A evolução da Genética

Cultura de Células e Testes de Viabilidade

AULA 1
 Microscopia
Biologia Celular Célula Cultura celular
Citometria de fluxo

Biologia Molecular Molécula Western blot

PCR
PCR em tempo real
RFLP
Microarray
Sequenciamento

Microscopia
Microscopia de luz ou óptica
Detalhes de até 200 nanômetros
Usados em laboratórios de análises
 Microscópio convencional
(reconto celular)
 Microscópio de fluorescência
(marcação de componentes celulares)
 Microscópio de contraste de fase
(células em garrafas de cultura)
 Microscópio de polarização
(ossos, músculos, fibras, cabelos)
1590→ Hans Janssen
1632→ Antonie van Leeuwenhoek
Microscopia eletrônica
Em vez da luz, um feixe de elétrons
Capacidade de ampliação superior
Resolução de 0,2 nanômetros
Microscópio Eletrônico de Varredura
(MEV) ampliam em até 100 mil vezes
estrutura superficial da amostra
Microscópio Eletrônico de Transmissão
(MET) detalhes ínfimos, ampliando o
objeto em até um milhão de vezes
 Cultura Celular

 Conjunto de técnicas que permitem o desenvolvimento de células vivas e em

crescimento fora de seu tecido original em condições controladas;

Permite cultivar ou manter células isoladas, fora do organismo original,

conservando as características próprias;

A cultura celular é uma ferramenta de estudo de diferentes processos

biológicos (Expressão gênica, interações celulares, ensaios de fármacos e
cosméticos); podem ser usadas como recurso terapêutico (células tronco);

• Usos: – biologia celular

– farmacologia
– bioengenharia
– produção em larga escala de materiais biológicos
 Tipos de Cultura Celular

 Células aderentes: aderem as garrafas ou placas de cultura

 Células em solução: ficam no sobrenadante sem adesão à placa

Cocultivo de células
 Manutenção ou repique
Células aderentes

Troca de meio Repique

Adição de agentes desagregantes

Meio novo
Tripsina, PBS-EDTA
2mm,
Meio velho TrypleTM
 Manutenção ou repique
Células não aderentes

Coleta de meio
com as células

Meio velho

Troca de meio Repique Meio velho

Meio novo
Meio novo
 Congelamento Descongelamento

Alíquota de células de 1-2x106 cels em 1 mL de meio de congelamento (90% de

soro bovino e 10% de DMSO (Dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo)

Nitrogênio líquido Freezer -70°C

 Congelamento lento;
 Descongelamento rápido;
 Compartimentos numerados;
 Identificação;
 Tanque em local ventilado;
 Treinamento para manipulação de N2.
Equipamentos básicos para cultura celular

• Banho maria
Materiais requeridos para cultura celular
Materiais requeridos para cultura celular
Principais contaminantes
 Testes de viabilidade

 MTT:

Após redução, o MTT forma cristais de formazan, de cor azul, que ao

serem dissolvidos absorvem na região do visível, podendo desta forma ser
quantificados por espectrofotometria.
Método de exclusão pelo Trypan blue
Câmara de Neubauer ou hemocitômetro
https://www.youtube.com/watch?v=3u1RxONtJIY

https://www.youtube.com/watch?v=pP0xERLUhyc

https://www.youtube.com/watch?v=vBJIy5TRQ2E&e
bc=ANyPxKpf4AaiFPdvft1aGAQASJvdrurE60vPLbuoTx
9MzAik71wVfzGjie4egDGB7mxs9s6IyyxaQOB8HzGys
_EC-tbjf-7ssg

http://www.epsjv.fiocruz.br/sites/default/files/capit
ulo_5_vol2.pdf
IMUNO-HISTOQUÍMICA

PRINCÍPIOS E APLICAÇÕES
 O que torna um
• Especificidade anticorpo
bom para a
IHQ?
• Sensibilidade
 MÉTODO DIRETO
anticorpo primário marcado
alta especificidade
pequena amplificação de sinal
um anticorpo conjugado
específico para cada antígeno a
ser pesquisado
Método indireto
• CD79
• Intestino
• Cão
• Mm lisa
padrões de marcação
Parte 2
 citoplasmático

• AE1/AE3
 Citoplasmático granular

• CROMOGRANINA
Western Blot / Citometria de Fluxo
Biologia Molecular Molécula Western blot
PCR
PCR em tempo real
RFLP
Microarray
Sequenciamento

Microscopia
Biologia Celular Célula Cultura celular
Inmunofluorescência
Citometria de fluxo
 Eletroforese

Suporte

– Gel para separação do material estudado

–Agarose ou Acrilamida → “esponjas” (polímero),
retardando a passagem das moléculas conforme
seus tamanhos

Poli-acrilamida:
Acrilamida (linear) e Bis-acrilamida (cross-linker)

Agarose
 Eletroforese

Equipamentos :

– Cuba de eletroforese
– Fonte
– Rack do gel (barquinha)
– Pentes
Eletroforese
 Immunoblot – Western blot
Etapas para execução da técnica

1. Amostras (extratos celulares)

2. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

3. Transferência (Blotting)

4. Marcação

5. Detecção

6. Imagens

7. Análises de Imagens
Imunofluorescência
Imunofluorescência
 CITOMETRIA DE FLUXO

 Técnica citológica avançada

utilizada para contar, analisar e
classificar partículas microscópicas
em suspensão.

 Vantagens:
 Análise multiparamétrica;
 Num curto espaço de tempo analisa grande nº de células;
 Análise célula a célula;

‐> Grande importância no estudo de populações celulares não sincronizadas (as

células encontram‐se em diferentes fases do ciclo celular).

‐> Avaliação da homogeneidade ou heterogeneidade da população.

 CITOMETRIA DE FLUXO

 Tamanho (FSC) ‐> Dispersão frontal da luz ‐“forward scatter” (tamanho)

 Complexidade (SSC) ‐> Dispersão lateral da luz ‐ “side scatter” (granulosidade ou complexidade)
 Fluorescência Relativa (FL1, FL2, FL3, FL4…)
 CITOMETRIA DE FLUXO

Óptico
Gera e coleta os sinais de luz

Fluidos
(alinhamento de particulas)
Eletrônico
Converte o sinal óptico em
sinal eletrônico para análise
em computador (software)
 CITOMETRIA DE FLUXO
Figure A-25 part 1 of 2
 CITOMETRIA DE FLUXO
Gráficos

Histograma

Dot plot
Generalidades
http://www.bd.com/videos/bdb/training/itf/overview/player.html

Fluorocromos
http://www.bd.com/videos/bdb/training/itf/optical_measurements/player.ht
ml

Lasers http://www.bd.com/videos/bdb/training/itf/optics/player.html

Análises
http://www.bd.com/videos/bdb/training/itf/data_analysis/player.html

Sorting http://www.bd.com/videos/bdb/training/itf/sorting/player.html
PCR / RFLP / SEQUENCIAMENTO
Biologia Molecular Molécula Western blot
PCR
PCR em tempo real
RFLP
Microarray
Sequenciamento

Microscopia
Biologia Celular Célula Cultura celular
Imunofluorescência
Citometria de fluxo
 PCR

Materiais
PCR

DNA ladder
 RFLP

http://www.youtube.com/watch?v=jMLIaxxY6-
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