on the carbon source. Biothechnology Letters, London, v.11, n.4, p.255-258, 1989. LOWRY, O. H., ROSEMBROUGH, J.J.; FARR, A.L; RANDALL, R.J. Protein measurement with the fenol reagent. Journal Biological Chemistry, Baltimore v.193, n. 1, p.265-275, Nov.1951. MANACHINI, P.L.; PARINI, C.; FORTINA, M.G. Pectic enzymes from Aureobasidium pullulans Lv 10. Enzyme Microbial Technology, Washington, v.10, p.682-685, 1988.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ALANA, A.; GABILONDO, A.; HERNANDO, F.; MORAGUES, M.D. Pectin lyase activity in a Penicillium italicum strain. Applied and Environment Microbiology, Washington, v.56, n.12, p.3755-3759, Dec. 1990. ALANA, A.; GABILONDO, A.; HERNANDO, F.; MORAGUES, M.D. Pectin lyase production by a Penicillium italicum strain. Applied and Environment. Microbiology, Washington, v.55,n. 7, p.1612-1616, July 1989.

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000

152 MILLER, G. L. Use of dinitrosalicilic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, v.31, p.426-428, 1959. PIMENTEL GOMES, F. Curso de estatstica experimental. Piracicaba: ESALQ, 1990. 468p. ROMBOUTS, F.M.; PILNIK, W. Pectinases and others cell-wall degrading enzymes of industrial importance. Symbiosis, Rehovot, v.2, p.79-90, 1986. SNYDER, H. E. Microbial sourses of protein. IN: CHICHESTER, C.O.; MRAK, E.M.; STEWART, G.F. Advances in food research. New York: Academic Press, 1970. v.18, p.85-140. UEDA, S.; FUJIO, Y.; LIM, J. Y. Production and some properties pectic enzymes from Aspergillus oryzae A3. Journal Applied Biochemestry, New York, v.4, p.524-532, 1982. URSINI, R. Opening remarks. In: DAVIS, P. Single-cell protein. New York: Academic Press, 1974. p.1-2. WHITAKER, J.R. Pectic substances, pectic enzymes and formation in fruit juices. Enzyme Microbial Technology, Washington, v.6, p.341-349, 1984.

Cinc. agrotec., v.24 (Edio Especial), p.137-152, dez., 2000