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MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA A célula pode ser estudada sob o aspecto morfológico (forma)

MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA A célula pode ser estudada sob o aspecto morfológico (forma) geral

A célula pode ser estudada sob o aspecto morfológico (forma) geral e de seus componentes, sob o aspecto bioquímico e sob o aspecto de seu funcionamento fisiológico; para cada um dos quais, se aplica um método e uma técnica específicos. O constante aperfeiçoamento da microscopia óptica e eletrônica permitiu estudar e observar a célula e seus componentes estruturais e moleculares. As técnicas de análise química e de biologia molecular contribuíram para esclarecer o funcionamento dessas estruturas e elucidar muitos outros aspectos da biologia dos organismos. A ressonância magnética nuclear permite determinar a estrutura de pequenas moléculas em solução e os novos microscópios confocais a laser, associados a tratamento computadorizado de V01/imagem, constituem poderosos instrumentos que nos auxiliam obter as informações necessárias à compreensão do funcionamento da célula e dos organismos.

MICROSCOPIA

Conjunto de técnicas para observação de objetos de dimensões muito reduzidas.

Limites de resolução

valor

Proporção

Olho humano

0,1mm

1= padrão

Microscópio óptico

0,27 m

500 x

Microscópio eletrônico

0,025 Å

100.000 x

As dimensões celulares são menores que o limite de nitidez do olho humano, sendo, portanto, impossível observá-las a olho nu. Para visualizá-las é necessário recorrer a instrumentos que aumentem nosso poder de resolução. Poder de resolução é a capacidade visual de distinguir dois pontos ou capacidade de um sistema óptico de revelar detalhes da estrutura. Não se trata, portanto, de simples ampliação da V01/imagem e sim da nitidez com que é possível diferenciá-la. O poder de resolução do olho humano é de 0,1 mm. Duas linhas paralelas mais próximas entre si do que essa distância serão visualizadas como uma única linha, e objetos que tenham diâmetro menor do que esse intervalo serão invisíveis ou vistos como borrão sem foco. Os microscópios são aparelhos que aumentam e resolvem nossa capacidade visual. O poder de resolução de um microscópio é limitado à metade do comprimento de onda de sua fonte; luz para o microscópio óptico e elétrons acelerados para o eletrônico. Assim, mesmo com as lentes mais perfeitamente construídas, tendo a luz branca um comprimento de onda médio de 0,55 m a melhor resolução obtida para o microscópio óptico será de 0,27 m, o que corresponde a um aumento de resolução para o olho humano de 500 vezes. Elétrons de alta velocidade são empregados no microscópio eletrônico ao invés de ondas de luz. Os elétrons acelerados, dentro do microscópio por uma diferença de potencial de 60.000 volts, possuem um comprimento de onda em torno de 0.05 Å, com poder de resolução de 0,025 Å. O aumento de resolução para o olho humano seria de 400.000 vezes, porém, devido a dificuldades de preservar os finos cortes submetidos ao bombardeio de elétrons e ao conseqüente aquecimento, são empregadas resoluções de até 100.000 vezes.

Preparação para o uso de microscópios

Fixação

Inclusão

Cortes

Coloração

Para podermos observar células ao microscópio é preciso cortes de alguns micrometros de espessura. Como as células são gelatinosas e moles, para serem cortadas em fatias finas, é preciso endurecê-las sem alterar sua estrutura. A fixação é um tratamento, químico ou físico, efetuado sobre células vivas que provoca sua morte, porém, preserva suas formas com um mínimo de danos às estruturas celulares. A fixação pode ocorrer pela técnica de congelamento, congelando as células, ou pelo método da inclusão, substituindo a água por um outro líquido passível de endurecimento em certas condições.

Fixação por tratamento químico A fixação por tratamento químico é realizada colocando-se as células em líquidos fixadores. Alguns

químico A fixação por tratamento químico é realizada colocando-se as células em líquidos fixadores. Alguns
fixadores atuam como coagulantes das proteínas como o ácido acético diluído, o álcool etílico, as

fixadores atuam como coagulantes das proteínas como o ácido acético diluído, o álcool etílico, as soluções aquosas de ácido pícrico ou cloreto de mercúrio. Para a conservação e a consolidação das ultra-estruturas, só são empregados os fixadores não-coagulantes. O mais usado é o tetróxido de ósmio, em solução a 1% num tampão salino de pH próximo da neutralidade, que na microscopia eletrônica atua, também, como contraste. Outros fixadores são o permanganato de potássio em solução aquosa a 1%, o aldeído fórmico em solução aquosa a 40% (formol) e o glutaraldeído em solução tampão a pH 7,2. Cada um dos fixadores apresenta vantagens e desvantagens, de forma que se recorre a misturas de fixadores para melhores resultados.

Fixação por tratamento físico

O tratamento físico mais comumente usado para a fixação é o congelamento. A peça a ser fixada é

resfriada rapidamente, seja por imersão num líquido de baixa temperatura como nitrogênio liquido, -196°C, o propano, -196°C, ou o hélio - 272°C, seja por descarga de gás carbônico comprimido (-60°C). Podemos igualmente fixar as células aquecendo-as rapidamente, tratamento que tem por fim coagular as proteínas celulares, em microscopia óptica. Esse último método, muito rápido, é usado freqüentemente em hematologia, para fixação das células sangüíneas espalhadas em esfregaços.

Inclusão

O endurecimento das amostras é feito substituindo-se a água das células por um líquido de inclusão que é

posteriormente solidificado. O endurecimento por inclusão é obtido pela substituição da água das células por parafina quente, que endurece pelo resfriamento. Essa substituição não é possível de ser feita diretamente. Primeiro a água das células fixadas é substituída por álcool etílico e depois por tolueno, que pode misturar-se com a parafina líquida. Na microscopia eletrônica, os cortes são muito menores e os meios de inclusão devem ser muito mais duros que a parafina. Utilizam-se resinas plásticas do tipo epóxi, como Araldite e Epon. As células são fixadas em álcool etílico, no qual a resina é solúvel, em seguida, na presença de um catalisador e sob calor, a resina endurece. Os blocos obtidos de parafina, de gelo ou de resinas, são submetidos à cortes finos em aparelhos especializados, designados de micrótomos. Na microscopia óptica os cortes, com espessura de 1 a 6 m são feitos com uma lâmina cortante de aço. Na microscopia eletrônica, esses cortes são feitos com lâminas de vidro ou diamante e a espessura é de 0,02 a 0,1 m.

Coloração Os cortes preparados são normalmente diáfanos, porque a maioria das organelas e inclusões celulares são transparentes à luz e incolores. Para aumentar o contraste e melhorar a visualização são empregadas técnicas de coloração. Na microscopia eletrônica, esse contraste é possível porque algumas estruturas podem ser tornadas mais densas aos elétrons com o emprego de substâncias que contenham metais pesados, tais como o ósmio, urânio, chumbo, bismuto, e manganês. Na microscopia óptica são conhecidos muitos processos de coloração. Os chamados corantes vitais são empregados para observação de células vivas, como o verde Janus, azul de metileno, vermelho neutro e outros. Os corantes podem ser ortocromáticos, quando não alteram a cor que as células apresentam ou metacromáticos, quando a alteram. Quanto à afinidade química os corantes podem ser ácidos, básicos e neutros. Os corantes ácidos, como o ácido ósmico, eosina, fucsina ácida, orange G, p.a.s. (periodic acid schiff), coram estruturas básicas, que são designadas de acidófilas (amigas de ácidos). Os corantes básicos como o azul de metileno, azul de toluidina, hematoxilina, lugol, orceína, verde Janus, violeta-de-genciana, coram estruturas ácidas designadas de basófilas (amigas de bases). O corante neutro mais empregado é o vermelho neutro. Normalmente, vários corantes são empregados para melhores resultados, como a dupla hematoxilina – eosina.

Microscópio óptico composto

dupla hematoxilina – eosina. Microscópio óptico composto O microscópio óptico e formado por uma parte mecânica

O microscópio óptico e formado por uma parte mecânica de suporte e de um sistema de lentes, em um

tubo telescópico.

A aproximação e o afastamento do sistema de lentes ao objeto observado, ajustando a melhor focalização

telescópico. A aproximação e o afastamento do sistema de lentes ao objeto observado, ajustando a melhor
visual é obtida por dois botões reguladores: o macrométrico, de definições maiores e o micrométrico

visual é obtida por dois botões reguladores: o macrométrico, de definições maiores e o micrométrico de ajustes finos. O charriot é um sistema que permite a movimentação horizontal da lamínula.

O sistema de lentes é composto pelas lentes: condensadora, objetiva e ocular. O aumento da V01/imagem

é o resultado do aumento fornecido pela lente ocular multiplicado pelo aumento

fornecido pela lente ocular multiplicado pelo aumento Microscópio de contraste de fase fornecido pela lente

Microscópio de contraste de fase

fornecido pela lente objetiva. A resolução da V01/imagem depende exclusivamente do poder de resolução da lente objetiva, porque a lente projetora, a ocular, pode aumentar somente o que a objetiva já resolveu. A lente condensadora faz incidir um cone de luz sobre o objeto. A luz passa através do objeto, é aumentada e resolvida pela lente objetiva e é, mais uma vez, ampliada pela lente ocular. Se a resolução da objetiva for de 0,5 m e aumento de 40x e a ocular aumentar 15x, significa que só poderemos observar espécimes de dimensões maiores que este limite com ampliação de 600x. A lente objetiva de imersão a óleo é a de melhor resolução.

As diferentes estruturas celulares têm maior ou menor quantidade de matéria ou densidade. Quanto maior

a densidade maior será o atraso da luz ao atravessá-lo e menor o índice de refração. Isto provoca diferenças de fase da luz emergente, que através de um sistema óptico especial, é transformado em diferentes intensidades de luz, na formação da V01/imagem. Este microscópio é excelente para observação de células vivas, em suas diferentes fases, sem a necessidade de corantes.

Microscópio confocal

O microscópio confocal utiliza um fino feixe de raio laser que corre pelo corte iluminando apenas um plano

de observação. A V01/imagem é formada pelas estruturas que estão no plano iluminado e as estruturas situadas acima ou abaixo deste plano não contribuem para a formação da V01/imagem. Assim como na topografia computadorizada, as imagens são processadas em um computador e podem ser montadas tridimensionalmente no monitor, além de ter seus dados biométricos quantificados.

Microscópio de polarização

O microscópio de polarização é semelhante ao microscópio óptico, sendo que no lugar da lente

condensadora existe um polarizador que emite um feixe de luz polarizada sobre o objeto. Na lente ocular existe um analisador. Se um feixe de luz polarizada não é desviado, ele será totalmente absorvido pelo analisador e não formará V01/imagem. Com o uso de um feixe de luz polarizada podemos evidenciar as regiões anisotrópicas ou birrefringentes das células, aquelas que desviam a luz polarizada em dois feixes perpendiculares, sendo que, um deles passará pelo analisador e formará a V01/imagem. Como a birrefringência está ligada à presença de partículas ou de moléculas assimétricas dispostas regularmente, alongadas e paralelas, que dividem o feixe polarizado em dois planos perpendiculares, é possível ter-se uma idéia da organização de certas estruturas nesse nível. As estruturas que não apresentam a organização acima não modificam o plano de luz polarizado, são chamadas isotrópicas, e não são observadas nas imagens que emergem deste microscópio. As estruturas contráteis das células musculares foram evidenciadas pelo uso deste tipo de aparelho.

Microscópio eletrônico

Consiste em um tubo blindado acoplado a uma bomba de vácuo. Os elétrons são emitidos
Consiste em um tubo blindado acoplado a uma bomba de vácuo. Os elétrons são emitidos

Consiste em um tubo blindado acoplado a uma bomba de vácuo. Os elétrons são emitidos por um filamento de tungstênio aquecido à vácuo. O filamento emissor representa o cátodo. São acelerados por uma diferença de potencial de 60.000 a 100.000 volts, entre o cátodo e o ânodo. O ânodo é uma placa perfurada que deixa passar apenas um feixe de elétrons. Este feixe passa por uma lente magnética condensadora que o dirige diretamente ao objeto. À medida que esses elétrons passam através do objeto, parte do espécime absorve ou espalha

através do objeto, parte do espécime absorve ou espalha os elétrons diferencialmente. Os elétrons que passam

os elétrons diferencialmente. Os elétrons que passam pelo objeto atravessam o campo magnético de outra bobina, a lente magnética objetiva, ocorrendo aqui uma primeira ampliação do feixe, que é projetado para um segundo campo magnético da lente projetora que dirige este feixe ampliado, mais uma vez, a uma placa revestida de sulfeto de zinco (ZnS), o égran; tela fluorescente que produz a V01/imagem. A V01/imagem obtida corresponde aos elétrons que passaram pelo objeto e incidiram sobre a placa. Os elétrons absorvidos ou desviados por partes do objeto não contribuem para a formação da V01/imagem, aparecendo como estruturas escuras. Como o olho humano não é estimulado por elétrons, existe a necessidade de chapas ou anteparos. Selecionadas as imagens, o égran é retirado, fazendo incidir os elétrons sobre uma chapa fotográfica. O filme é revelado e ampliado até 4 vezes. A V01/imagem assim obtida é chamada de micrografia.

Microscópio eletrônico de varredura

Similar ao microscópio eletrônico comum ou de transmissão, funciona com um feixe de elétrons e suas lentes magnéticas. O feixe de elétrons pode ter seu diâmetro modificado e direcionado, por um novo par de lentes magnéticas defletoras, que fazem o feixe de elétrons percorrer a superfície do objeto ponto a ponto em linhas paralelas (varredura). Os elétrons desviados diferencialmente pela superfície varrida são colhidos por um coletor, passam por um sistema ampliador e a V01/imagem é gerada em um monitor. As micrografias são obtidas diretamente do monitor. A resolução é menor que a do microscópio eletrônico comum, mas objetos bem maiores, de até de um centímetro, podem ser observados. O contraste realizado após a fixação emprega uma pulverização de ouro ou platina.