Como organizar um experimento científico

Na Bancada - Kathy Barker Capítulo 4 1
SEÇÃO 2
ESTABELECENDO UM RUMO
Capítulo 4
Como organizar um experimento #
Capítulo 5
Cadernos de Laboratório #
Capítulo 6
Apresentação de dados e de você mesmo #
Inserir figura (pág.68)
Como organizar um experimento
Um experimento é um Considerações filosóficas #

teste feito para examinar a Planejamento de experimentos #
validade de uma hipótese. A Referencial teórico #
experimentação é a razão pela Controles #
qual você está onde está. Se não Estatística #
conduzir os seus experimentos Uso de protocolos #
cuidadosa e perfeitamente desde Interpretação de resultados
o início, logo você estará Quando os experimentos não funcionam #
atolado num pântano de Fontes de consulta #
experimentos pela metade e de
resultados confusos, que somente poderá ser desfeito deixando o laboratório.
Existe uma advertência extremamente importante sobre este conselho a respeito da
organização e pensamento claro. FAÇA UM EXPERIMENTO DURANTE A PRIMEIRA
SEMANA. Não espere até que você ache que “sabe mais”. Planejar um experimento é
parecido com entrar para um time - você não pode entrar no time até que tenha
experiência, e você não ganha experiência antes de entrar no time. Você pode ter lido os
artigos relevantes, memorizado todos os protocolos, falado com todos no laboratório, mas
ainda assim não entende realmente o novo experimento que você está prestes a fazer. MAS
FAÇA-O. Depois que você tiver feito o primeiro experimento, tudo - teoria, técnicas,
implicações - vão se tornar magicamente claras. Leia e prepare você mesmo, mas saiba que
o completo entendimento do seu projeto não acontecerá até que tenha feito realmente os
experimentos.
Nem todos os experimentos serão sensacionais. É ótimo pensar em fazer somente

experimentos cruciais e excitantes, mas é mais importante estar certo, primeiro, que os seus
experimentos são reproduzíveis, confiáveis e honestos.
CONSIDERAÇÕES FILOSÓFICAS
 Tenha em mente a importância dos seus experimentos. Muitas vezes, quando você
começa a trabalhar, não há muita oportunidade em pensar conscientemente sobre a
relevância universal do seu experimento. Mas, à medida que for organizando os seus
experimentos, será importante lembrar porque você está fazendo o que está fazendo.
Pense sobre a Ciência. Algumas vezes o trabalho de laboratório parece tedioso e o fato
de lembrar porque você está repetindo o mesmo experimento pela décima vez faz com
que persista. Ter em mente o grande contexto também vai ajudá-lo a manter a
integridade da sua abordagem.
 Lembre-se de que você deve publicar os resultados dos seus experimentos. As
publicações são importantes - você não pode sobreviver sem elas. Se você considerar
cada experimento como uma entidade separada e passível de publicação, é mais
provável que você lembre de todos os “... os cientistas sempre colocam, no
controles e variáveis necessários. Pensar sobre mínimo, muito peso tanto em relação
cada experimento como uma publicação em a reputação de trabalho cuidadoso e
potencial pode ajudá-lo a manter o foco do seu meticuloso de um pesquisador, quanto
experimento. É muito fácil desviar-se para nos detalhes técnicos de um
outra áreas e parte da investigação é seguir por experimento, ao avaliar se os dados
novas avenidas. Mas a exploração deve ser constituem evidências confiáveis.”
feita rigorosamente e não com negligência. (Reproduzido de Woodward e
 Posicione-se como um investigador Goodstein 1996, com permissão, da
cuidadoso e perfeccionista. Você vai fazer a revista American Scientist, da Sigma
sua reputação não somente com os resultados Xi, The Scientific Research Society,
que obtém, mas também pela maneira como
executa os seus experimentos. Algumas pessoas são conhecidas como bons cientistas
“de bancada”, significando que seus experimentos são bem planejados e bem
executados. Crie a sua reputação desde cedo e qualquer dado não ortodoxo que você
produzir provavelmente será acreditado. Se os seus colegas de laboratório confiam nos
seus dados, o chefe do laboratório muito provavelmente também confiará e, a partir

disso, o resto da comunidade científica. Credibilidade é a chave.
 Seja um pensador crítico. Como de resto em ciência, as teorias por trás da
experimentação não são gravadas em rochas, e existem várias maneiras para explicar
como e porque os experimentos devem ser feitos.
Abordagens para a solução de problemas e para a experimentação

Reducionista. Quebra um problema em pedaços e resolve cada pedaço separadamente.
Dedutiva. Propõe uma hipótese e coleta dados para confirmar ou negar a hipótese.
Indutiva. Examina um conjunto de evidências sem discriminação e então propõe uma
teoria para julgar os fatos observados
Refutação. Proposta por Karl Popper. Se a prognóstico que fundamenta uma hipótese não
corresponde à realidade, a hipótese da qual ele é deduzido é considerada falsa e deve
ser rejeitada.
Separadamente, cada abordagem é

Eu sempre tenho tido razões para
inadequada. Você pode incorporar todas as
sentir que as minhas mãos são mais
abordagens. Ataque os seus dados por todos os
inteligentes do que a minha cabeça.
ângulos, procurando por falhas no seu
Esta é uma maneira crua de
raciocínio ou na abordagem experimental.
caracterizar a dialética da
Tente não inclinar os seus dados em direção à
experimentação. Quando um
conclusão que você quer ou espera.
experimento está indo bem, é quase
como uma conversa com a Natureza.
Fazemos uma pergunta e recebemos
PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS
uma resposta; então fazemos a
1. Defina a pergunta. Um experimento deve próxima pergunta e recebemos a
estar voltado para uma hipótese a fim de resposta seguinte. Um experimento é
responder a uma ou a duas questões uma estratégia para fazer a Natureza
específicas. Pensamento e leituras atentas, falar de modo inteligível. Depois, é só
assim como discussões com outros escutar.” (Reproduzido, com
cientistas, vão ajudar a definir as questões e permissão, de Geroge Wald 1968, 
estabelecer os parâmetros de um American Association for the
Advancement of Science.)
experimento. Certifique-se de não escolher perguntas que não são possíveis de

responder.
2. Delineie o experimento.
 Variáveis experimentais. Para o quê você quer olhar? Você quer ver, por
exemplo, um efeito em relação ao tempo, ou em relação à concentração, ou
ambos? Que concentrações vai usar e quais devem ser os tempos?
 Controles. Cada variável experimental precisa de um controle que mostre que os
resultados obtidos são devidos ao tratamento.
 Número de amostras. As amostras devem ser em duplicatas? Triplicatas? Mais?
As duplicatas são o mínimo para cada medida de atividade biológica.
FAÇA EXPERIMENTOS PEQUENOS. É muito tentador obter o máximo de dados de um

experimento, pois isto, teoricamente, vai maximizar o tempo. Mas a proporção
retorno/esforço é realmente muito maior em experimentos pequenos. Conduzir
grandes experimentos exige uma grande dose de capacidade, bem como sorte, e nunca
devem ser tentados antes que vários pequenos experimentos já tenham sido feitos.
A determinação do que é um experimento pequeno ou grande é completamente
subjetiva. Mas geralmente, se a grande quantidade de tubos faz você se sentir
perturbado ou confuso, o seu experimento é muito grande. Se você sentir isto
acontecer, divida o experimento em duas partes e faça somente a primeira parte.
No final, você não vai se sentir recompensado porque conseguiu levar adiante um
grande experimento, mas a sua recompensa pode ser um belo resultado publicado num
artigo e este é praticamente impossível de ser derivado de uma maratona espetacular. Não
dê uma de macho.
 Estatística. A análise É perda de tempo e de reagentes não refletir

estatística vai ajudar a cuidadosamente antes de organizar um experimento.
definir o tamanho da Muitos novatos (bem como pesquisadores sazonais)
amostra e outros podem confundir o trabalho e o senso de importância que
aspectos do alguém sente quando está fazendo muitos experimentos
delineamento com a idéia de estar realmente fazendo alguma coisa que
experimental. Descubra tenha sentido. Não se engane. NÃO HÁ NENHUM
SUBSTITUTO PARA O PLANEJAMENTO
CUIDADOSO!
se você vai submeter os seus dados a análise estatística - é muito tarde fazer isto
ao final do experimento.
3. Organize o experimento
 Obtenha e prepare um protocolo.
 Prepare os reagentes, reserve o equipamento, ponha as células para crescer e
esteja certo de que você dispõe de todos os elementos necessários.
 Execute mentalmente o protocolo, para certificar-se de que não esqueceu de
nada.
 Se este é um experimento complicado, com reagentes caros, primeiro execute na
prática o protocolo, omitindo estes reagentes. Isto vai garantir que as
manipulações que você planejou são exeqüíveis.
 Observe outra pessoa fazer o experimento. Se você vai usar uma nova técnica,
peça a outra pessoa que já tenha feito um experimento semelhante se você pode
olhar na próxima vez, ou se ela pode lhe ajudar.
4. Faça o experimento. Esteja certo de que você Não fale enquanto estiver
têm tempo suficiente para fazê-lo e acrescente planejando ou fazendo um
mais uma hora além do que estimou. Anote os experimento complicado, e não
resultados e observações assim que eles tenha medo de pedir às outras
acontecerem. pessoas para não falar com você.
5. Colete e analise os dados. Examine todos os Algumas pessoas usam um certo
seus dados assim que for possível - antes de boné ou usam um headphone para
fazer os próximo experimento! indicar aos colegas que elas
Não deixe acumular lâminas sem serem precisam ficar concentradas.
observadas ou pontos sem serem plotados em
gráfico. Este é um bom momento para consultar outro cientista do laboratório ou da
área sobre os resultados, se eles são “bons” ou “ruins”.
Erros comuns feitos ao organizar experimentos

Não pensar sobre a necessidade do experimento.
Planejar um experimento enorme e pantanoso com a intenção de envolver todas as
principais questões da biologia
Esquecer de avaliar experimentos anteriores.
Não refletir sobre cada controle para estar certo de que o experimento poderá ser
interpretado.
Não checar se todos os reagentes estão preparados e disponíveis antes de começar o
experimento.
6. Repita o experimento. Um resultado deve ser reproduzível ou será completamente

sem valor. E basicamente, ele deve ser repetido por outra pessoa, pois assim você
estará certo de que o resultado é confiável.
REFERENCIAL TEÓRICO
Muitos erros ao organizar um experimento podem ser evitados pelo conhecimento

da área. Mesmo que você tenha um protocolo, ainda vai precisar entender os detalhes e as
teorias do experimento. Através do levantamento da literatura, você pode encontrar quais
técnicas são geralmente usadas, que resultados pode esperar, quais reagentes são os que
provavelmente vão funcionar e em que concentração eles devem ser usados - mais uma
miríade de detalhes que podem ajudar nos momentos mais inesperados.
Comece com poucos artigos, os clássicos no seu tópico. Procure pelas referências
usadas nestes artigos: é provável que você tenha de ler a maioria, certamente alguns
duplicados em outros artigos. Vá para a biblioteca e leia.
Faça uma busca por palavras-chave no Medline ou outro banco de dados. Cheque
não somente os artigos mais recentes, mas também os mais antigos, pois há um número
surpreendente de bons experimentos que estão enterrados em periódicos obscuros porque o
seu valor não foi estimado como deveria. Use o seu próprio julgamento sobre a validade
dos dados nos artigos. Tente não ser influenciado por reputações ou nome de revistas
quando estiver avaliando os dados.
Mantenha-se atualizado na sua área pela leitura da literatura corrente. Muitas
pessoas têm alguns poucos periódicos que lêem regularmente para ficar a par do
desenvolvimento principal. Mas idéias de experimentos e de técnicas sempre são
encontradas em revistas especializadas e em outros periódicos que não se encontram na sua
biblioteca, por isso você deve procurar sistematicamente na literatura corrente. Disponha
de um horário para procurar no Medline, usando uma busca definida por palavras-chave e
autores. Ou use um dos programas de atualização de literatura que enviam semanalmente

um disquete com os últimos periódicos, e faça uma busca por palavras-chave e por autores.
CONTROLES
Teoricamente, um controle mostra o que aconteceria se você não tivesse feito nada;
portanto, ele mostra o que os seus lindos resultados significam. Deve haver um controle
para cada variável distinta do experimento. Não é incomum ter mais controles do que
amostras experimentais num experimento. Os controles não são extras, não são uma perda
de tempo, eles são absolutamente fundamentais para a interpretação de cada experimento.
Os controles não são feitos uma vez - eles devem ser repetidos a cada experimento.
Isto inclui curvas padrão para ensaios enzimáticos e pesos moleculares padrão para gel de
eletroforese. É absolutamente inválido voltar a um experimento anterior e usar os dados
dos seus controles, assumindo que os controles seriam os mesmos.
Tipos de controles
Controles experimentais. Estes controles vão lhe dizer se os procedimentos

experimentais básicos estão funcionando corretamente.
Exemplos de controles experimentais são os padrões de peso molecular usados para
DNA, RNA e géis de proteínas (bem como serem usados para medir pesos moleculares).
Através dos padrões de peso molecular pode-se presumir que o gel tem determinada
concentração de agarose ou acrilamida, se a transferência do gel para um filtro foi
satisfatoriamente concluída e se a eletroforese foi efetiva.
Controles de tratamento. Controles de tratamento são positivos ou negativos e
vão lhe mostrar se a manipulação experimental das células trouxe algum efeito. Se você
tem amostras que foram tratadas com múltiplos fatores, os efeitos de cada fator individual
deve ser controlado independentemente. Assim, se você está procurando pelo efeito da
incubação com os fatores X e Y, deve ter um controle incubado apenas com X e outro
incubado apenas com Y.
Controles positivos. Um controle positivo, geralmente é um controle experimental,
o qual mostra como os seus dados deveriam ser se o tratamento tivesse efeito.
Exemplos de controles positivos são a adição de uma linhagem de células que

expressam o receptor X quando se faz a imunofluorescência em células transfectadas com
o receptor X; e a inclusão de células que sabidamente respondem ao fator X pelo
crescimento estimulado quando se testa o efeito do fator X em células que nunca foram
testadas.
Controles negativos. O controle negativo mostra qual o efeito do não tratamento
na leitura de medidas.
Exemplos de controles negativos são a adição de uma linhagem de células que não
expressam o receptor X quando se faz a imunofluorescência em células transfectadas com
o receptor X; e a inclusão de células que sabidamente não respondem ao fator X pelo
crescimento estimulado quando se testa o efeito do fator X em células que nunca foram
testadas.
O controle negativo é aquele que sempre é esquecido e aquele cuja omissão não
será sentida até que se dê pela falta. É especialmente importante distinguir entre um
resultado positivo e um background forte quando se monta um sistema ou um conjunto de
experimentos. Muitas esperanças tem ido por água abaixo quando um resultado inicial
positivo é encontrado e o experimento é repetido com os mesmos resultados felizes - e
então, um controle negativo mostra que absolutamente tudo, apropriado ou inapropriado,
testa positivamente.
Tempos. Deve haver um controle para cada variação de tempo no experimento. Se
você está observando a meia-vida do mRNA aos 0, 5, 15 e 30 minutos depois de um
tratamento com o fator X, você deve ter um controle para incubação de suas células sem o
fator X aos 0, 5, 15 e 30 minutos. Não faça atalhos tentando ter um controle somente para
os tempos 0 e 30 minutos; cada tratamento precisa de um controle.
Selecione os tempos de tal maneira que a coleta de uma amostra esteja completa
antes da coleta da amostra seguinte. Se ocorrer um congestionamento de amostras,
encontre um “momento de pausa” durante a coleta - por exemplo, as células podem ser
mantidas em gelo até o final do experimento. Mas o que você faz com uma amostra deve
ser repetido com o resto: se você manteve um conjunto de amostras em gelo por 5
minutos, deve fazer o mesmo com todas as outras amostras.
Controle de tempo zero. Você deve, o quanto possível, coletar uma amostra
imediatamente após o experimento. Sim, em muitos casos, zero significa uma fração de
segundo ou minuto, mas você deve obter a amostra (e o seu respectivo controle) o mais
próximo possível do Agora.
Para um tempo zero, pode ser que faça mais sentido se ele for obtido DEPOIS dos
outros tempos iniciais, desde que a “idade” das amostras não seja importante. Se você
deseja coletar células em 0, 5, 10 e 30 minutos depois da adição do fator X, adicione o
fator X às amostras dos tempos 5, 10 e 30 e ponha-as para incubar. Então, adicione o fator
X para a amostra do tempo 0 e imediatamente colete a amostra ou pare a reação.
Que controles você pode eliminar se não tiver amostras suficientes?

Apesar do melhor planejamento, as coisas acontecem: algumas amostras podem
cair ou ficar contaminadas, pode não haver fatores de tratamento suficientes, você pode ser
chamado para fora do laboratório e não poder coletar as amostras em todos os tempos, mas
apesar disso, as amostras são preciosas e você precisa ter o máximo de dados possível.
O controle que você deixar de fora pode vir a ser o mais importante, mas no caso de
precisar excluir algum, elimine-os, na seguinte ordem:
1. Controles de procedimento.
2. Duplicatas de controles experimentais.
Se você precisar deixar de fora mais controles do que isto, é melhor não fazer o
experimento. Não existem experimentos válidos sem controles!
ESTATÍSTICA
Os seus dados precisam ser analisados estatisticamente para que sejam

convincentes? Na pesquisa biológica, esta não é uma questão de honestidade. Algumas
áreas de estudo aplicam a estatística religiosamente, mas existem campos de estudos
inteiros que insistem que os efeitos são tão grandes e os resultados tão obviamente
significantes que brincar com os números não é necessário. Geralmente, o seu laboratório
faz ou não faz análise estatística dos dados gerados.
Você deverá decidir por si mesmo se vai analisar os dados. Isto pode ser uma
decisão óbvia, especialmente se você for treinado em estatística. Olhe em outros artigos do
laboratório ou da área e veja como os dados são tratados. Pegue estes artigos e o seu
projeto de pesquisa e fale com um estatístico da instituição, talvez no centro de
computação. Chame uma das várias companhias que vendem pacotes de programas de
estatística ou visite um site on line para perguntar. Coloque o problema num grupo de
discussão.
Muito do que você está fazendo
Tenha cuidado, pois algumas fórmulas
consiste em estabelecer se os seus dados são
são às vezes diferentes para populações
devidos à manipulação experimental ou
e para amostras. É por isso que você
devidos ao acaso, e se os dados são
não pode simplesmente abrir um livro e
consistentes com a hipótese. Você pode querer
pegar uma fórmula, a menos que você
predizer as características de uma amostra
entenda o que está fazendo. É melhor
baseado na informação sobre a população, ou
nenhuma estatística do que estatística
pode querer predizer as características da
ruim.
população baseado na amostra.
Exemplos do uso de estatística no laboratório biomédico
 Para estimar as características de uma população com base nas informações sobre as
amostras: o test t de Student permite que você estabeleça um intervalo de confiança
para a média de uma população pequena com O valor de P, ou probabilidade,
distribuição normal. Você pode, então, obter a testa se os desvios observados
probabilidade de uma tabela. em relação à hipótese podem ter
 Para predizer as características de uma amostra ocorrido ao acaso. Se o valor de
com base na informação sobre a população: P é muito pequeno, pode-se
encontre a probabilidade usando uma curva de dizer que a hipótese é
distribuição normal. verdadeira.
 Para ver se a diferença entre as médias de dois
conjuntos de observações, como antes e depois de um tratamento, podem ser
explicadas pelo acaso: use o escore de diferenças para amostras de tamanho grande
(mais de 30) e o teste t para amostras de tamanho pequeno.
O desvio padrão é o tamanho do desvio de uma medida individual em relação à média de

muitas medidas. O erro padrão (também conhecido como o desvio padrão da média)
mede a média de todos os dados observados em relação à média de um banco de dados
hipotético e é a medida de quão perto da média está do valor “verdadeiro” (Koch 1994). O
desvio padrão e o erro padrão são às vezes (e erroneamente) usados alternadamente, com o
erro padrão sendo escolhido porque ele fornece valores menores e aparentemente minimiza
a dispersão dos dados.
Use o desvio padrão para mostrar o quão reproduzível um dado é, baseado em
múltiplas amostras.
 Para determinar a probabilidade de

Esteja certo de que os dados são lineares.
qualquer amostra dada, que tenha sido
Existem outros modelos, como o
retirada de uma dada população: use o
quadrático ou o exponencial, que podem
chi quadrado, uma distribuição
ser usado para os cálculos. Assumir que
amostral. Você pode também usar
há linearidade quando ela não existe é um
ANOVA ou teste t de Student.
erro comum que fornece números sem
 Para predizer o efeito de uma medida
exatidão.
relacionada a outra: use regressão
linear. Se as duas medidas têm uma
relação linear, você pode calcular um Muitos teste estatísticos (por exemplo
coeficiente de correlação. O uso mais ANOVA e o teste t) não devem ser usados se
comum da regressão linear no você espera um forte efeito de viés na
laboratório é para calcular o tempo de população. A maioria dos testes presume
duplicação. uma distribuição normal de uma população
 Para considerar os dados de várias desconhecida.
amostras ao mesmo tempo e distinguir as diferenças sistemáticas entre grupos das

variações ao acaso encontradas em A hipótese nula é a presunção de que os
cada grupo: faça uma análise de resultados do experimento são ao acaso.
variância (ANOVA). Se você deseja Se a probabilidade de obter este número
ver o efeito de dois tratamentos de amostras é menor do que uma pequena
experimentais sobre uma medida, faça porcentagem predeterminada, os
ANOVA de duas vias. resultados serão significantes e a hipótese
 Para ver a diferença entre duas nula é rejeitada.
amostras independentes, como quando
o Fator X foi adicionado a um grupo e o Fator Y a outro: use a hipótese nula e
determine a probabilidade. Use o teste z para um grande número de amostras, o teste t
de Student para um pequeno número de amostras.
A maioria das planilhas eletrônicas de computador fazem os cálculos estatísticos acima

(Koosis 1997). Programas de estatística também podem fazer isto, além de ajudá-lo a
decidir quais são os testes apropriados.
USO DE PROTOCOLOS
1. Obtenha um protocolo de:

 Outro investigador. O melhor lugar para obter um protocolo é de outro investigador
do laboratório, especialmente para os seus primeiros experimentos. O protocolo vai
estar sob medida para os recursos e para a especialidade do laboratório, e pode
conter detalhes importantes sobre os tubos usados na centrífuga do laboratório ou
truques para obter padrões. E você vai ter um especialista por perto.
Qualquer investigação, não interessa o quão experimental seja, deve ter um
protocolo. Sempre. Mesmo que você esteja montando uma técnica pela primeira vez, ou
repetindo um procedimento feito comumente, você deve fazer isto de acordo com um
protocolo escrito. Se você já fez o experimento 50 vezes, você ainda precisa ter um
protocolo ou uma referência de um (como, por exemplo, “Protocolo para extração, página
3, seguido exatamente”) no seu caderno de laboratório.
 Um livro de protocolos. Existem muitos manuais de laboratório disponíveis
comercialmente, com protocolos simples e claros para muitos campos da biologia.
Manuais do laboratório, do departamento e de cursos são também uma boa fonte
para protocolos simples. A desvantagem de usar um manual comercial é que você
terá de ajustar o protocolo
sozinho. Se você tem alguma dúvida sobre um protocolo de um
artigo, não hesite em ligar para o autor! O endereço, o
 Seção de “Métodos”
número de telefone e o endereço de E-mail para quem a
publicada nos artigos.
correspondência deve ser enviada está na primeira ou na
Este é o lugar menos
última página do artigo. A seqüência preferida para
confiável para achar um
entrar em contato é: primeiro E-mail e depois o telefone,
protocolo. As seções de
se não houver resposta eletrônica.
métodos são notórias pela
ausência de detalhes que são deixados de lado devido a problemas de espaço ou por
outros motivos.
2. Leia o protocolo para ver se ele faz sentido para você. Faça de conta que está
fazendo o experimento e procure por passos que estejam obviamente faltando em
relação à lógica (sua ou da fonte) ou em relação à funcionalidade. Muitas presunções
são feitas na maioria dos protocolos, mas elas podem não ser óbvias para você. Por
exemplo, “extração com fenol” sempre significa uma extração com fenol saturado em
tampão com pH ajustado, seguido por duas extrações com fenol:clorofórmio:álcool
isoamil.
3. Mude o protocolo conforme as suas necessidades e rescreva-o. Isto é para tornar os
passos mais compreensíveis para você ou para alterar algum equipamento conforme a
necessidade. Se um protocolo diz que uma amostra é centrifugada a 13.000g, você deve
procurar pela centrífuga apropriada para usar e anotar isto no protocolo.
4. Prepare todos os reagentes listados no protocolo e certifique-se que você tem tudo
o que precisa. Tudo! Nada é tão óbvio. Seria extremamente chato se você corresse até
a centrífuga com os seus tubos apenas para
Você deve usar um kit? Os
descobrir que alguém recém começou uma
reagentes estão preparados, as
centrifugação de uma hora. Consiga outra ou
instruções são claras e, sim, na
reserve a centrífuga. A reserva é um pouco
maioria dos casos você deve usar
arriscada nos primeiros experimentos, pois é
um kit, desde que o preço não seja
difícil de definir a hora que você vai precisar,
proibitivo. Mas, um alerta
portanto é mais seguro ter um plano de reserva.
importante: não deixe o kit
Esteja particularmente certo de que você tem o
substituir o seu raciocínio.
radioisótopo que precisa. Pode levar semanas
Conheça cada componente do kit e
desde a sua encomenda até que chegue para o
esteja certo de que compreende o
seu experimento.
que o kit faz.
5. Siga o protocolo exatamente na primeira vez
que fizer o experimento. Porque? Se alguém lhe dá um protocolo e você não o seguir
exatamente, aquela pessoa não poderá (e talvez não queira) ajudá-lo a interpretar os
dados. Você deve ser capaz de reproduzir os resultados típicos do protocolo antes que
começar a fazer variações nele. Você deve entender que está medindo o efeito de uma
variável, não a sua técnica. Você deve tentar não ser uma variável do seu próprio
experimento!
6. Modifique o protocolo baseado na sua Não se preocupe se não obtiver

própria experiência com ele. A medida que for sucesso imediato. Qualquer um que
executando o protocolo ao longo do tenha vivência de laboratório sabe:
experimento, faça anotações de qualquer um novo experimento nunca
melhoria que você perceba que possa ser feita. funciona na primeira vez. Você
Quando estiver avaliando os seus dados, reflita deve repeti-lo cuidadosamente.
sobre as alterações e confirme com alguém do Ainda não funciona. Você repete
laboratório se elas fazem sentido. Rescreva o novamente e, talvez, mais uma vez.
protocolo para a próxima vez que for executá- Ainda não funciona. Mas na
lo. Normalmente, você tem um protocolo no próxima tentativa, desde que você
qual você faz alterações ao longo de vários esteja certo de que está fazendo
experimentos. Vale a pena modificar, escanear, exatamente o que deve ser feito, o
ou mesmo digitar os novos protocolos no seu experimento deverá funcionar. A
computador e, quanto mais cedo tiver os seus partir de então, ele sempre vai
protocolos em arquivos de computador, melhor. funcionar.
Assim, a medida que o protocolo continua a
evoluir, você pode adicionar as alterações e ainda terá um protocolo legível.
Exemplos de protocolos
ELETROPORAÇÃO DE M. SMEGMATIS
B. Jacobs, Meth. Enzymol:204,527, 1991
1. Inocular 1 litro de caldo M-ADC-TW e incubar aproximadamente 48 h até A 200 alcançar 0,5-
1,0.
2. Coletar em frascos de 250 ml por centrifugação por 10 minutos a 10.000 rpm a 4°C.
3. Re-suspender cada pélete em 250 ml de glicerol 10% e centrifugar conforme acima.
4. Re-suspender cada pélete em 10 ml de glicerol 10% gelado, colocar em 2 tubos cônicos de
polipropileno de 50 ml e aumentar o volume para 50 ml com glicerol 10%. Centrifugar por 10
min a 3000 a 4°C.
5. Repetir a lavagem do item 4.
6. Re-suspender cada pélete até um volume final de 1 ml em glicerol 10%.
7. Colocar DNA (5 pg- 5ug em 5 l de volume máximo; conferir se o DNA foi lavado em etanol
70%) e 50 l de células num tubo Eppendorf e misturar pipetando para cima e para baixo.
Manter em gelo por 1 min.
8. Ajustar a voltagem do pulsador (Bio-Rad) para 2500 V, 25 F, e o controlador de pulso para
1000 ohms.
9. Transferir a solução contendo as células e o DNA para uma cubeta com um eletrodo de 0,2 cm
de espaço. Bater a cubeta contra o balcão várias vezes para as células irem para o fundo e
remover as bolhas.
10. Colocar a cubeta no pulsador e expor a um pulso (as constantes de tempo são geralmente entre
15,0 e 25,0 mseg).
11. Adicionar 1 ml de caldo M-ADC-TW, re-suspender as células e transferir para tubos de
polipropileno de 15 ml com fundo arredondado. Incubar a 37°C por 3 h.
12. Espalhar 300 l de células em meio seletivo.
* Alíquotas dos “bugs” podem ser colocadas em tubos Eppendorf, congeladas rapidamente em gelo
seco-etanol e estocadas em nitrogênio líquido ou a -70°C. Para usar, descongelar lentamente em
temperatura ambiente. Lavar as células duas vezes em glicerol 10%.
Protocolo 1.
Uma cópia do protocolo pode ser usada como um modelo no qual podem ser feitas
anotações sobre o experimento e as alterações no procedimento.
Imunoprecipitação da Proteína 68K - Proteína 68K marcada com P 32 foi imunoprecipitada de

lisados de células contendo quantidades equivalentes de proteínas usando-se um anti-soro direcionado contra
a proteína 87K de cérebro bovino como descrito previamente (4). Em alguns casos, foi utilizado um anti-
soro direcionado contra a proteína 68K de cérebro de camundongo purificado. Os dois anti-soros forneceram
resultados idênticos. Proteína 68K imunoprecipitada foi separada por eletroforese em gel SDS-PAGE 8% de
acordo com Laemmli (9) e a proteína 68K marcada com P 32 foi visualizada por auto-radiografia usando filme
de raio X Kodak X-Omar e telas intensificadoras. Onde indicado, os auto-radiogramas foram escaneados em
um densitômetro LKB Ultrascan.
PROTOCOLO DE IMUNOPRECIPITAÇÃO
Começar com lisados de células em aproximadamente 10 l de tampão de lise em gelo

(concentração de proteína 1,5 g/l). Manter as amostras a 4 graus para os passos seguintes.
Remover previamente com 50 l de esferas de Protein A Sepharose (Sigma #P-3391) (50% de
pasta fluida em PD). Adicionar as esferas e rotar 15 minutos a 4C.
Centrifugar os tubos a 7000 rpm, 2 minutos, 4C, em TOMY com Rotor com balanço.
Transferir cuidadosamente o sobrenadante para tubos eppendorf novos.
Para “supe”, adicionar 5l de anticorpo/150g de proteína. Rotar 1 hora a 4C.
Adicionar 50l de esferas Protein A Sepharose e rotar 15 minutos 4C.
Centrifugar como anteriormente. Guarde sobrenadante para gel para confirmar a depleção por
anticorpo.
Lavar as esferas duas vezes com Solução de Lavagem A.
Uma vez com Solução de Lavagem B
Uma vez com Solução de Lavagem C
isto é, adicionar 1ml de tampão, vórtex, centrifugar como antes, descartar o sobrenadante.
Re-suspender as esferas em tampão SDS, ferver 5 minutos e correr em gel SDS Page.
Preparação das esferas de Protein A Sepharose

Para 1,5g de esferas Protein A Sepharose adicionar 30ml PD
Rotar 15min a 4C
Centrifugar in Kneewell 1500 rpm, 10min, 4C
Aspirar Supe
Repetir esta lavagem 2 vezes
Adicionar 6ml de PD recente para lavar as esferas até o volume final de 12ml.
Adicionar 2,4mg de Azida Sódica (concentração final de 0,2mg/ml)
Protocolo 2.
Estes protocolos de imunoprecipitação são do mesmo laboratório. O primeiro é de um
manuscrito publicado (Rosen et al., J. Biol. Chem. 264:9118-9121), o outro de um
protocolo efetivo usado no laboratório. (Cortesia de Alan Aderem, Universidade de
Washington, Seatle.)
PARA TIRAR BELAS FOTOS DE FLUORESCÊNCIA COM O ZEISS

Ligar o microscópio (chave atrás, à direita)
Colocar o filme na câmera (à direita):
Alinhar a linha vermelha com o ponto vermelho e tire fora o corpo da câmera
Puxar a presilha
Usar a manivela para confirmar que não há filme na câmera (! botão na frente, à direita
existe uma lâmpada acesa se há filme dentro, e uma lâmpada piscando se não há filme.)
Tirar fora o corpo da câmera
Pressionar o botão prateado para abrir a tampa do receptáculo do filme
Colocar o filme na posição, puxar a extremidade e prender
Fechar a tampa
Colocar o receptáculo no corpo da câmera
Encaixar o corpo da câmera no microscópio
Pressionar o botão B (na frente) 3 vezes para avançar o filme
Ajustar a ASA (na frente do microscópio)
Ligar a lâmpada fluorescente (caixa à direita)
Desligar a fonte de luz visível (chave preta à esquerda)
Ajustar os filtros de fluorescência (chave preta à direita, segunda de cima para baixo)
1ª parada, 4 linhas = verde para rodamina
2ª parada, 3 linhas = azul para fluoresceína
NÃO TIRAR TOTALMENTE O FILTRO PARA FORA ENQUANTO A LÂMPADA
FLUORESCENTE ESTIVER LIGADA - PODE FERIR OS SEUS OLHOS
Focalizar
Cortar a luz para a ocular (chave preta no topo à direita). Você deve enxergar linhas cruzadas e usá-
las para conferir se o foco está correto, mas a luz é fraca.
Pressionar o botão A (botão em frente à direita) para tirar a foto. O medidor de exposição vai
indicar que proporção da exposição foi completada, a exposição está completa em 1. Filmes de
3200 ASA vão levar aproximadamente 15-30 segundos, e de 160 ASA levam mais do que 3
minutos.
Deslizar o filtro (atrás da objetiva) para bloquear a fluorescência. Usar este filtro, junto com o
botão de luz visível (à esquerda, atrás) para tirar fotos em luz visível.
Tirar o filme da câmera:
Desencaixar o corpo da câmera
Usar a manivela para rebobinar o filme completamente
Para desligar:
Desligar a lâmpada fluorescente
Desligar o microscópio
Limpar as objetivas gentil e completamente apenas com papel para lentes
Protocolo 3.
Um protocolo pode ser feito para um procedimento, assim como para um experimento, e
pode ser fixado próximo ao equipamento do qual descreve o uso.
INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
Você deve examinar os seus dados com a mesma atenção para detalhes que você
dedica aos experimentos de um concorrente. Exponha os seus dados e pergunte a si
mesmo:
1. O experimento funcionou? Cheque os seus controles. Olhe para os seus
procedimentos de controle primeiro para estar seguro de que o seu experimento
funcionou. As células se nutriram? Os marcadores de peso molecular correram como
você esperava? Examine os seus controles positivos. Se eles funcionaram,
provavelmente o seu experimento foi executado apropriadamente. Agora olhe para os
controles negativos. Se houve um efeito onde você não esperava, você deve decidir se
isto é um efeito real ou background. Se o seu controle negativo parece negativo,
provavelmente tudo está bem. Se ele está positivo, ou o experimento não foi planejado
corretamente ou outra variável manifestou-se por si própria durante o experimento.
2. Quais são os resultados? Comparados com o controle, e tirando o background, você
conseguiu algum efeito? O quanto de efeito? Duas vezes? Cinco vezes? Faça todos os
cálculos e gráficos, de tal forma que você compare dados ao invés de efeitos subjetivos.
Dois efeitos são sinérgicos ou aditivos? O efeito variou com o tempo?
3. O que o experimento significa? O resultado faz sentido? O resultado é o que você
esperava? Você tem alguma explicação para resultados espúrios? Algum controle
adicional poderia ajudar para uma melhor compreensão?
4. Outros investigadores vão entender o experimento? Fale com outros membros do
laboratório. Discuta os resultados com a pessoa que lhe forneceu o protocolo, ou outra
pessoa versada na técnica. Recue e leia os artigos fundamentais novamente. Não fique
muito animado ainda, até que os resultados tenham sido repetidos.
5. O resultado pode ser repetido? Faça o experimento de novo. Inclua controles que
possam reforçar o resultado e resolva quaisquer dúvidas que você tenha sobre o
resultado.
A única maneira de aprender a interpretar experimentos é fazendo, e muito. Você irá

desenvolver uma percepção sobre o significado de um experimento, ou que ele necessita.
A experiência com diferentes tipos de experimentos vão fazer com que você “saiba”
instantaneamente quando um experimento funcionou ou não funcionou. FAÇA muitos
experimentos.
QUANDO EXPERIMENTOS NÃO FUNCIONAM
Você fez o experimento e obteve um resultado completamente inesperado.

1. Se isto foi devido a um problema de procedimento, cheque o seu equipamento. Confira
se os plugues estão conectados, se usou o tampão correto. Leia atentamente as suas
anotações para ver se omitiu alguma coisa.
2. Refaça o experimento. Isto quase sempre resolve o problema, porque muitos enganos
com controles positivos e negativos são equívocos de manipulação.
3. Se o problema persiste, refaça somente aquela parte do experimento que está em
questão. Um experimento apenas com controles negativos e positivos é o que
geralmente é necessário.
Por exemplo, se um controle negativo tem um sinal forte no seu ensaio, num pequeno
experimento de repetição, cheque contra um controle positivo apenas o controle negativo e
mais um controle negativo obtido de outra fonte. Se apenas o controle negativo original
“comporta-se” incorretamente, existe um problema apenas com o controle negativo, e não

com o resto do experimento. Se ambos os controles negativos têm um resultado positivo,
você deve começar checando os tampões e outros componentes.
4. Quando você tiver identificado a fonte do problema, faça um pequeno experimento

para ver se o problema foi resolvido. Não fique tentado a repetir o experimento original
ainda - espere até que o resultado tenha sido explicado.
5. Quando você não consegue identificar a fonte do problema, mesmo depois de ter
solicitado conselhos e feito tudo o que podia, repita o experimento. E repita. E repita.
A dificuldade é distinguir entre um experimento que ainda não funcionou de outro que
nunca funcionará. Isto exige prática e experiência, e vai se tornar fácil - mas sempre será
parte da vida na bancada.
Troca de projetos
A maioria dos projetos iniciam com confiança e excitação. À medida que eles são
implementados e explorados, e à medida que muitas horas vão se passando, o investigador
pode perder a perspectiva. Emoção e ego são envolvidos no sucesso de um projeto. Muitas
vezes parece impossível que o projeto dê certo.
Uma idéia sempre precede a
É imperativo que, como um cientista, você
tecnologia disponível. Não
aprenda quando parar um projeto. E desde que, com
interessa o quão espetacular e
tal investimento emocional, não consiga tomar tal
importante é a idéia. Se você não
decisão, você deve pedir e aceitar conselhos.
pode prová-la com confiança, você
Perceber quando parar um projeto nem
não deve trabalhar nela.
sempre é claro. De fato, isto raramente fica
evidente. Algumas indicações são:
 Os dados não são reproduzíveis. Se você não pode replicar os seus resultados, mesmo
que acredite neles do fundo do coração, você não pode continuar o projeto. Pode ser
que haja problemas com um ensaio em particular ou com algum equipamento, e isto
deve ser investigado antes de abandonar o projeto. Pode ser, também, que as variações
sejam inerentes ao sistema, ou que o efeito não é importante, ou que o efeito que está
estudando é muito pequeno para ser explorado com a tecnologia disponível.
 O projeto não tem apoio do investigador principal. O grau de independência do

pessoal varia muito entre os Existem investigadores principais que não
laboratórios. Em alguns lugares, você se importam com o pessoal e lhes
pode escolher o seu próprio projeto e designam projetos com pouca chance de
como conduzi-lo, e vai receber muito sucesso. Isto geralmente é feito porque ele
pouca instrução do investigador ou ela tem uma idéia na qual estão
principal. Mas você provavelmente vai interessados, mas não têm uma
receber conselhos e opiniões, e deve oportunidade real de trabalhar nela. Se
ouvi-los. Mesmo que você receba você sentir que está sendo sacrificado,
liberdade total, não faz sentido faça algo imediatamente. Fale com o
continuar com um projeto no qual o investigador principal e com outros no
pesquisador principal não acredita. É departamento. Isto é uma característica de
muito difícil de trabalhar num projeto avaliação e de discernimento científico
que o chefe do laboratório não gosta. que você deve julgar. Se ele ou ela se
Tente convencê-lo com os seus dados, recusa em retirar você do projeto que está
é claro. Se não funcionar, considere obviamente condenado, você deve
uma troca de projeto. considerar em deixar o laboratório.
 A direção do projeto foi alterada.
Resultados inesperados podem colocar o projeto por um caminho no qual nem o
laboratório nem o investigador querem seguir. Um exemplo poderia ser de um
estudante que começou a trabalhar numa proteína que se pensava ser crítica para a
fisiologia de Drosophila. Depois de clonar e seqüenciar o gene, ele descobre que a
proteína está envolvida na neurogênese de mamíferos e que o seu papel em Drosophila
tem pouca importância. O projeto mudou, e o estudante deve decidir se estuda
neurogênese num laboratório equipado para a genética de moscas, se colabora ou se
agrega a outro laboratório, ou desiste do projeto.
 O projeto é muito difícil. A dificuldade de um projeto deve ser julgada em relação ao
tempo que você tem para trabalhar nele. Se o seu visto expira em 2 anos, não vai querer
trabalhar num projeto que irá levar 4 anos ou mais para continuar. Uma opção é ter
alguém pronto para assumir o projeto e dividir os créditos. Trocar de projeto não é um
fracasso! A maioria dos problemas que levam a fracassos ocorrem com pesquisadores
sem experiência agarrados a projetos inviáveis.
“Esperando pelo ônibus na chuva” ou “eu investi muito tempo neste projeto para
desistir agora”.
Você chega no ponto de ônibus. Espera pelo ônibus. Ele está atrasado. Você olha
para o seu relógio, olha para a rua molhada de chuva, olha para o seu relógio. Este ônibus
nunca se atrasa - geralmente. Mas está atrasado hoje. Existe outro ônibus que você pode
pegar se correr para a outra esquina. Mas... você investiu tanto tempo neste ônibus, e se ele
chegar assim que você for embora?
Bem, e se isto acontecer? O que você vai perder se pegar o outro ônibus? A
pesquisa é como esperar o ônibus na chuva. Não existe nenhum sinal de néon dizendo
quando trocar de projetos, mas você deve tomar uma decisão informada. Você não deve se
preocupar com o tempo que pensa ter perdido se trocou de projeto. Pense sobre o tempo
que você perde se não trocar no momento certo.
FONTES DE CONSULTA
Bausell R. Barker. 1994. Conducting meaningful experiments: 40 steps to becoming a

scientist. Sage Publications, Thousand Oaks, California. (Aborda a filosofia dos
experimentos, a decisão se um experimento vale a pena, a análise e a divulgação de
resultados)
Brown S., McDowell L., and Race P. 1995. 500 tips for research students. Kogan Page,
London. (Direcionado para estudantes, mas útil para todos os pesquisadores,
especialmente aqueles num ambiente acadêmico. Contem não apenas dicas de
organização de experimentos, mas conselhos práticos sobre tópicos como enfrentar
as incertezas, participação em conferências e o desenvolvimento de know-how
institucional.)
Carey S.S. 1993. A beginners guide to scientific method. Wordsworth Publishing, Belmont,
California.
Carr J.J. 1992. The art of science: A practical guide to experiments, observations, and
handling data. Hightext Publications, San Diego.
Jacobs, Jr. W:R., Kalpana G.V:, Cirillo J.D., Pascopella L., Snapper S.B., Udani R.A.,
Jones W:, Barletta R.G., and Bloom B.R. 1991. Genetic systems for mycobacteria.
Methods Enzymol. 204: 537-555.
Koch A.L. 1994.. Growth measurement. In: Methods for general and molecular
bacteriology (ed. Gerhardt P. et al.), pp. 249-276. American Society for
Microbiology, Washington, D.C.
Koosis D.J. 1997. Statistics. A self-teaching guide. John Wiley & Sons, New York.
Rosen A., Nairn A.C., Greengard P., Cohn Z.A, and Aderem A. 1989. Bacterial
lipopolysaccharide regulates the phosphorylation of the 68K pratein kinase C
substrate in macrophages. J Biol. Chem. 264: 9118-9121.
Stent G. 1982. Prematurity and uniqueness in scientific discovery. In: Readings from
Scientific American. Scientific genius and creativity, pp. 95~104.
Wald G. 1968. Molecular basis of visual excitation. Science 162: 230-239.
Woodward J. and Goodstein D. 1996. Conduct, misconduct and the structure of science.
Am. Sci. 84: 479-490.

Como organizar um experimento científico

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Na Bancada - Kathy Barker Capítulo 4 1

Inserir figura (pág.68)

Como organizar um experimento

Um experimento é um Considerações filosóficas #

Nem todos os experimentos serão sensacionais. É ótimo pensar em fazer somente

seus dados, o chefe do laboratório muito provavelmente também confiará e, a partir

Abordagens para a solução de problemas e para a experimentação

Separadamente, cada abordagem é

experimento. Certifique-se de não escolher perguntas que não são possíveis de

FAÇA EXPERIMENTOS PEQUENOS. É muito tentador obter o máximo de dados de um

 Estatística. A análise É perda de tempo e de reagentes não refletir

Erros comuns feitos ao organizar experimentos

6. Repita o experimento. Um resultado deve ser reproduzível ou será completamente

Muitos erros ao organizar um experimento podem ser evitados pelo conhecimento

autores. Ou use um dos programas de atualização de literatura que enviam semanalmente

Controles experimentais. Estes controles vão lhe dizer se os procedimentos

Exemplos de controles positivos são a adição de uma linhagem de células que

Que controles você pode eliminar se não tiver amostras suficientes?

Os seus dados precisam ser analisados estatisticamente para que sejam

Exemplos do uso de estatística no laboratório biomédico

O desvio padrão é o tamanho do desvio de uma medida individual em relação à média de

 Para determinar a probabilidade de

comum da regressão linear no você espera um forte efeito de viés na

laboratório é para calcular o tempo de população. A maioria dos testes presume

duplicação. uma distribuição normal de uma população

 Para considerar os dados de várias desconhecida.

amostras ao mesmo tempo e distinguir as diferenças sistemáticas entre grupos das

A maioria das planilhas eletrônicas de computador fazem os cálculos estatísticos acima

1. Obtenha um protocolo de:

6. Modifique o protocolo baseado na sua Não se preocupe se não obtiver

Imunoprecipitação da Proteína 68K - Proteína 68K marcada com P 32 foi imunoprecipitada de

Começar com lisados de células em aproximadamente 10 l de tampão de lise em gelo

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Bausell R. Barker. 1994. Conducting meaningful experiments: 40 steps to becoming a

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