FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE C. QUIMICAS CARRERA DE ING. EN BIOTECNOLOGA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA POR: Nelson Mecas (1904) Jeimy Prez 1. TEMA: NIVEL: 3 A

CULTIVOS DE VIRUS

2. OBJETIVOS 2.1.GENERAL Identificar la forma correcta de llevar a cabo un cultivo de virus mediante su estudio detallado a fin de llevar a cabo este tipo de procesos en nuestra vida profesional. 2.2.ESPECFICOS Lograr conocer mediante un anlisis exhaustivo la correcta forma de cultivar virus a nivel de laboratorio. Reconocer la utilidad de dicho proceso en pro de la ciencia en especial beneficios humanos. 3. INTRODUCCIN [1][2][4] Virus (en latn, veneno), entidades orgnicas compuestas tan slo de material gentico, rodeado por una envuelta o envoltura protectora. Carecen de vida independiente, pero se pueden replicar en el interior de las clulas vivas, perjudicando en muchos casos a su husped en este proceso. El aislamiento de virus es una tcnica sensible que presenta la ventaja de que el virus est disponible tanto para la identificacin como para la ulterior caracterizacin antignica y gentica, las pruebas de susceptibilidad a frmacos y la preparacin de vacunas. Sigue recurrindose al crecimiento de los virus en animales para el aislamiento primario de algunos de ellos, y para los estudios de la patogenia de las enfermedades virales y de la oncognesis viral. En los laboratorios de diagnstico se intenta recuperar a los virus de las muestras clnicas para establecer los aspectos etiolgicos de las enfermedades. En los laboratorios de investigacin se cultivan virus como base de los anlisis detallados de la expresin y la replicacin virales. El cultivo sirve para lograr una proliferacin de esos microorganismos y de ese modo poder estudiarlos mejor.

4. MARCO TEORICO Mtodos de cultivo de virus [3][4] El cultivo de los virus requiere un sustrato de clulas de mamferos, plantas, hongos o bacteria como hospedadores para el crecimiento y replicacin de los virus. En las condiciones adecuadas se pueden generar virus enteros, virus recombinantes o productos virales en clulas diferentes a los hospedadores naturales. Dependiendo de la especie del virus y el tipo celular que se utiliza como sustrato, la replicacin viral puede resultar en la lisis de la clula hospedadora y la formacin de placas de lisis virales. La disponibilidad de clulas desarrolladas in vitro ha facilitado la identificacin y el cultivo de virus recin aislados y la caracterizacin de los que ya se conocan. Hay tres tipos bsicos de cultivo celular. 1) Los cultivos primarios se efectan mediante dispersin de clulas (por lo general con tripsina) de tejidos huspedes recin extirpados. En general no pueden crecer ms all de unos cuantos pasos en cultivo, como cultivos secundarios. 2) Las lneas celulares diploides son cultivos secundarios que han experimentado un cambio que permite su cultivo limitado (hasta 50 pasos), pero que retienen su patrn cromosmico normal. 3) Las lneas celulares continuas son cultivos capaces de crecimiento ms prolongado, quiz indefinido, y que se han obtenido de lneas celulares diploides o de tejidos malignos. Invariablemente tienen nmeros alterados e irregulares de cromosomas. El tipo de cultivo celular que se emplee para cultivar virus depende de la sensibilidad de las clulas a tal virus particular. Identificacin de clulas infectadas por virus: Es posible vigilar la multiplicacin de un virus de diversas maneras: l. Desarrollo de efectos citopticos, es decir, cambios morfolgicos en las clulas. Los tipos de efectos citopticos inducidos por virus consisten en lisis o necrosis celulares, formacin de inclusiones, formacin de clulas gigantes y vacuolizacin citoplsmica 2. Aparicin de una protena codificada por el virus, como la hemaglutinina del virus de la influenza. Se pueden emplear antisueros especficos para identificar la sntesis de protenas virales en las clulas infectadas. 3. Adsorcin de eritrocitos a las clulas infectadas, tcnica que se llama hemadsorcin, a causa de la presencia de hemaglutinina codificada por el virus (parainfluenza, influenza) en las membranas celulares. Esta reaccin se vuelve positiva antes que sean visibles los cambios citopticos y, en algunos casos, ocurre en ausencia de stos. 4. Interferencia por un virus no citopatgeno (por ejemplo, el de la rubola) con la replicacin e induccin de efectos citopticos por un segundo virus de carga (por ejemplo, echovirus) que se aade como indicador.

5. Transformacin morfolgica por un virus oncgeno (por ejemplo, virus del sarcoma de Rous), que suele acompaarse de prdida de la inhibicin de contacto y acumulacin de clulas en focos definidos. Ej. Cultivo de virus de la gripe aviar A [1] La lnea celular preferida para el cultivo de virus de la gripe es la MDCK. La identificacin de un virus de la gripe desconocido puede llevarse a cabo mediante un anlisis de inmunofluorescencia (en "shell vial") utilizando anticuerpos monoclonales especficos o bien por hemaglutinacin (HA) y anlisis antignico (determinacin del subtipo) por inhibicin de la hemaglutinacin (IHA) utilizando antisueros de referencia seleccionados. Se adoptarn las precauciones convencionales en materia de bioseguridad cuando se manipulen muestras y cultivos celulares que presuntamente contienen gripe aviar A hiperpatgena. REGLA DE ORO: Las muestras clnicas procedentes de seres humanos y las procedentes de cerdos o aves nunca se manipularn en el mismo laboratorio. Material necesario Clulas renales de perro Madin-Darby (MDCK), ATCC CCL34 Juego de reactivos de la OMS para la identificacin del virus de la gripe A/H5. Los reactivos para la identificacin del A/H5 en cultivos celulares incluyen los siguientes: - antgeno de control de la gripe A/H5: virus inactivado - suero de cabra para A/Tern/South Africa/61/H5 - mezcla de sueros de pollo para A/Goose/Hong Kong/437-4/99 Juego de reactivos de la OMS para la gripe (distribucin anual) - antgenos de referencia y antisueros de referencia para A(H1N1) y A (H3N2) Enzima destructora de receptores Hemates (de pollo, de pavo, humanos de tipo O, o de cobayo) en solucin de Alsever. Procedimiento 1. Se seguirn los procedimientos uniformes para el cultivo de clulas en el laboratorio destinado a la propagacin de cultivos celulares, la inoculacin de muestras y la cosecha de clulas infectadas para el anlisis de inmunofluorescencia o la recogida del sobrenadante del cultivo para las pruebas de HA y de IHA (Lennette y Schmidt, 1979; OMS, 2002). Cuando se manipulen virus amplificados, se observarn las directrices uniformes en materia de bioseguridad en el laboratorio 2. Se seguirn los procedimientos uniformes en la HA y la IHA, incorporando todos los controles recomendados. En el manual de la OMS sobre diagnstico y vigilancia de la gripe animal (WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance (OMS, 2002)) se ofrecen pormenores especficos sobre los sueros y los antgenos de referencia.

5. CONCLUSIONES La forma correcta de llevar a cabo un cultivo de virus requiere un sustrato de clulas de mamferos, plantas, hongos o bacteria como hospedadores para su crecimiento y replicacin dependiendo de la especie. Hay tres tipos bsicos de cultivo celular. Cultivos primarios Mediante dispersin de clulas (por lo general con tripsina) de tejidos huspedes recin extirpados. Cultivos secundarios Las lneas celulares continuas Han experimentado un Crecimiento ms prolongado, cambio que permite su quiz indefinido, y que se han cultivo limitado (hasta 50 obtenido de lneas celulares pasos diploides o de tejidos malignos

su patrn El tipo de cultivo celular depende No pueden crecer ms Retienen de la sensibilidad de las clulas a all de unos cuantos cromosmico normal. tal virus particular. pasos en cultivo . Identificacin de clulas infectadas por virus L. Desarrollo de efectos 2. Aparicin de una 3. Adsorcin de eritrocitos citopticos cambios protena codificada por el a las clulas infectadas morfolgicos en las virus hemadsorcinclulasFormacin de inclusiones, Como la hemaglutinina del A causa de la presencia de formacin de clulas virus de la influenza hemaglutinina codificada gigantes y vacuolizacin por el virus (parainfluenza, citoplsmica influenza) en las membranas

4. Interferencia por un 5. Transformacin virus no citopatgeno (por morfolgica por un virus ejemplo, el de la rubola) oncgeno (por ejemplo, virus del sarcoma de Rous), Con la replicacin e Prdida de la inhibicin de induccin de efectos contacto y acumulacin de citopticos por un segundo clulas en focos definidos virus de carga (por ejemplo, echovirus) que se aade como indicador

Beneficio del cultivo de virus: En los laboratorios de diagnstico se intenta recuperar a los virus de las muestras clnicas para establecer los aspectos etiolgicos de las enfermedades. En los laboratorios de investigacin se cultivan virus como base de los anlisis detallados de la expresin y la replicacin virales. 6. BIBLIOGRAFIA

[1] WHO (2002). WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. Ginebra, Organizacin Mundial de la Salud (documento WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5, disponible en: http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/en/whocdscsrncs20025rev.pdf [2] "Virus." Microsoft Student 2009 [DVD]. Microsoft Corporation, 2008 [3] MTODOS DE CULTIVO DE VIRUS http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_celular 20110425 [4] CULTIVO DE VIRUS http://danival.org/600%20microbio/7400notasvir/virus/vir_200_cultivo.html