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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS FACULDADE DE CINCIAS BIOLGICAS

MASE GOMES QUEIROZ

INVESTIGAO DOS POLIMORFISMOS RELACIONADOS COM RESISTNCIA MALRIA (HEMOGLOBINA S, SISTEMA SANGUNEO DUFFY E DEFICINCIA EM G6PD) E DETECO DE PLASMODIUM POR QPCR EM POPULAO DO MUNICPIO DE ANAJS PA.

Belm JULHO / 2010

MASE GOMES QUEIROZ

INVESTIGAO DOS POLIMORFISMOS RELACIONADOS COM RESISTNCIA MALRIA (HEMOGLOBINA S, SISTEMA SANGUNEO DUFFY E DEFICINCIA EM G6PD) E DETECO DE PLASMODIUM POR QPCR EM POPULAO DO MUNICPIO DE ANAJS PA.

Pr - projeto apresentado Faculdade de Biologia da Universidade Federal do Par, como avaliao da disciplina Iniciao ao TCC e requisito parcial para a obteno do grau de Bacharel em Biologia.

Orientador: Prof. Dr Joo Farias Guerreiro

BELM 2010

1.

INTRODUO A malria considerada um problema de sade pblica em muitos pases,

principalmente os de localizao tropical e subtropical, os quais contaram em 2008 a estimativa de 243 milhes de casos, maioria destes no continente africano (85%), seguida pelo sudeste asitico (10%). O nmero de casos de bitos devido malaria em 2008 foi de aproximadamente 863.000, dos quais 89% foram na frica, e 6% na regio do Mediterrneo Oriental (WHO, 2009). Na Amrica, 21 pases so endmicos para malaria com diferentes graus de transmisso, dentre os quais 12 j apresentaram reduo no numero de casos, enquanto que o Brasil demonstra flutuaes nesta estimativa e corresponde a mais da metade do numero total estimado de casos para as Amricas (WHO, 2009), As ocorrncias de malaria de forma endmica esto restritas a regio amaznica, sendo o estado do Par o segundo estado com maior numero de casos registrados. (SIVEP, 2008). Dentre as espcies de Plasmodium, o agente etiolgico da malria, trs delas ocorrem oficialmente no Brasil, Plasmodium malariae, Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum. Os casos mais freqentes de infeco so por P. vivax, enquanto que os mais graves por P. falciparum (SIVEP, 2008), sendo que alguns autores tm considerado Plasmodium knowlesi (espcie causadora de malria em primatas no-humanos) como mais um parasita humano. (WHITE, 2008). 1.1. Ciclo biolgico da malria A infeco ocorre quando uma fmea do gnero Anopheles, ao realizar repasto sanguneo, transfere esporozotos de Plasmodium fazendo com que este atinja a corrente sangunea. Em seguida, os esporozoitos atingem os hepatcitos, local onde sero produzidos os merozotos, forma assexuada sanguinea que tambm considerada a mais antignica do parasita. nesse estgio, onde grande parte dos mecanismos de defesa do hospedeiro humano atua, como por exemplo, a Hemoglobina S (HbS) e a ausncia da glicoprotena do sistema sanguineo Duffy (Fy) na membrana eritride (VERONESI, 2005). 1.1. Hemoglobina S (HbS) A HbS caracterizada pela substituio de uma glutamina por valina na posio 6 na cadeia de aminocidos da globina Beta. Essa mudana gera

alteraes fsico-qumicas na protena de tal forma que quando desoxigenada, ocorre a polimerizao das mesmas. Desta maneira, os polmeros de globina formam fibras alterando a forma bicncava do eritrcito, o qual passa a apresentar a forma de foice (Anemia Falciforme). Sob essas condies, o eritrcito possui maior probabilidade de ser retirado da circulao sangunea por sequestro esplnico ou mesmo pelo sistema monocluear fagocitrio. Em se tratando de eritrcitos falcmicos parasitados pelo Plasmodium, estes no conseguem atingir a fase matura de merozoto devido remoo precoce, logo, no sero capazes de infectar outros eritrcitos (ZAGO, 2004). 1.3. Sistema sanguneo Duffy (Fy) O mecanismo de proteo, relacionado ao sistema sanguneo Duffy, caracterizado pela ausncia do antgeno em clulas eritrides (MASON et al, 1977). Esse grupo de glicoprotenas possui um domnio especfico para protenas receptoras de P. vivax, ou seja, esses antgenos medeiam a entrada desta espcie do parasita (CHITNIS and MILLER, 1994). So conhecidos dois antgenos para este grupo, FyA e FyB, os quais diferem por um nico aminocido (TOURNAMILLE and LE VAN KIM et al, 1995). A ausncia deste na membrana eritrocitria deve-se a uma mutao de ponto na regio GATA-box do promotor de FyB, alterando o stio de ligao do fator de transcrio eritride GATA1, que por sua vez leva ao silenciamento da expresso do gene (TOURNAMILLE and COLIN et al,1995). 1.4. Glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD) A enzima Glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD) participa da primeira etapa da Via das Pentoses fosfato, catalisando a reao de oxidao de glicose 6 fosfato em 6-fosfogliconolactona, ao passo que reduz NADP+ produzindo NADPH. Esta ltima atua como coenzima de agentes antioxidantes, tais como a glutationa redutase, a qual mantm os nveis basais de glutationa reduzida (GSH), responsvel pela manuteno do estado reduzido de protenas de membrana e hemoglobinas (FILOSA et al, 2003). Uma vez que, os eritrcitos maduros carecem de vrias organelas, inclusive as mitocndrias, a Via das pentose fosfato torna-se a nica fonte de NADPH nestas clulas (Luzzatto and Mehta, 1995). O gene G6PD est localizado no brao longo do cromossomo X (Xq28) (PREZ-CRESPO et al, 2005) e muitas mutaes neste locus do origem a um grande nmero de enzimas variantes, muitas das quais so caracterizadas por uma eficincia reduzida de sua atividade, em diferentes graus (MASON et al, 2007). Uma das muitas variantes

bem descritas a G6PD A-, a qual caracterizada pela substituio de G para A no nucleotdeo 202, localizado no xon 4 deste gene, modificando o aminocido metionina pela valina na posio 68 (HIRONO AND BEUTLER, 1988). Este polimorfismo, G202A, apresenta-se com elevadas freqncias em populaes africanas (VULLIAMY et al, 1991) 1.5. Mtodos diagnsticos O diagnstico da malria se d por diversos mtodos, os quais so caracterizados pela identificao visual de formas assexuadas sanguineas (microscopia ptica), ou deteco de antigenos, anticorpos, e mesmo cidos nuclicos do mesmo. O mtodo convencional de deteco por microscopia ptica, utilizando a tcnica do esfregao ou da gota espessa, vem sendo utilizado por mais de um sculo, e mesmo tendo sofrido poucas mudanas, ainda o mtodo padro de muitas reas endmicas de malria devido ao seu baixo custo. Contudo, apresenta baixa sensibilidade quando comparado a outros mtodos mais avanados, uma vez que um diagnstico acurado depende da experincia do microscopista e da quantidade de formas sanguineas do parasita, o que a torna um mtodo pouco eficiente nos casos de infeces subpatentes (TANGPUKDEE et al, 2009). As tcnicas de biologia molecular tm se mostrado mais eficazes na deteco e diferenciao de espcies nos casos de baixos nveis de parasitemia, sendo bastante teis em casos de infeces mistas.

2.

JUSTIFICATIVA A regio amaznica apresenta-se heterognea no que diz respeito aos

nveis de endemicidade e transmisso, os quais variam de baixa a mdia intensidade. Sendo assim, a populao exposta altamente susceptvel, uma vez que o grau de imunidade adquirida da mesma bastante varivel e que no chega a ter um efeito protetor. E mesmo com os resultados positivos obtidos com vrios programas de controle da malria nessas regies, a situao ainda alarmante em muitas reas e a incidncia parasitria vem oscilando ao longo dos anos, variando grandemente dentre os estados amaznicos. Portanto, a investigao de

parmetros biolgicos que podem estar relacionados infeco malrica, seja conferindo resistncia, susceptibilidade, ou mesmo algum grau de proteo, de fundamental importncia, os quais possam explicar tal susceptibilidade desta populao (PNCM, 2003). A triagem de indivduos portadores de deficincia na enzima glicose-6fosfato-desidrogenase (G6PD) faz-se necessria em reas endmicas para malria, uma vez que o tratamento da malria tipo vivax requer o medicamento primaquina. Devido ao seu carter oxidante, esta capaz de induzir anemia hemoltica grave em indivduos portadores desta enzimopatia. Tambm vale ressaltar a necessidade da avaliao de novos mtodos diagnsticos, visto que um controle efetivo da malria depende de diagnstico e tratamento imediatos. O mtodo tradicional utilizado para identificao do parasita feito por microscopia tica, contudo outras metodologias vm sendo desenvolvidas dentre elas, destaca-se as tcnicas de biologia molecular, as quais tm se mostrado mais sensveis como a Reao em Cadeia da Polimerase (PCR), permitindo a deteco em indivduos com baixos nveis de parasitemia e at mesmo a diferenciao das espcies de Plasmodium. A PCR em Tempo Real (qPCR), por sua vez, alm de ser mais sensvel que a PCR convencional, tanto no que diz respeito ao grau de parasitemia e identificao da espcie do parasita, ela permite essa deteco simultaneamente amplificao, diminuindo o tempo gasto no diagnstico. 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral

Investigar fatores biolgicos relacionados ao hospedeiro humano, que participam dos mecanismos de proteo contra a malria, e dessa maneira contribuir para futuro desenvolvimento de novas estratgias de tratamento e preveno da doena, assim como para a implantao de novas metodologias de diagnstico e monitoramento. 3.2 Objetivos Especficos

Investigar

prevalncia

de

polimorfismos

genticos,

tais

como

Hemoglobina S (HbS), grupo sanguineo Duffy e deficincia de G6PD em populao de rea endmica para a malaria; - Realizar a deteco, por biologia molecular, de Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax em reas consideradas endmicas para a malria, em indivduos com infeco confirmada por exame de gota espessa e em indivduos assintomticos; - Padronizar mtodos de diagnstico molecular pela Reao em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (q-PCR), com o objetivo de implantar servio auxiliar de deteco de infeces subpatentes e infeces mistas. 4. MATERIAL E MTODOS Amostras de sangue perifrico sero coletadas na rea urbana e em duas comunidades de Anajs, municpio localizado na Ilha do Maraj-PA, armazenadas em tubos de coleta vacuo, com EDTA, para futuras anlises genticas. Para a anlise de microscopia tica, ser feita pulso digital, a fim de se detectar a presena do Plasmodium. Posteriormente, sero utilizados uma quantidade aproximada de 400 L das amostras de sangue para obteno de DNA genmico, usando-se o mtodo de extrao por fenol-clorofrmio. Em seguida, o DNA ser visualizado em gel de agarose a fim de ser avaliada a qualidade do mesmo. As amostras de DNA genmico sero usadas como molde nas PCRs (Reao em Cadeia da Polimerase), que amplificar os fragmentos no qual sero identificados os polimorfismos investigados neste trabalho, ou seja, HbS e antgenos Duffy. A obteno do gentipo para HbS ser realizada por meio de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), usando o produto da PCR, sendo visualizado em gel de poliacrilamida. J para o sistema sanguneo Duffy, sero usados oligonucleotdeos (primers) alelo-especficos, de maneira que para cada amostra sero feitas quatro PCRs correspondentes aos quatro alelos, cujos produtos sero visualizados em gel de agarose. A identificao do alelo G6PD (202 A) ser realizada por meio de discriminao allica, utilizando a tcnica de aPCR, com a plataforma ABI 7500 (Applied Biosystems) e o kit TaqMan Genotyping Master Mix.

A partir da obteno desses resultados de genotipagem sero calculadas freqncias populao. As amostras de DNA sero submetidas qPCR para deteco de DNA mitocondrial especfico das espcies P. viivax, P. falciparum. Sero utilizadas sondas MGB-TaqMan, as quais so exclusivas para cada uma das espcies de Plasmodium investigadas e diferem entre elas em apenas um par de bases. Aps esse procedimento, sero comparados os resultados de deteco pela tcnica de biologia molecular e microscopia tica. A q-PCR ser realizada em plataforma ABI 7500 (Applied Biosystems) com o kit TaqMan Genotyping Master Mix, segundo protocolo do fabricante. allicas e genotpicas dos polimorfismos investigados nessa

5.

RESULTADOS PARCIAIS Uma equipe composta por pesquisadores, alunos de graduao e ps-

graduao, mdicos e tcnicos da Universidade Federal do Par realizou uma viagem para uma regio de alta endemicidade para malria, no municpio de Anajs, localizado no interior da ilha do Maraj-PA, onde disponibilizaram atendimento mdico e laboratorial para os pacientes atendidos nas duas comunidades Luciana e Vencedora, alm da rea urbana do local. De aproximadamente 1000 pacientes atendidos no total, foram coletadas amostras de sangue de 720 indivduos em tubos a vcuo com EDTA, e o diagnstico de indivduos infectados por Plasmodium foi feito por gota espessa a partir de puno digital. Destes, foram extradas, aproximadamente 400 amostras de DNA, as quais esto sendo submetidas s demais tcnicas de biologia molecular. 6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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