DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA/NITROGÊNIO

1. Objetivo

Através do Método de Kjeldahl, determina-se o nitrogênio total da amostra, que através de cálculo, é
transformado em nitrogênio proteico. Para tanto, considera-se que cada 100g de proteína contém em média 16g de
nitrogênio, obtendo-se desse modo o fator 6,38 (100/15,7), que multiplicado pelo percentual de nitrogênio total da
amostra, dará o percentual da fração proteica na mesma. No entanto, esta média do teor de nitrogênio pode variar
com o tipo de proteína, o que ocasiona variações nos valores do fator (ver valores correspondentes). O método de
Kjeldahl baseia-se na combustão úmida através de aquecimento com ácido sulfúrico concentrado na presença de
catalisadores, resultando na redução do nitrogênio orgânico da amostra a amônia, que é capturado em uma solução
alcalina formando sulfato de amônia. A amônia é então destilada em ignição em uma solução de ácido bórico a 4%
seguida de titulação direta da amônia com solução padrão de ácido sulfúrico.

*Visualização e acompanhamento de todas as etapas da análise (digestão, destilação e titulação).

2. ETAPA 1 - Digestão
2.1 Equipamentos e materiais

*Digestão: tubo micro ou macro Kjeldahl, bloco digestor, papel manteiga, espátula, pipeta de 5 mL, ácido sulfúrico
P.A., mistura catalítica (dióxido de selênio, sulfato de cobre, sulfato de sódio – 1:10:100).

2.2 Procedimento

Transfere-se 1,0g da amostra para um tubo de Kjeldahl, adiciona-se 0,5g da mistura catalítica
(aproximadamente uma pitada) seguida de 10 mL de ácido sulfúrico concentrado. Tenta-se fazer com que a amostra
e os reagentes caiam no fundo do tubo sem tocar as paredes. Acopla-se ao sistema de digestão, ajustando o
aquecedor inicialmente numa posição de aquecimento baixo, para evitar digestão violenta e consequentemente perda
de material. Aumenta-se a temperatura em intervalos de 50ºC a cada 30 minutos até atingir a temperatura de 350ºC.
Finaliza-se a digestão quando a solução estiver incolor ou levemente azulada. Quando houver precipitado no fundo
do frasco, este deverá ser branco ou levemente cinza. As paredes do tubo não deverão apresentar resíduos
carbonizados. Quando a digestão estiver terminada, desliga-se o aquecedor e deixa-se o tubo e a solução resfriarem
completamente. Durante o processo de digestão alguns cuidados devem ser tomados:
* O aquecimento deve ser feito sempre em capela, pois há desprendimentos de vapores e gases tóxicos.
* O fato de o líquido ficar incolor ou levemente colorido não significa que a digestão da matéria orgânica tenha sido
completa, por isso, recomenda-se aquecer por mais tempo (1 hora), depois de atingir esse ponto.

MATÉRIA ORGÂNICA + H2SO4 → (NH4)2SO4 + H2O + CO2

(Contendo Nitrogênio) (Sulfato de Amônia)

3. ETAPA 3 – Destilação
3.1 Equipamentos e materiais

*Destilação: Destilador de Kjeldahl, erlenmeyer de 125 mL, pipeta volumétrica de 25 mL, pinça, béquer de 100 mL,

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pipeta graduada de 1 mL, hidróxido de sódio 40%, ácido bórico 4% adicionado de 20 mL de solução alcoólica de
vermelho de metila 0,2% e 30 mL de solução de verde bromocresol 0,2%, solução de fenolftaleína 1%.
Observação: A adição da base (NaOH) à solução ácida (H2SO4) produz uma reação exotérmica. Proteger, portanto,
mãos e olhos adequadamente.

3.2 Procedimento

Inicialmente, liga-se o destilador na tomada e verifica-se o nível da água da caldeira, esta deverá encostar ao
sensor. Abre-se a torneira de água do laboratório para que haja fluxo de água no condensador. Liga-se o aparelho e
faz-se um pré-aquecimento da água da caldeira até ebulição. Em seguida, diminui-se a temperatura do destilador até
a escala de 2. Fecha-se a torneira do copo superior do destilador. Transfere-se a solução de NaOH a 40% para o copo
superior do destilador; esta solução deverá ser adicionada posteriormente ao tubo de Kjedahl contendo a amostra
digerida.
Adiciona-se um pouco de água destilada para lavar as paredes do tubo de Kjeldahl contendo a amostra
digerida. Adiciona-se 1 mL da solução de fenolftaleína a 1% à amostra digerida e conecta-se o tubo de Kjeldahl ao
destilador de proteínas, verificando se este ficou bem fixo evitando assim qualquer vazamento.
Transfere-se exatamente 25 mL de ácido bórico a 4% para um erlenmeyer de 125 mL. Mergulha-se a saída do
condensador de Kjeldahl no erlenmeyer contendo a solução de ácido bórico a 4%, tendo o cuidado de observar se a
extremidade final do condensador está completamente mergulhada na solução de ácido bórico.
Mantêm-se a temperatura de aquecimento do destilador na posição 2. Em seguida, adiciona-se a solução de
NaOH a 40% lentamente até conseguir pH alcalino, com mudança de cor de alaranjado para marrom. Após a “viragem”
da cor do tubo de Kjedahl, aumenta-se a temperatura do destilador para 8 a 10, a fim de promover a destilação até
que o volume final de 3 vezes o volume inicial, isto é, o volume de 75 mL. Quando este volume é atingido, retira-se
primeiramente o erlenmayer (para evitar refluxo da solução) e depois diminui-se a temperatura para 2 e desliga-se o
aquecedor.
A solução do erlenmeyer deve permanecer ácida durante a destilação. Se houver mudança de cor do indicador
para uma coloração avermelhada adicionar uma quantidade conhecida de ácido bórico a 4%. Retira-se o tubo de
proteína do destilador e descarta-se o conteúdo. Reserva-se a solução do ácido bórico contendo a proteína destilada
para a titulação.

(NH4)2SO4 + 2 NaOH → 2 NH4OH + Na2SO4

(Sulfato de Amônia) (Hidróxido de Sódio) (Hidróxido de Amônia) (Sulfato de sódio)

*Comparação do TE-0364 com o tri-destilador TE-0365

4. ETAPA 3 – Titulação
4.1 Equipamentos e materiais

*Destilação: bureta de 25 mL, suporte com garra para bureta, béquer de 50 mL, ácido clorídrico 0,1N (padronizada).

*Comparação da etapa de titulação de acordo com método tradicional (bureta) e titulador automático (TE-296)

4.2 Procedimento

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 Titula-se a solução do erlenmeyer com ácido clorídrico 0,1N padronizado, até o aparecimento da coloração
avermelhada. Um ensaio em branco, utilizando na digestão o papel de pesagem idêntico ao utilizado para a amostra,
deverá acompanhar a análise. A contribuição do branco deverá ser subtraída dos resultados das amostras.

6 NH4OH + 2 H3BO3 → 2 (NH4)3BO3 + 6 H2O (Hidróxido de Amônia) + (Ácido bórico) = (Borato de Amônia)

(NH4)3BO3 + 3 HCl → 3(NH4)Cl + H3BO3

(Borato de Amônia) = (Cloreto de Amônia)

Cálculo: Proteínas totais em g/100g = (VA - VB) x fa x F x 0,14

P
VA = volume de ácido clorídrico 0,1N padronizado gasto na titulação da amostra. VB = volume de ácido clorídrico 0,1N
padronizado gasto na titulação do branco. fa = fator de correção da solução de ácido clorídrico 0,1N.
F = 6,38 para produtos lácteos (ANVISA, 2003);
F = 6,25 para carnes ou misturas de proteínas, e proteínas de soja e de milho (ANVISA,
2003);
F = 5,83 para biscoitos, cevada, aveia e pão integral (PPGCTA); F = 5,75 para proteínas vegetais (ANVISA, 2003);
F = 5,74 para pão doce, pão caseiro e de leite (PPGCTA); F = 5,70 para pão francês (PPGCTA);
F = 5,55 para gelatina (PPGCTA); P = peso da amostra.

*Para águas e efluentes, realizando-se a destilação e titulação é determinado o nitrogênio orgânico juntamente com
o amoniacal (nitrogênio total Kjeldahl – NTK).

Amostras em geral: Método AOAC 960.52 (2016)

3. Quando utilizar tubos micro e macro?

Geralmente os tubos macro são destinados para realização da digestão de amostras líquidas ou sólidas, que
possuem baixo teor de nitrogênio, enquanto que os tubos micro são mais recomendadas para amostras sólidas com
alta concentração de nitrogênio, devido às maiores perdas que podem ocorrer durante o preparo.

4. Referências Bibliográficas:
 AOAC - Association of Official Analytical Chemists. Official Methods of Analysis. 20th Edition. Rockville: AOAC
International, 2016. 3172p.

 Para plantas, alimentos, bebidas e concentrados

 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21ª ed. Washington: American Public
Health Association, 2015. 1082p.

 Para águas e efluentes

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